CN115779080A - 一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种膜联蛋白ANX1和TNF‑α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。所述的ANX1具有抑制Th17细胞分化和溃疡性结肠炎治疗的能力。本发明的ANX1具有抑制Th17细胞分化的能力，在自身免疫性结肠炎小鼠模型中，人重组ANX1通过调节SOCS3/STAT3信号传导，限制Th17的发育来发挥其免疫抑制的作用，从而减轻了疾病的严重程度。

Description

一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠 炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种易复发的自身免疫性疾病，属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一种。溃疡性结肠炎在临床上的典型症状表现为血性腹泻、夜间排便、急症和里急后重，在最初的隐匿期后，它表现出粘膜炎症反复发作和缓解的特征。IBD的致病机制尚不明确，遗传、免疫和环境因素，如饮食、压力、吸烟和自由基等，都参与了其发展。
在世界范围内，UC的发病率呈现出逐年上升的趋势。UC在发达国家中的发病率较高，而在进入21世纪以来，UC发病率在发达国家中已经趋于稳定，而在南美、亚洲、非洲和中东地区的许多新工业化国家中有所上升。在我国溃疡性结肠炎以往非常少见，总体发病率在1.2/10万人/年，但是随着我国经济的发展，溃疡性结肠炎呈现快速上升的趋势。随着UC患病率的上升，整体医疗成本也会上升。因此，开发新型的高效低毒的治疗药物成为需求。
anti-TNF-α纳米抗体药物在20世纪90年代后期开发，在治疗自身免疫性疾病如炎症性肠病，强直性脊柱炎，牛皮癣和类风湿性关节炎方面取得了巨大成功。目前常见的TNF-α纳米抗体药物包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗和依那西普。
虽然TNF-α纳米抗体药物在自身免疫性疾病中取得了显著的作用，然而，随着上述疾病的高效治疗，关于不良反应的报道正在增加。接受anti-TNF-α纳米抗体药物治疗后，IBD，强直性脊柱炎和类风湿性关节炎患者(20％～22％)发生新发的牛皮癣(Puig L等,Dermatology 2012,225(1):14–17；Gannes G等,Arch.Dermatol.2007,143(2):223–231；KoJM等,J.Dermatol.Treat 2009,,20(2):100–108)。这种不良反应在应答者而不是无反应者中发展明显，并导致5％至35％的患者停止anti-TNF-α治疗(Rahier J等,Clin.Gastroenterol.Hepatol.2010,8(12):1048–1055；Scaldaferri F等,Gut 2014,63(4):699–701)。然而，与类风湿性关节炎和IBD患者相比，累积剂量对牛皮癣的发展时间没有影响(Scaldaferri F等,Gut 2014,63(4):699–701)。此外，一项研究表明，接受anti-TNF-α治疗的IBD患者的皮肤病变被Th17细胞浸润(Tillack C等,Gut 2014,63(4):567–577)。
Th17细胞是一个T细胞亚群，其特征是产生大量的IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22。Th17细胞是由IL-6和TGF-β共同诱导下分化的，它的扩张是由IL-23促进的(Caprioli F等,J.Crohn’s Colitis 2008,2(4):291–295)。由Th17细胞产生的IL-21反过来增加了其IL-23受体的表达，从而形成了一个正向的自动调节反馈回路增强了Th17细胞的扩张。Th17细胞，特别是其分泌的特征性细胞因子IL-17A在肠道炎症中的作用已被广泛研究。与正常黏膜相比，IBD患者血清和病变肠黏膜组织中IL-17A的分泌和mRNA水平显著高于正常人。UC疾病的严重程度与IL-17A的表达量呈正相关，这表明肠道中的IL-17A在促进了IBD患者疾病的发展(Gannes G等,Arch.Dermatol.2007,143(2):223–231；Cullen G等,Aliment.Pharmacol.Ther.2011,34(11–12):1318–1327；.Milanez FM等,ArthritisRes.Therapy 2016,18(1):52)。目前，已经在各种条件和因素下研究了肠道Th17细胞的诱导。有文献表明，抗原特异性Th17分化发生在肠道固有层(LP)中，CD11c+DC细胞可以通过吞噬或胞饮作用处理微生物等抗原，通过MHCII途径刺激TH17的生成，并且这个过程与肠系膜淋巴结和肠相关淋巴组织无关。
膜联蛋白A1(Annexin A1，ANX1)来源于研究糖皮质激素抑制前列腺素合成的机制的过程，又被称为大皮质激素、肾皮质激素、脂肪调节蛋白和脂皮质素1，其特征是通过影响磷脂酶A2(PLA2)的活性来抑制类二十烷的生成。ANX1是一个由346个氨基酸组成的单体两亲性蛋白，是膜联蛋白超家族中的一种，大小为37kDa。ANX1主要在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的亚细胞颗粒中表达，在特定的淋巴细胞亚群中有少量表达。
现在的证据表明，ANX1通过与甲酰肽受体(Formyl peptide receptor，FPR)的相互作用介导其大部分细胞效应。甲酰肽受体是一个包含七个跨膜结构域的G蛋白偶联受体家族的成员，主要在哺乳动物吞噬性白细胞中表达，它们可以诱导对各种配体的反应，在宿主的防御和炎症方面发挥重要的作用。人体内存在三种FPR受体，即FPR1、FPR2和FPR3，三种FPR具有显著的序列同源性。
在严重UC患者炎症结肠活检中检测到ANX1的分泌，而在健康人结肠，非UC患者或轻微或中度UC患者结肠的活检中没有检测到。英夫利昔单抗可预防DSS诱导的WT结肠炎的临床症状，但在ANX1-/-小鼠中不能(Gaffen SL等,Nat.Rev.Immunol.2009,9(8):556)，这表明TNF-α纳米抗体药物英夫利昔单抗需要通过内源性ANX1才能发挥急性结肠炎治疗作用。但是，如果ANX1作为外源性的药物使用，其作用于细胞外、而无法进入细胞内部时，ANX1的作用如何，其与TNF-α纳米抗体药物的作用是怎样的关系。
目前，缺乏一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的TNF-α纳米抗体治疗溃疡性结肠炎的缺陷，提出一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
为了解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备炎症药物中的应用。
本发明的一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的一种组合药物，所述的组合药物由所述的TNF-α纳米抗体和膜联蛋白ANX1组成。
进一步地，所述的膜联蛋白ANX1的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，具有抑制Th17细胞分化和治疗溃疡性结肠炎的能力。
进一步地，所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。
更进一步地，所述的TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.2或3或4限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
进一步地，所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。
进一步地，所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V7、TNF-α纳米抗体V1或TNF-α纳米抗体V19中的任意一种，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；膜联蛋白ANX1能与TNF-α纳米抗体V7、TNF-α纳米抗体V1或TNF-α纳米抗体V19中的任意一种联用。
TNF-α纳米抗体与TNF-α抗原/抗体复合物CPR诱导Th17细胞分化。CPR是指TNF-α纳米抗体和TNF-α抗原/抗体复合物。
更进一步地，TNF-α纳米抗体与TNF-α抗原/抗体复合物CPR促进巨噬细胞的吞噬能力和抗原递呈特征、并与Th17细胞分化相关。
进一步地，TNF-α纳米抗体与TNF-α抗原/抗体复合物CPR和FRP2诱导的Th17细胞分化的调节是通过STAT3途径介导的。
进一步地，在自身免疫性结肠炎小鼠模型中，人重组ANX1通过调节SOCS3/STAT3信号传导，限制TH17的发育来发挥其免疫抑制的作用，从而减轻了疾病的严重程度。
本发明所述的TNF-α纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过酶切酶联反应将TNF-α纳米抗体的编码基因导入pET28a载体，构建重组表达质粒；
(2)将目的质粒转入BL21感受态细胞，转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液。通过柱层析进行分离纯化，制得TNF-α纳米抗体。
具体详细步骤如下：(1)通过酶切酶联反应将如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQID No.4所示的TNF-α纳米抗体基因导入pET28a载体，构建表达质粒；
(2)将目的质粒转入BL21感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗生素LB培养基后37℃震荡1h，离心(2500rpm，5min)后弃上清，留下少许培养基重悬菌液；转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签；
通过离心(4000rpm，20min，4℃)收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心(12000rpm，30min，4℃)后收取上清液；
使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的TNF-α纳米抗体结合在Ni-NTA上，之后使用蛋白洗脱液进行洗脱；在4℃条件下使用HRV3C酶剪切TNF-α纳米抗体上的His标签12h；
(4)将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存(-80℃)；制得TNF-α纳米抗体。
在步骤(3)中，蛋白缓冲液配方：①300mM NaCl，②50mM Tris-HCl，③0.5mMβ-巯基乙醇，④pH 7.8。在步骤(3)中，蛋白洗脱液配方：①80mM imidazole，②300mM NaCl，③50mMTris-HCl，④0.5mMβ-巯基乙醇，⑤pH 7.8。
更进一步地，在步骤(4)中，用12％SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。
本发明所述的ANX1的制备方法，包括如下步骤：(1)通过酶切和酶联反应将如SEQID No.1所示的ANX1基因导入pET28a载体，构建表达质粒；
(2)将目的质粒转入BL21感受态细胞，转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液。通过柱层析进行分离纯化，具体操作步骤如TNF-α纳米抗体纯化过程，制得重组ANX1蛋白。
有益效果：本发明的ANX1具有抑制Th17细胞分化的能力，在自身免疫性结肠炎小鼠模型中，外源性的人重组ANX1通过调节SOCS3/STAT3信号传导，限制Th17的发育来发挥其免疫抑制的作用，从而减轻了疾病的严重程度。针对TNF-α纳米抗体治疗时，TNF-α纳米抗体与TNF-α形成的复合物导致促进Th17细胞浸润和IL-17A产生、反而促进了IBD患者的疾病状态的难题，本发明发现将ANX1与TNF-α纳米抗体联用，可以提高TNF-α纳米抗体对DSS小鼠结肠炎的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的TNF-α纳米抗体的纯化与表征；A：通过亲和层析表达和纯化TNF-α纳米抗体；B：通过MST检测TNF-α纳米抗体与鼠源s-TNF-α的亲和力。
图2为本发明的不同剂量TNF-α纳米抗体对DSS小鼠体重及结肠长度的影响。A：TNF-α纳米抗体治疗DSS诱导的结肠炎期间的一系列体重变化；B：第8天各组的代表性结肠的长度比较。
图3为本发明的TNF-α纳米抗体导致小鼠DSS小鼠结肠Th17细胞增加。A：流式细胞术分析DSS和TNF-α纳米抗体(10mg/kg)组小鼠的肠道Th17细胞；B：流式细胞术分析肠道CD11c+DC中的BFP荧光。
图4为本发明的TNF-α纳米抗体治疗中Th17扩增与TNF-α纳米抗体被吞噬。A：TNF-α纳米抗体体外刺激显著增加DSS小鼠LPL中Th17，而WT小鼠则不能；B：体外刺激TNF-α纳米抗体-BFP后，BFP阳性CD11c+DC增加；C：TNF-α纳米抗体诱导DSS小鼠而非WT小鼠肠道CD11c+DC的MHCII上调。
图5为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR可被CD11c+RAW264.7吞噬；A.构建TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物吞噬RAW264.7(CPR)的方案；B：CD11c+RAW264.7可吞噬TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物，但不能吞噬TNF-α纳米抗体V7。
图6为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2具有抗原递呈特征；A：流式细胞术分析不同TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物含量的CPR；B：CPR中MHCII、CIITA、CD74、H2-Aa、TGF-β和IL-6的qRT-PCR分析。
图7为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR使得WT小鼠结肠Th17扩增；A：流式细胞术分析经TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-1或CPR-2治疗的结肠中的Th17细胞；B：TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-1或CPR-2治疗后结肠RORα、RORγt、IL-17A和IL-23的表达。
图8为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR使得WT小鼠肠系膜淋巴结中Th17扩增图；流式细胞术分析经CPR-1或CPR-2治疗肠系膜淋巴结中的Th17细胞。
图9为本发明的ΔCIITA-RAW264.7的构建图；A：通过qRT-PCR检测ΔCIITA-CPR-2中MHCII的下调；B：通过qRT-PCR检测的ΔCIITA-CPR-2中TGF-β和IL-6下调。
图10为本发明的ΔCIITA-CPR对Th17的影响图；A：ΔCIITA-CPR-2在结肠中诱导Th17的流式分析；B：ΔCIITA-CPR-2在mLN中诱导Th17的流式分析。
图11为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2显著上调结肠中的ANX1图；A：通过qRT-PCR分析，与TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2相比，ΔCIITA-CPR-2中ANX1的表达下调；B：流式细胞术分析mLN和结肠中ANX1结合受体的表达。
图12为本发明的ANX1激活FPR2图；A：qRT-PCR检测CPR刺激结肠LPL后ANX1的表达水平；B：WRW4(10μg/ml)抑制FPR2的表达。
图13为本发明的ANX1抑制TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR诱导的Th17细胞分化图；在CPR-2(105细胞)、ANX1(1μg/ml)和WRW4(10μg/ml)处理下，对结肠和mLN中分化的Th17细胞进行流式细胞术分析。
图14为本发明的TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2通过STAT3途径介导Th17分化图；A：通过Western blot检测CPR-2(105细胞)、ANX1(0.5μg/ml)、ANX1(1μg/ml)和WRW4(10μg/ml)下结肠LPL中STAT3/p-STAT3的表达；B：qRT-PCR检测TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2(105细胞)、ANX1(1μg/ml)和WRW4(10μg/ml)下SOCS3、RORγt、IL-17A、IL-17F和IL-23的表达。
图15为本发明的不同剂量ANX1对DSS小鼠体重及结肠长度的影响图；A：ANX1治疗DSS诱导的结肠炎期间的一系列体重变化；B：第8天各组的代表性结肠的长度比较。
图16为本发明的TNF-α纳米抗体V7和ANX1联合使用治疗DSS诱导的结肠炎图；A：各组小鼠体重变化趋势比较；B：各组小鼠结肠长度比较；C：第7天各组的代表性肛门出血；D：各组疾病活动指数的比较。
图17为本发明的ANX1(500μg/kg)减少了TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)抗体治疗DSS小鼠时Th17的扩增图；A：通过流式细胞术比较各处理组小鼠的mLN和结肠LPL中的Th17细胞；B：统计各处理组中Th17细胞的比例。
图18为本发明的ANX1(500μg/kg)可通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)处理引起的Th17细胞分化图；A：通过qRT–PCR检测ANX1(500μg/kg)、TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)和ANX1(500μg/kg)/TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)处理的小鼠结肠LPL中FPR2的表达；B：western blot检测ANX1(500μg/kg)、TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)和ANX1(500μg/kg)/TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)处理小鼠结肠LPL中STAT3/p-STAT3的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明的一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备炎症药物中的应用。
本发明的一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的一种组合药物，所述的组合药物由所述的TNF-α纳米抗体和膜联蛋白ANX1组成。
所述的膜联蛋白ANX1的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，具有抑制Th17细胞分化和治疗溃疡性结肠炎的能力。
所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。
所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。所述的TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.2或3或4限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
TNF-α纳米抗体-TNF-α抗原/抗体复合物CPR和FRP2诱导的Th17细胞分化的调节是通过STAT3途径介导的。所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1或TNF-α纳米抗体V19，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。
在自身免疫性结肠炎小鼠模型中，人重组ANX1通过调节SOCS3/STAT3信号传导，限制Th17的发育来发挥其免疫抑制的作用，从而减轻了疾病的严重程度。
在本发明中，使用了2株不同的TNF-α纳米抗体，如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示，2株TNF-α纳米抗体亲和力不同，其中SEQ ID No.3的抗体比SEQ IDNo.2的抗体亲和力高约100倍。两种TNF-α纳米抗体获得的结果基本相同。为此，本发明仅以亲和力较差的、如SEQID No.2所示的TNF-α纳米抗体为例，提供具体数据。SEQ ID No.2所示的TNF-α纳米抗体在研究过程中代号为V7。
实施例1
如图1至图18所示，本发明首先在大肠杆菌中原核表达TNF-α纳米抗体V7，具体步骤为：通过酶切和酶联反应将如SEQ ID No.2所示的TNF-α纳米抗体V7基因导入pET28a载体，构建质粒。
将目的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s,冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，离心(2500rpm，5min)后弃上清，留下少许培养基重悬菌液。
转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。表达的V7蛋白中包含His标签。
通过离心(4000rpm，20min，4℃)收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心(12000rpm，30min，4℃)后收取上清液。
蛋白缓冲液配方：①300mM NaCl，②50mM Tris-HCl，③0.5mMβ-巯基乙醇。④pH7.8。
使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的TNF-α纳米抗体V7结合在Ni-NTA上，之后使用洗脱液进行洗脱。
蛋白洗脱液配方：①80mM imidazole，②300mM NaCl，③50mM Tris-HCl，④0.5mMβ-巯基乙醇，⑤pH 7.8。
在4℃条件下使用HRV3C酶剪切TNF-α纳米抗体V7蛋白上的His标签12h。
将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体V7，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存(-80℃)。
用12％SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体V7的分子量和纯度。
如图1A所示，孔道中为纯化后切除His标签后的TNF-α纳米抗体V7的蛋白，约为15kDa。
实施例2
本发明通过MST实验检测了纯化的TNF-α纳米抗体V7对可溶性TNF-α(s-TNF-α)的亲和力，具体步骤为：
使用MST缓冲液(50mM HEPES，100mM KCl，0.05％ Tween-20)配制100nM的TNF-α纳米抗体V7溶液。
使用PBST缓冲液制备10μM的人源或鼠源的TNF-α溶液。
TNF-α溶液的最高配体浓度为5μM，并按照16步梯度稀释法进行稀释，每个稀释系列样品的最终体积为10μl。
将10μl 100nM的TNF-α纳米抗体V7与各浓度梯度TNF-α样品混合并摇匀，室温孵育5min后将样品吸到毛细管中，并将毛细管放置于Monolith NT.115仪器中进行检测。
如图1B所示，TNF-α纳米抗体V7及TNF-α纳米抗体V7和鼠源s-TNF-α的解离常数达到146nM。
实施例3
本发明所述的ANX1的制备方法，包括如下步骤：
通过酶切和酶联反应将如SEQ ID No.1所示的ANX1基因导入pET28a载体，构建质粒；
将目的质粒转入BL21感受态细胞，转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液。通过柱层析进行分离纯化，具体操作步骤如TNF-α纳米抗体纯化过程，制得重组ANX1蛋白。
实施例4
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7在10mg/kg的剂量下对3％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠具有明显的治疗效果，具体步骤如下：
选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导8天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg TNF-α纳米抗体V7，给药周期为三天一次。
每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
如图2A所示，10mg/kg(18.40g±0.9959g，P＝0.0304)和5mg/kg(18.15g±0.5949g，P＝0.014)组的小鼠体重显著高于DSS组(17.03g±2.443g)，而1mg/kg(18.01g±1.674g，P＝0.3397)组的小鼠体重无显著变化。如图2B所示，治疗后，与DSS组相比，10mg/kg和5mg/kg组的结肠损伤更少。这表明在10mg/kg的剂量下，TNF-α纳米抗体V7对DSS小鼠有良好的治疗效果，为TNF-α纳米抗体V7的最佳治疗剂量。
实施例5
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7导致DSS小鼠结肠Th17细胞增加，具体步骤如下：
将小鼠脱颈处死后剖开腹腔，取结肠。
用棉签将结肠中残留的粪便排清，用PBS溶液冲洗结肠数次。
将结肠纵向剖开，翻转结肠使粘膜面向外置于盛有20ml(含1mmol/L DTT和1mmol/L EDTA的D-Hank’s溶液)的锥形瓶中，37℃孵育1h。
将消化后的结肠剪碎放入盛有20ml胶原酶消化液(RPMI1640培养液+1mg/ml的胶原蛋白酶Ⅰ)的锥形瓶中，37℃孵育1h。
将消化液经300目尼龙筛网过滤后，离心(300g，10min，4℃)，弃上清，用RPMI1640培养液洗涤两次。
将细胞重悬于5ml 40％ Percoll，在离心管底部轻轻加入4ml 70％ Percoll，将细胞重悬液轻轻加入，使两层液体间形成清晰的液面，制成Percoll梯度分离液，离心(600g，20min，25℃)，收取40％ Percoll与70％ Percoll界面间的固有层淋巴细胞。
用RPMI1640培养液清洗3次，用1％BSA的PBS重悬细胞备用。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，用1％BSA的PBS重悬细胞。加入CD4，IL-17A抗体4℃孵育标记Th17细胞，使用流式细胞仪进行分析。
如图3A所示，与DSS小鼠(19.82％±2.06％)相比，TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)治疗后小鼠的肠道Th17细胞显著增加(31.11％±2.787％)。
实施例6
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7治疗中DSS小鼠Th17的增加与CD11c+DC细胞的吞噬相关，具体步骤如下：
取3％ DSS造模5天的小鼠，腹腔注射TNF-α纳米抗体V7-BFP(Blue FluorescentProtein)10mg/kg。
2小时后，提取小鼠结肠固有层淋巴细胞(Lamina propria lymphocytes,LPL)，加入CD11c+，MHCII抗体4℃孵育标记，使用流式细胞仪进行分析。
如图3B所示，与PBS组相比，经过治疗后的小鼠结肠的CD11c+DC有明显的BFP荧光，并且伴随着MHCII的上调。这表明V7治疗过程中，TNF-α纳米抗体V7被吞噬进入CD11c+DC细胞中。
实施例7
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7治疗中Th17扩增与TNF-α纳米抗体V7-TNF-α复合体吞噬相关，具体步骤如下：
从3％ DSS造模5天的小鼠和WT小鼠中提取小鼠结肠固有层淋巴细胞。
对细胞进行以下三种处理：
①用TNF-α纳米抗体V7(10μg/ml)刺激2h，加入CD4，IL-17A抗体4℃孵育标记Th17细胞，使用流式细胞仪进行分析。
②用TNF-α纳米抗体V7-BFP(10μg/ml)刺激2h，加入CD11c+，MHCII抗体4℃孵育标记，使用流式细胞仪进行分析。
③用TNF-α纳米抗体V7(10μg/ml)刺激2h，离心(250g，4min，4℃)，弃上清，加入1ml预冷的Trizol提取RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA。按试剂盒说明书方法避光配置qPCR反应体系，设定反应条件在仪器中扩增。
如图4A所示，TNF-α纳米抗体V7(10μg/ml)刺激使得DSS小鼠结肠LPL中的Th17细胞显著增加(TNF-α纳米抗体V7，17.66％±1.598％；PBS，29.34％±3.818％)，而在WT小鼠中没有显著变化(TNF-α纳米抗体V7，7.567％±0.7021％；PBS，7.24％±2.01％)。
如图4B所示，来自DSS结肠的BFP阳性CD11c+DC明显多于WT结肠的BFP阳性CD11c+DC(DSS，36.8％±2.100％；WT，9.930％±1.601％)考虑到TNF-α在DSS小鼠的结肠中高表达，TNF-α纳米抗体V7治疗后在DSS小鼠结肠中形成TNF-α纳米抗体V7-TNF复合物的量也越多，这表明TNF-α纳米抗体V7-TNF复合物更可能是BFP阳性信号的来源。
如图4C所示，TNF-α纳米抗体V7刺激后，DSS小鼠结肠的CD11c+DC中MHCII也上调，而WT小鼠结肠的CD11c+DC中MHCII不上调。
如图4D所示，在DSS小鼠的LPL中，TNF-α纳米抗体V7(10μg/ml)刺激后，DSS小鼠结肠中对抗原呈递至关重要的H2a、CIITA和CD74显著上调。
实施例8
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物可被CD11c+RAW264.7吞噬，具体步骤如下：
RAW264.7在6孔板(105个细胞/孔)中培养。
TNF-α纳米抗体V7-BFP(10μg)和TNF-α(2μg)在37℃下孵育1小时，形成TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物。
然后将复合物添加到RAW264.7中，并在37℃下一起培养1h。
标记CD11c+抗体4℃孵育标记，使用流式细胞仪进行分析。
如图5B所示，TNF-α纳米抗体V7被吞噬后，在CD11c+CD11b+/CD11b-RAW264.7中，呈BFP阳性；而单独TNF-α纳米抗体V7刺激RAW264.7细胞中则没有(TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物，23.63％±1.960％，TNF-α纳米抗体V7，2327％±0.0832％，P<0.0001)。
实施例9
本发明证明了RAW264.7吞噬TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物具有抗原呈递的特征，具体步骤如下：
RAW264.7在6孔板(105个细胞/孔)中培养。
TNF-α纳米抗体V7-BFP和TNF-α在37℃下孵育1小时，形成TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物。
然后将复合物添加到RAW264.7中，并在37℃下一起培养1h，构建了两种吞噬的复合物RAW264.7(Complex phagocytized RAW264.7cells，CPR)：
CPR-1：RAW264.7吞噬复合物1(2μg TNF-α+10μg TNF-α纳米抗体V7)
CPR-2：RAW264.7吞噬复合物2(6μg TNF-α+30μg TNF-α纳米抗体V7)
流式细胞仪分析TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR中BFP荧光；qRT-PCR测定抗原呈递相关因子的转录水平。
如图6A所示，随着复合物含量的增加，RAW264.7吞噬的量显著增加(CPR-1，12.30％±5.499％；CPR-2，73.42％±3.73％，P<0.0001)。
如图6B所示，对于TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2，与RAW264.7相比，MHCII、CIITA、CD74和H2Aa显著上调，这提示CPR-2具有抗原递呈特征。此外，与RAW264.7相比，CPR-2刺中TGF-β和IL-6也上调，TGF-β和IL-6是刺激Th17分化的细胞因子，这表明CPR-2可能会促进Th17的生成。
实施例10
本发明证明了CPR使得WT小鼠结肠Th17扩增，具体步骤如下：
从WT小鼠结肠分离LPL。
用RAW264.7(105细胞)、CPR-1(105细胞)和CPR-2(105细胞)体外刺激2小时。
加入CD4，IL-17A抗体4℃孵育标记Th17细胞，使用流式细胞仪进行分析。定量qRT-PCR测定抗原呈递相关因子的转录水平。
如图7A所示，CPR-2和CPR-1均比RAW264.7显著诱导Th17细胞分化(CPR-2，15.46％±2.474％；CPR-1，9.183％±1.808％；RAW264.7，5.277％±0.6799％)。然而，与PBS相比，肠道Th17细胞对RAW264.7刺激也有反应(2.797％±0.7223％)。
如图7B所示，TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR体外刺激LPL时，CPR-1和CPR-2组的RORα、RORγt、IL-23和IL-17A均较PBS组上调；而与PBS相比，RAW264.7处理组中只有RORγt和IL-17A上调。提示CPR在体外能显著诱导肠Th17细胞分化。
实施例11
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR使得WT小鼠肠系膜淋巴结中Th17扩增，具体步骤如下：
取WT小鼠肠系膜淋巴结(Mesenteric lymphocyte nodes，mLN)，用磨砂玻片研磨并用PBS冲洗收集。
通过300目尼龙网后，收集切除的mLN。
用RPMI1640培养液清洗3次，用1％BSA的PBS重悬细胞备用。
以RAW264.7(105细胞)、CPR-1(105细胞)和CPR-2(105细胞)进行体外刺激2小时。
冰上孵育CD4，IL-17A抗体30min后，使用流式细胞仪进行检测。
如图8所示，RAW264.7相比，TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2仍然诱导Th17细胞数量显著增加(CPR-2，35.18％±3.419％；RAW264.7，19.78％±3.582％)。然而，比较CPR-1(CPR-1，22.02％±2.314％)和RAW264.7诱导的Th17细胞数量却发现没有显著变化。与PBS(13.29％±3.065％)相比，RAW264.7没有显著诱导Th17细胞分化。这表明体外CPR也可以诱导mLN中的Th17细胞，但与诱导肠LPL中Th17细胞的生成并不完全相同。
实施例12
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR通过MHCII在体外影响Th17细胞，具体步骤如下：
使用GenScript的siRNA设计中心合成了对应于编码区(5′-AAGAGAATCGAACTCACTCAG-3′)的小鼠CIITA siRNA。
并将小鼠CIITA siRNA编码DNA经BamH1和HindIII限制性酶插入pRNAU6.1/Neo。
将重组pRNAU6.1/Neo-CIITA转化到DH5α细胞中。
将2×105RAW264.7细胞接种在6孔板的每个孔中。
将2μg DNA和4μL LipofectAMINE 2000的复合物37℃孵育15min转染细胞。
转染后48小时，收集细胞，并通过qRT-PCR分析验证CIITA的表达。
如图9A所示，将shRNA干扰质粒转染RAW264.7后，MHCII的表达有着极显著的下调。如图9B所示，而在ΔCIITA-RAW264.7吞噬复合物2(CPR2)后所形成的ΔCIITA-CPR-2中，TGF-β和IL-6的表达均有极显著下调。
取WT小鼠的LPL和mLN细胞，用ΔCIITA-CPR-2(105细胞)和CPR-2(105细胞)体外刺激2h。
冰上孵育CD4，IL-17A抗体30min后，使用流式细胞仪进行检测。
如图10A所示，与ΔCIITA-CPR-2(6.050％±0.5507％)相比，CPR-2(10.60％±0.1572％)诱导了更多的肠道Th17细胞。如图10B所示，与ΔCIITA-CPR-2(6.003％±0.9445％)相比，CPR-2诱导mLN的Th17细胞更多(10.25％±0.9305％)。因此，CPR可以诱导mLN和肠道Th17细胞，这一过程依赖于MHCII。
实施例13
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2显著上调结肠中的ANX1，具体步骤如下：
取WT小鼠的LPL，用ΔCIITA-CPR-2(105细胞)和CPR-2(105细胞)体外刺激2h。
通过qRT-PCR分析验证ANX1的表达。
如图11A所示，与ΔCIITA-CPR-2相比，CPR-2显著上调结肠中的ANX1，而与RAW264.7和PBS处理相比，未发现显著变化。此外，与PBS相比，ΔCIITA-CPR-2中ANX1的表达也没有显著变化。这一趋势与CPR-2刺激下的肠道Th17细胞一致，表明ANX1和Th17细胞之间存在相关性。
取WT小鼠的结肠LPL和MLN，用CPR-2(105细胞)刺激2小时。
用1％多聚甲醛固定1小时。
用ANX1-mCherry标记固定细胞，并通过流式细胞仪进行分析。
如图11B所示，经过TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2刺激后来自结肠和mLN的细胞均能与ANX1呈阳性结合。这表明CPR-2治疗后ANX1结合受体上调。
实施例14
本发明证明了ANX1激活FPR2，具体步骤如下：
取WT小鼠的结肠LPL和MLN。
用TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2(105细胞)，ANX1(1μg/ml)，WRW4(10μg/ml)刺激2小时。
通过qRT-PCR分析验证FPR1，FPR2，FPR3的表达。
如图12A所示，与TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2单独刺激相比，FPR2与ANX1和CPR-2共同刺激LPL时表现出显著的上调。这表明FPR2在Th17细胞分化过程中被ANX1激活。如图12B所示，在ANX1和CPR-2共同刺激的结肠LPL中，WRW4(10μg/ml)显著下调FPR2。
实施例15
本发明证明了ANX1通过FPR2抑制TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR诱导的Th17细胞分化，具体步骤如下：
取WT小鼠的结肠LPL和MLN。
用TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2(105细胞)，ANX1(1μg/ml)，WRW4(10μg/ml)刺激2小时。
冰上孵育CD4，IL-17A抗体30min后，使用流式细胞仪进行检测。
如图13所示，ANX1能显著抑制CPR-2诱导的肠Th17细胞分化(CPR-2，32.46％±2.622％；CPR-2+ANX1，16.72％±1.425％)；而在mLN中，由CPR-2诱导的分化Th17细胞也被ANX1抑制(CPR-2，30.43％±1.218％；CPR-2+ANX1，9.22％±1.255％)。此外，WRW4(结肠：CPR-2+ANX1+WRW4，37.49％±7.253％；mLN：CPR-2+ANX1+WRW4，22.31％±0.8600％。这些结果表明，ANX1可激活FPR2，并抑制CPR诱导的Th17细胞分化。
实施例16
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2通过STAT3途径介导Th17分化，具体步骤如下：
取WT小鼠的结肠LPL。
用TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2(105细胞)，ANX1(1μg/ml)，ANX1(0.5μg/ml)，WRW4(10μg/ml)刺激2小时。
通过Western Blot检测STAT3和p-STAT3的表达。
采用qRT-PCR检测其中SOCS3、RORγt、IL-17A、IL-17F和IL-23的表达。
如图14A所示，与PBS处理相比，CPR-2刺激使得STAT3的磷酸化水平上调；加入ANX1后，p-STAT3的表达降低并且呈现出剂量依赖性；与ANX1和CPR-2治疗组相比，添加CPR-2后，p-STAT3的表达增加。
如图14B所示，与TNF-α纳米抗体V7-TNF-α抗原/抗体复合物CPR-2治疗组相比，ANX1治疗组SOCS3、RORγt、IL-17A和IL-23表达下调；添加WRW4后，SOCS3、RORγt、IL-17A和IL-23的表达显著上调。这些结果表明，CPR-2和FRP2诱导的Th17细胞分化的调节是通过STAT3途径介导的。
试验例1
本发明证明了ANX1在对DSS诱导的结肠炎有治疗效果，具体步骤如下：
选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导8天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射ANX1 100μg/kg，500μg/kg，2mg/kg，给药周期为三天一次。
每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
如图15所示，500μg/kg组的结肠长度和体重与对照组更接近，且明显高于DSS组，表明在500μg/kg的剂量下，ANX1对DSS诱导的结肠炎有一定的治疗效果，为最佳治疗剂量。
本发明证明了TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)抗体与ANX1(500μg/kg)联用，可以提高TNF-α纳米抗体V7对DSS小鼠结肠炎的治疗效果，具体步骤如下：
选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导11天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射ANX1(500μg/kg)和TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)给药周期为三天一次。
每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
如图16A所示，在第11天，联合治疗组小鼠的体重显著高于DSS小鼠和TNF-α纳米抗体V7治疗组小鼠(TNF-α纳米抗体V7+ANX1，19.62g±0.4729g；DSS组，15.12g±1.294g，P＝0.0012；TNF-α纳米抗体V7，18.77g±1.038g，P＝0.0328)；而ANX1处理的小鼠之间没有显著变化(ANX1，18.59g±1.274g，P＝0.05024)。
如图16B所示，对于结肠长度的宏观分析，ANX1/TNF-α纳米抗体V7处理的结肠明显长于DSS小鼠和ANX1处理的小鼠(TNF-α纳米抗体V7+ANX1，6.2cm±0.5cm与DSS组相比，P＝0.0057；ANX1，5.367cm±0.1155cm，P＝0.0482)；而TNF-α纳米抗体V7处理的小鼠之间没有显著变化(V7，5.3cm±0.4359cm，P＝0.0785)。
如图16C所示，在第7天，在DSS、TNF-α纳米抗体V7和ANX1中观察到明显的肛门出血，而在ANX1/V7处理的小鼠中没有观察到。
如图16D所示，结合体重减轻百分比、粪便血液和粪便粘度，计算疾病活动指数(DAI)[35]。ANX1/V7的DAI显著低于DSS、TNF-α纳米抗体V7和ANX1处理的小鼠(ANX1/V7，1.175±0.1667与DSS相比，4.00±0.00，P<0.0001；TNF-α纳米抗体V7，2.583±0.631，P＝0.032，ANX1，2.083±0.1667，P＝0.046)。这表明，与单独使用V7或ANX1治疗相比，TNF-α纳米抗体V7和ANX1联合使用可具有明显提高的DSS诱导的结肠炎的治疗效果。
试验例2
本发明证明了ANX1(500μg/kg)减少了TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)抗体治疗DSS小鼠时Th17的扩增，具体步骤如下：
选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导11天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射ANX1(500μg/kg)和TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)给药周期为三天一次。
取小鼠的LPL和mLN。
冰上孵育CD4，IL-17A抗体30min后，使用流式细胞仪进行检测。
如图17所示，在结肠LPL和mLN中，TNF-α纳米抗体V7处理的小鼠的Th17细胞显著低于ANX1/TNF-α纳米抗体V7处理的小鼠(mLN：TNF-α纳米抗体V7/ANX1，5.93％±0.2883％与TNF-α纳米抗体V7相比，8.923％±1.25％，P＝0.0156；结肠：TNF-α纳米抗体V7/ANX1，4.963％±0.9839％与TNF-α纳米抗体V7相比，11.87％±1.344％，P＝0.0002)。这表明，与anti-TNF单药治疗相比，联合ANX1治疗对Th17细胞分化具有更好的疗效。
试验例3
本发明证明了ANX1(500μg/kg)可通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)处理引起的Th17细胞分化，具体步骤如下：
选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导11天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射ANX1(500μg/kg)和TNF-α纳米抗体V7(10mg/kg)给药周期为三天一次。
通过Western Blot检测STAT3和p-STAT3的表达。
通过qRT-PCR分析验证FPR2的表达。
如图18A所示，与TNF-α纳米抗体V7或ANX1处理的小鼠相比，TNF-α纳米抗体V7/ANX1组FPR2的表达显著上调。如图18B所示，TNF-α纳米抗体V7组中STAT3的磷酸化水平明显高于DSS组。ANX1/TNF-α纳米抗体V7组的p-STAT3水平明显低于TNF-α纳米抗体V7组和ANX1组。这些结果表明ANX1可通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体V7治疗引起的Th17细胞分化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备炎症药物中的应用。
2.一种膜联蛋白ANX1和TNF-α纳米抗体联用在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
3.一种组合药物，其特征在于：所述的组合药物由权利要求1所述的TNF-α纳米抗体和膜联蛋白ANX1组成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的膜联蛋白ANX1的氨基酸序列为SEQID No.1所示，具有抑制Th17细胞分化和治疗溃疡性结肠炎的能力。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的膜联蛋白ANX1具有抑制Th17细胞分化的能力。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的膜联蛋白ANX1通过FPR2-STAT3通路抑制TNF-α纳米抗体处理引起Th17细胞分化。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.2或3或4限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.2或3或4所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
所述的TNF-α纳米抗体与TNF-α抗原/抗体复合物促进巨噬细胞的吞噬能力和抗原递呈特征、并与Th17细胞分化相关。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V7、TNF-α纳米抗体V1或TNF-α纳米抗体V19中的任意一种，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述的TNF-α纳米抗体与TNF-α抗原/抗体复合物CPR和FRP2诱导的Th17细胞分化的调节是通过STAT3途径介导的。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在自身免疫性结肠炎小鼠模型中，人重组ANX1通过调节SOCS3/STAT3信号传导，限制Th17细胞的发育来发挥其免疫抑制的作用，从而减轻了疾病的严重程度。
10.权利要求1至6任一项所述的ANX1的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)通过酶切和酶联反应将如SEQ ID No.1所示的ANX1基因导入pET28a载体，构建质粒；
(2)将目的质粒转入BL21感受态细胞，转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养；
(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h；通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液；通过柱层析进行分离纯化，具体操作过程同TNF-α纳米抗体的制备方法，制得重组ANX1蛋白。
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