CN117018185A - TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了TNF‑α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。具有增加TNF‑α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果。PGE2增加TNF‑α纳米抗体上调TNFR2表达的效果。PGE2通过EP4增加TNF‑α纳米抗体上调TNFR2表达、诱导Treg细胞生成。本发明所述的TNF‑α纳米抗体与PGE2联用方法在制备Treg细胞减少、或Th17细胞增加相关疾病药物中的应用。所述的应用方法对结肠炎的治疗效果更加显著，能刺激Treg细胞增加，减少Th17的生成，减少Th17所致的毒副作用。

Description

TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种易复发的自身免疫性疾病，属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一种。其常见症状包括血性腹泻、便血、腹痛、体重减轻、呕吐和里急后重等。溃疡性结肠炎通常会影响病人结肠和直肠的最内层粘膜，症状表现为持续的炎症和溃疡。IBD的致病机制尚不明确，遗传、免疫和环境因素都参与了其发展。
在过去的20年中，炎症性肠病的发病率在全球范围内稳步上升，其在西欧、美国和澳大利亚的患病率显著高于世界范围的其他地区。从1956年第一例溃疡性结肠炎确诊开始，中国IBD的发病率和发生率都在不断地增加，尤其是进入21世纪后，相关的文献和病患数有了大幅度上升。
调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)和辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)失衡被认为是炎症性肠病主要发生原因之一。Treg是维持免疫稳态的重要细胞，其功能障碍是自身免疫性疾病的主要特征。Treg可通过多种机制进行免疫抑制，在多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病(T1D)、甲状腺炎和炎症性肠病(IBD)的患者中都能发现Treg数量减少和功能受损。
Th17是一种独特的T细胞亚群，其特征在于产生大量的IL-17A，IL-17F，TNF-α，IL-22，IL-21和GM-CSF等细胞因子。Th17在IBD患者肠道中大量增加，与正常肠道相比，在CD和UC患者的粘膜中均检测到高转录水平的IL-17A。
近几年TNF-α抗体如阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普被广泛用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和强直性脊柱炎等自身免疫性疾病。研究表明，anti-TNF抗体可以增加IBD患者肠道中调节性T细胞比例，进而增强免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β表达分泌，维持肠道免疫稳态。最近研究表明，anti-TNF抗体可以通过刺激DC表达tmTNF，并作为配体与TNFR2结合，刺激Treg增加。然而在一些自身免疫性疾病的治疗中发现anti-TNF疗法会使得Th17扩增，造成银屑病等副作用的发生。这表明目前市售TNF-α抗体治疗效果及毒副作用方面仍有较大不足。
前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是一种重要的细胞生长和调节因子，是前列腺素的一种，也是重要的疼痛递质之一，存在于动物和人体中。它的主要作用是扩张血管，增加器官的血流量，可以降低外周阻力，降低血压；使支气管平滑肌舒张，降低通气阻力；抑制胃酸分泌；同时具有免疫抑制和抗炎作用。在临床上，PGE2在妊娠维持和分娩启动中起关键性作用。PGE2可以通过四种不同类型的受体发挥功能，分别为EP1，EP2，EP3和EP4。PGE2通过EP4在DSS诱导的结肠炎中发挥抗炎作用，择性EP4激动剂ONO-4819CD被证明对UC患者有效。
在过去的10多年时间里，TNF-α抗体一直高居全世界药物销售的首位，成为名副其实的“药王”，但是其副作用一直未得以克服。而，将TNF-α抗体与PGE2联用方法治疗溃疡性结肠炎，究竟是怎样的效果，这也是从未尝试和报道过的新的探索。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的一种克服TNF-α抗体治疗效果及其副作用的方法，即TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
进一步地，具有增加TNF-α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果。
进一步地，TNF-α纳米抗体能够治疗溃疡性结肠炎，PGE2增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达的效果。
更进一步地，PGE2通过EP4增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达、诱导Treg细胞生成。
本发明所述的TNF-α纳米抗体与PGE2联用方法在制备Treg细胞减少、或Th17细胞增加相关疾病药物中的应用。
进一步地，所述TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.1或2或3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
进一步地，所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V19或TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
进一步地，TNF-α纳米抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)通过酶切酶联反应将TNF-α纳米抗体的编码基因导入pET28a载体，构建重组表达质粒；
(2)将TNF-α纳米抗体的重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，第一次离心后弃上清，留下少许培养基重悬菌液；
(3)转化后取适量菌液涂布在含有K+的LB平板上37℃过夜培养；
(4)挑取阳性克隆在含K+的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h，表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签；
(5)通过第二次离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，第三次离心后收取上清液；
(6)使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的蛋白TNF-α纳米抗体结合在Ni-NTA上，之后使用蛋白洗脱液进行洗脱；
(7)在4℃条件下使用HRV3C等常规蛋白酶剪切TNF-α纳米抗体蛋白上的His标签12h；
(8)将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存，保存温度为-80℃，制得TNF-α纳米抗体。
进一步地，在步骤(2)中，所述的第一次离心的速率为2500rpm，离心的时间为5min；在步骤(5)中，所述的第二次离心的速率为4000rpm，离心的时间为20min，离心的温度为4℃；所述的第三次离心的速率为12000rpm，离心的时间为30min，离心的温度为4℃。
进一步地，在步骤(6)中，所述的蛋白缓冲液由300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白缓冲液的pH为7.8。
更进一步地，在步骤(6)中，所述的蛋白洗脱液由80mM imidazole，300mM NaCl，50mM Tris-HCl和0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白洗脱液的pH为7.8；在步骤(8)中，用12％ SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。
有益效果：本发明能够产生比TNF-α纳米抗体或者PGE2单独治疗溃疡性结肠炎更显著的治疗效果，同时增加TNF-α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果，减少TNF-α抗体治疗时产生的毒副作用。
与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明的TNF-α纳米抗体与PGE2联用方法简便、易行。TNF-α纳米抗体与PGE2联用方法显著增加TNF-α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果。PGE2能够增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达的效果；PGE2通过EP4增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达、诱导Treg细胞生成。TNF-α纳米抗体与PGE2联用方法能够应用于制备Treg细胞减少、或Th17细胞增加相关疾病药物。
附图说明
图1为本发明的TNF-α纳米抗体V19的纯化与表征图；A：1泳道表示BL21表达TNF-α纳米抗体V19后的上清液；2泳道表示使用Tris-HCl(80mM咪唑)洗脱液洗脱后的TNF-α纳米抗体V19；3泳道表示切除His标签的TNF-α纳米抗体V19。B：通过MST检测TNF-α纳米抗体V19与人源和鼠源TNF-α的亲和力。
图2为本发明的不同剂量TNF-α纳米抗体V19对DSS小鼠体重及结肠长度的影响图；A：各组小鼠结肠长度比较；B：各组小鼠体重随时间变化的趋势比较。
图3为本发明PGE2对DSS小鼠结肠长度和体重的影响图。A：各组小鼠结肠长度比较；B：各组小鼠体重随时间变化的趋势比较。
图4为本发明PGE2、TNF-α纳米抗体V19单用以及联用对DSS小鼠的疗效比较图。A：给药方案；B：各组小鼠结肠长度比较；C：各组小鼠体重随时间变化的趋势比较；D：各组小鼠结肠组织病理损伤评价。
图5为本发明PGE2、TNF-α纳米抗体V19单用及联用对DSS小鼠结肠Treg细胞比例的影响图。A：流式细胞术检测TNF-α纳米抗体V19和PGE2诱导的小鼠外周血中总的Treg和凋亡的Treg细胞；B：统计各组细胞比例。
图6为本发明PGE2、TNF-α纳米抗体V19单用及联用对DSS小鼠结肠Th17细胞比例的影响图。A：代表性流式散点图，其中CD4+IL-17+为Th17细胞；B：各组结肠Th17细胞比例统计分析。
图7为本发明PGE2通过EP4途径上调TNFR2表达图。A：qRT-PCR检测各实验组小鼠外周血中TNFR2的表达水平；B：qRT-PCR检测PGE2和CJ-42794处理的小鼠外周血中TNFR2的表达水平。
图8为本发明PGE2-EP4途径参与Treg细胞的生成过程图。A：流式细胞术检测TNF-α纳米抗体V19，PGE2和CJ-42794处理的DSS小鼠外周血中Treg细胞；B：统计各处理组中Treg细胞比例。
图9为本发明TNF-α纳米抗体V19和PGE2联用不影响TNFR2-/-小鼠外周血中Treg生成图。A：流式细胞术检测在TNF-α纳米抗体V19和PGE2处理不同时间下WT和TNFR2-/-小鼠外周血中Treg细胞；B：统计并绘制不同处理条件下Treg细胞比例随时间的变化曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明中的数据主要以TNF-α纳米抗体V19为例，其他TNF-α纳米抗体(如TNF-α纳米抗体V7)也具有类似的活性，本申请书中未予以重复呈现相同的实验结果。
实施例1
本发明的TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
具有增加TNF-α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果。TNF-α纳米抗体能够治疗溃疡性结肠炎，PGE2增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达的效果。PGE2通过EP4增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达、诱导Treg细胞生成。
本发明所述的TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备Treg细胞减少、或Th17细胞增加相关疾病药物中的应用。
所述TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.1或2或3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V19或TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
本发明TNF-α纳米抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)通过酶切酶联反应将TNF-α纳米抗体的编码基因导入pET28a载体，构建重组表达质粒；
(2)将TNF-α纳米抗体的重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，第一次离心后弃上清，留下少许培养基重悬菌液；所述的第一次离心的速率为2500rpm，离心的时间为5min；
(3)转化后取适量菌液涂布在含有K+的LB平板上37℃过夜培养；
(4)挑取阳性克隆在含K+的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h，表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签；
(5)通过第二次离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，第三次离心后收取上清液；所述的第二次离心的速率为4000rpm，离心的时间为20min，离心的温度为4℃；所述的第三次离心的速率为12000rpm，离心的时间为30min，离心的温度为4℃。
(6)使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的蛋白TNF-α纳米抗体结合在Ni-NTA上，之后使用蛋白洗脱液进行洗脱；所述的蛋白缓冲液由300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白缓冲液的pH为7.8。所述的蛋白洗脱液由80mM imidazole，300mM NaCl，50mM Tris-HCl和0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白洗脱液的pH为7.8；
(7)在4℃条件下使用HRV3C等常规蛋白酶剪切TNF-α纳米抗体蛋白上的His标签12h；
(8)将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存，保存温度为-80℃，制得TNF-α纳米抗体。用12％ SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。
试验例1
本发明首先在大肠杆菌中原核表达TNF-α纳米抗体，具体步骤为：
通过酶切酶联反应将TNF-α纳米抗体的编码基因导入pET28a载体，构建质粒。
将目的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，离心(2500rpm，5min)后弃上清，留下少许培养基重悬菌液。
转化后取适量菌液涂布在含有K+的LB平板上37℃过夜培养。
挑取阳性克隆在含K+的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签。
通过离心(4000rpm，20min，4℃)收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心(12000rpm，30min，4℃)后收取上清液。
蛋白缓冲液配方：
①300mM NaCl
②50mM Tris-HCl
③0.5mMβ-巯基乙醇
④pH 7.8
使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的蛋白V19结合在Ni-NTA上，之后使用洗脱液进行洗脱。
蛋白洗脱液配方：
①80mM imidazole
②300mM NaCl
③50mM Tris-HCl
⑤0.5mMβ-巯基乙醇
⑥pH 7.8
在4℃条件下使用HRV3C酶剪切TNF-α纳米抗体蛋白上的His标签12h。
将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存(-80℃)。
用12％ SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。
如图1A所示，孔道1为总蛋白，孔道2为纯化后的蛋白，孔道3为切除His标签后的TNF-α纳米抗体。
试验例2
本发明通过MST实验检测了纯化的TNF-α纳米抗体对可溶性TNF-α(s-TNF-α)的亲和力，具体步骤为：
使用MST缓冲液(50mM HEPES，100mM KCl，0.05％ Tween-20)配制100nM的TNF-α纳米抗体溶液。
使用PBST缓冲液制备10μM的人源或鼠源的TNF-α溶液。
TNF-α溶液的最高配体浓度为5μM，并按照16步梯度稀释法进行稀释，每个稀释系列样品的最终体积为10μl。
将10μl 100nM的TNF-α纳米抗体与各浓度梯度TNF-α样品混合并摇匀，室温孵育5min后将样品吸到毛细管中，并将毛细管放置于Monolith NT.115仪器中进行检测。
如图1B所示，TNF-α纳米抗体V19和人源s-TNF-α的解离常数达到6.5pM，TNF-α纳米抗体1和鼠源s-TNF-α的解离常数达到0.21nM。TNF-α纳米抗体1和人源s-TNF-α的解离常数达到85nM。
试验例3
本发明证明了TNF-α纳米抗体在10μg/kg的剂量下对3％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠具有明显的治疗效果，具体步骤如下：
1)选用6-8周C57BL/6雌性小鼠(体重17～19g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导7天。
2)从造模第二天开始，小鼠腹腔注射TNF-α纳米抗体2.5μg/kg，5μg/kg，10μg/kg，给药周期为三天一次。
3)每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
4)如图2所示，5μg/kg TNF-α纳米抗体组和10μg/kg TNF-α纳米抗体组的结肠长度和体重与对照组更接近，且明显高于DSS组，表明在5μg/kg和10μg/kg的剂量下，TNF-α纳米抗体对DSS诱导的结肠炎有一定的治疗效果，而10μg/kg组的效果最佳，为TNF-α纳米抗体的最佳治疗剂量。
试验例4
本发明证明了PGE2在1mg/kg的剂量下对3％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠具有明显的治疗效果，具体步骤如下：
选用6-8周C57BL/6雌性小鼠(体重17～19g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导7天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射PGE2 0.1mg/kg，1mg/kg，给药周期为一天一次。
每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
如图3所示，在1mg/kg的剂量下，PGE2治疗的小鼠体重和结肠长度与对照组接近，明显高于DSS组，表明在1mg/kg的剂量下，PGE2对DSS诱导的结肠炎有一定的治疗效果。
试验例5
本发明证明了TNF-α纳米抗体(10μg/kg)与PGE2(1mg/kg)联用，可以提高TNF-α纳米抗体对DSS小鼠结肠炎的治疗效果，具体步骤如下：
选用6-8周C57BL/6雌性小鼠(体重17～19g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导7天。
从造模第二天开始，小鼠腹腔注射PGE2 1mg/kg，给药周期为一天一次；小鼠腹腔注射TNF-α纳米抗体10μg/kg，给药周期为三天一次。
每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。
如图4所示，联合疗法组小数的结肠长度及体重与健康对照组之间没有明显差别。并且，与单用TNF-α纳米抗体组和PGE2组相比，效果更明显。与之对应，H&E染色结果表明，联合疗法组的小鼠的结肠横断面的完整性也最佳。以上结果表明，TNF-α纳米抗体(10μg/kg)抗体与PGE2(1mg/kg)联用，可以提高TNF-α纳米抗体对DSS小鼠结肠炎的治疗效果。
试验例6
本发明证明了PGE2(10μg/ml)与TNF-α纳米抗体(10μg/ml)联合体外刺激Treg细胞增加的比例比单独使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)体外刺激Treg细胞增加的比例多。具体步骤如下：
1)选用DSS诱导5天的小鼠，使用solarbio小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒(货号P8620)分离小鼠外周血淋巴细胞，步骤参考说明书：https://www.biomart.cn/infosupply/javascript:；https://www.biomart.cn/infosupply/jav ascript:；
①小鼠眼球取血至抗凝管中，用等体积的全血及组织稀释液稀释。
②在无菌15ml离心管中加入小鼠外周血淋巴细胞分离液3ml。
③将稀释后的血液缓慢均匀的加入到分离液中使之出现明显的分层，使用水平转子离心(900g，30min，25℃)。
④离心后出现明显分层，吸取中间淋巴细胞层转入新的15ml无菌离心管中，加入10ml PBS清洗，离心(300g，10min，4℃)。
⑤弃上清，重复上述步骤。
⑥弃上清，加入适量含有1％BSA的PBS重悬细胞备用。
使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)，PGE2(1mg/ml)在室温下刺激外周血淋巴细胞30min。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，用1％BSA的PBS重悬细胞。加入CD4，CD25和CD127抗体4℃孵育标记Treg细胞，使用流式细胞仪进行分析。
如图5所示，联用组中Treg的比例显著高于单用TNF-α纳米抗体组。
试验例7
本发明证明了PGE2(10μg/ml)与TNF-α纳米抗体(10μg/ml)联合体外刺激减少Th17的生成，减少毒副作用，具体步骤如下：
选用DSS诱导5天的小鼠，将小鼠脱颈处死后剖开腹腔，取结肠。
用棉签将结肠中残留的粪便排清，用PBS溶液冲洗结肠数次。
将结肠纵向剖开，翻转结肠使粘膜面向外置于盛有20ml(含1mmol/L DTT和1mmol/L EDTA的D-Hank’s溶液)的锥形瓶中，37℃孵育1h。
将消化后的结肠剪碎放入盛有20ml胶原酶消化液(RPMI1640培养液+1mg/ml的胶原蛋白酶Ⅰ)的锥形瓶中，37℃孵育1h。
将消化液经300目尼龙筛网过滤后，离心(300g，10min，4℃)，弃上清，用RPMI1640培养液洗涤两次。
将细胞重悬于5ml 40％ Percoll，在离心管底部轻轻加入4ml 70％ Percoll，将细胞重悬液轻轻加入，使两层液体间形成清晰的液面，制成Percoll梯度分离液，离心(600g，20min，25℃)，收取40％ Percoll与70％ Percoll界面间的固有层淋巴细胞。
用RPMI1640培养液清洗3次，用1％BSA的PBS重悬细胞备用。
使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)，PGE2(1mg/ml)在室温下刺激肠固有层淋巴细胞30min。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，用1％BSA的PBS重悬细胞。加入CD4，IL-17A抗体4℃孵育标记Th17细胞，使用流式细胞仪进行分析。
如图6所示，与DSS组相比，TNF-α纳米抗体组Th17细胞比例明显增加，而联合疗法组小鼠结肠中的Th17细胞明显低于TNF-α纳米抗体组，恢复到和对照组相近的水平。这表明PGE2(10μg/ml)与TNF-α纳米抗体(10μg/ml)联合体外刺激减少Th17的生成，减少毒副作用。
试验例8
本发明证明了PGE2通过EP4途径上调TNFR2表达，具体步骤如下：
选用DSS诱导5天的小鼠，使用小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒分离小鼠的外周血淋巴细胞。
使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)，PGE2(1mg/ml)，CJ-42794(1μg/ml)在室温下刺激外周血淋巴细胞30min。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，加入1ml预冷的Trizol提取RNA。
使用逆转录试剂盒合成cDNA。
按试剂盒说明书方法避光配置qPCR反应体系，设定反应条件在仪器中扩增。
如图7所示，与TNF-α纳米抗体组相比，联用组的TNFR2的表达水平明显上调。而加入EP4受体拮抗剂CJ-42794之后，PGE2对小鼠外周血中TNFR2的上调作用被阻断。这说明PGE2通过EP4途径上调TNFR2表达。
试验例9
PGE2通过EP4途径增加TNF-α纳米抗体诱导Treg的生成。选用DSS诱导5天的小鼠，使用小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒分离小鼠的外周血淋巴细胞。
使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)，PGE2(1mg/ml)，CJ-42794(1μg/ml)在室温下刺激外周血淋巴细胞30min。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，用1％BSA的PBS重悬细胞。加入CD4，CD25和CD127抗体4℃孵育标记Treg细胞，使用流式细胞仪进行分析。
如图8所示，CJ-42794可显著抑制TNF-α纳米抗体和PGE2所致的Treg细胞的比例升高。
试验例10
本发明通过TNFR2-/-小鼠验证TNFR2表达的上调对于PGE2在促进TNF-α纳米抗体诱导的Treg细胞的增加过程中是必需的，具体步骤如下：
选用DSS诱导5天的小鼠，使用小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒分离TNFR2-/-和WT小鼠的外周血淋巴细胞。
使用TNF-α纳米抗体(10μg/ml)，PGE2(1mg/ml)，CJ-42794(1μg/ml)在室温下刺激外周血淋巴细胞30min。
离心(250g，4min，4℃)，弃上清，用1％ BSA的PBS重悬细胞。加入CD4，IL-17A抗体4℃孵育标记Th17细胞，使用流式细胞仪进行分析。
如图9所示，TNF-α纳米抗体和PGE2共刺激的WT小鼠外周血中Treg显著增加，而处理TNFR2-/-小鼠外周血则不会。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.TNF-α纳米抗体与PGE2联用在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：具有增加TNF-α纳米抗体刺激Treg细胞生成和减少Th17生成的效果。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：TNF-α纳米抗体能够治疗溃疡性结肠炎，PGE2增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达的效果。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：PGE2通过EP4增加TNF-α纳米抗体上调TNFR2表达、诱导Treg细胞生成。
5.权利要求1所述的TNF-α纳米抗体与PGE2联用方法在制备Treg细胞减少、或Th17细胞增加相关疾病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述TNF-α纳米抗体具有如下氨基酸序列：
(1)由SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)与序列SEQ ID No.1或2或3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V19或TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：TNF-α纳米抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)通过酶切酶联反应将TNF-α纳米抗体的编码基因导入pET28a载体，构建重组表达质粒；
(2)将TNF-α纳米抗体的重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，第一次离心后弃上清，留下少许培养基重悬菌液；
(3)转化后取适量菌液涂布在含有K+的LB平板上37℃过夜培养；
(4)挑取阳性克隆在含K+的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h，表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签；
(5)通过第二次离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，第三次离心后收取上清液；
(6)使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的蛋白TNF-α纳米抗体结合在Ni-NTA上，之后使用蛋白洗脱液进行洗脱；
(7)在4℃条件下使用HRV3C等常规蛋白酶剪切TNF-α纳米抗体蛋白上的His标签12h；
(8)将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存，保存温度为-80℃，制得TNF-α纳米抗体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在步骤(2)中，所述的第一次离心的速率为2500rpm，离心的时间为5min；在步骤(5)中，所述的第二次离心的速率为4000rpm，离心的时间为20min，离心的温度为4℃；所述的第三次离心的速率为12000rpm，离心的时间为30min，离心的温度为4℃；在步骤(6)中，所述的蛋白缓冲液由300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白缓冲液的pH为7.8。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在步骤(6)中，所述的蛋白洗脱液由80mMimidazole，300mM NaCl，50mM Tris-HCl和0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白洗脱液的pH为7.8；在步骤(8)中，用12％SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。
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