JP2022518384A - ＨＩＦ－２アルファ（ＥＰＡＳ１）の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、その組成物及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤に関する。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びその使用方法を含む医薬組成物も開示されている。本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、標的化リガンド（例えば、インテグリンに対して親和性を有する化合物、例えば、α－ｖ－β－３及びα－ｖ－β－５インテグリン）及び薬物動態（ＰＫ）エンハンサーに結合又は複合させて、明細胞腎細胞癌細胞及び腫瘍への送達を容易にすることができる。インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物の送達は、ＨＩＦ－２α遺伝子発現の阻害を提供する。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ｃｃＲＣＣを含む種々の疾患及び障害の治療方法に用いることができる。

Description

配列表
この出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列リストを含む。ＡＳＣＩＩコピーの名前は３０６６３ ＳＥＱ ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔであり、サイズは２２７ｋｂである。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月９日出願の米国仮出願第６２／７９０，３６０号；２０１９年４月１日出願の米国仮出願第６２／８２７，５６４号；及び２０１９年４月２６日出願の米国仮出願第６２／８３９，３８１号に対する優先権を主張する。
発明の分野
本開示は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現の阻害のためのＲＮＡ干渉剤、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物、及びその使用方法に関する。
内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１（ＥＰＡＳ１）としても知られる低酸素誘導因子－２α（ＨＩＦ－２α、ＨＩＦ２－α、Ｈｉｆ２α、又はＨｉｆ２αと呼ばれる）は、利用可能な酸素の減少（低酸素症）に応答する低酸素誘導性転写因子である。ＨＩＦ－２αは、ＥＰＡＳ１遺伝子（別法として、本明細書では「ＨＩＦ－２α遺伝子」と称する）によってコードされ、その発現は、低酸素条件下でアップレギュレートされることが知られている。
高地に住むある種のヒト集団（チベット人など）では、低酸素環境下で体内の酸素輸送を改善するのに役立つＨＩＦ－２α遺伝子の特定の対立遺伝子変異体を保有するように、高い割合の集団が進化していることが発見された。しかしながら、より典型的な高地環境では、野生型ＥＰＡＳ１の過剰発現は、高血圧及び脳卒中の増加、ならびに赤血球の過剰産生による山岳病に類似した症状と関連している。この遺伝子の突然変異はまた、家族性４型赤血球増加症及び肺高血圧症と関連している。
注目すべきことに、ＨＩＦ－２αはヒトの種々の組織において広く発現されるが、ＨＩＦ－２αタンパク質は、腫瘍進行を含む種々の疾患に関与する種々の遺伝子の発現に、又はその発現を増強するために必要であると同定されている。例えば、ＨＩＦ－２αは、オートクリンループＶＥＧＦ－ｐＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲを促進することによって、及びＬＤＨＡの発現を増強することによって、成長優位性を付与することによって、ブドウ膜黒色腫の進行に役割を果たすと考えられている。
ＥＰＡＳ１はまた、ｃＭｙｃ（細胞増殖、形質転換、新生物及び腫瘍形成を促進し、ほとんどのがんで高度に発現する）、インターロイキン８（例えば、歯肉炎及び乾癬における炎症誘発性メディエーター）、ＳＰ－１（ＩＬ－８調節及びｃＭｙｃのコアクチベーターに関与する転写因子）、ＬＤＨ５（腫瘍壊死及び腫瘍サイズの増大と関連する）、及びＬＡＮＡ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスと関連する潜伏性関連核抗原）を含む他の因子と関連するか、又はその発現を上方制御することが示されている。さらに、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）活性は一般に、癌腫瘍増殖に必要な血管新生に役割を果たす可能性がある。例えば、ＨＩＦ－２αは、腎癌、明細胞腎細胞癌（及び他の癌の転移）、メラノーマ、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、関節リウマチ、ブドウ膜黒色腫、軟骨肉腫、及び多発性骨髄腫を含むいくつかの他の疾患に関与すると考えられている。ＥＰＡＳ１遺伝子の突然変異はまた、傍神経節腫、ソマトスタチノーマ及び／又は褐色細胞腫などの神経内分泌腫瘍の早期発症と相関している。突然変異は一般に、ＨＩＦ－２ａの一次水酸化部位に位置する体細胞ミスセンス突然変異である。これらの突然変異は、タンパク質の水酸化／分解メカニズムを破壊し、タンパク質の安定化及び偽低酸素シグナル伝達をもたらすと考えられている。さらに、神経内分泌腫瘍はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を循環血中に放出し、赤血球増加症を引き起こす。
より具体的には、ＨＩＦ－２αは明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）における腫瘍進行及び転移と関連している。高い割合のｃｃＲＣＣ腫瘍は、ＨＩＦ－２αを分解することができないＶｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌａｎｄａｕタンパク質の突然変異型を発現し、これは、ＨＩＦ－２αの蓄積及び腫瘍増殖及び転移を促進するＨＩＦ－２α調節遺伝子の活性化をもたらすと考えられている。
ｃｃＲＣＣのような癌を含む種々の疾患を治療するための生存可能な治療的処置が依然として必要である。同様に、ＨＩＦ－２αの発現を阻害し、及び／又は産生を減少させることができる治療薬製剤の必要性が引き続き存在する。単なる一例として、ｃｃＲＣＣ細胞におけるＨＩＦ－２α発現の実質的な減少は、望ましくない増殖を阻害することができ、さもなければこれらの癌細胞の進行を遅らせることができる。
遺伝子発現を阻害する１つの公知の方法は、遺伝子発現を阻害又はサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチドベースの薬物製剤（例えば、ＲＮＡｉ剤）を投与することによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介するものである。しかしながら、インビボで遺伝子発現をサイレンシングすることができる強力かつ安定なオリゴヌクレオチド配列を同定すること、ならびに治療を安全かつ選択的に所望の細胞又は組織に送達するための治療的に実行可能な方法を決定することの両方において、大きな課題が残されている。オリゴヌクレオチド系薬物は、とりわけ、比較的小さいサイズ及び固有の有機特性のために、生体内で投与された場合、容易かつ迅速に分解又は濾過される傾向があり、これらは、それらが意図された標的細胞及び／又は組織に到達するのを妨げることが多い。この制限を克服するために、例えば、リポソームへのカプセル封入、イオン泳動による、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性ミクロスフェア、タンパク質性ベクター、又はダイナミックポリコンジュゲート（商標）（ＤＰＣ）（例えば、ＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／００２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、及びＷＯ２０１２／０８３１８５を参照されたい。あるいは、細胞表面分子、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、又は細胞表面分子に対する親和性を有する抗体模倣物などの標的リガンドへのオリゴヌクレオチドの結合は、肝臓において肝細胞へのオリゴヌクレオチドベースの治療薬の送達において、いくつかの最近の成功を見てきた。しかし、これまでのところ、オリゴヌクレオチドベースの製剤を肝外細胞に標的とする試みは、有効性、毒性、又はその両方の組み合わせの欠如のいずれかのために、ほとんど失敗している。
この分野におけるある程度の進歩にもかかわらず、インビボでのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドベースの薬物製剤を含む治療薬の送達を容易にするための改良された送達メカニズムの必要性が依然として存在する。さらに、ＨＩＦ－２αの強力で選択的な阻害剤が必要である。
本明細書に開示されているのは、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を選択的かつ効率的に阻害することができる、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（本明細書ではＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉトリガー、又はトリガーとも呼ばれる）、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤である。ＨＩＦ－２αの発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を含む組成物であって、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が、標的細胞上に存在する細胞レセプターに対して親和性を有する少なくとも１つの標的化リガンド、及び、任意選択的に、少なくとも１つの薬物動態（ＰＫ）エンハンサーに連結されている組成物が、本明細書においてさらに開示される。本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、対象、例えばヒト又は動物対象におけるＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を選択的かつ効率的に減少又は阻害することができる。
一般に、本開示は、ＨＩＦ－２α遺伝子特異的ＲＮＡｉ剤、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物、及び本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及び組成物を用いてインビボ及び／又はインビトロでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害する方法を特徴とする。
記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、例えば明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）のような癌腫を含む、ＨＩＦ－２α発現の減少によって少なくとも部分的に媒介され得る状態及び疾患の治療（予防的及び予防的処置を含む）のための方法において使用することができる。本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、対象の細胞におけるＨＩＦ－２α遺伝子発現を選択的に減少させることができる。本明細書に開示される方法は、静脈内注入、静脈内注射、又は皮下注射のような当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて、１種以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を対象、例えばヒト又は動物対象に投与することを含む。
１つの実施形態において、本開示は、ヒトＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を特徴とし、ここで、ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、さらに、１以上の標的リガンド及び／又は１以上のＰＫエンハンサーに連結又はコンジュゲートすることができる。
本明細書にはまた、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤を含む薬学的組成物も記載され、ここで、該組成物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む。開示された１種以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む本明細書中に記載される医薬組成物は、インビボでＨＩＦ－２α遺伝子の発現を選択的かつ効率的に減少又は阻害することができる。１以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、例えばｃｃＲＣＣのような癌腫を含むＨＩＦ－２α発現の減少によって少なくとも部分的に媒介され得る状態及び疾患の処置（予防的処置又は抑制を含む）のために、ヒト又は動物対象のような対象に投与することができる。
本明細書に記載される１つの実施形態は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であり、以下を含む：
（ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖；
（ｉｉｉ）１つ以上の標的化リガンド。
別の実施形態では、以下を含むＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤が記載される：
（ｉ）ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子（配列番号：１）に対して少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖；
（ｉｉｉ）センス鎖に連結された標的化リガンド；及び
（ｉｖ）センス鎖に結合したＰＫエンハンサー。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＵＣＡＵＧＡＡＡＵＣＧＵＵＡＣＧＵＵＧ（配列番号８２７）とは異なる０又は１個の核酸塩基配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＵＣＡＵＧＡＡＡＵＣＧＵＵＡＣＧＵＵＧ（配列番号８２７）からなる、本質的に１ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＵＣＡＵＧＡＡＡＵＣＧＵＵＡＣＧＵＵＧ（配列番号８２７）とは異なる核酸塩基配列からなる、本質的に０又は１核酸塩基からなる、又は１核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含み、配列番号８２７は、アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）から１ヌクレオチド以下の異なる修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）からなる、本質的に１ヌクレオチド以下の改変ヌクレオチド配列からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖（配列番号３０）を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。当業者が明白に理解するように、本明細書に開示される修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合の包含は、典型的にオリゴヌクレオチド中に存在するホスホジエステル結合に取って代わる（例えば、全てのヌクレオシド間結合を示す図７Ａ～７Ｇ参照）。ある実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）からなる、又はそれらを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ａｓＣｆｓａｓＵｆａＧｆｕＡｆｃＡｆｕＡｆｇＡｆｇＡｆａＵｆｇＵｆｓｇ（配列番号９０）から１ヌクレオチド以下で異なる修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）からなる、又は本質的に１ヌクレオチド以下で異なる修飾ヌクレオチド配列を含む、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。ある実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ａｓＣｆｓａｓＵｆａＧｆｕＡｆｃＡｆｕＡｆｇＡｆｇＡｆａＵｆｇＵｆｓｇ（配列番号９０）からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓｕｓＵｆａＧｆｕＡｆｕＧｆｇＡｆｃＡｆｇＵｆｕＧｆｕＧｆｓｕ（配列番号１１３）から１ヌクレオチド以下異なる改変ヌクレオチド配列からなる、本質的にそれからなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。ある実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓｕｓＵｆａＧｆｕＡｆｕＧｆｇＡｆｃＡｆｇＵｆｕＧｆｕＧｆｓｕ（配列番号１１３）からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；及びｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＡＣＡＵＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＧ（配列番号８８３）とは異なる０又は１の核酸塩基配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＡＣＡＵＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＧ（配列番号８８３）からなる、本質的に１ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、全て又は実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＡＣＡＵＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＧ（配列番号８８３）とは異なる核酸塩基配列（５’→３’）からなる、本質的に０又は１核酸塩基からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号８８３は、アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＵＵＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＧＵ（配列番号９０２）とは異なる０又は１の核酸塩基配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＵＵＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＧＵ（配列番号９０２）からなる、本質的に１ヌクレオチド以下で異なるヌクレオチド配列からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＵＵＡＧＵＡＵＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＧＵ（配列番号９０２）とは異なる核酸塩基配列（５’→３’）からなる、本質的に０又は１核酸塩基からなる、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号９０２は、アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）と、修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）からなる、本質的に構成される、又はそれを含むセンス鎖と、を含む、又は本質的に含むアンチセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ及びｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、及びＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、各Ｘ、Ｙ及びＺは独立して薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ヌクレオチドの２’位に結合した薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）を有するウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、（ここで実施例に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングすることによって完成した）、（ＮＨ２－Ｃ６）は表７に定義されるとおりであり、それらはホスホロチオエート結合を表す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）からなる、本質的に構成される、又は修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）を含む、又はそれを含むアンチセンス鎖（ここで、センス鎖は、ヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端における逆弱毒残基をさらに含み、センス鎖はまた、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、ここで、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）ａｓＣｆｓａｓＵｆａＧｆｕＡｆｃＡｆｕＡｆｇＡｆｇＡｆａＵｆｇＵｆｓｇ（配列番号９０）からなる修飾ヌクレオチド配列からなる、本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）（Ｚ）３－（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ（ｉｎｖＡｂ）ｓｃａｃａｕｕｃｕＣｆＵｆＡｆｕｇｕＺａｃＺｕａＺｕｇＺｕｓ（ｉｎｖＡｂ）（Ｃ６－Ｓ）－Ｘ（配列番号８０６）からなる修飾ヌクレオチド配列からなる、本質的になる、またはそれらを含むセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジンを表す；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、グアノシン、及びウリジンを表す；各Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ウリジン、アデノシン、グアノシン及びシチジンを表し、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）は、ヌクレオチドの２’位に連結し（本明細書の実施例に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤については、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングさせることによって完成された）、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、（Ｃ６－Ｓ）、及び（ｉｎｖＡｂ）は、表７に定義される通りであり、ｓはホスホロチオエート連結を表す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）ａｓＣｆｓａｓＵｆａＧｆｕＡｆｃＡｆｕＡｆｇＡｆｇＡｆａＵｆｇＵｆｓｇ（配列番号：９０）からなる、本質的になる、又はそれを含むアンチセンス鎖、及び修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）（Ｚ）３－（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ（ｉｎｖＡｂ）ｓｃａｃａｕｕｃｕＣｆＵｆＡｆｕｇｕＺａｃＺｕａＺｕｇＺｕｓ（ｉｎｖＡｂ）（Ｃ６－Ｓ）－Ｘ（配列番号：８０６）からなり、又はそれを含むセンス鎖を含み、センス鎖はさらに、ヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆弱塩基残基を含み、センス鎖はまた、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓｕｓＵｆａＧｆｕＡｆｕＧｆｇＡｆｃＡｆｇＵｆｕＧｆｕＧｆｓｕ（配列番号１１３）からなる、本質的になる又はそれを含むアンチセンス鎖、及び修飾ヌクレオチド配列（５’→３’）（Ｚ）３－（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ（ｉｎｖＡｂ）ｓａｃａｃａａｃｕＧｆＵｆＣｆｃａｕＺａｃＺｕａＺａｃＺａｓ（ｉｎｖＡｂ）（Ｃ６－Ｓ）－Ｘ（配列番号８１０）をからなる、本質的になる又はそれを含むセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、グシチジン、アノシン、及びウリジンを表し；各Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ウリジン、アデノシン、グアノシン及びシチジンを表し、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）は、ヌクレオチドの２’位に連結し（本明細書の実施例に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤については、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングさせることによって完成された）、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、（Ｃ６－Ｓ）、及び（ｉｎｖＡｂ）は、表７に定義される通りであり、ｓはホスホロチオエート連結を表す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓｕｓＵｆａＧｆｕＡｆｕＧｆｇＡｆｃＡｆｇＵｆｕＧｆｕＧｆｓｕ（配列番号１１３）からなる、本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、及び修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）（Ｚ）３－（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ（ｉｎｖＡｂ）ｓａｃａｃａａｃｕＧｆＵｆＣｆｃａｕＺａｃＺｕａＺａｃＺａｓ（ｉｎｖＡｂ）（Ｃ６－Ｓ）－Ｘ（配列番号８１０）からなる、本質的になる、またはそれを含むセンス鎖を含み、センス鎖は、さらに、ヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端における逆弱毒残基を含み、センス鎖はまた、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号：３０）からなる、本質的になる、又はそれを含むアンチセンス鎖、及びＹ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａＺｃｇｕａＺａＣｆＧｆＡｆｕｕｕｃａＺｕｇａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７４０）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃＺｇｕａａＺＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａｕｇＺａａｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７５６）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇＺｕａａＺＣｆＧｆＡｆｕＺｕｕｃＺａｕｇａａｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７５７）、及びＹ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕｃａｕＺｇＺａＺａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６２）からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）からなる、本質的になる、又はそれを含むセンス鎖を含み、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、グシチジン、アノシン、及びウリジンを表し；各Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ウリジン、アデノシン、グアノシン及びシチジンを表し、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）は、ヌクレオチドの２’位に連結し（本明細書の実施例に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤については、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングさせることによって完成された）、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、（ＮＨ２－Ｃ６）、（ｉｎｖＡｂ）、及び（６－Ｓ）は、表７に定義される通りであり、ｓはホスホロチオエート連結を表す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）からなり、本質的になり、またはそれを含むアンチセンス鎖、及びＹ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａＺｃｇｕａＺａＣｆＧｆＡｆｕｕｕｃａＺｕｇａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７４０）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃＺｇｕａａＺＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａｕｇＺａａｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７５６）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇＺｕａａＺＣｆＧｆＡｆｕＺｕｕｃＺａｕｇａａｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７５７）、及びＹ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕｃａｕＺｇＺａＺａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６２）からなる群から選択される修飾されたヌクレオチド配列（５’→３’）からなる、本質的になる、又はそれを含むセンス鎖を含み、センス鎖はさらに、ヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆弱塩基残基を含み、センス鎖はまた、５’末端に共有結合している標的化リガンドを含み、標的化リガンドは、インテグリン受容体に親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
Figure 2022518384000001
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又は１ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ここで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；そしてアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方上のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
Figure 2022518384000002
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又は１ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。ここで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり；センス鎖が、さらに、３’末端及びヌクレオチド配列の５’末端における逆弱毒残基を含み、センス鎖は、５’末端に共有結合した標的化リガンドも含み、ここで、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
Figure 2022518384000003
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又は１ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。こｋで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み、ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、センス鎖が、さらに、３’末端及びヌクレオチド配列の５’末端に逆弱塩基残基を含み、センス鎖が、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、ここで、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含み；そして、それぞれのアンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の１～２１位に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）対：
Figure 2022518384000004
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列からなり、本質的に構成され、又はそれを含む。ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）対：
Figure 2022518384000005
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列からなり、本質的に構成され、又はそれを含む。ここで、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方におけるヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；そしてセンス鎖は、さらに、３’末端及びヌクレオチド配列の５’末端における逆弱めの残基を含み、センス鎖はまた、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、ここで、標的化リガンドは、インテグリン受容体に親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
Figure 2022518384000006
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し；これらは、ホスホロチオエート結合を表し；ここで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；ここで、センス鎖のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては、修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
Figure 2022518384000007
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤がさらにアンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を含み、センス鎖のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、センス鎖がさらに３’末端及びヌクレオチド配列の５’末端に逆弱塩基残基を含み、センス鎖が５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、標的化リガンドがインテグリン受容体に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び以下のヌクレオチド配列対（５’→３’）：
Figure 2022518384000008
のうちの１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、本質的に構成される、又はそれを含むセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ２’－メチルアデノシン、シチジン、Ｇｆ、及びウリジンを表し；各Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり；ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺは、それぞれ、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基）を有するウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表す。及び／又は、本明細書の実施例に開示されるヌクレオチド（ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表７に定義されるように、２’－Ｏ－プロパルギル基、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、（ＮＨ２－Ｃ６）、（Ｃ６－Ｓ）及び（ｉｎｖＡｂ）にカップリングすることによって完成され、そしてそれらはホスホロチオネート結合を表す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び以下のヌクレオチド配列対（５’→３’）：
Figure 2022518384000009
からなる、本質的に構成される、又はそれらのうちの１つを含むセンス鎖を含む。ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕは、それぞれ２’－メチルアデノシン、シチジン、Ｇｆ、及びウリジンを表し；各Ｘ、Ｙ、及びＺは、独立して、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサー）であり；ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺは、それぞれ、薬理学的部分（例えば、標的化リガンド、標的化基）を有するウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表す。本明細書の実施例に開示されているヌクレオチド（ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉエンハンサー）の２’位に結合した（この場合、ＴｒｉＡｌｋ１４）、（ＮＨ２－Ｃ６）、（Ｃ６－Ｓ）、（６－Ｓ）及び（ｉｎｖＡｂ）は、表７に定義されているように、ホスホロチオネート結合を表し；センス鎖はまた、５’末端に共有結合した標的化リガンドを含み、ここで、標的化リガンドは、インテグリン受容体に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
Figure 2022518384000010
からなる群より選択されるヌクレオチド配列から０又は１個の核酸塩基によって異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
Figure 2022518384000011
からなる群より選択されるヌクレオチド配列から０又は１個の核酸塩基によって異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。ここで、全て又は実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
Figure 2022518384000012
からなる群より選択されるヌクレオチド配列から０又は１個の核酸塩基によって異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。ここで、全て又は実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、配列番号５、配列番号１０及び配列番号１３は、それぞれ、アンチセンス鎖のヌクレオチド位置１～１９（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各々は、（５’→３’）：
Figure 2022518384000013
からなる群から選択されるヌクレオチド配列対から０又は１個の核酸塩基によって異なる核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、各々は、（５’→３’）：
Figure 2022518384000014
からなる群から選択されるヌクレオチド配列対から０又は１個の核酸塩基によって異なる核酸塩基配列を含む。ここで、全て又は実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、１以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む本明細書に記載される組成物は、キット、容器、パック、ディスペンサー、予め充填されたシリンジ、又はバイアルに包装される。ある実施形態において、本明細書に記載される組成物は、非経口的に、例えば、静脈内注射、静脈内注入、又は皮下注射によって投与される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得るが、適切な方法及び材料は、以下に記載される。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。
本発明の他の目的、特徴、実施形態、及び利点は、以下の詳細な説明、添付図面、及び特許請求の範囲から明らかになる。
３つの構造２－ａｖｂ３標的化リガンド、Ｃ１８－ジアシドＰＫエンハンサー、及びＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤上の内部ヌクレオチドに連結された４つの内部構造２－ａｂｖ３標的化リガンドを含む三座配位子標的化基に連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤（二重らせんとして示される）の模式図。標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサーの化学構造を示した。 一端にＰＫエンハンサーに連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤（二重らせんとして示される）及び他端に３つの標的化リガンドを含む三座配位子標的化基を形成するのに適した三座配位子骨格の模式図。ＨＩＦ－２α ＲＮＡ剤図は、さらに、標的リガンド（図２において「ＴＬ」として表される）をＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結するためのある種の可能な部位を示し、これには、内部ヌクレオチドに連結された４つの標的リガンドが示される。 遊離酸型のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤ＡＤ０６２９９の化学構造表示。アンチセンス鎖と塩基対を形成する最初のヌクレオチドから始まるセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（３’→５’）の２’位の「ＴＬ」を示す（図３Ｄから始まり、図３Ｃに続く）。「ＴＬ」は、これらの内部ヌクレオチド上の標的化リガンドの結合部位を表す。 遊離酸型のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤ＡＤ０６２９９の化学構造表示。アンチセンス鎖と塩基対を形成する最初のヌクレオチドから始まるセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（３’→５’）の２’位の「ＴＬ」を示す（図３Ｄから始まり、図３Ｃに続く）。「ＴＬ」は、これらの内部ヌクレオチド上の標的化リガンドの結合部位を表す。 遊離酸型のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤ＡＤ０６２９９の化学構造表示。アンチセンス鎖と塩基対を形成する最初のヌクレオチドから始まるセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（３’→５’）の２’位の「ＴＬ」を示す（図３Ｄから始まり、図３Ｃに続く）。「ＴＬ」は、これらの内部ヌクレオチド上の標的化リガンドの結合部位を表す。 遊離酸型のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤ＡＤ０６２９９の化学構造表示。アンチセンス鎖と塩基対を形成する最初のヌクレオチドから始まるセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（３’→５’）の２’位の「ＴＬ」を示す（図３Ｄから始まり、図３Ｃに続く）。「ＴＬ」は、これらの内部ヌクレオチド上の標的化リガンドの結合部位を表す。 本明細書の実施例１６に記載の研究に従い、３６日目に担癌マウスからの腫瘍サイズを示す画像。図４Ａは、溶媒対照群（Ｄ５Ｗ）からの腫瘍サイズを示し、左腎は対側腎、右腎は腫瘍腎を示す。図４Ｂは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与されたマウスからの腫瘍サイズを示し、左腎は対側腎であり、右腎は腫瘍腎である。 本明細書の実施例１６に従って投与した担癌マウス由来のＨＩＦ－２αタンパク質の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す画像。図５Ａは、溶媒対照群（Ｄ５Ｗ）を示し、黒くなったスポットは、ＨＩＦ－２αタンパク質の存在を示す。図５Ｂは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与された処置群マウスを示す。 本明細書の実施例１９に従って投与された動物の腫瘍サイズを反映する棒グラフ。３４日目の腫瘍サイズ測定に基づいて動物を分類した。 固体支持体上で合成されたＡＤ０５９７１、ＡＤ０６１５３、ＡＤ０５９６３０、ＡＤ０５９６６、ＡＤ０５９６７、ＡＤ０５９６７、ＡＤ０５９６７及びＡＤ０５９７２のヌクレオチド、ヌクレオシド間結合及びセンス鎖修飾を示す概略図であって、ａ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ａＡｌｋ、ｃＡｌｋ、ｇＡｌｋ及びｕＡｌｋはそれぞれ２’－Ｏ－プロパルギルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｏはホスホロチオエート結合を表し、ｉｎｖＡｂ、６－ＳＳ－６、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６、ＮＨ２－Ｃ６及びＴｒｉＡｌｋ１４はすべて表７に定義されている。図７のＲＮＡｉ剤に対するさらなる修飾は、標的化リガンド及びＰＫエンハンサーの添加などの固体支持体からの切断後に行うことができる。 固体支持体上で合成されたＡＤ０５９７１、ＡＤ０６１５３、ＡＤ０５９６３０、ＡＤ０５９６６、ＡＤ０５９６７、ＡＤ０５９６７、ＡＤ０５９６７及びＡＤ０５９７２のヌクレオチド、インテムクレオシド結合及びセンス鎖修飾を示す概略図であって、ａ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ａＡｌｋ、ｃＡｌｋ、ｇＡｌｋ及びｕＡｌｋはそれぞれ２’－Ｏ－プロパルギルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｏはホスホロチオエート結合を表し、ｉｎｖＡｂ、６－ＳＳ－６、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６、ＮＨ２－Ｃ６及びＴｒｉＡｌｋ１４はすべて表７に定義されている。図７のＲＮＡｉ剤に対するさらなる修飾は、標的化リガンド及びＰＫエンハンサーの添加などの固体支持体からの切断後に行うことができる。
ＲＮＡｉ剤
本明細書には、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子（本明細書ではＨＩＦ－２α又はＨＩＦ２α ＲＮＡｉ剤、又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉトリガーと称する）の発現を阻害するＲＮＡｉ剤が記載されている。本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）、及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに部分的、実質的、又は完全に相補的であり得る。ＲＮＡｉ剤センス及びアンチセンス鎖の長さは、それぞれ１６～４９ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は、独立して１７～２６ヌクレオチドの長さである。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２４ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２１ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、センス及び／又はアンチセンス鎖は、独立して、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。本明細書中に記載されるＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２αを発現する細胞への送達時に、インビボ又はインビトロで１以上のＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害する。
本明細書に記載される１つの実施形態は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であり、以下を含む：
（ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の標的化リガンド。
記載の別の実施形態では、以下を含むＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤である。
（ｉ）ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子（配列番号１）に対して少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖；
（ｉｉｉ）センス鎖に連結された標的化リガンド；及び
（ｉｖ）センス鎖に結合したＰＫエンハンサー。
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ中の同数のヌクレオチドのコア伸長配列（本明細書では「コア伸長」又は「コア配列」とも呼ばれる）及び対応するセンス鎖中の同数のヌクレオチドのコア伸長に対して少なくとも８５％の相補性を有する少なくとも１６の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態において、このアンチセンス鎖コア伸長は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。ある実施形態において、このアンチセンス鎖コア伸長は、１９ヌクレオチド長である。ある実施形態において、このアンチセンス鎖コア伸長は、１７ヌクレオチド長である。
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ中の同数のヌクレオチドのコア伸長に対して少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも１６の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態において、このセンス鎖コア伸長は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、このセンス鎖コア伸長は、長さが１７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、このセンス鎖コア伸長は、１９ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表１に開示される配列のいずれかの配列を有するＨＩＦ－２α遺伝子の一部を標的とする。
本明細書に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に含まれ得るＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖の例を表３に示す。本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に含まれ得るＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖の例は、表４、４．１、４．２、及び４．３に提供される。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤二本鎖の例を表５に示す。本明細書に開示するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる、又はそれらに含まれる１９ヌクレオチドコア伸長配列の例を表２に示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、表５に開示される二本鎖構造を有する１以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物である。
さらなる実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を１以上の標的リガンド（例えば、ＨＩＦ－２αを発現する細胞上に位置する１以上の細胞レセプターに対して親和性を有する化合物を含むリガンド）に共有結合又は接合することによって、標的細胞又は組織に送達することができる。ある実施形態において、適切な標的化リガンドは、１以上のインテグリン（代替的に「インテグリン受容体」と呼ばれる）に対する親和性を有する化合物を含むか、又はそれからなる。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、限定されるものではないが、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を用いて、（ｃｃＲＣＣ）細胞のような癌細胞を含む細胞に送達することができる。核酸送達方法は、限定されるものではないが、標的化リガンドへの連結又はコンジュゲート、リポソーム中のカプセル封入、イオン導入、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性マイクロスフェア、タンパク質性ベクター、又はダイナミックポリコンジュゲート（商標）（ＤＰＣ）などの他のビヒクルへの取り込みによるものを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１以上のインテグリンに対する親和性を有する化合物（以下、「インテグリン標的化リガンド」という）を含む標的化リガンドに連結される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤と共に使用するための適切な標的化リガンドは、インテグリンα－ｖ－β３、インテグリンα－ｖ－β－５、又はこれらのインテグリンの両方に対する親和性を有する。標的化リガンドは、個々に存在することができ（存在する１つの標的化化合物のみ）、又は２つ以上の標的化リガンドは、分岐点又は足場を介して連結され、共に標的化基を形成し、次いで、標的化基の分岐点又は足場は、ＲＮＡｉ剤に単独で連結され得る。標的化基は、２つの標的化リガンド（「二座」と呼ばれる）、３つの標的化リガンド（「三座」）、４つの標的化リガンド（「四座」）、又は４つ以上の標的化リガンドを含み得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２以上の標的化リガンドに連結される。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２～１０個の標的化リガンドに連結される。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、７つの標的化リガンドに好まれる。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超える標的リガンドに好まれる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が、インテグリンα－ｖ－β３及び／又はインテグリンα－ｖ－β－５に対して親和性を有する化合物を含む標的化リガンドにコンジュゲートされる場合、ＲＮＡｉ剤は、受容体媒介エンドサイトーシス又は他の手段のいずれかを介して、ｃｃＲＣＣ細胞によって選択的に内部移行される。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を送達するのに有用なインテグリンα－ｖ－β３及び／又はインテグリンα－ｖ－β－５に対して親和性を有する標的化リガンド及び標的化基の例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１９／２１０２００号に開示されている。
標的リガンドは、センス鎖の３’末端又は５’末端、アンチセンス鎖の３’末端又は５’末端、及び／又は内部で、センス鎖の１つ以上の個々のヌクレオチド及び／又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に連結され得る。ある実施形態において、標的化リガンド又は標的化基は、センス鎖の３’末端又は５’末端に連結される。ある実施形態において、標的化リガンド又は標的化基は、センス鎖の５’末端に連結される。ある実施形態において、標的化リガンド又は標的化基は、センス鎖のヌクレオチド及び／又はＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に内部的に連結される。ある実施形態において、標的化リガンド又は標的化基は、センス鎖の５’末端に連結され、１以上の標的化リガンドは、センス鎖の１以上の内部ヌクレオチドに連結される。ある実施形態において、標的化リガンド又は標的化基は、リンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結される。
リンカーを伴う又は伴わない標的リガンド又は標的化基は、表２、３、又は４、４．１、４．２、又は４．３に開示されるセンス及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端又は３’末端に連結され得る。標的化リガンド又は標的化基を伴う又は伴わないリンカーは、表２、３、又は４、４．１、４．２、又は４．３に開示されるセンス及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端又は３’末端に結合され得る。
さらなる実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１以上の薬物動態／薬力学（ＰＫ）エンハンサーに連結又は結合され得る。本明細書中で使用される場合、ＰＫエンハンサー（「薬物動態（ＰＫ）修飾剤」とも呼ばれる）は、オリゴヌクレオチドベースの薬物生成物又は他の治療薬に連結された場合、標的細胞又は組織への治療薬の送達を妨げることなく、腎排泄を制限することによって、治療薬の遊離型に対して、治療薬のインビボでの全身循環時間を増加させることができ（半減期又は血漿滞留時間の増加）、又はＰＫエンハンサーを伴わない治療薬を超える薬力学的改善を提供する化合物である。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤との使用に適した例示的なＰＫエンハンサーが本明細書に開示されている。当業者は、選択された治療薬に鑑みて、追加の適切なＰＫエンハンサーを同定するために、関連するインビボ及び／又はインビトロ試験を容易にデザインすることができるであろう。例えば、様々な時間間隔で対象の全身循環に残存する製剤の量を定量化する、又は関連する時点での治療効果の効果又は効力又は持続時間を評価する、ＰＫエンハンサーの有無を問わず、治療効果を比較する試験を容易にデザインすることができる。これは当業者の知識の範囲内である。
別の実施形態において、開示は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するための方法を特徴とし、ここで、該方法は、ＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害することができるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の量を、対象又は対象の細胞に投与することを含み、ここで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれかの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害する方法であって、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が表２、４、４．１、４．２又は４．３のセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの配列を含む、ＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害することができるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を対象又は細胞に投与することを含む方法が本明細書に開示されている。また、このような方法で使用するための組成物も本明細書に記載される。
哺乳動物などの対象においてインテグリン（本明細書では「インテグリン受容体」とも呼ばれる）を発現する細胞にＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤をインビボで送達する方法も本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の所望の細胞への送達は、ＨＩＦ－２ ＲＮＡｉ剤を１以上の標的化リガンド及び／又は１以上のＰＫエンハンサーに連結することによって促進される。このような方法で使用するための組成物も記載されている。
さらなる実施形態において、開示は、ｃｃＲＣＣを含む、ＨＩＦ－２α発現の減少によって少なくとも部分的に媒介され得る疾患、状態又は症状の治療（予防的又は予防的処置を含む）の方法を特徴とし、ここで、本方法は、表２又は３のいずれかの配列の配列を含むアンチセンス鎖を有するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ｃｃＲＣＣを含む、ＨＩＦ－２α発現の減少によって少なくとも部分的に媒介され得る疾患、症状又は状態の処置（予防的処置を含む）の方法であり、ここで、本方法は、表２、４、４．１、４．２又は４．３の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を有するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。また、このような方法で使用するための組成物も本明細書に記載される。
ＨＩＦ－２α遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される病理学的状態（例えば、状態又は疾患）を有するか、又は病理学的状態を発症するリスクがあるヒト対象を治療する方法も記載されており、この方法は、治療的に有効な量のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及び／又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤含有組成物を対象に投与する工程を含む。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及び／又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤含有組成物で対象を治療する方法は、任意に、１以上の追加の（例えば、第２の、第３の、など）治療薬又は治療を投与する１以上の工程と組み合わせることができる。さらなる治療薬は、別のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤（例えば、ＨＩＦ－２α遺伝子内の異なる配列を標的とするＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤）であり得る。さらなる治療はまた、小分子薬物、抗体、抗体フラグメント、及び／又はアプタマーであり得る。
さらなる実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、１以上の記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含み、場合により、１以上の追加（第２、第３、など）治療薬と組み合わされる。いくつかの実施形態において、１以上の記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む薬学的組成物は、場合により１以上の追加（例えば、第２、第３など）治療薬と組み合わせて、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に製剤化することができる。ある実施形態において、これらの組成物は、哺乳動物などの対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。ある実施形態において、任意の１以上の追加の治療薬は、１以上の癌腫などの癌の治療のために示される薬物製剤である。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びさらなる治療薬は、単一組成物で投与することができ、又は別々に投与することができる。いくつかの実施形態において、１以上の追加の治療薬は、ＲＮＡｉ剤とは別個の剤形で別々に投与される（例えば、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、静脈内注入又は注射によって投与され、一方、治療投与レジメンの方法に関与する追加の治療薬は、経口投与される）。いくつかの実施形態において、記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、静脈内注入又は注射を介して、それを必要とする対象に投与され、１以上の任意の追加の治療薬は、静脈内注入、注射、又は経口によっても投与され、一緒に、投与は、ｃｃＲＣＣなどのＨＩＦ－２α遺伝子発現によって媒介され得る疾患及び状態に対する治療レジメンを提供する。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及び１以上の追加治療薬は、単一の投与形態（例えば、静脈内注入又は注射のための単一の組成物に製剤化された「カクテル」）に組み合わされる。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１以上のさらなる治療薬を伴う又は伴わずに、１以上の賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を形成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、細胞又は対象におけるＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害するための方法であり、この方法は、表４、４．１、４．２又は４．３の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖、及び表３の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を有するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を細胞又は対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤をｃｃＲＣＣ細胞にインビボで送達するための組成物が記載されており、該組成物は、１以上の標的化リガンドに結合又は複合されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む。ある実施形態において、標的化リガンドは、インテグリンα－ｖ－β－３及び／又はインテグリンα－ｖ－β－５に対する親和性を有する化合物を含む。いくつかの実施形態において、１以上の標的リガンドに結合又は複合されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１以上のＰＫエンハンサーにさらに結合又は複合される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された組成物は、インビボでｃｃＲＣＣ細胞にＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を送達するための組成物であり、その組成物は、１つ以上の標的化リガンド及び／又は標的化基に結合又は連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む。ある実施形態において、標的化リガンド及び／又は標的化基は、１以上のインテグリンに対する親和性を有する化合物を含む。いくつかの実施形態において、インビボでｃｃＲＣＣ細胞にＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を送達するための組成物が記載されており、その組成物は、α－ｖ－β－３及び／又はα－ｖ－β－５インテグリン標的化リガンドに連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、細胞におけるＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するための方法であり、ここで、本方法は、表１の配列を有するＨＩＦ－２αｍＲＮＡの部分に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンス鎖を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、細胞におけるＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、表２又は表３のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖、及び表２又は表４、４．１、４．２又は４．３のいずれかの配列を含むセンス鎖を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、細胞におけるＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害する方法であり、ここでの方法は、表２又は表４、４．１、４．２又は４．３のいずれかの配列を含むセンス鎖、及びセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的である表２又は３のいずれかの配列の配列を含むアンチセンス鎖を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された組成物は、細胞におけるＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害するための組成物であり、ここで、本方法は、表５に示される二本鎖の二本鎖構造を有するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物を投与することを含む。
本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子上の特定の位置を標的とするように設計される（配列番号１）。本明細書中で定義されるように、アンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基が、遺伝子と塩基対を形成するときに、遺伝子上の位置から１９ヌクレオチド下流（３’末端に向かって）である位置と整列するときに、遺伝子上の所定の位置でＨＩＦ－２α遺伝子を標的とするように設計される。例えば、本明細書の表１及び２に示されるように、５０３３位でＨＩＦ－２α遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンス鎖配列は、遺伝子と塩基対を形成するとき、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基がＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の位置５０５１と整列することを必要とする。
本明細書に提供されるように、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の位置１（５’→３’）における核酸塩基が、少なくとも８５％の相補性（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９、又は１００％の相補性）が、少なくとも１６個の連続するヌクレオチドのコア伸長配列にわたって存在することを条件として、アンチセンス鎖の位置１（５’→３’）における核酸塩基が遺伝子に対して相補的であることを必要としない。例えば、ＨＩＦ－２α遺伝子の位置５０３３を標的とするように設計される本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤については、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、遺伝子の位置５０５１と整列されなければならないが、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の相補性）のアンチセンス鎖及び遺伝子の少なくとも８５％相補性があるならば、ＨＩＦ－２α遺伝子の位置５０５１と相補的であってもよいが、相補的である必要はない。とりわけ、本明細書に開示された例によって示されるように、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖による遺伝子の結合の特異的部位（例えば、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が５０３３位又は他の位置でＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子を標的とするように設計されているかどうか）は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤によって達成される阻害のレベルにとって重要である。
記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２αタンパク質の産生に必要な１つ以上の遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡ干渉を媒介することができる。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤はまた、ｃｃＲＣＣを含む種々の疾患、障害、又は状態を治療又は予防するために使用することができる。さらに、インビボでｃｃＲＣＣ細胞にＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を送達するための組成物を記載する。
１種以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、局所治療又は全身治療が所望されるかどうかに応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、皮下（例えば、埋め込みデバイスを介して）、及び実質内投与であり得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。
いくつかの実施形態において、１種以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む本明細書に記載される組成物は、キット、容器、パック、ディスペンサー、予め充填されたシリンジ、注入バッグ、又はバイアルに包装される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、非経口的に投与される。
各ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ１６～３０ヌクレオチドの長さであり得る。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであってもよく、又は異なる長さであってもよい。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、長さが１７～２７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、長さが１７～２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、それぞれ２１～２６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は、それぞれ２１～２４ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は約１９ヌクレオチドの長さであり、一方、アンチセンス鎖は約２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス鎖は約２１ヌクレオチドの長さであり、一方、アンチセンス鎖は約２３ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、センス鎖は２３ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、それぞれ２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤センス及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７ヌクレオチドである。ある実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの二本鎖長を有する。
いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間の完全、実質的、又は部分的相補性の領域は、長さが１６－２６（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６）ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端又はその近傍に存在する（例えば、この領域は、完全、実質的、又は部分的に相補的でない０、１、２、３、又は４ヌクレオチドだけ、アンチセンス鎖の５’末端から分離され得る）。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、長さが１６～２３ヌクレオチドであるコア伸長（本明細書では「コア配列」又は「コア伸長配列」とも呼ばれる）を含む。アンチセンス鎖コア伸長は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）ｍＲＮＡ標的中に存在するヌクレオチド配列（例えば、標的配列と称されることがある）に対して１００％（完全に）相補的であるか、又は少なくとも約８５％（実質的に）相補的である。センス鎖コア伸長配列は、アンチセンス鎖中のコア伸長配列に対して１００％（完全に）相補的であるか、又は少なくとも約８５％（実質的に）相補的であり、従って、センス鎖コア伸長配列は、典型的には、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ標的中に存在するヌクレオチド配列（標的配列）と完全に同一であるか、又は少なくとも約８５％同一である。センス鎖コア伸長配列は、対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであってもよく、又は異なる長さであってもよい。ある実施形態において、アンチセンス鎖コア伸長配列は、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖コア伸長配列は、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドである。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の形成に使用されるヌクレオチド配列の例を表２、３、及び４（ならびに４．１、４．２、及び４．３）に示す。表２、３及び４のセンス鎖及びアンチセンス鎖配列を含むＲＮＡｉ剤二本鎖の例を表５に示す。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス及びアンチセンス鎖はアニールして二本鎖を形成する。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに部分的、実質的、又は完全に相補的であり得る。相補的二本鎖領域内では、センス鎖コア伸長配列は、アンチセンスコア伸長配列に対して少なくとも８５％相補的又は１００％相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の対応する１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド配列に少なくとも８５％または１００％相補的である少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３ヌクレオチドの配列を含む（例えば、ＨＩＦ－２アルファＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンスコアストレッチ配列は、少なくとも８５％塩基対または１００％塩基対である少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３ヌクレオチドの領域を有し得る）。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖配列から０、１、２又は３ヌクレオチドだけ異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２又は表４、４．１、４．２又は４．３のセンス鎖配列のいずれからも、０、１、２又は３ヌクレオチドだけ異なる。
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、必要に応じて、及び独立して、コア伸長配列の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に付加的な１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド（伸長）を含有することができる。アンチセンス鎖付加ヌクレオチドが存在する場合、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ中の対応する配列と相補的であってもなくてもよい。センス鎖のさらなるヌクレオチドが存在する場合には、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ中の対応する配列と同一であってもなくてもよい。もし存在するならば、アンチセンス鎖付加ヌクレオチドは、対応するセンス鎖の付加ヌクレオチドと相補的であってもなくてもよい。
本明細書中で使用されるように、伸長は、センス鎖コア伸長配列及び／又はアンチセンス鎖コア伸長配列の５’末端及び／又は３’末端に１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。センス鎖上の伸長ヌクレオチドは、ヌクレオチドに対して相補的であってもなくてもよい。対応するアンチセンス鎖中のコア伸長配列ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれか。逆に、アンチセンス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のコア伸長ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドに対して相補的であってもなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、３’及び５’伸長を含む。いくつかの実施形態において、一方の鎖の３’伸長ヌクレオチドの１つ以上は、他方の鎖の１つ以上の５’伸長ヌクレオチドと塩基対を形成する。他の実施形態では、１つの鎖の１つ以上の３’伸長ヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’伸長ヌクレオチドと塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、３’伸長を有するアンチセンス鎖及び５’伸長を有するセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、伸長ヌクレオチドは不対であり、突出部を形成する。本明細書中で使用される「オーバーハング」とは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端に位置する１つ又は複数の不対ヌクレオチドの伸長であって、本明細書中に開示されるＲＮＡｉ剤のハイブリダイズ又は二本鎖化部分の一部を形成しないものをいう。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、長さが１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドの３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、長さが１、２、又は３ヌクレオチドの３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアンチセンス鎖伸長ヌクレオチドは、対応するＨＩＦ－２αｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアンチセンス鎖伸長ヌクレオチドは、対応するＨＩＦ－２αｍＲＮＡ配列と相補的でないヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端は、「非塩基部位」又は「非塩基性ヌクレオチド」とも称され得る非塩基性残基（Ａｂ）を含むことができ、非塩基性残基（Ａｂ）は、糖部分の１’位置に核酸塩基を欠くヌクレオチド又はヌクレオシドである。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、非塩基性残基は、ヌクレオチド配列内に配置され得る。ある実施形態において、Ａｂ又はＡｂは、アンチセンス鎖の３’末端に付加され得る。いくつかの実施形態において、センス鎖の５’末端は、１つ以上のさらなるアバシック残基（例えば、（Ａｂ）又は（Ａｂ））を含むことができる。ある実施形態において、ＵＵＡｂ、ＵＡｂ、又はＡｂは、センス鎖の３’末端に付加される。いくつかの実施形態において、アバシック（デオキシリボース）残基は、リビトール（アバシックリボース）残基で置換され得る。
いくつかの実施形態において、センス鎖又はアンチセンス鎖は、「末端キャップ」を含み得、これは、本明細書中で使用される場合、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤の鎖の１つ以上の末端に取り込まれ得る非ヌクレオチド化合物又は他の部分であり、いくつかの例では、ＲＮＡｉ剤に、例えば、エキソヌクレアーゼ分解に対する保護などの特定の有益な特性を提供することができる。いくつかの実施実施形態において、逆弱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）は、末端キャップとして付加される（表７を参照のこと）。（例えば、Ｆ．Ｃｚａｕｄｅｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００３，３１（１１），２７０５－１６参照）。末端キャップは、当技術分野において一般に知られており、例えば、末端Ｃ３Ｈ７基、Ｃ６Ｈ１３基、又はＣ１２Ｈ２５基のような炭素鎖と同様に、逆位の弱毒残基を含む。いくつかの実施形態において、末端キャップは、センス鎖の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端のいずれかに存在する。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端は、さらなる非塩基性残基又は逆弱毒末端キャップを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、１以上の逆位弱毒残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の３’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆弱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の５’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位軽減残基又は逆位軽減部位が、標的化リガンドとＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の末端又は末端又は末端付近に、１つ以上の逆弱毒化残基又は逆弱毒化部位を含めることにより、ＲＮＡｉ剤の活性又は他の所望の特性を増強することができる。
いくつかの実施形態において、１以上の逆位弱毒残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の５’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位軽減残基を、標的化リガンドとＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の末端又は末端付近に１つ又は複数の逆弱化残基を含めることにより、ＲＮＡｉ剤の活性又は他の所望の特性の増強を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、逆弱塩基（デオキシリボース）残基は、逆位リビトール（非塩基性リボース）残基で置換され得る。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖コア伸長配列の３’末端、又はアンチセンス鎖配列の３’末端は、逆弱塩基残基（ｉｎｖＡｂ（表７参照））を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、長さが１、２、３、４、又は５ヌクレオチドの３’伸長を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は、アデノシン、ウラシル、又はチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、又はＨＩＦ－２αｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに相当するか又は同一であるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、３’センス鎖伸長は、限定されないが、以下の配列：Ｔ、ＵＴ、ＴＴ、ＵＵ、ＵＵＴ、ＴＴＴ、又はＴＴＴＴ（それぞれ５’から３’に列挙）の１つを含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、長さが１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドの５’伸長を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のセンス鎖伸長ヌクレオチドは、ＨＩＦ－２α ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに相当する、又は同一であるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖５’伸長は、以下の配列のうちの１つであるが、これらに限定されない：ＣＡ、ＡＵＡＧＧＣ、ＡＵＡＧＧ、ＡＵＡＧ、ＡＵＡ、Ａ、ＡＡ、ＡＣ、ＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣ、ＵＡＵＣＡ、ＵＡＵＣ、ＵＣＡ、ＵＡＵ、Ｕ、ＵＵ（各々５’～３’に列挙）。センス鎖は、３’伸長及び／又は５’伸長を有することができる。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の形成に使用される配列の例を表２、３及び４、４．１、４．２及び４．３に示す。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は３のいずれかの配列の配列を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表３における修飾配列のいずれか１つを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ因子アンチセンス鎖は、表２又は３におけるいずれかの配列のヌクレオチド（５’末端→３’末端）１－１７、２－１５、２－１７、１－１８、２－１８、１－１９、２－１９、１－２０、２－２０、１－２１又は２－２１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２又は表４のいずれかの配列の配列を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２又は４のいずれかの配列のヌクレオチド（５’末端→３’末端）１－１８、１－１９、１－２０、１－２１、２－１９、２－２０、２－２１、３－２０、３－２１、又は４－２１の配列の配列を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表４、４．１、４．２、又は４．３の修飾された配列のいずれか１つの修飾された配列を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のセンス及びアンチセンス鎖は、同数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、センス鎖３’末端及びＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖５’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端も平滑末端ではない。本明細書で使用する「平滑末端」とは、二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端であって、２本のアニーリング鎖の末端ヌクレオチドが相補的（相補的な塩基対を形成する）である末端を指す。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、ほぐされた末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖３’末端及びアンチセンス鎖５’末端は、フライド末端を形成する。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両端は、フライド末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端も、フライド末端ではない。本明細書で使用される「ほぐれた末端」とは、二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端であって、対からの２本のアニール鎖の末端ヌクレオチドが（オーバーハングを形成しない）相補的ではない（非相補的対を形成する）末端を指す。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤の一本鎖の末端における１つ以上の不対ヌクレオチドは、オーバーハングを形成する。不対ヌクレオチドはセンス鎖又はアンチセンス鎖上にあり得、３’又は５’突出部のいずれかを生じる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、平滑末端及び欠損末端、平滑末端及び５’オーバーハング末端、平滑末端及び３’オーバーハング末端、フライ末端及び５’オーバーハング末端、フライ末端及び３’オーバーハング末端、フライ末端及び３’オーバーハング末端、２つの５’オーバーハング末端、２つの３’オーバーハング末端、５’オーバーハング末端及び３’オーバーハング末端、２つのフライ末端又は２つの平滑末端を含む。典型的には、オーバーハングが存在する場合、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置する。
修飾ヌクレオチドは、種々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド構築物中で使用される場合、細胞中の化合物の活性を保存すると同時に、これらの化合物の血清安定性を増加させることができ、また、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド構築物の投与時にヒトにおいてインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることができる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、又は遊離酸として調製されるか、又は提供される。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ナトリウム塩として調製される。当該技術分野で周知のそのような形態は、本明細書に開示された発明の範囲内である。
定義
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、それぞれ独立して修飾され得るか又は修飾され得ない結合ヌクレオシドのポリマーを意味する。
本明細書中で使用される「ＲＮＡｉ剤」（「ＲＮＡｉトリガー」とも呼ばれる）は、配列特異的な様式で標的ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の翻訳を分解又は阻害（例えば、適切な条件下で分解又は阻害）することができるＲＮＡ又はＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含有する組成物を意味する。本明細書中で用いるように、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉メカニズム（例えば、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路装置（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又はＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導することによって）、又は任意の代替メカニズム又は経路を介して作用し得る。ＲＮＡｉ剤は、本明細書中で使用されるように、主としてＲＮＡ干渉メカニズムを介して作用するが、開示されたＲＮＡｉ剤は、いずれの特定の経路又は作用メカニズムにも結合せず、限定されないと考えられる。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖からなり、限定されるものではないが、短い（又は短い）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質を含む。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的とするｍＲＮＡ（ＨＩＦ－２αｍＲＮＡ）に対して少なくとも部分的に相補的である。ＲＮＡｉ剤は、１以上の修飾ヌクレオチド及び／又は１以上の非ホスホジエステル結合を含むことができる。
本明細書中で使用される場合、用語「サイレンス」、「減少」、「抑制」、「ダウンレギュレーション」、又は「ノックダウン」は、所与の遺伝子の発現を指す場合、遺伝子の発現を、遺伝子から転写されたＲＮＡのレベル、又は遺伝子が転写される細胞、組織、器官、又は対象におけるｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質、又はタンパク質サブユニットのレベルによって測定される遺伝子の発現が、そのように処理されていないか、又は処理されていない細胞、組織、器官、又は対象の第２の細胞、グループと比較して、本明細書中に記載されたＲＮＡｉ剤で処理されると、減少することを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「配列」及び「ヌクレオチド配列」とは、標準的な命名法を用いて文字の連続で記載される、核酸塩基又はヌクレオチドの連続又は順序を意味する。
本明細書中で使用される場合、「塩基」、「ヌクレオチド塩基」、又は「核酸塩基」は、ヌクレオチドの成分である複素環ピリミジン又はプリン化合物であり、一次プリン塩基アデニン及びグアニン、ならびに一次ピリミジン塩基シトシン、チミン、及びウラシルを含む。核酸塩基は、限定されるものではないが、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基を含むようにさらに修飾され得る。（例えば、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８参照）。かかる修飾核酸塩基（修飾核酸塩基を含むホスホラミダイト化合物を含む）の合成は、当該技術分野において公知である。
本明細書中で使用される場合、及び別段の指示がない限り、第２の核酸塩基又はヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖又は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）に関して第１の核酸塩基又はヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤センス鎖又は標的ｍＲＮＡ）を記載するために使用される場合、用語「相補的」は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがハイブリダイズし（哺乳動物の生理学的条件下（又はインビトロにおける同様の条件下）塩基対水素結合を形成し）、特定の標準条件下で、２番目のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと二重らせん構造または二重らせん構造を形成することを意味する。相補的配列には、ワトソン－クリック塩基対又は非ワトソン－クリック塩基対が含まれ、少なくとも上記のハイブリダイゼーション要件が満たされる範囲において、天然又は修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物が含まれる。配列の同一性又は相補性は修飾とは無関係である。例えば、本明細書で定義されるａ及びＡｆは、同一性又は相補性を決定する目的で、Ｕ（又はＴ）に対して相補的であり、Ａと同一である。
本明細書中で使用される場合、「完全に相補的」又は「完全に相補的」とは、ハイブリダイズした一対の核酸塩基又はヌクレオチド配列分子において、第１のオリゴヌクレオチドの連続配列中のすべての（１００％）の塩基が、第２のオリゴヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全部又は一部を含み得る。
本明細書中で使用される「部分的に相補的」とは、ハイブリダイズした一対の核酸塩基又はヌクレオチド配列分子において、第１のオリゴヌクレオチドの連続配列中の塩基の少なくとも７０％が、全てではないが、第２のオリゴヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全部又は一部を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「実質的に相補的」とは、ハイブリダイズした一対の核酸塩基又はヌクレオチド配列分子において、第１のオリゴヌクレオチドの連続した配列中の塩基の少なくとも８５％が、第２のオリゴヌクレオチドの連続した配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズするが、全てではないことを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全部又は一部を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」、「完全に相補的」、「部分的に相補的」、及び「実質的に相補的」は、センス鎖とＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖との間、又はＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖とＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）ｍＲＮＡの配列との間の核酸塩基又はヌクレオチドマッチングに関して使用される。
本明細書中で使用される場合、核酸配列に適用される「実質的に同一」又は「実質的に同一」という用語は、参照配列と比較して、ヌクレオチド配列（又はヌクレオチド配列の一部）が少なくとも約８５％以上の配列同一性、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有することを意味する。配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列した配列を比較することによって決定される。パーセンテージは、両方の配列において同じタイプの核酸塩基が存在する位置の数を決定して、整合位置の数を生じさせ、整合位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算される。本明細書に開示された発明は、本明細書に開示されたものと実質的に同一のヌクレオチド配列を包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」、「治療」などは、対象における疾患の１以上の症状の数、重症度、及び／又は頻度からの緩和又は緩和を提供するために取られる方法又は工程を意味する。本明細書中で使用する場合、「治療する」及び「治療」には、予防治療、管理、予防治療、及び／又は対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は頻度の抑制又は減少が含まれ得る。
本明細書中で使用されるＲＮＡｉ剤を参照する場合、「細胞内に導入する」という語句は、ＲＮＡｉ剤を細胞内に機能的に送達することを意味する。用語「機能的送達」は、ＲＮＡｉ剤を、ＲＮＡｉ剤が予想される生物学的活性、例えば、遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを可能にする方法で細胞に送達することを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「異性体」は、同一の分子式を有するが、それらの原子の結合の性質又は順序、又は空間におけるそれらの原子の配列が異なる化合物を指す。空間的に原子の配置が異なる異性体を「立体異性体」、互いに鏡像でない立体異性体を「ジアステレオ異性体」、重ね合わせることのできない鏡像である立体異性体を「鏡像異性体」、あるいは光学異性体と呼ぶ。４つの非同一な置換基に結合した炭素原子を「キラル中心」と呼ぶ。
本明細書で使用する場合、特定の立体配座を有すると構造中で具体的に同定されない限り、不斉中心が存在する各構造について、したがってエナンチオマー、ジアステレオマー、又は他の立体異性体配座を生じさせ、本明細書で開示される各構造は、光学的に純粋な形態及びラセミ体形態を含む、そのような可能性のあるすべての異性体を含む。例えば、本明細書に開示される構造は、ジアステレオマーの混合物ならびに単一の立体異性体をカバーすることを意図している。
本明細書中の請求項で使用される場合、「からなる」という語句は、請求項に記載されていない要素、工程、又は成分を排除する。本明細書中のクレームにおいて使用される場合、「本質的に」からなる文言は、クレームの範囲を特定の材料又は工程に限定し、かつ、クレームに係る発明の基本的及び新規な特徴に実質的な影響を及ぼさないものに限定する。
当業者は、本明細書に開示される化合物及び組成物が、プロトン化又は脱プロトン化された状態で、化合物又は組成物が配置させる環境に応じて、ある種の原子（例えば、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子）を有し得ることを容易に理解する。従って、本明細書で使用されるように、本明細書に開示される構造は、例えば、ＯＨ、ＳＨ、又はＮＨのような特定の官能基がプロトン化又は脱プロトン化され得ることを想定している。本明細書の開示は、当業者によって容易に理解されるように、環境（例えば、ｐＨ）に基づくプロトン化の状態にかかわらず、開示された化合物及び組成物をカバーすることを意図している。
本明細書中で使用される場合、用語「連結された」又は「コンジュゲートされた」は、２つの化合物又は分子間の結合を指す場合、２つの分子が共有結合によって連結されるか、又は非共有結合（例えば、水素結合又はイオン結合）を介して結合されることを意味する。いくつかの例において、用語「連結された」又は「コンジュゲートされた」が非共有結合を介して２つの分子間の結合を指す場合、２つの異なる分子間の結合は、生理学的に許容される緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）中で１×１０－４Ｍ未満（例えば、１×１０－５Ｍ未満、１×１０－６Ｍ未満、又は１×１０－７Ｍ未満）のＫＤを有する。記載されていない限り、本明細書中で使用される用語「連結された」及び「コンジュゲートされた」は、介在する原子又は原子基を有するか否かを問わず、第一の化合物と第二の化合物との間の連結を指すことができる。
本明細書中で使用される場合、連結基は、１つの分子又は分子の一部を別の分子又は分子の第２の部分に連結する１つ以上の原子である。同様に、当該技術分野で使用されるように、足場という用語は、しばしば、連結基と互換的に使用される。連結基は、任意の数の原子又は官能基を含み得る。ある実施形態において、連結基は、いかなる生物学的又は薬学的応答も促進せず、単に２つの生物学的活性分子を連結するのに役立つ。
特に断らない限り、本明細書で使用される記号：
Figure 2022518384000015
の使用は、本明細書に記載される発明の範囲に従って、任意のグループ又はグループをそれに連結することができることを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「含む」は、本明細書中で使用され、「含むが、これらに限定されない」という語句を意味し、本明細書中で使用される。
本明細書中の請求項で使用される場合、「からなる」という語句は、請求項に記載されていない要素、工程、又は成分を排除する。本明細書中のクレームにおいて使用される場合、「本質的に」からなる文言は、クレームの範囲を特定の材料又は工程に限定し、かつ、クレームに係る発明の基本的及び新規な特徴に実質的な影響を及ぼさないものに限定する。
修飾ヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される「修飾ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’－ヒドロキシヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）は修飾ヌクレオチドである。本明細書中で用いるように、修飾ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド模倣物、非塩基性ヌクレオチド、２’－修飾ヌクレオチド、逆核酸塩基、修飾核酸塩基－含有ヌクレオチド、橋かけヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’、３’－セコヌクレオチド模倣物（アンロック核酸塩基類似体）、ロックされたヌクレオチド、３’－Ｏ－メトキシ（２’ヌクレオシド間結合）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、５’－Ｍｅ、２’－フルオロヌクレオチド、２’－修飾ヌクレオチド（すなわち、５員糖環の２’位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）には、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド（本明細書では２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドとも呼ばれる）、２’－デオキシヌクレオチド、２’－メトキシエチル（２’－Ｏ－２－メトキシエチルとも呼ばれる）ヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、及びある化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はない。逆に、単一のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤中に、又はその単一ヌクレオチド中にさえ、２つ以上の修飾を組み込むことができる。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、当技術分野で公知の方法によって合成及び／又は修飾することができる。あるヌクレオチドにおける修飾は、別のヌクレオチドにおける修飾とは無関係である。
修飾核酸塩基には、合成および天然核酸塩基が含まれ、例えば、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリン（例えば、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、または５－プロピニルシトシン）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－アルキル（例えば、６－メチル、６－エチル、６－イソプロピル、または６－ｎ－ブチル）アデニンおよびグアニンの誘導体、２－アルキル（例えば、２－メチル、２－エチル、２－イソプロピル、または２－ｎ－ブチル）およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、５－ハロウラシル、シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－スルフヒドリル、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ（例えば、５－ブロモ）、５－トリフルオロメチル、およびその他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、および３－デアザアデニンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては、修飾ヌクレオチドである。本明細書中で用いるように、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方に４個以下（０、１、２、３又は４）のヌクレオチドを有するＲＮＡｉ剤であり、アンチセンス鎖はリボヌクレオチドである（修飾されていない）。本明細書で用いる場合、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであるセンスストランドは、修飾されていないリボヌクレオチドであるセンスストランド中に２個以下の（０、１、又は２）ヌクレオチドを有するセンスストランドである。本明細書中で用いるように、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾されたヌクレオチドであるアンチセンス鎖は、修飾されていないリボヌクレオチドであるセンス鎖中の２個以下の（０、１、又は２）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖である。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤の１以上のヌクレオチドは、未修飾リボヌクレオチドである。
本明細書の他の箇所に記載されているように、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、インビボでのＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の送達を容易にするために、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖の内部ヌクレオチド上の１つ以上の標的化リガンド及び／又は１つ以上のＰＫエンハンサーに連結することができる。いくつかの実施形態において、標的化リガンド又はＰＫエンハンサーは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の１つ以上の内部ヌクレオチドに連結又はコンジュゲートされる。例えば、標的化リガンドは、リボース環の２’位置、リボース環の３’位置、リボース環の１’位置、又はヌクレオチドの核酸塩基、リボース環の４’位置、ヌクレオチドの５’位置、又はリボース環の酸素原子に個々のヌクレオチドに連結され得る。次の記述は、リボースヌクレオチドの炭素番号をつけたものである。
Figure 2022518384000016
いくつかの実施形態において、１以上の標的リガンドの内部ヌクレオチドへの連結を容易にするために、２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列に取り込まれる（例えば、表７及び表４、４．１、４．２及び４．３を参照のこと）。２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドは、各鎖の合成後、当技術分野で公知の標準的カップリング技術を用いて、２’位の標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサーに連結又はコンジュゲートすることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、標的化リガンド又は標的化基への結合を容易にするために、センス鎖中に少なくとも１つの２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドを有するように合成され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は１０を超える２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドへの結合を促進するために、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は１０を超える２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドを含むように合成される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中の１つの２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中の２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中の３つの２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中の４つの２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中の５つの２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中に５を超える２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチドで合成することができる。
修飾ヌクレオシド間結合
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の１つ以上のヌクレオチドは、非標準的な結合又は骨格（例えば、修飾されたヌクレオシド間結合又は修飾された骨格）によって連結される。修飾されたインタームクレオシド結合または骨格には、限定されないが、ホスホロチオエート基（本明細書では小文字の「ｓ」として表される）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネートまたは３’－アルキレンホスホネート）、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート（例えば、３’－アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、またはチオノホスホルアミデート）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルフォリノ結合、通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、ボラノホスフェートの２’－５’結合類似体、またはヌクレオシドユニットの隣接する対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に結合している逆極性を有するボラノホスフェートが含まれる。ある実施形態において、修飾されたヌクレオシド間結合又は骨格は、リン原子を欠いている。リン原子を欠く修飾されたヌクレオシド間結合には、限定されるものではないが、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキル糖間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環糖間結合が含まれる。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド間骨格は、限定されるものではないが、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分を有する他の骨格を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１、２、３、４、５、又は６個のホスホロチオエート結合を含むことができ、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、又は６個のホスホロチオエート結合を含むことができ、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が独立して、１、２、３、４、５、または６個のホスホロチオエート結合を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２アルファＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１つ、２、３、または４つのホスホロチオエート結合を含み得、ＨＩＦ－２アルファＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、または４つのホスホロチオエート結合を含み得、または、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が独立して、１、２、３、または４つのホスホロチオエート結合を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖の３’末端から１～３位のヌクレオチドの間にある。ある実施形態において、１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合はセンス鎖の５’末端にあり、もう１つのホスホロチオエート結合はセンス鎖の３’末端にある。ある実施形態において、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合はセンス鎖の５’末端に位置し、別のホスホロチオエート結合はセンス鎖の３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド間のいかなるホスホロチオエートヌクレオチド間結合も含まないが、５’末端及び３’末端の両方の末端ヌクレオチドと、任意に存在する逆塩基残基末端キャップとの間に、１つ、２つ、又は３つのホスホロチオエート結合を含む。ある実施形態において、標的化リガンドは、ホスホロチオエート結合を介してセンス鎖に連結される。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から１～３位のヌクレオチド間、及び５’末端から１９～２１、２０～２２、２１～２３、２２～２４、２３～２５、又は２４～２６位のヌクレオチド間である。ある実施形態において、３つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から１～４位の間に位置し、第４のホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から２０～２１位の間に位置する。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に少なくとも３つ又は４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態において、２’－修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオシド間結合と組み合わされる。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表１に示されるＨＩＦ－２α遺伝子配列の位置又はその近傍にＨＩＦ－２α遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表１に開示される標的ＨＩＦ－２α１９－ｍｅｒ配列に対して完全に、実質的に、又は少なくとも部分的に相補的であるコア伸長配列を含む。
Figure 2022518384000017
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の位置１９が表１に開示された１９量体標的配列の位置１と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の位置１が、表１に開示される１９量体標的配列の位置１９と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の位置２が表１に開示された１９量体標的配列の位置１８と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ａＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の２～１８位（５’→３’）が、表１に開示される１９量体標的配列の１８～２位に位置するそれぞれの相補的塩基と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。
本明細書に開示されたＲＮＡｉ剤については、アンチセンス鎖の位置１におけるヌクレオチド（５’末端→３’末端）は、ＨＩＦ－２α遺伝子に対して完全に相補的であり得るか、又はＨＩＦ－２α遺伝子に対して非相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の位置１（５’末端→３’末端）におけるヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、又はｄＴである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の位置１（５’末端→３’末端）におけるヌクレオチドは、センス鎖とＡ：Ｕ又はＵ：Ａ塩基対を形成する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド（５’末端→３’末端）２－１８又は２－１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉセンス鎖は、表２又は表４、４．１、４．２又は４．３におけるセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチドの配列（５’末端→３’末端）１－１７、１－１８、又は２－１８を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖配列の（５’末端→３’末端）２－１８又は２－１９の配列を含むアンチセンス鎖、及び（ｉｉ）表２又は表４、４．１、４．２又は４．３のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド配列（５’末端→３’末端）１－１７又は１－１８の配列を含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下の表２に示されるコア１９量体ヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022518384000018
表２の配列を含む、又はそれからなるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、修飾ヌクレオチド又は未修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、表２の配列を含むか又はそれから構成されるセンス及びアンチセンス鎖配列を有するＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、全て又は実質的に全ての修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２のいずれかのアンチセンス鎖配列から０、１、２、又は３ヌクレオチドだけ異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２のセンス鎖配列のいずれかとは、０、１、２、又は３ヌクレオチドだけ異なる。
本明細書中で用いる場合、表２に開示されている配列に列挙されている各Ｎは、任意の及びすべての核酸塩基（修飾ヌクレオチド及び非修飾ヌクレオチドの両方に見られるものを含む）から独立して選択され得る。いくつかの実施形態において、表２に開示されている配列に列挙されているＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドに相補的な核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置でＮヌクレオチドと相補的でない核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置におけるＮヌクレオチドと同じ核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置でＮヌクレオチドとは異なる核酸塩基を有する。
ある種の修飾ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖、ならびにそれらの下にある未修飾核酸塩基配列を表３に示す。ある種の修飾されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖、ならびにそれらの下にある未修飾核酸塩基配列を表４に示す（同様に、４．１、４．２及び４．３に反映される）。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を形成する際に、表３及び４、ならびに上記の表２に列挙された基底にある塩基配列の各々のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニーリングすることによって形成される。表２又は表４、４．１、４．２、又は４．３に列挙された配列を含むセンス鎖は、２つの配列が連続する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相補性の領域を有する場合、表２又は表３に列挙された配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズされ得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかの配列のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の核酸塩基配列及び表２、表３又は表４、４．１、４．２又は４．３のいずれかの配列のアンチセンス鎖を有する二本鎖を含み、又はそれからなる。
修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖の例を表３に示す。修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖の例を表４に示す。
表３及び４ならびに４．１、４．２、及び４．３で使用されるように、修飾ヌクレオチド、標的化基、及びリンキング基を示すために、以下の表記が使用される：
Ａ＝アデノシン－３’－リン酸；
Ｃ＝シチジン－３’－リン酸；
Ｇ＝グアノシン－３’－リン酸；
Ｕ＝ウリジン－３’－リン酸
Ｉ＝イノシン－３’－リン酸
ａ＝２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－リン酸
ａｓ＝２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスホロチオエート
ｃ＝２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－リン酸
ｃｓ＝２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスホロチオエート
ｇ＝２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－リン酸
ｇｓ＝２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスホロチオエート
ｔ＝２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン－３’－リン酸
ｔｓ＝２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
ｕ＝２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－リン酸
ｕｓ＝２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
ｉ＝２’－Ｏ－メチルイノシン－３’－リン酸
ｉｓ＝２’－Ｏ－メチルイノシン－３’－ホスホロチオエートである
Ａｆ＝２’－フルオロアデノシン－３’－リン酸
Ａｆｓ＝２’－フルオロアデノシン－３’－ホスホロチオエート
Ｃｆ＝２’－フルオロシチジン－３’－リン酸
Ｃｆｓ＝２’－フルオロシチジン－３’－ホスホロチオエート
Ｇｆ＝２’－フルオログアノシン－３’－リン酸
Ｇｆｓ＝２’－フルオログアノシン－３’－ホスホロチオエート
Ｔｆ＝２’－フルオロ－５’－メチルウリジン－３’－リン酸
Ｔｆｓ＝２’－フルオロ－５’－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
Ｕｆ＝２’－フルオロウリジン－３’－リン酸
Ｕｆｓ＝２’－フルオロウリジン－３’－ホスホロチオエート
ｄＡ＝２’－デオキシアデノシン－３’－リン酸
ｄＡｓ＝２’－デオキシアデノシン－３’－ホスホロチオエート
ｄＣ＝２’－デオキシシチジン－３’－リン酸
ｄＣｓ＝２’－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオエート
ｄＧ＝２’－デオキシグアノシン－３’－リン酸
ｄＧｓ＝２’－デオキシグアノシン－３’－ホスホロチオエート
ｄＴ＝２’－デオキシチミジン－３’－リン酸
ｄＴｓ＝２’－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオエート
ｄＵ＝２’－デオキシウリジン－３’－リン酸
ｄＵ＝２’－デオキシウリジン－３’－ホスホロチオエート
ＡＵＮＡ＝２’，３’－ｓｅｃｏ－アデノシン－３’－リン酸
ＡＵＮＡｓ＝２’，３’－ｓｅｃｏ－アデノシン－３’－ホスホロチオエート
ＣＵＮＡ＝２’，３’－セコシチジン－３’－リン酸
ＣＵＮＡｓ＝２’，３’－セコシチジン－３’－ホスホロチオエート
ＧＵＮＡ＝２’，３’－ｓｅｃｏ－グアノシン－３’－リン酸
ＧＵＮＡｓ＝２’，３’－ｓｅｃｏ－グアノシン－３’－ホスホロチオエート
ＵＵＮＡ＝２’，３’－ｓｅｃｏ－ウリジン－３’－リン酸
ＵＵＮＡｓ＝２’、３’－ｓｅｃｏ－ウリジン－３’－ホスホロチオエート
ａＡｌｋ＝２’－Ｏ－プロパルギルアデノシン－３’－リン酸、表７を参照
ａＡｌｋｓ＝２’－Ｏ－プロパルギルアデノシン－３’－ホスホロチオエート、表７を参照
ｃＡｌｋ＝２’－Ｏ－プロパルギルシチジン－３’－ホスフェート、表７を参照
ｃＡｌｋｓ＝２’－Ｏ－プロパルギルシチジン－３’－ホスホロチオエート、表７を参照
ｇＡｌｋ＝２’－Ｏ－プロパルギルグアノシン－３’－リン酸、表７を参照
ｇＡｌｋｓ＝２’－Ｏ－プロパルギルグアノシン－３’－ホスホロチオエート、表７を参照
ｔＡｌｋ＝２’－Ｏ－プロパルギル－５－メチルウリジン－３’－ホスフェート、表７を参照
ｔＡｌｋｓ＝２’－Ｏ－プロパルギル－５－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート、表７を参照
ｕＡｌｋ＝２’－Ｏ－プロパルギルウリジン－３’－ホスフェート、表７を参照
ｕＡｌｋｓ＝２’－Ｏ－プロパルギルウリジン－３’－ホスホロチオエート、表７を参照
ａ ２Ｎ＝表７参照
ａ ２Ｎｓ＝表７参照
（ｉｎｖＡｂ）＝逆塩基性デオキシリボヌクレオチド、表７参照
（ｉｎｖＡｂ）ｓ＝逆塩基性デオキシリボヌクレオチド－５’－ホスホロチオエート、表７参照
ｓ＝ホスホロチオエート結合
（Ｃ６－ＳＳ－Ａｌｋ）＝表７参照
（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）＝表７参照
（Ｃ３－ＳＳ－Ｃ３）＝表７参照
（６－ＳＳ－６）＝表７参照
（ＮＨ２－Ｃ６）＝表７参照
（Ｃ６－ＮＨ２）＝表７参照
（ＴｒｉＡｌｋ＃）＝表７参照
（ＴｒｉＡｌｋ＃）ｓ＝表７参照
当業者であれば、配列（例えば、ホスホロチオエート結合「ｓ」）によって別段の指示がない限り、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ヌクレオチドモノマーは、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に連結されることを容易に理解するであろう。当業者が明確に理解するように、本明細書に開示された修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合を含めることは、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合に取って代わる。さらに、当業者は、所与のオリゴヌクレオチド配列の３’末端ヌクレオチドは、典型的には、生体外でリン酸部分の代わりに、所与のモノマーのそれぞれの３’位置にヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するであろうことを容易に理解するであろう。さらに、本明細書に開示された実施形態では、それぞれのストランド５’→３’を見るとき、デオキシリボースの３’位置がそれぞれのストランド上の先行するモノマーの３’末端で連結されるように、逆塩基対が挿入される。さらに、当業者が容易に理解し認識するように、本明細書に示されるホスホロチオネート化学構造は、典型的には、硫黄原子のアニオンを示すが、本明細書に開示される発明は、全てのホスホロチオネート互変異性体（例えば、硫黄原子が二重結合を有し、アニオンが酸素原子上にある場合）を包含する。本明細書に別途明示的に示されない限り、当業者のかかる理解は、本明細書に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の組成物を記載する際に使用される。
本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤と使用される結合基の特定の例は、以下の表７に提供される。本明細書中に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結又は結合され得る標的化リガンド及び／又は標的化基、及びＰＫエンハンサーの特定の例もまた、本明細書中に開示される。例えば、ある例では、ＰＫ増強化合物は、下記の表６に提供される。さらに、いくつかの実施形態において、ＰＫエンハンサーは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に配置され得る。
結合基には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：（ＮＨ２－Ｃ６）、（Ｃ６－ＮＨ２）、（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）、（６－ＳＳ－６）、（ＴｒｉＡｌｋ１）、（ＴｒｉＡｌｋ１）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ２）、（ＴｒｉＡｌｋ２）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ３）、（ＴｒｉＡｌｋ３）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ４）、（ＴｒｉＡｌｋ４）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ５）、（ＴｒｉＡｌｋ５）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ６）、（ＴｒｉＡｌｋ６）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ７）、（ＴｒｉＡｌｋ７）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ８）、（ＴｒｉＡｌｋ８）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ９）、（ＴｒｉＡｌｋ９）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１０）、（ＴｒｉＡｌｋ１０）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１１）、（ＴｒｉＡｌｋ１１）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１２）、（ＴｒｉＡｌｋ１２）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１３）、（ＴｒｉＡｌｋ１３）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、又は（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ。各センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、配列の５’末端及び／又は３’末端にコンジュゲートされた任意の標的化リガンド又は標的化基、リンキング基、及び／又はＰＫエンハンサー、ならびに他の標的化リガンド／基、他のリンキング基、及び／又は他のＰＫエンハンサーを有することができる。
Figure 2022518384000019
Figure 2022518384000020
Figure 2022518384000021
Figure 2022518384000022
Figure 2022518384000023
Figure 2022518384000024
Figure 2022518384000025
Figure 2022518384000026
Figure 2022518384000027
Figure 2022518384000028
Figure 2022518384000029
Figure 2022518384000030
Figure 2022518384000031
Figure 2022518384000032
Figure 2022518384000033
Figure 2022518384000034
上記の表４に示すように、ＨＩＦ－２αヌクレオチド配列の例の多くは、さらに、センス鎖のヌクレオチド配列の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方に反応性連結基を含むことが示されている。例えば、上の表４に示されるいくつかのＨＩＦ－２αヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の５’末端に（ＮＨ２－Ｃ６）結合基又は（ＴｒｉＡｌｋ）結合基を有する。同様に、上の表４に示すＨＩＦ－２αヌクレオチド配列のいくつかは、ヌクレオチド配列の３’末端に（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）又は（６－ＳＳ－６）結合基を有する。そのような反応性連結基は、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤への標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサーの連結を容易にするために配置される。連結反応又はコンジュゲーション反応は、当技術分野において周知であり、２つの分子又は反応体間の共有結合の形成を提供する。本発明の範囲で使用するのに適した抱合反応としては、アミドカップリング反応、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応、ヒドラゾン生成反応及びクリック化学環化付加反応が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルとして合成することができ、このエステルは、反応性アミノ基（例えば、ＮＨ２－Ｃ６）によって置換されて、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に標的化リガンドを結合させることができる。ある実施形態において、標的化リガンドは、アジドとして合成され、これは、例えば、クリック化学環化付加反応を介して、プロパルギル又はＤＢＣＯ基にコンジュゲートされ得る。
さらに、ヌクレオチド配列のいくつかは、センス鎖の３’末端でｄＴヌクレオチドを用いて合成され、続いて（３’→５’）リンカー（例えば、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）が合成され、いくつかの実施形態では、レジンからの切断後に使用して、例えば、ＰＫエンハンサー又は１以上の標的化リガンドなどのさらなる成分への結合を容易にすることができる。この様式での合成は、レジンに結合したｄＴ、続いて、リンカー及びセンス鎖の残りのヌクレオチドのカップリングを含む。本明細書に記載されるように、所望のＰＫエンハンサー（又は標的化リガンド）のコンジュゲーションの際に、末端ｄＴは分子から切断される。下記の表４．１は、上記の表４において同定されたが、３’末端ｄＴヌクレオチドを含まないヌクレオチド配列を示す。
さらに、下記の表４．２は、上記の表４で同定されたが、存在する末端結合基がないヌクレオチド配列を示す。
Figure 2022518384000035
Figure 2022518384000036
Figure 2022518384000037
Figure 2022518384000038
Figure 2022518384000039
Figure 2022518384000040
Figure 2022518384000041
Figure 2022518384000042
Figure 2022518384000043
Figure 2022518384000044
Figure 2022518384000045
Figure 2022518384000046
Figure 2022518384000047
Figure 2022518384000048
本明細書中で議論されるように、いくつかの実施形態において、１以上の標的リガンド及び／又はＰＫエンハンサーは、ＲＮＡｉ剤に連結されているか、又は複合化されている。ある実施形態において、標的化リガンド（又は標的化基）及び／又はＰＫエンハンサーは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、及び／又は１以上の内部ヌクレオチドに連結される。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の合成は、反応基が、標的化リガンド又はＰＫエンハンサーなどのさらなる成分への結合を容易にするために容易に利用できるように設計することができる。以下の表４．３は、１以上の標的化リガンド及び／又はＰＫエンハンサー（まとめて、下記にＺとして示される）に連結した後、表４に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖を示す。
表４．３．標的化リガンドおよび／またはＰＫエンハンサーの位置を示すＨＩＦ－２アルファＲＮＡｉ剤センス鎖配列
（各Ｘ、Ｙ、およびＺは、独立して薬理学的部分（たとえば、標的化リガンド、標的化グループ、および／またはＰＫエンハンサー）；（Ｚ）３＝連結された３つのリガンド（たとえば、三座標的化グループ）；ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、およびｃＺは、それぞれウリジン、アデノシン、グアノシン、およびシチジンを表し、ヌクレオチドの２’位置（ＨＩＦの場合）にリンクされた薬理学的部分（たとえば、標的化リガンド、標的化グループ、および／またはＰＫエンハンサー）を有する。本明細書の実施例に開示されている２つのアルファＲＮＡｉ剤は、２’－０－プロパルギル基にカップリングすることによって完成された。）
Figure 2022518384000049
Figure 2022518384000050
Figure 2022518384000051
Figure 2022518384000052
Figure 2022518384000053
Figure 2022518384000054
Figure 2022518384000055
Figure 2022518384000056
Figure 2022518384000057
Figure 2022518384000058
Figure 2022518384000059
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニーリングすることによって形成される。表２又は表４（又は４．１、４．２、又は４．３）に列挙された配列を含むセンス鎖は、２つの配列が連続する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相補性の領域を有する場合、表２又は表３に列挙された配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズされ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表３のいずれかのアンチセンス鎖配列から０、１、２、又は３ヌクレオチドだけ異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表４のセンス鎖配列のいずれかとは、０、１、２、又は３ヌクレオチドだけ異なる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかの配列のヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ因子アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかの配列の１－１７、２－１７、１－１８、２－１８、１－１９、２－１９、１－２０、２－２０、１－２１、２－２１、１－２２、２－２２、１－２３、２－２３、１－２４、又は２－２４ヌクレオチド配列（５’末端→３’末端）を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表３における修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含むか、又はそれらの修飾配列からなる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２又は表４（又は表４．１、４．２又は４．３）のいずれかの配列のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、ヌクレオチドの配列（５’末端－３’末端）１－１７、２－１７、３－１７、４－１７、１－１８、２－１８、３－１８、４－１８、１－１９、２－１９、３－１９、４－１９、１－２０、２－２０、３－２０、４－２０、１－２１、２－２１、３－２１、４－２１、１－２２、２－２２、３－２２、４－２２、１－２３、２－２３、３－２３、４－２３、１－２４、２－２４、３－２４、または４－２４を含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表４（又は表４．１、４．２、又は４．３）の修飾された配列のいずれか１つの修飾された配列を含むか、又はそれらからなる。
本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤については、アンチセンス鎖の位置１（５’末端→３’末端）におけるヌクレオチドは、ＨＩＦ－２α遺伝子に対して完全に相補的であり得るか、又はＨＩＦ－２α遺伝子に対して非相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の位置１（５’末端→３’末端）におけるヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、又はｄＴ（又はその修飾されたバージョン）である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の位置１（５’末端→３’末端）におけるヌクレオチドは、センス鎖とＡ：Ｕ又はＵ：Ａ塩基対を形成する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド（５’末端→３’末端）２－１８又は２－１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉセンス鎖は、表２又は表４（又は表４．１、４．２又は４．３）のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチドの配列（５’末端→３’末端）１－１７又は１－１８を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２又は表３のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド配列（５’末端→３’末端）２－１８又は２－１９を含むアンチセンス鎖、及び（ｉｉ）表２又は表４（又は表４．１、４．２又は４．３）のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド配列（５’末端→３’末端）１－１７又は１－１８を含むセンス鎖
表２又は表４に列挙された配列を含むセンス鎖は、２つの配列が連続する１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相補性の領域を有する場合、表２又は表３に列挙された配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表４（又は表４．１、４．２、又は４．３）のいずれかの修飾された配列の修飾された配列からなるセンス鎖、及び表３のいずれかの修飾された配列の修飾された配列からなるアンチセンス鎖を有する。いくつかの代表的な配列対は、二重ＩＤ番号によって例示される。表５に示す。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二重鎖ＩＤ番号のいずれか１つによって表される二重鎖を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二重鎖ＩＤ番号のいずれかによって表される二重鎖のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２アα ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二重鎖ＩＤ番号のいずれかによって表される二重鎖のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、ならびに標的化リガンド、標的化基、および／または連結基を含み、標的化リガンド、標的化基、および／または連結基は、センス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合（結合）されている。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二重鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二重鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列、ならびに標的化リガンド、標的化基、および／または連結基を含み、標的化リガンド、標的化基、および／または連結基は、センス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合している。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び表２又は表５のいずれかのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含み、さらに標的化基を含む。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び表５のいずれかのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含み、さらにインテグリン受容体リガンド標的化基を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び表５のいずれかのヌクレオチド鎖／センス鎖二本鎖を含み、（ＮＨ２－Ｃ６）、（Ｃ６－ＮＨ２）、（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）、（６－ＳＳ－６）、（ＴｒｉＡｌｋ１）、（ＴｒｉＡｌｋ１）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ２）、（ＴｒｉＡｌｋ２）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ３）、（ＴｒｉＡｌｋ３）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ４）、（ＴｒｉＡｌｋ４）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ５）、（ＴｒｉＡｌｋ５）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ６）、（ＴｒｉＡｌｋ６）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ７）、（ＴｒｉＡｌｋ７）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ８）、（ＴｒｉＡｌｋ８）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ９）、（ＴｒｉＡｌｋ９）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１０）、（ＴｒｉＡｌｋ１０）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１１）、（ＴｒｉＡｌｋ１１）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１２）、（ＴｒｉＡｌｋ１２）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１３）、（ＴｒｉＡｌｋ１３）ｓ、（ＴｒｉＡｌｋ１４）、または（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓからなる群から選択される１以上の連結基をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表３又は表４、４．１、４．２又は４．３のいずれかのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖ヌクレオチド配列の修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖及び表５のいずれかの二本鎖のアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖ヌクレオチド配列の修飾ヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含み、さらにインテグリン標的化基を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、表５のいずれかの二本鎖を含む、それからなる、又は本質的にそれらからなる。
Figure 2022518384000060
Figure 2022518384000061
Figure 2022518384000062
Figure 2022518384000063
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサーに任意選択的に結合又はコンジュゲートされる前又は後のいずれかで、塩、混合塩、又は遊離酸として調製されるか、又は提供される。本明細書中に記載されるＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２α遺伝子を発現する細胞への送達時に、インビボ及び／又はインビトロにおける１以上のＨＩＦ－２α遺伝子の発現を阻害又はノックダウンする。
標的化リガンドと標的化グループ
標的化基又は標的化部分は、結合体又はＲＮＡｉ剤の細胞特異的（ある場合には、器官特異的）分布及び細胞特異的（又は器官特異的）取り込みを改善するためにそれらが結合された結合体又はＲＮＡｉ剤の薬物動態学的又は生体内分布特性を増強する。標的化基は、一価、二価、三価、四価、又はそれが指向される標的に対してより高い原子価を有することができる。代表的な標的化基には、細胞表面分子、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、及び細胞表面分子に対する親和性を有する抗体模倣物に対する親和性を有する化合物が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、標的化基は、ＰＥＧリンカー、又は１、２、又は３つのアバシック及び／又はリビトール（アバシックリボース）残基などのリンカーを用いてＲＮＡｉ剤に連結され、いくつかの例では、リンカーとして役立つことができる。ある実施形態において、標的化基は、インテグリン標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤は、標的化基に結合される。ある実施形態において、標的化リガンドは、ＲＮＡｉ剤の、目的の細胞上の特定の細胞受容体に結合する能力を増強する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤に結合した標的リガンドは、インテグリン受容体に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤と共に使用するための適切な標的化リガンドは、インテグリンα－ｖ－β３、インテグリンα－ｖ－β－５、又はこれらのインテグリンの両方に対する親和性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、式：
Figure 2022518384000064
の化合物を含む１以上のインテグリン標的化リガンドに連結され、式中、
Ｘは、－Ｃ（Ｒ３）２－、－ＮＲ３－、
Figure 2022518384000065
であり；
Ｙは、アルキレン鎖中に１～８個の炭素原子を有する場合には置換されたアルキレンであり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ３、又はＳであり；
Ｒ１は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたシクロアルキルであり、又はＲ１がＲＮＡｉ剤を含み；
Ｒ２は、Ｈであり、任意に置換されたアルキルであり、又はＲ２はＲＮＡｉ剤を含み；
Ｒ３の各場合は、Ｈ及び任意に置換されたアルキルからなる群から独立して選択され、又はＲ３はＲＮＡｉ剤を含み；
Ｒ４は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；並びに
Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の任意の場合、及びＲ４のうちの少なくとも１つがＲＮＡｉ剤を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下の構造の１つを含む１つ以上のインテグリン標的化リガンドに連結される：
Figure 2022518384000066
Figure 2022518384000067
Figure 2022518384000068
Figure 2022518384000069
Figure 2022518384000070
Figure 2022518384000071
Figure 2022518384000072
Figure 2022518384000073
は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤との結合点を示す。
いくつかの実施形態において、標的化基は、「クリック」化学反応を用いてＲＮＡｉ剤に結合される。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１以上のアルキン含有基で官能化され、標的化リガンドは、アジド含有基を含む。反応すると、アジドとアルキンはトリアゾールを生成する。反応スキームの例を以下に示す。
Figure 2022518384000074
式中、ＴＬは標的化リガンドを含み、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含む。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２つ以上の標的化リガンドを含み得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１～２０の標的化リガンドを含む。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９の標的化リガンドから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２以上の標的化リガンドを含む標的化基を含む。ある実施形態において、標的化基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端又は３’末端でコンジュゲートされ得る。ある実施形態において、標的化基は、ＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤上の内部ヌクレオチドに結合され得る。ある実施形態において、標的化基は、「二座」標的化基と呼ばれる、一緒に連結された２つの標的化リガンドからなり得る。ある実施形態において、標的化基は、「三座」標的化基と呼ばれる、一緒に連結された３つの標的化リガンドからなり得る。ある実施形態において、標的化基は、「四座配位」標的化基と呼ばれる、一緒に連結された４つの標的化リガンドからなり得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’末端又は５’末端にコンジュゲートされた標的化基と、内部ヌクレオチドにコンジュゲートされた標的化リガンドとの両方を含み得る。ある実施形態において、三座配位子標的化基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされ、少なくとも１つの標的化リガンドは、センス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされる。さらなる実施形態において、三座配位子標的化基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされ、４つの標的化リガンドは、センス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、４つの標的リガンドは、センス鎖の２、４、６、及び８ヌクレオチド位置にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下の式の１以上の標的化基に連結される：
Figure 2022518384000075
Figure 2022518384000076
は、接続点を示す。いくつかの実施形態において、結合点は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端である。
内部連結標的リガンド
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のいくつかの実施形態は、センス鎖又はアンチセンス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされた標的化リガンドを含む。ある実施形態において、最大１５個の標的リガンドが、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。ある実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の標的化リガンドは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。ある実施形態において、１～５（例えば、１、２、３、４、又は５）標的リガンドは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされる。ある実施形態において、３～４個の標的リガンドは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、内部標的化リガンドの配置は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の効力又は効力に影響し得る。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のいくつかの実施形態において、標的化基はセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされ、少なくとも１０ヌクレオチドはセンス鎖の５’末端に位置する三座配位子標的化基とセンス鎖の次に最も近い標的化配位子との間に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも５ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端に位置する三座配向基とセンス鎖の次の最も近接する標的化配位子との間に配置される。
２つ以上の標的リガンドがＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の内部ヌクレオチドに位置する内部ヌクレオチドにコンジュゲートされるいくつかの実施形態において、標的化リガンドにコンジュゲートされる２つの内部ヌクレオチドの間に位置する標的化リガンドにコンジュゲートされない少なくとも１つのヌクレオチドの空間が存在する。２つ以上の標的化リガンドがＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖にコンジュゲートされているいくつかの実施形態において、標的化リガンドにコンジュゲートされていない少なくとも２つのヌクレオチドは、標的化リガンドにコンジュゲートされている２つの内部ヌクレオチドの間に配置される。
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、アンチセンス鎖上の５’末端ヌクレオチドと塩基対を形成する最も遠い３’ヌクレオチドから出発して、３’から５’に番号が付されたセンス鎖の２、４、及び６ヌクレオチドにコンジュゲートされる。ある実施形態において、標的化リガンドは、アンチセンス鎖上の５’末端ヌクレオチドと塩基対を形成する３’末端ヌクレオチドからの２、４、６及び８ヌクレオチド（３’→５’）にコンジュゲートされる。
薬物動態増強薬
いくつかの実施形態において、薬物動態（ＰＫ）エンハンサーは、ＲＮＡｉ剤の所望の細胞又は組織への送達を容易にするために、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結される。ＰＫ増強化合物は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤上の１以上のリンカーへの結合を容易にするために容易に存在する、マレイミド又はアジド基のような反応性基を有する化合物を合成することができる。ある実施形態において、ＰＫエンハンサーは、マレイミドとして合成され得、本明細書に記載される反応を用いてＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされ得る。「クリック」化学又はアミド抱合のような他の抱合反応もまた使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＫエンハンサーは、約２０～１０００エチレンオキシド（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）単位を有する脂肪酸、脂質、アルブミン結合剤、抗体結合剤、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリアミノ酸、及び直鎖又は分枝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である分子を含み得る。
いくつかの実施形態において、ａＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤は、以下の式の構造を有する化合物を含むＰＫエンハンサーに連結される：
ここで、Ｙは、任意に置換された飽和又は不飽和の
Figure 2022518384000077
脂肪族鎖であり、ｎは５～２５の整数である。
いくつかの実施形態において、ａＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤は、以下の構造を有する化合物を含むＰＫエンハンサーに連結される：
Figure 2022518384000078
いくつかの実施形態において、ａＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤は、以下の構造を有する化合物を含むＰＫエンハンサーに連結される：
Figure 2022518384000079
下の表６は、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結するための出発物質として使用することができる、ある例示的なＰＫ増強化合物を示す。ＰＫ増強化合物は、当技術分野における任意の公知の方法を用いて、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に添加することができる。
Figure 2022518384000080
Figure 2022518384000081
Figure 2022518384000082
Figure 2022518384000083
Figure 2022518384000084
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１以上のＰＫエンハンサーを含み得る。 ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又はそれ以上のＰＫエンハンサーを含む。
ＰＫエンハンサーは、当技術分野における任意の公知の方法を使用して、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に結合され得る。ある実施形態において、ＰＫエンハンサーは、マレイミド部分を含み得、ジスルフィド結合を含むＲＮＡｉ剤と反応して、ＰＫエンハンサーを含むＲＮＡｉ剤を形成し得る。ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ－付加反応によりマレイミドに加えることができる。反応スキームの例を以下に示す。
Figure 2022518384000085
ここで、ＰＫはＰＫエンハンサーを含み、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含み、Ｒは当技術分野で公知の任意の適切なグループであり得る。上記の反応式のいくつかの例では、Ｒはヘキシル（Ｃ６Ｈ１３）のようなアルキル基である。
いくつかの実施形態において、ＰＫエンハンサーは、アジド部分を含み、アルキンを含むＲＮＡｉ剤と反応させて、ＰＫエンハンサーを含むＲＮＡｉ剤を形成することができる。ペアは、下記の一般反応スキームの「クリック」反応を用いて反応させることができる。
Figure 2022518384000086
ここで、ＰＫはＰＫエンハンサーを含み、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＫエンハンサーは、センス又はアンチセンス鎖の５’末端、センス又はアンチセンス鎖の３’末端、又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、ａＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’末端でジスルフィド含有部分と共に合成され、ＰＫエンハンサーは、上記の一般的合成スキームを用いてセンス鎖の３’末端とコンジュゲートされ得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２’－０－プロパルギル修飾ヌクレオチド（例えば、表７を参照）を含むように合成され、ＰＫエンハンサーは、上記の一般的合成スキームを用いて、内部ヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態において、ＰＫエンハンサーをＲＮＡｉ剤に結合させた後、ＰＫエンハンサーは以下の式を有し得る：
Figure 2022518384000087
Figure 2022518384000088
Figure 2022518384000089
Figure 2022518384000090
Figure 2022518384000091
ここで
Figure 2022518384000092
は、ＲＮＡｉ因子への結合点を示す。
連結基及び送達ビヒクル
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、連結基、又は送達ビヒクルを含むが、これらに限定されない、１以上の非ヌクレオチド基を含有するか、又はそれらに結合される。非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤の標的化、送達、又は付着を増強することができる。結合基の非限定的な例を表７に示す。非ヌクレオチド基は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの３’末端及び／又は５’末端に共有結合され得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’及び／又は５’末端に連結された非ヌクレオチド基を含む。ある実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’末端に連結される。非ヌクレオチド基は、リンカー／リンキング基を介してＲＮＡｉ剤に直接的又は間接的に連結され得る。ある実施形態において、非ヌクレオチド基は、不安定、切断可能、又は可逆的結合又はリンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結される。
いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、結合体の細胞又は組織特異的分布及び細胞特異的取り込みを改善するために結合されているＲＮＡｉ剤又は結合体の薬物動態学的又は生体内分布特性を増強する。ある実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤のエンドサイトーシスを増強する。
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、５’－末端及び／又は３’－末端に、アミノ基（本明細書ではアミンとも称する）のような反応基を有するように合成することができる。反応基は、その後、当技術分野で典型的な方法を用いて、標的化部分を付着させるために使用され得る。
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にＮＨ２－Ｃ６基を有するように合成される。続いて、末端アミノ基を反応させて、例えば、１以上のインテグリン（インテグリン標的化リガンド）又はＰＫエンハンサーに対する親和性を有する化合物を含む基とコンジュゲートを形成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’－末端に１つ以上のアルキン基を有するように合成される。末端アルキン基は、続いて反応して、例えば、標的化リガンドを含む基とコンジュゲートを形成することができる。
いくつかの実施形態において、標的化基は、インテグリン標的化リガンドを含む。ある実施形態において、インテグリン標的化リガンドは、インテグリンα－ｖ－β３及び／又はインテグリンα－ｖ－β５に親和性を有する化合物を含む。インテグリン標的化リガンドの使用は、そのそれぞれの表面上にそれぞれのインテグリンを有する細胞への細胞特異的標的化を促進することができ、インテグリン標的化リガンドの結合は、それが結合されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のｃｃＲＣＣ細胞のような細胞への侵入を促進することができる。標的リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサーは、当技術分野で一般的に公知の方法を用いて、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の３’末端及び／又は５’末端、及び／又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の内部ヌクレオチドに結合させることができる。インテグリンαｖβ３／αｖβ５のような標的化リガンド及び標的化基の調製は、例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれ米国仮特許出願第６２／６６３，７６３号に記載されている。
本開示の実施形態は、インビボでｃｃＲＣＣ細胞にＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を送達するための医薬組成物を含む。このような薬学的組成物は、例えば、インテグリンａｎｂ３及び／又はインテグリンαｖβ５に対して親和性を有するインテグリン標的化リガンドを含む標的化基に結合されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含むことができる。ある実施形態において、標的化リガンドは、インテグリンａｎｂ３及び／又はインテグリンαｖβ５に対する親和性を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、リンキング基を有して合成され、次いで、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサー、又はデリバリーポリマーなどの別のタイプのデリバリービヒクルへの共有結合を促進することができる。連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に連結され得る。ある実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖に連結される。ある実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’末端又は３’末端にコンジュゲートされる。ある実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる。結合基の例としては、限定されるものではないが、Ａｌｋ－ＳＭＰＴ－Ｃ６、Ａｌｋ－ＳＳ－Ｃ６、ＤＢＣＯ－ＴＥＧ、Ｍｅ－Ａｌｋ－ＳＳ－Ｃ６、及びＣ６－ＳＳ－Ａｌｋ－Ｍｅ、反応基、例えば第一級アミン及びアルキン、アルキル基、非塩基／ヌクレオチド、アミノ酸、トリアルキン官能基、リビトール、及び／又はＰＴＧ基が含まれる。
リンカー又はリンキング基は、１つの化学基（ＲＮＡｉ剤など）又は関心のあるセグメントを別の化学基（標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサー、又はデリバリーポリマーなど）又は１つ以上の共有結合を介して関心のあるセグメントに連結する２つの原子間の連結である。不安定な結合は不安定な結合を含む。結合は、場合により、２つの結合した原子間の距離を増加させるスペーサーを含むことができる。スペーサーは、さらに、結合に柔軟性及び／又は長さを付加することができる。スペーサーは、限定されるものではないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基を含み、これらの各々は、１つ以上のヘテロ原子、ヘテロ環、アミノ酸、ヌクレオチド、及び糖を含み得る。スペーサー基は、当該技術分野において周知であり、前述のリストは、明細書の範囲を限定することを意図していない。
いくつかの実施形態において、標的化基は、さらなるリンカーを使用することなく、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結される。ある実施形態において、標的化基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤への結合を容易にするために容易に提示されるリンカーを有するように設計される。ある実施形態において、２以上のＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２以上のＲＮＡｉ剤は、同じリンカーを用いて、それらのそれぞれの標的化基に連結され得る。ある実施形態において、２以上のＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２以上のＲＮＡｉ剤は、異なるリンカーを用いて、それらのそれぞれの標的化基に連結される。
表２、３、および４（または表４．１、４．２、または４．３）にリストされているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のヌクレオチド配列は、修飾されているかどうかにかかわらず、３’および／または５’の標的化基、連結基、薬物動態エンハンサーを含む場合がある。表３および４に記載され、または本明細書に記載されている、３’または５’標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサー、または連結基を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤配列のいずれも、代わりに３’または５’標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサーを含まなくてもよく、異なる３’または５’標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサーを含まなくてもよく、または限定されないが、表６及び７に記載された、異なる３’または５’標的化リガンド、標的化基、ＰＫエンハンサーを含んでもよい。表５に記載されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤二重鎖のいずれも、修飾されているかどうかにかかわらず、標的リガンド、標的基、連結基、またはＰＫエンハンサーをさらに含むことができ、図６及び７に示されるものに限定されないが含み、標的化基または連結基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤二重鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’または５’末端に結合することができる。
いくつかの実施形態において、連結基は、本明細書に記載されるａＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端又は３’末端に合成的に結合され得る。ある実施形態において、連結基は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に合成的にコンジュゲートされる。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に結合された結合基は、トリアルキン結合基であり得る。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、以下の式：
Figure 2022518384000093
を有する１以上の三座配位子標的化基、又は製薬上許容されるその塩に連結され、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ、任意に置換されたアルキレンを含む独立したリンカーであり；
Ｌ４は、任意に置換されたアルキレン、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたシクロアルキルを含むリンカーであり；
Ｒ５は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；
ＴＬは、標的リガンドであり；並びに
Ｙは、Ｏ又はＳである。
他の実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、下記の表７に示されるように、ＴｒｉＡｌｋ１－１４のいずれか１つの式を有するリンカーを用いて、１以上の三座配位子標的化基に連結される。式ＩＩの化合物の合成方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８２３２「トリアルキン結合剤及び使用方法」に記載されている。
特定の修飾ヌクレオチド及び連結基の例を表７に示す。
Figure 2022518384000094
Figure 2022518384000095
Figure 2022518384000096
Figure 2022518384000097
Figure 2022518384000098
Figure 2022518384000099
Figure 2022518384000100
Figure 2022518384000101
Figure 2022518384000102
Figure 2022518384000103
Figure 2022518384000104
Figure 2022518384000105
Figure 2022518384000106
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＴｒｉＡｌｋ １４：
Figure 2022518384000107
又は、ＴｒｉＡｌｋ １４ｓ：
Figure 2022518384000108
の構造を有するリンカーを含む。ＴＬは、（ＴｒｉＡｌｋ １４）又は（Ｔｒｉａｌｋ １４）ｓの化合物との「クリック」反応の結果である標的化リガンド、及びアジドを含む標的化リガンドを含む。
代わりに、当技術分野で公知の他の連結基を使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を１以上の標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫエンハンサーに連結することに加えて、又は代替的に、送達ビヒクルを使用して、ＲＮＡｉ剤を細胞又は組織に送達することができる。送達ビヒクルは、細胞又は組織へのＲＮＡｉ剤の送達を改善することができる化合物であり、限定されるものではないが、両親媒性ポリマー、膜活性ポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド、脂質、可逆的修飾ポリマー又はペプチド、又は可逆的修飾膜活性ポリアミンなどのポリマーを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、当技術分野で利用可能な脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ又は他の送達系と組み合わせることができる。ＲＮＡｉ剤はまた、標的化基、脂質（コレステロール及びコレステロール誘導体を含むが、これらに限定されない）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣに化学的にコンジュゲートされ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／０２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、及びＷＯ２０１２／０８３１８５、ＷＯ２０１３／０３２８２９、ＷＯ２０１３／１５８１４１を参照されたい）
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書中に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の１以上を含む、それらからなる、又は本質的にそれらからなる医薬組成物を提供する。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量の活性薬学的成分（ＡＰＩ）、及び場合により１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）とは、原薬（ＡＰＩ、治療用製剤）以外の物質であって、意図的にドラッグデリバリーシステムに含まれるものをいう。添加剤は、意図された用量で治療効果を発揮しないか、又は発揮することを意図していない。添加剤は、ａ）製造中のドラッグデリバリーシステムの処理を助けること、ｂ）原薬の安定性、バイオアベイラビリティ又は患者の受容性を保護、支持又は増強すること、ｃ）製品の同定を助けること、及び／又はｄ）全体的な安全性、有効性、貯蔵又は使用中の原薬のデリバリーのその他の特性を向上させること、薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。
賦形剤には、限定されないが、吸収促進剤、付着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、送達ポリマー、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、防腐剤、生理食塩水、塩、溶剤、糖、懸濁剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、張性剤、ビヒクル、撥水剤、および湿潤剤が含まれる。
本明細書に記載される医薬組成物は、医薬組成物中に一般的に見出される他の追加の成分を含有することができる。いくつかの実施形態において、追加の成分は、薬学的に活性な物質である。薬学的に活性な物質は、限定されるものではないが、抗掻痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン薬、ジフェンヒドラミンなど）、小分子薬物、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、及び／又はワクチンを含む。
医薬組成物はまた、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、におい剤、浸透圧変化のための塩、緩衝剤、コーティング剤、又は酸化防止剤を含んでもよい。それらはまた、既知の治療上の利点を有する他の薬剤を含んでもよい。
薬学的組成物は、局所的又は全身的治療が望ましいかどうか、及び治療すべき領域に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチによる）、肺（例えば、ネブライザー、気管内、鼻腔内）、表皮、経皮、経口又は非経口によるものを含めた粉末又はエアロゾルの吸入又は通気による）など、当技術分野で一般的に知られたいずれの方法によっても行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；皮下（例えば、埋め込みデバイスを介して）、頭蓋内、実質内、髄腔内、及び脳室内投与が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、皮下注射によって投与される。医薬組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質又は軟質ゼラチンカプセル、溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態で経口投与することができる。投与は、例えば座薬を用いて直腸に；例えば軟膏、クリーム、ゲル又は溶液を用いて局所的又は経皮的に；又は、例えば注射可能な溶液を用いて非経口的に行うこともできる。
注射可能な使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォアＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、パルシッパニー、ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによって行うことができる。
無菌注射用溶液は、必要に応じて、活性化合物を適当な溶媒中に、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせと混合し、次いでフィルター滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これは、活性成分の粉末と、その事前に無菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分とを生じる。
関節内投与に適した製剤は、微結晶形態、例えば、水性微結晶懸濁液の形態であり得る、本明細書中に記載されたいずれかのリガンドの無菌水性調製物の形態であり得る。リポソーム製剤又は生分解性ポリマーシステムは、関節内及び眼内投与の両方のために、本明細書に記載されるリガンドのいずれかを提示するために使用することもできる。
活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のような、体からの迅速な除去から化合物を保護する担体で調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている方法に従って調製することができる。
医薬組成物は、医薬組成物中に一般的に見出される他の追加の成分を含有することができる。そのような追加の成分は、限定されるものではないが、抗掻痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、又は抗炎症薬（例えば、抗ヒスタミン薬、ジフェンヒドラミンなど）を含む。本明細書中で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、又は単に「有効量」は、薬理学的、治療的又は予防的結果を生成するための薬理学的活性剤のその量を指す。
ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含有する媒体も本発明の目的であり、このような薬剤の製造方法は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含有する１種以上の化合物、及び所望であれば既知の治療効果を有する１種以上の他の物質を薬学的に許容される形態にすることを含む。
本明細書に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、キット、容器、パック、又はディスペンサーに包装又は包装することができる。ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、予め充填されたシリンジ又はバイアルに包装され得る。
治療法及び発現阻害
本明細書に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の投与から利益を受けるであろう疾患又は障害を有する対象（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２α ｍＲＮＡおよび／またはＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）タンパク質レベルの発現の減少および／または阻害から利益を得るであろう対象（例えば、ヒト）を治療するために使用することができる。例えば、癌、腎癌、明細胞腎細胞癌、非小細胞肺癌、星状細胞腫（脳癌）、膀胱癌、乳癌と診断された、またはそれらに関連する症状に苦しんでいる対象、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生疾患、および関節リウマチが挙げられる。
いくつかの実施形態において、対象は、任意の１以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の治療有効量を投与される。対象の治療には、治療的及び／又は予防的治療が含まれ得る。対象には、本明細書中に記載される任意の１以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の治療有効量が投与される。対象は、ヒト、患者、又はヒト患者であり得る。対象は、成人、青年、小児、又は乳児であってもよい。本明細書中に記載される医薬組成物の投与は、ヒト又は動物に対するものであり得る。
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２α関連疾患若しくは障害を有する、又はＨＩＦ－２α遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患若しくは障害を有する対象における少なくとも１つの症状を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡの減少から恩恵を受けるか、又は少なくとも部分的にはメディエートされるであろう疾患又は障害を有する対象の臨床症状を治療又は管理するために使用される。対象には、本明細書に記載される１種以上のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤含有組成物の治療有効量が投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含む組成物を、処理される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のいずれか１つ以上の予防的に有効な量を投与され、それによって、少なくとも１つの症状を予防又は阻害することによって対象を治療する。
特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において、少なくとも部分的にはＨＩＦ－２α遺伝子発現によって媒介される疾患、障害、状態、又は病理学的状態の治療方法を提供し、ここで、方法は、本明細書に記載されるいずれかのＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を患者に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が投与される対象のＨＩＦ－２α遺伝子の遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与される前に、又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与されない対象に対して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超まで減少される。対象における遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、対象の細胞、細胞群、及び／又は組織において低下させることができる。
いくつかの実施形態において、記載されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤が投与された対象におけるＨＩＦ－２αタンパク質レベルは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与される前に、又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を投与されない対象に対して、対象に対して少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超まで減少される。対象中のタンパク質レベルは、対象の細胞、細胞群、組織、血液、及び／又は他の流体中で低下させることができる。
ＨＩＦ－２αｍＲＮＡレベル及びＨＩＦ－２αタンパク質レベルの減少は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。本明細書中で用いる場合、ＨＩＦ－２αｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルの減少又は減少は、まとめて本明細書中では、ＨＩＦ－２αの減少又は減少、又はＨＩＦ－２αの発現の抑制又は減少と称される。本明細書に記載される実施例は、ＨＩＦ－２α遺伝子発現の阻害を評価するための公知の方法を例示する。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、ＨＩＦ－２α遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状の治療に使用するための医薬組成物の調製に使用され得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害又は症状は、癌、腎癌、明細胞腎細胞癌、非小細胞肺癌、星状細胞腫（脳癌）、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、大腸癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、又は関節リウマチである。
いくつかの実施形態において、対象を処置する方法は、対象の体重に依存する。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、対象の約３ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。他の実施形態では、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、対象の約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は分割投与で投与することができ、これは、２つの投与が短い（例えば、２４時間未満）時間内に対象に与えられることを意味する。いくつかの実施形態において、所望の１日量の約半分が最初の投与において投与され、所望の１日量の残りの約半分が最初の投与の約４時間後に投与される。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、週１回（週１回）投与され得る。他の実施形態では、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を隔週（隔週に１回）に投与することができる。
いくつかの実施形態において、投与されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の用量は、週１回投与される２２５ｍｇの固定用量である。いくつかの実施形態において、投与されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の用量は、週１回投与される５２５ｍｇの固定用量である。いくつかの実施形態において、投与されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の用量は、週１回投与される１，０５０ｍｇの固定用量である。いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、静脈内注入によって投与される。
いくつかの実施形態において、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤又はＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含有する組成物は、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状の治療に使用され得る。ある実施形態において、ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害又は症状は、ｃｃＲＣＣである。
細胞、組織、及び非ヒト生物
本明細書に記載されるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つを含む細胞、組織、及び非ヒト生物が意図される。細胞、組織、又は非ヒト生物は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を、当技術分野で利用可能な任意の手段により、細胞、組織、又は非ヒト生物に送達することによって作製される。ある実施形態において、細胞は、限定されるものではないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。
上述の実施形態及び項目は、以下の非限定的な実施例で示されている。
以下の実施例は限定的ではなく、本明細書に開示された特定の実施形態を例示することを意図している。
実施例１．ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を含有する組成物の合成
以下は、本明細書に記載の非限定的実施例に例示される、ある種のＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤及びその複合体の合成のための一般的な手順を記載する。
ＲＮＡｉ剤の合成。ＲＮＡｉ剤は、当該分野で一般に知られている方法を用いて合成することができる。本明細書に記載される実施例に例示されるＲＮＡｉ剤の合成のために、オリゴヌクレオチド合成に使用される固相上で、ホスホラミダイト技術に従って、ＲＮＡｉ剤のセンス及びアンチセンス鎖を合成した。スケールに応じて、ＭｅｒＭａｄｅ９６Ｅ（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｍｅｒａ Ｍａｄｅ１２（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。合成は、制御された孔ガラス（ＣＰＧ、５００Ａ又は６００Ａ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡから入手）又はポリスチレン（Ｋｉｎｏｖａｔｅ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ，ＵＳＡから入手）で作られた固体支持体上で行われた。すべてのＲＮＡ及び２’修飾ＲＮＡホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）、又はＨｏｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（米国ノースカロライナ州モリスビル）から購入した。具体的には、使用された以下の２’－Ｏ－メチルホスホラミダイトは、（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ６－（ベンゾイル）－２’－Ｏ－メチル－アデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－ＮＮ－ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－（アセチル）－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－アミノ）ホスホルアミダイト、（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ２－（イソブチリル）－２’－Ｏ－メチル－グアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、および５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトを含む。２’－デオキシ－２’－フルオロ－ホスホルアミダイトおよび２’－Ｏ－プロパルギルホスホルアミダイトは、２’－Ｏ－メチルホスホルアミダイトと同じ保護基を有した。５’－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－イノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ．Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州）から購入した。脱塩基（３’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デオキシリボース－５’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓから購入した。使用された以下のＵＮＡホスホルアミダイトには、以下が含まれた：５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ６－（ベンゾイル）－２’、３’－セコ－アデノシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ－アセチル－２’、３’－セコシトシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ－イソブチリル－２’，３’－セコグアノシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、および５’－（４，４’－ジメトキシ－トリチル）－２’、３’－セコウリジン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソ－プロピル）］－ホスホルアミダイト。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３－フェニル１，２，４－ジチアゾリン－５－オン（ＰＯＳ、米国マサチューセッツ州レオミンスターのＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．から入手）の１００ｍＭ溶液又はピリジン中のキサンタンヒドリド（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を採用した。
ＴＦＡアミノリンクホスホラミダイトは、（ＮＨ２－Ｃ６）反応性基リンカーを導入するために商業的に購入された（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ＴＦＡアミノリンクホスホラミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を添加した。５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）又は５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ－Ｍｅ）、及び６０秒（２’Ｆ）であった。トリアルキン含有ホスホラミダイトを合成して、それぞれの（ＴｒｉＡｌｋ＃）リンカーを導入した。本明細書中の特定の実施例に提示されたＲＮＡｉ剤に関連して使用する場合、トリアルキン含有ホスホラミダイトを無水ジクロロメタン又は無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、他のすべてのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３’Ａ）を添加した。５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）又は５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ－Ｍｅ）、及び６０秒（２’Ｆ）であった。
いくつかのＲＮＡｉ剤について、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６又は６－ＳＳ－６基のようなリンカーをセンス鎖の３’末端に導入した。予備充填樹脂は、それぞれのリンカーを用いて商業的に得られた。別法として、いくつかのセンス鎖について、ｄＴ樹脂を使用し、次いで、それぞれのリンカーを、標準的なホスホラミダイト合成を介して添加した。
担体結合オリゴマーの切断及び脱保護。固相合成の完了後、乾燥固相支持体を４０ｗｔの１：１体積の溶液で処理した。水中２８～３１％水酸化アンモニウム溶液（アルドリッチ）を３０℃で１．５時間蒸発させ、固形残渣を水中で再構成した（下記参照）。
精製。粗オリゴマーを、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ １３μｍカラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８システムを用いてアニオン交換ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは２０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０であり、２０％アセトニトリルを含み、緩衝液Ｂは１．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ａと同じであった。２６０ｎｍにおけるＵＶトレースを記録した。次いで、適当な画分を、ｐＨ６．７及び２０％アセトニトリルの１０ｍＭ重炭酸アンモニウムのランニング緩衝液でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５微粒子を充填したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＸＫ １６／４０カラム又は濾過水を用いてサイズ排除ＨＰＬＣ上でプールした。
アニーリング。１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、１×、Ｃｏｍｉｎｇ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の等モルＲＮＡ溶液（センス及びアンチセンス）を組み合わせて相補鎖を混合してＲＮＡｉ剤を形成した。ＲＮＡｉ剤の一部を凍結乾燥し、－１５～－２５℃で保存し、１×ＰＢＳ中のＵＶ－Ｖｉｓ分光器で溶液吸光度を測定することにより、二重線濃度を測定した。次いで、２６０ｎｍにおける溶液吸光度に換算係数及び希釈係数を乗じて、二本鎖濃度を決定した。使用した換算係数は、０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）又は実験的に求めた減光係数から計算した。
結合剤ＴｒｉＡｌｋ１４の合成
いくつかの実施形態において、ＴｒｉＡｌｋ１４のような連結剤は、リンアミダイトの形態で、トリアルキンを含むホスホラミダイトを反応させることによって、又は末端アミンのような反応基を含むＲＮＡｉ剤を合成することによって、及びＲＮＡｉ剤を樹脂から切断した後、ＲＮＡｉ剤を活性化エステルを含むトリアルキン部分と反応させることによって、ＲＮＡｉ剤に結合させることができる。以下の手順は、ＴｒｉＡｌｋ１４（化合物２２）の活性化エステルバージョン又はＴｒｉＡｌｋ１４（化合物１４）のホスホラミダイトバージョンを合成するための方法を提供する。
Figure 2022518384000109
３Ｌジャケット付き反応器に５００ｍＬのＤＣＭ及び４（７５．０ｇ、０．１６モル）を添加した。反応物の内部温度を０℃に冷却し、ＴＢＴＵ（１７０．０ｇ、０．５３ｍｏｌ）を添加した。次いで、この懸濁液を、内温を５℃未満に保った状態でアミン５（７５．５ｇ、０．５３ｍｏｌ）で滴下処理し、次いで、ＤＩＰＥＡ（７２．３ｇ、０．５６ｍｏｌ）でゆっくりと処理し、内温を５℃未満に保ち、反応を完了後、２３℃まで１時間加温し、３時間撹拌した。３つの試薬すべての１０％キッカー充填物を加え、さらに３時間撹拌した。４例中１％未満の残存が認められた場合、反応は完了したとみなされた。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液（２×５００ｍＬ）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（５００ｍＬ）で１回洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮して油状物とした。粗油の質量は１８８ｇであり、これはＱＮＭＲにより７２％６を含有した。粗油は次のステップに運ばれた。Ｃ４６Ｈ６０Ｎ４Ｏ１１の計算質量＝８４５．０ｍ／ｚ。［Ｍ＋Ｈ］＝８４６．０となる。
Figure 2022518384000110
７２ｗｔ％化合物６（８６．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）を含む１２１．２ｇの原油をＤＭＦ（３４４ｍＬ）に溶解し、内部温度を２３℃以下に保ちながらＴＥＡ（８６ｍＬ、２０ｖ／ｖ％）で処理した。溶液に無水グルタル酸（１２．８ｇ、０．１１モル）を添加し、中間体アミン７を２時間以内に化合物８に変換した。完了後、ＤＭＦ及びＴＥＡを減圧下３０℃で除去し、１００ｇの原油を得た。化合物７は水への溶解度が高いため、水処理は使用できず、クロマトグラフィーがＤＢＦ、ＴＭＵ、及び無水グルタル酸を除去する唯一の方法である。租油（７５ｇ）を、テレダインＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで３つの部分で精製した。粗油（２５ｇ）を３３０ｇシリカカラムに充填し、０～２０％メタノール／ＤＣＭから３０分間にわたって溶離し、４２ｇの化合物８（３段階にわたり５４％収率）を得た。Ｃ３６Ｈ５５Ｎ４Ｏ１２の計算質量＝７３６．４ｍ／ｚ。［Ｍ＋Ｈ］＝７３７．０となる。
Figure 2022518384000111
化合物８（４２．０ｇ、０．０５７モル）を、クロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを除去するために使用する前に、１０容量のアセトニトリルと共に除去した。油状物をＤＭＦ（２１０ｍＬ）に再溶解し、０℃に冷却し、溶液を４－ニトロフェノール（８．７ｇ、０．０６３ｍｏＬ）で処理し、次いでＥＤＣ－塩酸塩（１２．０ｇ、０．０６３ｍｏｌ）で処理し、１０時間以内に完了することが分かった。溶液を０℃に冷却し、１０容量の酢酸エチルに続いて１０容量の飽和塩化アンモニウム溶液を添加し、内部温度を１５℃以下に保ち、層を分離させ、酢酸エチル層をブラインで洗浄した。合わせた水層を５容量の酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮して油状物とした。租油（５５ｇ）を、テレダインＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで３つの部分で精製した。粗油（２５ｇ）を３３０ｇシリカカラムに充填し、０～１０％メタノール／ＤＣＭから３０分間かけて溶離して、２２ｇの純粋な９（化合物２２）（収率５０％）を得た。Ｃ４２Ｈ５９Ｎ５Ｏ１４の計算質量＝８５７．４ｍ／ｚ。［Ｍ＋Ｈ］＝８５８．０となる。
Figure 2022518384000112
ジクロロメタン中のエステル９（４９．０ｇ、５７．１ｍｍｏｌ）及び６－アミノ－１－ヘキサノール（７．３６ｇ、６．２８ｍｍｏｌ）の溶液をトリエチルアミン（１１，５６ｇ、１１１．４ｍｍｏｌ）で滴下処理した。ＨＰＬＣ法１で化合物９の消失を観察することにより反応をモニターし、１０分で完全であることが分かった。粗反応混合物を５容量のジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム（５容量）及びブライン（５容量）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状物とした。この原油を、３３０ｇシリカカラムを用いてテレジンＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで精製した。４－ニトロフェノールを１００％酢酸エチルで溶離し、１０を２０％メタノール／ＤＣＭを用いてカラムからフラッシュし、無色油状物（３９ｇ、収率８１％）を得た。Ｃ４２Ｈ６９Ｎ５Ｏ１２の計算質量＝８３６．０ｍ／ｚ。［Ｍ＋Ｈ］＝８３７．０となる。
Figure 2022518384000113
アルコール１０を１０容量のアセトニトリルで２回共除去してクロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを除去し、乾燥ジクロロメタン（ＫＦ＜６０ｐｐｍ）で再度除去して微量水を除去した。アルコール１０（２．３０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を５容量の乾燥ジクロロメタン（ＫＦ＜５０ｐｐｍ）に溶解し、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１８８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）で処理した。溶液を０℃に冷却し、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホラミダイト（１．００ｇ、３．３ｍｍｏｌ）で滴下処理した。この溶液を氷浴から除去し、２０℃で攪拌したところ、反応は３～６時間以内に完了することがわかった。反応混合物を０℃に冷却し、飽和重炭酸アンモニウム／ブラインの１：１溶液１０容量で処理し、次いで１分間周囲に加温し、２０℃でさらに３分間撹拌し、二相混合物を分液漏斗に移し、１０容量のジクロロメタンを加えた。有機層を分離し、１０容量の飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄して未反応のビスリン試薬を加水分解した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状物にし、３．０８ｇの９４重量％化合物１４を得た。Ｃ５１Ｈ８６Ｎ７Ｏ１３Ｐの計算質量＝１０３５．６ｍ／ｚ。［Ｍ＋Ｈ］＝１０３６となる。
トリアルキン足場の合成後コンジュゲーション。アニーリングの前又は後に、ＲＮＡｉ剤の５’又は３’アミン官能化センス鎖をトリアルキン足場にコンジュゲートすることができる。トリアルキン骨格のアニーリングされた二本鎖への結合を以下に示す：アミン官能化二本鎖を９０％ＤＭＳＯ／１０％Ｈ２Ｏに～５０～７０ｍｇ／ｍＬで溶解した。４０当量のトリエチルアミン、次いで３当量のトリアルキン－ＰＮＰを添加した。一旦完全にした後、１×リン酸緩衝生理食塩水／アセトニトリルの溶媒系（１：１４比）中で複合体を２回沈殿させ、乾燥させた。
ＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤への標的リガンドの結合。アニーリングの前又は後、及びＰＫエンハンサーのコンジュゲーションの前又は後のいずれにおいても、１つ以上の標的化リガンドを、本明細書に開示されているＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤に連結することができる。以下に、インテグリン標的化リガンドをアルキン官能化リンカー（例えば、（ＴｒｉＡｌｋ）又は内部ヌクレオチド上の２’－Ｏ－プロパルギル基に連結するために使用される一般的なコンジュゲーションプロセスを記載する。この手順は、三座配位子標的化基足場への３つの標的化リガンドの付加を記載する。標的化リガンドを内部ヌクレオチドに連結するために同じ手順を使用することができるが、標的化リガンドの当量の数は、添加される標的化リガンドの数に鑑みて調整することができる：０．５Ｍトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、０．５ＭのＣｕ（ＩＩ）硫酸五水和物（Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及びアスコルビン酸ナトリウムの２Ｍ溶液のストック溶液を脱イオン水で調製した
所望のインテグリン配位子のＤＭＳＯ中の７５ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。センス鎖（脱イオン水中７５ｍｇ／ｍＬ）を含むバイアル中で、インテグリンリガンドを撹拌しながら反応物（２当量／アルキン）に添加した。トリエチルアミン（４０ｅｑ／センス鎖）を反応バイアルに添加した。別々のバイアル中で、５部の０．５Ｍ ＴＨＰＴＡを１部の０．５Ｍ Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏと混合し、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。５分後、ＴＨＰＴＡ／Ｃｕ溶液（０．５当量のＣｕ／アルキン）を反応バイアルに添加した。直後、２Ｍアスコルビン酸塩（５ｅｑ／Ｃｕ）を反応バイアルに添加した。一旦反応が完了すると（典型的には０．５－ｌｈで完了する）、非変性アニオン交換クロマトグラフィーにより反応を直ちに精製した。別段の指定がない限り、三座配位標的化基を含む以下の実施例に記載される全ての構築物は、構造ＴｒｉＡｌｋ １４：
Figure 2022518384000114
ＴｒｉＡｌｋ １４ｓ：
Figure 2022518384000115
を有する基を含み、式中、
ＴＬは標的化リガンドを含み、
Figure 2022518384000116
は、ＲＮＡｉ因子との結合点を示す。
ＰＫエンハンサーのＨＩＦ－２ＲＮＡｉ剤へのコンジュゲーション。アニーリングの前又は後、及び１以上の標的化リガンドのコンジュゲーションの前又は後に、１以上のＰＫエンハンサーを、本明細書に開示されているＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤に連結することができる。以下に、ＰＫエンハンサーを、本明細書に示される実施例に示される構築物に連結するために使用される一般的な接合プロセスを記載する。以下に、ジスルフィドのジチオスレイトール還元を行い、続いてそれぞれのＰＫエンハンサーのチオール－Ｍｉｃｈａｅｌ付加を行うことにより、マレイミド官能化ＰＫエンハンサーをＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）又は（６－ＳＳ－６）官能化センス鎖に連結するために使用される一般的なプロセスを記載する：バイアル中で、官能化センス鎖を０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．５緩衝液中７５ｍｇ／ｍＬで溶解し、２５当量のジチオスレイトールを添加した。反応が完了したら（典型的には０．５－ｌｈで完全）、１ｘリン酸緩衝生理食塩水／アセトニトリルの溶媒系中で複合体を３回沈殿させ（１：４０比）、乾燥させた。次いで、ＤＭＳＯ中のマレイミド官能化ＰＫエンハンサーの７５ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。ジスルフィド還元（３’Ｃ６－ＳＨ、５’ＨＳ－Ｃ６、又は３’６－ＳＨ官能化）センス鎖を脱イオン水中に１００ｍｇ／ｍＬに溶解し、３当量のマレイミド官能化ＰＫエンハンサーを添加した。一旦反応が完了すると（典型的には１ｈ－３ｈで完了する）、結合体を、１ｘリン酸緩衝生理食塩水／アセトニトリルの溶媒系（１：４０比）中で沈殿させ、乾燥させた。
標的リガンドの作製方法
実施例の合成に関する以下の実験の詳細で使用される略語のいくつかは、次のように定義される。ｈまたはｈｒ＝時間；最小＝分；ｍｏｌ＝モル；ｍｍｏｌモル＝ｍｍｏｌ；Ｍ＝モル；ｍＭ＝マイクロモル；ｇ＝グラム；μｇ＝マイクログラム；ｒｔまたはＲＴ＝室温；Ｌ＝リットル；ｍＬ＝ミリリットル；ｗｔ＝重量；Ｅｔ２Ｏ＝ジエチルエーテル；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；Ｅｔ３ＮまたはＴＥＡ＝トリエチルアミン；ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔまたはＤＩＰＥＡまたはＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；ＣＨ２Ｃｌ２またはＤＣＭ＝塩化メチレン；ＣＨＣｌ３＝クロロホルム；ＣＤＣｌ３＝重水素化クロロホルム；ＣＣｌ４＝四塩化炭素；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＥｔＯＨ＝エタノール；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＢＯＣ＝ｔ－ブトキシカルボニル；ＣＢＺ＝ベンジルオキシカルボニル；ＴＢＳ＝ｔ－ブチルジメチルシリル；ＴＢＳＣｌまたはＴＢＤＭＳＣｌ＝ｔ－ブチルジメチルシリルクロリド；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＤＭＡＰ＝４－ジメチルアミノピリジン；ＮａＮ３＝アジ化ナトリウム；Ｎａ２ＳＯ４＝硫酸ナトリウム；ＮａＨＣＯ３＝重曹；ＮａＯＨ＝水酸化ナトリウム；Ｎａ２ＳＯ４＝硫酸マグネシウム；Ｋ２ＣＯ３＝炭酸カリウム；ＫＯＨ＝水酸化カリウム；ＮＨ４ＯＨ＝水酸化アンモニウム；ＮＨ４Ｃｌ＝塩化アンモニウム；ＳｉＯ２＝シリカ；Ｐｄ－Ｃ＝パラジウム炭素；ＨＣｌ＝塩化水素または塩酸；ＮＭＭ＝Ｎ－メチルモルホリン；Ｈ２＝水素ガス；ＫＦ＝フッ化カリウム；ＥＤＣ－ＨＣｌ＝Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩；ＭＴＢＥ＝メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル；ＭｅＯＨ＝メタノール；Ａｒ＝アルゴン；Ｎ２＝窒素；ＳｉＯ２＝シリカ；ＲＴ＝保持時間；ＰＴＳＡ＝パラトルエンスルホン酸；ＰＰＴＳ＝パラトルエンスルホン酸ピリジニウム。
構造１ｃ （（Ｓ）－３－（６－（（１－アジド－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザノナデカン－１９－イル）オキシ）ピリジン－３－イル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000117
ベンゼン（２５ｍＬ）中の化合物１（１．０３ｇ、８．２３ｍｍｏｌ）、化合物２（０．９２ｇ１４．８モル）及びＰＴＳＡ水和物（１５６ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を含有する混合物を、ディーンスターク装置中で一晩還流した。翌朝、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウムに注ぎ、次いで酢酸エチルを加えた。有機相を分離し、硫酸ナトリウム上で濾過し、濃縮して化合物３を９５％収率で得、その後さらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000118
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物４（５．３９ｇ、５３．３ｍｍｏｌ）及び３Åモレキュラーシーブを含有する溶液に、水素化ナトリウム（６０重量％、２．１３ｇ、５３．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１時間撹拌した。続いて、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物３（７．５２ｇ、７．５２ｇ）の溶液を添加し、懸濁液を８０℃で一晩加熱した。完了後、懸濁液を綿栓で濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をジエチルエーテルと水との間に分配し、有機相を分離し、硫酸ナトリウムで濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をＴＦＡ中の２０ｍｌの１０％ＦＬＯで処理し、３０分間撹拌した。完了後、溶液を０℃に冷却し、６Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１１に調整し、その上で生成物を油状物として沈殿させた。化合物５を油性懸濁液からジエチルエーテルで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。次いで、化合物５を、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上での分離により２６％収率で単離した。
Figure 2022518384000119
ＤＣＭ（２２ｍＬ）中の化合物５（２．２９ｇ、９．９４ｍｍｏｌ）、化合物６（４．８２ｇ、３９．８ｍｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（１２５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム（３ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）、硫酸銅（３．９７ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）、及び３Åモレキュラーシーブを含む混合物を一晩、加熱灌流した。完了後、混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。次いで、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより、化合物７を収率７６％で単離した。
Figure 2022518384000120
フレームドライしたフラスコにＴＨＦ（４０ｍＬ）及びジイソプロピルアミン（２．２９ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を充填した。それを－２０℃に冷却し、ｎ－ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、８．６４ｍＬ、２１．６ｍｍｏｌ）をカニューレを介して添加した。溶液を－２０℃で１０分間撹拌し、次いで－７８℃に冷却し、化合物８（２．０２ｍＬ、２０．６ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら滴下した。添加後、溶液を－７８℃で３０分間撹拌し、次いで、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液としてのＣｌＴｉ（ｉＰｒＯ）３（１１．２６ｇ、４３．２ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら、約１０分間、添加漏斗を介して添加した。反応物を－７８℃で３０分間撹拌し、最後に化合物７（２．２９ｇ）を得た。６．８６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中の懸濁液として滴下し、反応が完了するまで－７８℃で１．２５時間撹拌した。－７８℃での反応物に飽和塩化アンモニウム水溶液を添加した。次いで、反応物を冷却から除去し、水相を徐々に解凍し、クエンチした（黄色オレンジ色が消失）。混合物をＥｔＯＡｃと飽和塩化アンモニウム水溶液との間に分けた。有機相を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、ブライン上で乾燥し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥し、次いで濾過し、濃縮した。残渣をシリカ上で精製し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出させた。精製後、化合物９を単一ジアステレオマーとして７５％収率で得た。
Figure 2022518384000121
ＭｅＯＨ（３．２ｍＬ）中の化合物９（１．２８ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）をジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、３．２ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ）で処理し、室温で３０分間撹拌した。完了後、反応混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。続いて、２ＮのＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを１１に調整し、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、収率９２％の化合物１０を得、次いで、さらなる精製なしで使用した。
Figure 2022518384000122
１５℃でのＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物１０（０．７８ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）及び化合物１１（０．６０ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）の混合物に、固体としてＳＴＡＢ－Ｈ（１．２９ｇ、６．１２ｍｍｏｌ）部分的に添加後、冷却を除去し、混合物を約２．５時間撹拌して完了した。反応を飽和重炭酸ナトリウム水溶液の添加により停止させ、ｐＨを９にした。生成物をＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合わせ、ブラインで乾燥し、次いで硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物１２を、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより８５％の収率で単離した。
Figure 2022518384000123
ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（７．５３ｍＬ、５３．７５ｍｍｏｌ）に、ｎ－ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、１９．９ｍＬ、４９．８ｍｍｏｌ）をオーブン乾燥ガスタイトシリンジを介して－１０℃で２分間かけて添加し、混合物を－１０℃で１０分間撹拌し、－６０℃に冷却し、ＴＨＦ（８ｍＬ）中のジメチルホスホナート（６．４２ｇ、５１．８ｍｍｏｌ）の溶液を５～１０分かけて滴下した。－６０℃で約１時間熟成させた後、化合物１３（７．３７ｇ、３９．８２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の溶液として、－６０℃で５分間にわたって滴下して加えた。反応混合物を－６０℃で１時間、次に－４１℃で約１．５時間撹拌した。２．６当量のＨ２ＳＯ４（２．０Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、酢酸エチル（約５０ｍＬ）で３回抽出した。有機相を合わせてブラインで乾燥させ、硫酸ナトリウムで濾過し、短時間濃縮して粗重量を決定し、ＮＭＲ用のサンプルを採取した。乾燥重量を測定したら、化合物１４を、さらなる精製なしに次の反応で使用するためにＭｅＯＨに溶解した。収率７５．８３％と計算される。ＮＭＲによる粗重量／重量％７６．３％。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚのＣＤＣｌ３δ４．７５（ｓ、１Ｈ）、３．８１（ｓ、３Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、３．１０～３．１４（ｍ、２Ｈ）、３．０４～３．０９（ｍ、２Ｈ）、２．６８（ｔ、２Ｈ）、１．８２－１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）。
Figure 2022518384000124
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の化合物１４（ＮＭＲから約１２ｇ粗、３０．１６ｍｍｏｌの９．３３ｇ重量）に、水（１．５ｍＬ）中のＮａＯＨ（１．４５ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を５０℃に加熱し、化合物１５（２．７６ｇ、２２．６２ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間撹拌後、化合物１５の第２の部分（７３６ｍｇ、６．０３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５０℃で一晩撹拌し、次いで、反応混合物を濃縮して油状物にし、２容量のＥｔＯＡｃと１容量のＨ２Ｏとの間に分配し、有機相を分離し、１容量の水で洗浄した。水性洗浄液を合わせ、ＥｔＯＡｃで逆抽出（２回、１ｖｏｌ）した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。粗製物を約２０ｇのシリカ化合物１６上で乾燥し、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより、収率６９％で単離した。１Ｈ ＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ９．０９（ｄｄ、１Ｈ）、８．１７（ｄｄ、１Ｈ）、８．１２（ｄ、１Ｈ）、７．４６（ｄｄ、１Ｈ）、７．４１（ｄ、１Ｈ）、４．７８（ｓ、１Ｈ）、３．２４（ｑ、２Ｈ）、３．１０（ｔ，２Ｈ）、２．１２（ｑｕｉｎ、２Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）。
Figure 2022518384000125
ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中の化合物１６（５．９８ｇ、２０．８ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム（炭素上１０％、２．２２ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）及び水素を１気圧で充填した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。完了後、反応混合物をセライト（登録商標）上で濾過し、濃縮した。化合物１７を、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより、収率７９％で単離した。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３δ７．０５（ｄ、１Ｈ）、６．３４（ｄ、１Ｈ）、５．４８（ｓ、１Ｈ）、４．８１（ｓ、１Ｈ）、３．３６～３．４３（ｍ、２Ｈ）、３．１６（ｑ、２Ｈ）、２．６８（ｔ、２Ｈ）、２．５９（ｔ、２Ｈ）、１．９０（ｄｔ、２Ｈ）、１．８３、（ｑｕｉｎ、２Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）。
Figure 2022518384000126
化合物１７（４．８１ｇ、１６．５３ｍｍｏｌ）を６Ｍ ＨＣｌ水溶液（１６．４ｍＬ）に溶解し、４２℃で２時間加熱した。次いで、６Ｍ ＨＣｌ（２．８ｍＬ）のさらなる部分を加え、反応混合物をさらに２時間撹拌した。反応物に塩化ナトリウム、次いで水性２Ｎ ＮａＯＨを添加し、生成物を油状物として沈殿させた（ｐＨは１２より大きかった）。混合物を２－ブタノールで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。化合物１８は８５％の収率で得られ、その後さらに精製することなく使用された。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３δ７．０６（ｄ、１Ｈ）、６．３５（ｄ、１Ｈ）、４．８３（ｓ、１Ｈ）、３．３５～３．４６（ｍ、２Ｈ）、２．７５～２．６７（ｍ、４Ｈ）、２．５８（ｔ、２Ｈ）、１．８８－１．９５（ｍ、２Ｈ）、１．８４－１．７６（ｍ、４Ｈ）。
Figure 2022518384000127
－１０℃のフレームドライしたフラスコ中のＴＨＦ（０．９ｍＬ）中のトリホスゲン（８５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１８（２３６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．１３４ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を室温に加温した。ＴＬＣが完全反応を示した後、追加のＴＥＡ（０．１３４ｍＬ）を添加し、次いで、固体として化合物１２（１６６ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加した。不均一混合物を激しく攪拌しながら５０℃で２時間加熱した。完了後、反応混合物を１容量の水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで乾燥し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物１９は、１００％の収率を仮定して得られ、続いて、さらなる精製なしで使用された。
Figure 2022518384000128
ＴＨＦ（３７ｍＬ）に溶解した粗化合物１９（４００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌと仮定）にＨ２ＳＯ４（２Ｍ、０．６ｍＬ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。翌朝、Ｈ２ＳＯ４（０．６５当量）を追加した。４時間後、反応は完了した。反応混合物を酢酸エチルで希釈した。有機相を分離し、水相を酢酸エチルで１回再抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物２０を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより７５％の収率で単離した。
Figure 2022518384000129
エタノール（９ｍＬ）中の化合物２０（２５１ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０ｗｔ％、１００ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｈ２を１雰囲気に充填し、３５℃で一晩撹拌した。完了後、セライト（登録商標）上でろ過してパラジウムを除去した。化合物２１を、１％ＴＦＡを含有するＦＬＯ中のアセトニトリルの勾配を溶出するＣ１８ ５ｕ １９×２５０ｍｍ ＢＥＨカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて、逆相ＨＰＬＣにより、ＴＦＡ塩として２０％収率で単離した。
Figure 2022518384000130
ＤＣＭ（２５０ｕＬ）中の化合物２１（６１ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）の溶液にＴＥＡ（８ｕＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＣＭ（２７５μＬ）中の溶液としてＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｎ３（４１．４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５分間撹拌し、ＬＣ－ＭＳによってチェックしたところ、反応が完了したことが示された。全ての揮発性物質を除去し、残渣をＥｔＯＨ（０．４ｍＬ）及び水（０．４ｍＬ）に溶解した。ＬｉＯＨ（１１．２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４０℃で２時間加熱した。完了後、反応混合物を減圧下で濃縮した。化合物２２（構造１ｃ）を、１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ中のアセトニトリルの勾配を溶出するＣ１８ ５ｕ １９×２５０ｍｍ ＢＥＨカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて、逆相ＨＰＬＣにより４２％収率で単離した。
構造２ｃ（（Ｓ）－３－（４－（２－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）
Figure 2022518384000131
トルエン（８０ｍＬ）中の化合物２３（１０ｇ、４３．４ｍｍｏｌ）の溶液に化合物６（２１）を添加した。１ｇ、０．１７ｍｏｌ、ＰＰＴＳ（０．５５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、次いで酢酸（１．２４ｍＬ、２１．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器にＤｅａｎ Ｓｔａｒｋトラップを装備し、次いで一晩加熱還流した。完了後、反応混合物を濃縮し、シリカ６０グラム上で乾燥し、ヘキサン中酢酸エチルの勾配でＳｉＯ２上で精製し、収率６６％で化合物２４を得た。ＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３ δ８．４７（ｓ、１Ｈ）、７．６８（ｄ、１Ｈ）、７．３１～７．５６（ｍ、６Ｈ）、６．９８～７．１６（ｍ、１Ｈ）、５．２３（ｓ、２Ｈ）、１．２６（ｓ、９Ｈ）。
Figure 2022518384000132
フレームドライしたフラスコにＴＨＦ（１９０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（９．０７ｇ、８９．７ｍｍｏｌ）を充填し、－２０℃に冷却し、次いでカニューレを介してｎ－ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、３４．２ｍＬ、８５．６ｍｍｏｌ）を充填した。溶液を－２０℃で１０分間撹拌し、次いで－７８℃に冷却し、化合物８（８ｍＬ、８１．５ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら滴下した。添加後、－７８℃で３０分間撹拌し、次いで、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の溶液としてＣｌＴｉ（ｉＰｒＯ）３（４４．６ｇ、０．１７１ｍｏｌ）を、１０分間かけて、添加漏斗を介して添加した。反応物を－７８℃で３０分間撹拌し、最後に、化合物２４（９．０６ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中の懸濁液として滴下し、反応が完了するまで－７８℃で１．２５時間撹拌した。－７８℃での反応物に飽和塩化アンモニウム水溶液を添加した。次いで、反応物を冷却から除去し、水相を徐々に解凍し、クエンチした（黄色オレンジ色が消失）。混合物をＥｔＯＡｃと飽和塩化アンモニウム水溶液の間に分配した。有機相を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回洗浄した。有機相を合わせ、ブライン上で乾燥し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。化合物２５は、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上での分離により、単一ジアステレオマーとして７０％の収率で得られた。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３δ７．３１～７．４８（ｍ、５Ｈ）、７．０９（ｄｄ、１Ｈ）、６．８９～７．０４（ｍ、２Ｈ）、５．１３（ｓ、２Ｈ）、４．５９～４．７６（ｍ、２Ｈ）、４．１３（ｑ、２Ｈ）、２．８１（ｄｄ、２Ｈ）、１．２１～１．２５（ｍ、１２Ｈ）。
Figure 2022518384000133
化合物２５（８．０７ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）に水性ＨＣｌ（６Ｍ、２０．７ｍＬ、０．１２４モル）、次いでＭｅＯＨ（６０ｍＬ）を添加した。均一な溶液が得られるまでＴＨＦを添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１０に塩基性化し、次いでＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで乾燥し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物２６は９５％の収率で得られ、その後さらに精製することなく使用された。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３δ７．２８～７．４６（ｍ、６Ｈ）、７．１８（ｄ、１Ｈ）、６．９９（ｔ、１Ｈ）、５．１１（ｓ、２Ｈ）、４．５７（ｔ、１Ｈ）、４．０９（ｑ、２Ｈ）、２．９７～３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．８１～２．９３（ｍ，１Ｈ）、１．１８（ｔ、３Ｈ）。
Figure 2022518384000134
０℃でＴＨＦ（４０ｍＬ）中の配合物２６（５．７６ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）及び化合物２７（４．０９ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）の混合物に、固体としてＳＴＡＢ－Ｈ（８．８５ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）を分割して添加した。最終的な添加後、冷却を除去し、混合物を約２．５時間撹拌して完了した。反応混合物を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加することによりクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで乾燥し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物２８を、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより７３％の収率で単離した。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３δ７．３０～７．４９（ｍ、５Ｈ）、７．１１（ｄｄ、１Ｈ）、６．８８～７．０２（ｍ、２Ｈ）、５．１３（ｓ、２Ｈ）、４．４０（ｔ、１Ｈ）、４．１０（ｑ、２Ｈ）、４．００（ｄｄ、１Ｈ）、３．３５（ｓ、３Ｈ）、３．３１（ｓ、３Ｈ），２．４７～２．７５（ｍ、４Ｈ）、１．２０（ｔ、３Ｈ）。
Figure 2022518384000135
－１０℃のフレームドライしたフラスコ中のＴＨＦ（２４ｍＬ）中のトリホスゲン（１．２ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物１９（３．６４ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１．９４ｍｍｏｌ、１３．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を室温に加温した。ＴＬＣが完全な反応を示した後、追加のＴＥＡ（３．３ｍＬ、２３．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、固体として化合物２８（２．６１ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）を添加した。不均一混合物を激しく攪拌しながら５０℃で２時間加熱した。完了後、反応混合物を１容量の水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで乾燥し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。１００％収率を仮定して化合物２９を得、次いで粗製をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000136
ＴＨＦ（３７ｍＬ）に溶解した化合物２９（５．５９ｇ、８．９７ｍｍｏｌ）に水（０．８ｍＬ）及びＨ２ＳＯ４（２Ｍ、８．０７ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２８℃で一晩撹拌した。翌朝、混合物のｐＨを重炭酸ナトリウムを用いて９に調整し、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで乾燥し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物３０を、１％ＴＥＡを含有するＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出するシリカ上で分離することにより８２％の収率で単離した。
Figure 2022518384000137
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶解した化合物３０（４．１３ｇ、７．３９ｍｍｏｌ）に、Ｄｅｇｕｓｓａ（登録商標）パラジウム（１０重量％、３．１５ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）及び水素を５０ｐｓｉに充填した。混合物を室温で一晩撹拌した。翌日、反応は６４％完了した。反応混合物をセライト（登録商標）上で濾過し、濃縮した。残渣をＥｔＯＨに溶解し、パラジウム（１０重量％、１．５７ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及び水素で５０ｐｓｉに仕込んだ。４８時間撹拌後、反応混合物を３０℃に加熱し、さらに２４時間撹拌した。完了後、懸濁液をセライト（登録商標）上で濾過し、全ての揮発性物質を減圧下で除去した。残渣をシリカ上で精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出させ、収率７２％で化合物３１を得た。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６ ９．８８（ｓ、１Ｈ）、７．０２～７．１４（ｍ、２Ｈ）、６．８６～６．９３（ｍ、２Ｈ）、６．５０～６．７６（ｍ、１Ｈ）、６．３１（ｍ、１Ｈ）、６．３１（ｄ、１Ｈ）、５．１７（ｔ、１Ｈ）、４．００（ｑ、２Ｈ）、３．２３～３．２８（ｍ、４Ｈ）、２．７９～３．１８（ｍ、７Ｈ）、２．６１（ｔ、２Ｈ）、２．４１（ｔ、２Ｈ）、１．６５～１．７８（ｍ、４Ｈ）、１．０９（ｔ、３Ｈ）。
Figure 2022518384000138
－１０℃のＴＨＦ（０．４７ｍＬ）中のＰＰｈ３（６９９ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を室温に温め、化合物３１（６００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）及びＨＯ－ＰＥＧ４－Ｎ３（４６６ｍｇ、３．０６ｍｍｏｌ）の純粋な混合物に加え、一晩撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカ上で精製して、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出させ、収率５０％で化合物３２を得た。１ＨＮＭＲ：４００ＭＨｚのＤＭＳＯ－ｄ６δ７．１０～７．１９（ｍ、２Ｈ）、６．９７～７．０６（ｍ、２Ｈ）、６．１８～６．３１（ｍ、２Ｈ）、２．５（ｍ、１Ｈ）、４．１３～４．１６（ｍ、１Ｈ）、３．９８～４．０４（ｍ、２Ｈ）、３．７１～３．８０（ｍ、３．５２～３．６１（ｍ、Ｈ）、３．３８～３．３７（ｍ、５Ｈ）、３．１０～３．２５（ｍ、５Ｈ）、２．７９～３．０８（ｍ、５Ｈ）、２．５９（ｔ、２Ｈ）、２．３１～２．４２（ｍ、２Ｈ）、１．６５～１．７５（ｍ、４Ｈ）、１．１０（ｔ、３Ｈ）。
Figure 2022518384000139
化合物３２（８２６ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）にＥｔＯＨ（３ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３ｍＬ）、次いでＬｉＯＨ（９７ｍｇ、４．０５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０℃で一晩撹拌した。完了後、混合物を６ＭのＨＣｌ水溶液を用いてｐＨ＝５に中和し、濃縮した。残渣をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、０．１％を含有する水中のアセトニトリルの勾配を溶出させ、収率８１％で化合物３３（構造２ｃ）を得た。ＮＭＲ：４００ＭＨｚＤ２Ｏδ７．３０（ｄ、１Ｈ）、７．０１～７．１９（ｍ、３Ｈ）、６．４５（ｄ、１Ｈ）、５．２４（ｔ、１Ｈ）、４．１４～４．３２（ｍ、２Ｈ）、３．８４～３．９２（ｍ、２Ｈ）、３．５９～３．７７（ｍ、１０Ｈ）、３．１４～３．４５（ｍ、８Ｈ）、．０２～３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．９７（ｄ、２Ｈ）、２．８５（ｑ、１Ｈ）、２．５０～２．７２（ｍ、４Ｈ）、１．６８～１．９４（ｍ、４Ｈ）。
構造２．１ｃ （（（Ｓ）－３－（４－（１１－アジドンデシル）オキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000140
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、室温でＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を化合物３１とＯＨ－（ＣＨ２）１１－Ｎ３との混合物を含むバイアルに移し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を反応混合物から除去し、粗製物をＥｔＯＨに溶解した。Ｈ２Ｏ中の溶液としてＬｉＯＨを添加し、反応混合物が均質になるまで追加の水／ＥｔＯＨを添加した。室温で１．５時間撹拌した後、混合物をＨ２ＳＯ４でｐＨ３に酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍ、アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ、勾配溶出）で精製した。
構造２．２ｃ （（Ｓ）－３－（４－（２－（１－（６－アジドヘキサノイル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000141
ＤＣＭに０℃で溶解した化合物３５をＥＤ ＡＣで処理し、アセトニトリルを溶解性を助けるために添加した。５分後、ＴＥＡ及び化合物３６を添加し、冷却を除去し、撹拌を２時間続けた。完了後、飽和塩化アンモニウムを添加し、有機相を分離し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。得られた粗製物を、その後さらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000142
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、激しく攪拌しながら室温でＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を化合物３１と化合物３７の混合物を含むバイアルに移し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を反応混合物から除去し、粗製物をＥｔＯＨに溶解した。Ｈ２Ｏ中の溶液としてＬｉＯＨを添加し、反応混合物が均一になるまで追加の水を添加した。室温で１．５時間撹拌した後、混合物をＨ２ＳＯ４でｐＨ３に酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍ、アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ、勾配溶離）により精製し、化合物３８（構造２．２ｃ）を得た。
構造２．３ｃ （（（Ｓ）－３－（４－（２－（１ｒ，４Ｓ）－４－（５－アジドペンタナミド）シクロヘキシル）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000143
０℃のＤＣＭ中の化合物３５の懸濁液に、ＤＣＭ中の溶液としてＥＤＡＣを添加した。５分後、冷却を除去し、化合物３９を添加し、次いでＴＥＡを添加した。不均一混合物を室温で一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、沈殿物を溶解した。混合物を５％ＫＨＳＯ４で２回、及びブラインで１回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。化合物４０を含む粗残渣をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000144
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、激しく攪拌しながら室温でＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を化合物３１と化合物４０の混合物を含むバイアルに移し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を反応混合物から除去し、粗製物をＥｔＯＨに溶解した。Ｈ２Ｏ溶液としてＬｉＯＨを加え、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した後、さらなる水を加え、混合物をＨ２ＳＯ４でｐＨ３に酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍ、アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ、勾配溶離）により精製し、化合物４１（構造２．３ｃ）を得た。
構造２．４ｃ （（（Ｓ）－３－（４－（４－（５－アジドペンタナミド）フェネトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000145
ＤＣＭ中の化合物３５及び化合物４２の混合物にＥＥＤＱを添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ ＨＣｌで３回洗浄し、ブラインで１回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。次いで、化合物４３をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000146
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、激しく攪拌しながら室温でＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を化合物３１と化合物４３の混合物を含むバイアルに移し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を反応混合物から除去し、粗製物をＥｔＯＨに溶解した。Ｈ２Ｏ中の溶液としてＬｉＯＨを添加し、反応混合物が均一になるまで追加の水を添加した。室温で１．５時間撹拌した後、混合物をＨ２ＳＯ４でｐＨ３に酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍ、アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ、勾配溶離）により精製し、化合物４４（構造２．４ｃ）を得た。
構造２．５ｃ （（Ｓ）－３－（４－（４－（（５－アジドペンチル）オキシ）フェネトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000147
アセトン中の化合物４５及び化合物４６の溶液に炭酸カリウムを添加した。混合物を、Ｎ２保護下で一晩激しく撹拌しながら、懸濁液として密封バイアル中で６５℃に加熱した。次いで、反応物を濾過し、濃縮し、シリカ上で精製し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出させ、化合物４７を得た。
Figure 2022518384000148
ＤＭＦ中の化合物４７の溶液にアジ化ナトリウムを添加し、混合物を窒素保護下で密封バイアル中８０℃で一晩撹拌した。完了後、１容量の水を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。分離した有機相を硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。粗製の化合物４８をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000149
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、激しく攪拌しながら室温でＤＥＡＤの溶液を滴下した。混合物を化合物３１と化合物４８の混合物を含むバイアルに移し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。揮発性物質を反応混合物から除去し、粗製物をＥｔＯＨに溶解した。Ｈ２Ｏ中の溶液としてＬｉＯＨを添加し、反応混合物が均一になるまで追加の水を添加した。室温で１．５時間撹拌した後、混合物をＨ２ＳＯ４でｐＨ３に酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍ、アセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ、勾配溶離）により精製し、化合物４９（構造２．５ｃ）を得た。
構造２．６ｃ （（（Ｓ）－３－（３－（３－（１７－アジド－３－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－２－アザヘプタデシル）－５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）－２－オキソイミダゾリジン－１－イル）－３－（３－フルオロ－メトキシフェニル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000150
ＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に０℃でＤＥＡＤの溶液を滴下し、完全に添加した後、混合物を化合物３１とＭｅＯＨの純粋な混合物を含むバイアルに移した。バイアルをＮ２でキャップし、室温で一晩撹拌した。完了後、全ての揮発性物質を除去し、得られた粗生成物をシリカ上で精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出し、化合物５０を得た。
Figure 2022518384000151
ＡｃＯＨ中の化合物５０の溶液に臭素を加え、混合物を０．５時間撹拌した。完了後、反応物を５容量の酢酸エチル及び２．５容量の水で希釈した。水層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和し、有機相を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。続いて、得られた化合物５１の粗製を精製することなく使用した。
Figure 2022518384000152
ＤＭＡＣ中の化合物５１、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、及びＺｎ（ＣＮ）２の溶液を窒素で３０分間脱気し、混合物を密封バイアル中で１２８℃で一晩加熱した。完了後、混合物を５容量のＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を分離し、次いで水で２回洗浄し、食塩水で２回洗浄し、次いで有機相を硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。残渣をシリカ上で１００％ＥｔＯＡｃを溶出させて精製し、化合物５２を得た。
Figure 2022518384000153
ＭｅＯＨ中の化合物５２の溶液にアンモニアを添加し、次いでメタノールで３回予備洗浄したラネーニッケルのスラリーを添加した。Ｐａｒｒ（登録商標）フラスコに水素を６０ｐｓｉに充填し、室温で１６時間撹拌した。完了後、懸濁液を濾過し、濃縮した。得られた粗残渣をＤＭＦに再溶解した。ＤＩＥＡ及びＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｎ３を加え、混合物を１時間撹拌した。完了後、全ての揮発性物質を除去し、粗残渣をＭｅＯＨ及びＴＨＦの混合物中に再溶解した。Ｈ２Ｏ中のＬｉＯＨを添加し、混合物を室温で１７時間撹拌した。反応完了後、ｐＨをＴＦＡで３に調整し、混合物を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８、２５０×２１．２ｍｍ、ｐｍ、水／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ、勾配溶出）に直接注入し、化合物５３（構造２．６ｃ）を得た。
構造２．７ｃ （（Ｓ）－Ｎ－（２－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－３－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２，８－プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパンアミド）、構造２．８ｃ、構造２．９ｃ、及び構造２．１０ｃの合成
Figure 2022518384000154
化合物３１にＴＨＦ、ＰＰｈ３、及びＤＥＡＤの溶液を０℃で滴下し、混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、混合物を－２０℃に１時間冷却し、濾過してトリフェニルホスフィンオキシドを除去した。濾液を濃縮し、１％ＴＥＡを含有するヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶出するシリカ上での精製によりＯ－アルキル化の中間体を単離した。次いで、単離された中間体をＴＨＦ及びＨ２Ｏの混合物中に懸濁し、Ｈ２Ｏ中のＬｉＯＨで処理し、３５℃で１６時間撹拌した。完了後、ｐＨを２Ｍ ＨＣｌで７に調整し、全ての揮発性物質を除去した。粗製をＨ２Ｏに懸濁し、塩化ナトリウムを加え、化合物５４を酢酸エチルで５回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。その後、化合物５４をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000155
ＤＭＦ中の化合物５４の溶液をＨＢＴＵで処理し、５分間撹拌した。次いで、ＤＩＥＡ及びＮ３－ＰＥＧ３－ＮＨ２を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。完了後、ｐＨをＴＦＡで３に調整し、化合物５５を半分取逆相ＨＰＬＣ（フェノメネックスジェミニＣ１８、２５０×２１．２ｍｍ、ｐｍ、５ｐｍ、水／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ、勾配溶出）に直接注入することにより単離し、化合物５５を得た。
化合物２．８ｃ、２．９ｃ及び２．１０ｃを合成するためにそれぞれＮ３－ＰＥＧ１１－ＮＨ２、Ｎ３－ＰＥＧ２３－ＮＨ２、Ｎ３－ＰＥＧ３５－ＮＨ２を用いて、同様の方法を用いた。
構造２．１１ｃ （（（Ｒ）－３－（４－（２－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（２－オキソ－３－（３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル）イミダゾリジン－１－イル）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000156
窒素の不活性雰囲気でパージし維持した３－Ｌ ４－ネック丸底フラスコに、ＴＨＦ（１．５０Ｌ）、ＤＩＰＥＡ（１５０．００ｍＬ、７１６，０００ｍｍｏｌ、０．８８当量）、ｎ－ＢｕＬｉ（４３０．００ｍＬ、６８０，０００ｍｍｏｌ、０．８４当量）を入れた。次いで、－６０℃で亜リン酸トリメチル（１９５．００ｍＬ）を加え、－６０℃で１時間撹拌し、これに－６０℃で２－オキソピロリジン－１－カルボン酸ｔ－ブチル（１５０．００ｇ、８０９．８３５ｍｍｏｌ、１．００当量）を加え、得られた溶液を液体窒素浴中で－６０℃で１時間撹拌した。次いで、３５０ｍＬのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を加えて反応を停止させ、１．５ＬのＨ２Ｏで希釈し、得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルで抽出した。得られた混合物を１×１ＬのＨ２Ｏで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。これにより、２００ｇ（粗製）のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［５－（ジメトキシホスホリル）－４－オキソペンチル］カルバメートが黄色油状物として得られた。
Figure 2022518384000157
３－Ｌ丸底フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［５－（ジメトキシホスホリル）－４－オキソペンチル］カルバメート（２００．００ｇ、１５００．００ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＭｅＯＨ（１．５０Ｌ）、２－アミノピリジン－３－カルバアルデヒド（５３．００ｇ、１０００．００ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＯＨ（５０．００ｇ、１５００．００ｍｍｏｌ、１．５０当量）を入れた。得られた溶液を油浴中で５０℃で１６時間撹拌した。溶液のｐＨ値をＮａＨＣＯ３（水）で８に調整した。得られた混合物を濃縮した。次いで、１．５Ｌの水を加えて反応を停止させ、２×１．５Ｌの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。これにより、１６０ｇ（粗製）のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－（１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバメートが黄色油状物として得られた。
Figure 2022518384000158
５－Ｌ丸底フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－（１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバメート（１６０．００ｇ、５５６．７８７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＭｅＯＨ（２．００Ｌ）、Ｒｈ／Ｃ（１４０．００ｇ、１．３６０ｍｍｏｌ）、Ｈ２（４０Ｐｓｉ）を入れた。得られた溶液を２５℃で１６時間撹拌し、固体を濾過した。得られた混合物を濃縮した。この結果、黄色固体として１０６ｇ（６５．３３％）のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバメートが得られた。
Figure 2022518384000159
１－Ｌ丸底フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバメート（１０６．００ｇ、３６３．７６７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＥｔＯＡｃ（５００．００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ中のＨＣｌ（４Ｍ、４００．００ｍＬ）を入れた。得られた溶液を２５℃で３時間撹拌し、得られた溶液を１ＬのＨ２Ｏで希釈し、ＮａＯＨ（水）を用いてｐＨを１１に調整した。得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。この結果、黄色固体として３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロパン－１－アミン５６ｇ（８０．４８％）が得られた。
Figure 2022518384000160
２－Ｌ丸底フラスコに、３－フルオロ－４－ヒドロキシベンズアルデヒド（１４０．００ｇ、９９９．１９４ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＡＣＮ（１０００ｍＬ）、（ブロモメチル）ベンゼン（２０５．０８ｇ、１１９９．０３９ｍｍｏｌ、１．２０当量）、Ｋ２ＣＯ３（４１４．２８ｇ、２９９７．５８１ｍｍｏｌ、３．００当量）を入れた。得られた溶液を２５℃で１６時間撹拌し、固体を濾過した。得られた混合物を濃縮した。これにより、２３０ｇ（９９．９８％）の４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロベンズアルデヒドが白色固体として得られた。
Figure 2022518384000161
３－Ｌ丸底フラスコに、４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロベンズアルデヒド（２３０．００ｇ、９９８．９６６ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＣＭ（１６００ｍＬ）、（Ｓ）－２－メチルプロパン－２－スルホミド（１４５．２９ｇ、１１９８．７６２ｍｍｏｌ、１．２０当量）、Ｃｓ２ＣＯ３（６５０．９７ｇ、１９９７．９３３ｍｍｏｌ、２．００当量）を入れた。得られた溶液を油浴中で５０℃で６時間撹拌した。固体をろ過した。得られた混合物を濃縮した。これにより、（Ｓ）－Ｎ－［［［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］メチリデン］－２－メチルプロパン－２－スルホムアミドが白色固体として２６０ｇ（７８．０６％）得られた。
Figure 2022518384000162
窒素の不活性雰囲気でパージし維持した３Ｌ丸底フラスコに、ＴＨＦ（２．０Ｌ）、Ｚｎ（１．０２ｋｇ、１５５９５．９４５ｍｍｏｌ、２０．００当量）、ＣｕＣｌ（１１５．８０ｇ、１１６９．６９６ｍｍｏｌ、１．５０当量）、エチル２－ブロモ酢酸（３２５．５７ｇ、１９４９．４９８ｍｍｏｌ、２．５０当量）、（Ｓ）－Ｎ－［［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］メチリデン］－２－メチルプロパン－２－スルフマミド（２６０．００ｇ、７７９．７９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を入れた。得られた溶液を、水／氷浴中で０℃で３０分間撹拌した。得られた溶液をさらに２時間撹拌しながら反応させ、その間、温度を油浴中で５０℃に維持した。固体をろ過した。得られた混合物を濃縮した。次いで、２Ｌの水を加えて反応を停止させ、２×２Ｌの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。この結果、エチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［［（Ｓ）－２－メチルプロパン－２－スルホミル］アミノ］プロパノエート１５０ｇ（４５．６３％）が黄色油状物として得られた
Figure 2022518384000163
１－Ｌ丸底フラスコに、エチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［（Ｓ）－２－メチルプロパン－２－スルホミル］アミノ］プロパノエート（１５０．００ｇ、３５５．８４７ｍｍｏｌ、１．００当量）、１，４－ジオキサン中の得られた溶液を２５℃で２時間撹拌し、得られた混合物を濃縮した。次いで、１Ｌの水を加えて反応を停止させた。ＮａＨＣＯ３（水）を用いて、ｐＨを８に調節した。得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。これにより、黄色油状物として１００ｇ（８８．５５％）のエチル（３Ｒ）－３－アミノ－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］プロパノエートが得られた。
Figure 2022518384000164
ａ２－Ｌ丸底フラスコに、エチル（３Ｒ）－３－アミノ－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］プロパノエート（１００．００ｇ、３１５．１００ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＴＨＦ（１．００Ｌ）、２，２－ジメトキシアセトアルデヒド（４９．２１ｇ、４７２．６９６ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１３３．５７ｇ、６３０．１９９ｍｍｏｌ、２．００当量）を入れた。得られた溶液を２５℃で２時間撹拌し、次いで１Ｌの水を加えて反応を停止させた。得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルでＮａ２ＳＯ４乾燥し、減圧下で濃縮した。この結果、黄色油状物として８０ｇ（６２．６２％）のエチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［（２，２－ジメトキシエチル）アミノ］プロパン酸エチルが得られた。
Figure 2022518384000165
２－Ｌ ３－ネック丸底フラスコに、トリホスゲン（２２．２５ｇ、７４．９７５ｍｍｏｌ、０．３８当量）、ＴＨＦ（５００ｍＬ）、エチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［（２，２－イメトキシエチル）アミノ］プロパノエート（８０．００ｇ、１９７．３０４ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＴＥＡ（２９．９５ｇ、２９５．９５６ｍｍｏｌ、１．５０当量）、３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロパン－１－アミン（化合物１７７、３３．９７ｇ、１７７．５７３ｍｍｏｌ、０．９０当量）を入れた。得られた溶液を油浴中で５０℃で１時間撹拌した。次いで、１Ｌの水を加えて反応を停止させた。ＮａＨＣＯ３（水）を用いて、ｐＨを８に調節した。得られた溶液を２×１Ｌの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。この結果、黄色の粗油として９６ｇ（７８．１３％）のエチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［（２，２－ジメトキシエチル）（［［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバモイル］）アミノ］プロパノエートを得た。
Figure 2022518384000166
１０００ｍＬ丸底フラスコに、エチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［（２，２－ジメトキシエチル）（［［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］カルバモイル］アミノ］プロパノエート（９６．００ｇ、１５４．１５８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＴＨＦ（５００．００ｍＬ）、Ｈ２ＳＯ４（１８０．００ｍＬ、２Ｍ）を入れた。得られた溶液を２５℃で１６時間撹拌し、ＮａＯＨ（５Ｍ）を用いてｐＨを８に調整した。得られた溶液を２×１Ｌのジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（５０／１）を含むシリカゲルカラム上に塗布した。回収した画分を合わせ、濃縮した。この結果、黄色油状物として、７３ｇ（８４．７６％）のエチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［２－オキソ－３－［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－１－イル］プロパノエートを得た。
Figure 2022518384000167
３－Ｌ丸底フラスコに、エチル（３Ｒ）－３－［４－（ベンジルオキシ）－３－フルオロフェニル］－３－［２－オキソ－３－［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－１－イル］プロパノエート（７３．００ｇ、１３０．６７１ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＥｔＯＨ（１．５０Ｌ）、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（６０．００ｇ、４２７．２５９ｍｍｏｌ、３．２７当量）、Ｅｈ（５０気圧）を入れた。得られた溶液を２５℃で７２時間撹拌し、固体を濾過した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（９／１）を含むシリカゲルカラム上に塗布した。回収した画分を合わせ、濃縮した。この結果、４１．０４１５ｇ（６６．７５％）のエチル（３Ｒ）－３－（３－フルオロ－４－ヒドロキシフェニル）－３－［２－オキソ－３－［３－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）プロピル］イミダゾリジン－１－イル）プロパノエートを黄色油状物として得た。
ＬＣＭＳ－ＰＨ－ＡＲＰ－０５２－０：［ＭＳ＋１］＋＝４７１
旋光度［ａ］Ｄ ２０．０＝＋３７．５°（ＭｅＯＨ中、Ｃ＝１ｇ／１００ｍｌ）；Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６、ｐｐｍ）δ９．８４（ｓ、１Ｈ）、７．０７～７．００（ｍ、２Ｈ）、６．９５～６．８５０（ｍ、２Ｈ）、６．２４（ｄ、２Ｈ）、５．１８（ｔ、１Ｈ）、４．０６～３．９６（ｍ、２Ｈ）、３．３２～２．７５（ｍ、１０Ｈ）、２．６０（ｔ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、２Ｈ）、１．７７～１．６７（ｍ、４Ｈ）、１．１０（ｔ、３Ｈ）。
Figure 2022518384000168
－１０℃のＴＨＦ中のＰＰｈ３の溶液に、ＤＥＡＤの溶液を滴下して添加した。混合物を室温に温め、化合物１８５とＨＯ－ＰＥＧ４－Ｎ３との純粋な混合物に加え、一晩撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカ上で精製して、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出させ、化合物１８６を得た。
Figure 2022518384000169
化合物１８６にＥｔＯＨ及びＨ２Ｏ、次いでＬｉＯＨを添加した。混合物を３０℃で一晩撹拌した。完了後、混合物を６ＭのＨＣｌ水溶液を用いてｐＨ＝５に中和し、濃縮した。残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８、５０×２５０ｍｍ、１０ｐｍカラムを用い、０．１％を含有する水中のアセトニトリルの勾配を溶出する逆相ＨＰＬＣにより精製し、化合物１８７（構造２．１１ｃ）を得た。
構造２８ｃ（化合物１１８ａ）、構造２９ｃ（化合物１１８ｂ）、構造３１ｃ（化合物１１９ａ）、及び構造３０ｃ（化合物１１９ｂ）の合成
Figure 2022518384000170
ＬＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、９５ｍＬ、９５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（６０ｍＬ）の溶液に、－７８℃でＴＨＦ（１８０ｍＬ）中の化合物１０３（２－メチル－［１，８］ナフチリジン（１２．５ｇ、８６．７ｍｍｏｌ））の溶液を滴下し、３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中の化合物１０４（５－ブロモ－１－ペンテン（１９．４ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下して添加した。反応混合物を０℃に加温し、４時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）及び脱イオン水（１００ｍＬ）でクエンチし、次いで酢酸エチル（２×４００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物１０５を、ヘキサン中の５０～１００％酢酸エチルの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって単離した。化合物１０５の収率：７．９３ｇ（４３％）。
Figure 2022518384000171
アセトン（６７．５ｍＬ）中の化合物１０５（２．５０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、水（７．５ｍＬ）および２，６ルチジン（２．７４ｍＬ、２３．６ミリモル）に、４－メチルモルホリンＮ－オキシド（２．０７ｇ、１７．７ミリモル）および四酸化オスミウム（ｔ－ブタノール中２．５重量％、２．４０ｇ、０．２４ミリモル）室温で添加した。７５分間撹拌後、（ジアセトキシヨード）ベンゼン（５．６９ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。反応混合物を２時間撹拌し、次いで飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物１０６を、酢酸エチル中の０～５％メタノールの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって単離した。化合物１０６の収率：１．１２ｇ（４４％）。
Figure 2022518384000172
ＴＨＦ（９ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、０．１８５ｇ、４．６４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃でＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物１０７（ジエチル（Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルカルバモイルメチル）ホスホネート）（１．０６ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（９ｍＬ）中の化合物１０６（０．９０３ｇ、４．２１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌し、次いで飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を半飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で２回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。化合物１０８：１．４０ｇの収率（１００％収率と仮定し、さらに精製することなく次の工程で使用する）。
Figure 2022518384000173
酢酸エチル（２０ｍＬ）中の化合物１０８（１．３１ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％負荷、０．４６６ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器をＨ２～５０ＰＳＩで加圧した。３．５時間撹拌した後、反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を濃縮し、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中の５０～１００％酢酸エチルの勾配を溶離するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により化合物１０９を単離した。化合物１０９の収率：０．８３３ｇ（６２％）。
Figure 2022518384000174
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物１０９（０．８３３ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＥＡ（０．５９０ｍＬ、３．４１ｍｍｏｌ）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（０．７４４ｇ、３．４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃に５時間加熱した。ＬＣ／ＭＳに基づいて反応は不完全であり、ＤＩＥＡのさらなる部分（０．５９０ｍＬ、３．４１ｍｍｏｌ）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボナート（０．７４４ｇ、３．４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃でさらに１６時間加熱した。反応混合物を濃縮し、５０～１００％酢酸エチル／ヘキサンの勾配を溶離するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により化合物１１０を単離した。化合物１１０：０．９３４ｇ（８４％）の収率。
Figure 2022518384000175
ｎ－ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、０．７０ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（１．５ｍＬ）の溶液に、ＴＨＦ（０．８ｍＬ）中の溶液として化合物１１１（５－ブロモ－２－（フェニルメトキシ）－ピリジン）（０．４６５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を－７８℃で３分間かけて滴下し、次いで化合物１１０（０．５３５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）中の溶液として添加した。３０分間撹拌した後、反応物を０℃に加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）でクエンチし、さらに６ＭのＨＣｌ水溶液でｐＨ７に酸性化した。混合物を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。ＴＨＦ（８ｍＬ）中の粗溶液にＤＩＥＡ（０．９４ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（１．１８ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、化合物１１２を、ヘキサン中の０～４０％酢酸エチルの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって単離した。化合物１１２：４７１ｍｇ（５０％）の収率。
Figure 2022518384000176
ジメトキシエタン（２ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、０．１０６ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ジメトキシエタン（１ｍＬ）中の溶液として化合物１１３（ホスホノ酢酸トリエチル）（０．５９３ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を０℃で溶液として加え、２０分間撹拌した後、反応混合物を室温に加温し、ジメトキシエタン（２ｍＬ）中の化合物１１２（０．４６７ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を７０℃で４時間加熱した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）で停止し、生成物を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮し、化合物１１４を、ヘキサン中の０～３０％酢酸エチルの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）により、ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ異性体の１：１混合物として単離した。化合物１１４：３９２ｍｇ（７４％）の収率。
Figure 2022518384000177
エタノール（６ｍＬ）中の化合物１１４（３９０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％負荷、６９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器をＨ２で５０ＰＳＩまで加圧した。４時間撹拌後、反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を濃縮し、ＤＣＭ中の０～１０％メタノールの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって化合物１１５をラセミ混合物として単離した。化合物１１５：９５ｍｇ（２９％）の収率。キラル半分取ＨＰＬＣ（２５０×２１ｍｍキラルパック（登録商標）ＡＤカラム、５ｐｍ、９０／１０ヘキサン／ＥｔＯＨ、４０ｍＬ／分）を用いて、４２ｍｇの第一溶出－異性体（ＲＴ＝１２～１４ｍ、＞９９％ｅｅ、化合物１１５ａ）及び４０ｍｇの第二溶出Ｓ－異性体（ＲＴ＝１５～１８ｍ、＞９８％ｅｅ、化合１１５ｂ）。Ｒ及びＳ異性体の同定は、Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．４７ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８３４（２００４）が報告した構造的に類似した化合物の溶出順序に基づいて行った。
構造２８ｃ （（Ｒ）－３－（２－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン－３－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）及び３１ｃ（（Ｒ）－３－（１－（２－（２－（２－（２－（アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）
Figure 2022518384000178
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１１５ａ（４１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ４－ＯＴＳ（６１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（５３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）でクエンチし、次いで酢酸エチル（３×３ｍＬ）で抽出した。有機相を減圧下で濃縮した。続いて、Ｎ－及びＯ－アルキル化位置異性体の粗混合物を、さらなる精製なしに使用した。
Figure 2022518384000179
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）及び脱イオン水（１．０ｍＬ）中の化合物１１６ａ及び１１７ａ（５８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、９ａ：１０ａの４：６混合物）の溶液に、水酸化リチウム（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで３５℃で２時間撹拌した。さらに水酸化リチウム（４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加え、反応温度を４０℃に上げ、３時間撹拌した後、水酸化リチウムの最終部分（４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、総量１６ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で３時間撹拌した。反応混合物を６ＮのＨＣｌ水溶液でｐＨ７に酸性化し、減圧下で濃縮した。位置異性体、化合物１１８ａ及び１１９ａを、０．５％酢酸を含有するＤＣＭ中の０～５％メタノールの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって分離した。化合物１１８ａを、逆相ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ａｑｕａｓｉｌ（商標）Ｃ１８、２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ）によってさらに精製した。２０ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡ水／ＡＣＮ、勾配溶離液中、１３ｍｇの化合物１１８ａ（構造２８ｃ）を得る。化合物１１９ａを同じ条件下で精製して、１６ｍｇの化合物１１９ａ（構造３１ｃ）を得た。
構造２９ｃ （（Ｓ）－３－（６－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン－３－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）および３０ｃ（（Ｓ）－３－（１－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）
Figure 2022518384000180
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１１５ｂ（４０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ４－ＯＴＳ（５８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に炭酸セシウム（５１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で３０分間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）でクエンチし、次いで酢酸エチル（３×３ｍＬ）で抽出した。有機相を減圧下で濃縮した。続いて、Ｎ－及びＯ－アルキル化位置異性体の粗混合物を、さらなる精製なしに使用した。
Figure 2022518384000181
化合物１１６ｂ及び１１７ｂ（５６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、９ａ：１０ａの４：６混合物）のＴＨＦ（０．７５ｍＬ）及び脱イオン水（０．７５ｍＬ）溶液に、水酸化リチウム（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４５℃で２．５時間撹拌した。さらなる部分の水酸化リチウム（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２．５時間撹拌した。反応温度を３５℃に下げ、混合物を一晩撹拌した。反応混合物を６ＮのＨＣｌ水溶液でｐＨ＝７に酸性化し、減圧下で濃縮した。位置異性体、化合物１１８ｂ及び１１９ｂを、０．５％酢酸を含有するＤＣＭ中の０～５％メタノールの勾配を溶出するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより分離した。化合物１１８ｂを、逆相ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ａｑｕａｓｉｌ（商標）Ｃ１８、２５０×２１．２ｍｍ、５ｐｍ、２０ｍＬ／分、水／ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ、勾配溶離）によってさらに精製して、１４ｍｇの化合物１１８ｂ（構造２９ｃ）を得た。化合物１１９ｂを同じ条件下で精製し、１８ｍｇの化合物１１９ｂ（構造３０ｃ）を得た。
構造３２ｃ （（（Ｒ）－３－（４－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（Ｎ－メチル－５－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ペンタアミド）プロパン酸の合成
Figure 2022518384000182
トルエン（８０ｍＬ）中の１２０（２．７５ｇ、１１．９４ｍｍｏｌ）を３Åシーブにかけて化合物１２１（５．７９ｇ、４７．７８ｍｍｏｌ）、次いでＰＰＴＳ（３００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、次いでＡｃＯＨ（６８３ｕＬ、１１．９４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を一晩還流させた。反応が完了したら、飽和重炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させた。有機層を２容量の酢酸エチルで希釈し、分離し、硫酸ナトリウムで濾過した。生成物をシリカ上で単離し、ヘキサン中の酢酸エチル（０～３０％）の勾配を溶離して２．０５４ｇ（５４％）を得た。
Figure 2022518384000183
－７８℃のＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＤＩＡ（２．８５ｍＬ、２０．３３ｍｍｏｌ）に、ｎ－ＢｕＬｉ（７．７６ｍＬ、１９．４１ｍｍｏｌ）の２．５Ｍ溶液を滴下添加した。－７８℃で５分間撹拌し、酢酸エチル（１．８１ｍＬ、１８．４８ｍｍｏｌ）を滴下した。－７８℃でさらに１０分間撹拌を続け、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のクロロチタントリイソプロポキシド（９．２７ｍＬ、３８．３８１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。さらに－７８℃で１５分間撹拌を続け、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物１２２（２．０５４ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。－７８℃で１．５時間撹拌を継続し、反応終了後、飽和重炭酸アンモニウムを添加して反応を停止した。懸濁液を６容量の酢酸エチルで希釈し、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をシリカ上で単離し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶離して１．０４３ｇ（５３％）を得た。
Figure 2022518384000184
ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中で攪拌する化合物１２３（１．０４３ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）に、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ溶液（３．０９ｍＬ、１２．３７ｍｍｏｌ）を添加した。脱保護の完了後、溶液を水（８ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（６ｍＬ）で２回洗浄した。 水層を水酸化ナトリウムでｐＨ１１に調整した。沈殿物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して０．６１６ｇ（７８．５％）の生成物１２４を得、これをさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000185
０℃でＴＨＦ（１．５ｍＬ）中の化合物１２５（９２．１ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）にＤＣＣ（６８．１ｍｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、ＰＮＰ（１０６．１ｍｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴を除去し、撹拌を１時間続けた。完了後、懸濁液を－２０℃に１時間冷却し、沈殿物を濾過により除去した。上清を濃縮し、１２９ｍｇ（１０３％）の粗生成物１２６を得、これをさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000186
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１２４（１４８．６ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１２９ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）を含有する混合物をヨウ化メチル（６６．５ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）で処理し、５０℃で３時間撹拌した。アルキル化の完了に際して、全ての揮発性物質を除去し、生成物をシリカ上で単離し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶離し、各々を１％ＴＥＡで緩衝し、９４．６ｍｇ（６１％）を得た。
Figure 2022518384000187
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１２７（９４．５ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）にＤＩＥＡ（１４９μＬ、０．８５６ｍｍｏｌ）を加え、次いで化合物１２６（１２９．９ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８０℃で１時間撹拌し、完了後、全ての揮発性物質を除去し、粗製物をＭｅＯＨ中に溶解し、炭素上１０％パラジウム（２０ｍｇ）で処理し、フラスコを６０ＰＳＩの水素でチャージした。完了後、懸濁液を濾過した。上清を濃縮し、得られた粗生成物をさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000188
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１２８（１５９ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）、ブロモ－ＰＥＧ２－アジド（７４．７ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（２０４ｍｇ、０．６２７ｍｍｏｌ）を含有する混合物を、６０℃に２時間加熱した。完了後、全ての揮発性物質を除去し、粗製物をジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（０．５ｍＬ、２ｍｍｏｌ）で処理し、４０℃に３時間加熱した。完了後、全ての揮発性物質を除去した。粗製物をＴＨＦ（１ｍＬ）、ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）及びＦＬＯ（１．５ｍＬ）の混合物中に懸濁し、水酸化リチウム（８３．５ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）で処理し、４０℃に１６時間加熱した。完了後、ｐＨをＴＦＡで３に調整し、生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８カラム（２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン）上で分離して、０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリルの勾配を溶離して３３．１ｍｇ（２０％）を得た。
構造３３ｃ （（（Ｒ）－１－アジド－１３－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－１２－（５－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ペンタノイル）－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデカン－１５－酸）の合成
Figure 2022518384000189
トルエン（４５ｍＬ）中の化合物１３０（１．５ｇ、９．７３ｍｍｏｌ）、（Ｒ）ｔ－ブチルスルフィンアミド（２．３６ｇ、１９．４６ｍｍｏｌ）、及びＡｃＯＨ（０．１４ｍＬ）を含有する混合物を、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋトラップを装着したフラスコ中で還流した。反応が完了したら、飽和重炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をシリカ上で分離し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶離して１．７１４ｇ（６８．４％）を得た。
Figure 2022518384000190
－７８℃のＴＨＦ（１８ｍＬ）中のＤＩＡ（３．０５６ｍＬ、２１．８０ｍｍｏｌ）に、ｎ－ＢｕＬｉのａ２．５Ｍ溶液（８．３２４ｍＬ、２０．８１ｍｍｏｌ）を滴下添加した。－７８℃で５分間撹拌し、酢酸エチル（１．９４ｍＬ、１９．８２ｍｍｏｌ）を滴下した。－７８℃でさらに１０分間撹拌を続け、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のクロロチタントリイソプロポキシド（９．９４ｍＬ、４１．６２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。さらに－７８℃で１５分間撹拌を続け、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の化合物１３１（１．７０ｇ、６．６１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。－７８℃で１．５時間撹拌を継続し、反応終了後、飽和重炭酸アンモニウムを添加して反応を停止した。懸濁液を７容量の酢酸エチルで希釈し、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をシリカ上で単離し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶離して０．９８４ｇ（４３％）を得た。
Figure 2022518384000191
０℃のＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の化合物１３２（０．９７５ｇ、２．８２ｍｍｏｌ）に、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（２．１２ｍＬ、８．４７ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。反応終了後、水（１５ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。有機層を分離し、水層のｐＨを水酸化ナトリウムで１２に調節した。水層を５容量の酢酸エチルで洗浄し、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで濾過し、濃縮した。生成物をシリカ上で分離し、１％ＴＥＡを含有するヘキサン中の酢酸エチルの勾配を溶離して０．４３４ｇ（６４％）を得た。
Figure 2022518384000192
３Åモレキュラーシーブ上のＴＨＦ（２ｍＬ）中の化合物１３３（０．１２０ｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）及びＰＥＧ（０．１５１ｇ、０．６９６ｍｍｏｌ）の混合物にＳＴＡＢ－Ｈ（０．２５３ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を室温で１６時間撹拌した。反応が完了したら、飽和重炭酸ナトリウムを添加することにより反応を停止させ、粗製物を酢酸エチル３部で抽出した。分離した有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた粗製物を、その後さらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000193
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１３４（０．２００ｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）をＨＡＴＵ（０．２２７ｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）で処理し、５分間撹拌した。活性化されたエステルにＤＩＥＡ（０．２５９ｍＬ、１．４９ｍｍｏｌ）、次いでＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１２５（０．２２０ｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を１時間撹拌した。全ての揮発性物質を除去し、得られた粗製物を純ＴＦＡ（３．８ｍＬ）で処理し、４０℃で３時間撹拌し、ＢＯＣ除去の完了後、全ての揮発性物質を除去し、粗製物をＴＨＦ（４ｍＬ）、水（８ｍＬ）及びＭｅＯＨ（８ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。得られた混合物をＬｉＯＨ（７１．６ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ）で処理し、４０℃に１６時間加熱した。完了後、ｐＨをＴＦＡで３に調整し、生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８カラム（２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン）上で分離して、０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリルの勾配を溶離して５６．２ｍｇ（１８％、３段階）を得た。
構造３４ｃ （（（Ｓ）－１－アジド－１３－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－１２－（５－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ペンチル）－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデカン－１５－酸）の合成
Figure 2022518384000194
化合物１３６（０．５００ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（９．０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）の混合物中、０℃で処理した。冷却を除去し、ガス発生が停止するまで撹拌を継続した。反応混合物を５容量のＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を炭酸水素アンモニウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配を用いてシリカ上で溶離することにより単離し、３０９ｍｇ（６７％）を得た。
Figure 2022518384000195
０℃でＤＣＭ（９ｍＬ）中の化合物１３７（０．３０５ｇ、０．９５２ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、マーチン試薬をいくつかの部分で添加した。数滴の水を加え、冷却を除去し、反応物を３時間撹拌した。完了後、混合物を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、次いで飽和チオ硫酸ナトリウムで洗浄した。分離した有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物１３８をシリカ上で分離し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶離して１４０ｍｇ（４６％）を得た。
Figure 2022518384000196
ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の化合物１（８５．２ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）及び１３８（１３４．９ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）を含有する混合物に、ＳＴＡＢ－Ｈ（０．１５０ｇ、０．７０６ｍｍｏｌ）を加え、得られた懸濁液を１６時間４０℃に加熱した。反応が完了したら、５容量の酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウムで処理した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を、１％ＴＥＡを含有するＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶離するシリカ上で分離することにより単離し、６４ｍｇ（３３％）を得た。
Figure 2022518384000197
３Åモレキュラーシーブ上のＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の化合物１４０（６０ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）、Ａｌｄ－ＰＥＧ３－Ｎ３（７１．９ｍｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）及びＡｃＯＨ（３μＬ、０．０２７６ｍｍｏｌ）を含む混合物に、シアノホウ水素化ナトリウム（２８．９ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を４０℃で３時間撹拌した。完了後、混合物を０℃に冷却し、水（０．１５ｍＬ）を加え、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ）を用いて溶液をｐＨ７に酸性化した。その後、すべてのメタノールを除去し、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（０．１３８ｍＬ、０．５５２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４０℃で２時間撹拌した。ＢＯＣ除去の完了後、全ての揮発性物質を除去し、粗製物をＴＨＦ（１ｍＬ）、水（２ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２ｍＬ）の混合物中に懸濁し、水酸化リチウム（２６．５ｍｇ、１．１０４ｍｍｏｌ）で処理した。エステル除去の完了後、ＴＦＡの添加によりｐＨを３に調節し、生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）（２１．２×２５０ｍｍ）Ｃ１８カラム上での分離により単離し、０．１％ＴＦＡを含有する水中のアセトニトリルの勾配を溶離して１６．４ｍｇ（２４％、３－工程）を得た。
構造３６ｃ （（Ｓ）－３－（４－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）の合成
Figure 2022518384000198
ＤＣＭ（３０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（７５ｍＬ）中の６－オキソヘプタン酸（９．７４ｇ、６８ｍｍｏｌ）の溶液にコーンを添加した。室温でＨ２ＳＯ４（０．１８ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）。反応混合物を一晩還流した。次いで、反応混合物を油状物に濃縮し、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に再溶解し、そして飽和状態で洗浄した。飽和ＮａＨＣＯ３（２×４０ｍＬ）水溶液及びブライン（４０ｍＬ）。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で使用した。化合物１４１の収率：１０．２ｇ（９５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ３．５８（ｓ、３Ｈ）、２．４３（ｔ、２Ｈ）、２．２９（ｔ、２Ｈ）、１．４６（ｍ、４Ｈ）。
Figure 2022518384000199
ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中の化合物１４１（１０．２ｇ、６５ｍｍｏｌ）及び２－アミノ－３－ホルミルピリジン（７．８９ｇ、６５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｌ－プロリン（３．７２ｇ、３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流下で一晩加熱した。次いで、反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ＤＣＭ中のＥｔＯＡｃの勾配（１０～１００％）で溶離した。化合物１４２の収率：６．０８ｇ（３９％）。Ｃ１４Ｈ１６Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：２４５．１３で計算した質量：２４５．２１。
Figure 2022518384000200
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の化合物１４２（６．０８ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％負荷、Ｄｅｇｕｓｓａｔｙｐｅ、１．９９ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応フラスコに窒素を充填し、排気し、窒素を３回充填した。このプロセスを水素で繰り返し、反応容器に最終的に水素（１ａｔｍ）を投入し、室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）上で濾過し、パッドをＭｅＯＨで洗浄し、濾液を濃縮した。生成物である化合物１４３を、１００％収率を仮定したさらなる精製なしに、次の工程で使用した。Ｃ１４Ｈ２０Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：２４９．１６で計算した質量：２４９．０８。
Figure 2022518384000201
無水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中のジメチルホスホン酸（１２．３ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ－ＢｕＬｉ溶液（ヘキサン中２．５Ｍ、４０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）をシリンジポンプで－７８℃で１時間かけて添加し、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の化合物１４３（６．１７５ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）の溶液を－７８℃で４５ｍかけて反応混合物に添加し、－７８℃で２０分間撹拌後、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２００ｍＬ）を室温に加温し、ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で抽出する。有機層を水（２００ｍＬ）及びブライン（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で使用した。化合物１４４の収率：７．８６ｇ（９３％）。Ｃ１６Ｈ２５Ｎ２Ｏ４Ｐ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：３４１．１７、見出された質量：３４１．１７。
Figure 2022518384000202
ＴＨＦ（１３．５ｍＬ）中の３－フルオロ－４－（フェニルメトキシ）－ベンズアルデヒド（０．３８ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）、化合物１４４（０．６７ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）、および無水炭酸カリウム（０．５４７ｇ、３．９６ミリモル）の懸濁液は、一晩還流加熱した。追加の３－フルオロ－４－（フェニルメトキシ）－ベンズアルデヒド（０．１９ｇ、０．８３ミリモル）および炭酸カリウム（０．２３ｇ、１．６５ミリモル）を加え、反応混合物をさらに４時間還流した。混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配（０～１０％）で溶離した。化合物１４５：４４６ｍｇ（６１％）の収率。Ｃ２８Ｈ２９ＦＮ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋：４４５．２３で計算した質量：４４５．４１。
Figure 2022518384000203
Ｒ－ＢＩＮＡＬの調製：ＬＡＨ（０．３９６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、０．９８当量）のスラリーに、乾燥ＴＨＦ（３４ｍＬ）を、３５℃未満の内部温度を維持しながら１０分間、ＴＨＦ（３．２ｍＬ）中の溶液としてＥｔＯＨ（０．４９２ｇ、１０．６５ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。３０分間エージングした後、Ｒ－ＢＩＮＯＬ（３．０５ｇ、１０．６５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ）の溶液として加え、内部温度を３５°Ｃ未満に維持した（約１０分）。室温で２時間撹拌した後、反応混合物をドライアイス／アセトン浴上で－７８℃に冷却した。。
化合物１４５（１．１８ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を無水トルエン（５０ｍＬ）で共沸的に乾燥させ、無水ＴＨＦ（１２ｍＬ）に溶解した。化合物１４５の溶液を、シリンジポンプを介して－７８℃で４５ｍにわたってＲ－ＢＩＮＡＬの溶液に滴下して加えた。１．５時間後、反応容器を非常に大きな下水道に移し、ドライアイス／アセトンを充填し、アルミホイルで覆った。反応混合物を－７８℃でＯＮで撹拌した。減少の大部分は最初の１．５時間以内に発生し、一晩で少量の追加変換が行われた。飽和を加えることにより反応をクエンチした。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１５０ｍＬ）を加え、室温まで加温する。混合物を、６Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨ＝７にさらに酸性化し、次いで、ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（１２５ｍＬ）およびブライン（１２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残留物を、固定相としてシリカゲルを使用するコンビフラッシュによって精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配（０～５％）で溶出した。化合物１４６の収量：６３４ｍｇ（５３％）。キラル純度は、分析キラルＨＰＬＣ、ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ－Ｈカラム４．６×２５０ｍｍ、５ミクロン、ＥｔＯＨ ０．１％ジエチルアミンアイソクラティック、１．７５ｍＬ／分で測定した。最初に溶出したＲ異性体は８６面積％純粋で、７２％ｅｅに相当する。化合物１４６をキラルセミ分取ＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈ ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、ＥｔＯＨ ０．１％ジエチルアミン、２０ｍＬ／分）でさらに精製した。化合物１４６の最終収量：４４５ｍｇ（９８％ｅｅ）。Ｃ２８Ｈ３１ＦＮ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算された質量：４４７．２５、実測値：４４７．３０。
Figure 2022518384000204
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の化合物１４６（０．３２５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びマロン酸モノメチルエステル（０．１０３ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中のＤＭＡＰ（９ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を０℃に冷却し、ＤＣＣ（０．１８０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加した。冷却浴を除去し、反応物を室温で撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０－５％）の勾配で溶離した。化合物１４７：１４２ｍｇ（３７％）の収率。Ｃ３２Ｈ３５ＦＮ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：５４７．２６、見出された質量：５４７．５８。
Figure 2022518384000205
ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中の化合物１４７（０．２３２ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル（アセトアミド（０．２２９ｇ、１．１２ｍｍｏｌ））を添加した。混合物を６０℃で３０ｍ加熱した。塩水（５８μＬ）を５ｍにわたって２回に分けて添加した。次いで、反応混合物を９０℃で３時間加熱し、次いで室温で一晩加熱した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１２ｍＬ）で希釈し、水（３ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃ（１２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配で溶離した。化合物１４８：１４０ｍｇ（６６％）の収率。Ｃ３１Ｈ３５ＦＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋で計算した質量：５０３．２７、求めた質量：５０３．２９。
Figure 2022518384000206
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中の化合物１４８（０．１６９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中のＰｄ／Ｃ（１０％負荷、３６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）のスラリーを添加した。反応容器を加圧し、水素で３回ベントした。反応容器を５５ｐｓｉに３時間再加圧した。反応混合物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）で希釈し、濾過した。濾液を濃縮し、生成物である化合物１４９を、１００％収率を想定したさらなる精製なしに、次の工程で使用した。Ｃ２４Ｈ３１ＦＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋：４１５．２４で計算した質量は４１５．０７であった。
Figure 2022518384000207
ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中の化合物１４９（１３９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びアジド－ＰＥＧＭｏｓｙｌａｔｅ（０．１８８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（１６４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱し、次いで、飽和状態で急冷した。水炭酸水素ナトリウム３（３ｍＬ）。混合物をＥｔＯＡｃ、（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮し、さらに精製することなく次の工程に使用した。Ｃ３２Ｈ４６ＦＮ５Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：６１６．３５で計算した質量：６１６．９０。
Figure 2022518384000208
ＴＨＦ（１．５ｍＬ）及び水（１．５ｍＬ）中の化合物１５０（０．２０７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（０．０４０ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃に一晩加熱した。翌朝、反応混合物を６ＮＨＣｌでｐＨ＝７に酸性化し、減圧下で濃縮した。残渣をＨ２Ｏ中３５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡに溶解し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（サーモアクアシルＣ１８、２５０×２１ｍｍ、５ｐｍ、２０ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ中のＡＣＮの勾配）により精製した。化合物１５１（ＳＭ３６）：１２５ｍｇ（３段階にわたり５２％）の収率。Ｃ３１Ｈ４４ＦＮ５Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：６０２．３４で計算した質量：６０２．８５。
構造３７ｃ （（Ｓ）－３－（４－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）－３－フルオロフェニル）－３－（５－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ペンタナミド）プロパン酸）の合成
Figure 2022518384000209
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物１６９（９０ｍｇ、０．２６８ｍｍｏｌ）をＨＡＴＵ（１１２ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）で処理し、５分間撹拌した。ＤＭＦ（０．５）中の化合物１７０（９４ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．１５４ｍＬ、０．８８４ｍｍｏｌ）を含有する混合物を次に添加し、撹拌を１時間続けた。完了後、全ての揮発性物質を除去し、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出するシリカ上での分離により化合物１７１を単離し、１２３ｍｇ（７２％）を得た。
Figure 2022518384000210
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の１０％パラジウム炭素（２１ｍｇ、０．０１９４ｍｍｏｌ）および化合物１７１（１２３ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を含む懸濁液に、６０ＰＳＩ水素を入れ、１時間撹拌した。完了したら、懸濁液をセライト（登録商標）で濾過し、濃縮して、８８ｍｇ（８３％）の粗製物を得て、これをさらに精製することなく使用した。
Figure 2022518384000211
化合物１７２（８７ｍｇ、０．１６０ミリモル）、Ｂｒ－ＰＥＧ３－Ｎ３（５０ｍｇ、０．１７６ミリモル）および炭酸セシウム（１１５ｍｇ、０．３５２ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）中に含む懸濁液を６０℃に加熱し、２時間撹拌した。完了したら、すべての揮発性物質を除去し、化合物１７３を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨの勾配を溶出するシリカ上での分離によって単離して、９１ｍｇ（７６％）を得た。
Figure 2022518384000212
ジオキサン（０．５ｍＬ）中の化合物１７３（５０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（０．６７１ｍｍｏｌ、０．１６８ｍＬ）溶液で処理し、４０℃で３時間撹拌した。完了すると、すべての揮発性物質が除去された。粗生成物をＨ２Ｏ（０．４ｍＬ）、ＴＨＦ（０．２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（０．４ｍＬ）の混合物に溶解し、ＬｉＯＨ（８ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）で処理し、そして４０℃で１６時間撹拌した。完了したら、ＴＦＡでｐＨを３に調整し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（２１．２ｘ２５０ｍｍ、５ミクロン）で分離して、０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリルの勾配を溶出して生成物を単離し、収量は２５ｍｇ（６０％、２工程）であった。
構造３８ｃ （（Ｓ）－３－（２－（３－（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）－３－オキソプロピル）ピリミジン－５－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）及び構造３９ｃ （（Ｓ）－３－（２－（１－アジド－１２－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１３－アザヘキサデカン－１６－イル）ピリミジン－５－イル）－９－（５，６，７，８－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジン－２－イル）ノナン酸）の合成
Figure 2022518384000213
無水ＴＨＦ（９５ｍＬ）中の５－ブロモ－２－ヨード－ピリミジン（８．００ｇ、２８．１ミリモル）の溶液に、内部温度を－７０℃（約１５ｍ）未満に維持しながら、ＴＨＦ（０．７５Ｍ、５６ｍＬ、４２．０ｍｍｏｌ）中のｉ－ＰｒＭｇＢｒの溶液を－７８℃で添加した。次いで、得られた溶液を１５分間撹拌した後、ＣｕＣＮ・２ＬｉＣｌ溶液をＴＨＦ（１Ｍ、３１ｍＬ、３１．０ｍｍｏｌ）に加え、次いで臭化アリル（５．１０ｇ、４２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液として加えた。反応混合物を室温に加温し、１時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（４０ｍＬ）でクエンチし、濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配（０～２０％）で溶離した。化合物１５２：４．１３ｇ（７４％）の収率。Ｃ７Ｈ７ＢｒＮ２［Ｍ＋Ｈ］＋：１９８．９９について計算した質量：１９９．０５であった。
Figure 2022518384000214
ＴＨＦ（１１５ｍＬ）中の化合物１５２（７．７０ｇ、３８．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（０．５Ｍ、１３１ｍＬ、６５．８ｍｍｏｌ）中の９－ＢＢＮの溶液を３０ｍにわたって０℃で添加した。反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。反応混合物に、水（１００ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（４８．７ｇ、５８０ｍｍｏｌ）のスラリー、次いで水（１００ｍＬ）中のＮａＢＯ３一水和物（４３．３ｇ、４６４ｍｍｏｌ）のスラリーを０℃で添加し、冷却浴を除去し、混合物を１時間激しく撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。ブライン層をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、約１５ｇの粗黄色油状物を得た。この粗製物を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配（５０～１００％）で溶離した。化合物１５３：３．４４ｇ（４１％）の収率。Ｃ７Ｈ９ＢｒＮ２Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋：２１７．００に対して計算した質量：２１６．９７であった。
Figure 2022518384000215
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の化合物１５３（３．４４ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）の溶液に、イミダゾール（１．７３ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）及びＤＣＭ（１２ｍＬ）中のＴＢＤＰＳＣ１（５．２３ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）の０℃での溶液を添加し、反応物を室温に加温した。反応混合物をＤＣＭ（７５ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０～８％）の勾配で溶離した。化合物１５４の収率：５．５６ｇ（７７％）。Ｃ２３Ｈ２７ＢｒＮ２ＯＳｉ［Ｍ＋Ｈ］＋：４５５．１２で計算した質量は４５５．４４であった。
Figure 2022518384000216
－７５℃のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の化合物１５４（６．０７ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）の溶液に、内部温度を－７０℃未満（約１０ｍ）に維持しながら、ＴＨＦ（２．５Ｍ、５．６ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）中のｎＢｕＬｉの溶液を滴下した。３分後、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のギ酸エチル（１．０４ｇ、１．１３ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、内部温度を－７０℃未満に維持した。混合物を－７８℃で２０分間撹拌し、次にジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、３．６７ｍＬ、１４．７ｍｍｏｌ）でクエンチし、ＴＨＦ（５ｍＬ）でさらに希釈し、内部温度を－６５℃未満に維持した。冷却浴を取り外し、反応物を周囲温度に温め、濃縮した。残留物を、固定相としてシリカゲルを使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈによって精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配（０～２０％）で溶出した。化合物１５５の収量：１．７９ｇ（３３％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１０．０９（ｓ、１Ｈ）、９．０６（ｓ、２Ｈ）、７．６４（ｍ、４Ｈ）、７．３８（ｍ、６Ｈ）、３．７７（ｔ、２Ｈ）、３．２０（ｔ、２Ｈ）、２．１７（ｑ、２Ｈ）、１．０３（ｓ、９Ｈ）。
Figure 2022518384000217
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の化合物１４４（１．６８ｇ、４．１５ｍｍｏｌ）及び化合物１５５（１．７０ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）の溶液にＫ２ＣＯ３（０．８６１ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２．５時間４０℃に加熱し、次いで１２時間５０℃に加熱した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０～１００％）の勾配で溶離した。化合物１５６の収率：２．０４ｇ（７９％）。Ｃ３８Ｈ４６Ｎ４Ｏ２Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋：６１９．３５で計算した質量：６１９．６９であった。
Figure 2022518384000218
Ｒ－ＢＩＮＡＬ：ＬＡＨ（１．１６９ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）の調製を乾燥ＴＨＦ（９０ｍＬ）中でスラリー化した。スラリーに、Ｔｉｎｔ＜４０℃に保ったＴＨＦ溶液（６Ｍ、５．２ｍＬ、３１．４ｍｍｏｌ）としてＥｔＯＨを添加し、混合物を３５℃で４０ｍ冷却し、３０℃に冷却した。ＴＨＦ（４５ｍＬ）中のＲ－（ＢＩＮＯＬ）溶液（９．００ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）を添加し、Ｔｉｎｔ＜４０℃に保った。混合物を５０℃で１時間エージングし、周囲温度に冷却し、５０℃に加熱し、ＴＭＥＤＡ（１４．１ｍＬ、１１．０ｇ、９４．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５０℃で１時間エージングし、周囲温度まで冷却し、次いで化合物１５６と共に使用した。
ＴＨＦ中のＲ－ＢＩＮＡＬ（－０．２Ｍ、１１０ｍＬ、２２．０ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の化合物１６（１．１６ｇ、１．８８ミリモル）の溶液を－７８℃で５ｍにわたって加えた。３０分後、反応混合物をｓａｔでクエンチした。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を室温に温め、生成物をＥｔＯＡｃ（３×１２５ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残留物を、固定相としてシリカゲルを使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈによって精製し、１％トリエチルアミンを含むＥｔＯＡｃ中のＭｅＯＨ（０－５％）の勾配で溶出した。化合物１５７の収量：０．９６ｇ（８２％）。キラル純度は、分析キラルＨＰＬＣ、ＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤ－Ｈカラム４．６×２５０ｍｍ、５ミクロン、２５％ＥｔＯＨ、７５％ヘキサン、０．１％ジエチルアミンアイソクラティック、２ｍＬ／分で測定した。２番目に溶出するＲ異性体は－９５面積％純粋で、－９０％ｅｅに対応する。Ｃ３８Ｈ４８Ｎ４Ｏ２Ｓｉについて計算された質量［Ｍ＋Ｈ］＋：：６２１．３６、実測値：６２１．７１。
Figure 2022518384000219
トリエチルト酢酸（９．２５ｍＬ）中の化合物１５７（０．９２５ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、プロピオン酸のトリメチルオルト酢酸（０．１５Ｍ、０．５５ｍＬ、０．０８ｍｍｏｌ）溶液を添加した。反応混合物を密封バイアル中で１４０℃で１．５時間加熱した。反応混合物を濃縮し、残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０～５０％）の勾配で溶離した。化合物１５８の収率：０．８９８ｇ（８７％）。Ｃ４２Ｈ５４Ｎ４Ｏ３Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋：６９１．４１で計算した質量は６９１．９３であった。
Figure 2022518384000220
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物１５８（０．８９３ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）中のＰｄ／Ｃスラリー（負荷の程度：１０重量％、０．１３８ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物に５０ｐｓｉのＨ２を充填し、４．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濃縮し、さらに精製することなく次の工程に使用した。化合物１５９の収率：０．８８５ｇ（９９％）。Ｃ４２Ｈ５６Ｎ４Ｏ３Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋：６９３．４２で計算した質量は６９３．８２であった。
Figure 2022518384000221
ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中の無水Ｂｏｃ（０．８３６ｇ、３．８３ｍｍｏｌ）の溶液を化合物１５９（０．８８５ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）に加え、次いでＤＭＡＰ（ＴＨＦ中２０ｍｇ／ｍＬ、１５５ｕＬ、０．００３１ｇ、０．０２６ミ混合物を６０℃に６時間加熱した。反応混合物を濃縮し、残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０～５０％）の勾配で溶離した。化合物１６０：０．７２１ｇ（７１％）の収率。Ｃ４２Ｈ６４Ｎ４Ｏ５Ｓｉ［Ｍ＋Ｈ］＋：７９３．４７で計算した質量：７９４．２８。
Figure 2022518384000222
ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物１６０（０．６２１ｇ、０．７８３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＨＦ（１Ｍ、１．２ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）中のＴＢＡＦの溶液を加え、反応混合物を室温に加温し、２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を濃縮した。残渣を、固定相としてシリカゲルを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより精製し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（５０～１００％）の勾配で溶離した。化合物２１の収率：０．３６２ｇ（８３％）。キラル純度は、分析的キラルＨＰＬＣ、キラルパックＡＤ－Ｈカラム４．６×２５０ｍｍ、５ミクロン、２０％ＥｔＯＨ、８０％ヘキサン、０．１％ジエチルアミン、イソクラティック、１．５ｍＬ／分で測定した。第２の溶出Ｒ異性体は９３％純粋で、８６％ｅｅに相当した。化合物１６１を、キラル半分取ＨＰＬＣ（キラルパックＡＤ－Ｈ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、２０％ＥｔＯＨ、８０％ヘキサン、０．１％ジエチルアミン、６０ｍＬ／分）によってさらに精製した。化合物１６１の最終収量：３０８ｍｇ（９９％ｅｅ）。Ｃ３１Ｈ４６Ｎ４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋：５５５．３６で計算した質量は５５５．７２であった。
Figure 2022518384000223
ＡＣＮ（０．３０ｍＬ）中の化合物１６１（０．０３０ｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＡＩＢ（０．０４２ｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）及びＴＥＭＰＯ（２．５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで水（０．３０ｍＬ）を室温で添加した。２時間後、反応混合物を濃縮した。残渣をＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、０．１％ＴＦＡ水／ＡＣＮ、３０－８０％ＡＣＮ勾配）で精製した。化合物１６２の収率：０．０３０ｇ（９７％）。Ｃ３１Ｈ４４Ｎ４Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：５６９．３４に対して計算した質量：５６９．６８であった。
Figure 2022518384000224
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１６２（３３ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）及びアミノ－ＰＥＧ２－アジド（１５ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＴＵ（３２ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（３５μＬ、２６ｍｇ、０．２０３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を濃縮し、生成物である化合物１６３を精製することなく次の工程に使用した。Ｃ３７Ｈ５６Ｎ８Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋：７２５．４４で計算した質量は７２５．７７であった。
Figure 2022518384000225
ＴＨＦ（０．３０ｍＬ）中の化合物１６３（４２ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＯＨ（０．１７４ｍＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱した。ＬｉＯＨのさらなる部分（０．１７４ｍＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、反応は停止し、ＬｉＯＨのさらなる部分（０．１７４ｍＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をさらに２時間撹拌した（９当量のＬｉＯＨ、合計５時間）。反応混合物を３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ＝５に中和し、濃縮した。残渣をＴＦＡ：水［９５：５］に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、０．１％ＴＦＡ含有水／ＡＣＮ、２０－５０％ＡＣＮ勾配）で精製した。化合物１６４（構造３８ｃ）：２３ｍｇ（６６％）の収率。Ｃ３０Ｈ４４Ｎ８Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：５９７．３５、見出された質量：５９７．８５。
Figure 2022518384000226
ＴＨＦ（１５０μＬ）中の化合物１６１（３０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液にジフェニルホスホリルアジド（３５μＬ、４５ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）を添加し、次いで０℃でＤＢＵ（１２μＬ、１２ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。翌朝、反応混合物を６０℃で７時間加熱した。反応混合物を濃縮し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、０．１％ＴＦＡ水／ＡＣＮ、３２－６０％ＡＣＮ勾配）で精製した。化合物１６５の収率：１４ｍｇ（４４％）。Ｃ３１Ｈ４５Ｎ７Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：５８０．３６、見出された質量：５８０．６６。
Figure 2022518384000227
ＥｔＯＨ（１００μＬ）中の化合物１６５（１８ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（１７０μＬ）中のＰｄ／Ｃ（１０％負荷、３．３ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）のスラリーを添加した。反応容器にＨ２を充填し、次いで３回真空にし、次いでＨ２（１気圧）を充填した。３０ｍ後、反応混合物を濾過し、濃縮し、さらに精製することなく次の工程で使用した。化合物１６６：１７ｍｇ（９９％）の収率。Ｃ３１Ｈ４７Ｎ５Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：５５４．３７、求めた質量：５５４．７３。
Figure 2022518384000228
ＤＭＦ（１７０μＬ）中の化合物１６６（１７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）及びａｚｉｄｏ－ＰＥＧ３－ＮＨＳエステル（１４ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１６μＬ、１２ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮し、次の工程で精製することなく使用した。Ｃ４０Ｈ６２Ｎ８Ｏ８［Ｍ＋Ｈ］＋について計算した質量：７８３．４８、見出された質量：７８３．８４。
Figure 2022518384000229
ＴＨＦ（１８０μＬ）中の化合物１６７（２４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＯＨ（１５３μＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を添加した。反応混合物を４０℃で加熱し、１時間後、ＬｉＯＨのさらなる部分（１５３ｕＬ、０．１５３ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。反応混合物を４０℃で３時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。反応混合物を３Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ＝５に中和し、濃縮した。残渣をＴＦＡ：水［９５：５］に溶解し、室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン、０．１％ＴＦＡ含有水／ＡＣＮ、１５－４５％ＡＣＮ勾配）で精製した。化合物１６８（構造３９ｃ）：９．８ｍｇ（４９％）の収率。Ｃ３３Ｈ５０Ｎ８Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋で計算した質量は６５５．４０で、６５６．０１であった。
薬物動態エンハンサーの合成
Ｍａｌ－Ｃ２２－二酸
Figure 2022518384000230
化合物１（０．２００ｇ）を２ｍＬのＤＭＦ中のＴＢＴＵ（０．１８２ｇ）と混合した。ＤＩＰＥＡ（０．２０７ｍＬ）を滴下した。次いで、化合物２（０．２２７ｇ）を５分後に添加した。混合物を１時間撹拌した。次いで、混合物を４０ｍＬのＤＣＭで希釈し、５％クエン酸（４×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を回転蒸発器で乾燥し、高真空で乾燥させた。得られた固体を、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ０＝＞８０％でＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）上の１２ＧＲｅｄｉ－Ｓｅｐ（登録商標）Ｒｆカラム上に３０分間乾燥ロードした。収率：５３ｍｇ（３９．２％）。
Figure 2022518384000231
化合物１をトルエン、ＤＭＦ中２０％ピペリジン、及びＥｔ３Ｎ混合物で２回共沸蒸留した。収量は５０ｍｇであった。
Figure 2022518384000232
化合物１（０．０３５０ｇ）及び２（０．１０５ｇ）をＤＭＦ中に合わせ、Ｅｔ３Ｎ（０．０９５ｍＬ）を添加した。反応は１時間後に完了した。次いで、混合物をＤＣＭで希釈し、５％クエン酸（３×８ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をトルエン１ｍＬ中に取り出し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）上の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ０＝＞１００％ＥｔＯＡｃで１５分間かけて充填した。次いで、２０分間にわたり２０％ＭｅＯＨ ０＝＞１００％で移動相をＤＣＭ：ＤＣＭに切り替えた。収量：１２ｍｇ（２４．９％）。
Figure 2022518384000233
化合物１（０．０１２ｇ）をＤＣＭ／ＴＦＡの１：１混合物１ｍＬに溶解した。反応物を３時間撹拌した。生成物を回転蒸発器で乾燥し、高真空で乾燥させた。収率：０．０１１０ｇ（９９．６％）。
Ｃ１８－二酸－Ｎ３
Figure 2022518384000234
化合物１（０．５００ｇ、Ａｓｔａ Ｔｅｃｈ（登録商標）＃６４７０４）及び化合物２（０．４５４ｇ、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ＃１６１６７）をＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（０．４４２ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５８６ｍＬ）を添加した。混合物を２時間撹拌した。次いで、混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（４×４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をＤＣＭ２ｍＬに入れ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（移動相ＤＣＭ：ＤＣＭ、２０％ＭｅＯＨ ０＝＞２０％、２５分間）のＲｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに充填した。生成物を高真空に濃縮した。収量：７４０ｍｇ（８５％）
Figure 2022518384000235
化合物１（０．７２０ｇ）をフラスコ中のＭｅＯＨ５ｍＬに溶解した。フラスコに隔壁を置き、大気を排気し、窒素で２回置換した。次いで、Ｐｄ／Ｃ３０％（０．２００ｇ）を秤量紙を介して添加した。隔壁を置換し、次いで、大気を真空にし、水素で２回置換した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を回転蒸発器で乾燥し、高真空で乾燥させた。収量：６６５ｍｇ。
Figure 2022518384000236
化合物１（０．１５０ｇ）及び化合物２（０．０６１８ｇ）をＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（０．０８８４ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．１１７ｍＬ）を混合物に加えた。反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、混合物をＤＣＭ（１２ｍＬ）で希釈し、水（４×８ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、高真空下で濃縮した。生成物をＤＣＭ（１ｍＬ）に入れ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（移動相ＤＣＭ：ＤＣＭ、２０％メタノール、０＝＞５０％、２５分間）の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに充填した。収量：１６２ｍｇ（７９％）
Figure 2022518384000237
化合物１（０．１５５ｇ）をＤＣＭ：ＴＦＡの１：１混合物に溶解した。反応物を室温で２時間撹拌した。生成物を回転蒸発器に濃縮し、高真空に置いた。収量：１２９ｍｇ（９７％）
Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸（Ｄバージョン）
Figure 2022518384000238
化合物１（０．５００ｇ）及び化合物２（０．４５３９ｇ）をＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（０．４４１８ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５８６ｍＬ）を混合物に加えた。反応物を室温で２時間撹拌した。次いで、混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、水（４×４０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、高真空下で濃縮した。生成物をＤＣＭ（２ｍＬ）に入れ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（移動相ＤＣＭ：ＤＣＭ、２０％メタノール、０＝＞５０％、２５分間）の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに充填した。収量：７４０ｍｇ（８５％）
Figure 2022518384000239
化合物１（０．７２０ｇ）をＭｅＯＨ５ｍＬに溶解し、次いでセプタムをフラスコ上に置き、Ｎ２を２回塗布した。次いで、Ｐｄ／Ｃ（０．２００ｇ）を秤量紙を介して添加し、次いで、隔膜を置換し、真空後、Ｈ２を２回塗布した。反応物を室温で１時間撹拌した。生成物を濾過し、濾液をロータバプ及び高真空上で乾燥させた。収量：６５５ｍｇ。
Figure 2022518384000240
化合物１（０．１００ｇ）及び化合物２（０．０３１８ｇ）をＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（０．０５８９ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．０７８ｍＬ）を混合物に加えた。反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、水（４×７ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、高真空下で濃縮した。生成物をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に入れ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（移動相ＤＣＭ：ＤＣＭ、２０％メタノール、０＝＞５０％、２５分間）の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに充填した。収量：１００ｍｇ（８２％）
Figure 2022518384000241
化合物１（９６ｍｇ）をＴＦＡ：ＤＣＭの１：１混合物に溶解した。反応物を室温で２時間撹拌した。生成物を濃縮し、高真空に置いた。収量８０ｍｇ（９９％）
Ｍａｌ－Ｃ１８－メチル－三酸
Figure 2022518384000242
化合物２（Ｓｉｇｍａ（登録商標）＃２５４４８７、０．４０５ｇ）をＴＨＦ中のＮａＨ（３．５ｍＬ）の０℃の懸濁液に添加し、反応物を室温に加温し、２０分間撹拌した。反応が明らかになるまで混合した。次いで、２ｍＬのＴＨＦ中の化合物１（Ｓｉｇｍａ（登録商標）＃６８４５１１、０．４３６ｇ）を０℃で滴下して添加し、０．５時間撹拌した。次いで、氷浴を除去し、反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応物をＤＣＭ（３５ｍＬ）で希釈し、ＮＨ４Ｃｌ溶液（１×８ｍＬ）で洗浄した。有機物をＤＣＭ（１×８ｍＬ）で逆抽出した。有機物を合わせ、Ｈ２Ｏ（２×８ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をクロマトグラフィー（トルエン（１ｍＬ）中で湿式充填）により、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）１２ Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ、移動相ヘキサン：ヘキサン（１０％ＥＡ＝＞０＝＞５０％、２５分間）上で精製した。収量：３９０ｍｇ（６４．５％）
Figure 2022518384000243
化合物１（０．１００ｇ／０．５ｍＬ ＴＨＦ）を、０℃で０．７５ｍＬ ＴＨＦ中のＮａＨの懸濁液に添加し、反応物を室温に加温し、２０分間撹拌した。反応混合物が透明になった。次いで、化合物２（Ｓｉｇｍａ（登録商標）６７６９２、０．０１６ｍＬ／０．５ｍＬ ＴＨＦ）を０℃で滴下添加し、０．５時間撹拌した。氷浴を除去し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮＨ４Ｃｌ（１×５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＤＣＭ（１×５ｍＬ）で逆抽出した。有機物を合わせ、Ｈ２Ｏ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を、クロマトグラフィー（トルエン（１ｍＬ）中で湿式充填）により、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）１２ Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ、移動相ヘキサン：ヘキサン（１０％ＥＡ０＝＞５０％、２５分間）上で精製した。収量：３０ｍｇ（２９．２％）。
Figure 2022518384000244
化合物１（０．０３００ｇ）を０．４ｍＬのＴＨＦに溶解した。次いで、ＬｉＯＨ（１０ｍＬのＴＨＦ中４８０ｍｇ）を添加した。反応物を１６時間撹拌した。反応物をクエン酸でｐＨ＝３に酸性化した。有機層を２×６ｍＬのＤＣＭで抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。収率：２５ｍｇ（８５．７％）。
Figure 2022518384000245
化合物１（０．０２５０ｇ）及び化合物２（Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ（登録商標）＃３０４８７、０．０２３８ｇ）をＤＭＦに溶解し、ＴＢＴＵ（０．０１９０ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．０２２ｍＬ）を混合物に加えた。反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、混合物をＤＣＭで９ｍＬに希釈し、水（３×７ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、高真空下で濃縮した。生成物をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に入れ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（移動相ＤＣＭ：ＤＣＭ、２０％メタノール、０＝＞２５％、１５分間）の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｒｆカラムに充填した。 収率：３７．１ｍｇ（８４．７％）。
Figure 2022518384000246
化合物１（０．０３２０ｇ）をＤＭＦ中の２０％ピペリジン０．５ｍＬに溶解した。反応物を室温で１時間撹拌した。生成物を高真空に濃縮し、次いでトルエンに溶解し、高真空に濃縮した。生成物を０．５ｍＬのＤＣＭ中に２×０．２５ｍＬのリンスを含み、２０分間にわたり２０％ＭｅＯＨ ０＝＞５０％のＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）、移動相ＤＣＭ＝＞ＤＣＭ上の予め平衡化された４ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム上に湿式充填した。収率：０．０２０ｇ（８４．７％）。
Figure 2022518384000247
化合物１（０．０２００ｇ）を、ＤＭＦ（０．４ｍＬ）中のＥｔ３Ｎ（０．０２２ｍＬ）の溶液に添加した。次いで、化合物２（ＡｓｉａＴｅｃｈ（登録商標）＃２４９６１、０．０２４６ｇ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。反応物をＤＣＭで１０ｍＬに希釈し、水中５％クエン酸（３×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、高真空下で濃縮した。生成物を、０．５ｍＬのＤＣＭ中で、２×０．３ｍＬのリンスで、予め平衡化された４ｇ Ｒｅｄｉ Ｓｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相ＤＣＭ＝＞２０％ＭｅＯＨ、ＤＣＭ０＝＞３０％上に、２０分間、湿式充填した。収量：２０ｍｇ。
次いで、生成物をＴＦＡ：ＤＣＭの１：１混合物２ｍＬ中に持ち上げ、２時間撹拌した。生成物を回転蒸発器と高真空に濃縮した。収量：１３ｍｇ。
Ｍａｌ－Ｃ１７－Ｆｌｕｏｒｏ－ＰＯ３一酸
Figure 2022518384000248
化合物１（Ｓｉｇｍａ（登録商標）＃１７７４９０、５．００ｇ）を７０ｍＬのＴＨＦ及び２０ｍＬのＤＭＦの混合物に溶解した。次いで、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（Ｓｉｇｍａ（登録商標）＃２７４６２３、１１．７ｇ）を添加した。反応物を３時間撹拌した。混合物を回転蒸発器及び高真空上で濃縮し、次いで、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）、１０％ＤＣＭを含む移動相ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３０分間で０＝＞３０％で、１２０ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム上に乾燥負荷した。収量：２．８６ｇ。
Figure 2022518384000249
化合物１（２．８５ｇ）及びベンジルアルコール（１．３６ｍＬ）をＤＣＭ５０ｍＬ中に混合し、０℃に冷却した後、ＥＤＣ（２．５３ｇ）及びＤＭＡＰ（０．２５７ｇ）を順次添加した。反応物を室温に温め、次いでＴＬＣでモニターしながら２時間撹拌した。混合物をＮＨ４Ｃｌ（１×５０ｍＬ）溶液及びＤＣＭで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、８０ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相酢酸エチル：ヘキサンに、３０分間で０＝＞１５％で乾燥負荷した。収率：２．３１ｇ（６１．０％）。
Figure 2022518384000250
ＮａＨ（油中６０％、０．０４７ｍＬ）をフラスコに添加し、フラスコに１５ｍＬのＴＨＦを充填した。フラスコを０℃に冷却し、２ｍＬのＴＨＦ中の化合物１（ＡＫＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ｊ９１１９６、０．５００ｇ）を滴下した。反応物を５分間撹拌し、次いで氷を除去し、反応物を室温で１５分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、化合物２（東京化学工業）を得た。＃ｆ０３５８、０．７６８ｇを一固体部分として添加した。次いで、０．３ｍＬの無水ＤＭＦを添加し、次いで氷浴を除去した。反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１×１２ｍＬ）で洗浄した。水層をＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機物を合わせ、Ｈ２Ｏ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、回転蒸発器及び高真空上で濃縮した。生成物を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ上の４Ｇ Ｒｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨを有するＤＣＭ、２０分間で０＝＞３０％に１．５ｍＬのＤＣＭ中にロードした。収率１５７ｍｇ（３６．２％）
Figure 2022518384000251
化合物２（０．１４９ｇ／０．５ｍＬ ＴＨＦ）を、０℃でＴＨＦ中のＮａＨの懸濁液（０．７５ｍＬ）に添加し、反応物を室温に加温し、２０分間撹拌した。１．２５ｍＬのＴＨＦ中の化合物１（０．１４０ｇ）の溶液を０℃で徐々に添加し、０．５時間撹拌した。次いで、反応物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１×５ｍＬ）で洗浄した。生成物をＤＣＭ（１×５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を１ｇのシリカ、４Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ、移動相ヘキサン：ＥｔＯＡｃ０＝＞５０％上に乾燥ロードした。収率６７ｍｇ（３３．７％）
Figure 2022518384000252
化合物１（０．０５３０ｇ）を２ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、次いでセプタムをフラスコ上に置き、Ｎ２を２回塗布した。次いで、Ｐｄ／Ｃ（０．０２５０ｇ）を秤量紙を介して添加し、次いで、隔膜を置換し、真空後、Ｈ２を２回塗布した。反応物を室温で２時間撹拌した。生成物をシリンジフィルターで濾過し、濾液をロータベープ及び高真空で乾燥させた。収率：３６ｍｇ（８２．０％）
Figure 2022518384000253
化合物１（０．０２００ｇ）を０．３ｍＬのＤＭＦに溶解し、次いでＴＢＴＵ（０．０１７４ｇ）、次いでＤＩＰＥＡ ０．０２１ｍＬを添加した。混合物を５分間撹拌し、次いで化合物２（Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ（登録商標）＃３０４８７、０．０２１７ｇ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、混合物を６ｍＬのＤＣＭで希釈し、Ｈ２Ｏ（３×３ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、回転蒸発器及び高真空上で濃縮した。生成物を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）、移動相ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨ、０＝＞３０％のＤＣＭ上のＲｅｄｉＳｅｐ ４Ｇ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラムに１ｍＬのＤＣＭ中に１５分間かけてロードした。収率１０ｍｇ（８８．８％）
Figure 2022518384000254
化合物１（０．０３３０ｇ）を２０％ピペリジンで０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。反応物を室温で１時間撹拌した。反応物を回転蒸発器と高真空に濃縮した。生成物を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ上の４Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨを有するＤＣＭ、２０分間で０＝＞５０％に１ｍＬのＤＣＭ中にロードした。収率：１１．５ｍｇ（４８．５％）
Figure 2022518384000255
化合物１（０．０１１５ｇ）を０．３ｍＬのＤＭＦに溶解し、化合物２（Ａｓｔａ Ｔｅｃｈ（登録商標）＃２４９６１、０．０１５６ｇ）及びＥｔ３Ｎ（０．０１４ｍＬ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応物をＤＣＭ（６ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸（３×３ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ上の４Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相ＤＣＭ：２０分間で０＝＞３５％の２０％ ＭｅＯＨを有するＤＣＭ上に１ｍＬのＤＣＭ中にロードした。収量：１０ｍｇ（６４．９％）
Figure 2022518384000256
化合物１（０．０１００ｇ）を０．３ｍＬのＤＣＭに溶解し、混合物を０℃に冷却した後、０．０５１ｍＬのＴＭＳ－Ｂｒを添加し、反応物を０℃で４時間撹拌し、次いで室温で３時間撹拌した。反応物を乾燥し、１ｍＬのＭｅＯＨを添加した。反応物を一晩撹拌した。生成物を回転蒸発器で乾燥し、トルエン共沸（３×１ｍＬ）で高真空した。次いで、反応物をＤＣＭ ： ＴＦＡ １：１（１ｍＬ）中に集め、室温で撹拌する。１．５時間後、反応物を回転蒸発器及び高真空上で濃縮した。収量：８．５ｍｇ（９９％）
Ｍａｌ－Ｃ１７－Ｆｌｕｏｒｏ－ＰＯ３
Figure 2022518384000257
化合物１（０．０１５０ｇ）を０．２５ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いでＴＢＴＵ（０．０１２５）を混合物に加え、次いでＤＩＥＡ（０．０１５ｍＬ）を加え、混合物を５分間撹拌した。次いで、化合物２（０．００６２ｇ）を混合物に加え、反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応物をＤＣＭ（６ｍＬ）で希釈し、ＦＬＯ（３×３ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、そして回転蒸発器及び高真空上で濃縮した。生成物を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ上の４Ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｆカラム、移動相ＤＣＭ：０＝＞３０％の２０％ＭｅＯＨを有するＤＣＭ上に１ｍＬのＤＣＭ中に１５分間かけてロードした。収率：１２．５ｍｇ（６４．７％）
Figure 2022518384000258
０．４ｍＬのＤＣＭ中の化合物１（０．０１２５ｇ）の溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳＢｒを滴下した。反応物を０℃で３時間撹拌した。揮発性物質は、回転蒸発器及び高真空によって完全に除去された。残渣をＭｅＯＨで２時間撹拌し、ＴＭＳを除去した。混合物を回転蒸発器で乾燥し、高真空で乾燥した。収率：１１．５ｍｇ（９８．８％）
Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸及び関連化合物の合成
Figure 2022518384000259
工程１：化合物１（ＭＷ＝３７０．５７、０．７４１ｇ、２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＤＭＦに溶解した。ＴＢＴＵ（Ｍｗ＝３２１、０．６４２ｇ、２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（Ｍｗ＝１２９、０．８７ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を連続的に添加し、混合物を５分間撹拌した。化合物２を添加した（Ｍｗ＝４１８．９、０．８３８ｇ、２ｍｍｏｌ）。溶液を１時間撹拌した。溶液を４０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水で３回（毎回４０ｍＬ）洗浄した。有機相を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ＨＥＸ＝０％～１００％）を用いて精製し、化合物３（収率８０％）を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝７３６）。
工程２：化合物３をＤＭＦ中２０％ピペリジンで３０分間処理した。溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝０～１０％）により精製した。（観察された質量、Ｍ＋１＝５１４）。（観察された質量、Ｍ＋１＝７０７）。
工程３：化合物４（Ｍｗ＝５１３、５０ｍｇ、０．０９７５ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解した。化合物５（Ｍｗ＝３０８、３６ｍｇ、１．２当量）及びＴＥＡ（０．０４１ｍｌ、３当量）を添加した。反応物を２時間撹拌した。溶液をＤＣＭで希釈し、水で３回洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィー（ＥＡ：ＨＥＸ＝０％－１００％）により精製して化合物６を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝５９４）。
工程４：化合物６をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで２時間処理した。溶媒を蒸発させて、化合物７（Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸）（質量観察、Ｍ＋１＝５９４）を得た。
Ｍａｌ－Ｃ１８－三酸
Figure 2022518384000260
工程１：化合物９（１．２当量）を、０℃で３ｍｌのＴＨＦ中のＮａＨ（１．２当量）の溶液に添加し、室温で０．５時間撹拌した。次いで、１ｍｌのＴＨＦ中の化合物８（１ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で混合物に滴下し、混合物を０℃で０．５時間、溶液が透明になるまで撹拌した。次いで、溶液を室温に上げ、溶液を徐々にスラリーにした。５時間後、反応物をＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＤＣＭで抽出した。生成物をカラム（ヘキサン中のＨｅｘ：１０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、ピークはＥｔＯＡｃの約０％～３％である。（収率４２％、２００ｍｇ）（質量観察、Ｍ＋１＝４８６）。
工程２：化合物１０をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、１Ｍ ＬｉＯＨ（３ｍＬ）を添加した。反応物を２５℃で１６時間撹拌し、次いでクエン酸でｐＨ＝３に酸性化し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、真空中で濃縮し、さらなる精製は行わなかった。（観察された質量、Ｍ＋１＝４７２）。
Ｍａｌ－Ｃ１８－トリ酸は、化合物１の代わりに化合物１１を用いて、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について記載したものと同じ合成で合成した。（観察された質量、Ｍ＋１＝６３８）。
Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸－ＰＯ３
Figure 2022518384000261
工程１：化合物１２（２．６４ｍｍｏｌ、１当量）及び化合物１３（２．９０９ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ中で一緒に混合し、混合物を０℃に冷却した。ＥＤＣ（１．１当量）及びＤＭＡＰ（０．２当量）を連続的に添加した。反応物を室温に加温した。反応物を２時間撹拌し、ＴＬＣヘキサン：ＥｔＯＡｃ８：２でモニターした。有機物をＮＨ４Ｃｌ溶液及びＤＣＭで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、クロマトグラフィー（ＥＡ：ＨＥＸ＝０％～１０％）を用いて精製した。製品スポットはＥＡの約２％を占める。（観察された質量、Ｍ＋１＝４２６）。
工程２：化合物１５（１．２当量）を、０℃で３ｍＬのＴＨＦ中のＮａＨ（１．２当量）の溶液に添加し、そして室温で０．５時間撹拌した。１ｍｌのＴＨＦ中の化合物１４（０．４７０ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で混合物に滴下し、０℃で０．５時間撹拌したところ、溶液は透明であった。次いで、混合物を室温に上げ、溶液を徐々にスラリーにした。５時間後、反応物をＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＤＣＭで抽出した。カラム（六角：ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）では、ピークはＥｔＯＡｃの約３％に達する。（収率１６％、４５ｍｇ）（質量観察、Ｍ＋１＝５９８）。
工程３：化合物１６（０．０５１９ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨに溶解した。次いで、Ｐｄ／Ｃ（６０ｍｇ）を反応物に添加し、数回のパージ及び再充填サイクルをＨ２で行った。反応物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物をシリカで濾過し、真空中で濃縮して生成物を得た。（２４ｍｇ、収率９２％）（観察質量、Ｍ＋１＝５０８）。
Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸－ＰＯ３は、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸の合成において化合物１７を化合物１に置換することによりＭａｌ－Ｃ１８－二酸と同様に合成した。（観察された質量、Ｍ＋１＝６７４）。
Ｍａｌ－Ｃ６－ＰＥＧ２－Ｃ１８－二酸
Figure 2022518384000262
工程１：化合物１（１当量、２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。ＴＢＴＵ（１当量、２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．５当量、５ｍｍｏｌ）を連続的に添加し、混合物を５分間撹拌した。化合物２を添加した（１当量、２ｍｍｏｌ）。溶液を１時間撹拌した。この溶液をＤＣＭ４０ｍＬで希釈し、水で３回（毎回４０ｍＬ）洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィー（ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨ＝０％～２５％を含むＤＣＭ）により精製し、化合物３（収率８０％）を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝６４７）。（観測質量、Ｍ＋１＝７６７）
工程２：化合物３（１．６ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨに溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ）を反応物に添加し、数回のパージ及び再充填サイクルをＨ２で行った。反応物を２５℃で１２時間撹拌した。反応物をシリカを通して濾過し、真空中で濃縮して生成物を得た。（１．５ｍｍｏｌ、収率９４％）（観察された質量、Ｍ＋１＝５５７）。
工程３：化合物４（１当量、１．５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解した。ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５当量）を連続的に添加し、混合物を５分間撹拌した。化合物５（１当量、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１時間撹拌した。この溶液を４０ｍＬのＤＣＭで希釈し、水で３回（毎回４０ｍＬ）洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィー（ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨ＝０％～２５％を含むＤＣＭ）に付して、化合物６（収率８０％）を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝９０９）。
工程４：化合物６（１当量、１．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中２０％ピペリジンで３０分間処理した。溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨ＝０％～３０％を含むＤＣＭ）により精製して化合物７（０．９８４ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た（質量観察、Ｍ＋１＝６８７）。
工程５：化合物７（１当量、０．９８４ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した。化合物８（１．２当量、１．１８ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（３当量、２．９５２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２時間撹拌した。溶液をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、水で３回（毎回１５ｍＬ）洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィー（ＤＣＭ：２０％ＭｅｏＨ＝０％～３０％のＤＣＭ）に付して、化合物９（０．７３８ｍｍｏｌ、収率７５％）を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝８８０）。
工程６：化合物９をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで２時間処理した。混合物を真空中で濃縮して化合物１０を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝７６８）。
Ｍａｌ－Ｃ６－ＰＥＧ４－Ｃ１８－二酸
Ｍａｌ－Ｃ６－ＰＥＧ４－Ｃ１８－二酸をＭａｌ－Ｃ１８－二酸と同様に合成したが、化合物７をＮＨＦｍｏｃ－ＰＥＧ２－ＮＨ２で処理した。Ｆｍｏｃ保護基を、工程４に記載のように、２０％ピペリジン脱保護により除去し、次いで、工程５及び６を、上記のように繰り返した（質量観察、Ｍ＋１＝９１２）。
Ｍａｌ－Ｂｉｓ Ｃ１８－二酸
Figure 2022518384000263
工程１及び２：化合物４は、上記のＭａｌ－Ｃ１８－二酸の合成に記載されているように合成された。
工程３：化合物５（１．０ｍｍｏｌ、１当量）、化合物６（１．３当量）及びＴＥＡ（５．０当量）を３ｍＬのＤＭＦ中に十分に混合した。反応物を一晩撹拌した。混合物を回転蒸発器で濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物は、ＤＣＭ中の１％ＨＯＡｃ中で約４％ＭｅＯＨを溶出する。ＬＣ－ＭＳは不純物のある所望のピークを示す。最終生成物は収率４５％で１７０ｍｇであった。
工程４：化合物７（０．１２ｍｍｏｌ、１当量）、化合物８（２．４当量）、ＴＢＴＵ（２．４当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）を１ｍＬのＤＭＦ中に十分に混合した。反応物を一晩撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、生成物と１つの主要な副生成物（生成物以上）及び３つの小さな不純物を示す。混合物を回転蒸発器で濃縮し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨによりカラム上で精製した。生成物は約６～１２％のＭｅＯＨを溶出する。最終生成物は収率４２％で７８ｍｇ（油）として得られた。
工程５：化合物９（０．０５ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＤＣＭ／ＴＦＡ（１／１、ｖ／ｖ）に溶解した。反応物を１時間撹拌した。溶媒を蒸発させて化合物１０ ７２ｍｇを収率９９％で得た。
工程６：化合物１０（０．０５ｍｍｏｌ、１当量）、化合物４（２．２当量）、ＴＢＴＵ（２．２当量）及びＤＩＰＥＡ（８．０当量）を０．５ｍＬのＤＭＦ中に十分に混合した。反応物を１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、１つの主要な副生成物（非極性ＴＦＡ法）と同様に生成物を示す。混合物を回転蒸発器で濃縮し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨによりカラム上で精製した。生成物は約８～１２％のＭｅＯＨを溶出する。化合物１１は６０ｍｇとして得られ、収率は４９％であった。
工程７：化合物１１（０．０２５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＣＭ／ＴＦＡ（１／１、ｖ／ｖ）に溶解した。反応物を１時間撹拌した。溶媒を蒸発させて化合物１２、５３ｍｇを収率９７％で得た。
Ｍａｌ－Ｃ１８－酸及び関連化合物の合成
Figure 2022518384000264
工程１：化合物１（０．２７ｍｍｏｌ、１当量）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した。ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５当量）を連続的に添加し、混合物を５分間撹拌した。化合物２を添加した（１当量）。溶液を１時間撹拌した。溶液を４０ｍｌのＤＣＭで希釈し、水で３回（毎回４０ｍＬ）洗浄した。有機相を回転蒸発器を用いて濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ＨＥＸ＝０％－１００％）を用いて精製して化合物３を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝４９４）。
工程２：化合物３をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで２時間処理した。生成物を回転蒸発器を用いて濃縮して化合物４を得た。（観察された質量、Ｍ＋１＝４３７）。
Ｍａｌ－Ｃ２０－酸
Ｍａｌ－Ｃ２０－酸は化合物１の代わりに市販のＣ２０出発物質（質量観察、Ｍ＋１＝４６５）を用いてＭａｌ－Ｃ１８－酸と同様に合成した。
Ｍａｌ－Ｃ１７－ＰＯ３
Figure 2022518384000265
工程１：ＤＭＰ（１．３当量、４．７８ｍｍｏｌ）及び化合物５（１当量、３．６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）中に混合した。２時間後、ＴＬＣにより示されるように反応を終了した。固体の沈殿物がいくつか形成された。精密検査：固形物を除去するための濾過、ＤＣＭですすぐ。生成物を真空中で濃縮し、クロマトグラフィー（１０％ＤＣＭ：ＥｔＯＡＣ≧０％－２０％のＨｅｘ）を用いて精製し、生成物を５％－１０％で溶出する。（０．８１３６ｍｍｏｌ、収率２２％）（観察質量、Ｍ＋１＝２７１）。
工程２：化合物６（１当量、０．８１３６ｍｍｏｌ）及び化合物７（１．１当量、０．８９４９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）中に混合し、０℃に冷却し、ＥＤＣ（１．１当量）及びＤＭＡＰ（０．２当量）を連続的に添加した。反応物を室温に加温した。反応物を２時間撹拌し、ＴＬＣヘキサン：ＥｔＯＡｃ ８：２でモニターした。生成物をＮＨ４Ｃｌ溶液及びＤＣＭで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、クロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ＝０％～１０％）により精製した。生成物スポットは、４％のＥｔＯＡｃ（０．４４３８ｍｍｏｌ、収率５４．５％）で得られる。（観察された質量、Ｍ＋１＝３６１）。
工程３：化合物９（１．４当量）を、０℃で１．５ｍｌのＴＨＦ中のＮａＨ（１．２当量）の溶液に添加し、室温で０．５時間撹拌した。１ｍｌのＴＨＦ中の化合物８（１当量、０．４４３８ｍｍｏｌ）を０℃で混合物に滴下し、０℃で０．５時間撹拌したところ、溶液は透明であった。混合物を室温に加温し、溶液を徐々にスラリーにした。５時間後、反応物をＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＤＣＭで抽出した。カラム（六角：ＥｔＯＡｃ＞＝０％～５０％）、ＥｔＯＡｃの３５％で生成物が得られる。（０．２０２０ｍｍｏｌ、収率４５．５％）（観測質量、Ｍ＋１＝４９６）。
工程４：化合物１０（１当量、０．２０２０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、及び１Ｍ ＬｉＯＨ（全溶液３ｍＬ）の１：１：１の混合物に溶解した。混合物を２５℃で２時間撹拌し、反応物をクエン酸でｐＨ＝３に酸性化し、そしてＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。さらに精製する必要はなかった。（観察された質量、Ｍ＋１＝４０５）。
工程５：化合物１１（１当量、０．０９３８ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した。ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５当量）を連続的に添加し、混合物を５分間撹拌した。化合物２を添加した（１当量）。溶液を１時間撹拌した。溶液をＤＣＭで１０ｍＬ希釈し、水で３回（各回５ｍＬ）洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィー（ＤＣＭ：２０％ＭｅＯＨ＝０％～３０％のＤＣＭ）により精製して化合物１２（０．０６８３、収率７３％）を得た（質量観察、Ｍ＋１＝５２８）。
工程６：ＤＣＭ中の化合物１２の溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳ－Ｂｒを滴下した。反応物を０℃で撹拌し、ＬＣ－ＭＳによってモニターした。反応は２．５時間以内に完了した。揮発性物質を、回転蒸発器及び高真空（酸を完全に除去するため）により完全に除去した。残渣をＭｅＯＨで２時間撹拌し、ＴＭＳを除去した。生成物を真空中で濃縮して所望の生成物を得た。（収率を１００％とする）（観測された質量、Ｍ＋１＝４７１）。
Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸（Ｌバージョン）
Ｍａｌ－Ｃ １８－二酸（Ｌ－バージョン）をＭａｌ－Ｃ１８－Ｍａｌ－Ｃ１８－Ｇｌｕ（Ｌ）－二酸と同じ方法で合成したが、Ｇｌｕ（Ｌ）の代わりにＧｌｕ（Ｄ）を用いた（質量観測、Ｍ＋１＝５６７）。
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８二酸及び関連化合物の合成
Figure 2022518384000266
工程１及び２：化合物４を、上記のＭａｌ－Ｃ１８－二酸の合成に記載されているように合成した。
工程３：化合物５（１ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ中３ｍＬ２０％ピペリジンで２０分間処理した。次いで、樹脂をＤＭＦで３回すすぎ、さらなる精製なしに次の工程で使用した。
工程４：化合物６に、３ｍＬのＤＭＦ中のＴＢＴＵ（２当量）、化合物７（２当量）、ＤＩＰＥＡ（６当量）の混合物を加え、１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、樹脂を３ｍＬのＤＭＦで３回すすいだ。
工程５：化合物８をＤＭＦ中２０％ピペリジン３ｍｌで２０分間処理した。次いで、樹脂をＤＭＦで３回すすぎ、さらなる精製なしに次の工程で使用した。
工程６：化合物９に、３ｍＬのＤＭＦ中の化合物１０（２当量）及びＤＩＰＥＡ（６当量）の混合物を加え、一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、樹脂を３ｍＬのＤＭＦで３回すすいだ。
工程７：化合物１１をＤＣＭ中３０％ＨＦＩＰ３ｍｌで３０分間処理した。溶液を濾過し、濾液を集め、蒸発させて化合物１２を得た。
工程８：ＤＣＭ中の化合物１０（１当量）にＥＤＣ（１当量）、次いでＨＯＢｔ（１当量）を添加し、１５分間撹拌した。次いで化合物４を添加し、反応物をさらに４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗物質をＤＣＭ及びＭｅＯＨ中のクロマトグラムにより精製した。
工程９：化合物１３をＤＣＭ中の３ｍｌ ５０％ＴＦＡで１時間処理した。溶媒を蒸発させて化合物１４を得る。Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｐｅｇ２－Ｃ１８ジアシド（観察された質量、Ｍ＋１＝９７９）。
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８－二酸
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８－二酸を、Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８－二酸と同じ手順を用いて合成したが、化合物９はさらなる工程に進む前に工程４及び５の反応に供した。（観察された質量、Ｍ＋１＝１２０４）。
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８二酸
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８二酸を、Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８二酸と同じ手順を用いて合成したが、化合物９は、さらなる工程を継続する前に、工程４及び５の２回の反応に供した。（観測質量、Ｍ＋１＝１４２９）
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１２酸
Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－Ｃ１２－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１２酸を、Ｍａｌ－Ｃ６－Ｃ１２－ＰＥＧ２－Ｃ１８二酸と同じ手順を用いて合成したが、化合物９は、さらなる工程を継続する前に、工程４及び５の２回の反応に供し、次いで、化合物４の市販のＣ１２類似体を使用した。（観察された質量、Ｍ＋１＝１２４５）。
実施例２．ヒトＡ－４９８細胞を用いた同所明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）腫瘍担持マウスモデル
ＳＥＡＰ発現明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）Ａ４９８細胞の作製。ＣＭＶプロモーター下でレポーター遺伝子分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するｐＣＲ３．１発現ベクターを、ＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＳＥＡＰ２基本ベクターから増幅したＳＥＡＰコード配列ＰＣＲの方向性クローニングによって調製した。ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローニングのためのＳＥＡＰコード配列を増幅するために使用されるプライマーに、便利な制限部位を添加した。得られた構築物ｐＣＲ３－ＳＥＡＰを用いて、ＳＥＡＰ発現Ａ４９８ｃｃＲＣＣ細胞株を作製した。簡単に説明すると、ｐＣＲ３－ＳＥＡＰプラスミドを、製造業者の推奨に従ってエレクトロポレーションによりＡ４９８ｃｃＲＣＣ細胞にトランスフェクトした。Ｇ４１８耐性により安定なトランスフェクタントを選択した。選択したＡ４９８－ＳＥＡＰクローンをＳＥＡＰ発現及び統合安定性について評価した。
ＳＥＡＰ発現明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）Ａ４９８細胞の移植。雌の無胸腺（免疫不全）ヌードマウスを約３％のイソフロウランで麻酔し、右側臥位に置いた。左側腹部に０．５～１ｃｍの小型腹部切開を行った。湿らせた綿棒で左腎臓を腹膜から持ち上げ、穏やかに安定させた。注射直前に、１．０ｍｌシリンジに細胞／マトリゲル混合物を充填し、２７ゲージ針カテーテルをシリンジチップに取り付けた。次いで、充填されたシリンジをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、モデルＰＨＤ２０００）に取り付け、プライムして空気を除去した。シリンジに取り付けられた２７ゲージ針カテーテルの先端を、尾極近くの腎嚢の直下に挿入し、針の先端を３～４ｍｍのカプセルに沿って注意深く頭側に進めた。約３０万個の細胞を含む２：１（ボクボル）細胞／マトリゲル混合物の１０パイアリコートを、注射器ポンプを用いて腎実質にゆっくりと注入した。注射が完了したことを確認するため、針を１５～２０秒間腎臓内に留置した。次いで、針を腎臓から取り出し、綿棒を注射部位の上に３０秒間置き、細胞の漏出又は出血を防止した。その後、腎臓を穏やかに腹腔内に戻し、腹壁を閉じた。移植後７～１４日毎に血清を採取し、市販のＳＥＡＰアッセイキットを用いて腫瘍増殖をモニターした。ほとんどの研究では、腫瘍マウスは移植後５～６週間で使用され、腫瘍の測定値は典型的には約４～８ｍｍであった。
ＨＩＦ２ ｍＲＮＡ発現の決定。本明細書の実施例で報告された研究については、マウスを注射後の同定された日に安楽死させ、製造業者の推奨に従ってトリゾール試薬を用いて腎臓腫瘍から全ＲＮＡを単離した。相対ＨｉＦ２α ｍＲＮＡレベルは、以下に記載されるようにＲＴ－ｑＰＣＲによって測定し、送達緩衝液（等張グルコース）のみで処理されたマウスと比較した。定量ＰＣＲの準備として、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）でホモジナイズした組織試料から単離した。約５００ｎｇのＲＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写した。ヒト（腫瘍）Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）発現については、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＶｅｒｉＱｕｅｓｔ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、ヒト（腫瘍）Ｈｉｆ２α（カタログ＃４３３１１８２）及びＣｙｃＡ（ＰＰＩＡ）カタログ＃：４３２６３１６Ｅ）のための前製ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを二重反応で三重に用いた。定量ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ又はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ＡＡＣＴ法を用いて相対遺伝子発現を計算した。
実施例３．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下を含む投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000267
グループ５及び６において、以下の構造を有するＰＫエンハンサーは、ジスルフィドを還元し、ＰＫエンハンサー化合物のマレイミド反応基を連結するためのＭｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによって、センス鎖の３’末端に連結された。
Figure 2022518384000268
Figure 2022518384000269
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す（実施例１も参照されたい）。
グループ４及び６において、三座インテグリン標的化グループ（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、官能化アミンリンカー（ＮＨ２－Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された。
Figure 2022518384000270
各群に３匹のマウス（３匹）を投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000271
上記の表９に示すように、標的リガンド又はＰＫエンハンサーに結合していないＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤である第２群（ＡＤ０４５４５、ビヒクル対照と比較して約０％のノックダウン（１．０３０）を示す）では、わずかなノックダウンしか観察されなかった。各々が三座配位子標的化基を含むグループ４及び６は、標的化配位子依存性を示す存在する標的化配位子のない構築物と比較して、より大きな活性を示した。さらに、標的化リガンド及びＰＫエンハンサーの両方を含む群において、さらなる阻害活性が観察された。（例えば、グループ４（約７０％のノックダウン（０．３０８）及びグループ６（約５５％のノックダウン（０．４５６）を示す）を参照）。
実施例４．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下を含む投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000272
グループ３～９において、以下の構造を有するそれぞれのＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結された。
Figure 2022518384000273
Figure 2022518384000274
Figure 2022518384000275
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ２～９において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２～Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウス（３匹）を投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000276
上の表１１に示されているように、三座位標的化基（群２～９）に連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の各々は、対照と比較して実質的な阻害活性を示した。
実施例５．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、本明細書に列挙した第１群～第６群のマウスに、下記の表１２の以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。さらに、本明細書に列挙した第７群のマウスに、皮膚と筋肉との間の皮下（ＳＱ）注射を介して、頸部及び肩領域のゆるい皮膚に投与した。投与群は以下の通りであった。
Figure 2022518384000277
グループ２～５及び７において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーは、センス鎖の３’末端に連結された。
グループ２及び５－７において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。グループ３では、三座インテグリン標的化基（構造６．１－ａｖｂ６の構造のα－ｖ－β－６に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）が官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結され、グループ４では、三座インテグリン標的化基（構造１４－ａｖｂ６の構造のα－ｖ－β－６に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）が官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された。インテグリン標的化リガンドを含む三座配位子標的化基の構造６．１－ａｖｂ６及び構造１４－ａｖｂ６を以下に示す。
Figure 2022518384000278
Figure 2022518384000279
Figure 2022518384000280
は、官能化アミンリンカーへの結合点を示す。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000281
上述の表１３に示されるように、１以上の標的リガンド及びＰＫエンハンサーを連結する優先性は、ＨＩＦ－２α発現のサイレンシングにおいて改善された効力を示した。（例えば、グループ６（ＰＫエンハンサーなし）は、約２５％のノックダウン（０．７５１）しか達成していない。さらに、データは、α－ｖ－β－６に対する親和性を有する標的化リガンドと比較して、インテグリンα－ｖ－β－３に対する親和性を有する標的化リガンドを含む標的化基に対する好みを示す。α－ｖ－β－６リガンドを用いた第３群（約３１％のノックダウン（０．６９１））及びα－ｖ－β－６リガンドを用いた第４群（約４２％のノックダウン（０．５８２））と、α－ｖ－β－３リガンドを用いた第２群（約５６％のノックダウン（０．４３７））及び第５群（約５８％のノックダウン（０．４１３））とを比較する。さらに、第７群及び第２群に示されるように、Ｃ１８－二酸（Ｃ１８二酸）のＰＫエンハンサーを用いてＩＶ及びＳＱの両方を投与する場合に同等の効力を達成することができる。
実施例６．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000282
Figure 2022518384000283
グループ２、４～７において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーは、センス鎖の３’末端に連結された。グループ３は、以下の構造のセンス鎖の３’末端に連結されたＰＫエンハンサーを含んでいた：
Figure 2022518384000284
Figure 2022518384000285
は、表４．３に示されるように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ１０は、以下の構造のセンス鎖の３’末端に連結されたＰＫエンハンサーを含んでいた：
Figure 2022518384000286
Figure 2022518384000287
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ１１は、以下の構造のセンス鎖の３’末端に連結されたＰＫエンハンサーを含んでいた：
Figure 2022518384000288
Figure 2022518384000289
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ５～７では、ＰＫエンハンサーを内部ヌクレオチドに結合させた。示されるようなヌクレオチドは、２’－０－プロパルギル基を含み、アジド含有ＰＫエンハンサー（Ｃ１８－二酸－Ｎ３）を添加してトリアゾールを形成した。グループ５～７には、構造のＰＫエンハンサーが含まれていた。
Figure 2022518384000290
Figure 2022518384000291
は、指示されたヌクレオチドの２’位のＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ２～１１において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２～Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000292
上の表１５に示されるように、三座配位標的化基に連結されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の各々（グループ２～１１）は、対照と比較して実質的な阻害活性を示した。
実施例７．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに約３００マイクロリットルの注射液を尾静脈（ＩＶ）注射により投与し、これには以下の投与群が含まれた。
Figure 2022518384000293
グループ２～４、９及び１０において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーは、センス鎖の３’末端に連結された。
グループ６は、構造を有するセンス鎖の３’末端にＰＫエンハンサーを含む：
Figure 2022518384000294
Figure 2022518384000295
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ７は、構造を有するセンス鎖の３’末端にＰＫエンハンサーを含む：
Figure 2022518384000296
Figure 2022518384000297
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ８は、実施例６に示すように、ジスルフィドを含むセンス鎖の３’末端へのＭａｌ－Ｃ１８－三酸のマイケル付加によって形成されるＰＫエンハンサーを含む。
グループ２、４－８及び１０において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。グループ９は、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された３つのインテグリンリガンド（構造１０－ａｖｂ６の構造のα－ｖ－β－６に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）を含み、その構造を以下に示す。
Figure 2022518384000298
グループ１０は、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された３つのインテグリンリガンド（構造２６－ａｖｂ６の構造のα－ｖ－β－６に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）を含み、その構造は以下に示される。
Figure 2022518384000299
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000300
上の表１７に示されるように、４つの内部に配置された構造２ａｖｂ３リガンドを含む４群は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖上に、ｈｕＨＩＦ－２αｍＲＮＡ（０．２２８）の約７８％ノックダウンを示した。
実施例８．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000301
Figure 2022518384000302
Figure 2022518384000303
グループ２、３及び５－８において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。グループ４及び９は、実施例６に示す構造を有するＰＫエンハンサーを含んでいた。グループ１０は、実施例７に示す構造を有するＰＫエンハンサーを含んでいた。グループ１１は、構造を有するセンス鎖の３’末端にＰＫエンハンサーを含む。
Figure 2022518384000304
Figure 2022518384000305
は、表４．３に示すように、Ｃ６－Ｓ基におけるＲＮＡｉ剤への結合点を示す。
グループ２、４－５及び８－１１において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する三つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。グループ２において、単一構造２ａ－ａｖｂ３標的化リガンドは、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された。グループ７において、ＰＫエンハンサーＣ１８－ジアシドは、センス鎖の５’末端に位置する（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）ジスルフィドリンカー、ならびにセンス鎖の３’末端に連結された。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000306
上の表１９に示されるように、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のセンス鎖上に位置する内部標的化リガンドの含有は、ノックダウンにおいてさらなる改善を示す。例えば、グループ２（約８２％のノックダウン（０．１８３）を示す４つの内部に配置された標的化リガンド）およびグループ８（約４９％のノックダウン（０．５１６）を示す内部に配置された標的化リガンドなし）を参照されたい。
実施例９．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000307
Figure 2022518384000308
Figure 2022518384000309
Figure 2022518384000310
グループ２～１３において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。
グループ２～１３において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000311
実施例９で調べたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の各々は、ヌクレオチドの２’位置に結合したａｖｂ３インテグリンを標的とするリガンドを含む少なくとも２つの内部ヌクレオチドを含み、上述の表２１に示すように、試験したＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の各々は、ビヒクル対照と比較して、ＨＩＦ－２αのほぼ５０％以上のノックダウンを示した。グループ２（４つの内部リガンド、約７４％のノックダウンを有する）及びグループ１３（８つの内部リガンド、約８６％のノックダウンを有する）は、ｈｕＨＩＦ－２αｍＲＮＡ発現の特に高い減少を示した。
実施例１０．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000312
Figure 2022518384000313
Figure 2022518384000314
グループ２～１３において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に結合させた。
グループ２～１３において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000315
実施例１１．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000316
Figure 2022518384000317
グループ２～９において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に結合させた。
グループ２～９において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２～Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウスを投与したが、２群には２匹（２匹）のマウスしか投与しなかった。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000318
実施例１２．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000319
Figure 2022518384000320
Figure 2022518384000321
グループ２～１１において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。
グループ２～１１において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２～Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹（３匹）のマウスを投与したが、６群には２匹（２匹）のマウスしか投与しなかった。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000322
実施例１３．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000323
Figure 2022518384000324
Figure 2022518384000325
Figure 2022518384000326
グループ２～１０において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。
グループ２－１０において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）とカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ－ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000327
実施例１４．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を投与した。
Figure 2022518384000328
Figure 2022518384000329
Figure 2022518384000330
グループ２～７において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。
グループ２～７において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２－Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
各群に３匹のマウス（３匹）を投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000331
実施例１４におけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤の各々は、（ｉ）３つの標的化リガンドを含むセンス鎖の５’末端に位置する三座配向基；（ｉｉ）アンチセンス鎖と塩基対を形成する第１のヌクレオチドから２、４、６、及び８位に位置するヌクレオチドの各々に対して２’位置で連結された合計４つの追加の内部標的化リガンド；及び（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端に連結されたＰＫエンハンサーを含むセンス鎖を含んでいた。上の表３１に示されるように、２．０ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇの両方で投与されたＲＮＡｉ剤の各々は、ビヒクル対照と比較して、ｈｕＨＩＦ－２αｍＲＮＡの実質的な減少を示した。
実施例１５．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目に、マウスに約３００マイクロリットルの注射液を尾静脈（ＩＶ）注射により投与し、これには以下の投与群が含まれた。
Figure 2022518384000332
グループ２～４において、Ｍａｌ－Ｃ１８－二酸について前の実施例で示された構造を有するＰＫエンハンサーを、ジスルフィドを還元し、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を行うことによってマレイミド反応基を連結することによってセンス鎖の３’末端に連結した。
グループ２～４において、官能化アミン反応性基リンカー（ＮＨ２～Ｃ６）にカップリングすることによりセンス鎖の５’末端に連結された三座インテグリン標的化基（構造２ａ～ａｖｂ３の構造のα－ｖ－β－３に対して親和性を有する３つのインテグリンリガンドを含む）は、上記実施例３に記載の構造を有する。
３匹のマウスを各群に投与したが、２匹のマウスしかいなかった溶媒対照群（第１群）を除いた。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000333
実施例１６．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。試験１日目、２日目、８日目、９日目、１５日目、２２日目、及び２９日目に、マウスに、５．０ｍｇ／ｋｇのＴｒｉ－構造２ａ－ａｖｂ３－ＡＤ０５９７１－（Ｉｎｔ構造２ａ－ａｖｂ３）４－Ｃ１８－ジアシド、又はＲＮＡｉ剤を用いない等張グルコースのいずれかを約３００マイクロリットルの容量で注射する尾静脈（ＩＶ）注射を行った。
各群に６匹のマウスに投与した。試験３６日目にマウスを屠殺し、腎臓腫瘍を採取した。図４Ａは、未処置対照群のマウスからの腎臓を示し、腫瘍腎は画像の右側に、対側腎は左側に示す。図４Ｂは、ＲＮＡｉ剤で処置された群のマウスからの腎臓を示し、また、腫瘍腎は、その画像の右側に示され、対側腎は、左側に示される。画像から明らかであり、腫瘍重量によって確認されるように、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ因子群は腫瘍増殖を阻害した。さらに、図５Ａに示されるように、対照群における腫瘍担持マウス由来の細胞の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色は、暗くなったスポットによって目に見えるＨＩＦ－２αタンパク質の存在を確認するが、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤で処理された腫瘍担持マウスの細胞を示す図５Ｂの画像上では、そのような暗くなったスポットは明白ではない。
実施例１７．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。マウスには、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を行った。
Figure 2022518384000334
Figure 2022518384000335
各群に４匹のマウスを投与した。上記の表３４に記載されているように、屠殺予定日に、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを、採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000336
実施例１８．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。マウスには、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を行った。
Figure 2022518384000337
各群に４匹のマウスを投与した。マウスを試験８日目に屠殺し、腎臓腫瘍を採取し、腎臓腫瘍中の全ヒトＨＩＦ－２ ｍＲＮＡを採取及び均質化後に単離した。ＨＩＦ－２α（ｈｕＨＩＦ－２α）ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲにより定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、溶媒対照群の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000338
実施例１９．ｃｃＲＣＣ腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤のインビボ投与
実施例２の腫瘍担持マウスモデルを用いて、インビボでＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤を評価した。マウスには、以下の投与群に従って、約３００マイクロリットルの注射量の尾静脈（ＩＶ）注射を行った。
Figure 2022518384000339
各群１５匹のマウスに投与し、体重及び腫瘍成長を毎週触診及びキャリパー推定によりモニターした。グループ４の１例が第２１日に死亡していた。図６は、試験３４日目までの腫瘍増殖に対する影響を示したものである。図６に報告されているように、データは、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤と共に投与された場合、生理食塩水賦形剤対照と比較して、腫瘍サイズ減少の全体的な改善を示す。
実施例２０．腎腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２αを標的とするＲＮＡｉ剤に結合したインテグリン標的リガンドのインビボ投与
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を、当技術分野で公知の一般的手順に従って固相上でホスホラミダイト技術に従って合成し、本明細書の実施例１に記載のオリゴヌクレオチド合成に一般的に使用した。ＲＮＡｉ剤は、本明細書の実施例２に記載のそれぞれの修飾ヌクレオチド配列を有し、Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするように設計された。
試験１日目に、腎臓腫瘍担癌マウスに以下の投与群に従って尾静脈注射を行った。
Figure 2022518384000340
Figure 2022518384000341
各群に３匹の担癌マウス（ｎ＝３）を投与した。注射後８日目にマウスを屠殺し、腎臓腫瘍から総ＲＮＡを分離した。次に、プローブベースの定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により相対ヒトＨＩＦ２α ｍＲＮＡ発現を定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、ビヒクル対照群（等張グルコース）の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000342
上の表４０に示されるように、Ｈｉｆ２α ＲＮＡｉ剤－インテグリン標的化リガンド複合体の各々は、対照と比較してマウスにおいてｍＲＮＡ発現の減少を示した。
実施例２１．腎腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２αを標的とするＲＮＡｉ剤に結合したインテグリン標的リガンドのインビボ投与
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を、当技術分野で公知の一般的な手順に従って固相上でホスホラミダイト技術に従って合成し、本明細書の実施例１に記載のオリゴヌクレオチド合成に一般的に使用した。ＲＮＡｉ剤は、本明細書に記載されたそれぞれの修飾ヌクレオチド配列を有し、Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするように設計された。
試験１日目に、腎臓腫瘍担癌マウス（実施例４参照）を、以下の投与群に従って尾静脈注射により投与した。
Figure 2022518384000343
Figure 2022518384000344
各群に３匹の担癌マウス（ｎ＝３）を投与した。注射後８日目にマウスを屠殺し、腎臓腫瘍から総ＲＮＡを分離した。次に、プローブベースの定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により相対ヒトＨＩＦ２α ｍＲＮＡ発現を定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、ビヒクル対照群（等張グルコース）の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000345
上の表４２に示されるように、Ｈｉｆ２α ＲＮＡｉ剤－インテグリン標的化リガンド複合体の各々は、対照と比較してマウスにおいてｍＲＮＡ発現の減少を示した。
実施例２２．腎腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２αを標的とするＲＮＡｉ剤に結合したインテグリン標的リガンドのインビボ投与
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を、当技術分野で公知の一般的手順に従って固相上でホスホラミダイト技術に従って合成し、本明細書の実施例１に記載のオリゴヌクレオチド合成に一般的に使用した。ＲＮＡｉ剤は、本明細書に記載されたそれぞれの修飾ヌクレオチド配列を有し、Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするように設計された。
試験１日目に、腎臓腫瘍担癌マウスに以下の投与群に従って尾静脈注射を行った。
Figure 2022518384000346
Figure 2022518384000347
Figure 2022518384000348
Figure 2022518384000349
各群に３匹の担癌マウス（ｎ＝３）を投与した。注射後、マウスを試験８日目に屠殺し、実施例４に記載の手順に従って、腎臓腫瘍から全ＲＮＡを単離した。次に、プローブベースの定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により相対ヒトＨＩＦ２α ｍＲＮＡ発現を定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、ビヒクル対照群（等張グルコース）の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000350
上の表４４に示されるように、Ｈｉｆ２α ＲＮＡｉ剤－インテグリン標的化リガンド複合体の各々は、対照と比較してマウスにおけるｍＲＮＡ発現の減少を示した。
実施例２３．腎腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２αを標的とするＲＮＡｉ剤に結合したインテグリン標的リガンドのインビボ投与
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を、当技術分野で公知の一般的な手順に従って固相上でホスホラミダイト技術に従って合成し、本明細書の実施例１に記載のオリゴヌクレオチド合成に一般的に使用した。ＲＮＡｉ剤は、本明細書の実施例２に記載のそれぞれの修飾ヌクレオチド配列を有し、Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするように設計された。
試験１日目に、腎臓腫瘍担癌マウスに以下の投与群に従って尾静脈注射を行った。
Figure 2022518384000351
Figure 2022518384000352
Figure 2022518384000353
Figure 2022518384000354
４匹の担癌マウスを各群（ｎ＝４）に投与したが、１匹のマウスに３匹（３匹）のマウスしか注射不良とみなされなかった４群を除いた。注射後、マウスを試験８日目に屠殺し、実施例４に記載の手順に従って、腎臓腫瘍から全ＲＮＡを単離した。次に、プローブベースの定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により相対ヒトＨＩＦ２α ｍＲＮＡ発現を定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、ビヒクル対照群（等張グルコース）の割合（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）で表した。
Figure 2022518384000355
上の表４６に示されるように、Ｈｉｆ２α ＲＮＡｉ剤－インテグリン標的化リガンド複合体の各々は、対照と比較してマウスにおいてｍＲＮＡ発現の減少を示した。
実施例２４．腎腫瘍担持マウスにおけるＨＩＦ－２αを標的とするＲＮＡｉ剤に結合したインテグリン標的リガンドのインビボ投与
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を、当技術分野で公知の一般的な手順に従って固相上でホスホラミダイト技術に従って合成し、本明細書の実施例２に記載のオリゴヌクレオチド合成に一般的に使用した。ＲＮＡｉ剤は、本明細書の実施例２に記載のそれぞれの修飾ヌクレオチド配列を有し、Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）を標的とするように設計された。
試験１日目に、腎臓腫瘍担癌マウスに以下の投与群に従って尾静脈注射を行った。
Figure 2022518384000356
ＲＮＡｉ剤は、ヒトＨｉｆ２α遺伝子を標的とするヌクレオチド配列を有するように合成され、センス鎖の５’末端に官能化アミン反応基（ＮＨ２－Ｃ６）を含み、インテグリン標的化リガンドへのコンジュゲーションを促進した。
各群に３匹の担癌マウス（ｎ＝３）を投与した。注射後、マウスを試験８日目に屠殺し、実施例４に記載の手順に従って、腎臓腫瘍から全ＲＮＡを単離した。次に、ヒト相対ＨＩＦ２α ｍＲＮＡ発現をプローブベース定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により定量し、ヒトシクロフィリンＡ（ＰＰＩＡ）発現に正規化し、実施例４で説明したように、ビヒクル対照群（等張グルコース）の画分（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）として表した。
Figure 2022518384000357
上の表４８に示されるように、Ｈｉｆ２α ＲＮＡｉ剤－インテグリン標的化リガンド複合体の各々は、対照と比較して、ｍＲＮＡ発現の減少を示した。
実施形態
実施形態１．ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、以下を含む：
（ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の標的化リガンド
を含むＲＮＡｉ剤
実施形態２．アンチセンス鎖が、表３に提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド２～１８を含む、実施形態のＲＮＡｉ剤。
実施形態３．センス鎖が、表４、４．１、４．２又は４．３に提供されるセンス鎖配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖に対する１７の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８５％の相補性の領域を有する、実施形態１又は実施形態２のＲＮＡｉ剤。
実施形態４．ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖、又はＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方のヌクレオチドの全部又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’、３’－セコヌクレオチド模倣ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、２’－メトキシエチルヌクレオチド、アバシックヌクレオチド、リビトール、逆ヌクレオチド、逆位２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、逆位２’－デオキシヌクレオチド、逆位２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホナート修飾ヌクレオチド、シクロプロピルホスホナート修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－トリアゾール修飾ヌクレオチド、及び３’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態４のＲＮＡｉ剤。
実施形態６．各修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、及び２’－Ｏ－トリアゾール修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、実施形態のＲＮＡｉ剤。
実施形態７．アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾されたアンチセンス鎖配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８．センス鎖が、表４に提供される修飾センス鎖配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態９．アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、表４、表４．１、表４．２又は表４．３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１０．アンチセンス鎖が、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）のヌクレオチド２～１８を含み、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表す、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１１．アンチセンス鎖が、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）の配列を含み、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表す、実施形態１０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１２．センス鎖が、ＣＡＡＣＧＵＡＡＣＧＡＵＵＵＣＡＵＧＡＡＡ（配列番号４２８）の配列のヌクレオチド２～１８を含む、実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１３．センス鎖が、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）の配列を含み、ａ、ｃ、ｇ、およびｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆはそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、各Ｘ、Ｙ及びＺは独立して薬理学的部分であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分Ｚはヌクレオチドの２’位に連結され、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、
Figure 2022518384000358
を表し、（ｉｎｖＡｂ）は、
Figure 2022518384000359
を表し、（６－Ｓ）は、
Figure 2022518384000360
を表し、ｓはホスホロチオエート結合を表す、実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１４．アンチセンス鎖がセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である、実施形態１２又は１３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１５．センス鎖のヌクレオチドが、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６）－Ｓ（配列番号７６１）の配列からなり、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、各Ｘ、Ｙ及びＺが独立して薬理学的部分であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺがそれぞれウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分はヌクレオチドの２’位に連結し（本明細書の実施例に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングすることによって完成され）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、
Figure 2022518384000361
を表し、（ｖＡｂで）は、
Figure 2022518384000362
を表し、（６－Ｓ）は、
Figure 2022518384000363
を表し、ｓはホスホロチオエート結合を表す、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１６．アンチセンス鎖のヌクレオチドが、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）の配列からなり、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表す、実施形態１５に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１７．ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、少なくとも１つの標的化リガンドに連結されている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１８．標的化リガンドがインテグリンに対する親和性を有する化合物を含む、実施形態１７に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１９．標的化リガンドが、インテグリンα－ｖ－β－３、α－ｖ－β－５、又はα－ｖ－β－３及びα－ｖβ－５の両方に対して親和性を有する化合物を含む、実施形態１８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２０．標的化リガンドが、式：
Figure 2022518384000364
（式中、
Ｘは－Ｃ（Ｒ３）２－、－ＮＲ３－、
Figure 2022518384000365
であり、
Ｙは、アルキレン鎖中に１～８個の炭素原子を有する任意に置換されたアルキレンであり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ３、又はＳであり；
Ｒ１は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたシクロアルキルであるか、又はＲ１はＲＮＡｉ剤を含み；
Ｒ２は、Ｈ、任意に置換されたアルキルでああるか、又はＲ２はＲＮＡｉ剤を含み、
Ｒ３の各場合は、Ｈ及び任意に置換されたアルキルからなる群から独立して選択されるか、又はＲ３はＲＮＡｉ剤を含み；
Ｒ４は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；
Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかの場合、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＲＮＡｉ剤を含む）
で表される化合物である、実施形態１９に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２１．標的化リガンドが、
Figure 2022518384000366
Figure 2022518384000367
Figure 2022518384000368
Figure 2022518384000369
Figure 2022518384000370
Figure 2022518384000371
Figure 2022518384000372
から選択され、
Figure 2022518384000373
は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤との結合点を示す、実施形態２０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２２．標的化リガンドが、構造：
Figure 2022518384000374
のものである、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２３．薬物動態（ＰＫ）エンハンサーをさらに含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２４．ＰＫエンハンサーが、式：
Figure 2022518384000375
（式中、Ｙは任意に置換された飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、ｎは５～２５の整数である）
を含む、実施形態２３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２５．ＰＫエンハンサーが、
Figure 2022518384000376
を含む、実施形態２４に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２６．ＰＫエンハンサーが、
Figure 2022518384000377
Figure 2022518384000378
Figure 2022518384000379
Figure 2022518384000380
Figure 2022518384000381
からなる群から選択され、
Figure 2022518384000382
は、ＲＮＡｉ因子への結合点を示す、実施形態２３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２７．標的化リガンドがセンス鎖に連結されている、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２８．ＰＫエンハンサーがセンス鎖に連結されている、実施形態２３～２７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２９．ＲＮＡｉ剤が２～１０の標的化リガンドに連結されている、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３０．ＲＮＡｉ剤が、センス鎖の５’末端に２つ以上の標的化リガンドを含む標的化基に連結されている、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３１．少なくとも１つの標的化リガンドがセンス鎖の５’末端に連結され、少なくとも１つの標的化リガンドがセンス鎖の非末端ヌクレオチドに連結されている、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３２．２つ以上の標的化リガンドに連結され、２つ以上の標的化リガンドが分岐点で連結され、標的化基を形成する、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３３．標的化基が３つの標的化リガンドを含み、標的化基が式：
Figure 2022518384000383
（式中、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ、任意に置換されたアルキレンを含む独立したリンカーであり；
Ｌ４は、任意に置換されたアルキレン；任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたシクロアルキルを含むリンカーであり；
Ｒ５は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；
ＴＬは標的リガンドであり；
ＹはＯ又はＳである）
のものである、実施形態３２に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３４．標的化基が式：
Figure 2022518384000384
のものである、実施形態３３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３５．三座配位標的化基が、センス鎖の５’末端に連結され、少なくとも２つのさらなる標的化リガンドはセンス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結されている、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３６．少なくとも１０個のヌクレオチドが、センス鎖の５’末端に位置する標的化基とセンス鎖上に位置する標的化リガンドとの間に位置する、実施形態３１又は３５に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３７．少なくとも１つの標的化リガンドが、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチドの２’位置に連結されている、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３８．ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結されている、実施形態２３～３７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３９．５～８個の標的リガンドがセンス鎖に連結されている、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４０．ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、センス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結された少なくとも１つの三座配位子標的化基及び少なくとも２つの標的化リガンドに連結されている、実施形態３９に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４１．ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、（ｉ）センス鎖の５’末端における三座配位子標的化基、及び（ｉｉ）センス鎖の５’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドに連結された２～４個の標的化リガンドに連結されている、実施形態４０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４２．標的化リガンドが、（ｉ）３つの個々の標的化リガンドを含む三座配位子標的化基がセンス鎖の５’末端に位置し、（ｉｉ）追加の標的化リガンドが、センス鎖の５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れたセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結された個々の標的化リガンドであるように、センス鎖に連結されている、実施形態２９～４１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４３．標的化リガンドが、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドと塩基対を形成するセンス鎖の３’ヌクレオチドから２、４、６、及び８位（３’→５’）に位置するセンス鎖ヌクレオチドに連結されている、実施形態４２に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４４．少なくとも１つの標的化リガンドが、リボース環の２’位置、リボース環の３’位置、リボース環の１’位置、又はヌクレオチドの核酸塩基、リボース環の４’位置、又はヌクレオチドの５’位置の個々のヌクレオチドに連結されている、実施形態４３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４５．少なくとも１つの標的化リガンドが、個々のヌクレオチドのリボース環の２’位置に連結されている、実施形態４４に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４６．センス鎖が１８～４９ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が１８～４９ヌクレオチドの長さである、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４７．センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ１８～２７ヌクレオチドの長さである、実施形態４６に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４８．センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ１８～２４ヌクレオチドの長さである、実施形態４７に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４９．センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ２１ヌクレオチドの長さである、実施形態４８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施例５０．ＲＮＡｉ剤が２つの平滑末端を有する、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５１．センス鎖が１つ又は２つの末端キャップを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５２．センス鎖が、１個又は２個の逆位軽減残基を含む、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５３．ＲＮＡｉ剤が、センス鎖及び表５の二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するアンチセンス鎖を含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５４．センス鎖が、さらに、ヌクレオチド配列の３’末端、ヌクレオチド配列の５’末端、又はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端の両方に逆弱塩基残基を含む、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５５．（ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；及び
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖
を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤。
実施形態５６．（ｉ）ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子（配列番号１）に対して少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖；
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖；
（ｉｉｉ）センス鎖に連結された標的化リガンド；及び
（ｉｖ）センス鎖に結合したＰＫエンハンサー
を含むＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤。
実施形態５７．標的化リガンドがセンス鎖の５’末端に連結されている、実施形態５６に記載のＲＮＡｉ剤。。
実施形態５８．ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結されている、実施形態５６又は５７に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態５９．１つ以上の標的リガンドがセンス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結されている、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６０．２～１２の標的リガンドがセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、実施形態５９記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６１．３つの標的化リガンドからなる三座配位子標的化基がセンス鎖の５’末端に連結され；ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結され；２～１２の標的化リガンドがセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結されている、実施形態５６～６０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６２．センス鎖の個々のヌクレオチドに連結された標的化リガンドが、各ヌクレオチドの２’位置で連結されている、実施形態６１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６３．標的化リガンドが、アンチセンス鎖と塩基対を形成する第一のヌクレオチドからの位置２、６、１５、及び１９（３’→５’）に位置するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、実施形態～６２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６４．標的化リガンドが、アンチセンス鎖と塩基対を形成する第一のヌクレオチドからの位置２、４、６、及び８（３’→５’）に位置するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、実施形態５６～６２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６５．標的化リガンドが、アンチセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（５’→３’）から横断するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、実施形態５６～６２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６６．３つの標的化リガンドを含む三座配向基がセンス鎖の５’末端に位置し、センス鎖がセンス鎖のヌクレオチドに連結された２～４つの標的化リガンドをさらに含み、センス鎖の５’末端で三座配向基を分離する少なくとも１０ヌクレオチド、及びヌクレオチドに結合された次の最も近接する標的化リガンドがある、実施形態５６～６５のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６７．４つの標的化リガンドがセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結されている、実施形態６６に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６８．標的化リガンドが、インテグリンα－ｖ－β－３に対する親和性を有する化合物を含むインテグリン標的化リガンドである、実施形態５６～６７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態６９．ＰＫエンハンサーが、式：
Figure 2022518384000385
（式中、Ｙは任意に置換された飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、ｎは５～２５の整数である）
のものである、実施形態５６～６８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７０．配列ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）を含むアンチセンス鎖、及び配列Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）を含むセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤であって、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分は、ヌクレオチドの２’位に連結されたＺを含み、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、以下：
Figure 2022518384000386
を表し；（ｉｎｖＡｂ）は、以下：
Figure 2022518384000387
を表し；（６－Ｓ）は、以下：
Figure 2022518384000388
を表し、それぞれのＸ、Ｙ、Ｚは、独立して、
（ｉ）１つ以上の標的化リガンドを含む標的化基であって、標的化リガンドが構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ、及び構造３２ａからなる群より選択される標的化基；
（ｉｉ）構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ及び構造３２ａからなる群から選択される構造を有する標的化リガンド；又は
（ｉｉｉ）Ｃ－１８二酸、Ｃ－１８三酸、Ｍａｌ－Ｃ１７－ビニル－ＰＯ３、及びＣ２０酸からなる群から選択される構造を有するＰＫエンハンサー
を表すＲＮＡｉ剤。
実施形態７１．各Ｚが、構造２ａの構造：
Figure 2022518384000389
を有する標的化リガンドでああり、
Figure 2022518384000390
は結合点を示す、実施形態７０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７２．各Ｚが、構造２．１１ａの構造：
Figure 2022518384000391
を有する標的化リガンドでああり、
Figure 2022518384000392
は結合点を示す、実施形態７０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７３．各Ｚが、構造２９ａの構造：
Figure 2022518384000393
を有する標的化リガンドでああり、
Figure 2022518384000394
は結合点を示す、実施形態７０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７４．各Ｚが、構造３２ａの構造：
Figure 2022518384000395
を有する標的化リガンドでああり、
Figure 2022518384000396
は結合点を示す、実施形態７０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７５．Ｘが、Ｃ－１８二酸の構造：
Figure 2022518384000397
を有するＰＫエンハンサーであり、
Figure 2022518384000398
は結合点を示す、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７６．Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ－１８三酸の構造：
Figure 2022518384000399
を有するＰＫエンハンサーであり、
Figure 2022518384000400
は結合点を示す、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７７．Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ１７－ビニルＰＯ３の構造：
Figure 2022518384000401
を有するＰＫエンハンサーであり
Figure 2022518384000402
は結合点を示す、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７８．Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ２０酸の構造
Figure 2022518384000403
を有するＰＫエンハンサーであり、
Figure 2022518384000404
は結合点を示す、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態７９．ＲＮＡｉ剤が２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の標的化リガンドを含む、実施形態７０～７８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８０．ＲＮＡｉ剤が７個の標的化リガンドを含む、実施形態７９に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８１．Ｙが、ＴｒｉＡｌｋ １４の構造：
Figure 2022518384000405
又はＴｒｉＡｌｋ １４Ｓの構造：
Figure 2022518384000406
を有する標的化基であり、ＴＬは、構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ、及び構造３２ａからなる群から選択される標的化リガンドを含む、実施形態８０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８２．各ＴＬが、構造２ａ：
Figure 2022518384000407
を含み、
Figure 2022518384000408
は結合点を示す、実施形態８１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８３．各ＴＬが、構造２．１１ａ：
Figure 2022518384000409
を含み、
Figure 2022518384000410
は結合点を示す、実施形態８１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８４．各ＴＬが、構造２９ａ：
Figure 2022518384000411
を含み、
Figure 2022518384000412
は結合点を示す、実施形態８１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８５．各ＴＬが、構造３２ａ：
Figure 2022518384000413
を含み、
Figure 2022518384000414
は結合点を示す、実施形態８１に記載のＲＮＡｉ剤
実施形態８６．アンチセンス鎖のヌクレオチドが配列番号３０のヌクレオチドからなる、実施形態７０～８１のいずれか１ｔｕに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８７．センス鎖のヌクレオチドが配列番号７６１のヌクレオチドからなる、実施形態７０～８６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態８８．組成物が薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤を含む組成物。
実施形態８９．ＨＩＦ－２αの発現を阻害するための第２のＲＮＡｉ剤をさらに含む、実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９０．１以上のさらなる治療薬をさらに含む、実施形態８８又は８９に記載の組成物。
実施形態９１．細胞におけるＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するための方法であって、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤又は実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の組成物の有効量を細胞に導入することを含む方法。
実施形態９２．細胞が対象内にある、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３．対象がヒト対象である、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４．ＨＩＦ２－α遺伝子発現がインビボで少なくとも約３０％阻害される、実施形態９１～９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５．ＨＩＦ２－α関連疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とするヒト対象に、実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
実施形態９６．疾患又は障害が、癌、腎臓癌、明細胞腎細胞癌、非小細胞肺癌、星状細胞腫（脳癌）、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、大腸癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、又は関節リウマチである、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９７．疾患が明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）である、実施形態９５又は９６記載の方法。
実施形態９８．ＲＮＡｉ剤が、ヒト対象の体重１ｋｇあたり約３ｍｇ～約８０ｍｇの用量で投与される、実施形態９１～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．ＲＮＡｉ剤が、ヒト対象の体重１ｋｇあたりの約５ｍｇ～約２０ｍｇの用量で投与されるる、実施形態９８に記載の方法。
実施形態１００．ＲＮＡｉ剤が分割投与され、所望の１日量の約半分が最初の投与で投与され、残りの所望の１日量の約半分が最初の投与の約４時間後に投与される、実施形態９８又は９９に記載の方法。
実施形態１０１．ＲＮＡｉ剤の用量が週１回投与される、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２．ＲＮＡｉ剤の用量又は分割用量を隔週（隔週に１回）投与する、実施形態９９～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０３．少なくとも部分的にＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって媒介される疾患、障害、又は症状の治療のための、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤又は実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態１０４．疾患がｃｃＲＣＣである、実施形態１０３に記載の使用。
実施形態１０５．少なくとも部分的にＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって媒介される疾患、障害、又は症状を治療するための医薬組成物の調製のための、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤又は実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態１０６．疾患がｃｃＲＣＣである、実施形態１０５に記載の使用。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に説明されてきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことを理解されたい。他の実施形態、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (106)

  1. ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
    （ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；
    （ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖；及び
    （ｉｉｉ）１つ以上の標的化リガンド
    を含むＲＮＡｉ剤。
  2. アンチセンス鎖が、表３に提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド２～１８を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  3. センス鎖が、表４、４．１、４．２又は４．３に提供されるセンス鎖配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖に対する１７の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８５％の相補性の領域を有する、請求項１又は２に記載のＲＮＡｉ剤。
  4. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖、又はＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方のヌクレオチドの全部又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  5. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’、３’－セコヌクレオチド模倣ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、２’－メトキシエチルヌクレオチド、アバシックヌクレオチド、リビトール、逆ヌクレオチド、逆位２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、逆位２’－デオキシヌクレオチド、逆位２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホナート修飾ヌクレオチド、シクロプロピルホスホナート修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－プロパルギル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－トリアゾール修飾ヌクレオチド、及び３’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のＲＮＡｉ剤。
  6. 各修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、及び２’－Ｏ－トリアゾール修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、請求項５に記載のＲＮＡｉ剤。
  7. アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾されたアンチセンス鎖配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  8. センス鎖が、表４に提供される修飾センス鎖配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  9. アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、表４、表４．１、表４．２又は表４．３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  10. アンチセンス鎖が、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）のヌクレオチド２～１８を含み、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、及びｓがホスホロチオエート結合を表す、請求項１～９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  11. アンチセンス鎖が、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）の配列を含み、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、及びｓがホスホロチオエート結合を表す、請求項１０に記載のＲＮＡｉ剤。
  12. センス鎖が、ＣＡＡＣＧＵＡＡＣＧＡＵＵＵＣＡＵＧＡＡＡ（配列番号４２８）の配列のヌクレオチド２～１８を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  13. センス鎖が、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）の配列を含み、ａ、ｃ、ｇ、およびｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆはそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、各Ｘ、Ｙ及びＺは独立して薬理学的部分であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分Ｚはヌクレオチドの２’位に連結され、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、
    Figure 2022518384000415
     を表し、（ｉｎｖＡｂ）は、
    Figure 2022518384000416
     を表し、（６－Ｓ）は、
    Figure 2022518384000417
     を表し、ｓはホスホロチオエート結合を表す、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  14. アンチセンス鎖がセンス鎖に対して少なくとも実質的に相補的である、請求項１２又は１３に記載のＲＮＡｉ剤。
  15. センス鎖のヌクレオチドが、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６）－Ｓ（配列番号７６１）の配列からなり、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、各Ｘ、Ｙ及びＺが独立して薬理学的部分であり、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺがそれぞれウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分はヌクレオチドの２’位に連結し（本明細書の実施例に開示されたＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤は、２’－Ｏ－プロパルギル基にカップリングすることによって完成され）、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、
    Figure 2022518384000418
     を表し、（ｖＡｂで）は、
    Figure 2022518384000419
     を表し、（６－Ｓ）は、
    Figure 2022518384000420
     を表し、ｓはホスホロチオエート結合を表す、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  16. アンチセンス鎖のヌクレオチドが、ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）の配列からなり、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、及びｓが、ホスホロチオエート結合を表す、請求項１５に記載のＲＮＡｉ剤。
  17. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、少なくとも１つの標的化リガンドに連結されている、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  18. 標的化リガンドがインテグリンに対する親和性を有する化合物を含む、請求項１７に記載のＲＮＡｉ剤。
  19. 標的化リガンドが、インテグリンα－ｖ－β－３、α－ｖ－β－５、又はα－ｖ－β－３及びα－ｖβ－５の両方に対して親和性を有する化合物を含む、請求項１８に記載のＲＮＡｉ剤。
  20. 標的化リガンドが、式：
    Figure 2022518384000421
     （式中、
    Ｘは－Ｃ（Ｒ３）２－、－ＮＲ３－、
    Figure 2022518384000422
     であり、
    Ｙは、アルキレン鎖中に１～８個の炭素原子を有する任意に置換されたアルキレンであり；
    Ｚは、Ｏ、ＮＲ３、又はＳであり；
    Ｒ１は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたシクロアルキルであるか、又はＲ１はＲＮＡｉ剤を含み；
    Ｒ２は、Ｈ、任意に置換されたアルキルでああるか、又はＲ２はＲＮＡｉ剤を含み、
    Ｒ３の各場合は、Ｈ及び任意に置換されたアルキルからなる群から独立して選択されるか、又はＲ３はＲＮＡｉ剤を含み；
    Ｒ４は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；
    Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかの場合、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＲＮＡｉ剤を含む）
    で表される化合物である、請求項１９に記載のＲＮＡｉ剤。
  21. 標的化リガンドが、
    Figure 2022518384000423
    Figure 2022518384000424
    Figure 2022518384000425
    Figure 2022518384000426
    Figure 2022518384000427
    Figure 2022518384000428
    Figure 2022518384000429
     から選択され、
    Figure 2022518384000430
     は、ＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤との結合点を示す、請求項２０に記載のＲＮＡｉ剤。
  22. 標的化リガンドが、構造：
    Figure 2022518384000431
     のものである、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  23. 薬物動態（ＰＫ）エンハンサーをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  24. ＰＫエンハンサーが、式：
    Figure 2022518384000432
     （式中、Ｙは任意に置換された飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、ｎは５～２５の整数である）
    を含む、請求項２３に記載のＲＮＡｉ剤。
  25. ＰＫエンハンサーが、
    Figure 2022518384000433
     を含む、請求項２４に記載のＲＮＡｉ剤。
  26. 前記ＰＫエンハンサーが、
    Figure 2022518384000434
    Figure 2022518384000435
    Figure 2022518384000436
    Figure 2022518384000437
    Figure 2022518384000438
     からなる群から選択され、
    Figure 2022518384000439
     は、ＲＮＡｉ因子への結合点を示す、請求項２３に記載のＲＮＡｉ剤。
  27. 標的化リガンドがセンス鎖に連結されている、請求項１～２６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  28. ＰＫエンハンサーがセンス鎖に連結されている、請求項２３～２７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  29. ＲＮＡｉ剤が２～１０個の標的化リガンドに連結されている、請求項１～２８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  30. ＲＮＡｉ剤が、センス鎖の５’末端に２つ以上の標的化リガンドを含む標的化基に連結されている、請求項１～２９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  31. 少なくとも１つの標的化リガンドがセンス鎖の５’末端に連結され、少なくとも１つの標的化リガンドがセンス鎖の非末端ヌクレオチドに連結されている、請求項１～３０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  32. ２つ以上の標的化リガンドに連結され、２つ以上の標的化リガンドが分岐点で連結され、標的化基を形成する、請求項１～３１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  33. 標的化基が３つの標的化リガンドを含み、標的化基が式：
    Figure 2022518384000440
     （式中、
    Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ、任意に置換されたアルキレンを含む独立したリンカーであり；
    Ｌ４は、任意に置換されたアルキレン；任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたシクロアルキルを含むリンカーであり；
    Ｒ５は、Ｈ又は任意に置換されたアルキルであり；
    ＴＬは標的リガンドであり；
    ＹはＯ又はＳである）
    のものである、請求項３２に記載のＲＮＡｉ剤。
  34. 標的化基が式：
    Figure 2022518384000441
     のものである、請求項３３に記載のＲＮＡｉ剤。
  35. 三座配位標的化基が、センス鎖の５’末端に連結され、少なくとも２つのさらなる標的化リガンドはセンス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結されている、請求項１～３４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  36. 少なくとも１０個のヌクレオチドが、センス鎖の５’末端に位置する標的化基とセンス鎖上に位置する標的化リガンドとの間に位置する、請求項３１又は３５に記載のＲＮＡｉ剤。
  37. 少なくとも１つの標的化リガンドが、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチドの２’位置に連結されている、請求項１～３６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  38. ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結されている、請求項２３～３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  39. ５～８個の標的リガンドがセンス鎖に連結されている、請求項１～３８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  40. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、センス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結された少なくとも１つの三座配位子標的化基及び少なくとも２つの標的化リガンドに連結されている、請求項３９に記載のＲＮＡｉ剤。
  41. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、（ｉ）センス鎖の５’末端における三座配位子標的化基、及び（ｉｉ）センス鎖の５’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドに連結された２～４個の標的化リガンドに連結されている、請求項４０に記載のＲＮＡｉ剤。
  42. 標的化リガンドが、（ｉ）３つの個々の標的化リガンドを含む三座配位子標的化基がセンス鎖の５’末端に位置し、（ｉｉ）追加の標的化リガンドが、センス鎖の５’末端から少なくとも１０ヌクレオチド離れたセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結された個々の標的化リガンドであるように、センス鎖に連結されている、請求項２９～４１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  43. 標的化リガンドが、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドと塩基対を形成するセンス鎖の３’ヌクレオチドから２、４、６、及び８位（３’→５’）に位置するセンス鎖ヌクレオチドに連結されている、請求項４２に記載のＲＮＡｉ剤。
  44. 少なくとも１つの標的化リガンドが、リボース環の２’位置、リボース環の３’位置、リボース環の１’位置、又はヌクレオチドの核酸塩基、リボース環の４’位置、又はヌクレオチドの５’位置の個々のヌクレオチドに連結されている、請求項４３に記載のＲＮＡｉ剤。
  45. 少なくとも１つの標的化リガンドが、個々のヌクレオチドのリボース環の２’位置に連結されている、請求項４４に記載のＲＮＡｉ剤。
  46. センス鎖が１８～４９ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が１８～４９ヌクレオチドの長さである、請求項１～４５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  47. センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ１８～２７ヌクレオチドの長さである、請求項４６に記載のＲＮＡｉ剤。
  48. センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ１８～２４ヌクレオチドの長さである、請求項４７に記載のＲＮＡｉ剤。
  49. センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ２１ヌクレオチドの長さである、請求項４８に記載のＲＮＡｉ剤。
  50. ＲＮＡｉ剤が２つの平滑末端を有する、請求項４６～４９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  51. センス鎖が１つ又は２つの末端キャップを含む、請求項１～５０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  52. センス鎖が、１個又は２個の逆位軽減残基を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  53. ＲＮＡｉ剤が、センス鎖及び表５の二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するアンチセンス鎖を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  54. センス鎖が、さらに、ヌクレオチド配列の３’末端、ヌクレオチド配列の５’末端、又はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端の両方に逆弱塩基残基を含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  55. （ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つから０又は１ヌクレオチドだけ異なる少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；及び
    （ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むセンス鎖
    を含むＨＩＦ－２α ＲＮＡｉ剤。
  56. （ｉ）ＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子（配列番号１）に対して少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖；
    （ｉｉ）アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖；
    （ｉｉｉ）センス鎖に連結された標的化リガンド；及び
    （ｉｖ）センス鎖に結合したＰＫエンハンサー
    を含むＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤。
  57. 標的化リガンドがセンス鎖の５’末端に連結されている、請求項５６に記載のＲＮＡｉ剤。
  58. ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結されている、請求項５６又は５７に記載のＲＮＡｉ剤。
  59. １つ以上の標的リガンドがセンス鎖の１つ以上のヌクレオチドに連結されている、請求項５６～５８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  60. ２～１２の標的リガンドがセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、請求項５９記載のＲＮＡｉ剤。
  61. ３つの標的化リガンドからなる三座配位子標的化基がセンス鎖の５’末端に連結され；ＰＫエンハンサーがセンス鎖の３’末端に連結され；２～１２の標的化リガンドがセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結されている、請求項５６～６０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  62. センス鎖の個々のヌクレオチドに連結された標的化リガンドが、各ヌクレオチドの２’位置で連結されている、請求項６１に記載のＲＮＡｉ剤。
  63. 標的化リガンドが、アンチセンス鎖と塩基対を形成する第一のヌクレオチドからの位置２、６、１５、及び１９（３’→５’）に位置するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、請求項５６～６２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  64. 標的化リガンドが、アンチセンス鎖と塩基対を形成する第一のヌクレオチドからの位置２、４、６、及び８（３’→５’）に位置するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、請求項５６～６２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  65. 標的化リガンドが、アンチセンス鎖のヌクレオチド２、４、６、及び８（５’→３’）から横断するセンス鎖のヌクレオチドに連結されている、請求項５６～６２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  66. ３つの標的化リガンドを含む三座配向基がセンス鎖の５’末端に位置し、センス鎖がセンス鎖のヌクレオチドに連結された２～４つの標的化リガンドをさらに含み、センス鎖の５’末端で三座配向基を分離する少なくとも１０ヌクレオチド、及びヌクレオチドに結合された次の最も近接する標的化リガンドがある、請求項５６～６５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  67. ４つの標的化リガンドがセンス鎖の個々のヌクレオチドに連結されている、請求項６６に記載のＲＮＡｉ剤。
  68. 標的化リガンドが、インテグリンα－ｖ－β－３に対する親和性を有する化合物を含むインテグリン標的化リガンドである、請求項５６～６７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  69. ＰＫエンハンサーが、式：
    Figure 2022518384000442
     （式中、Ｙは任意に置換された飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、ｎは５～２５の整数である）
    のものである、請求項５６～６８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  70. 配列ｕｓＵｆｓｕｓＣｆａＵｆｇＡｆａＡｆｕＣｆｇＵｆｕＡｆｃＧｆｕＵｆｓｇ（配列番号３０）を含むアンチセンス鎖、及び配列Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）ｓｃｓａａｃｇｕａａＣｆＧｆＡｆｕｕｕＺｃａＺｕｇＺａａＺｓａ（ｉｎｖＡｂ）（６－Ｓ）－Ｘ（配列番号７６１）を含むセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤であって、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンを表し、ｕＺ、ａＺ、ｇＺ、及びｃＺはそれぞれ、ウリジン、アデノシン、グアノシン、及びシチジンを表し、薬理学的部分は、ヌクレオチドの２’位に連結されたＺを含み、Ｙ－（ＮＨ－Ｃ６）は、以下：
    Figure 2022518384000443
     を表し；（ｉｎｖＡｂ）は、以下：
    Figure 2022518384000444
     を表し；（６－Ｓ）は、以下：
    Figure 2022518384000445
     を表し、それぞれのＸ、Ｙ、Ｚは、独立して、
    （ｉｖ）１つ以上の標的化リガンドを含む標的化基であって、標的化リガンドが構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ、及び構造３２ａからなる群より選択される標的化基；
    （ｖ）構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ及び構造３２ａからなる群から選択される構造を有する標的化リガンド；又は
    （ｖｉ）Ｃ－１８二酸、Ｃ－１８三酸、Ｍａｌ－Ｃ１７－ビニル－ＰＯ３、及びＣ２０酸からなる群から選択される構造を有するＰＫエンハンサー
    を表すＲＮＡｉ剤。
  71. 各Ｚが、構造２ａの構造：
    Figure 2022518384000446
     を有する標的化リガンドでああり、
    Figure 2022518384000447
     は結合点を示す、請求項７０に記載のＲＮＡｉ剤。
  72. 各Ｚが、構造２．１１ａの構造：
    Figure 2022518384000448
     を有する標的化リガンドでああり、
    Figure 2022518384000449
     は結合点を示す、請求項７０に記載のＲＮＡｉ剤。
  73. 各Ｚが、構造２９ａの構造：
    Figure 2022518384000450
     を有する標的化リガンドでああり、
    Figure 2022518384000451
     は結合点を示す、請求項７０に記載のＲＮＡｉ剤。
  74. 各Ｚが、構造３２ａの構造：
    Figure 2022518384000452
     を有する標的化リガンドでああり、
    Figure 2022518384000453
     は結合点を示す、請求項７０に記載のＲＮＡｉ剤。
  75. Ｘが、Ｃ－１８二酸の構造：
    Figure 2022518384000454
     を有するＰＫエンハンサーであり、
    Figure 2022518384000455
     は結合点を示す、請求項７０～７４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  76. Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ１８三酸の構造：
    Figure 2022518384000456
     を有するＰＫエンハンサーであり、
    Figure 2022518384000457
     は結合点を示す、請求項７０～７４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  77. Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ１７－ビニルＰＯ３の構造：
    Figure 2022518384000458
     を有するＰＫエンハンサーであり
    Figure 2022518384000459
     は結合点を示す、請求項７０～７４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  78. Ｘが、Ｍａｌ－Ｃ２０酸の構造
    Figure 2022518384000460
     を有するＰＫエンハンサーであり、
    Figure 2022518384000461
     は結合点を示す、請求項７０～７４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  79. ＲＮＡｉ剤が２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の標的化リガンドを含む、請求項７０～７８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  80. ＲＮＡｉ剤が７個の標的化リガンドを含む、請求項７９に記載のＲＮＡｉ剤。
  81. Ｙが、ＴｒｉＡｌｋ １４の構造：
    Figure 2022518384000462
     又はＴｒｉＡｌｋ １４Ｓの構造：
    Figure 2022518384000463
     を有する標的化基であり、ＴＬは、構造２ａ、構造２．１１ａ、構造２９ａ、及び構造３２ａからなる群から選択される標的化リガンドを含む、請求項８０に記載のＲＮＡｉ剤。
  82. 各ＴＬが、構造２ａ：
    Figure 2022518384000464
     を含み、
    Figure 2022518384000465
     は結合点を示す、請求項８１に記載のＲＮＡｉ剤。
  83. 各ＴＬが、構造２．１１ａ：
    Figure 2022518384000466
     を含み、
    Figure 2022518384000467
     は結合点を示す、請求項８１に記載のＲＮＡｉ剤。
  84. 各ＴＬが、構造２９ａ：
    Figure 2022518384000468
     を含み、
    Figure 2022518384000469
     は結合点を示す、請求項８１に記載のＲＮＡｉ剤。
  85. 各ＴＬが、構造３２ａ：
    Figure 2022518384000470
     を含み、
    Figure 2022518384000471
     は結合点を示す、請求項８１に記載のＲＮＡｉ剤。
  86. アンチセンス鎖のヌクレオチドが配列番号３０のヌクレオチドからなる、請求項７０～８５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  87. センス鎖のヌクレオチドが配列番号７６１のヌクレオチドからなる、請求項７０～８６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤。
  88. 組成物が薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１～８７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤を含む組成物。
  89. ＨＩＦ－２αの発現を阻害するための第２のＲＮＡｉ剤をさらに含む、請求項８８に記載の組成物。
  90. １以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項８８又は８９に記載の組成物。
  91. 細胞におけるＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するための方法であって、請求項１～８８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤又は請求項８８～９０のいずれか１項に記載の組成物の有効量を細胞に導入することを含む方法。
  92. 細胞が対象内にある、請求項９１に記載の方法。
  93. 対象がヒト対象である、請求項９２記載の方法。
  94. ＨＩＦ２－α遺伝子発現がインビボで少なくとも約３０％阻害される、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. ＨＩＦ２－α関連疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とするヒト対象に、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
  96. 疾患又は障害が、癌、腎臓癌、明細胞腎細胞癌、非小細胞肺癌、星状細胞腫（脳癌）、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、大腸癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、又は関節リウマチである、請求項９５に記載の方法。
  97. 疾患が明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）である、請求項９５又は９６記載の方法。
  98. ＲＮＡｉ剤が、ヒト対象の体重１ｋｇあたり約３ｍｇ～約８０ｍｇの用量で投与される、請求項９１～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. ＲＮＡｉ剤が、ヒト対象の体重１ｋｇあたりの約５ｍｇ～約２０ｍｇの用量で投与される、請求項９８に記載の方法。
  100. ＲＮＡｉ剤が分割投与され、所望の１日量の約半分が最初の投与で投与され、残りの所望の１日量の約半分が最初の投与の約４時間後に投与される、請求項９８又は９９に記載の方法。
  101. ＲＮＡｉ剤の用量が週１回投与される、請求項９８～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. ＲＮＡｉ剤の用量又は分割用量を隔週（隔週に１回）投与する、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 少なくとも部分的にＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって媒介される疾患、障害、又は症状の治療のための、請求項１～８８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤又は請求項８８～９０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  104. 疾患がｃｃＲＣＣである、請求項１０３に記載の使用。
  105. 少なくとも部分的にＨＩＦ－２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子発現によって媒介される疾患、障害、又は症状を治療するための医薬組成物の調製のための、請求項１～８８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ剤又は請求項８８～９０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  106. 疾患がｃｃＲＣＣである、請求項１０５に記載の使用。
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