KR20210113273A - HIF-2 알파 (EPAS1)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

HIF-2 알파 (EPAS1)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제에 관한 것이다. 또한, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물 및 그의 사용 방법이 개시된다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표적화 리간드 (예컨대 알파-v-베타-3 및 알파-v-베타-5 인테그린을 포함한, 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물) 및 약동학적 (PK) 인핸서에 연결 또는 접합되어, 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) 세포 및 종양을 포함한 세포 및 조직으로의 전달을 용이하게 할 수 있다. HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물의 생체내 전달은 HIF-2 알파 유전자 발현의 억제를 제공한다. HIF-2 알파 RNAi 작용제는 ccRCC를 포함한 다양한 질환 및 장애의 치료 방법에 사용될 수 있다.

Description

HIF-2 알파 (EPAS1)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ASCII 카피는 30663_SEQ_LISTING.txt로 명명되고, 크기는 227 kb이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/790,360; 2019년 4월 1일에 출원된 62/827,564; 및 2019년 4월 26일에 출원된 62/839,381을 우선권 주장하며; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현의 억제를 위한 RNA 간섭 (RNAi) 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
내피 PAS 도메인-함유 단백질 1 (EPAS1)로도 공지되어 있는 저산소증-유도성 인자-2 알파 (HIF-2 알파, HIF2-알파, Hif2알파, 또는 Hif2α로 지칭됨)는 이용가능한 산소의 감소 (저산소증)에 반응하는 저산소증-유도성 전사 인자이다. HIF-2 알파는 EPAS1 유전자 (대안적으로 본원에서 "HIF-2 알파 유전자"로 지칭됨)에 의해 코딩되고, 그의 발현은 낮은 산소 조건 하에 상향조절되는 것으로 공지되어 있다.
높은 고도 (예컨대, 티베트)에서 거주하는 특정 인간 집단에서, 높은 비율의 집단이 낮은 산소 환경에서 체내에서 산소 수송을 개선시키는 역할을 하는 HIF-2 알파 유전자의 특정 대립유전자 변이체를 보유하도록 진화한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 보다 전형적인 고도 환경에서, 야생형 EPAS1의 과다-발현은 고혈압 및 졸중 증가, 및 적혈구의 과량 생산으로 인한 고산병과 유사한 증상과 연관되었다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 또한 적혈구증가증 가족성 유형 4 및 폐고혈압과 연관되었다.
특히, HIF-2 알파는 인간의 다양한 조직에서 광범위하게 발현되지만, HIF-2 알파 단백질은 종양 진행을 포함한 여러 질환에 수반되는 다양한 유전자의 발현을 위해 또는 그의 발현을 증진시키기 위해 필요한 것으로 확인되었다. 예를 들어, HIF-2 알파는 자가분비 루프 VEGF-pVEGFR2/KDR을 촉진하고 LDHA의 발현을 증진시켜 성장 이점을 부여함으로써 포도막 흑색종의 진행에서 소정의 역할을 하는 것으로 생각된다.
EPAS1은 또한 cMyc (세포 증식, 형질전환, 신생물 및 종양발생을 지지하고, 대부분의 암에서 고도로 발현됨); 인터류킨 8 (예를 들어, 치은염 및 건선에서의 염증유발 매개자); SP-1 (IL-8 조절에 수반되는 전사 인자 및 cMyc의 보조활성화제); LDH5 (종양 괴사 및 증가된 종양 크기와 연관됨); 및 LANA (카포시 육종-연관 헤르페스바이러스와 연관된 잠복성 연관 핵 항원)를 포함한 다른 인자와 연관되거나 또는 그의 발현을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다. 또한, HIF (저산소증 유도성 인자) 활성은 일반적으로 암 종양 성장에 요구되는 혈관신생에서 소정의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, HIF-2 알파는 신암, 투명 세포 신세포 암종 (및 이러한 암 및 다른 암의 전이), 흑색종, 염증, 만성 염증, 신생혈관 질환, 류마티스 관절염, 포도막 흑색종, 연골육종 및 다발성 골수종을 포함한 여러 다른 질환에 수반되는 것으로 여겨진다. EPAS1 유전자에서의 돌연변이는 또한 신경내분비 종양, 예컨대 부신경절종, 소마토스타틴종 및/또는 크롬친화세포종의 조기 발병과 상관되었다. 돌연변이는 통상적으로 HIF-2α의 1차 히드록실화 부위에 위치하는 체세포 미스센스 돌연변이이다. 이들 돌연변이는 단백질 히드록실화/분해 메카니즘을 파괴하고, 이는 단백질 안정화 및 가성저산소 신호전달로 이어지는 것으로 여겨진다. 또한, 신경내분비 종양은 에리트로포이에틴 (EPO)을 순환 혈액 내로 방출하고, 이는 다혈구혈증으로 이어진다.
보다 구체적으로, HIF-2 알파는 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC)에서 종양 진행 및 전이와 연관되었다. 높은 비율의 ccRCC 종양은 HIF-2 알파를 분해할 수 없는 폰 히펠-란다우 단백질의 돌연변이체 형태를 발현하며, 이는 종양 성장 및 전이를 촉진하는 HIF-2 알파의 축적 및 HIF-2 알파-조절된 유전자의 활성화로 이어지는 것으로 여겨진다.
암종, 예컨대 ccRCC를 포함한 다양한 질환을 치료하기 위한 실행가능한 치유적 치료에 대한 필요가 계속 존재한다. 유사하게, HIF-2 알파의 발현을 억제하고/거나 그의 생산을 감소시킬 수 있는 치료 약물 제품에 대한 필요가 계속 존재한다. 단지 한 예로서, ccRCC 세포에서의 HIF-2 알파 발현의 실질적인 감소는 이들 암 세포의 바람직하지 않은 성장을 억제하거나 또는 달리 그의 진행을 늦출 수 있다.
유전자 발현을 억제하는 하나의 공지된 방법은 RNA 간섭 (RNAi)을 통하는 것으로, 이는 유전자 발현을 억제하거나 침묵시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드-기반 약물 제품 (예를 들어, RNAi 작용제)을 투여하는 것에 의한다. 그러나, 생체내에서 유전자 발현을 침묵시킬 수 있는 강력하고 안정한 올리고뉴클레오티드 서열을 확인하는 것, 뿐만 아니라 치료제를 목적하는 세포 또는 조직에 안전하고 선택적으로 전달하기 위한 치료적으로 실행가능한 방법을 결정하는 것 둘 다에서 큰 도전과제가 남아 있다. 올리고뉴클레오티드-기반 약물 제품은 특히 그의 상대적으로 작은 크기 및 고유한 유기 특성으로 인해 생체내 투여 시 신체 전반에서 용이하고 신속하게 분해 또는 여과되는 경향이 있으며, 이는 종종 이들이 의도된 표적 세포 및/또는 조직에 도달하는 것을 막는다. 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화에 의한 것, 이온영동에 의한 것, 다른 비히클, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생체접착성 마이크로구체, 단백질성 벡터, 또는 다이나믹 폴리컨쥬게이트(Dynamic Polyconjugate)™ (DPC) 내로의 혼입에 의한 것을 포함한, 이러한 제한을 극복하기 위한 다양한 시도가 제안되었다 (예를 들어, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169, 및 WO 2012/083185 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨). 대안적으로, 표적화 리간드, 예컨대 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 또는 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 항체 모방체에 대한 올리고뉴클레오티드의 접합은 올리고뉴클레오티드-기반 치료제를 간 내의 간세포로 전달하는데 있어서 최근 일부 성공하였다. 그러나, 지금까지, 올리고뉴클레오티드-기반 약물 제품을 간외 세포로 표적화하기 위한 노력은 효능의 결여, 독성, 또는 둘 다의 조합으로 인해 크게 실패하였다.
관련 기술분야에서의 특정 진보에도 불구하고, 생체내에서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드-기반 약물 제품을 포함한 치료제의 전달을 용이하게 하기 위한 개선된 전달 메카니즘에 대한 필요가 계속 존재한다. 또한, HIF-2 알파의 강력하고 선택적인 억제제에 대한 필요가 남아있다.
HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 선택적이고 효율적으로 억제할 수 있는 RNA 간섭 (RNAi) 작용제 (또한 본원에서 RNAi 작용제, RNAi 촉발제, 또는 촉발제로도 지칭됨), 예를 들어 이중-가닥 RNAi 작용제가 본원에 개시된다. HIF-2 알파의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 추가로 개시되며, 여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표적화된 세포 상에 존재하는 세포 수용체에 대해 친화도를 갖는 적어도 1개의 표적화 리간드, 및 임의로 적어도 1개의 약동학적 (PK) 인핸서에 연결된다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 선택적이고 효율적으로 감소 또는 억제할 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용은 HIF-2 알파 유전자-특이적 RNAi 작용제, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 및 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 사용하여 생체내 및/또는 시험관내에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하는 방법을 특색으로 한다.
기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는, 예를 들어 암종, 예컨대 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC)을 포함한 HIF-2 알파 발현의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있는 병태 및 질환의 치유적 치료 (예방적 및 방지적 치료 포함)를 위한 방법에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 대상체의 세포에서 HIF-2 알파 유전자 발현을 선택적으로 감소시킬 수 있다. 본원에 개시된 방법은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 정맥내 주입, 정맥내 주사, 또는 피하 주사를 사용하여 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에게 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 인간 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 특색으로 한다. HIF-2 알파 RNAi 작용제는 추가로 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 1개 이상의 PK 인핸서에 연결 또는 접합될 수 있다.
또한, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제를 포함하고, 추가로 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다. 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 중 1종 이상을 포함하는 본원에 기재된 제약 조성물은 생체내에서 HIF-2 알파 유전자의 발현을 선택적이고 효율적으로 감소 또는 억제할 수 있다. 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물은, 예를 들어 암종, 예컨대 ccRCC를 포함한 HIF-2 알파 발현의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있는 병태 및 질환의 치료 (예방적 치료 또는 억제 포함)를 위해 대상체, 예컨대 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 한 측면은
(i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥; 및
(iii) 1개 이상의 표적화 리간드
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다.
또 다른 측면에서,
(i) HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥;
(iii) 센스 가닥에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 센스 가닥에 연결된 PK 인핸서
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제가 기재된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 827은 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 분명하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다 (예를 들어, 모든 뉴클레오시드간 연결을 보여주는 도 7a 내지 7g 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 883은 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902)와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902)와 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 902는 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (NH2-C6)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') (Z)3-(TriAlk14)s(invAb)scacauucuCfUfAfuguZacZuaZugZus(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 806)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (TriAlk14), (C6-S), 및 (invAb)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') (Z)3-(TriAlk14)s(invAb)scacauucuCfUfAfuguZacZuaZugZus(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 806)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') (Z)3-(TriAlk14)s(invAb)sacacaacuGfUfCfcauZacZuaZacZas(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 810)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (TriAlk14), (C6-S), 및 (invAb)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') (Z)3-(TriAlk14)s(invAb)sacacaacuGfUfCfcauZacZuaZacZas(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 810)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 Y-(NH-C6)scsaaZcguaZaCfGfAfuuucaZugaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 740), Y-(NH-C6)scsaacZguaaZCfGfAfuuuZcaugZaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 756), Y-(NH-C6)scsaacgZuaaZCfGfAfuZuucZaugaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 757), 및 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucauZgZaZaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 762)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (NH2-C6), (invAb), 및 (6-S)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 Y-(NH-C6)scsaaZcguaZaCfGfAfuuucaZugaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 740), Y-(NH-C6)scsaacZguaaZCfGfAfuuuZcaugZaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 756), Y-(NH-C6)scsaacgZuaaZCfGfAfuZuucZaugaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 757), 및 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucauZgZaZaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 762)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827);
ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883); 또는
UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902);
여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827);
ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883); 또는
UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902);
여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827);
ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883); 또는
UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902);
여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하고; 여기서 각각의 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 위치 1-21에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827) 및
CAACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 428);
ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883) 및
CACAUUCUCUAUGUACUAUGU (서열식별번호: 485); 또는
UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902) 및
ACACAACUGUCCAUACUAACA (서열식별번호: 507);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGUUG (서열식별번호: 827) 및
CAACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 428);
ACAUAGUACAUAGAGAAUGUG (서열식별번호: 883) 및
CACAUUCUCUAUGUACUAUGU (서열식별번호: 485); 또는
UGUUAGUAUGGACAGUUGUGU (서열식별번호: 902) 및
ACACAACUGUCCAUACUAACA (서열식별번호: 507);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30);
asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90); 또는
usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30);
asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90); 또는
usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113);
여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761);
asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90) 및
(Z)3-(TriAlk14)s(invAb)scacauucuCfUfAfuguZacZuaZugZus(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 806);
usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113) 및
(Z)3-(TriAlk14)s(invAb)sacacaacuGfUfCfcauZacZuaZacZas(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 328);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 810) 및
Y-(NH-C6)scsaaZcguaZaCfGfAfuuucaZugaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 740);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacZguaaZCfGfAfuuuZcaugZaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 756);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacgZuaaZCfGfAfuZuucZaugaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 757);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucauZgZaZaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 762);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (TriAlk14), (NH2-C6), (C6-S), (6-S), 및 (invAb)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761);
asCfsasUfaGfuAfcAfuAfgAfgAfaUfgUfsg (서열식별번호: 90) 및
(Z)3-(TriAlk14)s(invAb)scacauucuCfUfAfuguZacZuaZugZus(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 806);
usGfsusUfaGfuAfuGfgAfcAfgUfuGfuGfsu (서열식별번호: 113) 및
(Z)3-(TriAlk14)s(invAb)sacacaacuGfUfCfcauZacZuaZacZas(invAb)(C6-S)-X (서열식별번호: 810);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaaZcguaZaCfGfAfuuucaZugaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 740);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacZguaaZCfGfAfuuuZcaugZaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 756);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacgZuaaZCfGfAfuZuucZaugaasa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 757);
usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30) 및
Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucauZgZaZaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 762);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), (TriAlk14), (NH2-C6), (C6-S), (6-S), 및 (invAb)은 표 7에 정의된 바와 같고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다:
UUUCAUGAAAUCGUUACGU (서열식별번호: 5);
UGUUAGUAUGGACAGUUGU (서열식별번호: 10); 및
ACAUAGUACAUAGAGAAUG (서열식별번호: 13).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGU (서열식별번호: 5);
UGUUAGUAUGGACAGUUGU (서열식별번호: 10); 및
ACAUAGUACAUAGAGAAUG (서열식별번호: 13);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGU (서열식별번호: 5);
UGUUAGUAUGGACAGUUGU (서열식별번호: 10); 및
ACAUAGUACAUAGAGAAUG (서열식별번호: 13);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 13은 각각 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1-19 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다:
UUUCAUGAAAUCGUUACGU (서열식별번호: 5) 및 ACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 17);
UGUUAGUAUGGACAGUUGU (서열식별번호: 10); 및 ACAACUGUCCAUACUAACA (서열식별번호: 22); 또는
ACAUAGUACAUAGAGAAUG (서열식별번호: 13) 및 CAUUCUCUAUGUACUAUGU (서열식별번호: 25).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
UUUCAUGAAAUCGUUACGU (서열식별번호: 5) 및 ACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 17);
UGUUAGUAUGGACAGUUGU (서열식별번호: 10); 및 ACAACUGUCCAUACUAACA (서열식별번호: 22); 또는
ACAUAGUACAUAGAGAAUG (서열식별번호: 13) 및 CAUUCUCUAUGUACUAUGU (서열식별번호: 25);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 본원에 기재된 조성물은 키트, 용기, 팩, 분배기, 사전-충전된 시린지, 또는 바이알 내에 포장된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 비경구로, 예를 들어 정맥내 주사, 정맥내 주입, 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법 및 예는 예시적일 뿐이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특색, 측면 및 이점이 하기의 상세한 설명, 첨부 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1. 3개의 구조 2-avb3 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기, C18-이산 PK 인핸서, 및 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 내부 뉴클레오티드에 연결된 것으로 제시된 4개의 내부 구조 2-abv3 표적화 리간드에 연결된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 (이중-나선으로 제시됨)의 개략적 다이어그램. 표적화 리간드, 표적화 기, 및 PK 인핸서에 대한 화학 구조가 제시된다.
도 2. 하나의 단부에는 PK 인핸서, 및 다른 단부에는 3개의 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기를 형성하는데 적합한 세자리 스캐폴드에 연결된 것으로 제시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 (이중-나선으로 제시됨)의 개략적 다이어그램. HIF-2 알파 RNA 작용제 다이어그램은 내부 뉴클레오티드에 연결된 4개의 표적화 리간드를 보여주는 것을 포함하여, 표적화 리간드 (도 2에서 "TL"로 표시됨)를 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결하기 위한 특정의 가능한 부위를 추가로 보여준다.
도 3a 내지 3d. 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성한 제1 뉴클레오티드로부터 출발하여 센스 가닥의 뉴클레오티드 2, 4, 6, 및 8 (3' → 5')의 2' 위치의 "TL"을 보여주는, 유리 산 형태의 HIF-2 알파 RNAi 작용제 AD06299의 화학 구조 표현 (도 3d에서 시작하여 도 3c까지 계속됨). "TL"은 이들 내부 뉴클레오티드 상의 표적화 리간드의 접합 부위를 나타낸다.
도 4a 내지 4b. 본원의 실시예 16에 기재된 연구에 따른 제36일의 종양-보유 마우스로부터의 종양 크기를 보여주는 영상. 도 4a는 비히클 대조군 (D5W)으로부터의 종양 크기를 보여주며, 좌측 신장은 대측 신장이고, 우측 신장 (더 큰 것)은 종양 신장이다. 도 4b는 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여된 마우스로부터의 종양 크기를 보여주며, 좌측 신장은 대측 신장이고, 우측 신장은 종양 신장이다.
도 5a 내지 5b. 본원의 실시예 16에 따라 투여된 종양-보유 마우스로부터의 HIF-2 알파 단백질의 면역조직화학 (IHC) 염색을 보여주는 영상. 도 5a는 비히클 대조군 (D5W)을 보여주며, 흑색 스팟은 HIF-2 알파 단백질의 존재를 보여준다. 도 5b는 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여된 처리군 마우스를 보여준다.
도 6. 본원의 실시예 19에 따라 투여된 동물의 종양 크기를 반영한 막대 그래프. 동물을 제34일에 종양 크기 측정에 기초하여 분류하였다.
도 7a 내지 7g. 고체 지지체 상에서 합성된 바와 같은 AD05971, AD06153, AD06157, AD05930, AD05966, AD05967 및 AD05972의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드간 연결, 및 센스 가닥 변형을 보여주는 개략도이며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; aAlk, cAlk, gAlk, 및 uAlk는 각각 2'-O-프로파르길 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, o는 포스포네이트 연결을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, invAb, 6-SS-6, C6-SS-C6, NH2-C6, 및 TriAlk14는 모두 표 7에 정의된 바와 같다. 도 7의 RNAi 작용제에 대한 추가의 변형, 예컨대 표적화 리간드 및 PK 인핸서의 첨가는 고체 지지체로부터의 절단 후에 실시될 수 있다.
RNAi 작용제
HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제 (본원에서 HIF-2 알파 또는 HIF2α RNAi 작용제, 또는 HIF-2 알파 또는 HIF2α RNAi 촉발제로 지칭됨)가 본원에 기재된다. 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 (또한 패신저 가닥으로도 지칭됨) 및 안티센스 가닥 (또한 가이드 가닥으로도 지칭됨)을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적일 수 있다. 본원에 기재된 RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥의 길이는 각각 16 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥은 독립적으로 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는, HIF-2 알파를 발현하는 세포에의 전달 시, 생체내 또는 시험관내에서 1개 이상의 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제한다.
본원에 기재된 한 측면은
(i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥; 및
(iii) 1개 이상의 표적화 리간드
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다.
또 다른 측면에서,
(i) HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 (서열식별번호: 1)에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥;
(iii) 센스 가닥에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 센스 가닥에 연결된 PK 인핸서
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제가 기재된다.
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 HIF-2 알파 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열 (또한 본원에서 "코어 스트레치" 또는 "코어 서열"로도 지칭됨) 및 상응하는 센스 가닥 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 적어도 85% 상보성을 갖는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 가닥 코어 스트레치는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 HIF-2 알파 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 센스 가닥 코어 스트레치는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이러한 센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이러한 센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 1에 개시된 서열 중 임의의 것의 서열을 갖는 HIF-2 알파 유전자의 부분을 표적화한다.
본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 포함될 수 있는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥의 예는 표 3에 제공된다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 포함될 수 있는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥의 예는 표 4, 4.1, 4.2, 및 4.3에 제공된다. HIF-2 알파 RNAi 작용제 듀플렉스의 예는 표 5에 제공된다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어지거나 그에 포함되는 19-뉴클레오티드 코어 스트레치 서열의 예는 표 2에 제공된다.
일부 실시양태에서, 표 5에 개시된 듀플렉스 구조를 갖는 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
추가 측면에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 RNAi 작용제를 1개 이상의 표적화 리간드 (예를 들어, HIF-2 알파를 발현하는 세포 상에 위치하는 1개 이상의 세포 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 리간드)에 공유 연결 또는 접합시킴으로써 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 표적화 리간드는 1개 이상의 인테그린 (대안적으로 "인테그린 수용체"로 지칭됨)에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하거나 그로 이루어진다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 암종 세포, 예컨대 (ccRCC) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포에 전달될 수 있다. 핵산 전달 방법은 표적화 리간드에의 연결 또는 접합에 의한 것, 리포솜 내 캡슐화에 의한 것, 이온영동에 의한 것, 또는 다른 비히클, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생체접착성 마이크로구체, 단백질성 벡터, 또는 다이나믹 폴리컨쥬게이트™ (DPC) 내로의 혼입에 의한 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 표적화 리간드 (이하 "인테그린 표적화 리간드"로 지칭됨)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 표적화 리간드는 인테그린 알파-v-베타 3, 인테그린 알파-v-베타-5, 또는 이들 인테그린 둘 다에 대해 친화도를 갖는다. 표적화 리간드는 개별적으로 존재할 수 있거나 (단지 1개의 표적화 화합물이 존재함), 또는 2개 이상의 표적화 리간드가 분지점 또는 스캐폴드를 통해 연결되어 함께 표적화 기를 형성할 수 있고, 이어서 표적화 기의 분지점 또는 스캐폴드는 RNAi 작용제에 단독으로 연결된다. 표적화 기는 2개의 표적화 리간드 ("두자리"로 지칭됨), 3개의 표적화 리간드 ("세자리"), 4개의 표적화 리간드 ("네자리"), 또는 4개 초과의 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 2개 이상의 표적화 리간드에 연결된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 2 내지 10개의 표적화 리간드에 연결된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 7개의 표적화 리간드에 연결된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과의 표적화 리간드에 연결된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제가 인테그린 알파-v-베타 3 및/또는 인테그린 알파-v-베타-5에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 표적화 리간드에 접합된 경우에, RNAi 작용제는 수용체-매개 세포내이입을 통해 또는 다른 수단에 의해 ccRCC 세포에 의해 선택적으로 내재화된다. HIF-2 알파 RNAi 작용제를 전달하는데 유용한 인테그린 알파-v-베타 3 및/또는 인테그린 알파-v-베타-5에 대해 친화도를 갖는 표적화 리간드 및 표적화 기의 예는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허 공개 번호 WO 2019/210200에 개시되어 있다.
표적화 리간드는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 3' 또는 5' 단부, 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 단부, 및/또는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 1개 이상의 개별 뉴클레오티드에 내부적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 센스 가닥의 3' 또는 5' 단부에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 센스 가닥의 5' 단부에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 내부적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고, 1개 이상의 표적화 리간드는 센스 가닥의 1개 이상의 내부 뉴클레오티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
표적화 리간드 또는 표적화 기는, 링커의 존재 또는 부재 하에, 표 2, 3, 또는 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3에 개시된 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 것의 5' 또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 링커는, 표적화 리간드 또는 표적화 기의 존재 또는 부재 하에, 표 2, 3, 또는 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3에 개시된 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 것의 5' 또는 3' 단부에 부착될 수 있다.
추가 측면에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 약동학적/약역학적 (PK) 인핸서에 연결 또는 접합될 수 있다. 본원에 사용된 PK 인핸서 (또한 "약동학적 (PK) 조절제"로도 지칭됨)는, 올리고뉴클레오티드-기반 약물 제품 또는 다른 치료제에 연결된 경우에, 표적화된 세포 또는 조직으로의 치료제의 전달을 저해하지 않으면서 신장 배설을 제한함으로써 치료제의 유리 형태에 비해 치료제의 생체내 전신 순환 시간을 증가시킬 수 있거나 (증가된 반감기 또는 혈장 체류 시간), 또는 다르게는 PK 인핸서가 없는 치료제에 비해 약역학적 개선을 제공하는 화합물이다. HIF-2 알파 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 예시적인 PK 인핸서가 본원에 개시된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 선택된 치료제에 비추어, 추가의 적합한 PK 인핸서를 확인하기 위한 관련 생체내 및/또는 시험관내 연구를 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 예를 들어, 다양한 시간 간격으로 대상체의 전신 순환에 남아있는 약물 제품의 양을 정량화하거나, 또는 관련 시점에 치료제의 효과 또는 효력 또는 효과의 지속기간을 평가하는, PK 인핸서가 존재하는 경우 및 부재하는 경우 둘 다에서 치료제를 비교하는 연구가 용이하게 설계될 수 있다. 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 내에 있다.
또 다른 측면에서, 개시내용은 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 양을 대상체 또는 대상체의 세포에 투여하는 것을 포함하는 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하는 방법을 특색으로 하며, 여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제할 수 있는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 양을 대상체 또는 세포에 투여하는 것을 포함하는 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 표 2, 4, 4.1, 4.2 또는 4.3의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다.
또한 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 대상체, 예컨대 포유동물에서 인테그린 (또한 본원에서 "인테그린 수용체"로도 지칭됨)을 발현하는 세포에 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 목적하는 세포로의 전달은 HIF-2 RNAi 작용제를 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 1개 이상의 PK 인핸서에 연결함으로써 용이해진다. 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 또한 기재된다.
추가 측면에서, 개시내용은 ccRCC를 포함하여 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 발현의 감소에 의해 매개될 수 있는 질환, 병태, 또는 증상의 치료 (방지적 또는 예방적 치료 포함) 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 표 2 또는 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ccRCC를 포함하여 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 발현의 감소에 의해 매개될 수 있는 질환, 증상, 또는 병태의 치료 (방지적 치료 포함) 방법이 본원에 기재되며, 여기서 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 표 2, 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥을 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다.
또한, 치료 유효량의 HIF-2 알파 RNAi 작용제 및/또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제-함유 조성물을 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 병리학적 상태 (예컨대 병태 또는 질환)를 갖거나 또는 병리학적 상태가 발생할 위험이 있는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 기재된다. HIF-2 알파 RNAi 작용제 및/또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제-함유 조성물로 대상체를 치료하는 방법은 임의로 1종 이상의 추가의 (예를 들어, 제2, 제3 등) 치료제 또는 치료를 투여하는 1개 이상의 단계와 조합될 수 있다. 추가의 치료제는 또 다른 HIF-2 알파 RNAi 작용제 (예를 들어, HIF-2 알파 유전자 내의 상이한 서열을 표적화하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제)일 수 있다. 추가의 치료제는 또한 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 및/또는 압타머일 수 있다.
추가 측면에서, 1종 이상의 추가의 (제2, 제3 등) 치료제와 임의로 조합된 1종 이상의 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제(들)를 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 (예를 들어 제2, 제3 등) 치료제와 임의로 조합된 1종 이상의 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제(들)를 포함하는 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 조성물은 대상체, 예컨대 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 임의적인 1종 이상의 추가의 치료제는 암, 예컨대 1종 이상의 암종의 치료를 위해 지시된 약물 제품이다. HIF-2 알파 RNAi 작용제 및 추가의 치료제(들)는 단일 조성물로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 개별적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 치료제는 RNAi 작용제와 개별 투여 형태로 개별적으로 투여된다 (예를 들어, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여되는 한편, 치료 투여 요법의 방법에 수반되는 추가의 치료제는 경구로 투여됨). 일부 실시양태에서, 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제(들)는 이를 필요로 하는 대상체에게 정맥내 주입 또는 주사를 통해 투여되고, 1종 이상의 임의적인 추가의 치료제는 또한 정맥내 주입, 주사에 의해, 또는 경구로 투여되고, 함께 투여하는 것은 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개될 수 있는 질환 및 병태, 예컨대 ccRCC에 대한 치료 요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 및 1종 이상의 추가의 치료제는 단일 투여 형태 (예를 들어, 정맥내 주입 또는 주사를 위한 단일 조성물로 제제화된 "칵테일")로 조합된다. HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1종 이상의 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에 1종 이상의 부형제와 조합되어 제약 조성물을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥 및 표 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 세포 또는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 대상체에서 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 ccRCC 세포에 생체내 전달하기 위한, 1개 이상의 표적화 리간드에 연결 또는 접합된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물이 기재된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 인테그린 알파-v-베타-3 및/또는 인테그린 알파-v-베타-5에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 표적화 리간드에 연결 또는 접합된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 PK 인핸서에 추가로 연결 또는 접합된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 표적화 기에 접합 또는 연결된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 ccRCC 세포에 생체내 전달하기 위한 조성물이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 및/또는 표적화 기는 1개 이상의 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알파-v-베타-3 및/또는 알파-v-베타-5 인테그린 표적화 리간드에 연결된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 ccRCC 세포에 생체내 전달하기 위한 조성물이 기재된다.
일부 실시양태에서, 표 1의 서열을 갖는 HIF-2 알파 mRNA의 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 표 2 또는 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 서열 중 임의의 것을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 서열 중 임의의 것을 포함하는 센스 가닥, 및 센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 표 2 또는 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 세포에서 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 표 5에 제시된 듀플렉스의 듀플렉스 구조를 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 (서열식별번호: 1) 상의 특이적 위치를 표적화하도록 설계된다. 본원에 정의된 바와 같이, 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 유전자와 염기 쌍형성할 때 유전자 상의 위치로부터 (3' 단부를 향해) 19개 뉴클레오티드 하류인 위치와 정렬된 경우에 유전자 상에 주어진 위치에서 HIF-2 알파 유전자를 표적화하도록 설계된다. 예를 들어, 본원의 표 1 및 2에 예시된 바와 같이, 위치 5033에서 HIF-2 알파 유전자를 표적화하도록 설계된 안티센스 가닥 서열은 유전자와 염기 쌍형성할 때 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 위치 5051과 정렬되는 것을 필요로 한다.
본원에 제공된 바와 같이, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥 및 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재하는 한, 안티센스 가닥의 위치 1의 핵염기 (5' → 3')가 유전자에 대해 상보적일 것을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, HIF-2 알파 유전자의 위치 5033을 표적화하도록 설계된 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우에, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 유전자의 위치 5051과 정렬되어야 하지만; 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥 및 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재하는 한, 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 HIF-2 알파 유전자의 위치 5051에 대해 상보적일 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 특히, 본원에 개시된 예에 의해 제시된 바와 같이, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥에 의한 유전자의 특이적 결합 부위 (예를 들어, HIF-2 알파 RNAi 작용제가 위치 5033 또는 일부 다른 위치에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자를 표적화하도록 설계되는지 여부)는 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 의해 달성되는 억제 수준에 중요하다.
기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 RNA 간섭을 매개하여 HIF-2 알파 단백질의 생산에 필요한 1종 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. HIF-2 알파 RNAi 작용제는 또한 ccRCC를 포함한 다양한 질환, 장애, 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 또한, ccRCC 세포에 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 전달하기 위한 조성물이 기재된다.
1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 진피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통함), 및 실질내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 본원에 기재된 조성물은 키트, 용기, 팩, 분배기, 사전-충전된 시린지, 주입 백, 또는 바이알 내에 포장된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 비경구로 투여된다.
각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 16 내지 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나, 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17 내지 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17-21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21-26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21-24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 19개 뉴클레오티드 길이인 한편, 안티센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이인 한편, 안티센스 가닥은 약 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 뉴클레오티드 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 듀플렉스 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 완벽한, 실질적 또는 부분적 상보성 영역은 16-26개 (예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개) 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥의 5' 단부에서 또는 그 부근에서 발생한다 (예를 들어, 이러한 영역은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 완벽하게, 실질적으로 또는 부분적으로 상보적이지 않은 0, 1, 2, 3, 또는 4개 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있음).
센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 16 내지 23개 뉴클레오티드 길이의 코어 스트레치 (또한 본원에서 "코어 서열" 또는 "코어 스트레치 서열"로도 지칭됨)를 함유한다. 안티센스 가닥 코어 스트레치는 HIF-2 알파 (EPAS1) mRNA 표적 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열 (때때로, 예를 들어, 표적 서열로 지칭됨)에 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이다. 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열에 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이고, 따라서 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 HIF-2 알파 mRNA 표적 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열 (표적 서열)과 전형적으로 완벽하게 동일하거나 또는 적어도 약 85% 동일하다. 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 상응하는 안티센스 코어 서열과 길이가 동일할 수 있거나, 또는 길이가 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제를 형성하는데 사용된 뉴클레오티드 서열의 예가 표 2, 3, 및 4 (뿐만 아니라 4.1, 4.2, 및 4.3)에 제공된다. 표 2, 3, 및 4의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는 RNAi 작용제 듀플렉스의 예가 표 5에 제시된다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 듀플렉스를 형성한다. HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적일 수 있다. 상보적 듀플렉스 영역 내에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 코어 스트레치 서열에 대해 적어도 85% 상보적 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 상응하는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 서열에 적어도 85% 또는 100% 상보적인 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개 뉴클레오티드의 서열을 함유한다 (예를 들어, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 코어 스트레치 서열은 적어도 85%의 염기가 쌍을 이루거나 또는 100%의 염기가 쌍을 이룬 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개 뉴클레오티드의 영역을 가질 수 있음).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 임의로 및 독립적으로 코어 스트레치 서열의 3' 단부, 5' 단부, 또는 3' 및 5' 단부 둘 다에 추가의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 (연장부)를 함유할 수 있다. 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는, 존재하는 경우, HIF-2 알파 mRNA 내의 상응하는 서열에 대해 상보적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는, 존재하는 경우, HIF-2 알파 mRNA 내의 상응하는 서열과 동일할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 존재하는 경우의 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우의 상응하는 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 연장부는 센스 가닥 코어 스트레치 서열 및/또는 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 5' 및/또는 3' 단부에 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 반대로, 안티센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다 3' 및 5' 연장부를 함유한다. 일부 실시양태에서, 하나의 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 다른 가닥의 1개 이상의 5' 연장부와 염기 쌍을 이룬다. 다른 실시양태에서, 하나의 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 다른 가닥의 1개 이상의 5' 연장부와 염기 쌍을 이루지 않는다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥 및 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 연장부 뉴클레오티드(들)는 쌍을 이루지 않고, 오버행을 형성한다. 본원에 사용된 "오버행"은 본원에 개시된 RNAi 작용제의 혼성화 또는 듀플렉스화 부분의 일부를 형성하지 않는, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단 단부에 위치하는 1개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 스트레치를 지칭한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 HIF-2 알파 mRNA 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 HIF-2 알파 mRNA 서열에 대해 상보적이지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3' 단부는 무염기성 잔기 (Ab)를 포함할 수 있고, 이는 또한 "무염기성 부위" 또는 "무염기성 뉴클레오티드"를 지칭할 수 있다. 무염기성 잔기 (Ab)는 당 모이어티의 1' 위치에서 핵염기가 결여된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,998,203 참조, 이는 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 무염기성 잔기는 뉴클레오티드 서열에서 내부에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 3' 단부에 Ab 또는 AbAb가 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 단부는 1개 이상의 추가의 무염기성 잔기 (예를 들어, (Ab) 또는 (AbAb))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, UUAb, UAb, 또는 Ab는 센스 가닥의 3' 단부에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 "말단 캡"을 포함할 수 있고, 이는, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 RNAi 작용제의 가닥의 1개 이상의 말단에 혼입될 수 있고, 일부 경우에, RNAi 작용제에 특정의 유익한 특성, 예컨대 예를 들어, 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공할 수 있는 비-뉴클레오티드 화합물 또는 다른 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 말단 캡으로서 첨가된다 (표 7 참조). (예를 들어, 문헌 [F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16] 참조). 말단 캡은 일반적으로 관련 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 역전된 무염기성 잔기, 뿐만 아니라 탄소 쇄 예컨대 말단 C3H7 (프로필), C6H13 (헥실), 또는 C12H25 (도데실) 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 캡은 센스 가닥의 5' 말단 단부, 3' 말단 단부, 또는 5' 및 3' 말단 단부 둘 다에 존재한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 3' 단부는 추가의 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 말단 캡을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 3' 단부에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 단부에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에서 또는 그 근처에서 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 단부에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에서 또는 그 근처에서 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 역전된 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 3' 단부, 또는 안티센스 가닥 서열의 3' 단부는 역전된 무염기성 잔기 (invAb (표 7 참조))를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 아데노신, 우라실, 또는 티미딘 뉴클레오티드, AT 디뉴클레오티드, 또는 HIF-2 알파 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 센스 가닥 연장부는 하기 서열 중 하나를 포함하거나 그로 이루어지지만, 이에 제한되지는 않는다: T, UT, TT, UU, UUT, TTT, 또는 TTTT (각각 5'에서 3'로 열거됨).
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장부 뉴클레오티드 중 1개 이상은 HIF-2 알파 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 5' 연장부는 하기 서열 중 하나이지만, 이에 제한되지는 않는다: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U, UU (각각 5'에서 3'로 열거됨). 센스 가닥은 3' 연장부 및/또는 5' 연장부를 가질 수 있다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제를 형성하는데 사용된 서열의 예가 표 2, 3, 및 4, 4.1, 4.2, 및 4.3에 제공된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17, 2-15, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 또는 2-21의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 4의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 2-19, 2-20, 2-21, 3-20, 3-21, 또는 4-21의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 단부 및 안티센스 가닥 3' 단부는 평활 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 단부 및 안티센스 가닥 5' 단부는 평활 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양쪽 단부는 평활 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느쪽 단부도 평활 단부가 아니다. 본원에 사용된 "평활 단부"는 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인 (상보적 염기 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 단부를 지칭한다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 단부 및 안티센스 가닥 3' 단부는 풀린 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 단부 및 안티센스 가닥 5' 단부는 풀린 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양쪽 단부는 풀린 단부를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느쪽 단부도 풀린 단부가 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 풀린 단부는 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지만 (오버행을 형성하지 않지만) 상보적이지는 않은 (비-상보적 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 단부를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 하나의 가닥의 단부의 1개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 오버행을 형성한다. 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 있어, 3' 또는 5' 오버행을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 평활 단부 및 풀린 단부, 평활 단부 및 5' 오버행 단부, 평활 단부 및 3' 오버행 단부, 풀린 단부 및 5' 오버행 단부, 풀린 단부 및 3' 오버행 단부, 2개의 5' 오버행 단부, 2개의 3' 오버행 단부, 5' 오버행 단부 및 3' 오버행 단부, 2개의 풀린 단부, 또는 2개 평활 단부를 함유한다. 전형적으로, 존재하는 경우, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 3' 말단 단부에 위치한다.
변형된 뉴클레오티드는, 다양한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 구축물에서 사용될 때, 세포 내에서 화합물의 활성을 보존하면서 동시에 이러한 화합물의 혈청 안정성을 증가시킬 수 있고, 또한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 구축물의 투여 시 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 염, 혼합 염, 또는 유리 산으로서 제조되거나 제공된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 나트륨 염으로서 제조된다. 관련 분야에 널리 공지되어 있는 이러한 형태들은 본원에 개시된 발명의 범주 내이다.
정의
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 각각 독립적으로 변형되거나 또는 비변형될 수 있는 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
본원에 사용된 "RNAi 작용제" (또한 "RNAi 촉발제"로도 지칭됨)는 서열 특이적 방식으로 표적 메신저 RNA (mRNA)인 mRNA 전사체를 분해하거나 또는 그의 번역을 억제할 수 있는 (예를 들어, 적절한 조건 하에 그를 분해하거나 또는 그의 번역을 억제하는) RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘 (예를 들어, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도 침묵화 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도하는 것에 의함)을 통해, 또는 임의의 대안적인 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제가, 이러한 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정 경로 또는 메카니즘에 의해 구속되거나 또는 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은 (또는 소형) 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA (HIF-2 알파 mRNA)에 대해 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 주어진 유전자의 발현을 언급할 때의 용어 "침묵시킨다", "감소시킨다", "억제한다", "하향-조절한다" 또는 "녹다운시킨다"는 유전자가 전사되는 세포, 세포 군, 조직, 기관, 또는 대상체 내의 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된 바와 같은 유전자 발현이 세포, 세포 군, 조직, 기관, 또는 대상체가 본원에 기재된 RNAi 작용제로 처리될 때 이렇게 처리되지 않은 제2 세포, 세포 군, 조직, 기관, 또는 대상체와 비교하여 감소된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 표준 명명법을 사용하여 일련의 문자로 기재된, 일련의 또는 연속된 핵염기 또는 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 "염기", "뉴클레오티드 염기", 또는 "핵염기"는 뉴클레오티드의 성분인 헤테로시클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이고, 1차 퓨린 염기인 아데닌 및 구아닌, 및 1차 피리미딘 염기인 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 핵염기는, 비제한적으로, 보편적 염기, 소수성 염기, 혼잡 염기, 크기-확장 염기, 및 플루오린화 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008] 참조). 이러한 변형된 핵염기 (변형된 핵염기를 포함하는 포스포르아미다이트 화합물 포함)의 합성은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은, 제1 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 센스 가닥 또는 표적화된 mRNA)을 제2 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 안티센스 가닥 또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 기재하기 위해 사용할 때, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 표준 조건 하에 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하고 (포유동물의 생리학적 조건 (또는 시험관내 유사한 조건) 하에 염기 쌍 수소 결합을 형성하고), 듀플렉스 또는 이중 나선 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 적어도 상기 혼성화 요건이 충족되는 한, 상보적 서열은 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기 쌍을 포함하고, 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형에 독립적이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 a 및 Af는 U (또는 T)에 대해 상보적이고, 동일성 또는 상보성을 결정하기 위한 목적으로 A와 동일하다.
본원에 사용된 "완벽하게 상보적" 또는 "완전히 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 모든 (100％) 염기가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열 모두 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "부분적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아니라 그의 적어도 70%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열 모두 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아니라 그의 적어도 85%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열 모두 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보적", "완전히 상보적", "부분적으로 상보적", 및 "실질적으로 상보적"은 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 HIF-2 알파 (EPAS1) mRNA의 서열 사이의 핵염기 또는 뉴클레오티드 매칭에 관련하여 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열에 적용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"은 뉴클레오티드 서열 (또는 뉴클레오티드 서열의 부분)이 참조 서열과 비교하여 적어도 약 85% 서열 동일성 또는 그 초과, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 서열 동일성의 백분율은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 비교함으로써 결정된다. 백분율은 동일한 유형의 핵산 염기가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본원에 개시된 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 완화 또는 그의 수, 중증도 및/또는 빈도의 경감을 제공하도록 취해지는 방법 또는 단계를 의미한다. 본원에 사용된 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서의 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 방지적 치료, 관리, 예방적 치료, 및/또는 억제 또는 감소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포 내로 도입하는"은, RNAi 작용제를 언급할 때, RNAi 작용제를 세포 내로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. "기능적 전달"은 RNAi 작용제가 예상되는 생물학적 활성, 예를 들어, 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 가질 수 있게 하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포로 전달하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 분자식이 동일하지만 그의 원자의 성질 또는 결합 순서 면에서 또는 공간 내에서의 그의 원자의 배열 면에서 상이한 화합물을 지칭한다. 공간 내에서의 그의 원자의 배열 면에서 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 명명된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 명명되고, 비-중첩가능한 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체", 또는 때때로 광학 이성질체로 명명된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정한 입체형태를 갖는 것으로 구조 면에서 구체적으로 확인되지 않는 한, 비대칭 중심이 존재하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 다른 입체이성질체 형상을 발생시키는 각각의 구조에 대해, 본원에 개시된 각각의 구조는 그의 광학적으로 순수한 형태 및 라세미 형태를 포함하여 모든 이러한 가능한 이성질체를 나타내도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 구조는 부분입체이성질체, 뿐만 아니라 단일 입체이성질체의 혼합물을 포괄하도록 의도된다.
본원의 청구범위에 사용된 바와 같이, 어구 "로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에서 사용될 때, 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 화합물 및 조성물이, 화합물 또는 조성물이 놓이는 환경에 따라, 양성자화 또는 탈양성자화 상태의 특정 원자 (예를 들어, N, O, 또는 S 원자)를 가질 수 있다는 것을 쉽게 이해하고 인지할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대 예를 들어, OH, SH, 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있는 것으로 생각된다. 본원의 개시내용은, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 이해할 바와 같이, 개시된 화합물 및 조성물을 환경 (예컨대 pH)에 기초한 그의 양성자화 상태와 관계 없이 포괄하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 화합물 또는 분자 사이의 연결을 언급할 때의 용어 "연결된" 또는 "접합된"은 2개의 분자가 공유 결합에 의해 연결되거나 또는 비공유 결합 (예를 들어, 수소 결합 또는 이온 결합)을 통해 회합된다는 것을 의미한다. 일부 예에서, 용어 "연결된" 또는 "접합된"이 비공유 결합을 통한 2개의 분자 사이의 회합을 지칭하는 경우에, 2개의 상이한 분자 사이의 회합은 생리학상 허용되는 완충제 (예를 들어, 완충 염수) 중에서 1 x 10-4 M 미만 (예를 들어, 1 x 10-5 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 또는 1 x 10-7 M 미만)의 KD를 갖는다. 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "연결된" 및 "접합된"은 임의의 개재 원자 또는 원자 군의 존재 또는 부재 하의 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연결을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 연결기는 하나의 분자 또는 분자의 부분을 또 다른 내지 제2 분자 또는 제2 분자의 부분에 연계시키는 1개 이상의 원자이다. 유사하게, 관련 기술분야에 사용되는 용어 스캐폴드가 때때로 연결기와 상호교환가능하게 사용된다. 연결기는 임의의 수의 원자 또는 관능기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 임의의 생물학적 또는 제약 반응을 용이하게 하지 않을 수 있고, 단지 2개의 생물학적 활성 분자를 연결하는 역할을 할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
Figure pct00001
의 사용은 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따른 임의의 기 또는 기들이 그에 연결될 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 본원에서 어구 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미하는 것으로 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "또는"은, 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 본원에서 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
본원의 청구범위에 사용된 어구 "로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에서 사용될 때, 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
변형된 뉴클레오티드
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-변형된 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드, 변형된 핵염기-포함 뉴클레오티드, 가교 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비-잠금 핵염기 유사체), 잠금 뉴클레오티드, 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 시클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (즉, 5-원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'O메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드 (또한 본원에서 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡실에틸) 뉴클레오티드 (또한 2'-MOE로도 지칭됨), 2'-아미노 뉴클레오티드, 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 단일 HIF-2 알파 RNAi 작용제에서 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에서 하나를 초과하는 변형이 혼입될 수 있다. HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성되고/거나 변형될 수 있다. 하나의 뉴클레오티드에서의 변형은 또 다른 뉴클레오티드에서의 변형에 독립적이다.
변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, (예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 (예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬 (예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-술프히드릴, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (예를 들어, 5-브로모), 5-트리플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드를 나타내는 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 4개 이하 (0, 1, 2, 3, 또는 4개)의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 (비변형된 것)인 RNAi 작용제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 존재하는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 센스 가닥은 센스 가닥 내의 2개 이하 (0, 1, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 센스 가닥이다. 본원에 사용된 바와 같이, 존재하는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 센스 가닥 내의 2개 이하 (0, 1, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 안티센스 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비변형된 리보뉴클레오티드이다.
본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 생체내 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 전달을 용이하게 하기 위해 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 내부 뉴클레오티드 상에서 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 1개 이상의 PK 인핸서에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 PK 인핸서는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 1개 이상의 내부 뉴클레오티드에 연결 또는 접합된다. 예를 들어, 표적화 리간드는 리보스 고리의 2' 위치, 리보스 고리의 3' 위치, 리보스 고리의 1' 위치에서 개별 뉴클레오티드에, 또는 뉴클레오티드의 핵염기, 리보스 고리의 4' 위치, 뉴클레오티드의 5' 위치에, 또는 리보스 고리 상의 산소 원자에 연결될 수 있다. 하기는 탄소가 넘버링된 가설 리보스 뉴클레오티드를 도시한다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 내부 뉴클레오티드에의 1개 이상의 표적화 리간드의 연결을 용이하게 하기 위해, 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열에 혼입된다 (예를 들어, 표 7 및 표 4, 4.1, 4.2, 및 4.3 참조). 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드는, 각각의 가닥의 합성 후에, 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 표준 커플링 기술을 사용하여 2' 위치에서 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서에 연결 또는 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표적화 리간드 또는 표적화 기에의 연결을 용이하게 하기 위해 센스 가닥 내에 적어도 1개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 내부 뉴클레오티드에, 각각 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 10개 초과의 표적화 리간드 및/또는 표적화 기에의 연결을 용이하게 하기 위해, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 10개 초과의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 합성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 1개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 2개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 3개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 4개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 5개의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥 내에 5개 초과의 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 갖도록 합성될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비-표준 연결 또는 백본 (예를 들어, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 변형된 백본)에 의해 연결된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 포스포로티오에이트 기 (본원에서 소문자 "s"로 나타내어짐), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5' → 5'-3' 또는 2'-5' → 5'-2' 연결된 역극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 인 원자가 결여된다. 인 원자가 결여된 변형된 뉴클레오시드간 연결은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 당간 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 백본은 실록산 백본, 술피드 백본, 술폭시드 백본, 술폰 백본, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 알켄-함유 백본, 술파메이트 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 아미드 백본, 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분을 갖는 다른 백본을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 3' 단부로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 5' 단부에 있고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 단부에 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 5' 단부에 위치하고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 단부에 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 사이에 어떠한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결도 포함하지 않지만, 5' 및 3' 단부 둘 다의 말단 뉴클레오티드 및 임의로 존재하는 역전된 무염기성 잔기 말단 캡 사이에 1, 2, 또는 3개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 센스 가닥에 연결된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드 사이 및 5' 단부로부터 위치 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25, 또는 24-26의 뉴클레오티드 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 1-4 사이에 위치하고, 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 위치 20-21 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 내의 적어도 3 또는 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드간 연결과 조합된다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 HIF-2 알파 유전자를 표 1에 제시된 HIF-2 알파 유전자 서열의 위치에서 또는 그 근처에서 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 1에 개시된 표적 HIF-2 알파 19량체 서열에 완전히, 실질적으로 또는 적어도 부분적으로 상보적인 코어 스트레치 서열을 포함한다.
표 1. HIF-2 알파 19량체 mRNA 표적 서열 (호모 사피엔스(homo sapiens) 내피 PAS 도메인 단백질 1 (EPAS1 또는 HIF-2 알파) 전사체, 진뱅크(GenBank) NM_001430.4 (서열식별번호: 1)로부터 취함)
Figure pct00003
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 19가 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 1과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 1이 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 19와 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2가 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2 내지 18이 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18 내지 2에 위치하는 각각의 상보적인 염기 각각과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
본원에 개시된 RNAi 작용제에 대해, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 HIF-2 알파 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 HIF-2 알파 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 센스 가닥은 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17, 1-18, 또는 2-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 표 2에 제시된 코어 19량체 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 2. HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 코어 스트레치 염기 서열 (N=임의의 핵염기)
Figure pct00004
표 2의 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2의 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 센스 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 모두 또는 실질적으로 모두 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, 표 2에 개시된 서열에서 열거된 각각의 N은 임의의 및 모든 핵염기 (변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 둘 다에서 발견되는 것 포함)로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에서 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치의 N 뉴클레오티드에 대해 상보적인 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에서 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치의 N 뉴클레오티드에 대해 상보적이지 않은 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에서 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치의 N 뉴클레오티드와 동일한 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에서 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치의 N 뉴클레오티드와 상이한 핵염기를 갖는다.
특정 변형된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 3에 제공된다. 특정 변형된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 4에 제공된다 (뿐만 아니라 4.1, 4.2, 및 4.3에 반영됨). HIF-2 알파 RNAi 작용제의 형성에서, 표 3 및 4, 뿐만 아니라 상기 표 2에 열거된 각각의 기저 염기 서열 내의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링시킴으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥과 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열은 인접 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 2, 표 3, 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 서열 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 핵염기 서열을 갖는 듀플렉스를 포함하거나 그로 이루어진다.
변형된 뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥의 예가 표 3에 제공된다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 센스 가닥의 예가 표 4에 제공된다.
표 3 및 4 및 4.1, 4.2, 및 4.3에 사용된 바와 같이, 하기의 표기법이 변형된 뉴클레오티드, 표적화 기, 및 연결기를 나타내는데 사용된다:
A = 아데노신-3'-포스페이트;
C = 시티딘-3'-포스페이트;
G = 구아노신-3'-포스페이트;
U = 우리딘-3'-포스페이트
I = 이노신-3'-포스페이트
a = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트
as = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트
c = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트
cs = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트
g = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트
gs = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스포로티오에이트
t = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스페이트
ts = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
u = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트
us = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
i = 2'-O-메틸이노신-3'-포스페이트
is = 2'-O-메틸이노신-3'-포스포로티오에이트
Af = 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트
Afs = 2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트
Cf = 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트
Cfs = 2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트
Gf = 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트
Gfs = 2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트
Tf = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스페이트
Tfs = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Uf = 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트
Ufs = 2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트
dA = 2'-데옥시아데노신-3'-포스페이트
dAs = 2'-데옥시아데노신-3'-포스포로티오에이트
dC = 2'-데옥시시티딘-3'-포스페이트
dCs = 2'-데옥시시티딘-3'-포스포로티오에이트
dG = 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트
dGs = 2'-데옥시구아노신-3'-포스포로티오에이트
dT = 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트
dTs = 2'-데옥시티미딘-3'-포스포로티오에이트
dU = 2'-데옥시우리딘-3'-포스페이트
dUs = 2'-데옥시우리딘-3'-포스포로티오에이트
AUNA = 2',3'-세코-아데노신-3'-포스페이트
AUNAs = 2',3'-세코-아데노신-3'-포스포로티오에이트
CUNA = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스페이트
CUNAs = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스포로티오에이트
GUNA = 2',3'-세코-구아노신-3'-포스페이트
GUNAs = 2',3'-세코-구아노신-3'-포스포로티오에이트
UUNA = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스페이트
UUNAs = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스포로티오에이트
aAlk = 2'-O-프로파르길아데노신-3'-포스페이트, 표 7 참조
aAlks = 2'-O-프로파르길아데노신-3'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
cAlk = 2'-O-프로파르길시티딘-3'-포스페이트, 표 7 참조
cAlks = 2'-O-프로파르길시티딘-3'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
gAlk = 2'-O-프로파르길구아노신-3'-포스페이트, 표 7 참조
gAlks = 2'-O-프로파르길구아노신-3'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
tAlk = 2'-O-프로파르길-5-메틸우리딘-3'-포스페이트, 표 7 참조
tAlks = 2'-O-프로파르길-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
uAlk = 2'-O-프로파르길우리딘-3'-포스페이트, 표 7 참조
uAlks = 2'-O-프로파르길우리딘-3'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
a_2N = 표 7 참조
a_2Ns = 표 7 참조
(invAb) = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드, 표 7 참조
(invAb)s = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'-포스포로티오에이트, 표 7 참조
s = 포스포로티오에이트 연결
(C6-SS-Alk) = 표 7 참조
(C6-SS-C6) = 표 7 참조
(C3-SS-C3) = 표 7 참조
(6-SS-6) = 표 7 참조
(NH2-C6) = 표 7 참조
(C6-NH2) = 표 7 참조
(TriAlk#) = 표 7 참조
(TriAlk#)s = 표 7 참조
관련 분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해할 바와 같이, 서열에 의해 (예컨대, 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결 "s"에 의해) 달리 나타내지 않는 한, 올리고뉴클레오티드 내에 존재할 때, 뉴클레오티드 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 분명하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다. 추가로, 관련 분야의 통상의 기술자는 주어진 올리고뉴클레오티드 서열의 3' 단부의 말단 뉴클레오티드가 주어진 단량체의 각각의 3' 위치에 생체외 포스페이트 모이어티 대신 히드록실 (-OH) 기를 전형적으로 가질 것임을 용이하게 이해할 것이다. 추가적으로, 본원에 개시된 실시양태의 경우, 각각의 가닥 5' → 3'를 보았을 때, 역전된 무염기성은 데옥시리보스의 3' 위치가 각각의 가닥의 선행 단량체의 3' 단부에서 연결되도록 삽입된다. 또한, 통상의 기술자가 용이하게 이해하고 인식할 바와 같이, 본원에 도시된 포스포로티오에이트 화학 구조는 전형적으로 황 원자 상에 음이온을 나타내는 한편, 본원에 개시된 발명은 모든 포스포로티오에이트 호변이성질체 (예를 들어, 황 원자가 이중-결합을 갖고, 음이온이 산소 원자 상에 있는 경우)를 포괄한다. 본원에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 관련 분야의 통상의 기술자의 이러한 이해가 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 및 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 조성물을 기재할 때 사용된다.
본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제와 함께 사용된 연결기의 특정의 구체적 예가 하기 표 7에 제공된다. 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결 또는 접합될 수 있는 표적화 리간드 및/또는 표적화 기, 및 PK 인핸서의 특정 예가 또한 본원에 개시된다. 예를 들어, 특정의 예시적인 PK 증진 화합물이 하기 표 6에 제공된다. 추가로, 일부 실시양태에서, PK 인핸서는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 3' 말단 단부에 위치할 수 있다.
연결기는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 그의 화학 구조는 하기 표 7에 제공된다: (NH2-C6), (C6-NH2), (C6-SS-C6), (6-SS-6), (TriAlk1), (TriAlk1)s, (TriAlk2), (TriAlk2)s, (TriAlk3), (TriAlk3)s, (TriAlk4), (TriAlk4)s, (TriAlk5), (TriAlk5)s, (TriAlk6), (TriAlk6)s, (TriAlk7), (TriAlk7)s, (TriAlk8), (TriAlk8)s, (TriAlk9), (TriAlk9)s, (TriAlk10), (TriAlk10)s, (TriAlk11), (TriAlk11)s, (TriAlk12), (TriAlk12)s, (TriAlk13), (TriAlk13)s, (TriAlk14), 또는 (TriAlk14)s. 각각의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 서열의 5' 및/또는 3' 단부에 접합된, 본원에 열거된 임의의 표적화 리간드 또는 표적화 기, 연결기, 및/또는 PK 인핸서, 뿐만 아니라 다른 표적화 리간드/기, 다른 연결기, 및/또는 다른 PK 인핸서를 가질 수 있다.
표 3. HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
표 4. HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
상기 표 4에 제시된 바와 같이, 많은 예시적인 HIF-2 알파 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부, 3' 말단 단부, 또는 5' 및 3' 말단 단부 둘 다에 반응성 연결기를 추가로 포함하는 것으로 제시된다. 예를 들어, 상기 표 4에 제시된 몇몇 HIF-2 알파 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 (NH2-C6) 연결기 또는 (TriAlk) 연결기를 갖는다. 유사하게, 상기 표 4에 제시된 HIF-2 알파 뉴클레오티드 서열 중 몇몇은 뉴클레오티드 서열의 3' 단부에 (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 연결기를 갖는다. 이러한 반응성 연결기는 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 대한 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서의 연결을 용이하게 하도록 위치한다. 연결 또는 접합 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원의 본 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 접합 반응은 아미드 커플링 반응, 마이클 첨가 반응, 히드라존 형성 반응 및 클릭 화학 고리화첨가 반응을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르로서 합성될 수 있고, 표적화 리간드를 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 부착시키기 위해 이는 반응성 아미노 기 (예를 들어, NH2-C6)에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 아지드로서 합성되며, 이는 예를 들어 클릭 화학 고리화첨가 반응을 통해 프로파르길 또는 DBCO 기에 접합될 수 있다.
추가적으로, 뉴클레오티드 서열 중 몇몇은 센스 가닥의 3' 말단 단부에서 dT 뉴클레오티드에 이어 (3' → 5') 링커 (예를 들어, C6-SS-C6)를 갖도록 합성되었고, 이는 일부 실시양태에서 추가의 성분, 예컨대 예를 들어, PK 인핸서 또는 1개 이상의 표적화 리간드에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 수지로부터 절단된 후에 사용될 수 있다. 이러한 방식의 합성은 수지에 부착된 dT, 이어서 링커 및 센스 가닥의 나머지 뉴클레오티드의 커플링을 수반한다. 본원에 기재된 바와 같이, 목적하는 PK 인핸서 (또는 표적화 리간드(들))의 접합 시, 말단 dT는 분자로부터 절단된다. 하기 표 4.1은 상기 표 4에서 확인되지만 3' 말단 dT 뉴클레오티드는 포함되지 않은 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
추가로, 하기 표 4.2는 상기 표 4에서 확인되지만 말단 연결기가 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
표 4.1. 3' 말단 dT 없이 제시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00021
Figure pct00022
표 4.2. 말단 연결기 없이 제시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
본원에 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 PK 인핸서가 RNAi 작용제에 연결 또는 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 (또는 표적화 기) 및/또는 PK 인핸서는 센스 가닥의 5' 단부, 센스 가닥의 3' 단부, 및/또는 1개 이상의 내부 뉴클레오티드에 연결된다. 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 합성은 반응성 기가 추가의 성분, 예컨대 표적화 리간드 또는 PK 인핸서에 대한 연결을 용이하게 하는데 용이하게 이용가능하도록 설계될 수 있다. 하기 표 4.3은 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 PK 인핸서 (집합적으로 Z로서 하기 제시됨)에 연결된 후의 표 4에 상기 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥을 도시한다.
표 4.3. 표적화 리간드 및/또는 PK 인핸서 위치를 보여주는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
(각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)이고; (Z)3 = 3개의 연결된 리간드 (예를 들어, 세자리 표적화 기)이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서)를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타낸다 (이는 본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성됨).
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링시킴으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4 (또는 4.1, 4.2, 또는 4.3)에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥과 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열은 인접 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24, 또는 2-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17, 2-17, 3-17, 4-17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4-19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21, 4-21, 1-22, 2-22, 3-22, 4-22, 1-23, 2-23, 3-23, 4-23, 1-24, 2-24, 3-24, 또는 4-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 HIF-2 알파 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 HIF-2 알파 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT (또는 그의 변형된 버전)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 단부에서 → 3' 단부)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 센스 가닥은 표 2 또는 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2 또는 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 단부에서 → 3' 단부) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
표 2 또는 표 4에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥과 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열은 인접 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖는다. 특정의 대표적인 서열 쌍이 표 5에 제시된 듀플렉스 식별 번호(Duplex ID No.)에 의해 예시된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 식별 번호 중 어느 하나에 의해 나타내어지는 듀플렉스를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것에 의해 나타내어지는 듀플렉스 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것에 의해 나타내어지는 듀플렉스 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 및 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 연결기를 포함하며, 여기서 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다 (접합된다). 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열 및 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 연결기를 포함하며, 여기서 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 2 또는 표 5의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 표적화 기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 5의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 수용체 리간드 표적화 기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 5의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각 표 7에 정의된 바와 같은 (NH2-C6), (C6-NH2), (C6-SS-C6), (6-SS-6), (TriAlk1), (TriAlk1)s, (TriAlk2), (TriAlk2)s, (TriAlk3), (TriAlk3)s, (TriAlk4), (TriAlk4)s, (TriAlk5), (TriAlk5)s, (TriAlk6), (TriAlk6)s, (TriAlk7), (TriAlk7)s, (TriAlk8), (TriAlk8)s, (TriAlk9), (TriAlk9)s, (TriAlk10), (TriAlk10)s, (TriAlk11), (TriAlk11)s, (TriAlk12), (TriAlk12)s, (TriAlk13), (TriAlk13)s, (TriAlk14), 또는 (TriAlk14)s로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 연결기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 3 또는 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 5의 듀플렉스 중 임의의 것의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 표적화 기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 표 5의 듀플렉스 중 임의의 것을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
표 5. 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 식별 번호를 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서에 임의로 연결되거나 접합되기 전 또는 후에, 염, 혼합 염 또는 유리-산으로서 제조되거나 제공된다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는, HIF-2 알파 유전자를 발현하는 세포로 전달되면, 생체내 및/또는 시험관내에서 1종 이상의 HIF-2 알파 유전자의 발현을 억제하거나 녹다운시킨다.
표적화 리간드 및 표적화 기
표적화 기 또는 표적화 모이어티는 그것이 부착된 접합체 또는 RNAi 작용제의 약동학 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체 또는 RNAi 작용제의 세포-특이적 (일부 경우에, 기관 특이적 포함) 분포 및 세포-특이적 (또는 기관 특이적) 흡수를 개선시킨다. 표적화 기는 지시되는 표적에 대해 1가, 2가, 3가, 4가일 수 있거나, 또는 더 높은 결합가를 가질 수 있다. 대표적인 표적화 기는, 비제한적으로, 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커, 예컨대 PEG 링커, 또는 일부 경우에 링커로서의 역할을 할 수 있는 1, 2, 또는 3개의 무염기성 및/또는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기를 사용하여 RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 인테그린 표적화 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제는 표적화 기에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 관심 세포 상의 특정한 세포 수용체에 결합하는 RNAi 작용제의 능력을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제에 접합된 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 표적화 리간드는 인테그린 알파-v-베타 3, 인테그린 알파-v-베타-5, 또는 이들 인테그린 둘 다에 대해 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 화학식:
Figure pct00050
의 화합물을 포함하는 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 연결되며,
여기서
X는 -C(R3)2-, -NR3-,
Figure pct00051
이고;
Y는 알킬렌 쇄에서 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 알킬렌이고;
Z는 O, NR3, 또는 S이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 RNAi 작용제를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 RNAi 작용제를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 RNAi 작용제를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 RNAi 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 구조 중 1개를 포함하는 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 연결되며:
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
여기서
Figure pct00059
는 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 "클릭" 화학 반응을 사용하여 RNAi 작용제에 접합된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 1개 이상의 알킨-함유 기로 관능화되고, 표적화 리간드는 아지드-함유 기를 포함한다. 반응 시, 아지드 및 알킨은 트리아졸을 형성한다. 예시적인 반응식을 하기에 제시하며:
Figure pct00060
,
여기서 TL은 표적화 리간드를 포함하고, RNA는 RNAi 작용제를 포함한다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 초과의 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1-20개의 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 표적화 리간드 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 표적화 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 2개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 또는 3' 단부에서 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 HIF-2 RNAi 작용제의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "두자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 2개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "세자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 3개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "네자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 4개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 또는 5' 단부에 접합된 표적화 기, 및 추가적으로 내부 뉴클레오티드에 접합된 표적화 리간드 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 세자리 표적화 기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 접합되고, 적어도 1개의 표적화 리간드는 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합된다. 추가 실시양태에서, 세자리 표적화 기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 접합되고, 4개의 표적화 리간드는 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 4개의 표적화 리간드는 센스 가닥의 2, 4, 6, 및 8 뉴클레오티드 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 화학식의 1개 이상의 표적화 기에 연결되며:
Figure pct00061
여기서
Figure pct00062
는 연결 지점을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 연결 지점은 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부이다.
내부적으로 연결된 표적화 리간드
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 일부 실시양태는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합된 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 최대 15개의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 5개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 3 내지 4개의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 접합된다.
일부 실시양태에서, 내부 표적화 리간드의 배치는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 효능 또는 효력에 영향을 미칠 수 있다. HIF-2 알파 RNAi 작용제의 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 5' 단부에 접합되고, 센스 가닥의 5' 단부 상에 위치하는 세자리 표적화 기와 센스 가닥 상에 위치하는 그 다음의 가장 가까운 표적화 리간드 사이에 적어도 10개의 뉴클레오티드가 위치한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 단부 상에 위치하는 세자리 표적화 기와 센스 가닥 상에 위치하는 그 다음의 가장 가까운 표적화 리간드 사이에 적어도 5개의 뉴클레오티드가 위치한다.
2개 이상의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥에 위치하는 내부 뉴클레오티드에 접합된 일부 실시양태에서, 표적화 리간드에 접합된 2개의 내부 뉴클레오티드 사이에 위치하는, 표적화 리간드에 접합되지 않은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 공간이 존재한다. 2개 이상의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합된 일부 실시양태에서, 표적화 리간드에 접합된 2개의 내부 뉴클레오티드 사이에 표적화 리간드에 접합되지 않은 적어도 2개의 뉴클레오티드가 위치한다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 안티센스 가닥 상의 5' 말단 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하는 가장 먼 3' 뉴클레오티드로부터 출발하여 3'에서 5'로 넘버링된 바와 같은 센스 가닥의 2, 4, 및 6 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 안티센스 가닥 상의 5' 말단 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하는 3' 말단 뉴클레오티드로부터의 2, 4, 6 및 8 뉴클레오티드 (3' → 5')에 접합된다.
약동학적 인핸서
일부 실시양태에서, 약동학적 (PK) 인핸서는 목적하는 세포 또는 조직으로의 RNAi 작용제의 전달을 용이하게 하기 위해 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결된다. HIF-2 알파 RNAi 작용제 상의 1개 이상의 링커에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 용이하게 존재하는 반응성 기, 예컨대 말레이미드 또는 아지도 기를 갖는 PK 증진 화합물이 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, PK 인핸서는 말레이미드로서 합성될 수 있고, 본원에 기재된 반응을 사용하여 RNAi 작용제에 접합될 수 있다. 다른 접합 반응, 예컨대 "클릭" 화학 또는 아미드 접합이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, PK 인핸서는 지방산, 지질, 알부민-결합제, 항체-결합제, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트, 폴리-아미노산, 및 약 20-1000개의 에틸렌 옥시드 (CH2-CH2-O) 단위를 갖는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티인 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 RNAi 작용제는 하기 화학식의 구조를 갖는 화합물을 포함하는 PK 인핸서에 연결되며:
Figure pct00063
, 여기서 Y는 임의로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 쇄이고, n은 5-25의 정수이다.
일부 실시양태에서, HIF-2 RNAi 작용제는 하기 구조를 갖는 화합물을 포함하는 PK 인핸서에 연결된다:
Figure pct00064
.
일부 실시양태에서, HIF-2 RNAi 작용제는 하기 구조를 갖는 화합물을 포함하는 PK 인핸서에 연결된다:
Figure pct00065
하기 표 6은 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있는 특정의 예시적인 PK 증진 화합물을 보여준다. PK 증진 화합물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 첨가될 수 있다.
표 6. HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결하기에 적합한 예시적인 PK 인핸서 화합물
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1개 이상의 PK 인핸서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 PK 인핸서를 포함한다.
PK 인핸서는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, PK 인핸서는 말레이미드 모이어티를 포함할 수 있고, 디술피드 연결을 포함하는 RNAi 작용제와 반응하여 PK 인핸서를 포함하는 RNAi 작용제를 형성할 수 있다. 디술피드는 환원될 수 있고, 마이클-첨가 반응에 의해 말레이미드에 첨가될 수 있다. 예시적인 반응식을 하기에 제시하며:
Figure pct00071
여기서 PK는 PK 인핸서를 포함하고, RNA는 RNAi 작용제를 포함하고, R은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기일 수 있다. 상기 반응식의 일부 예에서, R은 알킬 기, 예컨대 헥실 (C6H13)이다.
일부 실시양태에서, PK 인핸서는 아지드 모이어티를 포함할 수 있고, 알킨을 포함하는 RNAi 작용제와 반응하여 PK 인핸서를 포함하는 RNAi 작용제를 형성할 수 있다. 쌍은 하기의 일반적 반응식의 "클릭" 반응을 사용하여 반응할 수 있고:
Figure pct00072
여기서 PK는 PK 인핸서를 포함하고, RNA는 RNAi 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, PK 인핸서는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 단부, 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 단부, 또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 단부에 디술피드-함유 모이어티를 갖도록 합성되고, PK 인핸서는 상기 제시된 일반적 합성 반응식을 사용하여 센스 가닥의 3' 단부에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 2'-O-프로파르길 변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 합성되고 (예를 들어, 표 7 참조), PK 인핸서는 상기 제시된 일반적 합성 반응식을 사용하여 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, PK 인핸서가 RNAi 작용제에 접합된 후에, PK 인핸서는 하기 화학식을 가질 수 있고:
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
여기서
Figure pct00078
는 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
연결기 및 전달 비히클
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 연결기 또는 전달 비히클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 기를 함유하거나 또는 그에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 표적화, 전달, 또는 부착을 증진시킬 수 있다. 연결기의 비제한적 예가 표 7에 제공된다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 단부에 연결된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제에 직접적으로 또는 링커/연결기를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 불안정성, 절단가능성, 또는 가역성 결합 또는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착되는 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 증진시킨다.
5'-말단 및/또는 3'-말단에 반응성 기, 예컨대 아미노 기 (또한 본원에서 아민으로도 지칭됨)를 갖는 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 합성될 수 있다. 반응성 기는 후속해서 관련 기술분야에 전형적인 방법을 사용하여 표적화 모이어티를 부착시키는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 NH2-C6 기를 갖는, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 합성된다. 후속적으로, 말단 아미노 기를 반응시켜, 예를 들어 1개 이상의 인테그린 (인테그린 표적화 리간드) 또는 PK 인핸서에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 1개 이상의 알킨 기를 갖는, 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 합성된다. 후속적으로 말단 알킨 기(들)를 반응시켜, 예를 들어 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 인테그린 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 인테그린 알파-v-베타 3 및/또는 인테그린 알파-v-베타 5에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다. 인테그린 표적화 리간드의 사용은 그의 각각의 표면 상에 각각의 인테그린을 갖는 세포에 대한 세포-특이적 표적화를 용이하게 할 수 있고, 인테그린 표적화 리간드의 결합은 그것이 연결된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 세포, 예컨대 ccRCC 세포 내로의 진입을 용이하게 할 수 있다. 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 3' 및/또는 5' 단부에, 및/또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 내부 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 표적화 리간드 및 표적화 기, 예컨대 인테그린 αvβ3/αvβ5의 제조는, 예를 들어 미국 특허 가출원 번호 62/663,763에 기재되어 있으며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.
본 개시내용의 실시양태는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 ccRCC 세포에 생체내 전달하기 위한 제약 조성물을 포함한다. 이러한 제약 조성물은, 예를 들어 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5에 대해 친화도를 갖는 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 접합된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5에 대해 친화도를 갖는 화합물로 구성된다.
일부 실시양태에서, 연결기를 갖는 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 합성되고, 이는 이어서 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 표적화 리간드, 표적화 기, PK 인핸서, 또는 또 다른 유형의 전달 비히클, 예컨대 전달 중합체에의 공유 연결을 용이하게 할 수 있다. 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥에 연결된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 또는 3' 단부에 접합된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 단부에 접합된다. 연결기의 예는 Alk-SMPT-C6, Alk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-Alk-SS-C6, 및 C6-SS-Alk-Me, 반응성 기 예컨대 1급 아민 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 잔기/뉴클레오티드, 아미노산, 트리알킨 관능화 기, 리비톨, 및/또는 PEG 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커 또는 연결기는 하나의 화학적 기 (예컨대 RNAi 작용제) 또는 관심 절편을 또 다른 화학적 기 (예컨대 표적화 리간드, 표적화 기, PK 인핸서, 또는 전달 중합체) 또는 관심 절편에 1개 이상의 공유 결합을 통해 연결하는 2개의 원자 사이의 이음이다. 불안정성 연결은 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 2개의 결합된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 연결에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 및 아르알키닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않고; 이들 각각은 1개 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 상기 목록은 설명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 추가의 링커를 사용하지 않고 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 용이하게 존재하는 링커를 갖도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2개 이상의 RNAi 작용제는 동일한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2개 이상의 RNAi 작용제는 상이한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결된다.
표 2, 3, 또는 4 (또는 표 4.1, 4.2, 또는 4.3)에 열거된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것은, 변형된 것이든 또는 비변형된 것이든, 3' 및/또는 5' 표적화 기(들), 연결기(들), 및/또는 약동학적 인핸서(들)를 함유할 수 있다. 3' 또는 5' 표적화 리간드, 표적화 기, PK 인핸서, 또는 연결기를 함유하는, 표 3 및 4에 열거되거나 본원의 다른 곳에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 서열 중 임의의 것은 대안적으로 3' 또는 5' 표적화 리간드, 표적화 기, 연결기, 또는 PK 인핸서를 함유하지 않을 수 있거나, 또는 표 6 및 7에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 3' 또는 5' 표적화 리간드, 표적화 기, 연결기, 또는 PK 인핸서를 함유할 수 있다. 표 5에 열거된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 듀플렉스 중 임의의 것은, 변형된 것이든 또는 비변형된 것이든, 표 6 및 7에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표적화 리간드, 표적화 기, 연결기, 또는 PK 인핸서를 추가로 포함할 수 있고, 표적화 기 또는 연결기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 연결기는 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 또는 3' 단부에 합성적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 합성적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제에 접합된 연결기는 트리알킨 연결기일 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 화학식을 갖는 1개 이상의 세자리 표적화 기:
Figure pct00079
또는 그의 제약상 허용되는 염에 연결되며, 여기서
L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로, 임의로 치환된 알킬렌을 포함하는 링커이고;
L4는 임의로 치환된 알킬렌, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 시클로알킬을 포함하는 링커이고;
R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
TL은 표적화 리간드이고;
Y는 O 또는 S이다.
다른 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 하기 표 7에 제시된 바와 같은 TriAlk 1-14 중 어느 하나의 화학식을 갖는 링커를 사용하여 1개 이상의 세자리 표적화 기에 연결된다. 화학식 II의 화합물의 합성 방법은 표제 "Trialkyne Linking Agents and Methods of Use"의 PCT 출원 번호 PCT/US19/18232에 기재되어 있다.
특정의 변형된 뉴클레오티드 및 연결기의 예가 표 7에 제공된다.
표 7. 다양한 변형된 뉴클레오티드 및 연결기를 나타내는 구조
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 TriAlk 14:
Figure pct00093
또는 TriAlk 14s:
Figure pct00094
의 구조를 갖는 링커를 포함하며, 여기서, TL은 (TriAlk14) 또는 (Trialk14)s의 화합물, 및 아지드를 포함하는 표적화 리간드와의 "클릭" 반응의 결과로 표적화 리간드를 포함한다.
대안적으로, 관련 기술분야에 공지된 다른 연결기가 사용될 수 있다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제를 1개 이상의 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK 인핸서에 연결하는 것에 더하여 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 전달 비히클은 RNAi 작용제를 세포 또는 조직에 전달하는데 사용될 수 있다. 전달 비히클은 RNAi 작용제를 세포 또는 조직으로 전달하는 것을 개선시킬 수 있는 화합물이고, 중합체, 예컨대 양친매성 중합체, 막 활성 중합체, 펩티드, 멜리틴 펩티드, 멜리틴-유사 펩티드 (MLP), 지질, 가역적 변형 중합체 또는 펩티드, 또는 가역적 변형 막 활성 폴리아민을 포함하거나 그로 이루어질 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, DPC 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi 작용제는 또한 표적화 기, 지질 (콜레스테롤 및 콜레스테릴 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, DPC (예를 들어, WO 2000/053722, WO 2008/022309, WO 2011/104169, 및 WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141 참조, 이는 각각 본원에 참조로 포함됨), 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수도 있다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 중 1개 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 제약 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 "제약 조성물"은 약리학상 유효량의 활성 제약 성분 (API), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는, 활성 제약 성분 (API, 치료 제품) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 치료 효과를 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공을 보조하고/거나, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 용인성을 보호, 지원 또는 증진시키고/거나, c) 제품 식별을 돕고/거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전반적인 안전성, 유효성, 전달의 임의의 다른 속성을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 또는 불활성 물질이 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 전달 중합체, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 등장화제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 성분은 제약 활성 물질이다. 제약 활성 물질은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등), 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 압타머 및/또는 백신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물은 또한 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 부취제, 삼투압의 변동을 위한 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 공지된 치료 이익을 갖는 다른 작용제를 함유할 수 있다.
제약 조성물은 국부 치료가 바람직한지 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료하고자 하는 부위에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 임의의 방식에 의해, 예컨대, 비제한적으로, 국소 (예를 들어, 경피 패치에 의해), 폐 (예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해, 예컨대 네뷸라이저, 기관내, 비강내에 의한 것 포함), 표피, 경피, 경구 또는 비경구로 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통해), 두개내, 실질내, 척수강내 및 뇌실내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 제약 조성물은 경구로, 예를 들어 정제, 코팅된 정제, 당의정, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장으로, 예를 들어 좌제를 사용하여; 국부로 또는 경피로, 예를 들어 연고, 크림, 겔 또는 용액을 사용하여; 또는 비경구로, 예를 들어 주사액을 사용하여 수행될 수 있다.
주사가능한 사용에 적합한 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아 수, 크레모포르 ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수를 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정적이어야 하며, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입한 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정질 형태, 예를 들어, 수성 미세결정질 현탁액의 형태일 수 있는, 본원에 기재된 임의의 리간드의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포솜 제제 또는 생분해성 중합체 시스템이 또한 관절내 및 안과적 투여 둘 다를 위한 본원에 기재된 임의의 리간드를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
활성 화합물은, 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제와 같이, 체내로부터의 급속 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 리포솜 현탁액이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "약리학상 유효량", "치료 유효량" 또는 간단하게 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 발생시키기 위한 제약 활성제의 양을 지칭한다.
HIF-2 알파 RNAi 작용제를 함유하는 의약이 또한 본 발명의 목적이며, HIF-2 알파 RNAi 작용제를 함유하는 1종 이상의 화합물 및 원하는 경우에 1종 이상의 다른 공지된 치료 이익을 갖는 물질을 제약상 허용되는 형태가 되도록 하는 것을 포함하는, 이러한 의약의 제조 방법도 마찬가지로 본 발명의 목적이다.
기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제, 및 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 키트, 용기, 팩 또는 분배기 내에 패키징되거나 포함될 수 있다. HIF-2 알파 RNAi 작용제, 및 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 사전-충전된 시린지 또는 바이알 내에 패키징될 수 있다.
치료 방법 및 발현 억제
본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 투여가 이로울 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는 HIF-2 알파 mRNA의 발현 및/또는 HIF-2 알파 (EPAS1) 단백질 수준의 감소 및/또는 억제가 이로울 대상체 (예를 들어, 인간), 예를 들어 암, 신암, 투명 세포 신세포 암종, 비소세포 폐암, 성상세포종 (뇌암), 방광암, 유방암, 연골육종, 결장직장 암종, 위 암종, 교모세포종, 두경부 편평 세포 암종, 간세포성 암종, 폐 선암종, 신경모세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 직장암, 전이, 치은염, 건선, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 전자간증, 염증, 만성 염증, 신생혈관 질환, 및 류마티스 관절염을 진단받았거나 또는 그와 관련된 증상을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 어느 1종 이상의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 치료 유효량이 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료는 치유적 및/또는 예방적 치료를 포함할 수 있다. 어느 1종 이상의 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 치료 유효량이 대상체에게 투여된다. 대상체는 인간, 환자, 또는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 성인, 청소년, 아동 또는 유아일 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물의 투여가 인간 또는 동물에 대해 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 HIF-2 알파-관련 질환 또는 장애를 갖거나, 또는 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 1종의 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 HIF-2 알파 mRNA의 감소로부터 이익을 얻거나 또는 적어도 부분적으로 그에 의해 매개될 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 임상 제시를 치료 또는 관리하는데 사용된다. 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제-함유 조성물 중 1종 이상의 치료 유효량이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 치료될 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 중 어느 1종 이상의 예방 유효량을 대상체에게 투여하고, 그에 의해 적어도 1종의 증상이 방지되거나 억제됨으로써 대상체가 치료된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 병태, 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 상태 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여되는 대상체에서의 HIF-2 알파 유전자의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 및/또는 조직에서 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여된 대상체에서의 HIF-2 알파 단백질 수준은 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 단백질 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 조직, 혈액 및/또는 다른 체액에서 감소될 수 있다.
HIF-2 알파 mRNA 수준 및 HIF-2 알파 단백질 수준의 감소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, HIF-2 알파 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준의 감소 또는 저하는 본원에서 HIF-2 알파의 감소 또는 저하 또는 HIF-2 알파의 발현을 억제하거나 감소시키는 것을 총괄적으로 지칭한다. 본원에 제시된 실시예는 HIF-2 알파 유전자 발현의 억제를 평가하기 위한 공지된 방법을 예시한다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상은 암, 신암, 투명 세포 신세포 암종, 비소세포 폐암, 성상세포종 (뇌암), 방광암, 유방암, 연골육종, 결장직장 암종, 위 암종, 교모세포종, 두경부 편평 세포 암종, 간세포성 암종, 폐 선암종, 신경모세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 직장암, 전이, 치은염, 건선, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 전자간증, 염증, 만성 염증, 신생혈관 질환, 또는 류마티스 관절염이다.
일부 실시양태에서, 대상체를 치료하는 방법은 대상체의 체중에 좌우된다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 대상체의 체중의 약 3 mg/kg 내지 약 80 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 대상체의 체중의 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 분할 용량으로 투여될 수 있으며, 이는 2회 용량이 짧은 (예를 들어, 24시간 미만) 기간 내에 대상체에게 주어짐을 의미한다. 일부 실시양태에서, 목적하는 1일 양의 약 절반은 초기 투여로 투여되고, 목적하는 1일 양의 나머지 약 절반은 초기 투여의 대략 4시간 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 1주 1회 (매주) 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 격주로 (격주 1회) 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여되는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 용량은 매주 투여되는 225 mg의 고정 용량이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 용량은 매주 투여되는 525 mg의 고정 용량이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 용량은 매주 투여되는 1,050 mg의 고정 용량이다. 일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제는 정맥내 주입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, HIF-2 알파 RNAi 작용제 또는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 함유하는 조성물은 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 증상은 ccRCC이다.
세포, 조직, 및 비-인간 유기체
본원에 기재된 HIF-2 알파 RNAi 작용제 중 적어도 1개를 포함하는 세포, 조직, 및 비-인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직, 또는 비-인간 유기체는 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 관련 기술분야에서 입수가능한 임의의 수단에 의해 세포, 조직, 또는 비-인간 유기체에 전달하는 것에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물 세포이다.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기의 비제한적 실시예로 예시된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 특정 실시양태를 제한하지 않고 예시하는 것으로 의도된다.
실시예 1. HIF-2 알파 RNAi 작용제의 합성 및 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 함유하는 조성물.
하기는 본원에 제시된 비제한적 실시예에 예시된 특정 HIF-2 알파 RNAi 작용제 및 그의 접합체의 합성을 위한 일반적 절차를 기재한다.
RNAi 작용제의 합성. RNAi 작용제는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 본원에 제시된 실시예에 예시된 RNAi 작용제의 합성을 위해, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥을 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. 규모에 따라, 머메이드96E(MerMade96E)® (바이오오토메이션(Bioautomation)), 머메이드12® (바이오오토메이션), 또는 올리고파일럿 100(Oligopilot 100) (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하였다. 합성은 제어된 세공 유리 (CPG, 500 Å 또는 600Å, 미국 펜실베니아주 아스톤 소재의 프라임 신테시스(Prime Synthesis)로부터 입수함) 또는 폴리스티렌 (미국 캘리포니아주 오션사이드 소재의 키노베이트(Kinovate)로부터 입수함)으로 제조된 고체 지지체 상에서 수행하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) (미국 위스콘신주 밀워키), 켐진스(ChemGenes) (미국 매사추세츠주 윌밍톤), 또는 홍진 바이오테크(Hongene Biotech) (미국 노스캐롤라이나주 모리스빌)에서 구입하였다. 구체적으로, 사용된 하기 2'-O-메틸 포스포르아미다이트는 하기를 포함한다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트 및 2'-O-프로파르길 포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 포스포르아미다이트와 동일한 보호기를 보유하였다. 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-이노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 글렌 리서치(Glen Research) (버지니아주)에서 구입하였다. 역전된 무염기성 (3'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시리보스-5'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 켐진스에서 구입하였다. 사용된 하기 UNA 포스포르아미다이트는 하기를 포함하였다: 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-2',3'-세코-아데노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-아세틸-2',3'-세코-시토신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-이소부티릴-2',3'-세코-구아노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 및 5'-(4,4'-디메톡시-트리틸)-2',3'-세코-우리딘, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N- 디이소-프로필)]-포스포르아미다이트. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 미국 매사추세츠주 레오민스터 소재의 폴리오르그, 인크.(PolyOrg, Inc.)로부터 입수함)의 100 mM 용액 또는 피리딘 중 크산탄 히드라이드 (티씨아이 아메리카(TCI America), 미국 오레곤주 포틀랜드 소재)의 200mM 용액을 사용하였다.
또한 (NH2-C6) 반응성 기 링커를 도입하기 위해 TFA 아미노연결 포스포르아미다이트를 상업적으로 구입하였다 (써모피셔). TFA 아미노연결 포스포르아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다. 트리알킨-함유 포스포르아미다이트를 합성하여 각각의 (TriAlk#) 링커를 도입하였다. 본원의 특정 실시예에 제시된 RNAi 작용제와 관련하여 사용되는 경우에, 트리알킨-함유 포스포르아미다이트는 무수 디클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키는 한편, 모든 다른 아미다이트는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다.
일부 RNAi 작용제의 경우, 링커, 예컨대 C6-SS-C6 또는 6-SS-6 기를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 도입하였다. 각각의 링커를 갖는 사전-로딩된 수지는 상업적으로 획득하였다. 대안적으로, 일부 센스 가닥의 경우, dT 수지를 사용한 다음, 각각의 링커를 표준 포스포르아미다이트 합성을 통해 첨가하였다.
지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호. 고체 상 합성의 종료 후, 건조된 고체 지지체를 40 중량%의 물 중 메틸아민 및 28% 내지 31% 수산화암모늄 용액 (알드리치(Aldrich))의 1:1 부피 용액으로 1.5시간 동안 30℃에서 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에 재구성시켰다 (하기 참조).
정제. 조 올리고머를 TSK겔 수퍼Q-5PW 13μm 칼럼 및 시마즈(Shimadzu) LC-8 시스템을 사용하는 음이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 20 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH 9.0이었고, 20% 아세토니트릴을 함유하였으며, 완충제 B는 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 완충제 A와 동일한 것이었다. 260 nm에서의 UV 트레이스를 기록하였다. 적절한 분획을 풀링한 후, 100mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴 또는 여과수의 구동 완충제와 함께 세파덱스 G25 파인(Sephadex G25 fine)이 패킹된 지이 헬스케어 XK 16/40 칼럼을 사용하여 크기 배제 HPLC 상에서 실행시켰다.
어닐링. 1x PBS (포스페이트 완충 염수, 1x, (코닝(Corning), 셀그로(Cellgro)) 중에서 등몰 RNA 용액 (센스 및 안티센스)을 조합함으로써 상보적 가닥을 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 저장하였다. 1x PBS에서 UV-Vis 분광계 상에서 용액 흡광도를 측정함으로써 듀플렉스 농도를 결정하였다. 그 후, 260 nm에서의 용액 흡광도에 전환 인자 및 희석 배율을 곱하여 듀플렉스 농도를 결정하였다. 사용된 전환 인자는 0.037 mg/(mL·cm)이었거나, 또는 실험적으로 결정된 흡광 계수로부터 이를 계산하였다.
연결제 TriAlk 14의 합성
일부 실시양태에서, TriAlk 14와 같은 연결제는, 트리알킨을 포함하는 포스포르아미다이트를 반응시킴으로써, 또는 말단 아민과 같은 반응성 기를 포함하는 RNAi 작용제를 합성하고 RNAi 작용제를 수지로부터 절단한 후에 RNAi 작용제를 활성화된 에스테르를 포함하는 트리알킨 모이어티와 반응시킴으로써, 포스포르아미다이트의 형태로 RNAi 작용제에 부착시킬 수 있다. 하기 절차는 TriAlk 14의 활성화된 에스테르 버전 (화합물 22) 또는 TriAlk 14의 포스포르아미다이트 버전 (화합물 14)의 합성 방법을 제공한다.
Figure pct00095
3-L 재킷 반응기에 500 mL DCM 및 4 (75.0 g, 0.16 mol)를 첨가하였다. 반응물의 내부 온도를 0℃로 냉각시키고, TBTU (170.0 g, 0.53 mol)를 첨가하였다. 이어서, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지시키면서 현탁액을 아민 5 (75.5 g, 0.53 mol)로 적가 처리하였다. 이어서, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지시키면서 반응물을 DIPEA (72.3 g, 0.56 mol)로 천천히 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 반응물을 23℃로 1시간에 걸쳐 가온하고, 3시간 동안 교반되도록 하였다. 모든 3종의 시약의 10% 키커 충전물을 첨가하고, 추가로 3시간 동안 교반되도록 하였다. 반응은 4의 <1%가 남아있을 때 완결된 것으로 간주하였다. 반응 혼합물을 포화 염화암모늄 용액 (2 x 500 mL)으로 세척하고, 포화 중탄산나트륨 용액 (500 mL)으로 1회 세척하였다. 이어서, 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일의 질량은 188 g이었고, 이는 QNMR에 의하면 72% 6을 함유하였다. 조 오일을 후속 단계에 사용하였다. C46H60N4O11에 대한 계산된 질량 = 845.0 m/z. 실측치 [M+H] = 846.0.
Figure pct00096
72 wt% 화합물 6 (86.0 g, 0.10 mol)을 함유하는 121.2 g의 조 오일을 DMF (344 mL) 중에 용해시키고, 내부 온도를 23℃ 미만으로 유지시키면서 TEA (86 mL, 20 v/v%)로 처리하였다. Fmoc-아민 6의 소모 대비 디벤조풀벤 (DBF)의 형성을 HPLC 방법 1을 통해 모니터링하였고 (도 2), 반응은 10시간 내에 완결되었다. 용액에 글루타르산 무수물 (12.8 g, 0.11 mol)을 첨가하였고, 중간체 아민 7은 2시간 내에 화합물 8로 전환되었다. 완결된 후, DMF 및 TEA를 30℃에서 감압 하에 제거하여 조 오일 100 g을 수득하였다. 물 중 화합물 7의 높은 용해도로 인해 수성 후처리는 사용할 수 없었고, 크로마토그래피가 DBF, TMU, 및 글루타르산 무수물을 제거하기 위한 유일한 방법이다. 조 오일 (75 g)을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬(Teledyne ISCO Combi-flash)® 정제 시스템 상에서 3 부분으로 정제하였다. 조 오일 (25 g)을 330 g 실리카 칼럼 상에 로딩하고, 0 - 20% 메탄올/DCM으로부터 30분에 걸쳐 용리시켜 화합물 8 42 g (3 단계에 걸쳐 54% 수율)을 수득하였다. C36H55N4O12에 대한 계산된 질량 = 736.4 m/z. 실측치 [M+H] = 737.0.
Figure pct00097
화합물 8 (42.0 g, 0.057 mol)을 사용 전에 10 부피의 아세토니트릴로 공동-스트리핑하여 크로마토그래피 용매로부터 임의의 잔류 메탄올을 제거하였다. 오일을 DMF (210 mL) 중에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 용액을 4-니트로페놀 (8.7 g, 0.063 moL)에 이어서 EDC-히드로클로라이드 (12.0 g, 0.063 mol)로 처리하였고, 10시간 내에 완결상태에 도달하는 것으로 확인되었다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 내부 온도를 15℃ 미만으로 유지시키면서 10 부피의 에틸 아세테이트에 이어서 10 부피의 포화 염화암모늄 용액을 첨가하였다. 층이 분리되도록 하고, 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하였다. 합한 수성 층을 5 부피의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일 (55 g)을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬® 정제 시스템 상에서 3 부분으로 정제하였다. 조 오일 (25 g)을 330 g 실리카 칼럼 상에 로딩하고, 0 - 10% 메탄올/DCM으로부터 30분에 걸쳐 용리시켜 순수한 9 (화합물 22) 22 g (50% 수율)을 수득하였다. C42H59N5O14에 대한 계산된 질량 = 857.4 m/z. 실측치 [M+H] = 858.0.
Figure pct00098
디클로로메탄 (3 부피) 중 에스테르 9 (49.0 g, 57.1 mmol) 및 6-아미노-1-헥산올 (7.36 g, 6.28 mmol)의 용액을 트리에틸아민 (11.56 g, 111.4 mmol)으로 적가 처리하였다. HPLC 방법 1에서 화합물 9의 소멸을 관찰함으로써 반응을 모니터링하였고, 이는 10분 내에 완결되는 것으로 확인되었다. 조 반응 혼합물을 5 부피의 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 염화암모늄 (5 부피) 및 염수 (5 부피)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬® 정제 시스템 상에서 330 g 실리카 칼럼을 사용하여 정제하였다. 4-니트로페놀을 100% 에틸 아세테이트로 용리시키고, 10을 칼럼으로부터 20% 메탄올/DCM을 사용하여 플러싱하여 무색 오일 (39 g, 81% 수율)을 수득하였다. C42H69N5O12에 대한 계산된 질량 = 836.0 m/z. 실측치 [M+H] = 837.0.
Figure pct00099
알콜 10을 10 부피의 아세토니트릴로 2회 공동-스트리핑하여 크로마토그래피 용매로부터 임의의 잔류 메탄올을 제거하고, 건조 디클로로메탄 (KF < 60 ppm)으로 1회 더 공동-스트리핑하여 미량의 물을 제거하였다. 알콜 10 (2.30 g, 2.8 mmol)을 5 부피의 건조 디클로로메탄 (KF < 50 ppm) 중에 용해시키고, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (188 mg, 1.1 mmol)로 처리하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포르아미다이트 (1.00 g, 3.3 mmol)로 적가 처리하였다. 용액을 빙조로부터 제거하고, 20℃에서 교반하였다. 반응은 3 - 6시간 내에 완결되는 것으로 확인되었다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 10 부피의 포화 중탄산암모늄/염수 1:1 용액으로 처리한 다음, 1분에 걸쳐 주위 온도로 가온하고, 20℃에서 추가로 3분 동안 교반되도록 하였다. 2상 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 10 부피의 디클로로메탄을 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 10 부피의 포화 중탄산나트륨 용액으로 세척하여 미반응 비스-인 시약을 가수분해하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켜 94 wt% 화합물 14 3.08 g을 수득하였다. C51H86N7O13P에 대한 계산된 질량 = 1035.6 m/z. 실측치 [M+H] = 1036.
트리알킨 스캐폴드의 합성후 접합. 어닐링 전 또는 후에, RNAi 작용제의 5' 또는 3' 아민 관능화된 센스 가닥을 트리알킨 스캐폴드에 접합시킬 수 있다. 하기는 어닐링된 듀플렉스에의 트리알킨 스캐폴드의 접합을 기재한다: 아민 관능화된 듀플렉스를 90% DMSO/10% H2O 중에 ~50-70 mg/mL로 용해시켰다. 40 당량의 트리에틸아민을 첨가한 후, 3 당량의 트리알킨-PNP를 첨가하였다. 완결되면, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매계에서 2회 침전시키고, 건조시켰다.
HIF-2 RNAi 작용제에의 표적화 리간드의 접합. 어닐링 전 또는 후 및 PK 인핸서의 접합 전 또는 후에, 1개 이상의 표적화 리간드를 본원에 개시된 HIF-2 RNAi 작용제에 연결할 수 있다. 하기는 인테그린 표적화 리간드를 알킨-관능화된 링커 (예를 들어, (TriAlk) 또는 내부 뉴클레오티드 상의 2'-O-프로파르길 기)에 연결하는데 사용되는 일반적 접합 과정을 기재한다. 절차는 세자리 표적화 기 스캐폴드에의 3개의 표적화 리간드의 첨가를 기재한다. 표적화 리간드를 내부 뉴클레오티드에 연결하기 위해 동일한 절차를 사용할 수 있지만, 첨가될 표적화 리간드의 수의 관점에서 표적화 리간드의 당량수를 조정할 수 있다: 0.5M 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 0.5M Cu(II) 술페이트 5수화물 (Cu(II)SO4 · 5 H2O) 및 아스코르브산나트륨의 2M 용액의 원액을 탈이온수 중에서 제조하였다. 목적하는 인테그린 리간드의 DMSO 중 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 센스 가닥 (탈이온수 중 75 mg/mL)을 함유하는 바이알에서, 인테그린 리간드를 교반하면서 반응물에 첨가하였다 (2 당량/알킨). 트리에틸아민 (40 당량/센스 가닥)을 반응 바이알에 첨가하였다. 별도의 바이알에서, 5부의 0.5M THPTA를 1부의 0.5M Cu(II)SO4 · 5 H2O와 혼합하고, 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후, THPTA/Cu 용액 (0.5 당량 Cu/알킨)을 반응 바이알에 첨가하였다. 그 직후에, 2M 아스코르베이트 (5 당량/Cu)를 반응 바이알에 첨가하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 반응물을 비-변성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다. 달리 명시되지 않는 한, 세자리 표적화 기를 포함하는 하기 실시예에 기재된 모든 구축물은 구조 TriAlk14:
Figure pct00100
또는 TriAlk14s:
Figure pct00101
를 갖는 기를 포함하며, 여기서 TL은 표적화 리간드를 포함하고,
Figure pct00102
는 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
HIF-2 RNAi 작용제에의 PK 인핸서의 접합. 어닐링 전 또는 후 및 1개 이상의 표적화 리간드의 접합 전 또는 후에, 1개 이상의 PK 인핸서를 본원에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 연결할 수 있다. 하기는 PK 인핸서를 본원에 도시된 실시예에 제시된 구축물에 연결하는데 사용되는 일반적 접합 과정을 기재한다. 하기는 디술피드의 디티오트레이톨 환원에 이어서 각각의 PK 인핸서의 티올-마이클 첨가를 수행함으로써 말레이미드-관능화된 PK 인핸서를 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 관능화된 센스 가닥에 연결하는데 사용되는 일반적 과정을 기재한다: 바이알에서, 관능화된 센스 가닥을 0.1M Hepes pH 8.5 완충제 중에 75 mg/mL로 용해시키고, 25 당량의 디티오트레이톨을 첨가하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:40 비)의 용매계에서 3회 침전시키고, 건조시켰다. 이어서, DMSO 중 말레이미드 관능화된 PK 인핸서의 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 디술피드-환원된 (3' C6-SH, 5' HS-C6, 또는 3' 6-SH 관능화된) 센스 가닥을 탈이온수 중에 100mg/mL로 용해시키고, 3 당량의 말레이미드-관능화된 PK 인핸서를 첨가하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 1시간-3시간 내에 완결됨), 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:40 비)의 용매계에서 침전시키고, 건조시켰다.
표적화 리간드의 제조 방법
실시예의 합성의 하기 실험 세부사항에 사용된 약어의 일부는 하기와 같이 정의된다: h 또는 hr = 시간; min = 분; mol = 몰; mmol = 밀리몰; M = 몰; μM = 마이크로몰; g = 그램; μg = 마이크로그램; rt 또는 RT = 실온; L= 리터; mL = 밀리리터; wt = 중량; Et2O = 디에틸 에테르; THF = 테트라히드로푸란; DMSO = 디메틸 술폭시드; EtOAc = 에틸 아세테이트; Et3N 또는 TEA = 트리에틸아민; i-Pr2NEt 또는 DIPEA 또는 DIEA = 디이소프로필에틸아민; CH2Cl2 또는 DCM = 메틸렌 클로라이드; CHCl3 = 클로로포름; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CCl4 = 사염화탄소; MeOH = 메탄올; EtOH = 에탄올; DMF = 디메틸포름아미드; BOC = t-부톡시카르보닐; CBZ = 벤질옥시카르보닐; TBS = t-부틸디메틸실릴; TBSCl 또는 TBDMSCl = t-부틸디메틸실릴 클로라이드; TFA = 트리플루오로아세트산; DMAP = 4-디메틸아미노피리딘; NaN3 = 아지드화나트륨; Na2SO4 = 황산나트륨; NaHCO3 = 중탄산나트륨; NaOH = 수산화나트륨; MgSO4 = 황산마그네슘; K2CO3 = 탄산칼륨; KOH = 수산화칼륨; NH4OH = 수산화암모늄; NH4Cl = 염화암모늄; SiO2 = 실리카; Pd-C = 탄소 상 팔라듐; HCl = 염화수소 또는 염산; NMM = N-메틸모르폴린; H2 = 수소 기체; KF = 플루오린화칼륨; EDC-HCl = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드; MTBE = 메틸-tert-부틸 에테르; MeOH = 메탄올; Ar = 아르곤; N2 = 질소; SiO2 = 실리카; RT = 체류 시간; PTSA = 파라-톨루엔술폰산; PPTS = 피리디늄 파라-톨루엔술포네이트.
구조 1c ((S)-3-(6-((1-아지도-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자노나데칸-19-일)옥시)피리딘-3-일)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00103
벤젠 (25 mL) 중 화합물 1 (1.03 g, 8.23 mmol), 화합물 2 (0.92 g 14.8 mol), 및 PTSA 수화물 (156 mg, 0.82 mmol)을 함유하는 혼합물을 딘 스타크 장치 내에서 밤새 환류하였다. 다음 날 아침, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨에 붓고, 에틸 아세테이트를 후속적으로 첨가하였다. 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켜 화합물 3을 95% 수율로 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00104
DMF (100 mL) 중 화합물 4 (5.39 g, 53.3 mmol) 및 3Å 분자체를 함유하는 용액에 수소화나트륨 (60 wt%, 2.13 g, 53.3 mmol)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. DMF (20 mL) 중 화합물 3 (7.52 g, 7.52 g)의 용액을 후속적으로 첨가하고, 현탁액을 80℃에서 밤새 가열하였다. 완결된 후, 현탁액을 코튼 플러그 상에서 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르와 물 사이에 분배하고, 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 TFA 중 10% H2O 20 ml로 처리하고, 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 용액을 0℃로 냉각시키고, 6M NaOH로 pH를 11로 조정하였고, 이때 생성물이 오일로서 침전되었다. 화합물 5를 유성 현탁액으로부터 디에틸 에테르를 사용하여 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 화합물 5를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 26% 수율로 단리하였다.
Figure pct00105
DCM (22 mL) 중 화합물 5 (2.29 g, 9.94 mmol), 화합물 6 (4.82 g, 39.8 mmol), PPTS (125 mg, 0.50 mmol), 황산마그네슘 (3 g, 24.9 mmol), 황산구리 (3.97 g, 24.9 mmol), 및 3 옹스트롬 분자체를 함유하는 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 완결된 후, 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 이어서, 화합물 7을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 76% 수율로 단리하였다.
Figure pct00106
화염 건조된 플라스크에 THF (40 mL) 및 디이소프로필아민 (2.29 g, 22.6 mmol)을 채웠다. 이것을 -20℃로 냉각시키고, n-BuLi (2.5 M, 8.64 mL, 21.6 mmol)를 캐뉼라를 통해 첨가하였다. 용액을 -20℃에서 10분 동안 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 화합물 8 (2.02 mL, 20.6 mmol)을 격렬한 교반 하에 적가하였다. 첨가한 후, 용액을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 다음에, THF (10 mL) 중 용액으로서 ClTi(iPrO)3 (11.26 g, 43.2 mmol)을 첨가 깔때기를 통해 대략 10분에 걸쳐 격렬한 교반 하에 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종적으로, 화합물 7 (2.29 g. 6.86 mmol)을 THF 중 현탁액으로서 적가하고, 반응이 완결될 때까지 -78℃에서 1.25시간 동안 교반하였다. 반응물에 -78℃에서 포화 수성 염화암모늄을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 냉각으로부터 제거하고, 수성 상이 서서히 해동 및 켄칭되게 하였다 (황색빛 오렌지색이 사라짐). 혼합물을 EtOAc와 포화 수성 염화암모늄 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수에 이어서 황산나트륨 상에서 건조시키고, 이어서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 정제 후, 화합물 9를 단일 부분입체이성질체로서 75% 수율로 수득하였다.
Figure pct00107
MeOH (3.2 mL) 중 화합물 9 (1.28 g, 3.21 mmol)를 디옥산 중 HCl (4M, 3.2 mL, 12.9 mmol)로 처리하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 물로 희석하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 후속적으로, 2 N 수성 NaOH를 사용하여 pH를 11로 조정하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물 10을 92% 수율로 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00108
15℃에서 THF (6 mL) 중 화합물 10 (0.78 g, 2.67 mmol) 및 화합물 11 (0.60 g, 3.46 mmol)의 혼합물에 STAB-H (1.29g, 6.12 mmol)를 조금씩 고체로서 첨가하였다. 첨가한 후, 냉각을 제거하고, 혼합물을 대략 2.5시간 내지 완결될 때까지 교반하였다. 반응물을 포화 수성 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하고, pH를 9로 만들었다. 생성물을 EtOAc로 3회 추출하고, 유기 상을 합하고, 염수로 건조시키고, 이어서 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 12를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 85% 수율로 단리하였다.
Figure pct00109
THF (35 mL) 중 DIPEA (7.53 mL, 53.75 mmol)에 n-BuLi (2.5 M, 19.9 mL, 49.8 mmol)를 오븐 건조된 기밀 구조의 시린지를 통해 2분에 걸쳐 -10℃에서 첨가하였다. 혼합물을 -10℃에서 10분 동안 교반하고, 이어서 -60℃로 냉각시키고, THF (8 mL) 중 디메틸 메틸포스포네이트 (6.42 g, 51.8 mmol)의 용액을 5-10분에 걸쳐 적가하였다. -60℃에서 약 1시간 동안 숙성시킨 후, 화합물 13 (7.37 g. 39.82 mmol)을 THF (15 mL) 중 용액으로서 5분에 걸쳐 -60℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 -60℃에서 1시간 동안 교반한 다음, -41℃에서 약 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 2.6 당량의 H2SO4 (2.0 M)의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (~50 mL)로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 간단히 농축시켜 조 물질의 중량을 결정하고, NMR을 위한 샘플을 채취하였다. 건조 중량이 결정되면, 화합물 14를 후속 반응에 사용하기 위해 추가 정제 없이 MeOH 중에 용해시켰다. 계산치 75.83% 수율. NMR에 의한 조 물질 wt/wt% 76.3%.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 4.75 (s, 1 H), 3.81 (s, 3 H), 3.78 (s, 3 H), 3.10 - 3.14 (m, 2 H), 3.04 - 3.09 (m, 2 H), 2.68 (t, 2 H), 1.82-1.75 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
Figure pct00110
MeOH (40 mL) 중 화합물 14 (~12g 조 물질의 NMR로부터의 중량 기준 9.33g, 30.16 mmol)에 물 (1.5 mL) 중 NaOH (1.45 g, 36.2 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하고, 화합물 15 (2.76 g, 22.62 mmol)를 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 화합물 15의 제2 부분 (736 mg, 6.03 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 오일로 농축시키고, 2 부피 EtOAc와 1 부피 H2O 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 1 부피의 물로 세척하였다. 수성 세척물을 합하고, EtOAc로 역추출하였다 (2x, 1 vol). 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 건조시켰고, 대략 20g의 실리카 화합물 16을 실리카 상에서 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 69% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 9.09 (dd, 1 H), 8.17 (dd, 1 H), 8.12 (d, 1 H), 7.46 (dd, 1 H), 7.41 (d, 1 H), 4.78 (s, 1 H), 3.24 (q, 2 H), 3.10 (t, 2 H), 2.12 (quin, 2 H), 1.43 (s, 9 H).
Figure pct00111
EtOH (50 mL) 중 화합물 16 (5.98 g, 20.8 mmol)의 용액에 팔라듐 (탄소 상 10%, 2.22 g, 2.08 mmol) 및 수소를 1 기압에서 채웠다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)® 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 17을 실리카 상에서 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 79% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.05 (d, 1 H), 6.34 (d, 1 H), 5.48 (s, 1 H), 4.81 (s, 1 H), 3.36 - 3.43 (m, 2 H), 3.16 (q, 2 H), 2.68 (t, 2 H), 2.59 (t, 2 H), 1.90 (dt, 2 H), 1.83 (quin, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
Figure pct00112
화합물 17 (4.81 g, 16.53 mmol)을 수성 6 M HCl (16.4 mL) 중에 용해시키고, 42℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이어서, 6 M HCl의 추가의 부분 (2.8 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응물에 염화나트륨에 이어서 수성 2 N NaOH를 생성물이 오일로서 침전될 때까지 첨가하였다 (pH는 12를 초과함). 혼합물을 2-부탄올로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 18을 85% 수율로 수득하고, 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.06 (d, 1 H), 6.35 (d, 1 H), 4.83 (s, 1 H), 3.35 - 3.46 (m, 2 H), 2.75-2.67 (m, 4 H), 2.58 (t, 2 H), 1.88 - 1.95 (m, 2 H), 1.84-1.76 (m, 4 H).
Figure pct00113
-10℃에서 화염 건조된 플라스크 내의 THF (0.9 mL) 중 트리포스겐 (85 mg, 0.28 mmol)의 용액에 THF (0.5 mL) 중 화합물 18 (236 mg, 0.62 mmol) 및 TEA (0.134 mL, 0.96 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. TLC가 완전한 반응을 나타낸 후, 추가의 TEA (0.134 mL)를 첨가하고, 이어서 화합물 12 (166 mg, 0.87 mmol)를 고체로서 첨가하였다. 불균질 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 격렬한 교반 하에 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 1 부피의 물로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 19를 100% 수율로 가정하여 수득하고, 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00114
THF (37 mL) 중에 용해시킨 조 화합물 19 (400 mg, 0.62 mmol로 가정됨)에 H2SO4(2M, 0.6 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, H2SO4의 추가의 부분 (0.65 당량)을 첨가하였다. 4시간 후에 반응이 완결되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 1회 역추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 20을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 75% 수율로 단리하였다.
Figure pct00115
에탄올 (9 mL) 중 화합물 20 (251 mg, 0.47 mmol) 및 Pd/C (10 wt%, 100mg, 0.094 mmol)의 현탁액에 1 기압까지 H2를 채우고, 35℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 팔라듐을 셀라이트® 상에서 여과에 의해 제거하였다. 화합물 21을 C18 5u 19x250 mm BEH 칼럼 (워터스 코포레이션(Waters Corp.))을 사용하여 1% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 TFA 염으로서 20% 수율로 단리하였다.
Figure pct00116
DCM (250uL) 중 화합물 21 (61 mg, 0.097 mmol)의 용액에 TEA (8 uL, 0.24 mmol)를 첨가하고, 이어서 NHS-PEG4-N3 (41.4 mg, 0.11 mmol)을 DCM (275 μL) 중 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반하고, LC-MS에 의해 확인하였고, 이는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 모든 휘발물을 제거하고, 잔류물을 EtOH (0.4 mL) 및 물 (0.4 mL) 중에 용해시켰다. LiOH (11.2 mg, 0.47 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 화합물 22 (구조 1c)를 C18 5u 19x250 mm BEH 칼럼 (워터스 코포레이션)을 사용하여 1% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 42% 수율로 단리하였다.
구조 2c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00117
톨루엔 (80 mL) 중 화합물 23 (10 g, 43.4 mmol)의 용액에 화합물 6 (21.1g, 0.17 mol), PPTS (0.55g, 2.2 mmol)에 이어서 아세트산 (1.24 mL, 21.7 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기에 딘 스타크 트랩을 장착한 다음, 환류 하에 밤새 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 실리카 60 그램 상에서 건조시키고, 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 SiO2 상에서 정제하여, 화합물 24를 66% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 8.47 (s, 1 H), 7.68 (d, 1 H), 7.31 - 7.56 (m, 6 H), 6.98 - 7.16 (m, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 1.26 (s, 9 H).
Figure pct00118
화염 건조된 플라스크에 THF (190 mL) 및 DIPEA (9.07 g, 89.7 mmol)를 채우고, -20℃로 냉각시킨 다음, 캐뉼라를 통해 n-BuLi (2.5M, 34.2 mL, 85.6 mmol)를 채웠다. 용액을 -20℃에서 10분 동안 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 화합물 8 (8 mL, 81.5 mmol)을 격렬한 교반 하에 적가하였다. 첨가한 후, -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, ClTi(iPrO)3 (44.6g, 0.171 mol)을 THF (40 mL) 중 용액으로서 첨가 깔때기를 통해 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종적으로, 화합물 24 (9.06g, 27.2 mmol)를 THF (20 mL) 중 현탁액으로서 적가하고, 반응이 완결될 때까지 -78℃에서 1.25시간 동안 교반하였다. -78℃에서 반응물에 포화 수성 염화암모늄을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 냉각으로부터 제거하고, 수성 상이 서서히 해동 및 켄칭되게 하였다 (황색빛 오렌지색이 사라짐). 혼합물을 EtOAc와 포화 수성 염화암모늄 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 EtOAc로 2회 세척하였다. 유기 상을 합하고, 염수에 이어서 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 25를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 단일 부분입체이성질체로서 70% 수율로 수득하였다.
1H NMR:400 MHz CDCl3 δ 7.31 - 7.48 (m, 5 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.89 - 7.04 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 4.59 - 4.76 (m, 2 H), 4.13 (q, 2 H), 2.81 (dd, 2 H), 1.21 - 1.25 (m, 12 H).
Figure pct00119
화합물 25 (8.07g, 19.1 mmol)에 수성 HCl (6M, 20.7 mL, 0.124 mol)에 이어서 MeOH (60 mL)를 첨가하였다. 균질 용액이 수득될 때까지 THF를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 2 N NaOH를 사용하여 pH 10으로 염기성화시킨 다음, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 26을 95% 수율로 수득하였고, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.28 - 7.46 (m, 6 H), 7.18 (d, 1 H), 6.99 (t, 1 H), 5.11 (s, 2 H), 4.57 (t, 1 H), 4.09 (q, 2 H), 2.97 - 3.09 (m, 1 H), 2.81 - 2.93 (m, 1 H), 1.18 (t, 3 H).
Figure pct00120
0℃에서 THF (40 mL) 중 화합물 26 (5.76g, 18.2 mmol) 및 화합물 27 (4.09g, 23.6 mmol)의 혼합물에 STAB-H (8.85g, 41.8 mmol)를 고체로서 조금씩 첨가하였다. 최종 첨가 후, 냉각을 제거하고, 혼합물을 대략 2.5시간 내지 완결될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 28을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 73% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.30 - 7.49 (m, 5 H), 7.11 (dd, 1 H), 6.88 - 7.02 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 4.40 (t, 1 H), 4.10 (q, 2 H), 4.00 (dd, 1 H), 3.35 (s, 3 H), 3.31 (s, 3 H), 2.47 - 2.75 (m, 4 H), 1.20 (t, 3 H).
Figure pct00121
-10℃에서 화염 건조된 플라스크 내의 THF (24 mL) 중 트리포스겐 (1.2 g, 4.04 mmol)의 용액에 THF (6 mL) 중 화합물 19 (3.64 g, 8.99 mmol) 및 TEA (1.94 mmol, 13.9 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. TLC가 완전한 반응을 나타낸 후, 추가의 TEA (3.3 mL, 23.6 mmol)를 첨가하고, 이어서 화합물 28 (2.61 g, 13.7 mmol)을 고체로서 첨가하였다. 불균질 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 격렬한 교반 하에 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 1 부피의 물로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 29를 100% 수율로 가정하여 수득하고, 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00122
THF (37 mL) 중에 용해시킨 화합물 29 (5.59g, 8.97 mmol)에 물 (0.8 mL) 및 H2SO4 (2M, 8.07 ml, 16.2 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 28℃에서 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, 혼합물의 pH를 중탄산나트륨을 사용하여 9로 조정하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 30을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 82% 수율로 단리하였다.
Figure pct00123
EtOH (30 mL) 중에 용해시킨 화합물 30 (4.13 g, 7.39 mmol)에 데구사(Degussa)® 팔라듐 (10 wt%, 3.15 g, 2.96 mmol) 및 수소를 50psi까지 채웠다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응은 64% 완결되었다. 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 EtOH 중에 용해시키고, 팔라듐 (10 wt%, 1.57 g, 1.48 mmol) 및 수소로 50 psi까지 채웠다. 48시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 추가로 24시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 셀라이트® 상에서 여과하고, 모든 휘발물을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 31을 72% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 9.88 (s, 1 H), 7.02 - 7.14 (m, 2 H), 6.86 - 6.93 (m, 2 H), 6.50 - 6.76 (m, 1 H), 6.31 (d, 1 H), 5.17 (t, 1 H), 4.00 (q, 2 H), 3.23 - 3.28 (m, 4 H), 2.79 - 3.18 (m, 7 H), 2.61 (t, 2 H), 2.41 (t, 2 H), 1.65 - 1.78 (m, 4 H), 1.09 (t, 3 H).
Figure pct00124
-10℃에서 THF (0.47 mL) 중 PPh3 (699 mg, 2.66 mmol)의 용액에 DEAD의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 화합물 31 (600mg, 1.33 mmol) 및 HO-PEG4-N3, (466 mg, 3.06 mmol)의 순수한 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 32를 50% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 7.10 - 7.19 (m, 2 H), 6.97 - 7.06 (m, 2 H), 6.18 - 6.31 (m, 2 H), 5.20 (t, 1 H), 4.13 - 4.16 (m, 1 H), 3.98 - 4.04 (m, 2 H), 3.71 - 3.80 (m, 2 H), 3.52 - 3.61 (m, 8 H), 3.38 - 3.37 (m, 5 H), 3.10 - 3.25 (m, 5 H), 2.79 - 3.08 (m, 5 H), 2.59 (t, 2 H), 2.31 - 2.42 (m, 2 H), 1.65 - 1.75 (m, 4 H), 1.10 (t, 3 H).
Figure pct00125
화합물 32 (826 mg, 1.23 mmol)에 EtOH (3 mL) 및 H2O (3 mL)에 이어서 LiOH (97 mg, 4.05 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH=5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) C18, 50 x 250 mm, 10 μm 칼럼을 사용하여 0.1%를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 정제하여, 화합물 33 (구조 2c)을 81% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz D2O δ 7.30 (d, 1 H), 7.01 - 7.19 (m, 3 H), 6.45 (d, 1 H), 5.24 (t, 1 H), 4.14 - 4.32 (m, 2 H), 3.84 - 3.92 (m, 2 H), 3.59 - 3.77 (m, 10 H), 3.14 - 3.45 (m, 8 H), .02 - 3.12 (m, 1 H), 2.97 (d, 2 H), 2.85 (q, 1 H), 2.50 - 2.72 (m, 4 H), 1.68 - 1.94 (m, 4 H).
구조 2.1c ((S)-3-(4-((11-아지도운데실)옥시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00126
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 OH-(CH2)11-N3의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물/EtOH를 첨가하였다. 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하였다.
구조 2.2c ((S)-3-(4-(2-(1-(6-아지도헥사노일)피페리딘-4-일)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00127
0℃에서 DCM 중에 용해된 화합물 35를 EDAC로 처리하고, 아세토니트릴을 첨가하여 용해도를 보조하였다. 5분 후, TEA 및 화합물 36을 첨가하고, 냉각을 제거하고, 2시간 동안 교반을 계속하였다. 완결된 후, 포화 염화암모늄을 첨가하고, 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00128
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 37의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 38 (구조 2.2c)을 수득하였다.
구조 2.3c ((S)-3-(4-(2-((1r,4S)-4-(5-아지도펜탄아미도)시클로헥실)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00129
0℃에서 DCM 중 화합물 35의 현탁액에 EDAC를 DCM 중 용액으로서 첨가하였다. 5분 후, 냉각을 제거하고, 화합물 39를 첨가한 다음, TEA를 첨가하였다. 불균질 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응물을 DCM으로 희석하고, 침전물을 용해시켰다. 혼합물을 5% KHSO4로 2회 및 염수로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 40을 함유하는 조 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00130
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 40의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 41 (구조 2.3c)을 수득하였다.
구조 2.4c ((S)-3-(4-(4-(5-아지도펜탄아미도)페네톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00131
DCM 중 화합물 35 및 화합물 42의 혼합물에 EEDQ를 첨가하고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 1M HCl로 3회 세척하고, 염수로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 화합물 43을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00132
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 43의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 44 (구조 2.4c)를 수득하였다.
구조 2.5c ((S)-3-(4-(4-((5-아지도펜틸)옥시)페네톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00133
아세톤 중 화합물 45 및 화합물 46의 용액에 탄산칼륨을 첨가하였다. 혼합물을 현탁액으로서 밀봉된 바이알에서 N2 보호 하에 밤새 격렬히 교반하면서 65℃로 가열하였다. 이어서, 반응물을 여과하고, 농축시키고, 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 47을 수득하였다.
Figure pct00134
DMF 중 화합물 47의 용액에 아지드화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 밀봉된 바이알에서 질소 보호 하에 80℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 1 부피의 물을 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 48의 조 물질을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00135
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 48의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 49 (구조 2.5c)를 수득하였다.
구조 2.6c ((S)-3-(3-(3-(3-(17-아지도-3-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-2-아자헵타데실)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)-2-옥소이미다졸리딘-1-일)-3-(3-플루오로-4-메톡시페닐)프로판산)의 합성.
Figure pct00136
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 0℃에서 적가하였다. 첨가를 완결한 후, 혼합물을 화합물 31 및 MeOH의 순수한 혼합물이 들은 바이알로 옮겼다. 바이알을 N2로 캡핑하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 수득된 조 물질을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 50을 수득하였다.
Figure pct00137
AcOH 중 화합물 50의 용액에 브로민을 첨가하고, 혼합물을 0.5시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 에틸 아세테이트 5 부피 및 물 2.5 부피로 희석하였다. 수성 층을 포화 수성 중탄산나트륨으로 pH 7로 중화시키고, 유기 상을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추가로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 51의 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00138
DMAC 중 화합물 51, Pd(PPh3)4, 및 Zn(CN)2의 용액을 질소로 30분 동안 탈기시켰다. 혼합물을 밀봉된 바이알에서 128℃에서 밤새 가열하였다. 완결된 후, 혼합물을 EtOAc 5 부피로 희석하였다. 유기 상을 분리한 다음, 물로 2회 세척하고, 염수로 2회 세척한 다음, 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 100% EtOAc로 용리시키면서 정제하여, 화합물 52를 수득하였다.
Figure pct00139
MeOH 중 화합물 52의 용액에 암모니아를 첨가한 다음, 메탄올로 3회 사전에-헹군 라니 니켈의 슬러리를 첨가하였다. 파르(Parr)® 플라스크를 수소로 60 psi까지 채우고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 잔류물을 DMF 중에 재용해시켰다. DIEA 및 NHS-PEG4-N3을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 잔류물을 MeOH 및 THF의 혼합물 중에 재용해시켰다. H2O 중 LiOH를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 혼합물을 반정제용 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리) 상에 직접 주입하여 화합물 53 (구조 2.6c)을 수득하였다.
구조 2.7c ((S)-N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-3-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판아미드), 구조 2.8c, 구조 2.9c, 및 구조 2.10c의 합성.
Figure pct00140
화합물 31에 순차적으로 THF, PPh3, 및 DEAD의 용액을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 -20℃로 1시간 동안 냉각시키고, 여과하여 트리페닐포스핀 옥시드를 제거하였다. 여과물을 농축시키고, O-알킬화의 중간체를 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하여 단리하였다. 이어서, 단리된 중간체를 THF 및 H2O의 혼합물 중에 현탁시키고, H2O 중 LiOH로 처리하고, 35℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 2 M HCl로 pH를 7로 조정하고, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 H2O에 현탁시키고; 염화나트륨을 첨가하고, 화합물 54를 에틸 아세테이트로 5회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 54를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00141
DMF 중 화합물 54의 용액을 HBTU로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. DIEA 및 N3-PEG3-NH2를 후속적으로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, TFA로 pH를 3으로 조정하고, 화합물 55를 반정제용 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에의 직접 주입에 의해 단리하여 화합물 55를 수득하였다.
유사한 절차를 사용하여, 각각 N3-PEG11-NH2, N3-PEG23-NH2 및 N3-PEG35-NH2를 사용하여, 화합물 2.8c, 2.9c 및 2.10c를 합성하였다.
구조 2.11c ((R)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00142
질소의 불활성 분위기로 퍼징되고 유지된 3-L 4구 둥근 바닥 플라스크에 THF (1.50 L), DIPEA (150.00 mL, 716.000 mmol, 0.88 당량), n-BuLi (430.00 mL, 680.000 mmol, 0.84 당량)를 넣었다. 이어서, 트리메틸 포스파이트 (195.00 mL)를 -60℃에서 첨가하고, -60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 여기에 tert-부틸 2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (150.00 g, 809.835 mmol, 1.00 당량)를 -60℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 -60℃에서 액체 질소 조에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 H2SO4 (2N) 350 mL를 첨가하여 켄칭하고, H2O 1.5 L로 희석하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하였다. 생성된 혼합물을 H2O 1x1 L로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[5-(디메톡시포스포릴)-4-옥소펜틸]카르바메이트 200 g (조 물질)을 황색 오일로 수득하였다.
Figure pct00143
3-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[5-(디메톡시포스포릴)-4-옥소펜틸]카르바메이트 (200.00 g, 1500.00 mmol, 1.50 당량), MeOH (1.50 L), 2-아미노피리딘-3-카르브알데히드 (53.00 g, 1000.00 mmol, 1.00 당량), NaOH (50.00 g, 1500.00 mmol, 1.50 당량)를 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 용액의 pH 값을 NaHCO3 (수성)으로 8로 조정하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 물 1.5 L의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 2x1.5L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[3-(1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 160 g (조 물질)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00144
5-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[3-(1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 (160.00 g, 556.787 mmol, 1.00 당량), MeOH (2.00 L), Rh/C (140.00 g, 1.360 mmol), H2 (40 Psi)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 106 g (65.33%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00145
1-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 (106.00 g, 363.767 mmol, 1.00 당량), EtOAc (500.00 mL), EtOAc 중 HCl (4M, 400.00 mL)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 H2O 1L로 희석하였다. NaOH (수성)를 사용하여 pH를 11로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로판-1-아민 56 g (80.48%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00146
2-L 둥근 바닥 플라스크에 3-플루오로-4-히드록시벤즈알데히드 (140.00 g, 999.194 mmol, 1.00 당량), ACN (1000 mL), (브로모메틸)벤젠 (205.08 g, 1199.039 mmol, 1.20 당량), K2CO3 (414.28 g, 2997.581 mmol, 3.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 4-(벤질옥시)-3-플루오로벤즈알데히드 230 g (99.98%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00147
3-L 둥근 바닥 플라스크에 4-(벤질옥시)-3-플루오로벤즈알데히드 (230.00 g, 998.966 mmol, 1.00 당량), DCM (1600 mL), (S)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (145.29 g, 1198.762 mmol, 1.20 당량), Cs2CO3 (650.97 g, 1997.933 mmol, 2.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 6시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 (S)-N-[[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]메틸리덴]-2-메틸프로판-2-술핀아미드 260 g (78.06%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00148
질소의 불활성 분위기로 퍼징되고 유지된 3-L 둥근 바닥 플라스크에 THF (2.0 L), Zn (1.02 kg, 15595.945 mmol, 20.00 당량), CuCl (115.80 g, 1169.696 mmol, 1.50 당량), 에틸 2-브로모아세테이트 (325.57 g, 1949.498 mmol, 2.50 당량), (S)-N-[[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]메틸리덴]-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (260.00 g, 779.797 mmol, 1.00 당량)를 넣었다. 생성된 용액을 물/빙조에서 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 온도를 오일 조에서 50℃로 유지하면서 생성된 용액을 교반하면서 추가로 2시간 동안 반응되게 하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 2 L의 물의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 2x2 L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써, 에틸 (3R )-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[[(S)-2-메틸프로판-2-술피닐]아미노]프로파노에이트 150 g (45.63%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00149
1-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[[(S)-2-메틸프로판-2-술피닐]아미노]프로파노에이트 (150.00 g, 355.847 mmol, 1.00 당량), 1,4-디옥산 중 HCl (400.00 mL, 4M)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. NaHCO3 (수성)을 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-아미노-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]프로파노에이트 100 g (88.55%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00150
2-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-아미노-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]프로파노에이트 (100.00 g, 315.100 mmol, 1.00 당량), THF (1.00 L), 2,2-디메톡시아세트알데히드 (49.21 g, 472.696 mmol, 1.50 당량), NaBH(OAc)3 (133.57 g, 630.199 mmol, 2.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)아미노]프로파노에이트 80 g (62.62%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00151
2-L 3구 둥근 바닥 플라스크에 트리포스겐 (22.25 g, 74.975 mmol, 0.38 당량), THF (500 mL), 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)아미노]프로파노에이트 (80.00 g, 197.304 mmol, 1.00 당량), TEA (29.95 g, 295.956 mmol, 1.50 당량), 3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로판-1-아민 (화합물 177, 33.97 g, 177.573 mmol, 0.90 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. NaHCO3 (수성)을 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)([[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바모일])아미노]프로파노에이트 96 g (78.13%)을 황색 조 오일로서 수득하였다.
Figure pct00152
1000-mL 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)([[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바모일])아미노]프로파노에이트 (96.00 g, 154.158 mmol, 1.00 당량), THF (500.00 mL), H2SO4 (180.00 mL, 2M)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. NaOH (5M)를 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 디클로로메탄 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/메탄올 (50/1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에 적용하였다. 수집된 분획을 합하고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]-2,3-디히드로-1H-이미다졸-1-일]프로파노에이트 73 g (84.76%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00153
3-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]-2,3-디히드로-1H-이미다졸-1-일]프로파노에이트 (73.00 g, 130.671 mmol, 1.00 당량), EtOH (1.50 L), Pd(OH)2/C (60.00 g, 427.259 mmol, 3.27 당량), H2 (50 atm)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 72시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 잔류물을 디클로로메탄/메탄올 (9/1)과 함께 실리카 겔 칼럼 상에 적용하였다. 수집된 분획을 합하고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]이미다졸리딘-1-일]프로파노에이트 41.0415 g (66.75%)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS-PH-ARP-052-0: [MS+1]+=471
회전 광학 [a]D 20.0 = +37.5o (C=1 g/100ml MeOH 중)
H-NMR: (300 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 9.84 (s, 1H), 7.07 - 7.00 (m, 2H), 6.95 - 6.850 (m, 2H), 6.24 (d, 2H), 5.18 (t, 1H), 4.06 - 3.96 (m, 2H), 3.32 - 2.75 (m, 10H), 2.60 (t, 2H), 2.37 (t, 2H), 1.77 - 1.67 (m, 4H), 1.10 (t, 3H).
Figure pct00154
-10℃에서 THF 중 PPh3의 용액에 DEAD의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 화합물 185 및 HO-PEG4-N3의 순수한 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여 화합물 186을 수득하였다.
Figure pct00155
화합물 186에 EtOH 및 H2O, 이어서 LiOH를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH=5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm 칼럼을 사용하여 0.1%를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 정제하여, 화합물 187 (구조 2.11c)을 수득하였다.
구조 28c (화합물 118a) 구조 29c (화합물 118b), 구조 31c (화합물 119a), 및 구조 30c (화합물 119b)의 합성.
Figure pct00156
LHMDS (THF 중 1.0 M, 95 mL, 95 mmol) 및 THF (60 mL)의 용액에 THF (180 mL) 중 화합물 103 (2-메틸-[1,8]나프티리딘 (12.5 g, 86.7 mmol))의 용액을 -78℃에서 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, THF (120 mL) 중 화합물 104 (5-브로모-1-펜텐 (19.4 g, 130 mmol))의 용액을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 가온하고, 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (100 mL) 및 탈이온수 (100 mL)로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (2 x 400 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 105를 콤비플래쉬(CombiFlash)®에 의해 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 105의 수율: 7.93 g (43%).
Figure pct00157
아세톤 (67.5 mL), 물 (7.5 mL), 및 2,6 루티딘 (2.74 mL, 23.6 mmol) 중 화합물 105 (2.50 g, 11.8 mmol)의 용액에 실온에서 4-메틸모르폴린 N-옥시드 (2.07 g, 17.7 mmol) 및 사산화오스뮴 (t-부탄올 중 2.5wt%, 2.40 g, 0.24 mmol)을 첨가하였다. 75분 동안 교반한 후, (디아세톡시아이오도)벤젠 (5.69 g, 17.7 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 포화 수성 티오황산나트륨 용액 (100 mL)으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 106을 콤비플래쉬®에 의해 에틸 아세테이트 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 106의 수율: 1.12 g (44%).
Figure pct00158
THF (9 mL) 중 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.185 g, 4.64 mmol)의 현탁액에 THF (5 mL) 중 화합물 107 (디에틸 (N-메톡시-N-메틸카르바모일메틸)포스포네이트) (1.06 g, 4.43 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, THF (9 mL) 중 화합물 106 (0.903 g, 4.21 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 포화 수성 NH4Cl 용액 (30 mL)으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (3 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 반포화 수성 NaHCO3 용액으로 2회 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 108의 수율: 1.40 g (100% 수율로 가정하고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용함).
Figure pct00159
에틸 아세테이트 (20 mL) 중 화합물 108 (1.31 g, 4.38 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 0.466 g, 0.44 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기를 H2로 50 PSI까지 가압하였다. 3.5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 메탄올로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 화합물 109를 콤비플래쉬®에 의해 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 109의 수율: 0.833 g (62%).
Figure pct00160
THF (10 mL) 중 화합물 109 (0.833 g, 2.73 mmol)의 용액에 DIEA (0.590 mL, 3.41 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (0.744 g, 3.41 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃로 5시간 동안 가열하였다. 반응은 LC/MS에 기초하면 불완전하였고, 추가의 부분의 DIEA (0.590 mL, 3.41 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (0.744 g, 3.41 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 추가로 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 화합물 110을 콤비플래쉬®에 의해 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 110의 수율: 0.934 g (84%).
Figure pct00161
n-부틸 리튬 (헥산 중 2.5 M, 0.70 mL, 1.8 mmol) 및 THF (1.5 mL)의 용액에 화합물 111 (5-브로모-2-(페닐메톡시)-피리딘) (0.465 g, 1.8 mmol)을 THF (0.8 mL) 중 용액으로서 -78℃에서 3분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 화합물 110 (0.535 g, 1.3 mmol)을 THF (1 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 0℃로 가온하고, 포화 수성 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH 7로 추가로 산성화시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. THF (8 mL) 중 조 물질의 용액에 DIEA (0.94 mL, 5.4 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (1.18 g, 5.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 화합물 112를 콤비플래쉬®에 의해 헥산 중 0-40% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 112의 수율: 471 mg (50%).
Figure pct00162
디메톡시에탄 (2 mL) 중 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.106 g, 2.65 mmol)의 현탁액에 0℃에서 화합물 113 (트리에틸 포스포노아세테이트) (0.593 g, 2.65 mmol)을 디메톡시에탄 (1 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 디메톡시에탄 (2 mL) 중 화합물 112 (0.467 g, 0.88 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL)로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 114를 헥산 중 0-30% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 시스:트랜스 이성질체의 1:1 혼합물로서 단리하였다. 화합물 114의 수율: 392 mg (74%).
Figure pct00163
에탄올 (6 mL) 중 화합물 114 (390 mg, 0.65 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 69 mg, 0.07 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기를 H2로 50 PSI까지 가압하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 메탄올로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 화합물 115를 DCM 중 0-10% 메탄올의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 라세미 혼합물로서 단리하였다. 화합물 115의 수율: 95 mg (29%). 키랄 반정제용 HPLC (250 x 21 mm 키랄팩(Chiralpak)® AD 칼럼, 5 μm, 90/10 헥산/EtOH, 40 mL/분)를 사용하여 42 mg의 제1 용리 R-이성질체 (RT = 12-14 m, >99% ee, 화합물 115a) 및 40 mg의 제2 용리 S-이성질체 (RT = 15-18 m, >98% ee, 화합물 115b)를 단리하였다. R- 및 S-이성질체의 아이덴티티는 문헌 [Coleman et al. 47 J. Med. Chem. 4834 (2004)]에 보고된 구조적으로 유사한 화합물의 용리 순서에 기초하여 할당되었다.
구조 28c ((R)-3-(6-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 31c ((R)-3-(1-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)
Figure pct00164
DMF (0.5 mL) 중 화합물 115a (41 mg, 0.08 mmol) 및 N3-PEG4-OTs (61 mg, 0.16 mmol)의 용액에 탄산세슘 (53 mg, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액 (1 mL)으로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (3 x 3 mL)로 추출하였다. 유기 상을 감압 하에 농축시켰다. N- 및 O-알킬화된 위치이성질체의 조 혼합물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00165
THF (1.0 mL) 및 탈이온수 (1.0 mL) 중 화합물 116a 및 117a (58 mg, 0.08 mmol, 9a:10a의 4:6 혼합물)의 용액에 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 35℃에서 2시간 동안 교반하였다. 추가 부분의 수산화리튬 (4 mg, 0.16 mmol)을 첨가하고, 반응 온도를 40℃로 증가시켰다. 3시간 동안 교반한 후, 최종 부분의 수산화리튬 (4 mg, 0.25 mmol, 총 16 mg, 0.66 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 6 N 수성 HCl을 사용하여 pH 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 위치이성질체, 화합물 118a 및 119a를, 0.5% 아세트산을 함유하는 DCM 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 분리하였다. 화합물 118a를 역상 HPLC (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)™ 아쿠아실(Aquasil)™ C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 20 mL/분, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에 의해 추가로 정제하여, 화합물 118a (구조 28c) 13 mg를 수득하였다. 화합물 119a를 동일한 조건 하에 정제하여, 16 mg의 화합물 119a (구조 31c)를 수득하였다.
구조 29c ((S)-3-(6-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 30c ((S)-3-(1-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)
Figure pct00166
DMF (0.5 mL) 중 화합물 115b (40 mg, 0.08 mmol) 및 N3-PEG4-OTs (58 mg, 0.16 mmol)의 용액에 탄산세슘 (51 mg, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액 (1 mL)으로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (3 x 3 mL)로 추출하였다. 유기 상을 감압 하에 농축시켰다. N- 및 O-알킬화된 위치이성질체의 조 혼합물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00167
THF (0.75 mL) 및 탈이온수 (0.75 mL) 중 화합물 116b 및 117b (56 mg, 0.08 mmol, 9a:10a의 4:6 혼합물)의 용액에 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 추가 부분의 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 온도를 35℃로 낮추고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 6 N 수성 HCl을 사용하여 pH = 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 위치이성질체인 화합물 118b 및 119b를 콤비플래쉬에 의해 0.5% 아세트산을 함유하는 DCM 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 분리하였다. 화합물 118b를 역상 HPLC (써모 사이언티픽™ 아쿠아실™ C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 20 mL/분, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에 의해 추가로 정제하여, 화합물 118b (구조 29c) 14 mg를 수득하였다. 화합물 119b를 동일한 조건 하에 정제하여, 18 mg의 화합물 119b (구조 30c)를 수득하였다.
구조 32c ((R)-3-(4-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(N-메틸-5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜탄아미도)프로판산)의 합성
Figure pct00168
3Å 체 상의 톨루엔 (80 mL) 중 화합물 120 (2.75 g, 11.94 mmol)에 화합물 121 (5.79 g, 47.78 mmol)에 이어서 PPTS (300 mg, 1.19 mmol), 이어서 AcOH (683 uL, 11.94 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 환류하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 층을 2 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하였다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트 (0-30%)의 구배로 용리시키면서 단리하여 2.054 g (54%)을 수득하였다.
Figure pct00169
-78℃에서 THF (15 mL) 중 DIA (2.85 mL, 20.33 mmol)에 n-BuLi의 2.5M 용액 (7.76 mL, 19.41 mmol)을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 5분 동안 계속하고, 에틸 아세테이트 (1.81 mL, 18.48 mmol)를 적가하였다. -78℃에서 추가로 10분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 클로로 티타늄 트리이소프로폭시드 (9.27 mL, 38.381 mmol)의 용액을 적가하였다. -78℃에서 추가로 15분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 화합물 122 (2.054 g, 6.16 mmol)의 용액을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 1.5시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산암모늄의 첨가에 의해 켄칭하였다. 현탁액을 6 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 1.043 g (53%)을 수득하였다.
Figure pct00170
MeOH (3 mL) 중에서 교반 중인 화합물 123 (1.043 g, 2.47 mmol)에 디옥산 중 4M HCl 용액 (3.09 mL, 12.37 mmol)을 첨가하였다. 탈보호가 완결된 후, 용액을 물 (8 mL)로 희석하고, 디에틸 에테르 (6 mL)로 2회 세척하였다. 수성 층을 후속적으로 수산화나트륨을 사용하여 pH 11로 조정하였다. 침전물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 생성물 124 0.616 g (78.5%)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00171
0℃에서 THF (1.5 mL) 중 화합물 125 (92.1 mg, 0.275 mmol)에 DCC (68.1 mg, 0.331 mmol)를 첨가하였다. 5분 후, PNP (106.1 mg, 0.331 mmol)를 첨가하고, 빙조를 제거하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 현탁액을 -20℃로 1시간 동안 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 상청액을 농축시켜 조 생성물 126 129 mg (103%)을 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00172
DMF (2 mL) 중 화합물 124 (148.6 mg, 0.468 mmol) 및 탄산칼륨 (129 mg, 0.937 mmol)을 함유하는 혼합물을 메틸 아이오다이드 (66.5 mg, 0.468 mmol)로 처리하고, 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 알킬화가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 생성물을 실리카 상에서 각각 1% TEA로 완충된 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 94.6 mg (61%)을 수득하였다.
Figure pct00173
DMF (2 mL) 중 화합물 127 (94.5 mg, 0.285 mmol)에 DIEA (149 uL, 0.856 mmol)에 이어서 화합물 126 (129.9 mg, 0.285 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 MeOH 중에 용해시키고, 탄소 상 10% 팔라듐 (20 mg)으로 처리하고, 플라스크에 60 PSI의 수소를 채웠다. 완결된 후, 현탁액을 여과하였다. 상청액을 농축시키고, 수득된 조 생성물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00174
DMF (2 mL) 중 화합물 128 (159 mg, 0.285 mmol), 브로모-PEG2-아지드 (74.7 mg, 0.314 mmol) 및 탄산세슘 (204 mg, 0.627 mmol)을 함유하는 혼합물을 2시간 동안 60℃로 가열하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 디옥산 중 4M HCl (0.5 mL, 2 mmol)로 처리하고, 3시간 동안 40℃로 가열하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 THF (1 mL), MeOH (1.5 mL) 및 H2O (1.5 mL)의 혼합물 중에 현탁시키고, 수산화리튬 (83.5 mg, 3.48 mmol)으로 처리하고, 40℃로 16시간 동안 가열하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® 제미니® C18 칼럼 (21.2x250 mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 33.1 mg (20%)을 수득하였다.
구조 33c ((R)-1-아지도-13-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-12-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜타노일)-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데칸-15-산)의 합성
Figure pct00175
톨루엔 (45 mL) 중 화합물 130 (1.5 g, 9.73 mmol), (R) t-부틸 술핀아미드 (2.36 g, 19.46 mmol) 및 AcOH (0.14 mL)를 함유하는 혼합물을 딘-스타크 트랩이 장착된 플라스크에서 16시간 동안 환류하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 1.714 g (68.4%)을 수득하였다.
Figure pct00176
-78℃에서 THF (18 mL) 중 DIA (3.056 mL, 21.80 mmol)에 n-BuLi의 2.5M 용액 (8.324 mL, 20.81 mmol)을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 5분 동안 계속하고, 에틸 아세테이트 (1.94 mL, 19.82 mmol)를 적가하였다. -78℃에서 추가로 10분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 클로로 티타늄 트리이소프로폭시드의 용액 (9.94 mL, 41.62 mmol)을 적가하였다. -78℃에서 추가로 15분 동안 교반을 계속하고, THF (12 mL) 중 화합물 131 (1.70 g, 6.61 mmol)의 용액을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 1.5시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산암모늄의 첨가에 의해 켄칭하였다. 현탁액을 7 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 0.984 g (43%)을 수득하였다.
Figure pct00177
0℃에서 EtOH (6 mL) 중 화합물 132 (0.975 g, 2.82 mmol)에 디옥산 중 4 M HCl (2.12 mL, 8.47 mmol)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 물 (15 mL)로 희석하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 수산화나트륨을 사용하여 수성 층의 pH를 12로 조정하였다. 수성 층을 5 부피의 에틸 아세테이트로 세척하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 0.434 g (64%)을 수득하였다.
Figure pct00178
3Å 분자체 상의 THF (2 mL) 중 화합물 133 (0.120 g, 0.497 mmol) 및 PEG (0.151 g, 0.696 mmol)의 혼합물에 STAB-H (0.253 g, 1.19 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하고, 조 물질을 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00179
DMF (2 mL) 중 화합물 134 (0.200 g, 0.597 mmol)를 HATU (0.227 g, 0.597 mmol)로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. 활성화된 에스테르에 DIEA (0.259 mL, 1.49 mmol)에 이어서 DMF (1 mL) 중 화합물 125 (0.220 g, 0.497 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물을 제거하고, 생성된 조 물질을 순수한 TFA (3.8 mL)로 처리하고, 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. BOC 제거가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 THF (4 mL), 물 (8 mL), 및 MeOH (8 mL)의 혼합물 중에 현탁시켰다. 생성된 혼합물을 LiOH (71.6 mg, 2.98 mmol)로 처리하고, 40℃로 16시간 동안 가열하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® 제미니® c18 칼럼 (21.2x250mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 56.2 mg (18%, 3-단계)을 수득하였다.
구조 34c ((S)-1-아지도-13-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-12-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜틸)-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데칸-15-산)의 합성
Figure pct00180
0℃에서 THF (9.0 mL) 및 MeOH (0.5 mL)의 혼합물 중 화합물 136 (0.500 g, 1.45 mmol)을 수소화붕소리튬 (94.5 mg, 4.34 mmol)으로 처리하였다. 냉각을 제거하고, 기체 발생이 중지될 때까지 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 5 부피의 EtOAc로 희석하였다. 유기 층을 중탄산암모늄으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배를 사용하여 용리시킴으로써 단리하여 309 mg (67%)을 수득하였다.
Figure pct00181
0℃에서 DCM (9 mL) 중 화합물 137 (0.305 g, 0.952 mmol)을 함유하는 용액에 마르틴 시약을 여러 부분으로 첨가하였다. 여러 방울의 물을 첨가하고, 냉각을 제거하고, 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 포화 중탄산나트륨에 이어서 포화 티오황산나트륨으로 세척하였다. 분리된 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물 138을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 140 mg (46%)을 수득하였다.
Figure pct00182
3Å 분자체 상의 THF (2.5 mL) 중 화합물 1 (85.2 mg, 0.353 mmol) 및 138 (134.9 mg, 0.424 mmol)을 함유하는 혼합물에 STAB-H (0.150 g, 0.706 mmol)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 16시간 동안 40℃로 가열하였다. 완결된 후, 반응물을 5 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 포화 중탄산나트륨으로 처리하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 64 mg (33%)을 수득하였다.
Figure pct00183
3Å 분자체 상의 MeOH (1 mL) 중 화합물 140 (60 mg, 0.110 mmol), Ald-PEG3-N3 (71.9 mg, 0.331 mmol) 및 AcOH (3 μL, 0.0276 mmol)를 함유하는 혼합물에 소듐 시아노보로히드라이드 (28.9 mg, 0.276 mmol)를 첨가하고, 반응물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물을 첨가하고 (0.15 mL), 용액을 디옥산 중 HCl (4M)을 사용하여 pH 7로 산성화시켰다. 모든 메탄올을 후속적으로 제거하고, 디옥산 중 4M HCl (0.138 mL, 0.552 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. BOC 제거가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 THF (1 mL), 물 (2 mL) 및 MeOH (2 mL)의 혼합물 중에 현탁시키고, 수산화리튬 (26.5 mg, 1.104 mmol)으로 처리하였다. 에스테르 제거가 완결된 후, TFA를 첨가하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® (21.2x250mm) C18 칼럼 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 16.4 mg (24%, 3-단계)을 수득하였다.
구조 36c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)의 합성
Figure pct00184
DCM (30 mL) 및 MeOH (75 mL) 중 6-옥소헵탄산 (9.74 g, 68 mmol)의 용액에 실온에서 진한 H2SO4 (0.18 mL, 3.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류하였다. 이어서, 반응 혼합물을 오일로 농축시키고, DCM (150 mL) 중에 재용해시키고, 포화 수성 NaHCO3 (2 x 40 mL) 및 염수 (40 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 141의 수율: 10.2 g (95%).
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 3.58 (s, 3H), 2.43 (t, 2H), 2.29 (t, 2H), 1.46 (m, 4H).
Figure pct00185
EtOH (80 mL) 중 화합물 141 (10.2 g, 65 mmol) 및 2-아미노-3-포르밀피리딘 (7.89 g, 65 mmol)의 용액에 L-프롤린 (3.72 g, 32 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, EtOAc (50 mL) 중에 용해시키고, 물 (3 x 30 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 EtOAc (10-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 142의 수율: 6.08 g (39%). 질량 계산치 C14H16N2O2 [M+H]+: 245.13, 실측치: 245.21.
Figure pct00186
MeOH (50 mL) 중 화합물 142 (6.08 g, 24.9 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 데구사 유형, 1.99 g, 1.87 mmol)를 첨가하였다. 반응 플라스크에 질소를 채우고, 배기시키고, 질소로 3회 재충전하였다. 이 과정을 수소로 반복하고, 반응 용기에 최종적으로 수소 (1 atm)를 채우고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 패드를 MeOH로 헹구고, 여과물을 농축시켰다. 생성물인 화합물 143을 100% 수율로 가정하여 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C14H20N2O2 [M+H]+: 249.16, 실측치: 249.08.
Figure pct00187
무수 THF (120 mL) 중 디메틸 메틸포스포네이트 (12.3 g, 100 mmol)의 용액에 n-BuLi 용액 (헥산 중 2.5 M, 40 mL, 100 mmol)을 -78℃에서 1시간에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 첨가하였다. THF (40 mL) 중 화합물 143 (6.175 g, 24.9 mmol)의 용액을 -78℃에서 45분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 20분 동안 -78℃에서 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (200 mL)으로 켄칭하고, 실온으로 가온하고, EtOAc (400 mL)로 추출하였다. 유기 층을 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 144의 수율: 7.86 g (93%). 질량 계산치 C16H25N2O4P [M+H]+: 341.17, 실측치: 341.17.
Figure pct00188
THF (13.5 mL) 중 3-플루오로-4-(페닐메톡시)-벤즈알데히드 (0.38 g, 1.65 mmol), 화합물 144 (0.67 g, 1.98 mmol), 및 무수 탄산칼륨 (0.547 g, 3.96 mmol)의 현탁액을 환류 하에 밤새 가열하였다. 추가의 3-플루오로-4-(페닐메톡시)-벤즈알데히드 (0.19 g, 0.83 mmol) 및 탄산칼륨 (0.23 g, 1.65 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 4시간 동안 환류하였다. 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 물 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH (0-10%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 145의 수율: 446 mg (61%). 질량 계산치 C28H29FN2O2 [M+H]+: 445.23, 실측치: 445.41.
Figure pct00189
R-BINAL의 제조: LAH (0.396 g, 10.4 mmol, 0.98 당량) 건조 THF (34 mL)의 슬러리에 EtOH (0.492 g, 10.65 mmol, 1.00 당량)를 THF (3.2 mL) 중 용액으로서 10분에 걸쳐 첨가하면서 내부 온도를 < 35℃로 유지시켰다. 30분 동안 숙성시킨 후, 내부 온도를 < 35℃로 (대략 10분) 유지시키면서, R-BINOL (3.05 g, 10.65 mmol, 1.00 당량)을 THF (10 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 드라이 아이스/아세톤 조 상에서 -78℃로 냉각시켰다.
화합물 145 (1.18 g, 2.65 mmol)를 무수 톨루엔 (50 mL)으로 공비 건조시키고, 무수 THF (12 mL) 중에 용해시켰다. 화합물 145의 용액을 -78℃에서 45분에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 R-BINAL의 용액에 적가하였다. 1.5시간 후, 반응 용기를 매우 큰 듀어로 옮기고, 드라이 아이스/아세톤을 충전하고, 알루미늄 호일로 덮었다. 반응 혼합물을 -78℃에서 밤새 교반하였다. 대부분의 환원이 처음 1.5시간 내에 일어났고, 단지 소량의 추가의 전환이 밤새 일어났다. 반응물을 포화 수성 NH4Cl (150 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 실온으로 가온하였다. 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH = 7로 추가로 산성화시킨 다음, EtOAc (2 x 250 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 (125 mL) 및 염수 (125 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 146의 수율: 634 mg (53%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, EtOH 0.1% 디에틸아민 등용매, 1.75 mL/분에 의해 결정하였다. 제1 용리 R 이성질체는 86 면적% 순수하였으며, 이는 72% ee에 상응한다. 화합물 146을 키랄 반정제용 HPLC (키랄팩 AD-H 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, EtOH 0.1% 디에틸아민, 20 mL/분)에 의해 추가로 정제하였다. 화합물 146의 최종 수율: 445 mg (98% ee). 질량 계산치 C28H31FN2O2 [M+H]+: 447.25, 실측치: 447.30.
Figure pct00190
DCM (3 mL) 중 화합물 146 (0.325 g, 0.73 mmol) 및 말론산 모노메틸 에스테르 (0.103 g, 0.87 mmol)의 용액에 DCM 중 DMAP (9 mg, 0.073 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DCC (0.180 g, 0.87 mmol)를 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석하고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 147의 수율: 142 mg (37%). 질량 계산치 C32H35FN2O5 [M+H]+: 547.26, 실측치: 547.58.
Figure pct00191
NMP (0.5 mL) 중 화합물 147 (0.232 g, 0.42 mmol)의 용액에 실온에서 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (0.229 g, 1.12 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 30분 동안 가열하였다. 염수 (58 μL)를 5분에 걸쳐 2 부분으로 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 90℃에서 3시간 동안, 이어서 실온에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (12 mL)로 희석하고, 물 (3 mL)로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (12 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 층을 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH의 구배로 용리시켰다. 화합물 148의 수율: 140 mg (66%). 질량 계산치 C31H35FN2O3 [M+H]+: 503.27, 실측치: 503.29.
Figure pct00192
EtOH (3 mL) 중 화합물 148 (0.169 g, 0.34 mmol)의 용액에 EtOH (1 mL) 중 Pd/C (10% 로딩, 36 mg, 0.034 mmol)의 슬러리를 첨가하였다. 반응 용기를 가압하고, 수소로 3회 환기시켰다. 반응 용기를 3시간 동안 55 psi로 재가압하였다. 반응 혼합물을 MeOH (5 mL)로 희석하고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 생성물, 화합물 149를 100% 수율로 가정하여 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C24H31FN2O3 [M+H]+: 415.24, 실측치: 415.07.
Figure pct00193
DMF (2.5 mL) 중 화합물 149 (139 mg, 0.34 mmol) 및 아지도-PEG4-토실레이트 (0.188 mg, 0.50 mmol)의 용액에 탄산세슘 (164 mg, 0.50 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 포화 수성 NaHCO3 (3 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 (2 x 5 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C32H46FN5O6 [M+H]+: 616.35, 실측치: 616.90.
Figure pct00194
THF (1.5 mL) 및 물 (1.5 mL) 중 화합물 150 (0.207 mg, 0.34 mmol)의 용액에 수산화리튬 (0.040 g, 1.68 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 밤새 가열하였다. 다음 날 아침 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH = 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 H2O 중 35% ACN, 0.1% TFA 중에 용해시키고, RP-HPLC (써모 아쿠아실 C18, 250 x 21 mm, 5 μm, 20 mL/분, 0.1% TFA를 함유하는 H2O 중 ACN의 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 151 (SM 36)의 수율: 125 mg (3 단계에 걸쳐 52%). 질량 계산치 C31H44FN5O6 [M+H]+: 602.34, 실측치: 602.85.
구조 37c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜탄아미도)프로판산)의 합성
Figure pct00195
DMF (1.5 mL) 중 화합물 169 (90 mg, 0.268 mmol)를 HATU (112 mg, 0.295 mmol)로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. DMF (0.5) 중 화합물 170 (94 mg, 0.295 mmol) 및 DIEA (0.154 mL, 0.884 mmol)를 함유하는 혼합물을 후속적으로 첨가하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 화합물 171을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 123 mg (72%)을 수득하였다.
Figure pct00196
MeOH (2 mL) 중 탄소 상 10% 팔라듐 (21 mg, 0.0194 mmol) 및 화합물 171 (123 mg, 0.194 mmol)을 함유하는 현탁액에 60 PSI 수소를 채우고, 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 셀라이트® 상에서 여과하고, 농축시켜 조 물질 88 mg (83%)을 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00197
DMF (1 mL) 중 화합물 172 (87 mg, 0.160 mmol), Br-PEG3-N3 (50 mg, 0.176 mmol) 및 탄산세슘 (115 mg, 0.352 mmol)을 함유하는 현탁액을 60℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 화합물 173을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 91 mg (76%)을 수득하였다.
Figure pct00198
디옥산 (0.5 mL) 중 화합물 173 (50 mg, 0.067 mmol)을 디옥산 중 4M HCl (0.671 mmol, 0.168 mL) 용액으로 처리하고, 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 H2O (0.4 mL), THF (0.2 mL) 및 MeOH (0.4 mL)의 혼합물 중에 용해시키고, LiOH (8 mg, 0.356 mmol)로 처리하고, 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스 제미니 C18 칼럼 (21.2x250mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 25 mg (60%, 2-단계)을 수득하였다.
구조 38c ((S)-3-(2-(3-((2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에틸)아미노)-3-옥소프로필)피리미딘-5-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 구조 39c ((S)-3-(2-(1-아지도-12-옥소-3,6,9-트리옥사-13-아자헥사데칸-16-일)피리미딘-5-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)의 합성
Figure pct00199
무수 THF (95 mL) 중 5-브로모-2-아이오도-피리미딘 (8.00 g, 28.1 mmol)의 용액에 THF 중 i-PrMgBr의 용액 (0.75 M, 56 mL, 42.0 mmol)을 -78℃에서 첨가하면서 내부 온도를 < -70℃로 (대략 15분) 유지시켰다. 이어서, 생성된 용액을 15분 동안 교반한 후, THF 중 CuCN·2LiCl 용액 (1 M, 31 mL, 31.0 mmol)에 이어서 알릴 브로마이드 (5.10 g, 42 mmol)를 THF (10 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 MeOH (40 mL)로 켄칭하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-20%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 152의 수율: 4.13 g (74%). 질량 계산치 C7H7BrN2 [M+H]+: 198.99, 실측치: 199.05.
Figure pct00200
THF (115 mL) 중 화합물 152 (7.70 g, 38.7 mmol)의 용액에 THF 중 9-BBN의 용액 (0.5 M, 131 mL, 65.8 mmol)을 0℃에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (100 mL) 중 NaHCO3 (48.7 g, 580 mmol)의 슬러리에 이어서 물 (100 mL) 중 NaBO3 1수화물 (46.3 g, 464 mmol)의 슬러리를 0℃에서 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 혼합물을 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성 층을 EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수 (100 mL)로 세척하였다. 염수 층을 EtOAc (100 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 ~15 g의 조 황색 오일을 수득하였다. 조 물질을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (50-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 153의 수율: 3.44 g (41%). 질량 계산치 C7H9BrN2O [M+H]+: 217.00, 실측치: 216.97.
Figure pct00201
DCM (40 mL) 중 화합물 153 (3.44 g, 15.8 mmol)의 용액에 0℃에서 이미다졸 (1.73 g, 25.4 mmol) 및 DCM (12 mL) 중 TBDPSCl (5.23 g, 19.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (75 mL)으로 희석하고, 물 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-8%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 154의 수율: 5.56 g (77%). 질량 계산치 C23H27BrN2OSi [M+H]+: 455.12, 실측치: 455.44.
Figure pct00202
-75℃에서 THF (150 mL) 중 화합물 154 (6.07 g, 13.3 mmol)의 용액에, 내부 온도를 < -70℃로 (대략 10분) 유지시키면서, THF 중 nBuLi의 용액 (2.5 M, 5.6 mL, 14.0 mmol)을 적가하였다. 3분 후, 내부 온도를 < -70℃로 유지시키면, THF (5 mL) 중 에틸 포르메이트 (1.04 g, 1.13 mL, 14.0 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 20분 동안 교반한 다음, 디옥산 중 HCl (4 M, 3.67 mL, 14.7 mmol)로 켄칭하고, 내부 온도를 < -65℃로 유지시키면서 THF (5 mL)로 추가로 희석하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응물을 주위 온도로 가온하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-20%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 155의 수율: 1.79 g (33%).
1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 10.09 (s, 1H), 9.06 (s, 2H), 7.64 (m, 4H), 7.38 (m, 6H), 3.77 (t, 2H), 3.20 (t, 2H), 2.17 (q, 2H), 1.03 (s, 9H).
Figure pct00203
THF (25 mL) 중 화합물 144 (1.68 g, 4.15 mmol) 및 화합물 155 (1.70 g, 4.98 mmol)의 용액에 K2CO3 (0.861 g, 6.23 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 2.5시간 동안 가열한 다음, 50℃로 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 물 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 EtOAc (0-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 156의 수율: 2.04 g (79%). 질량 계산치 C38H46N4O2Si [M+H]+: 619.35, 실측치: 619.69.
Figure pct00204
R-BINAL의 제조: LAH (1.169 g, 30.8 mmol)를 건조 THF (90 mL) 중에 슬러리화하였다. Tint를 < 40℃로 유지시키면서 슬러리에 EtOH를 THF 중 용액 (6 M, 5.2 mL, 31.4 mmol)으로서 첨가하였다. 혼합물을 35℃에서 40분 동안 숙성시킨 다음, 30℃로 냉각시켰다. Tint를 < 40℃로 유지시키면서 THF (45 mL) 중 R-(BINOL) (9.00 g, 31.4 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 숙성시키고, 주위 온도로 냉각시킨 다음, 50℃로 가열하고, TMEDA (14.1 mL, 11.0 g, 94.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 숙성시키고, 주위 온도로 냉각시킨 다음, 화합물 156과 함께 사용하였다.
THF 중 R-BINAL (~0.2 M, 110 mL, 22.0 mmol)의 용액에 THF (12 mL) 중 화합물 16 (1.16 g, 1.88 mmol)의 용액을 -78℃에서 5분에 걸쳐 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl로 켄칭하고, 실온으로 가온하고, 생성물을 EtOAc (3 x 125 mL)로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 1% 트리에틸아민을 함유하는 EtOAc 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 157의 수율: 0.96 g (82%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, 25% EtOH, 75% 헥산, 0.1% 디에틸아민 등용매, 2 mL/분)에 의해 결정하였다. 제2 용리 R 이성질체는 ~95 면적% 순수하였으며, 이는 ~90% ee에 상응한다. 질량 계산치 C38H48N4O2Si [M+H]+: 621.36, 실측치: 621.71.
Figure pct00205
트리에틸오르토아세테이트 (9.25 mL) 중 화합물 157 (0.925 g, 1.49 mmol)의 용액에 트리메틸오르토아세테이트 중 프로피온산의 용액 (0.15 M, 0.55 mL, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밀봉된 바이알에서 140℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 EtOAc (0-50%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 158의 수율: 0.898 g (87%). 질량 계산치 C42H54N4O3Si [M+H]+: 691.41, 실측치: 691.93.
Figure pct00206
EtOH (10 mL) 중 화합물 158 (0.893 g, 1.30 mmol)의 용액에 EtOH (4 mL) 중 Pd/C (로딩 정도: 10 wt%, 0.138 g, 0.13 mmol)의 슬러리를 첨가하였다. 반응 혼합물에 50 psi H2를 채우고, 4.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 159의 수율: 0.885 g (99%). 질량 계산치 C42H56N4O3Si [M+H]+: 693.42, 실측치: 693.82.
Figure pct00207
THF (2.5 mL) 중 Boc 무수물 (0.836 g, 3.83 mmol)의 용액에 화합물 159 (0.885 g, 1.28 mmol)에 이어서 DMAP의 용액 (THF 중 20 mg/mL, 155 uL, 0.0031 g, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃로 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 헥산 중 EtOAc (0-50%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 160의 수율: 0.721 g (71%). 질량 계산치 C47H64N4O5Si [M+H]+: 793.47, 실측치: 794.28.
Figure pct00208
THF (6 mL) 중 화합물 160 (0.621 g, 0.783 mmol)의 용액에 THF 중 TBAF의 용액 (1 M, 1.2 mL, 1.2 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (2 x 10 mL)로 세척하였다. 유기 층을 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (50-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 21의 수율: 0.362 g (83%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, 20% EtOH, 80% 헥산, 0.1% 디에틸아민, 등용매, 1.5 mL/분에 의해 결정하였다. 제2 용리 R 이성질체는 93% 순수하였으며, 이는 86% ee.에 상응한다. 화합물 161을 키랄 반정제용 HPLC (키랄팩 AD-H 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 20% EtOH, 80% 헥산, 0.1% 디에틸아민, 60 mL/분)에 의해 추가로 정제하였다. 화합물 161의 최종 수율: 308 mg (99% ee). 질량 계산치 C31H46N4O5 [M+H]+: 555.36, 실측치: 555.72.
Figure pct00209
ACN (0.30 mL) 중 화합물 161 (0.030 g, 0.054 mmol)의 용액에 실온에서 BAIB (0.042 g, 0.130 mmol) 및 TEMPO (2.5 mg, 0.016 mmol)에 이어서 물 (0.30 mL)을 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 0.1% TFA 물/ACN, 30-80% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 162의 수율: 0.030 g (97%). 질량 계산치 C31H44N4O6 [M+H]+: 569.34, 실측치: 569.68.
Figure pct00210
DMF (0.5 mL) 중 화합물 162 (33 mg, 0.058 mmol) 및 아미노-PEG2-아지드 (15 mg, 0.087 mmol)의 용액에 TBTU (32 mg, 0.099 mmol)에 이어서 DIEA (35 μL, 26 mg, 0.203 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 생성물인 화합물 163을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C37H56N8O7 [M+H]+: 725.44, 실측치: 725.77.
Figure pct00211
THF (0.30 mL) 중 화합물 163 (42 mg, 0.058 mmol)의 용액에 LiOH의 1 M 용액 (0.174 mL, 0.174 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 가열하였다. 추가 부분의 LiOH를 첨가하였다 (0.174 mL, 0.174 mmol). 3시간 후, 반응을 멈추고, LiOH의 추가의 부분 (0.174 mL, 0.174 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 추가로 2시간 동안 교반하였다 (9 당량 LiOH, 총 5시간). 반응 혼합물을 3 N HCl을 사용하여 pH = 5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 TFA:물 [95:5] 중에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 물/0.1% TFA를 함유하는 ACN, 20-50% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 164 (구조 38c)의 수율: 23 mg (66%). 질량 계산치 C30H44N8O5 [M+H]+: 597.35, 실측치: 597.85.
Figure pct00212
THF (150 μL) 중 화합물 161 (30 mg, 0.054 mmol)의 용액에 디페닐 포스포릴 아지드 (35 μL, 45 mg, 0.162 mmol)에 이어서 DBU (12 μL, 12 mg, 0.081 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, 반응 혼합물을 60℃에서 7시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 0.1% TFA 물/ACN, 32-60% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 165의 수율: 14 mg (44%). 질량 계산치 C31H45N7O4 [M+H]+: 580.36, 실측치: 580.66.
Figure pct00213
EtOH (100 μL) 중 화합물 165 (18 mg, 0.031 mmol)의 용액에 EtOH (170 μL) 중 Pd/C의 슬러리 (10% 로딩, 3.3 mg, 0.003 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기에 H2를 채운 다음, 3회 배기시키고, 이어서 H2 (1 atm)를 채웠다. 30분 후, 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 166의 수율: 17 mg (99%). 질량 계산치 C31H47N5O4 [M+H]+: 554.37, 실측치: 554.73.
Figure pct00214
DMF (170 μL) 중 화합물 166 (17 mg, 0.031 mmol) 및 아지도-PEG3-NHS 에스테르 (14 mg, 0.040 mmol)의 용액에 실온에서 DIEA (16 μL, 12 mg, 0.092 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시킨 다음, 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C40H62N8O8 [M+H]+: 783.48, 실측치: 783.84.
Figure pct00215
THF (180 μL) 중 화합물 167 (24 mg, 0.031 mmol)의 용액에 LiOH의 1 M 용액 (153 μL, 0.153 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 가열하였다. 1시간 후, 추가 부분의 LiOH를 첨가하였다 (153 uL, 0.153 mmol, 5 당량). 반응 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 3 N HCl을 사용하여 pH = 5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 TFA:물 [95:5] 중에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 물/0.1% TFA를 함유하는 ACN, 15-45% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 168 (구조 39c)의 수율: 9.8 mg (49%). 질량 계산치 C33H50N8O6 [M+H]+: 655.40, 실측치: 656.01.
약동학적 인핸서의 합성
Mal-C22-이산
Figure pct00216
화합물 1 (0.200 g)을 DMF 2 mL 중 TBTU (0.182 g)와 혼합하였다. DIPEA (0.207 mL)를 적가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.227 g)를 5분 후에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 DCM 40 mL로 희석하고, 5% 시트르산 (4x30mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 생성된 고체를 Hex:EtOAc 0=>80% 중 콤비플래쉬® 상의 12 G 레디-셉(Redi-Sep)® Rf 칼럼 상에 30분에 걸쳐 건조-로딩하였다. 수율: 53 mg (39.2%).
Figure pct00217
화합물 1을 톨루엔, DMF 중 20% 피페리딘, 및 Et3N 혼합물로 2회 공비 증류시켰다. 수율은 50 mg이었다.
Figure pct00218
화합물 1 (0.0350 g) 및 2 (0.105 g)를 DMF 중에서 합하고, Et3N (0.095 mL)을 첨가하였다. 반응은 1시간 후에 완결되었다. 이어서, 혼합물을 DCM으로 희석하고, 5% 시트르산 (3x8mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 톨루엔 1 mL 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 4G 레디-셉 Rf 칼럼 상에 Hex:EtOAc 0=>100% EtOAc로 15분에 걸쳐 로딩하였다. 이어서, 이동상을 DCM:20% MeOH를 함유하는 DCM 0=>100%로 20분에 걸쳐 전환시켰다. 수율: 12 mg (24.9%).
Figure pct00219
화합물 1 (0.012 g)을 DCM/TFA의 1:1 혼합물 1 mL 중에 용해시켰다. 반응물을 3시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 0.0110 g (99.6%).
C18-이산-N3
Figure pct00220
화합물 1 (0.500 g, 아스타 테크.(Asta Tech.)® #64704) 및 화합물 2 (0.454 g, 켐-임펙스(Chem-Impex) #16167)를 DMF 중에 용해시키고, TBTU (0.442 g) 및 DIPEA (0.586 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 DCM (40 mL)으로 희석하고, H2O (4x40mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 DCM 2 mL 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 레디-셉 Rf 칼럼 상에 로딩하였다 (이동상 DCM:20% MeOH를 함유하는 DCM 0=>20%, 25분에 걸침). 생성물을 고진공 하에 농축시켰다. 수율: 740 mg (85%).
Figure pct00221
화합물 1 (0.720 g)을 플라스크에서 MeOH 5 mL 중에 용해시켰다. 격막을 플라스크에 넣고, 분위기를 배기시키고, 질소로 2회 대체하였다. 이어서, Pd/C 30% (0.200 g)를 칭량지를 통해 첨가하였다. 격막을 대체한 다음, 분위기를 배기시키고, 수소로 2회 대체하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 665 mg.
Figure pct00222
화합물 1 (0.150 g) 및 화합물 2 (0.0618 g)를 DMF 중에 용해시키고, TBTU (0.0884 g) 및 DIPEA (0.117 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 DCM (12 mL)으로 희석하고, 물 (4 x 8 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 DCM (1 mL) 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 4G 레디-셉 Rf 칼럼 상에 로딩하였다 (이동상 DCM:20% 메탄올을 함유하는 DCM 0=>50%, 25분에 걸침). 수율: 162 mg (79%).
Figure pct00223
화합물 1 (0.155 g)을 DCM:TFA의 1:1 혼합물 중에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 회전 증발기 상에서 농축시키고, 고진공 하에 두었다. 수율: 129 mg (97%).
Mal-C18-이산 (D-버전)
Figure pct00224
화합물 1 (0.500 g) 및 화합물 2 (0.4539 g)를 DMF 중에 용해시키고, TBTU (0.4418 g) 및 DIPEA (0.586 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 DCM (40 mL)으로 희석하고, 물 (4 x 40 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 DCM (2 mL) 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 4G 레디-셉 Rf 칼럼 상에 로딩하였다 (이동상 DCM:20% 메탄올을 함유하는 DCM 0=>50%, 25분에 걸침). 수율: 740 mg (85%).
Figure pct00225
화합물 1 (0.720 g)을 MeOH 5 mL 중에 용해시킨 다음, 격막을 플라스크에 두고, N2를 2회 적용하였다. 이어서, Pd/C (0.200 g)를 칭량지를 통해 첨가한 다음, 격막을 교체하고, 진공에 이어서 H2를 2회 적용하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 여과하고, 여과물을 회전증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 655 mg.
Figure pct00226
화합물 1 (0.100 g) 및 화합물 2 (0.0318 g)를 DMF 중에 용해시키고, TBTU (0.0589 g) 및 DIPEA (0.078 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석하고, 물 (4 x 7 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 DCM (0.5 mL) 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 4G 레디-셉 Rf 칼럼 상에 로딩하였다 (이동상 DCM:20% 메탄올을 함유하는 DCM 0=>50%, 25분에 걸침). 수율: 100 mg (82%).
Figure pct00227
화합물 1 (96 mg)을 TFA:DCM의 1:1 혼합물 중에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 농축시키고, 고진공 하에 두었다. 수율 80 mg (99%).
Mal-C18-메틸-삼산
Figure pct00228
THF 1 mL 중 화합물 2 (시그마(Sigma)® #254487, 0.405 g)를 THF 중 NaH의 현탁액 (3.5 mL)에 0℃에서 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 20분 동안 교반하였다. 반응물을 투명해질 때까지 혼합하였다. 이어서, 2 mL THF 중 화합물 1 (시그마® #684511, 0.436 g)을 0℃에서 적가하고, 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 DCM (35 mL)으로 희석하고, NH4Cl 용액 (1 x 8 mL)으로 세척하였다. 유기부를 DCM (1 x 8 mL)으로 역추출하였다. 유기부를 합하고, H2O (2 x 8 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 크로마토그래피 (톨루엔 (1 mL) 중에서 콤비플래쉬® 12 G 레디셉 Rf 골드 상에 습윤-로딩, 이동상 헥산:10% EA를 함유하는 헥산 => 0=>50%, 25분에 걸침)를 통해 정제하였다. 수율: 390 mg (64.5%).
Figure pct00229
화합물 1 (0.5 mL THF 중 0.100 g)을 0.75 mL THF 중 NaH의 현탁액에 0℃에서 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 투명해졌다. 이어서, 화합물 2 (시그마® 67692, 0.5 mL THF 중 0.016 mL)를 0℃에서 적가하고, 0.5시간 동안 교반하였다. 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 반응물을 DCM (20 mL)으로 희석하고, NH4Cl (1 x 5 mL)로 세척하였다. 유기 층을 DCM (1 x 5 mL)으로 역추출하였다. 유기부를 합하고, H2O (2 x 5 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 크로마토그래피 (톨루엔 (1 mL) 중에서 콤비플래쉬® 12 G 레디셉 Rf 골드 상에 습윤-로딩, 이동상 헥산:10% EA를 함유하는 헥산 0=>50%, 25분에 걸침)를 통해 정제하였다. 수율: 30 mg (29.2%).
Figure pct00230
화합물 1 (0.0300 g)을 THF 0.4 mL 중에 용해시켰다. 이어서, LiOH (THF 10 mL 중 480 mg)를 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 시트르산을 사용하여 pH=3으로 산성화시켰다. 유기 층을 DCM 2 x 6 mL로 추출하고, 유기부를 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 수율: 25 mg (85.7%).
Figure pct00231
화합물 1 (0.0250 g) 및 화합물 2 (켐 임펙스® # 30487, 0.0238 g)를 DMF 중에 용해시키고, TBTU (0.0190 g) 및 DIPEA (0.022 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 DCM으로 9 mL로 희석하고, 물 (3 x 7 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 DCM (0.5 mL) 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 4G 레디-셉 Rf 칼럼 상에 로딩하였다 (이동상 DCM:20% 메탄올을 함유하는 DCM 0=>25%, 15분에 걸침). 수율: 37.1 mg (84.7%).
Figure pct00232
화합물 1 (0.0320 g)을 DMF 중 20% 피페리딘 0.5 mL 중에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 고진공 하에 농축시킨 다음, 톨루엔 중에 용해시키고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 2 x 0.25 mL 헹굼하면서 0.5 mL의 DCM 중에 두고, 콤비플래쉬® 상의 사전-평형화된 4g 레디셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM=>20% MeOH를 함유하는 DCM 0=>50%로 20분에 걸쳐 습윤-로딩하였다. 수율: 0.020 g (84.7%).
Figure pct00233
화합물 1 (0.0200 g)을 DMF (0.4 mL) 중 Et3N (0.022 mL)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (아스타 테크® #24961, 0.0246 g)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 DCM을 사용하여 10 mL로 희석하고, 물 중 5% 시트르산 (3 x 5 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 2 x 0.3 mL 헹굼하면서 0.5 mL DCM 중에서 사전-평형화된 4g 레디 셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM => DCM 중 20% MeOH 0=> 30%로 20분에 걸쳐 습윤-로딩하였다. 수율: 20 mg.
이어서, 생성물을 TFA:DCM의 1:1 혼합물 2 mL 중에 두고, 2시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 수율: 13 mg.
Mal-C17-플루오로-PO3 일산
Figure pct00234
화합물 1 (시그마® #177490, 5.00 g)을 THF 70 mL 및 DMF 20 mL의 혼합물 중에 용해시켰다. 이어서, 데스-마르틴 퍼아이오디난 (시그마® #274623, 11.7 g)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 교반되도록 하였다. 혼합물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시킨 다음, 콤비플래쉬® 상의 120g 레디-셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 10% DCM을 함유하는 헥산 : EtOAc, 0=>30%로 30분에 걸쳐 건조-로딩하였다. 수율: 2.86 g.
Figure pct00235
화합물 1 (2.85 g) 및 벤질 알콜 (1.36 mL)을 DCM 50 mL 중에서 혼합하고, 0℃로 냉각시켰다. 이어서 EDC (2.53 g) 및 DMAP (0.257 g)를 순차적으로 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되도록 한 다음, TLC에 의해 모니터링하면서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 NH4Cl (1 x 50 mL) 용액 및 DCM으로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 80g 레디셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 에틸 아세테이트 : 헥산, 0=>15%로 30분에 걸쳐 건조-로딩하였다. 수율: 2.31 g (61.0%).
Figure pct00236
NaH (오일 중 60%, 0.047 mL)를 플라스크에 첨가하고, 플라스크에 15 mL THF를 채웠다. 플라스크를 0℃로 냉각시키고, 2 mL THF 중 화합물 1 (에이케이 사이언티픽(AK Scientific) #J91196, 0.500 g)을 적가하였다. 반응물을 5분 동안 교반한 다음, 얼음을 제거하고, 반응물을 실온에서 15분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 화합물 2 (도쿄 케미칼 인더스트리 캄파니(Tokyo Chemical Industry Co.) #f0358, 0.768 g)를 하나의 고체 부분으로서 첨가하였다. 이어서, 무수 DMF 0.3 mL를 첨가한 후, 빙조를 제거하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 DCM (50 mL)으로 희석하고, 포화 NH4Cl (1 x 12 mL)로 세척하였다. 수성 층을 DCM (1 x 10 mL)으로 세척하였다. 유기부를 합하고, H2O (2 x 10 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 1.5 mL DCM 중에서 콤비플래쉬 상의 4G 레디-셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM, 0=>30%로 20분에 걸쳐 로딩하였다. 수율 157 mg (36.2%).
Figure pct00237
화합물 2 (0.5 mL THF 중 0.149 g)를 THF 중 NaH의 현탁액 (0.75 mL)에 0℃에서 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 20분 동안 교반하였다. 1.25 mL THF 중 화합물 1 (0.140 g)의 용액을 0℃에서 서서히 첨가하고, 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 DCM (20 mL)으로 희석하고, 포화 NH4Cl (1 x 5 mL)로 세척하였다. 생성물을 DCM (1 x 5 mL)으로 역추출하였다. 합한 유기 층을 H2O (2 x 5 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 1 g 실리카, 4G 레디셉 Rf 골드, 이동상 헥산:EtOAc 0=>50% 상에 건조 로딩하였다. 수율 67 mg (33.7%).
Figure pct00238
화합물 1 (0.0530 g)을 2 mL MeOH 중에 용해시킨 다음, 격막을 플라스크에 두고, N2를 2회 적용하였다. 이어서, Pd/C (0.0250 g)를 칭량지를 통해 첨가한 다음, 격막을 교체하고, 진공에 이어서 H2를 2회 적용하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 생성물을 시린지 필터로 여과하고, 여과물을 회전증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 36 mg (82.0%).
Figure pct00239
화합물 1 (0.0200 g)을 DMF 0.3 mL 중에 용해시킨 다음, TBTU (0.0174 g)에 이어서 DIPEA 0.021 mL를 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반되도록 한 다음, 화합물 2 (켐 임펙스® #30487, 0.0217 g)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 혼합물을 6 mL DCM으로 희석하고, H2O (3 x 3 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 1 mL DCM 중에서 콤비플래쉬® 상의 레디셉 4G 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM, 0=>30%로 15분에 걸쳐 로딩하였다. 수율 10 mg (88.8%).
Figure pct00240
화합물 1 (0.0330 g)을 20% 피페리딘을 함유하는 0.5 mL DMF 중에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 1 mL DCM 중에서 콤비플래쉬 상의 4G 레디셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM, 0=>50%로 20분에 걸쳐 로딩하였다. 수율: 11.5 mg (48.5%).
Figure pct00241
화합물 1 (0.0115 g)을 DMF 0.3 mL 중에 용해시키고, 화합물 2 (아스타 테크® #24961, 0.0156 g) 및 Et3N (0.014 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 DCM (6 mL)으로 희석하고, 5% 시트르산 (3 x 3 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 1 mL DCM 중에서 콤비플래쉬 상의 4G 레디셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM 0 => 35%로 20분에 걸쳐 로딩하였다. 수율: 10 mg (64.9%).
Figure pct00242
화합물 1 (0.0100 g)을 DCM 0.3 mL 중에 용해시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이어서 TMS-Br 0.051 mL를 첨가하고, 반응물을 0℃에서 4시간에 이어서 실온에서 3시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 건조시키고, MeOH 1 mL를 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반되도록 하였다. 생성물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 톨루엔 공비혼합 (3 x 1 mL)으로 건조시켰다. 이어서, 반응물을 DCM : TFA 1 : 1 (1 mL) 중에 두고, 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 반응물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 수율: 8.5 mg (99%).
Mal-C17-플루오로-PO3
Figure pct00243
화합물 1 (0.0150 g)을 DMF 0.25 mL 중에 용해시켰다. 이어서, TBTU (0.0125)를 혼합물에 첨가한 후 DIEA (0.015 mL)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 화합물 2 (0.0062 g)를 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 DCM (6 mL)으로 희석하고, H2O (3 x 3 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전 증발기 상에서 고진공 하에 농축시켰다. 생성물을 1 mL DCM 중에서 콤비플래쉬 상의 4G 레디셉 골드 Rf 칼럼 상에 이동상 DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM 0 => 30%로 15분에 걸쳐 로딩하였다. 수율: 12.5 mg (64.7%).
Figure pct00244
0.4 mL DCM 중 화합물 1 (0.0125 g)의 용액을 0℃로 냉각시키고, TMSBr을 적가하였다. 반응물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 회전 증발기에 의해 고진공 하에 완전히 제거하였다. 잔류물을 MeOH와 함께 2시간 동안 교반하여 TMS를 제거하였다. 혼합물을 회전 증발기 상에서 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 11.5 mg (98.8%).
Mal-C18-이산 및 관련 화합물의 합성
Figure pct00245
단계 1: 화합물 1 (MW=370.57, 0.741g, 2 mmol)을 10mL DMF 중에 용해시켰다. TBTU (Mw=321, 0.642g, 2mmol) 및 DIPEA (Mw=129, 0.87ml, 5mmol)를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 화합물 2를 첨가하였다 (Mw=418.9, 0.838g, 2mmol). 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 40 ml DCM으로 희석하고, 물로 3회 (각각 40mL) 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 칼럼 크로마토그래피 (EA:HEX=0%-100%)를 사용하여 정제하여 화합물 3 (80% 수율)을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 736).
단계 2: 화합물 3을 DMF 중 20% 피페리딘으로 30분 동안 처리하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 크로마토그래피 (MeOH:DCM=0%-10%)를 통해 정제하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 514). (관찰된 질량, M + 1 = 707).
단계 3: 화합물 4 (Mw=513, 50mg, 0.0975mmol)를 1 ml DMF 중에 용해시켰다. 화합물 5 (Mw=308, 36mg, 1.2 당량) 및 TEA (0.041ml, 3 당량)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 용액을 DCM으로 희석하고, 물로 3회 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 크로마토그래피 (EA:HEX=0%-100%)에 의해 정제하여 화합물 6을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 594).
단계 4: 화합물 6을 DCM 중 50% TFA로 2시간 동안 처리하였다. 용매를 증발시켜 화합물 7 (Mal-C18-이산) (관찰된 질량, M+1 = 594)을 수득하였다.
Mal-C18-삼산
Figure pct00246
단계 1: 화합물 9 (1.2 당량)를 THF 3 ml 중 NaH (1.2 당량)의 용액에 0℃에서 첨가하고, 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, THF 1 ml 중 화합물 8 (1 mmol, 1 당량)을 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 용액이 투명해질 때까지 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 실온으로 상승시켰고, 용액은 천천히 슬러리가 되었다. 5시간 후, 반응물을 NH4Cl로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 생성물을 칼럼 (Hex : 헥산 중 10% EtOAc) 상에서 정제하였고, 피크는 약 0%-3%의 EtOAc에서 출현하였다. (42% 수율, 200 mg) (관찰된 질량, M + 1 = 486).
단계 2: 화합물 10을 THF (3 mL) 중에 용해시키고, 1M LiOH (3 mL)를 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 25℃에서 교반하였다. 이어서, 용액을 시트르산으로 pH =3으로 산성화시키고, DCM (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 진공 하에 농축시켰고, 추가로 정제하지 않았다. (관찰된 질량, M + 1 = 472).
Mal-C18-이산에 대해 기재된 것과 동일한 합성으로 화합물 1 대신 화합물 11을 사용하여 Mal-C18-삼산을 합성하였다. (관찰된 질량, M+1 = 638).
Mal-C18-이산-PO3
Figure pct00247
단계 1: 화합물 12 (2.64 mmol, 1 당량) 및 화합물 13 (2.909 mmol, 1.1 당량)을 DCM 중에서 함께 혼합하고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. EDC (1.1 당량) 및 DMAP (0.2 당량)를 순차적으로 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하고, TLC 헥산 : EtOAc 8:2에 의해 모니터링하였다. 유기부를 NH4Cl 용액 및 DCM으로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 크로마토그래피 (EA: HEX = 0%에서 10%)를 사용하여 정제하였다. 생성물 스폿은 약 2%의 EA에서 출현하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 426).
단계 2: 화합물 15 (1.2 당량)를 THF 3 mL 중 NaH (1.2 당량)의 용액에 0℃에서 첨가하고, 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. THF 1 ml 중 화합물 14 (0.470 mmol, 1 당량)를 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 반응물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였고, 용액은 투명하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 상승시켰고, 용액은 천천히 슬러리가 되었다. 5시간 후, 반응물을 NH4Cl로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 칼럼 (Hex : 헥산 중 10% EtOAc), 피크는 약 3%의 EtOAc에서 출현하였다. (16% 수율, 45 mg) (관찰된 질량, M + 1 = 598).
단계 3: 화합물 16 (0.0519 mmol, 1 당량)을 MeOH 중에 용해시켰다. 이어서 Pd/C (60 mg)를 반응물에 첨가하고, H2를 사용하여 수회의 퍼징 및 재충전 사이클을 수행하였다. 반응물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실리카를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켜 생성물을 수득하였다. (24 mg, 92% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 508).
Mal-C18-이산의 합성에서의 화합물 1을 화합물 17로 치환함으로써, Mal-C18-이산과 동일한 방식으로 Mal-C18-이산-PO3을 합성하였다. (관찰된 질량, M+1 = 674).
Mal-C6-PEG2-C18-이산
Figure pct00248
단계 1: 화합물 1 (1 당량, 2mmol)을 10mL DMF 중에 용해시켰다. TBTU (1 당량, 2mmol) 및 DIPEA (2.5 당량, 5mmol)를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 화합물 2를 첨가하였다 (1 당량, 2mmol). 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 40 mL DCM으로 희석하고, 물로 3회 (각각 40mL) 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 크로마토그래피 (DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM =0%-25%)에 의해 정제하여 화합물 3 (80% 수율)을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 647). (관찰된 질량, M+1 = 767).
단계 2: 화합물 3 (1.6 mmol, 1 당량)을 MeOH 중에 용해시켰다. Pd/C (150 mg)를 반응물에 첨가하고, H2를 사용하여 수회의 퍼징 및 재충전 사이클을 수행하였다. 반응물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응물을 실리카를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켜 생성물을 수득하였다. (1.5 mmol, 94% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 557).
단계 3: 화합물 4 (1 당량, 1.5 mmol)를 10 ml DMF 중에 용해시켰다. TBTU (1 당량) 및 DIPEA (2.5 당량)를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 화합물 5 (1 당량, 1.5 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 40 mL DCM으로 희석하고, 물로 3회 (각각 40 mL) 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 크로마토그래피 (DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM =0%-25%)하여 화합물 6 (80% 수율)을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 909).
단계 4: 화합물 6 (1 당량, 1.2 mmol)을 DMF 중 20% 피페리딘으로 30분 동안 처리하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 크로마토그래피 (DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM =0%-30%)를 통해 정제하여 화합물 7 (0.984 mmol, 82% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 687)을 수득하였다.
단계 5: 화합물 7 (1 당량, 0.984 mmol)을 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. 화합물 8 (1.2 당량, 1.18 mmol) 및 TEA (3 당량, 2.952 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 용액을 DCM (30 mL)으로 희석하고, 물로 3회 (각각 15 mL) 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 크로마토그래피 (DCM : 20% MeoH를 함유하는 DCM =0%-30%)하여 화합물 9 (0.738 mmol, 75% 수율)를 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 880).
단계 6: 화합물 9를 DCM 중 50% TFA로 2시간 동안 처리하였다. 혼합물을 진공 하에 농축시켜 화합물 10을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 768).
Mal-C6-PEG4-C18-이산
Mal-C6-PEG4-C18-이산을 Mal-C18-이산과 동일한 방식으로 합성하되, NHFmoc-PEG2-NH2에 의한 처리에 화합물 7을 적용하였다. Fmoc 보호기를 단계 4에 기재된 바와 같이 20% 피페리딘 탈보호로 제거한 다음, 단계 5 및 6을 상기 기재된 바와 같이 반복하였다 (관찰된 질량, M+1 = 912).
Mal-비스 C18-이산
Figure pct00249
단계 1 & 2: 화합물 4를 상기 Mal-C18-이산의 합성에 기재된 바와 같이 합성하였다.
단계 3: 화합물 5 (1.0 mmol, 1 당량), 화합물 6 (1.3 당량) 및 TEA (5.0 당량)를 DMF 3 mL 중에서 잘 혼합하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 회전 증발기 상에서 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 DCM 중 1%HOAc 중 약 4%MeOH로 용리시켰다. LC-MS는 불순물이 존재하는 목적하는 피크를 나타내었다. 최종 생성물은 45% 수율로 170 mg이었다.
단계 4: 화합물 7 (0.12 mmol, 1당량), 화합물 8 (2.4 당량), TBTU (2.4 당량) 및 DIPEA (5.0 당량)를 DMF 1 mL 중에서 잘 혼합하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. LC-MS는 생성물 뿐만 아니라 1종의 주요 부산물 (생성물 초과) 및 3종의 소량의 불순물을 나타내었다. 혼합물을 회전 증발기에 의해 농축시키고, 칼럼 상에서 DCM/MeOH에 의해 정제하였다. 생성물을 약 6-12%의 MeOH로 용리시켰다. 최종 생성물을 78 mg (오일)으로서 42% 수율로 수득하였다.
단계 5: 화합물 9 (0.05 mmol)를 DCM/TFA (1/1, v/v) 2mL 중에 용해시켰다. 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 화합물 10 72 mg을 99% 수율로 수득하였다.
단계 6: 화합물 10 (0.05 mmol, 1 당량), 화합물 4 (2.2 당량), TBTU (2.2 당량) 및 DIPEA (8.0 당량)를 0.5 mL DMF 중에서 잘 혼합하였다. 반응물을 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 생성물 뿐만 아니라 1종의 주요 부산물 (비극성 TFA 방법)을 나타내었다. 혼합물을 회전 증발기에 의해 농축시키고, 칼럼 상에서 DCM/MeOH에 의해 정제하였다. 생성물을 약 8-12%의 MeOH로 용리시켰다. 화합물 11을 60 mg으로서 49% 수율로 수득하였다.
단계 7: 화합물 11 (0.025 mmol)을 0.5 mL DCM/TFA (1/1, v/v) 중에 용해시켰다. 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 화합물 12, 53 mg을 97% 수율로 수득하였다.
Mal-C18-산 및 관련 화합물의 합성
Figure pct00250
단계 1: 화합물 1 (0.27 mmol, 1 당량)을 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. TBTU (1 당량) 및 DIPEA (2.5 당량)를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 화합물 2를 첨가하였다 (1 당량). 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 40 ml DCM으로 희석하고, 물로 3회 (각각 40 mL) 세척하였다. 유기 상을 회전 증발기를 사용하여 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피 (EA:HEX=0%-100%)를 사용하여 정제하여 화합물 3을 수득하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 494).
단계 2: 화합물 3을 DCM 중 50% TFA로 2시간 동안 처리하였다. 생성물을 회전 증발기를 사용하여 농축시켜 화합물 4를 수득하였다. (관찰된 질량, M+1 = 437).
Mal-C20-산
화합물 1 대신 상업적으로 입수가능한 C20 출발 물질을 사용하여 Mal-C18-산과 동일한 방식으로 Mal-C20-산을 합성하였다 (관찰된 질량, M+1 = 465).
Mal-C17-PO3
Figure pct00251
단계 1: DMP (1.3 당량, 4.78 mmol) 및 화합물 5 (1 당량, 3.68 mmol)를 DMF (15 mL) 중에서 혼합하였다. 2시간 후, TLC에 의해 제시된 바와 같이 반응이 종료되었다. 일부 고체 침전물이 형성되었다. 후처리: 여과하여 고체를 제거하고, DCM으로 헹구었다. 생성물을 진공 하에 농축시키고, 크로마토그래피 (10% DCM을 함유하는 Hex : EtOAC => 0% -20%)를 사용하여 정제하였고, 생성물은 5%-10%에서 용리되었다. (0.8136 mmol, 22% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 271).
단계 2: 화합물 6 (1 당량, 0.8136 mmol) 및 화합물 7 (1.1 당량, 0.8949 mmol)을 DCM (5 mL) 중에서 혼합하고, 0℃로 냉각시켰다. EDC (1.1 당량) 및 DMAP (0.2 당량)를 순차적으로 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하고, TLC 헥산 : EtOAc 8:2에 의해 모니터링하였다. 생성물을 NH4Cl 용액 및 DCM으로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 크로마토그래피 (Hex : EtOAC = 0%에서 10%)를 통해 정제하였다. 생성물 스폿은 4%의 EtOAc (0.4438 mmol, 54.5% 수율)에서 출현하였다. (관찰된 질량, M + 1 = 361).
단계 3: 화합물 9 (1.4 당량)를 THF 1.5 ml 중 NaH (1.2 당량)의 용액에 0℃에서 첨가하고, 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. THF 1 ml 중 화합물 8 (1 당량, 0.4438 mmol)을 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 반응물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였고, 용액은 투명하였다. 혼합물을 실온으로 가온하였고, 용액은 천천히 슬러리가 되었다. 5시간 후, 반응물을 NH4Cl로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 칼럼 (Hex : EtOAc => 0%에서 50%), 생성물은 35%의 EtOAc에서 출현하였다. (0.2020 mmol, 45.5% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 496).
단계 4: 화합물 10 (1 당량, 0.2020 mmol)을 MeOH, THF, 및 1M LiOH의 1:1:1 혼합물 (3 mL 총 용액) 중에 용해시켰다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 시트르산으로 pH =3으로 산성화시키고, DCM (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 추가의 정제는 필요하지 않았다. (관찰된 질량, M + 1 = 405).
단계 5: 화합물 11 (1 당량, 0.0938 mmol)을 DMF 1 mL 중에 용해시켰다. TBTU (1 당량) 및 DIPEA (2.5 당량)를 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 화합물 2를 첨가하였다 (1 당량). 용액을 1시간 동안 교반하였다. 용액을 DCM을 사용하여 10 mL에 의해 희석하고, 물로 3회 (각각 5 mL) 세척하였다. 유기 상을 증발시키고, 크로마토그래피 (DCM : 20% MeOH를 함유하는 DCM =0%-30%)에 의해 정제하여 화합물 12 (0.0683, 73% 수율) (관찰된 질량, M + 1 = 528)를 수득하였다.
단계 6: DCM 중 화합물 12의 용액을 0℃로 냉각시키고 TMS-Br을 적가하였다. 반응물을 0℃에서 교반하고 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응은 2.5시간 내에 완결되었다. 휘발성 물질을 회전 증발기에 의해 고진공 하에 완전히 제거하였다 (산을 완전히 제거하기 위함). 잔류물을 MeOH와 함께 2시간 동안 교반하여 TMS를 제거하였다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 목적 생성물을 수득하였다. (100% 수율을 가정함) (관찰된 질량, M + 1 = 471).
Mal-C18-이산 (L-버전)
Mal-C18-이산 (L-버전)을 Mal-C18-산 Mal-C18-Glu (L)-이산과 동일한 방식으로 합성하되, Glu(L) 대신 Glu(D)를 사용하였다 (관찰된 질량, M+1 = 567).
Mal-C6-C12-PEG2-C18 이산 및 관련 화합물의 합성
Figure pct00252
단계 1 & 2: 화합물 4를 상기 Mal-C18-이산의 합성에 기재된 바와 같이 합성하였다.
단계 3: 화합물 5 (1 mmol, 1 당량)를 DMF 중 20% 피페리딘 3 mL로 20분 동안 처리하였다. 이어서, 수지를 DMF로 3회 헹구고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 4: 화합물 6에 DMF 3 mL 중 TBTU (2 당량), 화합물 7 (2 당량), DIPEA (6 당량)의 혼합물을 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 수지를 DMF 3 mL로 3회 헹구었다.
단계 5: 화합물 8을 DMF 중 20% 피페리딘 3 ml로 20분 동안 처리하였다. 이어서, 수지를 DMF로 3회 헹구고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 6: 화합물 9에 DMF 3 mL 중 화합물 10 (2 당량) 및 DIPEA (6 당량)의 혼합물을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 수지를 DMF 3 mL로 3회 헹구었다.
단계 7: 화합물 11을 DCM 중 30% HFIP 3 ml로 30분 동안 처리하였다. 용액을 여과하고, 여과물을 수집하고, 증발시켜 화합물 12를 수득하였다.
단계 8: DCM 중 화합물 10 (1 당량)에 EDC (1 당량)에 이어서 HOBt (1 당량)를 첨가하고, 15분 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 4를 첨가하고, 반응물을 추가로 4시간 동안 추가로 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조 물질을 DCM 및 MeOH 중 크로마토그램을 통해 정제하였다.
단계 9: 화합물 13을 DCM 중 50% TFA 3 ml로 1시간 동안 처리하였다. 용매를 증발시켜 화합물 14를 수득하였다. Mal-C6-C12-Peg2-C18 이산 (관찰된 질량, M+1 = 979).
Mal-C6-C12-C12-PEG2-C18-이산
Mal-C6-C12-C12-PEG2-C18-이산을 Mal-C6-C12-PEG2-C18 이산과 동일한 절차를 사용하여 합성하되, 화합물 9를 단계 4 및 5의 반응에 적용한 후, 추가의 단계를 계속하였다. (관찰된 질량, M+1 = 1204).
Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C18 이산
Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C18 이산을 Mal-C6-C12-PEG2-C18 이산과 동일한 절차를 사용하여 합성하되, 화합물 9를 단계 4 및 5의 반응에 2회 적용한 후, 추가의 단계를 계속하였다. (관찰된 질량, M+1 = 1429).
Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C12 산
Mal-C6-C12-C12-C12-PEG2-C12 산을 Mal-C6-C12-PEG2-C18 이산과 동일한 절차를 사용하여 합성하되, 화합물 9를 단계 4 및 5의 반응에 2회 적용한 후, 추가의 단계를 계속하였고, 이어서 화합물 4의 상업적으로 입수가능한 C12 유사체를 사용하였다. (관찰된 질량, M+1 = 1245).
실시예 2. 인간 A-498 세포를 사용한 동소 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) 종양-보유 마우스 모델.
SEAP-발현 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) A498 세포의 생성. CMV 프로모터 하에 리포터 유전자 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 발현하는 pCR3.1 발현 벡터를 클론테크(Clontech)의 pSEAP2-염기성 벡터로부터 PCR 증폭된 SEAP 코딩 서열의 방향성 클로닝에 의해 제조하였다. pCR3.1 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하기 위한 SEAP 코딩 서열을 증폭시키는데 사용되는 프라이머에 편리한 제한 부위를 부가하였다. 생성된 구축물 pCR3-SEAP를 사용하여 SEAP-발현 A498 ccRCC 세포주를 생성하였다. 간략하게, pCR3-SEAP 플라스미드를 제조업체의 권장사항에 따라 전기천공에 의해 A498 ccRCC 세포 내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 G418 저항성에 의해 선택하였다. 선택된 A498-SEAP 클론을 SEAP 발현 및 통합 안정성에 대해 평가하였다.
SEAP-발현 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) A498 세포의 이식. 암컷 무흉선 (면역-결핍) 누드 마우스를 ~3% 이소플루란으로 마취시키고, 우측 측와위 자세로 놓았다. 좌측 측복부에 작은 0.5-1cm의 종방향 복부 절개를 만들었다. 습윤 면봉을 사용하여, 좌측 신장을 복막 밖으로 들어올리고 서서히 안정화시켰다. 주사 직전에, 1.0 ml 시린지를 세포/매트리겔 혼합물로 충전하고, 27 게이지 니들 카테터를 시린지 팁에 부착시켰다. 이어서, 충전된 시린지를 시린지 펌프 (하버드 어패러투스(Harvard Apparatus), 모델 PHD2000)에 부착시키고, 프라이밍하여 공기를 제거하였다. 시린지에 부착된 27-게이지 니들 카테터의 팁을 미측 끝부분 근처의 신피막 바로 아래에 삽입하고, 이어서 니들의 팁을 피막 3-4 mm를 따라 두개로 조심스럽게 전진시켰다. 약 300,000개 세포를 함유하는 2:1 (vol:vol) 세포/매트리겔 혼합물의 10 μl 분취물을 시린지 펌프를 사용하여 신장 실질 내로 천천히 주사하였다. 니들을 신장 내에 15-20초 동안 두어 주사가 확실하게 완결되게 하였다. 이어서, 니들을 신장으로부터 제거하고, 면봉을 주사 부위 위에 30초 동안 두어 세포의 누출 또는 출혈을 방지하였다. 이어서 신장을 복부 내로 서서히 되돌려 놓고, 복벽을 닫았다. 이식 후 7-14일마다 혈청을 수집하여, 상업적 SEAP 검정 키트를 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 대부분의 연구의 경우, 이식 5-6주 후에, 종양 측정치가 전형적으로 약 4-8 mm일 때, 종양 마우스를 사용하였다.
HIF2 mRNA 발현의 결정. 본원의 실시예에 보고된 연구를 위해, 마우스를 주사 후 확인된 날에 안락사시키고, 제조업체의 권장사항에 따라 트리졸 시약을 사용하여 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 상대적 HiF2α mRNA 수준을 하기 기재된 바와 같이 RT-qPCR에 의해 결정하고, 전달 완충제 (등장성 글루코스)만으로 처리한 마우스와 비교하였다. 정량적 PCR을 준비하기 위해, 트리리에이전트(TriReagent) (몰레큘라 리서치 센터(Molecular Research Center), 오하이오주 신시내티)에서 균질화된 조직 샘플로부터 제조업체의 프로토콜에 따라 총 RNA를 단리하였다. 대략 500 ng RNA를 고용량 cDNA 역전사 키트 (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 역전사시켰다. 인간 (종양) Hif2α (EPAS1) 발현에 대해, 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 또는 베리퀘스트 프로브 마스터 믹스 (아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 인간 Hif2α (카탈로그 # 4331182) 및 CycA (PPIA) 카탈로그 #: 4326316E)에 대해 사전-제조된 택맨 유전자 발현 검정을 바이플렉스 반응에서 삼중으로 사용하였다. 7500 패스트(7500 Fast) 또는 스텝원플러스(StepOnePlus) 실시간 PCR 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. ΔΔCT 방법을 사용하여 상대적 유전자 발현을 계산하였다.
실시예 3. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기를 포함하는 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 8. 실시예 3에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00253
군 5 및 6에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행하여 PK 인핸서 화합물의 말레이미드 반응성 기를 연결함으로써 하기 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였고:
Figure pct00254
여기서
Figure pct00255
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다 (또한 실시예 1 참조).
군 4 및 6에서, 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)를 관능화된 아민 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결하였다:
Figure pct00256
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 9. 실시예 3에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00257
상기 표 9에 제시된 바와 같이, 표적화 리간드 또는 PK 인핸서에 연결되지 않은 HIF-2 알파 RNAi 작용제인 군 2에 대해 단지 최소의 녹다운이 관찰되었다 (AD04545, 비히클 대조군과 비교하여 대략 0% 녹다운 (1.030)을 나타냄). 각각 세자리 표적화 기를 포함하는 군 4 및 6은 표적화 리간드가 존재하지 않는 구축물과 비교하여 더 큰 활성을 나타내어, 표적화 리간드 의존성을 나타내었다. 또한, 표적화 리간드 및 PK 인핸서 둘 다를 포함하는 군에서 추가의 억제 활성이 관찰되었다. (예를 들어, 군 4 (대략 70% 녹다운 (0.308)을 나타냄) 및 군 6 (대략 55% 녹다운 (0.456)을 나타냄) 참조).
실시예 4. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기를 포함하는 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 10. 실시예 4에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00258
Figure pct00259
군 3-9에서, 하기 구조를 갖는 각각의 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였고:
군 3:
Figure pct00260
군 4:
Figure pct00261
군 5:
Figure pct00262
군 6:
Figure pct00263
군 7:
Figure pct00264
군 8:
Figure pct00265
군 9:
Figure pct00266
여기서
Figure pct00267
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 2-9에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 11. 실시예 4에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00268
상기 표 11에 제시된 바와 같이, 세자리 표적화 기에 연결된 각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제 (군 2 내지 9)는 대조군과 비교하여 실질적인 억제 활성을 나타내었다.
실시예 5. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 본원에 열거된 군 1 내지 6의 마우스에게 하기 표 12의 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다. 추가적으로, 본원에 열거된 군 7의 마우스에게 피부와 근육 사이의 피하 (SQ) 주사를 통해 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 내로 투여하였다. 투여된 군은 하기를 포함하였다:
표 12. 실시예 5에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00269
군 2-5 및 7에서, Mal-C18-이산에 대해 이전의 실시예에서 표시된 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2 및 5-7에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다. 군 3에서, 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 6.1-avb6의 구조의 알파-v-베타-6에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되었고, 군 4에서, 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 14-avb6의 구조의 알파-v-베타-6에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되었다. 인테그린 표적화 리간드 구조 6.1-avb6 및 구조 14-avb6을 포함하는 세자리 표적화 기에 대한 구조가 하기에 제시되며:
Figure pct00270
Figure pct00271
여기서
Figure pct00272
는 관능화된 아민 링커에 대한 연결 지점을 나타낸다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 13. 실시예 5에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00273
상기 표 13에 제시된 바와 같이, 1개 이상의 표적화 리간드 및 PK 인핸서를 연결하는 것에 대한 선호는 HIF-2 알파 발현을 침묵시키는데 있어서 개선된 효력을 나타내었다. (예를 들어, 단지 대략 25% 녹다운 (0.751)을 달성한 군 6 (PK 인핸서 부재) 참조). 추가로, 데이터는 알파-v-베타-6에 대해 친화도를 갖는 표적화 리간드와 비교하여, 인테그린 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 대한 선호를 나타낸다. (군 3 (알파-v-베타-6 리간드를 사용하여 대략 31% 녹다운 (0.691)) 및 군 4 (알파-v-베타-6 리간드를 사용하여 대략 42% 녹다운 (0.582))를 군 2 (알파-v-베타-3 리간드를 사용하여 대략 56% 녹다운 (0.437)) 및 군 5 (알파-v-베타-3 리간드를 사용하여 대략 58% 녹다운 (0.413))와 비교함). 추가적으로, 군 7 및 2에 제시된 바와 같이, C18-이산 (C18이산)의 PK 인핸서를 사용한 IV 및 SQ 둘 다의 투여에 대해 대등한 효능이 달성될 수 있다.
실시예 6. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 14. 실시예 6에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00274
Figure pct00275
군 2, 4-7에서, Mal-C18-이산에 대해 이전의 실시예에서 표시된 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다. 군 3은 하기 구조의 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK 인핸서를 포함하였고:
Figure pct00276
여기서
Figure pct00277
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 10은 하기 구조의 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK 인핸서를 포함하였고:
Figure pct00278
여기서
Figure pct00279
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 11은 하기 구조의 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK 인핸서를 포함하였고:
Figure pct00280
여기서
Figure pct00281
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 5-7에서, PK 인핸서를 내부 뉴클레오티드에 접합시켰다. 표시된 바와 같은 뉴클레오티드는 2'-O-프로파르길 기를 포함하였고, 아지드-함유 PK 인핸서 (C18-이산-N3)를 첨가하여 트리아졸을 형성하였다. 군 5-7은 하기 구조의 PK 인핸서를 포함하였고:
Figure pct00282
여기서
Figure pct00283
는 표시된 뉴클레오티드의 2' 위치에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 2-11에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 15. 실시예 6에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00284
상기 표 15에 제시된 바와 같이, 세자리 표적화 기에 연결된 각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제 (군 2 내지 11)는 대조군과 비교하여 실질적인 억제 활성을 나타내었다.
실시예 7. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군을 포함하는 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 16. 실시예 7에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00285
Figure pct00286
군 2-4, 9 및 10에서, Mal-C18-이산에 대해 이전의 실시예에서 표시된 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 6은 하기 구조를 갖는 센스 가닥의 3' 단부 상에 PK 인핸서를 포함하며:
Figure pct00287
여기서
Figure pct00288
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 7은 하기 구조를 갖는 센스 가닥의 3' 단부 상에 PK 인핸서를 포함하며:
Figure pct00289
여기서
Figure pct00290
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 8은 실시예 6에 제시된 바와 같이 디술피드를 포함하는 센스 가닥의 3' 단부에의 Mal-C18-삼산의 마이클 첨가에 의해 형성된 PK 인핸서를 포함한다.
군 2, 4-8, 및 10에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다. 군 9는 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 10-avb6의 구조의 알파-v-베타-6에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)를 포함하였고, 그의 구조는 하기에 제시된다:
Figure pct00291
군 10은 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 26-avb6의 구조의 알파-v-베타-6에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)를 포함하였고, 그의 구조는 하기에 제시된다:
Figure pct00292
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 17. 실시예 7에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00293
상기 표 17에 제시된 바와 같이, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥 상에 4개의 내부적으로 배치된 구조 2a-avb3 리간드를 포함하는 군 4는 huHIF-2 알파 mRNA의 대략 78% 녹다운을 나타내었다 (0.228).
실시예 8. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 18. 실시예 8에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00294
Figure pct00295
Figure pct00296
군 2, 3 및 5-8에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다. 군 4 및 9는 실시예 6에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 포함하였다. 군 10은 실시예 7에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 포함하였다. 군 11은 하기 구조를 갖는 센스 가닥의 3' 단부 상의 PK 인핸서를 포함하며:
Figure pct00297
여기서
Figure pct00298
는 표 4.3에 나타낸 바와 같은 C6-S 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
군 2, 4-5, 및 8-11에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다. 군 2에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 단일 구조 2a-avb3 표적화 리간드를 연결하였다. 군 7에서, PK 인핸서 C18-이산을 센스 가닥의 5' 말단 단부 상에 위치하는 (C6-SS-C6) 디술피드 링커에 연결하고, 뿐만 아니라 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 19. 실시예 8에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00299
상기 표 19에 제시된 바와 같이, HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥 상에 위치한 내부 표적화 리간드의 포함은 녹다운에서 추가의 개선을 나타낸다. (예를 들어, 군 2 (대략 82% 녹다운 (0.183)을 나타내는 4개의 내부적으로 위치하는 표적화 리간드), 및 군 8 (대략 49% 녹다운 (0.516)을 나타내는 어떠한 내부적으로 위치하는 표적화 리간드도 갖지 않는 것) 참조).
실시예 9. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 20. 실시예 9에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00300
Figure pct00301
Figure pct00302
Figure pct00303
군 2-13에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-13에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 21. 실시예 9에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00304
실시예 9에서 조사된 각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 뉴클레오티드의 2' 위치에 부착된 avb3 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 적어도 2개의 내부 뉴클레오티드를 포함하였고, 상기 표 21에 제시된 바와 같이, 시험된 각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 비히클 대조군과 비교하여 HIF-2 알파의 거의 50% 이상의 녹다운을 나타내었다. 군 2 (4개의 내부 리간드를 가짐, 대략 74% 녹다운) 및 군 13 (8개의 내부 리간드를 가짐, 대략 86% 녹다운)은 huHIF-2 알파 mRNA 발현의 특히 높은 감소를 나타내었다.
실시예 10. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 22. 실시예 10에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00305
Figure pct00306
Figure pct00307
Figure pct00308
Figure pct00309
군 2-13에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-13에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 23. 실시예 10에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00310
실시예 11. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 24. 실시예 11에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00311
Figure pct00312
Figure pct00313
군 2-9에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-9에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
단지 2마리의 마우스에게만 투여한 군 2를 제외하고, 각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 25. 실시예 11에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00314
실시예 12. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 26. 실시예 12에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00315
Figure pct00316
Figure pct00317
Figure pct00318
군 2-11에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-11에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
단지 2마리의 마우스에게만 투여한 군 6을 제외하고, 각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 27. 실시예 12에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00319
실시예 13. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 28. 실시예 13에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00320
Figure pct00321
Figure pct00322
군 2-10에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-10에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 29. 실시예 13에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00323
실시예 14. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 30. 실시예 14에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00324
Figure pct00325
군 2-7에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-7에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 31. 실시예 14에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00326
실시예 14에서의 각각의 HIF-2 알파 RNAi 작용제는 (i) 3개의 표적화 리간드를 포함하는 센스 가닥의 5' 말단 단부에 위치한 세자리 표적화 기; (ii) 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 제1 뉴클레오티드로부터의 위치 2, 4, 6 및 8에 위치하는 뉴클레오티드의 각각에 대해 2' 위치에서 연결된 총 4개의 추가의 내부 표적화 리간드; 및 (iii) 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK 인핸서를 포함하는 센스 가닥을 포함하였다. 상기 표 31에 제시된 바와 같이, 2.0 mg/kg 및 5.0 mg/kg 둘 다로 투여된 각각의 RNAi 작용제는 비히클 대조군과 비교하여 huHIF-2 알파 mRNA의 실질적인 감소를 나타내었다.
실시예 15. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일에, 마우스에게 하기 투여 군을 포함하는 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 32. 실시예 15에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00327
군 2-4에서, 디술피드를 환원시키고 마이클 첨가 반응을 수행함으로써 말레이미드 반응성 기를 연결하는 것에 의해 Mal-C18-이산에 대해 이전 실시예에 나타낸 구조를 갖는 PK 인핸서를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결하였다.
군 2-4에서, 관능화된 아민 반응성 기 링커 (NH2-C6)에 커플링시킴으로써 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 세자리 인테그린 표적화 기 (이는 구조 2a-avb3의 구조의 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 3개의 인테그린 리간드를 포함함)는 상기 실시예 3에 제시된 구조를 갖는다.
단지 2마리의 마우스만을 갖는 비히클 대조군 (군 1)을 제외하고, 각각의 군에서 3마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 33. 실시예 15에서의 희생 시 (제8일) 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00328
실시예 16. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 연구 제1일, 제2일, 제8일, 제9일, 제15일, 제22일, 및 제29일에, 마우스에게 5.0 mg/kg의 삼-구조 2a-avb3-AD05971-(Int 구조 2a-avb3)4-C18-이산, 또는 RNAi 작용제가 없는 등장성 글루코스의 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다.
각각의 군에서 6마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제36일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하였다. 도 4a는 비처리 대조군의 마우스로부터의 신장을 보여주며, 여기서 종양 신장은 영상의 우측에 제시되고, 대측 신장은 좌측에 제시된다. 도 4b는 RNAi 작용제로 처리된 군의 마우스로부터의 신장을 보여주며, 여기서 또한 종양 신장은 본 영상의 우측에 제시되고, 대측 신장은 좌측에 제시된다. 영상으로부터 입증되고 종양 중량에 의해 확인된 바와 같이, HIF-2 알파 RNAi 작용제 군은 종양 성장을 억제하였다. 추가적으로, 도 5a에 제시된 바와 같이, 대조군의 종양-보유 마우스로부터의 세포의 면역조직화학 (IHC) 염색으로 HIF-2 알파 단백질의 존재가 흑색 스팟에 의해 가시적인 것으로 확인된 한편, HIF-2 알파 RNAi 작용제로 처리된 종양-보유 마우스의 세포를 보여주는 도 5b의 영상에서는 이러한 흑색 스팟이 입증되지 않았다.
실시예 17. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 34. 실시예 17에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00329
Figure pct00330
각각의 군에서 4마리의 마우스에게 투여하였다. 상기 표 34에 표시된 바와 같은 스케줄링된 희생 날짜에, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화한 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 35. 실시예 17에서의 희생 시 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00331
실시예 18. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 36. 실시예 18에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00332
각각의 군에서 4마리의 마우스에게 투여하였다. 마우스를 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양을 수거하고, 신장 종양에서의 총 인간 HIF-2 mRNA를 수집 및 균질화 후에 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 HIF-2 알파 (huHIF-2 알파) mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 37. 실시예 18에서의 희생 시 평균 상대적 huHIF-2 알파 mRNA 발현.
Figure pct00333
실시예 19. ccRCC 종양-보유 마우스에서의 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 생체내 투여.
실시예 2의 종양-보유 마우스 모델을 사용하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제를 생체내 평가하였다. 마우스에게 하기 투여 군에 따라 대략 300 마이크로리터 부피의 주사를 꼬리 정맥 정맥내 (IV) 주사를 통해 투여하였다:
표 38. 실시예 19에서의 종양-보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00334
각각의 군의 15 마리의 마우스에게 투여하고, 체중 및 종양 성장을 매주 촉진 및 캘리퍼 추정에 의해 모니터링하였다. 군 4의 1마리의 동물은 제21일에 사망한 것으로 발견되었다. 도 6은 연구 제34일까지의 종양 성장에 대한 효과를 보여준다. 도 6에 보고된 바와 같이, 데이터는 염수 비히클 대조군과 비교하여 HIF-2 알파 RNAi 작용제와 함께 투여된 경우 종양 크기 감소에서 전반적인 개선을 보여준다.
실시예 20. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 39. 실시예 20에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00335
Figure pct00336
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에게 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 40. 실시예 20에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00337
상기 표 40에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 21. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에게 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 41. 실시예 21에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00338
Figure pct00339
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에게 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 42. 실시예 21에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00340
상기 표 42에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 22. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 43. 실시예 22에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00341
Figure pct00342
Figure pct00343
Figure pct00344
Figure pct00345
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에게 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 44. 실시예 22에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00346
Figure pct00347
상기 표 44에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 23. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 45. 실시예 23에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00348
Figure pct00349
Figure pct00350
Figure pct00351
Figure pct00352
1마리의 마우스에서 주사 오류가 있었던 것으로 여겨져 단지 3마리의 마우스만을 갖는 군 4를 제외하고, 각각의 군에서 4마리의 종양 보유 마우스에게 투여하였다 (n=4). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 46. 실시예 23에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00353
상기 표 46에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 24. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 47. 실시예 24에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00354
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에게 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 48. 실시예 24에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00355
상기 표 48에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시양태
실시양태 1.
(i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥; 및
(iii) 1개 이상의 표적화 리간드
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 센스 가닥이 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3에 제공된 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 안티센스 가닥에 대해 17개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 적어도 85% 상보성 영역을 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥, RNAi 작용제의 안티센스 가닥, 또는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-프로파르길-변형된 뉴클레오티드, 2'-O-트리아졸-변형된 뉴클레오티드, 및 3'-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 각각의 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 2'-O-트리아졸-변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 표 4에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 표 4, 표 4.1, 표 4.2, 또는 표 4.3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 10. 실시양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥이 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 뉴클레오티드 2-18을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, 안티센스 가닥이 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 서열을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, 센스 가닥이 CAACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 428)의 서열의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 13. 실시양태 1에 있어서, 센스 가닥이 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)의 서열을 포함하고, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, 각각의 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티를 나타내고, Y-(NH-C6)s는
Figure pct00356
를 나타내고, (invAb)는
Figure pct00357
를 나타내고, (6-S)는
Figure pct00358
를 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 14. 실시양태 12 또는 13에 있어서, 안티센스 가닥이 센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적인 것인 RNAi 작용제.
실시양태 15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 뉴클레오티드가 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)의 서열로 이루어지고, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, 각각의 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티를 나타내고, Y-(NH-C6)s는
Figure pct00359
를 나타내고, (invAb)는
Figure pct00360
를 나타내고, (6-S)는
Figure pct00361
를 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 16. 실시양태 15에 있어서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 서열로 이루어지며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 적어도 1개의 표적화 리간드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 알파-v-베타-3, 알파-v-베타-5, 또는 알파-v-베타-3 및 알파-v-베타-5 둘 다에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 20. 실시양태 19에 있어서, 표적화 리간드가 화학식:
Figure pct00362
의 화합물이며,
여기서
X는 -C(R3)2-, -NR3-,
Figure pct00363
이고;
Y는 알킬렌 쇄에서 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 알킬렌이고;
Z는 O, NR3, 또는 S이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 RNAi 작용제를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 RNAi 작용제를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 RNAi 작용제를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 RNAi 작용제를 포함하는 것인
RNAi 작용제.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 표적화 리간드가 하기로부터 선택되며:
Figure pct00364
Figure pct00365
Figure pct00366
Figure pct00367
Figure pct00368
Figure pct00369
Figure pct00370
여기서
Figure pct00371
는 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 구조
Figure pct00372
를 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 약동학적 (PK) 인핸서를 추가로 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, PK 인핸서가 화학식:
Figure pct00373
를 포함하고, 여기서 Y는 임의로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 쇄이고, n은 5-25의 정수인 RNAi 작용제.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, PK 인핸서가
Figure pct00374
를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 26. 실시양태 23에 있어서, PK 인핸서가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
Figure pct00375
Figure pct00376
Figure pct00377
Figure pct00378
Figure pct00379
여기서
Figure pct00380
는 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 28. 실시양태 23-27 중 어느 하나에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 29. 실시양태 1-28 중 어느 하나에 있어서, 2 내지 10개의 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제.
실시양태 30. 실시양태 1-29 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 2개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 연결된 RNAi 작용제.
실시양태 31. 실시양태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고, 적어도 1개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 비-말단 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 32. 실시양태 1-31 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 표적화 리간드에 연결되며, 여기서 2개 이상의 표적화 리간드는 분지점에서 연결되어 표적화 기를 형성하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, 표적화 기가 3개의 표적화 리간드를 포함하고, 표적화 기가 화학식:
Figure pct00381
를 갖고, 여기서
L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로, 임의로 치환된 알킬렌을 포함하는 링커이고;
L4는 임의로 치환된 알킬렌, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 시클로알킬을 포함하는 링커이고;
R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
TL은 표적화 리간드이고;
Y는 O 또는 S인
RNAi 작용제.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 표적화 기가 화학식:
Figure pct00382
를 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 35. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고, 적어도 2개의 추가의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 36. 실시양태 31 또는 35에 있어서, 적어도 10개의 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 단부 상에 위치하는 표적화 기와 센스 가닥 상에 위치하는 표적화 리간드 사이에 위치하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 37. 실시양태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 38. 실시양태 23-37 중 어느 하나에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 39. 실시양태 1-38 중 어느 하나에 있어서, 5 내지 8개의 표적화 리간드가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 적어도 1개의 세자리 표적화 기에 연결되고, 적어도 2개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 (i) 센스 가닥의 5' 말단 단부의 세자리 표적화 기, 및 (ii) 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드 외의 뉴클레오티드에 연결된 2 내지 4개의 표적화 리간드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 42. 실시양태 29-41 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 하기와 같이 연결되는 것인 RNAi 작용제: (i) 3개의 개별 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기는 센스 가닥의 5' 말단 단부에 위치하고; (ii) 추가의 표적화 리간드는 센스 가닥의 5' 말단 단부로부터 적어도 10개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있는 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 개별 표적화 리간드임.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥 상의 5' 말단 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하는 3' 말단 핵염기로부터 위치 2, 4, 6, 및 8 (3' → 5')에 위치하는 센스 가닥 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 44. 실시양태 43에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 리보스 고리의 2' 위치, 리보스 고리의 3' 위치, 리보스 고리의 1' 위치에서의 개별 뉴클레오티드에, 또는 뉴클레오티드의 핵염기, 리보스 고리의 4' 위치, 또는 뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 개별 뉴클레오티드의 리보스 고리의 2' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 46. 실시양태 1-45 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 50. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, 2개의 평활 단부를 갖는 RNAi 작용제.
실시양태 51. 실시양태 1-50 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 말단 캡을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 52. 실시양태 1-51 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 53. 실시양태 1-52 중 어느 하나에 있어서, 표 5의 듀플렉스 중 어느 하나의 구조를 갖는 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 RNAi 작용제.
실시양태 54. 실시양태 51-53 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오티드 서열의 3' 단부, 뉴클레오티드 서열의 5' 단부, 또는 뉴클레오티드 서열의 3' 단부 및 5' 단부 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 55.
(i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
을 포함하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제.
실시양태 56.
(i) HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 (서열식별번호: 1)에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥;
(iii) 센스 가닥에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 센스 가닥에 연결된 PK 인핸서
를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제.
실시양태 57. 실시양태 56에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 58. 실시양태 56 또는 57에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 59. 실시양태 56-58 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 60. 실시양태 59에 있어서, 2 내지 12개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 61. 실시양태 56-60 중 어느 하나에 있어서, 3개의 표적화 리간드로 구성된 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고; PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결되고; 2 내지 12개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 62. 실시양태 61에 있어서, 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 표적화 리간드가 각각 각각의 뉴클레오티드의 2' 위치에서 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 63. 실시양태 56-62 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 제1 뉴클레오티드로부터의 위치 2, 6, 15, 및 19 (3' → 5')에 위치하는 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 64. 실시양태 56-62 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 제1 뉴클레오티드로부터의 위치 2, 4, 6, 및 8 (3' → 5')에 위치하는 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 65. 실시양태 56-62 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 2, 4, 6, 및 8 (5' → 3')에 걸친 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 66. 실시양태 56-65 중 어느 하나에 있어서, 3개의 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 위치하고, 센스 가닥이 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 2 내지 4개의 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부의 세자리 표적화 기와 뉴클레오티드에 부착된 그 다음의 가장 가까운 표적화 리간드를 분리하는 적어도 10개의 뉴클레오티드가 존재하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 67. 실시양태 66에 있어서, 4개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 68. 실시양태 56-67 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 인테그린 표적화 리간드인 RNAi 작용제.
실시양태 69. 실시양태 56-68 중 어느 하나에 있어서, PK 인핸서가 화학식:
Figure pct00383
를 갖고, 여기서 Y는 임의로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 쇄이고, n은 5-25의 정수인 RNAi 작용제.
실시양태 70. 서열 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)를 포함하는 안티센스 가닥, 서열 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 포함 Z를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고; Y-(NH-C6)s는
Figure pct00384
를 나타내고; (invAb)는
Figure pct00385
를 나타내고; (6-S)는
Figure pct00386
를 나타내고, 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로:
(i) 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기;
(ii) 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 표적화 리간드; 또는
(iii) C-18 이산, C-18 삼산, Mal-C17-비닐-PO3, 및 C20 산으로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 PK 인핸서
를 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 71. 실시양태 70에 있어서, 각각의 Z가 구조 2a:
Figure pct00387
의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
Figure pct00388
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 72. 실시양태 70에 있어서, 각각의 Z가 구조 2.11a:
Figure pct00389
의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
Figure pct00390
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 73. 실시양태 70에 있어서, 각각의 Z가 구조 29a:
Figure pct00391
의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
Figure pct00392
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 74. 실시양태 70에 있어서, 각각의 Z가 구조 32a:
Figure pct00393
의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
Figure pct00394
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 75. 실시양태 70-74 중 어느 하나에 있어서, X가 C-18 이산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
Figure pct00395
여기서
Figure pct00396
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 76. 실시양태 70-74 중 어느 하나에 있어서, X가 Mal-C-18 삼산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
Figure pct00397
여기서
Figure pct00398
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 77. 실시양태 70-74 중 어느 하나에 있어서, X가 Mal-C17-비닐 PO3의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
Figure pct00399
여기서
Figure pct00400
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 78. 실시양태 70-74 중 어느 하나에 있어서, X가 Mal-C20 산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
Figure pct00401
여기서
Figure pct00402
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 79. 실시양태 70-78 중 어느 하나에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표적화 리간드를 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 80. 실시양태 79에 있어서, 7개의 표적화 리간드를 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 81. 실시양태 80에 있어서, Y가 TriAlk 14:
Figure pct00403
또는 TriAlk 14s:
Figure pct00404
의 구조를 갖는 표적화 기이고, 여기서 TL은 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 리간드를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 82. 실시양태 81에 있어서, 각각의 TL이 구조 2a:
Figure pct00405
를 포함하며, 여기서
Figure pct00406
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 83. 실시양태 81에 있어서, 각각의 TL이 구조 2.11a:
Figure pct00407
를 포함하며, 여기서
Figure pct00408
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 84. 실시양태 81에 있어서, 각각의 TL이 구조 29a:
Figure pct00409
를 포함하며, 여기서
Figure pct00410
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 85. 실시양태 81에 있어서, 각각의 TL이 구조 32a:
Figure pct00411
를 포함하며, 여기서
Figure pct00412
는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 86. 실시양태 70-81 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 서열식별번호: 30의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 RNAi 작용제.
실시양태 87. 실시양태 70-82 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥의 뉴클레오티드가 서열식별번호: 761의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 RNAi 작용제.
실시양태 88. 실시양태 1-88 중 어느 하나의 RNAi 작용제를 포함하며, 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
실시양태 89. 실시양태 88에 있어서, HIF-2 알파의 발현을 억제하기 위한 제2 RNAi 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 90. 실시양태 88 또는 89에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 91. 세포 내로 유효량의 실시양태 1-88 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시양태 88-90 중 어느 하나의 조성물을 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하는 방법.
실시양태 92. 실시양태 91에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 것인 방법.
실시양태 93. 실시양태 92에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
실시양태 94. 실시양태 91-94 중 어느 하나에 있어서, HIF2-알파 유전자 발현이 적어도 약 30%만큼 억제되는 것인 방법.
실시양태 95. HIF2-알파-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 88-90 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HIF2-알파-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
실시양태 96. 실시양태 95에 있어서, 질환 또는 장애가 암, 신암, 투명 세포 신세포 암종, 비소세포 폐암, 성상세포종 (뇌암), 방광암, 유방암, 연골육종, 결장직장 암종, 위 암종, 교모세포종, 두경부 편평 세포 암종, 간세포성 암종, 폐 선암종, 신경모세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 직장암, 전이, 치은염, 건선, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 전자간증, 염증, 만성 염증, 신생혈관 질환, 또는 류마티스 관절염인 방법.
실시양태 97. 실시양태 95 또는 96에 있어서, 질환이 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC)인 방법.
실시양태 98. 실시양태 91-97 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 인간 대상체의 체중의 약 3 mg/kg 내지 약 80 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 99. 실시양태 98에 있어서, RNAi 작용제가 인간 대상체의 체중의 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 100. 실시양태 98 또는 99에 있어서, RNAi 작용제가 분할 용량으로 투여되며, 여기서 목적하는 1일 양의 약 절반이 초기 투여로 투여되고, 목적하는 1일 양의 나머지 약 절반이 초기 투여의 대략 4시간 후에 투여되는 것인 방법.
실시양태 101. 실시양태 98-100 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 용량 또는 용량들이 1주 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 102. 실시양태 99-101 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 용량 또는 분할 용량이 격주로 (격주 1회) 투여되는 것인 방법.
실시양태 103. 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료를 위한, 실시양태 1-88 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시양태 88-90 중 어느 하나에 따른 조성물의 용도.
실시양태 104. 실시양태 103에 있어서, 질환이 ccRCC인 용도.
실시양태 105. 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한, 실시양태 1-88 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시양태 88-90 중 어느 하나에 따른 조성물의 용도.
실시양태 106. 실시양태 105에 있어서, 질환이 ccRCC인 용도.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하는 것으로 의도되고 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARROWHEAD PHARMACEUTICALS, INC. <120> RNAi Agents for Inhibiting Expression of HIF-2 alpha (EPAS1) <130> 30663-WO1 <150> 62/790,360 <151> 2019-01-09 <150> 62/827,564 <151> 2019-04-01 <150> 62/839,381 <151> 2019-04-26 <160> 1049 <210> 1 <211> 5184 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Homo Sapiens Endothelial PAS Domain Protein 1 (EPAS1 or HIF-2 alpha), transcript, GenBank NM_001430.4 <400> 1 gctttacact cgcgagcgga ccgccacacg ggtccggtgc ccgctgcgct tccgccccag 60 cgctcctgag gcggccgtac aatcctcggc agtgtcctga gactgtatgg tcagctcagc 120 ccggcctccg actccttccg actcccagca ttcgagccac tttttttttt ctttgaaaac 180 tcagaaaagt gactcctttt ccagggaaaa aggaacttgg gttcccttct ctccgtcctc 240 ttttcgggtc tgacagcctc cacccactcc ttccccggac cccgcctccg cgcgcaggtt 300 cctcccagtc acctttctcc acccccgccc ccgcacctag cccgccgcgc gccaccttcc 360 acctgactgc gcggggcgct cgggacctgc gcgcacctcg gaccttcacc acccgcccgg 420 gccgcgggga gcggacgagg gccacagccc cccacccgcc agggagccca ggtgctcggc 480 gtctgaacgt ctcaaagggc cacagcgaca atgacagctg acaaggagaa gaaaaggagt 540 agctcggaga ggaggaagga gaagtcccgg gatgctgcgc ggtgccggcg gagcaaggag 600 acggaggtgt tctatgagct ggcccatgag ctgcctctgc cccacagtgt gagctcccat 660 ctggacaagg cctccatcat gcgactggca atcagcttcc tgcgaacaca caagctcctc 720 tcctcagttt gctctgaaaa cgagtccgaa gccgaagctg accagcagat ggacaacttg 780 tacctgaaag ccttggaggg tttcattgcc gtggtgaccc aagatggcga catgatcttt 840 ctgtcagaaa acatcagcaa gttcatggga cttacacagg tggagctaac aggacatagt 900 atctttgact tcactcatcc ctgcgaccat gaggagattc gtgagaacct gagtctcaaa 960 aatggctctg gttttgggaa aaaaagcaaa gacatgtcca cagagcggga cttcttcatg 1020 aggatgaagt gcacggtcac caacagaggc cgtactgtca acctcaagtc agccacctgg 1080 aaggtcttgc actgcacggg ccaggtgaaa gtctacaaca actgccctcc tcacaatagt 1140 ctgtgtggct acaaggagcc cctgctgtcc tgcctcatca tcatgtgtga accaatccag 1200 cacccatccc acatggacat ccccctggat agcaagacct tcctgagccg ccacagcatg 1260 gacatgaagt tcacctactg tgatgacaga atcacagaac tgattggtta ccaccctgag 1320 gagctgcttg gccgctcagc ctatgaattc taccatgcgc tagactccga gaacatgacc 1380 aagagtcacc agaacttgtg caccaagggt caggtagtaa gtggccagta ccggatgctc 1440 gcaaagcatg ggggctacgt gtggctggag acccagggga cggtcatcta caaccctcgc 1500 aacctgcagc cccagtgcat catgtgtgtc aactacgtcc tgagtgagat tgagaagaat 1560 gacgtggtgt tctccatgga ccagactgaa tccctgttca agccccacct gatggccatg 1620 aacagcatct ttgatagcag tggcaagggg gctgtgtctg agaagagtaa cttcctattc 1680 accaagctaa aggaggagcc cgaggagctg gcccagctgg ctcccacccc aggagacgcc 1740 atcatctctc tggatttcgg gaatcagaac ttcgaggagt cctcagccta tggcaaggcc 1800 atcctgcccc cgagccagcc atgggccacg gagttgagga gccacagcac ccagagcgag 1860 gctgggagcc tgcctgcctt caccgtgccc caggcagctg ccccgggcag caccaccccc 1920 agtgccacca gcagcagcag cagctgctcc acgcccaata gccctgaaga ctattacaca 1980 tctttggata acgacctgaa gattgaagtg attgagaagc tcttcgccat ggacacagag 2040 gccaaggacc aatgcagtac ccagacggat ttcaatgagc tggacttgga gacactggca 2100 ccctatatcc ccatggacgg ggaagacttc cagctaagcc ccatctgccc cgaggagcgg 2160 ctcttggcgg agaacccaca gtccaccccc cagcactgct tcagtgccat gacaaacatc 2220 ttccagccac tggcccctgt agccccgcac agtcccttcc tcctggacaa gtttcagcag 2280 cagctggaga gcaagaagac agagcccgag caccggccca tgtcctccat cttctttgat 2340 gccggaagca aagcatccct gccaccgtgc tgtggccagg ccagcacccc tctctcttcc 2400 atggggggca gatccaatac ccagtggccc ccagatccac cattacattt tgggcccaca 2460 aagtgggccg tcggggatca gcgcacagag ttcttgggag cagcgccgtt ggggccccct 2520 gtctctccac cccatgtctc caccttcaag acaaggtctg caaagggttt tggggctcga 2580 ggcccagacg tgctgagtcc ggccatggta gccctctcca acaagctgaa gctgaagcga 2640 cagctggagt atgaagagca agccttccag gacctgagcg ggggggaccc acctggtggc 2700 agcacctcac atttgatgtg gaaacggatg aagaacctca ggggtgggag ctgccctttg 2760 atgccggaca agccactgag cgcaaatgta cccaatgata agttcaccca aaaccccatg 2820 aggggcctgg gccatcccct gagacatctg ccgctgccac agcctccatc tgccatcagt 2880 cccggggaga acagcaagag caggttcccc ccacagtgct acgccaccca gtaccaggac 2940 tacagcctgt cgtcagccca caaggtgtca ggcatggcaa gccggctgct cgggccctca 3000 tttgagtcct acctgctgcc cgaactgacc agatatgact gtgaggtgaa cgtgcccgtg 3060 ctgggaagct ccacgctcct gcaaggaggg gacctcctca gagccctgga ccaggccacc 3120 tgagccaggc cttctacctg ggcagcacct ctgccgacgc cgtcccacca gcttcactct 3180 ctccgtctgt ttttgcaact aggtatttct aacgccagca cactatttac aagatggact 3240 tacctggcag acttgcccag gtcaccaagc agtggccttt ttctgagatg ctcactttat 3300 tatccctatt tttaaagtac acaattgttt tacctgttct gaaatgttct taaattttgt 3360 aggatttttt tcctccccac cttcaatgac ttctaattta tattatccat aggtttctct 3420 ccctccttct ccttctcaca cacaactgtc catactaaca agtttggtgc atgtctgttc 3480 ttctgtaggg agaagcttta gcttcatttt actaaaaaga ttcctcgtta ttgttgttgc 3540 caaagagaaa caaaaatgat tttgctttcc aagcttggtt tgtggcgtct ccctcgcaga 3600 gcccttctcg tttctttttt aaactaatca ccatattgta aatttcaggg tttttttttt 3660 tttgtttaag ctgactcttt gctctaattt tggaaaaaaa gaaatgtgaa gggtcaactc 3720 caacgtatgt ggttatctgt gaaagttgca cagcgtggct tttcctaaac tggtgttttt 3780 cccccgcatt tggtggattt tttattatta ttcaaaaaca taactgagtt ttttaaaaga 3840 ggagaaaatt tatatctggg ttaagtgttt atcatatata tgggtacttt gtaatatcta 3900 aaaacttaga aacggaaatg gaatcctgct cacaaaatca ctttaagatc ttttcgaagc 3960 tgttaatttt tcttagtgtt gtggacactg cagacttgtc cagtgctccc acggcctgta 4020 cggacactgt ggaaggcctc cctctgtcgg ctttttgcca tctgtgatat gccataggtg 4080 tgacaatccg agcagtggag tcattcagcg ggagcactgc gcgctatccc ctcacattct 4140 ctatgtacta tgtatgtatg tattattatt attgctgcca agagggtctg atggcacgtt 4200 gtggggtcgg ggggtggggc ggggaagtgc tctaactttt cttaaggttt tgttgctagc 4260 ccttcaagtg cactgagcta tgtgactcgg atggtctttc acacggcaca tttggacatt 4320 tccagaacta ccatgagatg gtttagacgg gaattcatgc aaatgagggg tcaaaaatgg 4380 tatagtgacc ccgtccacgt cctccaagct cacgaccttg gagccccgtg gagctggact 4440 gaggaggagg ctgcacagcg ggagagcagc tggtccagac cagccctgca gcccccactc 4500 agccggcagc cagatggccc cgcaaggcct ccagggatgg cccctagcca caggccctgg 4560 ctgaggtctc tgggtcggtc agtgacatgt aggtaggaag cactgaaaat agtgttccca 4620 gagcactttg caactccctg ggtaagaggg acgacacctc tggtttttca ataccaatta 4680 catggaactt ttctgtaatg ggtacaatga agaagtttct aaaaacacac acaaagcaca 4740 ttgggccaac tatttagtaa gcccggatag acttattgcc aaaaacaaaa aatagctttc 4800 aaaagaaatt taagttctat gagaaattcc ttagtcatgg tgttgcgtaa atcatatttt 4860 agctgcacgg cattacccca cacagggtgg cagaacttga agggttactg acgtgtaaat 4920 gctggtattt gatttcctgt gtgtgttgcc ctggcattaa gggcatttta cccttgcagt 4980 tttactaaaa cactgaaaaa tattccaagc ttcatattaa ccctacctgt caacgtaacg 5040 atttcatgaa cgttattata ttgtcgaatt cctactgaca acattataac tgtatgggag 5100 cttaacttta taaggaaatg tattttgaca ctggtatctt attaaagtat tctgatccta 5160 ccactgaaaa aaaaaaaaaa aaaa 5184 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Hif2-alpha mRNA (gene transcript) target sequence <400> 2 acguaacgau uucaugaac 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Hif2-alpha mRNA (gene transcript) target sequence <400> 3 acaacugucc auacuaaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Hif2-alpha mRNA (gene transcript) target sequence <400> 4 cauucucuau guacuaugu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 19-mer base sequence <400> 5 uuucaugaaa ucguuacgu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 19-mer base sequence <400> 6 guucaugaaa ucguuacgu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 19-mer base sequence <400> 7 auucaugaaa ucguuacgu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 19-mer base sequence <220> <221> modified_base <222> 1 <223> n = any nucleobase <400> 8 nuucaugaaa ucguuacgu 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 19-mer base sequence <220> <221> modified_base <222> 1, 19 <223> n = any nucleobase <400> 9 nuucaugaaa ucguuacgn 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand core 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strand underlying base sequence <400> 994 caacguaacg auuucaugaa at 22 <210> 995 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 995 cacauucucu auguacuaug ut 22 <210> 996 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 996 acacaacugu ccauacuaac at 22 <210> 997 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 997 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 998 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 998 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 999 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 999 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1000 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1000 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1001 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1001 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1002 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1002 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1003 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1003 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1004 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1004 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1005 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1005 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1006 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1006 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1007 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1007 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1008 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1008 cacauucucu auguacuaug u 21 <210> 1009 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1009 cacauucucu auguacuaug u 21 <210> 1010 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1010 cacauucucu auguacuaug u 21 <210> 1011 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1011 acacaacugu ccauacuaac a 21 <210> 1012 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1012 acacaacugu ccauacuaac a 21 <210> 1013 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1013 acacaacugu ccauacuaac a 21 <210> 1014 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1014 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1015 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1015 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1016 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1016 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1017 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1017 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1018 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1018 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1019 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1019 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1020 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1020 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1021 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1021 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1022 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1022 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1023 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1023 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1024 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1024 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1025 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1025 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1026 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1026 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1027 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1027 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1028 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1028 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1029 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1029 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1030 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1030 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1031 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1031 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1032 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1032 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1033 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1033 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1034 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1034 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1035 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1035 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1036 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1036 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1037 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1037 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1038 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1038 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1039 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1039 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1040 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1040 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1041 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1041 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1042 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1042 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1043 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1043 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1044 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1044 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1045 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1045 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1046 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1046 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1047 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1047 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1048 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1048 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 1049 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <400> 1049 caacguaacg auuucaugaa a 21

Claims (106)

  1. (i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
    (ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥; 및
    (iii) 1개 이상의 표적화 리간드
    를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 센스 가닥이 표 4, 4.1, 4.2, 또는 4.3에 제공된 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 안티센스 가닥에 대해 17개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 적어도 85% 상보성 영역을 갖는 것인 RNAi 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥, RNAi 작용제의 안티센스 가닥, 또는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  5. 제4항에 있어서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 변형된 리보뉴클레오티드, 시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-프로파르길-변형된 뉴클레오티드, 2'-O-트리아졸-변형된 뉴클레오티드, 및 3'-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 RNAi 작용제.
  6. 제5항에 있어서, 각각의 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 2'-O-트리아졸-변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 RNAi 작용제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 표 4에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 표 4, 표 4.1, 표 4.2, 또는 표 4.3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 뉴클레오티드 2-18을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  11. 제10항에 있어서, 안티센스 가닥이 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 서열을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  12. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 CAACGUAACGAUUUCAUGAAA (서열식별번호: 428)의 서열의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  13. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)의 서열을 포함하고, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 Z를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고, Y-(NH-C6)은
    Figure pct00413

    를 나타내고; (invAb)는
    Figure pct00414

    를 나타내고; (6-S)는
    Figure pct00415

    를 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 안티센스 가닥이 센스 가닥에 대해 적어도 실질적으로 상보적인 것인 RNAi 작용제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 뉴클레오티드가 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)의 서열로 이루어지고, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로 약리학적 모이어티이고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고 (본원의 실시예에 개시된 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 경우 2'-O-프로파르길 기에의 커플링에 의해 완성되었음), Y-(NH-C6)s는
    Figure pct00416

    를 나타내고, (invAb)는
    Figure pct00417

    를 나타내고, (6-S)는
    Figure pct00418

    를 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  16. 제15항에 있어서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)의 서열로 이루어지며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 적어도 1개의 표적화 리간드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  18. 제17항에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  19. 제18항에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 알파-v-베타-3, 알파-v-베타-5, 또는 알파-v-베타-3 및 알파-v-베타-5 둘 다에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  20. 제19항에 있어서, 표적화 리간드가 화학식:
    Figure pct00419

    의 화합물이며,
    여기서
    X는 -C(R3)2-, -NR3-,
    Figure pct00420
    이고;
    Y는 알킬렌 쇄에서 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    Z는 O, NR3, 또는 S이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 RNAi 작용제를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 RNAi 작용제를 포함하고;
    각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 RNAi 작용제를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 RNAi 작용제를 포함하는 것인
    RNAi 작용제.
  21. 제20항에 있어서, 표적화 리간드가 하기로부터 선택되며:
    Figure pct00421

    Figure pct00422

    Figure pct00423

    Figure pct00424

    Figure pct00425

    Figure pct00426

    Figure pct00427

    여기서
    Figure pct00428
    는 HIF-2 알파 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 구조
    Figure pct00429

    를 갖는 것인 RNAi 작용제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약동학적 (PK) 인핸서를 추가로 포함하는 RNAi 작용제.
  24. 제23항에 있어서, PK 인핸서가 화학식:
    Figure pct00430

    를 포함하고, 여기서 Y는 임의로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 쇄이고, n은 5-25의 정수인 RNAi 작용제.
  25. 제24항에 있어서, PK 인핸서가
    Figure pct00431

    를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  26. 제23항에 있어서, PK 인핸서가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00432

    Figure pct00433

    Figure pct00434

    Figure pct00435

    Figure pct00436

    여기서
    Figure pct00437
    는 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 2 내지 10개의 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 2개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 연결된 RNAi 작용제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고, 적어도 1개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 비-말단 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 표적화 리간드에 연결되며, 여기서 2개 이상의 표적화 리간드는 분지점에서 연결되어 표적화 기를 형성하는 것인 RNAi 작용제.
  33. 제32항에 있어서, 표적화 기가 3개의 표적화 리간드를 포함하고, 표적화 기가 화학식:
    Figure pct00438

    를 갖고, 여기서
    L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로, 임의로 치환된 알킬렌을 포함하는 링커이고;
    L4는 임의로 치환된 알킬렌, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 시클로알킬을 포함하는 링커이고;
    R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    TL은 표적화 리간드이고;
    Y는 O 또는 S인
    RNAi 작용제.
  34. 제33항에 있어서, 표적화 기가 화학식:
    Figure pct00439

    를 갖는 것인 RNAi 작용제.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고, 적어도 2개의 추가의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  36. 제31항 또는 제35항에 있어서, 적어도 10개의 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 단부 상에 위치하는 표적화 기와 센스 가닥 상에 위치하는 표적화 리간드 사이에 위치하는 것인 RNAi 작용제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 5 내지 8개의 표적화 리간드가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  40. 제39항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 적어도 1개의 세자리 표적화 기에 연결되고, 적어도 2개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  41. 제40항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 (i) 센스 가닥의 5' 말단 단부의 세자리 표적화 기, 및 (ii) 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드 외의 뉴클레오티드에 연결된 2 내지 4개의 표적화 리간드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 하기와 같이 연결되는 것인 RNAi 작용제: (i) 3개의 개별 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기는 센스 가닥의 5' 말단 단부에 위치하고; (ii) 추가의 표적화 리간드는 센스 가닥의 5' 말단 단부로부터 적어도 10개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있는 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 개별 표적화 리간드임.
  43. 제42항에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하는 센스 가닥의 3' 뉴클레오티드로부터 위치 2, 4, 6, 및 8 (3' → 5')에 위치하는 센스 가닥 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  44. 제43항에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 리보스 고리의 2' 위치, 리보스 고리의 3' 위치, 리보스 고리의 1' 위치에서의 개별 뉴클레오티드에, 또는 뉴클레오티드의 핵염기, 리보스 고리의 4' 위치, 또는 뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  45. 제44항에 있어서, 적어도 1개의 표적화 리간드가 개별 뉴클레오티드의 리보스 고리의 2' 위치에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  47. 제46항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  48. 제47항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  49. 제48항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 평활 단부를 갖는 RNAi 작용제.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 말단 캡을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 표 5의 듀플렉스 중 어느 하나의 구조를 갖는 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 RNAi 작용제.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오티드 서열의 3' 단부, 뉴클레오티드 서열의 5' 단부, 또는 뉴클레오티드 서열의 3' 단부 및 5' 단부 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  55. (i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
    (ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
    을 포함하는 HIF-2 알파 RNAi 작용제.
  56. (i) HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 (서열식별번호: 1)에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥;
    (ii) 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥;
    (iii) 센스 가닥에 연결된 표적화 리간드; 및
    (iv) 센스 가닥에 연결된 PK 인핸서
    를 포함하는, HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제.
  57. 제56항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 표적화 리간드가 센스 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  60. 제59항에 있어서, 2 내지 12개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 표적화 리간드로 구성된 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결되고; PK 인핸서가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결되고; 2 내지 12개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  62. 제61항에 있어서, 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 표적화 리간드가 각각 각각의 뉴클레오티드의 2' 위치에서 연결된 것인 RNAi 작용제.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 제1 뉴클레오티드로부터의 위치 2, 6, 15, 및 19 (3' → 5')에 위치하는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  64. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 제1 뉴클레오티드로부터의 위치 2, 4, 6, 및 8 (3' → 5')에 위치하는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  65. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 2, 4, 6, 및 8 (5' → 3')에 걸친 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  66. 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 표적화 리간드를 포함하는 세자리 표적화 기가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 위치하고, 센스 가닥이 센스 가닥의 뉴클레오티드에 연결된 2 내지 4개의 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부의 세자리 표적화 기와 뉴클레오티드에 부착된 그 다음의 가장 가까운 표적화 리간드를 분리하는 적어도 10개의 뉴클레오티드가 존재하는 것인 RNAi 작용제.
  67. 제66항에 있어서, 4개의 표적화 리간드가 센스 가닥의 개별 뉴클레오티드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 알파-v-베타-3에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 인테그린 표적화 리간드인 RNAi 작용제.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, PK 인핸서가 화학식:
    Figure pct00440

    를 갖고, 여기서 Y는 임의로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 쇄이고, n은 5-25의 정수인 RNAi 작용제.
  70. 서열 usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 30)를 포함하는 안티센스 가닥, 및 서열 Y-(NH-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuZcaZugZaaZsa(invAb)(6-S)-X (서열식별번호: 761)를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; uZ, aZ, gZ, 및 cZ는 각각 뉴클레오티드의 2' 위치에 연결된 약리학적 모이어티 포함 Z를 갖는 우리딘, 아데노신, 구아노신 및 시티딘을 나타내고; Y-(NH-C6)s는
    Figure pct00441

    를 나타내고; (invAb)는
    Figure pct00442

    를 나타내고; (6-S)는
    Figure pct00443

    를 나타내고, 각각의 X, Y 및 Z는 독립적으로:
    (iv) 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기;
    (v) 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 표적화 리간드; 또는
    (vi) C-18 이산, C-18 삼산, Mal-C17-비닐-PO3, 및 C20 산으로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 PK 인핸서
    를 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  71. 제70항에 있어서, 각각의 Z가 구조 2a:
    Figure pct00444

    의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
    Figure pct00445
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  72. 제70항에 있어서, 각각의 Z가 구조 2.11a:
    Figure pct00446

    의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
    Figure pct00447
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  73. 제70항에 있어서, 각각의 Z가 구조 29a:
    Figure pct00448

    의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
    Figure pct00449
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  74. 제70항에 있어서, 각각의 Z가 구조 32a:
    Figure pct00450

    의 구조를 갖는 표적화 리간드이고, 여기서
    Figure pct00451
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, X가 C-18 이산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
    Figure pct00452

    여기서
    Figure pct00453
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  76. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Mal-C-18 삼산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
    Figure pct00454

    여기서
    Figure pct00455
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  77. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Mal-C17-비닐 PO3의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
    Figure pct00456

    여기서
    Figure pct00457
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  78. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Mal-C20 산의 구조를 갖는 PK 인핸서이고:
    Figure pct00458

    여기서
    Figure pct00459
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 표적화 리간드를 포함하는 RNAi 작용제.
  80. 제79항에 있어서, 7개의 표적화 리간드를 포함하는 RNAi 작용제.
  81. 제80항에 있어서, Y가 TriAlk 14:
    Figure pct00460

    또는 TriAlk 14s:
    Figure pct00461

    의 구조를 갖는 표적화 기이고, 여기서 TL은 구조 2a, 구조 2.11a, 구조 29a, 및 구조 32a로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 리간드를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  82. 제81항에 있어서, 각각의 TL이 구조 2a:
    Figure pct00462

    를 포함하며, 여기서
    Figure pct00463
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  83. 제81항에 있어서, 각각의 TL이 구조 2.11a:
    Figure pct00464

    를 포함하며, 여기서
    Figure pct00465
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  84. 제81항에 있어서, 각각의 TL이 구조 29a:
    Figure pct00466

    를 포함하며, 여기서
    Figure pct00467
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  85. 제81항에 있어서, 각각의 TL이 구조 32a:
    Figure pct00468

    를 포함하며, 여기서
    Figure pct00469
    는 부착 지점을 나타내는 것인 RNAi 작용제.
  86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 서열식별번호: 30의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 RNAi 작용제.
  87. 제70항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 뉴클레오티드가 서열식별번호: 761의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 RNAi 작용제.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제를 포함하며, 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  89. 제88항에 있어서, HIF-2 알파의 발현을 억제하기 위한 제2 RNAi 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  91. 세포 내로 유효량의 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물을 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, HIF2-알파 유전자 발현이 생체내에서 적어도 약 30%만큼 억제되는 것인 방법.
  95. HIF2-알파-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료 유효량의 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HIF2-알파-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 질환 또는 장애가 암, 신암, 투명 세포 신세포 암종, 비소세포 폐암, 성상세포종 (뇌암), 방광암, 유방암, 연골육종, 결장직장 암종, 위 암종, 교모세포종, 두경부 편평 세포 암종, 간세포성 암종, 폐 선암종, 신경모세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 직장암, 전이, 치은염, 건선, 카포시 육종-연관 헤르페스바이러스, 전자간증, 염증, 만성 염증, 신생혈관 질환, 또는 류마티스 관절염인 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 질환이 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC)인 방법.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 인간 대상체의 체중의 약 3 mg/kg 내지 약 80 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, RNAi 작용제가 인간 대상체의 체중의 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, RNAi 작용제가 분할 용량으로 투여되며, 여기서 목적하는 1일 양의 약 절반이 초기 투여로 투여되고, 목적하는 1일 양의 나머지 약 절반이 초기 투여의 대략 4시간 후에 투여되는 것인 방법.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 용량 또는 용량들이 1주 1회 투여되는 것인 방법.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 용량 또는 분할 용량이 격주로 (격주 1회) 투여되는 것인 방법.
  103. 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료를 위한, 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  104. 제103항에 있어서, 질환이 ccRCC인 용도.
  105. 적어도 부분적으로 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상을 치료하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  106. 제105항에 있어서, 질환이 ccRCC인 용도.
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