KR20240014067A - 뮤신 5AC (MUC5AC)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

뮤신 5AC (MUC5AC)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 Download PDF

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에릭 더블유. 부쉬
앤서니 니콜라스
카지 엠. 쉬네베크
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애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드
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Abstract

뮤신 5AC (MUC5AC) 유전자의 억제를 위한 RNAi 작용제, RNAi 작용제를 포함하는 조성물 및 방법이 기재된다. 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제 및 RNAi 작용제 접합체는 MUC5AC 유전자의 발현을 억제한다. 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 임의로 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 포함하는 제약 조성물이 또한 기재된다. 기재된 MUC5AC RNAi 작용제의 폐 상피 세포로의 생체내 전달은 MUC5AC 유전자 발현의 억제 및 MUC5AC 생산의 감소를 제공하며, 이는 점막폐쇄성 폐 질환, 예컨대 중증 천식 및 다양한 암을 포함한 다양한 질환의 치료를 위해 인간 대상체를 포함한 대상체에게 치료 이익을 제공할 수 있다.

Description

뮤신 5AC (MUC5AC)의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2021년 5월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/194,370을 우선권 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<서열 목록>
본 출원은 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ASCII 카피는 SEQLIST_30659.txt로 명명되고, 크기는 460 kb이다.
<기술 분야>
본 개시내용은 뮤신 5AC ("MUC5AC") 유전자 발현의 억제를 위한 RNA 간섭 (RNAi) 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
MUC5AC는 폐의 기도 상피 및 다른 점막 조직 (예를 들어, 위장, 비뇨생식기, 눈 및 귀)에서 발현되는 전사적으로 조절되는 분비된 뮤신이다 (문헌 [Lillehoj et al., Int Rev Cell Mol Biol, 2013]). 기도에서, MUC5AC 및 MUC5B는 주요 겔-형성 뮤신이다. MUC5B는 구성적으로 발현되고, 점액섬모 클리어런스에 요구된다 (문헌 [Roy et al., Nature 2014]). 정상 대상체는 기관 및 근위 기도에서 MUC5AC에 비해 MUC5B의 상대적으로 더 높은 발현을 가지며, 여기서 이 비는 원위 및 종말 세기관지에서 거의 검출불가능한 MUC5AC의 발현과 함께 원위 기도에서 추가로 증가한다 (문헌 [Okuda et al., AJRCCM 2019]). 전형적으로 기도에서 낮은 수준으로 발현되는 MUC5AC 발현은 염증유발 매개체 (예를 들어, 제2형 시토카인: IL-4, IL-9, IL-17, IL-23 및 IL-13 포함), 유해 흡입 물질 (예를 들어, 담배 연기, 아크롤레인, 독성 기체), 바이러스 감염 및 알레르겐과 같은 외부 스트레스 자극에 의해 강건하게 유도될 수 있다. 생성된 점액 과다분비 및 과다농축은 중증 천식 및 다른 점막폐쇄성 폐 질환, 예컨대 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 비-CF 기관지확장증 (NCFB), 및 원발성 섬모 이상운동증 (PCD)에서의 기도 폐쇄와 연관된 통상적인 병원성 메카니즘인 것으로 이해된다 (문헌 [Boucher, NEJM 2019]). 천식, COPD 및 NCFB 환자에서, MUC5AC의 과도한 발현 및 분비는 기도 내강의 협소화, 기도 폐쇄 및 악화를 유발한다 (문헌 [Dunican et al., JCI 2017; Bonser et al., JCI 2016; Kesimer et al., NEJM 2017; Ramsey et al., AJRCCM 2019]). 게놈전반 연관 연구 (GWAS)는 증가된 MUC5AC 발현 및 중등도- 내지-중증 천식을 갖는 환자와 연관된 신규 MUC5AC 대립유전자를 확인하였다 (문헌 [Shrine et al., Lancet Respir Med 2019]). MUC5AC-결핍 마우스로부터의 실험적 증거는 MUC5AC-매개 기도 막힘이 염증 및 기관지수축과 무관하게 알레르겐에 대한 기도 과민반응에 대한 주요 기여자임을 입증하였다 (문헌[Evans et al., Nat Commun, 2015]). 중증 천식 및 다른 점막폐쇄성 폐 질환에 대한 현행 표준 관리 치료는 기관지확장제 및 항염증 치료제 (예컨대, 코르티코스테로이드 및 생물제제)를 포함하지만, 현재 이용가능한 치료는 병원성 뮤신 과다발현 및 과다분비를 직접적으로 다루지 않는다. 점액 과다분비 및 폐쇄를 직접 치료하는 대안적 접근법이 필요하다.
MUC5AC의 증가된 발현은 또한 악성종양, 예컨대 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종, 난소암, 및 종양 세포의 이동 및 침습성과 연관된 다른 종양에서 관찰되었다 (문헌 [Krishn et al., Carcinogenesis 2018]). MUC5AC 및 다른 뮤신 유전자에서의 기능-상실 돌연변이는 종양 세포에서 유의하게 과소표현되며, 이는 뮤신 과다발현이 면역 세포에 의한 인식으로부터 종양을 차폐할 수 있음을 시사한다 (문헌 [Gorlov et al., Cancer Genetics 2019]). 종양 MUC5AC 과다발현은 폐 선암종 환자에서의 진행 및 불량한 생존율과 연관된다 (문헌 [Bauer et al., JCI Insight 2018]). MUC5AC 과다발현은 또한 알레르기성 비염, 만성 비부비동염, 중이염, 바렛 식도, 췌장염, 및 염증성 장 질환을 포함한 다수의 다른 상태와 연관되어 있다 (문헌 [Krishn et al., Carcinogenesis 2018]).
치료제 또는 의약으로서의 사용을 포함하는, MUC5AC 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 억제할 수 있는 신규 RNA 간섭 (RNAi) 작용제 (RNAi 작용제, RNAi 촉발제 또는 촉발제로 지칭됨), 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제에 대한 필요가 존재한다. 추가로, 점액 과다분비 및 폐쇄와 연관된 질환 또는 장애 (본원에서 "점막폐쇄성" 폐 질환 및 장애로 지칭됨), 예컨대 예를 들어 낭성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 비-CF 기관지확장증 (NCFB), 원발성 섬모 이상운동증 (PCD), 및 천식, 및/또는 MUC5AC 유전자 발현 및/또는 MUC5AC 단백질 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위한 신규 MUC5AC-특이적 RNAi 작용제의 조성물에 대한 필요가 존재한다.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 뉴클레오티드 서열 및 화학적 변형, 뿐만 아니라 MUC5AC RNAi 작용제를 생체내에서 선택적으로 및 효율적으로 전달하는 데 적합한 특정 특이적 표적화 리간드와의 그의 조합은 관련 기술분야에 공지된 것들과 상이하다. 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자의 발현의 고도로 강력하고 효율적인 억제를 제공하고, 질환 및 장애의 치료를 위한 치료제로서 사용하기에 적합한 서열을 갖는다.
일반적으로, 본 개시내용은 MUC5AC 유전자-특이적 RNAi 작용제, MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 및 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 사용하여 시험관내 및/또는 생체내에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법을 특색으로 한다. 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 감소시킬 수 있고, 그에 의해 MUC5AC 단백질의 발현을 감소시킬 수 있으며, 이는 치료 이익, 예컨대 예를 들어 폐에서의 점막폐쇄의 감소로 이어질 수 있다.
기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 점막폐쇄성 폐 질환 (예컨대, 천식, CF, COPD, NCFB, PCD), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 간질성 폐 질환, 암 (예컨대, 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종, 난소암, 및 다른 종양), 호흡기 감염 (예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 리노바이러스), 중이염, 염증성 장 질환, 담석 질환, 알레르기성 비염, 만성 비부비동염 및 비강 폴립증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 증상 및 질환의 치유적 치료 (방지적 또는 예방적 치료 포함)를 위한 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 특색으로 하며, 여기서 RNAi 작용제는 센스 가닥 (패신저 가닥으로도 지칭됨) 및 안티센스 가닥 (가이드 가닥으로도 지칭됨)을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다. 본원에 기재된 RNAi 작용제 센스 가닥의 길이는 각각 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본원에 기재된 RNAi 작용제 안티센스 가닥의 길이는 각각 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 18 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 독립적으로 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 독립적으로 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드 길이이다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는 MUC5AC를 발현하는 세포에 전달 시, 생체내 및/또는 시험관내에서 1종 이상의 MUC5AC 유전자 변이체의 발현을 억제한다.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 인간 MUC5AC 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1 참조)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 표 1에 개시된 서열 중 임의의 것의 서열을 갖는 MUC5AC 유전자의 일 부분을 표적화한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 MUC5AC 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 감소시킬 수 있는 개시된 MUC5AC RNAi 작용제 중 1종 이상을 포함하는 제약 조성물을 포함한 조성물을 특색으로 한다. 본원에 기재된 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물은 MUC5AC 유전자 발현 및/또는 MUC5AC 단백질 수준과 연관된 증상 및 질환의 치료 (예방적 치료 또는 억제 포함)를 위해 대상체, 예컨대 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
MUC5AC RNAi 작용제에 사용될 수 있는 MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예가 표 3, 4, 5, 6 및 7에 제공된다. MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 예가 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11에 제공된다. 본원에 개시된 특정 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어질 수 있거나 또는 그에 포함될 수 있는 19-뉴클레오티드 코어 스트레치 서열의 예가 표 2에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 MUC5AC RNAi 작용제를 대상체, 예컨대 포유동물 내의 상피 세포에 생체내 전달하는 방법을 특색으로 한다. 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제를 대상체의 폐 세포 (상피 세포, 대식세포, 평활근, 내피 세포)에 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
본원에 개시된 방법은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의한 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에게의 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제의 투여를 포함한다. 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 본원에 개시된 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료가 요구되는지에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통해), 및 실질내 투여일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 흡입 (예컨대, 건조 분말 흡입 또는 에어로졸 흡입), 비강내 투여, 기관내 투여 또는 구인두 흡인 투여에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 폐 상피에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 것이 요구되며, 이를 위한 투여는 흡입에 의한 (예를 들어, 흡입기 장치, 예컨대 계량 흡입기, 또는 네뷸라이저, 예컨대 제트 또는 진동 메쉬 네뷸라이저, 또는 연무 흡입기에 의한) 것이다.
1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 RNAi 작용제를 표적화 기에 공유 연결시킴으로써 세포 또는 조직에 전달된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 세포 수용체 리간드, 예컨대 인테그린 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 인테그린은 세포-세포외 매트릭스 (ECM) 부착을 용이하게 하는 막횡단 수용체의 패밀리이다. 특히, 인테그린 알파-v-베타-6 (αvβ6)은 ECM 단백질 및 TGF-베타 잠복성-연관 펩티드 (LAP)에 대한 수용체인 것으로 공지된 상피-특이적 인테그린이고, 다양한 세포 및 조직에서 발현된다. 인테그린 αvβ6은 손상된 폐 상피에서 고도로 상향조절되는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 인테그린 αvβ6에 대해 친화도를 갖는 인테그린 표적화 리간드에 연결된다. 본원에 지칭된 "αvβ6 인테그린 표적화 리간드"는 인테그린 αvβ6에 대해 친화도를 갖는 화합물이며, 이는 목적하는 세포 및/또는 조직 (즉, 인테그린 αvβ6을 발현하는 세포)에 부착되는 RNAi 작용제의 표적화 및 전달을 용이하게 하기 위한 리간드로서 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중 αvβ6 인테그린 표적화 리간드 또는 αvβ6 인테그린 표적화 리간드의 클러스터는 MUC5AC RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제-αvβ6 인테그린 표적화 리간드 접합체는 수용체-매개 세포내이입을 통해 또는 다른 수단에 의해 폐 상피 세포에 의해 선택적으로 내재화된다.
αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 MUC5AC RNAi 작용제를 전달하는 데 유용한 표적화 기의 예가, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/085415 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/089765에 개시되어 있고, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
표적화 기는 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드에 내부적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11에 개시된 듀플렉스 구조를 갖는 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 특색으로 한다.
MUC5AC RNAi 작용제의 사용은 MUC5AC 유전자 발현의 감소 및/또는 MUC5AC 단백질 수준의 감소가 치료 이익을 제공할 수 있는 질환 또는 장애의 치유적 (예방적 포함) 치료를 위한 방법을 제공한다. 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 점막폐쇄성 폐 질환 (예컨대, 천식, CF, COPD, NCFB, PCD), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 간질성 폐 질환, 암 (예컨대, 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종, 난소암, 및 다른 종양), 호흡기 감염 (예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 리노바이러스), 중이염, 염증성 장 질환, 담석 질환, 알레르기성 비염, 만성 비부비동염 및 비강 폴립증을 포함한 다양한 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 점막폐쇄성 폐 질환, 예컨대 중증 천식 또는 COPD를 치료하는 데 사용될 수 있다. MUC5AC RNAi 작용제는, 예를 들어 다양한 암을 치료하는 데 추가로 사용될 수 있다. 이러한 치료 방법은 요구되는 것보다 높은 상승 또는 증진된 MUC5AC 유전자 발현 및/또는 MUC5AC 단백질 수준을 갖는 인간 또는 동물에게 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 한 측면은 하기를 포함하는, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이며:
(i) MUC5AC 유전자 전사체 (서열식별번호: 1)의 인접 뉴클레오티드의 상응하는 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이인 안티센스 가닥; 및
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥;
여기서 RNAi 작용제 센스 가닥은 임의로 표적화 리간드에 추가로 연결되고, RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 하기를 포함하는, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이며:
(i) 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥;
여기서 RNAi 작용제 센스 가닥은 임의로 표적화 리간드에 추가로 연결되고, RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525)와 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525)와 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 1525는 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다 (예를 들어, 모든 뉴클레오시드간 연결을 나타내는 도 3a 내지 3j 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535)와 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535)와 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 1535는 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다 (예를 들어, 모든 뉴클레오시드간 연결을 나타내는 도 3a 내지 3j 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)와 1개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다 (예를 들어, 모든 뉴클레오시드간 연결을 나타내는 도 3a 내지 3j 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191) (여기서, a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타냄)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535);
여기서 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535);
여기서 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 말단에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535);
여기서 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 말단에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함하며; 여기서 각각의 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 위치 1-21에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525) 및
GCUGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 1617); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535) 및
GCUGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 1632);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525) 및
GCUGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 1617); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535) 및
GCUGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 1632);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 말단에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127);
usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065);
usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166);
cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥, 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하먀; 여기서 센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127);
usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065);
usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166);
cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191);
여기서 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥, 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 말단에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하며, 여기서 표적화 리간드는 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127) 및
gscuguucuGfCfGfacuacuacaa (서열식별번호: 1265);
usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065) 및
gscuguucuGfCfGfacuacuacaa (서열식별번호: 1265);
usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166) 및
gscugauUfuGfcCfugaacaagaa (서열식별번호: 1315); 및
cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191) 및
gscugauUfuGfcCfugaacaagaa (서열식별번호: 1315);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 센스 가닥은 또한 인테그린 수용체에 대해 친화도를 갖는 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 센스 가닥의 5'-말단에서 임의로 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127) 및
Tri-SM6.1-avb6-(TA14)gscuguucuGfCfGfacuacuacaas(invAb) (서열식별번호: 1491);
usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065) 및
Tri-SM6.1-avb6-(TA14)gscuguucuGfCfGfacuacuacaas(invAb) (서열식별번호: 1491);
usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166) 및
Tri-SM6.1-avb6-(TA14)gscugauUfuGfcCfugaacaagaas(invAb) (서열식별번호: 1513);
cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191) 및
Tri-SM6.1-avb6-(TA14)gscugauUfuGfcCfugaacaagaas(invAb) (서열식별번호: 1513);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘을 나타내고; Tri-SM6.1-αvβ6-(TA14)는 도 1에 제시된 바와 같은 화학 구조를 갖는 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 나타내고; (invAb)는 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고 (또한 표 11 참조), s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 및
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 및
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 및
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 83은 각각 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1-19 5' → 3')에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 및 UGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 568); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83) 및 UGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 572).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기가 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 및 UGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 568); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83) 및 UGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 572);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
정의
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 각각 독립적으로 변형되거나 또는 비변형될 수 있는 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
본원에 사용된 "RNAi 작용제" ("RNAi 촉발제"로도 지칭됨)는 표적화된 메신저 RNA (mRNA) 전사체의 번역을 서열 특이적 방식으로 분해 또는 억제할 수 있는 (예를 들어, 적절한 조건 하에 분해 또는 억제하는) RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 본원에 사용된 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘 (즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도된 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함)을 통해, 또는 임의의 대안적 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제는, 그 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정한 경로 또는 작용 메카니즘에 얽매이거나 또는 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되고, 소형 (또는 짧은) 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA (즉, MUC5AC mRNA)에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "침묵시키다", "감소시키다", "억제하다", "하향-조절하다" 또는 "녹다운시키다"는 주어진 유전자의 발현을 지칭하는 경우, 유전자가 전사되는 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에서 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된 바와 같은 유전자의 발현이, 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체가 본원에 기재된 RNAi 작용제로 처리될 때 그렇게 처리되지 않은 제2 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체와 비교하여 감소된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 표준 명명법을 사용하여 일련의 문자로 기재된 핵염기 또는 뉴클레오티드의 연속 또는 순서를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재된다.
본원에 사용된 "염기", "뉴클레오티드 염기" 또는 "핵염기"는 뉴클레오티드의 성분인 헤테로시클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이고, 1차 퓨린 염기 아데닌 및 구아닌, 및 1차 피리미딘 염기 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 핵염기는 비제한적으로 범용 염기, 소수성 염기, 혼재성 염기, 크기-확장 염기, 및 플루오린화 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008] 참조). 이러한 변형된 핵염기 (변형된 핵염기를 포함하는 포스포르아미다이트 화합물 포함)의 합성은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티, 염기 모이어티 및 공유 연결된 기 (연결 기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 기를 포함하는 글리코시드를 지칭하고, 자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기 모이어티를 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오티드 (본원에서 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드로도 지칭됨) 둘 다를 포괄한다. 단일 뉴클레오티드는 본원에서 단량체 또는 단위로 지칭될 수 있다.
본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은 제1 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 센스 가닥 또는 표적화된 mRNA)을 제2 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 안티센스 가닥 또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 기재하는 데 사용되는 경우, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 표준 조건 하에 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화하고 (포유동물 생리학적 조건 (또는 달리 적합한 생체내 또는 시험관내 조건) 하에 염기 쌍 수소 결합을 형성하고) 듀플렉스 또는 이중 나선 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 혼성화 시험에 가장 적절한 조건의 세트를 선택할 수 있을 것이다. 상보적 서열은 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기 쌍을 포함하고, 적어도 상기 혼성화 요건이 충족되는 정도로 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형과 무관하다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 a 및 Af는 U (또는 T)에 상보적이고, 동일성 또는 상보성을 결정할 목적으로 A와 동일하다.
본원에 사용된 "완벽하게 상보적" 또는 "완전히 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 모든 (100%) 염기가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "부분적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아닌 적어도 70%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아닌 적어도 85%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보적", "완전히 상보적", "부분적으로 상보적" 및 "실질적으로 상보적"은 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 MUC5AC mRNA의 서열 사이의 핵염기 또는 뉴클레오티드 매칭과 관련하여 사용된다.
핵산 서열에 적용된 바와 같은 본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"은 뉴클레오티드 서열 (또는 뉴클레오티드 서열의 일 부분)이 참조 서열과 비교하여 적어도 약 85% 서열 동일성 또는 그 초과, 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 것을 의미한다. 서열 동일성의 백분율은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 비교함으로써 결정된다. 백분율은 동일한 유형의 핵산 염기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본원에 개시된 발명은 본원에 개시된 것들과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 완화 또는 경감을 제공하기 위해 취해지는 방법 또는 단계를 의미한다. 본원에 사용된 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 예방, 관리, 예방적 치료 및/또는 억제 또는 감소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포 내로 도입하는"은 RNAi 작용제를 지칭하는 경우에 RNAi 작용제를 세포 내로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적 전달"은 RNAi 작용제가 예상되는 생물학적 활성, 예를 들어 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 갖는 것을 가능하게 하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포에 전달하는 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
Figure pct00001
의 사용은 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따른 임의의 기 또는 기들이 그에 연결될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 그의 원자의 성질 또는 결합 순서 또는 그의 원자의 공간 배열이 상이한 화합물을 지칭한다. 그의 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 지칭되고, 비-중첩가능한 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체" 또는 때때로 광학 이성질체로 지칭된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, 구조에서 특정한 입체형태를 갖는 것으로 구체적으로 확인되지 않는 한, 비대칭 중심이 존재하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 다른 입체이성질체 배위를 생성하는 각각의 구조에 대해, 본원에 개시된 각각의 구조는 그의 광학적으로 순수한 및 라세미 형태를 포함한 모든 이러한 가능한 이성질체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 구조는 부분입체이성질체의 혼합물 뿐만 아니라 단일 입체이성질체를 포함하도록 의도된다.
본원의 청구범위에 사용된 어구 "로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에서 사용될 때, 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 화합물 및 조성물이, 화합물 또는 조성물이 위치하는 환경에 따라, 특정 원자 (예를 들어, N, O, 또는 S 원자)를 양성자화 또는 탈양성자화 상태로 가질 수 있음을 용이하게 이해하고 알 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대, 예를 들어 OH, SH 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있음을 고려한다. 본원의 개시내용은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 개시된 화합물 및 조성물을 환경 (예컨대, pH)에 기초한 그의 양성자화 상태와 무관하게 포괄하는 것으로 의도된다. 상응하게, 불안정한 양성자 또는 염기성 원자를 갖는 본원에 기재된 화합물은 또한 상응하는 화합물의 염 형태를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 화합물은 유리 산, 유리 염기 또는 염 형태일 수 있다. 본원에 기재된 화합물의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "접합된"은 2개의 화합물 또는 분자 사이의 연결을 지칭하는 경우에 2개의 화합물 또는 분자가 공유 결합에 의해 연결됨을 의미한다. 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "연결된" 및 "접합된"은 임의의 개재 원자 또는 원자단을 갖거나 갖지 않는 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연결을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "포함한"은 본원에서 어구 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미하도록 사용되고, 그와 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "또는"은 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 본원에서 용어 "및/또는"을 의미하도록 사용되고, 그와 상호교환가능하게 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
값이 명백하게 언급되는 경우, 언급된 값과 거의 동일한 수량 또는 양인 값이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소의 각각의 하위-조합이 또한 구체적으로 개시되고, 본 개시내용의 범주 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 군이 개별적으로 개시된 경우, 그의 조합이 또한 개시된다. 본 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시된 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 그 개시내용의 예가 또한 본원에 개시되고; 본 개시내용의 하나 초과의 요소가 이러한 배제를 가질 수 있고, 이러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에 개시된다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 측면 및 이점은 하기 상세한 설명, 첨부 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1. 본원에서 Tri-SM6.1-αvβ6-(TA14)로 지칭되는 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드의 화학 구조 표현.
도 2. 본원에서 αvβ6-pep1로 지칭되는 펩티드 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드의 화학 구조 표현.
하기 약어가 도 3a 내지 3j에서 사용된다: a, c, g, i 및 u는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; o는 포스포디에스테르 연결이고; s는 포스포로티오에이트 연결이고; invAb는 역전된 무염기성 잔기이고 (예를 들어, 표 11 참조); cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘 변형된 뉴클레오티드이고 (예를 들어, 표 11 참조); Tri-SM6.1-αvβ6-(TA14)는 도 1에 나타낸 구조를 갖는 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드이고; (TriAlk14)는 표적화 리간드에 대한 후속 커플링에 적합한 표 11에 나타낸 바와 같은 연결 기이다 (또한, 본원의 실시예 1 참조).
도 3a. 센스 가닥의 5' 말단에 연결된 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 갖는, AC000437의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 9, 10 및 11 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3b. 센스 가닥의 5' 말단에 연결된 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 갖는, AC000480의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 9, 10 및 11 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3c. 센스 가닥의 5' 말단에 연결된 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 갖는, AC000482의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 9, 10 및 11 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3d. 센스 가닥의 5' 말단에 연결된 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 갖는, AC001305의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 9, 10 및 11 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3e. 센스 가닥의 5' 말단에 연결된 세자리 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드를 갖는, AC001306의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 9, 10 및 11 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3f. 센스 가닥의 5' 말단에 (TriAlk14) 링커를 갖는, AD08089의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 8 및 10 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3g. 센스 가닥의 5' 말단에 (TriAlk14) 링커를 갖는, AD08174의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 8 및 10 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3h. 센스 가닥의 5' 말단에 (TriAlk14) 링커를 갖는, AD08173의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 8 및 10 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3i. 센스 가닥의 5' 말단에 (TriAlk14) 링커를 갖는, AD09240의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 8 및 10 참조)의 개략적 다이어그램.
도 3j. 센스 가닥의 5' 말단에 (TriAlk14) 링커를 갖는, AD09241의 구조를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 8 및 10 참조)의 개략적 다이어그램.
RNAi 작용제
MUC5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제 (본원에서 MUC5AC RNAi 작용제 또는 MUC5AC RNAi 촉발제로 지칭됨)가 본원에 기재된다. 본원에 개시된 각각의 MUC5AC RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥은 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안티센스 가닥은 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 18 내지 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21-26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21-24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19-21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 19개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 약 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 센스 가닥은 각각 독립적으로 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 듀플렉스를 형성하고, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드의 듀플렉스 길이를 갖는다.
MUC5AC RNAi 작용제를 형성하는 데 사용된 뉴클레오티드 서열의 예가 표 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 제공된다. 표 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는 RNAi 작용제 듀플렉스의 예가 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11에 나타나 있다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 완벽한, 실질적 또는 부분적 상보성의 영역은 15-26개 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개) 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 발생한다 (예를 들어, 이러한 영역은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 완벽하게, 실질적으로 또는 부분적으로 상보적이지 않은 0, 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있음).
본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 MUC5AC mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열 (본원에서 "코어 스트레치" 또는 "코어 서열"로도 지칭됨)에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열에 대해 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이며, 따라서 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 전형적으로 MUC5AC mRNA 표적 내에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열 (때때로, 예를 들어 표적 서열로 지칭됨)과 완벽하게 동일하거나 또는 적어도 약 85% 동일하다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 MUC5AC mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치 및 상응하는 센스 가닥 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 적어도 85% 상보성을 갖는 적어도 18개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치는 MUC5AC mRNA 표적 내에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 표적 서열)에 대해 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 21개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 상응하는 안티센스 코어 스트레치 서열과 동일한 길이일 수 있거나, 또는 상이한 길이일 수 있다.
MUC5AC RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 듀플렉스를 형성한다. MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다. 상보적 듀플렉스 영역 내에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 코어 스트레치 서열에 대해 적어도 85% 상보적 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 상응하는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 뉴클레오티드 서열에 적어도 85% 또는 100% 상보적인 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 또는 적어도 23개의 뉴클레오티드의 서열을 함유한다 (즉, MUC5AC RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 코어 스트레치 서열은 적어도 85% 염기 쌍형성되거나 또는 100% 염기 쌍형성된 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 또는 적어도 24개의 뉴클레오티드의 영역을 가짐).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이하다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 임의로 및 독립적으로 코어 스트레치 서열의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 및 5' 말단 양쪽 모두에 추가적인 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드 (연장물)를 함유할 수 있다. 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우에 MUC5AC mRNA 내의 상응하는 서열에 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우에 MUC5AC mRNA 내의 상응하는 서열과 동일할 수 있거나 또는 동일하지 않을 수 있다. 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드 (존재하는 경우)는 상응하는 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드 (존재하는 경우)에 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 연장물은 센스 가닥 코어 스트레치 서열 및/또는 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥 상의 연장물 뉴클레오티드는 상응하는 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장물 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 반대로, 안티센스 가닥 상의 연장물 뉴클레오티드는 상응하는 센스 가닥 내의 코어 스트레치 뉴클레오티드 또는 연장물 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 3' 및 5' 연장물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 한 가닥의 3' 연장물 뉴클레오티드 중 하나 이상이 다른 가닥의 하나 이상의 5' 연장물 뉴클레오티드와 염기 쌍형성한다. 다른 실시양태에서, 한 가닥의 3' 연장물 뉴클레오티드 중 하나 이상이 다른 가닥의 하나 이상의 5' 연장물 뉴클레오티드와 염기 쌍형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥 및 5' 연장물을 갖는 센스 가닥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 연장 뉴클레오티드(들)는 쌍형성되지 않고 오버행을 형성한다. 본원에 사용된 "오버행"은 본원에 개시된 RNAi 작용제의 혼성화 또는 듀플렉스화 부분의 일부를 형성하지 않는, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단 단부에 위치한 1개 이상의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드의 연장부 또는 스트레치를 지칭한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 MUC5AC mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 MUC5AC mRNA 서열에 상보적이지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 아데노신, 우라실 또는 티미딘 뉴클레오티드, AT 디뉴클레오티드, 또는 MUC5AC mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 센스 가닥 연장물은 다음 서열 중 하나를 포함하거나 또는 그로 이루어지지만, 이에 제한되지는 않는다: T, UT, TT, UU, UUT, TTT 또는 TTTT (각각 5' → 3'으로 열거됨).
센스 가닥은 3' 연장물 및/또는 5' 연장물을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 5' 연장물을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 MUC5AC mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다.
MUC5AC RNAi 작용제를 형성하는 데 사용된 서열의 예가 표 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 제공된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 3 또는 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21 또는 2-21의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2, 4, 5, 6 또는 7의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2, 4, 5, 6 또는 7의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 2-19, 2-20, 2-21, 3-20, 3-21, 또는 4-21의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4, 5, 6, 7 또는 11의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양쪽 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 말단도 평활-말단이 아니다. 본원에 사용된 "평활 말단"은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인 (상보적 염기-쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단을 지칭한다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양쪽 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 말단도 풀린 말단이 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 풀린 말단은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지만 (즉, 오버행을 형성하지 않음), 상보적이지 않은 (즉, 비-상보적 쌍을 형성함) 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 하나의 가닥의 말단의 1개 이상의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드는 오버행을 형성한다. 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 존재하여 3' 또는 5' 오버행을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 평활 말단 및 풀린 말단, 평활 말단 및 5' 오버행 말단, 평활 말단 및 3' 오버행 말단, 풀린 말단 및 5' 오버행 말단, 풀린 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 5' 오버행 말단, 2개의 3' 오버행 말단, 5' 오버행 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 풀린 말단, 또는 2개의 평활 말단을 함유한다. 전형적으로, 존재하는 경우, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 3' 말단 단부에 위치한다.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 또한 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 추가로 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예를 들어 1개 이상의 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결과 조합된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 염, 혼합 염 또는 유리-산으로서 제조 또는 제공된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 제약상 허용되는 염으로서 제조된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 제약상 허용되는 나트륨 염으로서 제조된다. 관련 기술분야에 널리 공지된 이러한 형태는 본원에 개시된 본 발명의 범주 내에 있다.
변형된 뉴클레오티드
변형된 뉴클레오티드는, 다양한 올리고뉴클레오티드 구축물에 사용되는 경우, 세포에서 화합물의 활성을 보존하면서 동시에 이들 화합물의 혈청 안정성을 증가시킬 수 있고, 또한 올리고뉴클레오티드 구축물의 투여 시 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 99% 또는 그 초과, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-변형된 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드, 변형된 핵염기-포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체), 잠금 뉴클레오티드, 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 시클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (즉, 5-원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 (2'-메톡시 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2'-플루오로 뉴클레오티드 (2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡실에틸) 뉴클레오티드 (2'-MOE로도 지칭됨), 2'-아미노 뉴클레오티드 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 하나 초과의 변형이 단일 MUC5AC RNAi 작용제 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 1개의 뉴클레오티드에서의 변형은 또 다른 뉴클레오티드에서의 변형과 독립적이다.
변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, (예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬(예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬(예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-술프히드릴, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (예를 들어, 5-브로모), 5-트리플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3' 말단은 "무염기성 부위" 또는 "무염기성 뉴클레오티드"로도 지칭될 수 있는 무염기성 잔기 (Ab)를 포함할 수 있다. 무염기성 잔기 (Ab)는 당 모이어티의 1' 위치에서 핵염기가 결여된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,998,203 참조). 일부 실시양태에서, 무염기성 잔기는 뉴클레오티드 서열의 내부에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, Ab 또는 AbAb는 안티센스 가닥의 3' 말단에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 말단은 1개 이상의 추가적인 무염기성 잔기 (예를 들어, (Ab) 또는 (AbAb))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, UUAb, UAb 또는 Ab는 센스 가닥의 3' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 모든 존재하는 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다 내의 4개 이하 (즉, 0, 1, 2, 3 또는 4개)의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 (즉, 비변형된 것)인 RNAi 작용제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 모든 존재하는 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 센스 가닥은 센스 가닥 내의 2개 이하 (즉, 0, 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 센스 가닥이다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 모든 존재하는 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 내의 2개 이하 (즉, 0, 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 안티센스 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비변형된 리보뉴클레오티드이다. 특정 변형된 뉴클레오티드에 대한 화학 구조는 본원의 표 12에 제시된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비-표준 연결 또는 백본 (즉, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 변형된 백본)에 의해 연결된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 포스포로티오에이트 기 (본원에서 소문자 "s"로 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 인 원자가 결여된다. 인 원자가 결여된 변형된 뉴클레오시드간 연결은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 백본은 실록산 백본, 술피드 백본, 술폭시드 백본, 술폰 백본, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 알켄-함유 백본, 술파메이트 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 아미드 백본, 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분을 갖는 다른 백본을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드들 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 있고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 5' 말단에 위치하고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드들 사이에 임의의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하지 않지만, 5' 및 3' 말단 둘 다 상의 말단 뉴클레오티드와 임의로 존재하는 역전된 무염기성 잔기 말단 캡 사이에 1, 2 또는 3개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 센스 가닥에 연결된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드들 사이 및 5' 말단으로부터 위치 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25 또는 24-26의 뉴클레오티드들 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-4 사이에 위치하고, 제4 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 20-21 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥 내에 적어도 3 또는 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다.
캡핑 잔기 또는 모이어티
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 때때로 관련 기술분야에서 "캡", "말단 캡" 또는 "캡핑 잔기"로 지칭되는 1개 이상의 캡핑 잔기 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "캡핑 잔기"는 본원에 개시된 RNAi 작용제의 뉴클레오티드 서열의 1개 이상의 말단에 혼입될 수 있는 비-뉴클레오티드 화합물 또는 다른 모이어티이다. 캡핑 잔기는 일부 경우에 RNAi 작용제에 특정의 유익한 특성, 예컨대 예를 들어 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 잔기 (invAb) (관련 기술분야에서 "역전된 무염기성 부위"로도 지칭됨)가 캡핑 잔기로서 부가된다 (표 12 참조) (예를 들어, 문헌 [F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16] 참조). 캡핑 잔기는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 역전된 무염기성 잔기 뿐만 아니라 탄소 쇄, 예컨대 말단 C3H7 (프로필), C6H13 (헥실), 또는 C12H25 (도데실) 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 잔기는 센스 가닥의 5' 말단 단부, 3' 말단 단부, 또는 5' 및 3' 말단 단부 둘 다에 존재한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단은 캡핑 잔기로서 1개 초과의 역전된 무염기성 데옥시리보스 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 3' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에서 또는 그 근처에서 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 역전된 무염기성 잔기는 포스페이트, 포스포로티오에이트 (예를 들어, 본원에서 (invAb)s로 나타냄), 또는 다른 뉴클레오시드간 연결을 통해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에서 또는 그 근처에서 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 역전된 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 3' 말단 또는 안티센스 가닥 서열의 3' 말단은 역전된 무염기성 잔기를 포함할 수 있다. 역전된 무염기성 데옥시리보스 잔기에 대한 화학 구조를 아래 표 12에 나타낸다.
MUC5AC RNAi 작용제
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1 (NM_001304359.2)) 상의 특정 위치를 표적화하도록 설계된다. 본원에 정의된 바와 같이, 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 유전자와 염기 쌍형성할 때 유전자 상의 위치로부터 (3' 말단을 향해) 19개 뉴클레오티드 하류인 위치와 정렬되는 경우에 유전자 상의 주어진 위치에서 MUC5AC 유전자를 표적화하도록 설계된다. 예를 들어, 본원의 표 1 및 2에 예시된 바와 같이, 위치 3535에서 MUC5AC 유전자를 표적화하도록 설계된 안티센스 가닥 서열은 유전자와 염기 쌍형성할 때 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 MUC5AC 유전자의 위치 3553과 정렬되는 것을 요구한다.
본원에 제공된 바와 같이, MUC5AC RNAi 작용제는, 안티센스 가닥 및 적어도 16개의 연속적인 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸친 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재하는 한, 안티센스 가닥의 위치 1 (5' → 3')의 핵염기가 유전자에 상보적일 필요는 없다. 예를 들어, MUC5AC 유전자의 위치 3535를 표적화하도록 설계된 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 경우, MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 유전자의 위치 3553과 정렬되어야 하지만; 안티센스 가닥 및 적어도 16개의 연속적인 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸친 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재하는 한, 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 MUC5AC 유전자의 위치 3553에 상보적일 수 있지만, 반드시 상보적일 필요는 없다. 특히 본원에 개시된 다양한 예에 의해 나타낸 바와 같이, MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥에 의한 유전자의 특이적 결합 부위 (예를 들어, MUC5AC RNAi 작용제가 위치 3535, 위치 4993, 위치 15051 또는 일부 다른 위치에서 MUC5AC 유전자를 표적화하도록 설계되는지 여부)는 MUC5AC RNAi 작용제에 의해 달성되는 억제 수준에 대한 중요한 인자이다 (또한, 문헌 [Kamola et al., The siRNA Non-seed Region and Its Target Sequences are Auxiliary Determinants of Off-Target Effects, PLOS Computational Biology, 11(12), Figure 1 (2015)] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 표 1에 나타낸 MUC5AC 서열의 위치에서 또는 그 근처에서 MUC5AC 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 1에 개시된 표적 MUC5AC 19-mer 서열에 완전히, 실질적으로 또는 적어도 부분적으로 상보적인 코어 스트레치 서열을 포함한다.
표 1. MUC5AC 19-mer mRNA 표적 서열 (호모 사피엔스 뮤신 5AC, 올리고머 점액/겔-형성 (MUC5AC) 유전자 전사체, 진뱅크 NM_001304359.2 (서열식별번호: 1)로부터 취함)
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호모 사피엔스 뮤신 5AC, 올리고머성 점액/겔-형성 (MUC5AC) 유전자 전사체, 진뱅크 NM_001304359.2 (서열식별번호: 1) (17,448개의 염기):
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일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 19가 표 1에 개시된 19-mer 표적 서열의 위치 1과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 1이 표 1에 개시된 19-mer 표적 서열의 위치 19와 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2가 표 1에 개시된 19-mer 표적 서열의 위치 18과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2 내지 18이 표 1에 개시된 19-mer 표적 서열의 위치 18 내지 2에 위치하는 각각의 상보적 염기 각각과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
본원에 개시된 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 MUC5AC 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 MUC5AC 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A 또는 dT이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 센스 가닥은 표 2, 표 4, 표 5, 표 6 또는 표 7의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 1-18 또는 2-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-18, 1-19, 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2, 표 4, 표 5, 표 6 또는 표 7의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 2-19, 1-19, 1-18, 또는 2-18의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 하기 표 2에 나타낸 코어 19-mer 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 2. MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 코어 스트레치 염기 서열 (N=임의의 핵염기; I = 이노신 (하이포크산틴 핵염기)
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표 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함하거나 또는 그로 이루어진 센스 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 MUC5AC RNAi 작용제는 모두 또는 실질적으로 모두 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표 2에 개시된 서열에 열거된 각각의 N은 임의의 및 모든 핵염기 (변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 둘 다에서 발견되는 것들 포함)로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적인 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적이지 않은 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 동일한 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 상이한 핵염기를 갖는다.
특정 변형된 MUC5AC RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥이 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 및 표 11에 제공된다. 특정 변형된 MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 3에 제공된다. 특정 변형된 MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 4, 5 및 6에 제공된다. MUC5AC RNAi 작용제의 형성에서, 상기 표 3, 4, 5, 6 및 7, 뿐만 아니라 상기 표 2에 열거된 각각의 기저 염기 서열 내의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링함으로써 형성된다. 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단 2개의 서열은 인접 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 핵염기 서열을 갖는 듀플렉스를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
변형된 뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥의 예가 표 3에 제공된다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 센스 가닥의 예가 표 4, 5 및 6에 제공된다.
표 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 사용된 바와 같이, 하기 표기법을 사용하여 변형된 뉴클레오티드, 표적화 기 및 연결 기를 나타된다:
A = 아데노신-3'-포스페이트
C = 시티딘-3'-포스페이트
G = 구아노신-3'-포스페이트
U = 우리딘-3'-포스페이트
I = 이노신-3'-포스페이트
a = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트
as = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트
c = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트
cs = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트
g = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트
gs = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스포로티오에이트
i = 2'-O-메틸이노신-3'-포스페이트
is = 2'-O-메틸이노신-3'-포스포로티오에이트
t = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스페이트
ts = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
u = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트
us = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Af = 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트
Afs = 2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트
Cf = 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트
Cfs = 2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트
Gf = 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트
Gfs = 2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트
Tf = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스페이트
Tfs = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Uf = 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트
Ufs = 2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트
dT = 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트
AUNA = 2',3'-세코-아데노신-3'-포스페이트
AUNAs = 2',3'-세코-아데노신-3'-포스포로티오에이트
CUNA = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스페이트
CUNAs = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스포로티오에이트
GUNA = 2',3'-세코-구아노신-3'-포스페이트
GUNAs = 2',3'-세코-구아노신-3'-포스포로티오에이트
UUNA = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스페이트
UUNAs = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스포로티오에이트
a_2N = 표 12 참조
a_2Ns = 표 12 참조
(invAb) = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'-포스페이트, 표 12 참조
(invAb)s = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'-포스포로티오에이트, 표 12 참조
s = 포스포로티오에이트 연결
p = 말단 포스페이트 (합성된 바와 같음)
vpdN = 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드
cPrpa = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트 (표 12 참조)
cPrpas = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트 (표 12 참조)
cPrpu = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트 (표 12 참조)
cPrpus = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트 (표 12 참조)
(Alk-SS-C6) = 표 12 참조
(C6-SS-Alk) = 표 12 참조
(C6-SS-C6) = 표 12 참조
(6-SS-6) = 표 12 참조
(C6-SS-Alk-Me) = 표 12 참조
(NH2-C6) = 표 12 참조
(TriAlk14) = 표 12 참조
(TriAlk14)s = 표 12 참조
-C6- = 표 12 참조
-C6s- = 표 12 참조
-L6-C6- = 표 12 참조
-L6-C6s- = 표 12 참조
-Alk-cyHex- = 표 12 참조
-Alk-cyHex- = 표 12 참조
(TA14) = 표 12 (접합 후 (TriAlk14)s의 구조) 참조
(TA14)s = 표 12 (접합 후 (TriAlk14)s의 구조) 참조
관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해할 바와 같이, 서열에 의해 (예컨대, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결 "s"에 의해) 달리 나타내지 않는 한, 올리고뉴클레오티드에 존재할 때 뉴클레오티드 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 올리고뉴클레오티드 서열의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드가 전형적으로 주어진 단량체의 각각의 3' 위치에 생체외 포스페이트 모이어티 대신에 히드록실 (-OH) 기를 가질 것임을 용이하게 이해할 것이다. 추가적으로, 본원에 개시된 실시양태의 경우, 각각의 가닥을 5' → 3'으로 볼 때, 역전된 무염기성 잔기는 데옥시리보스의 3' 위치가 각각의 가닥 상의 선행 단량체의 3' 말단에서 연결되도록 삽입된다 (예를 들어, 표 12 참조). 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해하고 인지할 바와 같이, 본원에 도시된 포스포로티오에이트 화학 구조는 전형적으로 황 원자 상에 음이온을 나타내지만, 본원에 개시된 발명은 모든 포스포로티오에이트 호변이성질체 (예를 들어, 황 원자가 이중 결합을 갖고 음이온이 산소 원자 상에 있는 경우)를 포괄한다. 본원에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이러한 이해는 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제 및 MUC5AC RNAi 작용제의 조성물을 기재하는 경우에 사용된다.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제와 함께 사용된 표적화 기 및 연결 기의 특정 예는 하기 표 12에 제공된 화학 구조에 포함된다. 본원에 개시된 각각의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 접합된, 본원에 열거된 임의의 표적화 기 또는 연결 기, 뿐만 아니라 다른 표적화 또는 연결 기를 가질 수 있다.
표 3. MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥 서열
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
표 4. MUC5AC 작용제 센스 가닥 서열 (링커, 접합체 또는 캡핑 모이어티 없이 나타냄)
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
(A2N) = 2-아미노아데닌-함유 뉴클레오티드; I = 하이포크산틴 (이노신) 뉴클레오티드
** 상기 표 4의 구축물에 대해, 캡핑 모이어티, 예컨대 예를 들어 (InvAb) 또는 s(InvAb), 또는 접합체는 전형적으로 나타낸 변형된 센스 가닥 서열의 3' 말단에 위치한다 (예를 들어, 하기 표 5 참조).
표 5. MUC5AC 작용제 센스 가닥 서열 (TriAlk14 링커와 함께 나타냄 (구조 정보에 대해서는 표 12 참조)).
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
(A2N) = 2-아미노아데닌-함유 뉴클레오티드; I = 하이포크산틴 (이노신) 뉴클레오티드
표 6. 시험관내 시험된 특정 MUC5AC RNAi 작용제에 대해 나타낸 말단 캡을 갖는 뉴클레오티드 서열.
Figure pct00053
Figure pct00054
(A2N) = 2-아미노아데닌-함유 뉴클레오티드; I = 하이포크산틴 (이노신) 뉴클레오티드
표 7. MUC5AC 작용제 센스 가닥 서열 (표적화 리간드 접합체와 함께 나타냄). αvβ6-SM6.1의 구조는 표 12에 나타나 있고, Tri-SM6.1-αvβ6-(TA14)의 구조는 도 1에 나타나 있다.
Figure pct00055
Figure pct00056
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링함으로써 형성된다. 표 2, 표 4, 표 5, 표 6 또는 표 7에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열은 인접 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다.
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 특정 예시적인 MUC5AC RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 5' 말단 단부 및 3' 말단 단부 중 하나 또는 둘 다에 반응성 연결 기를 추가로 포함하는 것으로 나타내어 진다. 예를 들어, 상기 표 5에 나타낸 다수의 MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥 서열은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 (TriAlk14) 연결 기를 갖는다. 다른 연결 기, 예컨대 (NH2-C6) 연결 기 또는 (6-SS-6) 또는 (C6-SS-C6) 연결 기가 또한 또는 대안적으로 특정 실시양태에서 존재할 수 있다. 이러한 반응성 연결 기는 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제에 대한 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 PK/PD 조정제의 연결을 용이하게 하도록 위치한다. 연결 또는 접합 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 접합 반응은 아미드 커플링 반응, 마이클 첨가 반응, 히드라존 형성 반응, 역-요구 딜스-알더 고리화첨가 반응, 옥심 라이게이션, 및 구리 (I)-촉매된 또는 변형-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 반응 고리화첨가 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드, 예컨대 본원에 개시된 실시예 및 도면에 나타낸 인테그린 표적화 리간드는 활성화된 에스테르, 예컨대 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르로서 합성될 수 있고, 이는 반응성 아미노 기 (예를 들어, NH2-C6)에 의해 대체되어 표적화 리간드를 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제에 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 아지드로서 합성되며, 이는 예를 들어 구리 (I)-촉매된 또는 변형-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 반응을 통해 프로파르길 (예를 들어, TriAlk14) 또는 DBCO 기에 접합될 수 있다.
추가적으로, 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 3' 말단 단부의 dT 뉴클레오티드, 이어서 (3' → 5') 링커 (예를 들어, C6-SS-C6)와 함께 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 추가의 성분, 예컨대 예를 들어 PK/PD 조정제 또는 하나 이상의 표적화 리간드에 대한 연결을 용이하게 할 수 있다. 이어서, C6-SS-C6의 디술피드 결합을 환원시켜 분자로부터 dT를 제거할 수 있고, 이는 이어서 목적하는 PK/PD 조정제의 접합을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 말단 dT 뉴클레오티드는 완전히 접합된 구축물의 일부가 아닐 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이하다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24 또는 2-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3 또는 표 11의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 표 4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 2-17, 3-17, 4-17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4-19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21, 4-21, 1-22, 2-22, 3-22, 4-22, 1-23, 2-23, 3-23, 4-23, 1-24, 2-24, 3-24 또는 4-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥은 표 3 또는 표 11의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본원에 개시된 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 MUC5AC 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 MUC5AC 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A 또는 dT (또는 U, A 또는 dT의 변형된 버전)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단에서 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 센스 가닥은 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 (i) 표 2, 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
표 2 또는 표 4에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열은 인접한 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 11의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖는다. 특정의 대표적인 서열 쌍은 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A 및 10B에 나타낸 듀플렉스 ID 번호에 의해 예시된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 어느 하나에 의해 나타내어지는 듀플렉스를 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 임의의 것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 및 표적화 기, 연결 기, 및/또는 다른 비-뉴클레오티드 기를 포함하며, 여기서 표적화 기, 연결 기 및/또는 다른 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다 (즉, 접합된다). 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 본원에 제시된 듀플렉스 ID 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열 및 표적화 기, 연결 기, 및/또는 다른 비-뉴클레오티드 기를 포함하며, 여기서 표적화 기, 연결 기 및/또는 다른 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 2, 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 또는 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 표적화 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 2, 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B, 또는 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 하나 이상의 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 2, 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 또는 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 표적화 리간드인 표적화 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 2, 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 또는 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 하나 이상의 αvβ6 인테그린 표적화 리간드 또는 αvβ6 인테그린 표적화 리간드의 클러스터 (예를 들어, 세자리 αvβ6 인테그린 표적화 리간드)를 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 표적화 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11의 듀플렉스 중 임의의 것을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
표 8A. 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 서열에 대한 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 및 서열 ID 번호를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스 (연결제 또는 접합체 없이 나타냄)
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
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Figure pct00061
표 8B. 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 서열에 대한 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 및 서열 ID 번호를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
표 8C. 시험관내 시험된 특정 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 서열에 대한 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 및 서열 ID 번호를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00067
Figure pct00068
표 9. 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 서열에 대한 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 및 서열 ID 번호를 갖는 MUC5AC RNAi 작용제 접합된 듀플렉스 (표적화 리간드 접합체와 함께 나타냄)
Figure pct00069
Figure pct00070
표 10A. MUC5AC (MUC5AC) 유전자 상에서 표적화된 위치를 참조하는 접합체 듀플렉스 ID 번호
Figure pct00071
Figure pct00072
표 10B. 접합체 ID 번호 및 상응하는 AD 듀플렉스 번호, MUC5AC (MUC5AC) 유전자 상에서 표적화된 위치 참조
Figure pct00073
Figure pct00074
표 11. 화학적으로 변형된 안티센스 및 센스 가닥을 갖는 접합체 ID 번호 (링커 및 접합체 포함)
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 염, 혼합 염 또는 유리-산으로서 제조 또는 제공된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 제약상 허용되는 염으로서 제조되거나 또는 제공된다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 제약상 허용되는 나트륨 또는 칼륨 염으로서 제조되거나 또는 제공된다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는 MUC5AC 유전자를 발현하는 세포에 전달 시 생체내 및/또는 시험관내에서 1종 이상의 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 녹다운시킨다.
표적화 기, 연결 기, 약동학/약역학 (PK/PD) 조정제, 및 전달 비히클
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표적화 기, 연결 기, 약동학/약역학 (PK/PD) 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 기를 함유하거나 또는 그에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 표적화, 전달 또는 부착을 증진시킬 수 있다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 MUC5AC RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 비-뉴클레오티드 기는 링커/연결 기를 통해 RNAi 작용제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 불안정성, 절단성, 또는 가역적 결합 또는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착된 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 증진시킨다.
표적화 기 또는 표적화 모이어티는 이들이 부착되어 있는 접합체 또는 RNAi 작용제의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체 또는 RNAi 작용제의 세포-특이적 (일부 경우에, 기관 특이적 포함) 분포 및 세포-특이적 (또는 기관 특이적) 흡수를 개선시킨다. 표적화 기는 그것이 지시되는 표적에 대해 1가, 2가, 3가, 4가일 수 있거나, 또는 더 높은 원자가를 가질 수 있다. 대표적인 표적화 기는 비제한적으로 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대해 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커, 예컨대 PEG 링커, 또는 일부 경우에 링커로서의 역할을 할 수 있는 1, 2 또는 3개의 무염기성 및/또는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기를 사용하여 RNAi 작용제에 연결된다.
표적화 기는, 링커와 함께 또는 링커 없이, 표 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 개시된 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 것의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있다. 링커는, 표적화 기와 함께 또는 표적화 기 없이, 표 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 개시된 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 임의의 것의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있다.
5'-말단 및/또는 3'-말단에 반응성 기, 예컨대 아미노 기 (본원에서 아민으로도 지칭됨)를 갖는 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제가 합성될 수 있다. 반응성 기는 후속적으로 관련 기술분야에 전형적인 방법을 사용하여 표적화 모이어티를 부착시키는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 NH2-C6 기를 갖는 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제가 합성될 수 있다. 후속적으로 말단 아미노 기를 반응시켜, 예를 들어 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 1개 이상의 알킨 기를 갖는 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제가 합성된다. 후속적으로 말단 알킨 기(들)를 반응시켜, 예를 들어 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 인테그린 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 αvβ6 인테그린 표적화 리간드이다. αvβ6 인테그린 표적화 리간드의 사용은 그의 각각의 표면 상에 αvβ6을 갖는 세포에 대한 세포-특이적 표적화를 용이하게 하고, 인테그린 표적화 리간드의 결합은 그가 연결된 치료제, 예컨대 RNAi 작용제의 세포, 예컨대 폐 상피 세포 및 신장 상피 세포를 포함한 상피 세포 내로의 진입을 용이하게 할 수 있다. 인테그린 표적화 리간드는 단량체 또는 1가 (예를 들어, 단일 인테그린 표적화 모이어티를 가짐) 또는 다량체 또는 다가 (예를 들어, 다중 인테그린 표적화 모이어티를 가짐)일 수 있다. 표적화 기는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 RNAi 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 표적화 기, 예컨대 αvβ6 인테그린 표적화 리간드의 제조는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/085415 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/089765에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 추가의 링커의 사용 없이 MUC5AC RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 MUC5AC RNAi 작용제에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 용이하게 존재하는 링커를 갖도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우, 2종 이상의 RNAi 작용제는 동일한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우, 2종 이상의 RNAi 작용제는 상이한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결된다.
일부 실시양태에서, 연결 기는 RNAi 작용제에 접합된다. 연결 기는 표적화 기, 약동학 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클에 대한 작용제의 공유 연결을 용이하게 한다. 연결 기는 RNAi 작용제 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결 기는 RNAi 작용제 센스 가닥에 연결된다. 일부 실시양태에서, 연결 기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, 연결 기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 연결 기의 예는 C6-SS-C6, 6-SS-6, 반응성 기, 예컨대 1급 아민 (예를 들어, NH2-C6) 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 잔기/뉴클레오티드, 아미노산, 트리-알킨 관능화된 기, 리비톨, 및/또는 PEG 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 연결 기의 예가 표 12에 제공된다.
링커 또는 연결 기는 1개의 화학적 기 (예컨대, RNAi 작용제) 또는 관심 절편을 또 다른 화학적 기 (예컨대, 표적화 기, 약동학적 조정제, 또는 전달 중합체) 또는 관심 절편에 1개 이상의 공유 결합을 통해 연결하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 불안정성 연결은 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 연결에 유연성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기 및 아르알키닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 이들 각각은 1개 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 상기 목록은 설명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티, 또는 12개 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 예컨대 콜레스테롤 또는 팔미토일 기에 접합된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 하나 이상의 약동학/약역학 (PK/PD) 조정제에 연결된다. PK/PD 조정제는 개선된 세포 수용체 결합, 개선된 세포 흡수 및/또는 다른 수단을 통해 접합된 약물의 순환 시간을 증가시키고/거나 RNAi 작용제의 활성을 증가시킬 수 있다. RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 다양한 PK/PD 조정제는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, PK/PD 조정제는 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 유도체일 수 있거나, 또는 일부 상황에서 PK/PD 조정제는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기 또는 아르알키닐 기로 구성될 수 있으며, 이들 각각은 선형, 분지형, 시클릭, 및/또는 치환 또는 비치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 모이어티에 대한 부착 위치는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단일 수 있고/거나, 센스 가닥의 임의의 주어진 뉴클레오티드의 리보스 고리의 2' 위치일 수 있고/거나, 센스 가닥의 임의의 위치의 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 백본에 부착된다.
표 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 열거된 MUC5AC RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것은, 변형되었든 또는 변형되지 않았든, 3' 및/또는 5' 표적화 기(들), 연결 기(들), 및/또는 PK/PD 조정제(들)를 함유할 수 있다. 3' 또는 5' 표적화 기, 연결 기 및/또는 PK/PD 조정제를 함유하는, 표 3, 4, 5, 6, 7 및 11에 열거되거나 또는 본원에 달리 기재된 임의의 MUC5AC RNAi 작용제 서열은 대안적으로 3' 또는 5' 표적화 기, 연결 기 또는 PK/PD 조정제를 함유하지 않을 수 있거나, 또는 표 12에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 3' 또는 5' 표적화 기, 연결 기, 또는 약동학적 조정제를 함유할 수 있다. 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11에 열거된 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스 중 임의의 것은, 변형되었든 또는 변형되지 않았든, 표 11에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표적화 기 또는 연결 기를 추가로 포함할 수 있고, 표적화 기 또는 연결 기는 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
특정 변형된 뉴클레오티드, 캡핑 모이어티, 및 연결 기의 예가 표 12에 제공된다.
표 12. 다양한 변형된 뉴클레오티드, 캡핑 모이어티 및 연결 기를 나타내는 구조 (여기서
Figure pct00078
은 연결 지점을 나타냄)
Figure pct00079
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Figure pct00084
대안적으로, 관련 기술분야에 공지된 다른 연결 기가 사용될 수 있다. 많은 경우, 연결 기는 상업적으로 입수될 수 있거나, 또는 다르게는 상업적으로 입수가능한 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 내로 혼입된다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/161213 참조).
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표적화 리간드 또는 약동학/약역학 (PK/PD) 조정제에 접합되지 않고 전달된다 ("네이키드" 또는 "네이키드 RNAi 작용제"로 지칭됨).
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표적화 기, 연결 기, PK 조정제 및/또는 또 다른 비-뉴클레오티드 기에 접합되어, MUC5AC RNAi 작용제의 선택된 세포 또는 조직, 예를 들어 생체내 상피 세포로의 전달을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 표적화 기에 접합되며, 여기서 표적화 기는 인테그린 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 αvβ6 인테그린 표적화 리간드이다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 하나 이상의 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 RNAi 작용제를 세포 또는 조직에 전달하는 데 사용될 수 있다. 전달 비히클은 RNAi 작용제의 세포 또는 조직으로의 전달을 개선시키는 화합물이다. 전달 비히클은 중합체, 예컨대 양친매성 중합체, 막 활성 중합체, 펩티드, 멜리틴 펩티드, 멜리틴-유사 펩티드 (MLP), 지질, 가역적으로 변형된 중합체 또는 펩티드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, DPC 또는 핵산 전달을 위해 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 시스템과 조합할 수 있다. RNAi 작용제는 또한 표적화 기, 지질 (콜레스테릴 및 콜레스테릴 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 나노입자 내 캡슐화, 리포솜, 미셀, 중합체 또는 DPC에의 접합 (예를 들어, WO 2000/053722, WO 2008/022309, WO 2011/104169, 및 WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에, 이온영동에 의해, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 비히클 또는 시스템, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생체접착성 마이크로구체 또는 단백질성 벡터 내로의 혼입에 의해 화학적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 폐 상피 세포에 대해 친화도를 갖는 항체에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 폐 상피 세포 또는 폐 상피 세포 상에 존재하는 수용체에 대해 친화도를 갖는 표적화 리간드에 연결될 수 있다.
제약 조성물 및 제제
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 제약 조성물 또는 제제 (본원에서 "의약"으로도 지칭됨)로서 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 MUC5AC RNAi 작용제를 포함한다. 이들 제약 조성물은 표적 세포, 세포 군, 조직 또는 유기체에서의 MUC5AC mRNA의 발현의 억제에 특히 유용하다. 제약 조성물은 표적 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 제약 조성물은 표적 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 표적화 리간드에 연결된 MUC5AC RNAi 작용제를 치료될 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 (비히클, 담체, 희석제, 및/또는 전달 중합체 포함)가 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물에 첨가되고, 그에 의해 인간을 포함한 대상체로의 생체내 전달에 적합한 제약 제제 또는 의약이 형성된다.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물 및 방법은, 예컨대 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하고 그에 의해 대상체에서 MUC5AC mRNA의 발현을 억제하는 것에 의해 세포, 세포 군, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에서 표적 mRNA의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 MUC5AC 발현의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 이전에 확인되거나 또는 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 1종 이상의 점막폐쇄성 폐 질환, 예컨대 천식, CF, COPD, NCFB, PCD를 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 점막폐쇄성 폐 질환은 중증 천식이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 간질성 폐 질환, 암 (예컨대, 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종, 난소암 및 다른 종양), 호흡기 감염 (예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 리노바이러스), 중이염, 염증성 장 질환, 담석 질환, 알레르기성 비염, 만성 비부비동염 또는 비강 폴립증을 갖는 것으로 진단되었다.
본 개시내용의 실시양태는 MUC5AC RNAi 작용제를 폐 상피 세포에 생체내 전달하기 위한 제약 조성물을 포함한다. 이러한 제약 조성물은, 예를 들어 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 접합된 MUC5AC RNAi 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 αvβ6 인테그린 리간드로 구성된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 기재된 제약 조성물은 MUC5AC의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 대상체에서 임상 제시를 치료 또는 관리하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 치료 또는 예방 유효량의 제약 조성물 중 1종 이상이 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 개시된 MUC5AC RNAi 작용제 중 임의의 것의 투여는 대상체에서 질환 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 임의로 1종 이상의 추가의 (즉, 제2, 제3 등) 치료제와 조합된다. 제2 치료제는 또 다른 MUC5AC RNAi 작용제 (예를 들어, MUC5AC 유전자 내의 상이한 서열을 표적화하는 MUC5AC RNAi 작용제)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 MUC5AC 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제일 수 있다. 추가의 치료제는 또한 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및/또는 압타머일 수 있다. MUC5AC RNAi 작용제는 1종 이상의 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에 1종 이상의 부형제와 조합하여 제약 조성물을 형성할 수 있다.
MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 기재된 제약 조성물은 MUC5AC mRNA의 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 1종의 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 1종 이상의 제약 조성물의 치료 유효량을 투여함으로써 증상을 치료한다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 예방 유효량의 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하고, 그에 의해 적어도 1종의 증상이 예방 또는 억제된다.
일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 중 1종 이상은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에서 포유동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
투여 경로는 MUC5AC RNAi 작용제가 신체와 접촉되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위해 약물, 올리고뉴클레오티드 및 핵산을 투여하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 특정한 경로에 적절하게 맞춰진 제제로 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 흡입, 비강내 투여, 기관내 투여 또는 구인두 흡인 투여를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 정맥내로, 근육내로, 피내로, 피하로, 관절내로, 안구내로, 또는 복강내로, 또는 국소로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 세포, 세포 군, 조직 또는 대상체에게 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 (시험관내 또는 생체내) 전달하기 위해 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 적합한 방법은 본원에 기재된 조성물과 함께 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 전달은 국부 투여 (예를 들어, 직접 주사, 이식 또는 국소 투여), 전신 투여, 또는 피하, 정맥내, 복강내 또는 비경구 경로, 예컨대 두개내 (예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 척수강내), 근육내, 경피, 기도 (에어로졸), 비강, 경구, 직장 또는 국소 (협측 및 설하 포함) 투여에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 흡입, 비강내 투여, 구인두 흡인 투여 또는 기관내 투여를 통해 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제가 폐 상피에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 것이 요구되며, 이를 위해 흡입 (예를 들어, 흡입기 장치, 예컨대 계량 흡입기, 또는 네뷸라이저, 예컨대 제트 또는 진동 메쉬 네뷸라이저, 또는 연무 흡입기에 의함)을 통한 투여가 특히 적합하고 유리하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 본원에 기재된 제약 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제제화된다.
본원에 사용된 제약 조성물 또는 의약은 약리학상 유효량의 기재된 치료 화합물 중 적어도 1종 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는 활성 제약 성분 (API, 치료 제품, 예를 들어 MUC5AC RNAi 작용제) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공을 보조하고/거나, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 허용성을 보호, 지지 또는 증진시키고/거나, c) 제품 식별을 보조하고/거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전달의 전체 안전성, 유효성의 임의의 다른 속성을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 또는 불활성 물질이 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 전달 중합체, 세제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 계면활성제, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 장성 작용제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor)® ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 요구되는 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분 + 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정질 형태, 예를 들어 수성 미세결정질 현탁액의 형태일 수 있는 약물의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포솜 제제 또는 생분해성 중합체 시스템은 또한 관절내 및 안과적 투여 둘 다를 위한 약물을 제시하는 데 사용될 수 있다.
흡입 투여에 적합한 제제는 적절한 용매 중에 목적하는 양의 활성 화합물을 혼입시킨 후, 멸균 여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 흡입 투여용 제제는 생리학적 pH에서 멸균 용액이고, 저점도 (< 5 cP)를 갖는다. 장성 균형을 맞추기 위해 염이 제제에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제 또는 공-용매를 첨가하여 활성 화합물 용해도를 증가시키고 에어로졸 특성을 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, 분무된 액적의 크기 및 분포를 보장하기 위해 점도를 제어하도록 부형제를 첨가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 흡입 투여에 적합한 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 제약 제제는 주사용수 (멸균수), 등장성 염수 (0.9% 염수), 또는 수성 인산나트륨 완충제 (예를 들어, 물 중 0.5 mM 일염기성 인산나트륨, 0.5 mM 이염기성 인산나트륨 중에 제제화된 MUC5AC RNAi 작용제) 중에서 제조될 수 있다.
활성 화합물은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 리포솜 현탁액은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
MUC5AC RNAi 작용제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 조성물로 제제화될 수 있다. 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성될 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 좌우되고, 이에 직접적으로 의존한다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 정의된 RNAi 작용제를 발현하거나 포함하는 세포, 조직 또는 단리된 기관이 "제약 조성물"로서 사용될 수 있는 것으로 또한 구상된다. 본원에 사용된 "약리학상 유효량", "치료 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 RNAi 작용제의 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 RNAi 작용제를 투여하는 것에 추가로 제2 치료제 또는 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 또 다른 MUC5AC RNAi 작용제 (예를 들어, MUC5AC 표적 내의 상이한 서열을 표적화하는 MUC5AC RNAi 작용제)이다. 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및/또는 압타머일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상이한 서열을 갖는 적어도 2종의 MUC5AC RNAi 작용제의 조합 또는 칵테일을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제는 각각 개별적으로 및 독립적으로 표적화 기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제는 각각 인테그린 표적화 리간드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 표적화 기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제는 각각 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 표적화 기에 연결된다.
MUC5AC RNAi 작용제를 폐 상피 세포에 전달하기 위한 조성물이 본원에 기재된다. 게다가, MUC5AC RNAi 작용제를 신장 상피 세포 및/또는 GI 또는 생식관에서의 상피 세포 및/또는 눈 내의 안구 표면 상피 세포를 비롯한 세포로 생체내 전달하기 위한 조성물이 본원에 일반적으로 기재된다.
일반적으로, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.0001 내지 약 20 mg/kg 체중/폐 침착 용량 (PDD), 예를 들어 약 0.001 내지 약 5 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.03 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.01 내지 약 1.0 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.25 내지 약 1.0 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.25 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.50 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 1.0 mg/kg 체중/폐 침착 용량의 범위일 것이다. 폐 침착 용량 (PDD)을 계산하는 것은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행된다 (문헌 [Wolff R.K., Dorato M.A., Toxicologic Testing of Inhaled Pharmaceutical Aerosols, Crit Rev Toxicol., 1993; 23(4):343-369; Tepper et al., International J. Toxicology, 2016, vol. 35(4):376-392] 참조). 특히 인간 대상체에 대해, 관련 기술분야에 널리 공지된 용량을 계산하는 대등하고 대안적으로 허용되는 방법은 호흡가능한 전달 용량 (RDD)을 결정하는 것이다. RDD는 폐로의 침투에 적합한 크기의 액적에 함유된 약물의 양을 지칭한다. 일반적으로, 본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제의 유효량은 약 0.001 내지 약 5 mg 호흡가능한 전달 용량 (RDD) / kg 체중의 범위일 것이다.
임상 용도를 위해, 인간 대상체에서 이러한 RDD를 생성하는 데 요구되는, 선택된 전달 장치 (예를 들어, 네뷸라이저)에 로딩될 필요가 있는 MUC5AC RNAi 작용제의 양은 사용되는 전달 장치에 따라 달라질 것이다 (예를 들어, 문헌 [Hatley RHM, Byrne SM, Variability in delivered dose and respirable delivered dose from nebulizers: are current regulatory testing guidelines sufficient to produce meaningful information?, Med Devices, 2017, 10:17-28)] 참조). 일부 보다 낮은 효율의 네뷸라이저, 예를 들어 RDD는 네뷸라이저에 로딩된 용량의 대략 15%-25%이다. 다른 보다 효율적인 장치의 경우, 예를 들어 RDD는 네뷸라이저에 로딩된 용량의 대략 50%, 대략 60%, 또는 심지어 60% 초과이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 대략 5 mg, 대략 10 gm, 대략 20 mg, 대략 25 mg, 대략 50 mg, 대략 75 mg, 대략 100 mg, 대략 150 mg, 대략 200 mg, 대략 250 mg 또는 대략 300 mg의 MUC5AC RNAi 작용제의 고정 용량이 각각의 선택된 장치에 로딩될 수 있으며, 이는 약 0.001 내지 약 5 mg/kg 체중/용량의 RDD를 생성할 것이다. 투여하기에 바람직하거나 요구되는 양은 또한 환자의 전반적 건강 상태, 전달되는 화합물의 상대 생물학적 효능, 약물의 제제, 제제 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 가능성이 있을 것이다. 또한, 투여되는 초기 투여량이 상기 상한 수준을 초과하여 증가되어 목적하는 혈액-수준 또는 조직-수준을 급속하게 달성할 수 있거나, 또는 초기 투여량이 최적보다 적을 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 실시양태에서, 용량은 매일, 매주, 격주, 3주마다, 매월 1회, 분기마다 1회 (즉, 3개월마다 1회), 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 용량은 상기 제공된 범위 내에 함유된 다른 간격으로 투여될 수 있다.
질환의 치료를 위해 또는 질환의 치료를 위한 의약 또는 조성물의 형성을 위해, MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 본원에 기재된 제약 조성물은 부형제와, 또는 제2 또는 다른 RNAi 작용제, 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 펩티드 및/또는 압타머를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2 치료제 또는 치료와 조합될 수 있다.
기재된 MUC5AC RNAi 작용제는, 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트에 첨가되는 경우, 키트, 용기, 팩 또는 분배기로 포장될 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물은 건조 분말 또는 에어로졸 흡입기, 다른 계량 흡입기, 네뷸라이저, 사전-충전 시린지 또는 바이알에 포장될 수 있다.
MUC5AC 발현의 치료 및 억제 방법
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 투여로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는 MUC5AC mRNA의 발현의 감소 및/또는 억제 및/또는 MUC5AC 수용체 수준의 감소로부터 이익을 얻을 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는 점막폐쇄성 폐 질환 (예컨대, 천식, CF, COPD, NCFB, PCD), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 간질성 폐 질환, 암 (예컨대, 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종, 난소암, 및 다른 종양), 호흡기 감염 (예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 리노바이러스), 중이염, 염증성 장 질환, 담석 질환, 알레르기성 비염, 만성 비부비동염 및 비강 폴립증을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대상체가 MUC5AC 수용체의 감소로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폐 질환은 중증 천식이다. 대상체의 치료는 치유적 및/또는 예방적 치료를 포함할 수 있다. 대상체는 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 투여받는다. 대상체는 인간, 환자, 또는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 성인, 청소년, 소아 또는 유아일 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물의 투여는 인간 또는 동물에게 이루어질 수 있다.
증가된 막 MUC5AC 활성은 점막폐색 조직을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제는 대상체에서 MUC5AC 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 적어도 1종의 증상을 치료하는 데 사용된다. 대상체는 치료 유효량의 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 중 임의의 1종 이상을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 예방 유효량의 기재된 RNAi 작용제 중 임의의 1종 이상을 투여받고, 그에 의해 적어도 1종의 증상을 예방 또는 억제함으로써 대상체를 치료한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 MUC5AC 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애, 상태 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환, 장애, 상태 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 상기 환자에게 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC RNAi 작용제는 대상체에서 임상 제시 또는 병리학적 상태를 치료 또는 관리하는 데 사용되며, 여기서 임상 제시 또는 병리학적 상태는 적어도 부분적으로 MUC5AC 발현의 감소에 의해 매개된다. 대상체는 치료 유효량의 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 또는 MUC5AC RNAi 작용제-함유 조성물 중 1종 이상을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 치료될 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 MUC5AC 수용체 수준의 감소에 의해 해결될 수 있는 질환 또는 증상의 치료 (예방적 또는 방지적 치료 포함) 방법을 특색으로 하며, 여기서 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 표 2, 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다.
기재된 MUC5AC RNAi 작용제 및/또는 MUC5AC RNAi 작용제를 포함하는 조성물은 증진된 또는 상승된 MUC5AC 단백질 또는 MUC5AC 유전자 발현으로 인한 질환 또는 상태의 치유적 치료를 위한 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 MUC5AC 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 병리학적 상태 (예컨대, 상태 또는 질환)의 치료 (예방적 치료 포함) 방법을 제공하며, 여기서 방법은 대상체에게 표 2, 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 2, 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 세포에 투여하는 것을 포함하는, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 병리학적 상태의 치료 (예방적 치료 포함) 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 대상체에게 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 세포에 투여하는 것을 포함하는, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, MUC5AC 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 병리학적 상태의 치료 (예방적 치료 포함) 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 대상체에게 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 세포에 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 대상체에게 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 핵염기 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 11의 서열 중 임의의 것의 핵염기 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 대상체에게 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 11의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 표 8A, 8B, 8C, 9, 10A, 10B 및 11에 제시된 듀플렉스 중 하나의 듀플렉스 구조를 포함하는 1종 이상의 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제가 투여되는 대상체의 특정 폐 상피 세포에서의 MUC5AC 단백질 및/또는 MUC5AC mRNA의 수량 또는 양은 MUC5AC RNAi 작용제를 투여받기 전의 대상체 또는 MUC5AC RNAi 작용제를 받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제가 투여되는 대상체의 특정 상피 세포에서의 MUC5AC 단백질 수준은 MUC5AC RNAi 작용제를 투여받기 전의 대상체 또는 MUC5AC RNAi 작용제를 받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 유전자 발현 수준, 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군 및/또는 조직에서 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 MUC5AC RNAi 작용제가 투여된 대상체의 특정 상피 세포에서의 MUC5AC mRNA 수준은 MUC5AC RNAi 작용제를 투여받기 전의 대상체 또는 MUC5AC RNAi 작용제를 받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%만큼 감소된다.
MUC5AC mRNA 및 MUC5AC 단백질 수준의 감소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. MUC5AC mRNA 및/또는 MUC5AC 단백질 수준의 감퇴 또는 감소는 본원에서 MUC5AC 유전자 발현의 감소, 감퇴 또는 억제로서 집합적으로 지칭된다. 본원에 제시된 실시예는 MUC5AC의 억제를 평가하기 위한 공지된 방법을 예시한다.
세포, 조직, 기관 및 비-인간 유기체
본원에 기재된 MUC5AC RNAi 작용제 중 적어도 1종을 포함하는 세포, 조직, 기관 및 비-인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직, 기관 또는 비-인간 유기체는 RNAi 작용제를 세포, 조직, 기관 또는 비-인간 유기체에 전달함으로써 제조된다.
추가의 예시적 실시양태
개시된 기술의 특정의 추가의 예시적 실시양태가 본원에 제공된다. 이들 실시양태는 단지 예시적이며, 본 개시내용 또는 본원에 첨부된 청구범위의 범주를 제한하지 않는다.
실시양태 1. 표 2 또는 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는, 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 표 2 또는 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 센스 가닥이 표 2 또는 표 4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥이 17개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 안티센스 가닥에 대해 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 5. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
실시양태 6. 실시양태 4-5 중 어느 하나에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 시클로프로필 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 및 3'-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 7. 실시양태 5에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드 또는 그의 조합으로 변형된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3 또는 표 11에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 표 4 또는 표 11에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3 또는 표 11에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 표 4 또는 표 11에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 18 내지 30개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 18 내지 30개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 2개의 평활 말단을 갖는 RNAi 작용제.
실시양태 16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 1개 또는 2개의 말단 캡을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 18. 실시양태 1에 있어서, 표 8A, 표 8B, 표 8C, 표 9, 표 10A 또는 표 10B의 듀플렉스 중 어느 하나의 구조를 갖는 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 RNAi 작용제.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
실시양태 20. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83).
실시양태 21. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525); 또는
UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535).
실시양태 22. 실시양태 1에 있어서, 센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
UGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 568); 또는
UGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 572).
실시양태 23. 실시양태 20, 21 또는 22에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
실시양태 24. 실시양태 1에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며:
cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127);
usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065);
usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166); 또는
cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인
RNAi 작용제.
실시양태 25. 실시양태 1에 있어서, 센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며:
gscuguucuGfCfGfacuacuacaa (서열식별번호: 1265); 또는
gscugauUfuGfcCfugaacaagaa (서열식별번호: 1315);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 안티센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인
RNAi 작용제.
실시양태 26. 실시양태 20-25 중 어느 하나에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단, 또는 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 표적화 리간드가 상피 세포 상에서 발현된 세포 수용체에 대해 친화도를 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 30. 실시양태 29에 있어서, 인테그린 표적화 리간드가 αvβ6 인테그린 표적화 리간드인 RNAi 작용제.
실시양태 31. 실시양태 30에 있어서, 표적화 리간드가 하기 구조를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
Figure pct00085
또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는
Figure pct00086
또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
실시양태 32. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 하기 구조를 갖는 표적화 리간드에 접합된 RNAi 작용제:
Figure pct00088
또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
실시양태 33. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 하기 구조를 갖는 것인 RNAi 작용제:
Figure pct00090
또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
실시양태 34. 실시양태 27-33 중 어느 하나에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 접합된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 35. 실시양태 34에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 접합된 것인 RNAi 작용제.
실시양태 36. 실시양태 1-35 중 어느 하나의 RNAi 작용제를 포함하며, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 37. 실시양태 36에 있어서, 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제2 RNAi 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 38. 실시양태 36-37 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 39. 실시양태 36-38 중 어느 하나에 있어서, 흡입에 의한 투여를 위해 제제화된 조성물.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 계량 흡입기, 제트 네뷸라이저, 진동 메쉬 네뷸라이저 또는 연무 흡입기에 의해 전달되는 조성물.
실시양태 41. 실시양태 36-40 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 나트륨 염인 조성물.
실시양태 42. 실시양태 36-41 중 어느 하나에 있어서, 제약상 허용되는 부형제가 주사용수인 조성물.
실시양태 43. 실시양태 36-42 중 어느 하나에 있어서, 제약상 허용되는 부형제가 등장성 염수인 조성물.
실시양태 44. 유효량의 실시양태 1-35 중 어느 하나의 RNAi 작용제 또는 실시양태 36-43 중 어느 하나의 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 것인 방법.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
실시양태 47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 투여 후에 뮤신 5AC 유전자 발현이 적어도 약 30% 억제되는 것인 방법.
실시양태 48. MUC5AC 단백질 수준과 연관된 1종 이상의 증상 또는 질환의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 36-43 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, MUC5AC 단백질 수준과 연관된 1종 이상의 증상 또는 질환을 치료하는 방법.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 질환이 점막폐쇄성 폐 질환인 방법.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 점막폐쇄성 폐 질환이 천식 (중증 천식 포함), 낭성 섬유증 (CF), 기관지확장증 (NCFB) 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)인 방법.
실시양태 51. 실시양태 50에 있어서, 질환이 천식 (중증 천식 포함)인 방법.
실시양태 52. 실시양태 48에 있어서, 질환이 암인 방법.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 암이 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종 또는 난소암인 방법.
실시양태 54. 실시양태 44-53 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 5.0 mg의 폐 침착 용량 (PDD)으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 55. 실시양태 44-53 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 2.0 mg의 폐 침착 용량 (PDD)으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 56. 실시양태 44-53 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 5.0 mg의 호흡가능한 전달 용량 (RDD)으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 57. 실시양태 44-53 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 2.0 mg의 호흡가능한 전달 용량 (RDD)으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 58. 실시양태 44-57 중 어느 하나에 있어서, RNAi 작용제가 2회 이상의 용량으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 59. 뮤신 5AC 단백질 수준에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한, 실시양태 1-35 중 어느 하나의 RNAi 작용제의 용도.
실시양태 60. 뮤신 5AC 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한, 실시양태 36-43 중 어느 하나에 따른 조성물의 용도.
실시양태 61. 뮤신 5AC 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 실시양태 36-43 중 어느 하나에 따른 조성물의 용도.
실시양태 62. 실시양태 59-61 중 어느 하나에 있어서, 질환이 천식 (중증 천식 포함)인 용도.
실시양태 63. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 어닐링하여 이중-가닥 리보핵산 분자를 형성하는 것을 포함하는, 실시양태 1-35 중 어느 하나의 RNAi 작용제를 제조하는 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, 센스 가닥이 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 64에 있어서, 표적화 리간드를 센스 가닥에 접합시키는 것을 포함하는 방법.
실시양태 66. 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
표 2, 표 3 또는 표 11에 제공된 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
을 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 67. 뮤신 5AC (MUC5AC) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
표 2 또는 표 3에 개시된 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
을 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 68. 뮤신 5AC (MUC5AC) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
서열식별번호: 1의 동일한 길이의 뉴클레오티드의 스트레치와 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥; 및 센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥
을 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 69. 표 1의 표적 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MUC5AC 유전자의 억제제.
실시양태 70. (i) 표 2, 표 3 또는 표 11의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 71. (i) 표 2, 표 3 또는 표 11의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 11의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제.
실시양태 72. 듀플렉스를 형성하도록 어닐링된 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 듀플렉스는 표 8A, 표 8B, 표 8C, 표 9, 표 10 또는 표 11에 제시된 듀플렉스 중 임의의 것의 구조를 갖는 것인 RNAi 작용제.
실시양태 73. 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
표 2 또는 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
을 포함하고,
여기서 임의로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 임의로 연결된 것인
RNAi 작용제.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기 비제한적 실시예로 예시된다.
실시예
실시예 1. MUC5AC RNAi 작용제의 합성.
본원에 개시된 MUC5AC RNAi 작용제 듀플렉스를 하기에 따라 합성하였다:
A. 합성. MUC5AC RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥을 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. 규모에 따라, 머메이드(MerMade)96E® (바이오오토메이션(Bioautomation)), 머메이드12® (바이오오토메이션), 또는 OP 파일럿(OP Pilot) 100 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하였다. 제어된 세공 유리 (CPG, 500Å 또는 600Å, 미국 펜실베니아주 아스톤 소재의 프라임 신테시스(Prime Synthesis)로부터 수득됨)로 제조된 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) (미국 위스콘신주 밀워키)으로부터 구입하였다. 구체적으로, 사용된 2'-O-메틸 포스포르아미다이트는 다음을 포함하였다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유하였다. 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-이노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 글렌 리서치(Glen Research) (버지니아)로부터 구입하였다. 역전된 무염기성 (3'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시리보스-5'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 켐진스(ChemGenes) (미국 매사추세츠주 윌밍톤)로부터 구입하였다. 다음 UNA 포스포르아미다이트를 사용하였다: 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-2',3'-세코-아데노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-아세틸-2',3'-세코-시토신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-이소부티릴-2',3'-세코-구아노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 및 5'-(4,4'-디메톡시-트리틸)-2',3'-세코-우리딘, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트 또한 상업적으로 구입하였다 (써모피셔). 링커 L6을 프로파르길-PEG5-NHS로서 브로드팜(BroadPharm) (카탈로그 # BP-20907)으로부터 구입하고, 표준 커플링 조건을 사용하여 아미노연결 포스포르아미다이트로부터의 NH2-C6 기에 커플링시켜 -L6-C6-을 형성하였다. 링커 Alk-cyHex를 프로파르길-함유 화합물 포스포르아미다이트 화합물로서 루미프로브(Lumiprobe) (알킨 포스포르아미다이트, 5'-말단)로부터 유사하게 상업적으로 구입하여 링커 -Alk-cyHex-를 형성하였다. 각 경우에, 포스포로티오에이트 연결을 본원에 제시된 조건을 사용하여 명시된 바와 같이 도입하였다. 시클로프로필 포스포네이트 포스포르아미다이트를 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/214112에 따라 합성하였다 (또한 문헌 [Altenhofer et al., Chem. Communications (Royal Soc. Chem.), 57(55):6808-6811 (2021)] 참조).
트리-알킨-함유 포스포르아미다이트를 무수 디클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시킨 한편, 모든 다른 아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me) 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 미국 매사추세츠주 레오민스터 소재의 폴리오르그, 인크.로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하였다.
대안적으로, 트리-알킨 모이어티를 합성 후에 도입하였다 (하기 섹션 E 참조). 이러한 경로를 위해, 센스 가닥을 1급 아민을 함유하는 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드로 관능화시켰다. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me) 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 미국 매사추세츠주 레오민스터 소재의 폴리오르그, 인크.로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하였다.
B. 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호. 고체 상 합성의 종료 후에, 건조된 고체 지지체를 물 중 40 wt. % 메틸아민의 1:1 부피 용액 및 28% 내지 31% 수산화암모늄 용액 (알드리치)으로 1.5시간 동안 30℃에서 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에 재구성하였다 (하기 참조).
C. 정제. 조 올리고머를 TSK겔 슈퍼Q-5PW 13 μm 칼럼 및 시마즈 LC-8 시스템을 사용하여 음이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 20 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH 9.0이었고, 20% 아세토니트릴을 함유하였고, 완충제 B는 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 완충제 A와 동일하였다. 260 nm에서의 UV 트레이스를 기록하였다. 적절한 분획을 합한 다음, 크기 배제 HPLC 상에서 100 mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴 또는 여과수의 구동 완충제를 갖는 미세 세파덱스 G-25로 패킹된 지이 헬스케어 XK 16/40 칼럼을 사용하여 구동시켰다. 대안적으로, 합한 분획을 탈염시키고, 접선 흐름 여과를 통해 적절한 완충제 또는 용매계로 교환하였다.
D. 어닐링. 상보적 가닥을 1x PBS (포스페이트-완충 염수, 1x, 코닝, 셀그로) 중 등몰 RNA 용액 (센스 및 안티센스)을 조합함으로써 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 저장하였다. 1x PBS 중에서 UV-Vis 분광계 상에서 용액 흡광도를 측정함으로써 듀플렉스 농도를 결정하였다. 이어서, 260 nm에서의 용액 흡광도에 전환 인자 (0.050 mg/(mL·cm)) 및 희석 배율을 곱하여 듀플렉스 농도를 결정하였다.
E. 트리-알킨 링커의 접합. 일부 실시양태에서, 트리-알킨 링커는 포스포르아미다이트로서 수지 상의 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합된다 (예시적인 트리-알킨 링커 포스포르아미다이트의 합성에 대해서는 실시예 1G 및 포스포르아미다이트의 접합에 대해서는 실시예 1A 참조). 다른 실시양태에서, 트리-알킨 링커는 다음과 같이 기재된 수지로부터의 절단 후에 센스 가닥에 접합될 수 있다: 어닐링 전 또는 후에, 일부 실시양태에서, 5' 또는 3' 아민 관능화된 센스 가닥이 트리-알킨 링커에 접합된다. 본원에 개시된 구축물을 형성하는 데 사용될 수 있는 트리-알킨 링커 구조의 예는 다음과 같다:
Figure pct00092
. 트리-알킨 링커를 어닐링된 듀플렉스에 접합시키기 위해, 아민-관능화된 듀플렉스를 90% DMSO/10% H2O 중에 ~50-70 mg/mL로 용해시켰다. 40 당량의 트리에틸아민을 첨가한 후, 3 당량의 트리-알킨-PNP를 첨가하였다. 완결되면, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매계에서 2회 침전시키고, 건조시켰다.
F. 표적화 리간드 SM6.1의 합성
((S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(4-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)부탄아미도)아세트아미도)프로판산)
Figure pct00093
화합물 5 (tert-부틸(4-메틸피리딘-2-일)카르바메이트) (0.501 g, 2.406 mmol, 1 당량)를 DMF (17 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물에 NaH (0.116 mg, 3.01 mmol, 1.25 당량, 오일 중 60% 분산액)를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 화합물 20 (에틸 4-브로모부티레이트 (0.745 g, 3.82 mmol, 0.547 mL)) (시그마 167118)을 첨가하였다. 3시간 후, 반응물을 에탄올 (18 mL)로 켄칭하고, 농축시켰다. 농축물을 DCM (50 mL) 중에 용해시키고, 포화 수성 NaCl 용액 (1 x 50 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 칼럼 상에서 DCM 중 0-5% 메탄올 구배로 정제하였다.
Figure pct00094
화합물 21을 아세톤:0.1 M NaOH [1:1] 100 mL 중에 용해시켰다 (0.80 g, 2.378 mmol). 반응을 TLC (헥산 중 5% 에틸 아세테이트)에 의해 모니터링하였다. 유기부를 농축시키고, 잔류물을 0.3 M 시트르산 (40 mL)을 사용하여 pH 3-4로 산성화시켰다. 생성물을 DCM (3 x 75 mL)으로 추출하였다. 유기부를 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00095
무수 DMF (10 mL) 중 화합물 22 (1.1 g, 3.95 mmol, 1 당량), 화합물 45 (595 mg, 4.74 mmol, 1.2 당량), 및 TBTU (1.52 g, 4.74 mmol, 1.2 당량)의 용액에 0℃에서 디이소프로필에틸아민 (2.06 mL, 11.85 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 켄칭하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬(CombiFlash)®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 분리하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 366.20, 실측치 367.
Figure pct00096
무수 DMF (10 mL) 중 화합물 61 (2 g, 8.96 mmol, 1 당량), 및 화합물 62 (2.13 mL, 17.93 mmol, 2 당량)의 용액에 0℃에서 K2CO3 (2.48 g, 17.93 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 물 (10 mL)로 켄칭하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 분리하였다.
Figure pct00097
THF (5 mL) 및 H2O (5 mL) 중 화합물 60 (1.77 g, 4.84 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 수산화리튬 1수화물 (0.61 g, 14.53 mmol, 3 당량)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 HCl (6 N)에 의해 pH 3.0으로 산성화시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 20 mL)로 추출하고, 유기 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 352.18, 실측치 352.
Figure pct00098
무수 THF (20 mL) 중 화합물 63 (1.88 g, 6.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 헥산 중 n-BuLi (3.6 mL, 9.0 mmol, 1.5 당량)를 -78℃에서 적가하였다. 반응물을 -78℃에서 추가로 1시간 동안 유지하였다. 이어서, 트리이소프로필보레이트 (2.08 mL, 9.0 mmol, 1.5 당량)를 -78℃에서 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 가온하고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액 (20 mL)에 의해 켄칭하고, pH를 3으로 조정하였다. 수성 상을 EtOAc (3 x 20 mL)로 추출하고, 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다.
Figure pct00099
화합물 12 (300 mg, 0.837 mmol, 1.0 당량), 화합물 65 (349 mg, 1.256 mmol, 1.5 당량), XPhos Pd G2 (13 mg, 0.0167 mmol, 0.02 당량), 및 K3PO4 (355 mg, 1.675 mmol, 2.0 당량)를 둥근 바닥 플라스크에서 혼합하였다. 플라스크를 스크류 마개 격막으로 밀봉한 다음, 배기시키고, 질소로 재충전하였다 (이 과정을 총 3회 반복함). 이어서, THF (8 mL) 및 물 (2 mL)을 시린지를 통해 첨가하였다. 혼합물을 질소로 20분 동안 버블링하고, 반응물을 실온에서 밤새 유지하였다. 반응물을 물 (10 mL)로 켄칭하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 15% EtOAc로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 512.24, 실측치 512.56.
Figure pct00100
화합물 66 (858 mg, 1.677 mmol, 1.0 당량)을 빙조에 의해 냉각시켰다. 디옥산 중 HCl (8.4 mL, 33.54 mmol, 20 당량)을 플라스크에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하고, 생성물을 직접 추가 정제 없이 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 412.18, 실측치 412.46.
Figure pct00101
무수 DMF (15 mL) 중 화합물 64 (500 mg, 1.423 mmol, 1 당량), 화합물 67 (669 mg, 1.494 mmol, 1.05 당량), 및 TBTU (548 mg, 0.492 mmol, 1.2 당량)의 용액에 0℃에서 디이소프로필에틸아민 (0.744 mL, 4.268 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (10 mL)으로 켄칭하고, 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 20 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 3-4% 메탄올로 용리시켰다. 수율은 96.23%였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 745.35, 실측치 746.08.
Figure pct00102
에틸 아세테이트 (10 mL) 중 화합물 68 (1.02 g, 1.369 mmol, 1 당량)의 용액에 10% Pd/C (0.15 g, 50% H2O)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 반응을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 실온에서 밤새 유지하였다. 고체를 셀라이트®를 통해 여과하고, 용매를 회전 증발기에 의해 제거하였다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: [M+H]+ 655.31, 실측치 655.87.
Figure pct00103
무수 DMF (2 mL) 중 화합물 69 (100 mg, 0.152 mmol, 1 당량) 및 아지도-PEG5-OTs (128 mg, 0.305 mmol, 2 당량)의 용액에 0℃에서 K2CO3 (42 mg, 0.305 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액에 의해 켄칭하고, 수성 층을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 900.40, 실측치 901.46.
Figure pct00104
THF (2 mL) 및 물 (2 mL) 중 화합물 72 (59 mg, 0.0656 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (5 mg, 0.197 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. pH를 HCl (6 N)에 의해 3.0으로 조정하고, 수성 상을 EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. TFA (0.5 mL) 및 DCM (0.5 mL)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 3시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 786.37, 실측치 786.95.
G. TriAlk 14의 합성
상기 표 12에 나타낸 바와 같은 TriAlk14 및 (TriAlk14)s는 하기 나타낸 합성 경로를 사용하여 합성될 수 있다. 화합물 14는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 포스포르아미다이트로서 센스 가닥에 첨가될 수 있거나, 또는 화합물 22는 아미드 커플링 반응에서 아민을 포함하는 센스 가닥에 접합될 수 있다.
Figure pct00105
3-L 재킷 반응기에 500 mL DCM 및 4 (75.0 g, 0.16 mol)를 첨가하였다. 반응물의 내부 온도를 0℃로 냉각시키고, TBTU (170.0 g, 0.53 mol)를 첨가하였다. 이어서, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 현탁액을 아민 5 (75.5 g, 0.53 mol)로 적가 처리하였다. 이어서, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 반응물을 DIPEA (72.3 g, 0.56 mol)로 천천히 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 반응물을 23℃로 1시간에 걸쳐 가온하고, 3시간 동안 교반되도록 하였다. 모든 3종의 시약의 10% 키커 충전물을 첨가하고, 추가로 3시간 동안 교반되도록 하였다. 4의 <1%가 남아있을 때 반응이 완결된 것으로 간주하였다. 반응 혼합물을 포화 염화암모늄 용액 (2 x 500 mL)으로 세척하고, 포화 중탄산나트륨 용액 (500 mL)으로 1회 세척하였다. 이어서, 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일의 질량은 188 g이었고, 이는 QNMR에 의하면 72% 6을 함유하였다. 조 오일을 후속 단계에 사용하였다. C46H60N4O11에 대한 계산된 질량 = 845.0 m/z. 실측치 [M+H]= 846.0.
Figure pct00106
72 wt% 화합물 6 (86.0 g, 0.10 mol)을 함유하는 조 오일 121.2 g을 DMF (344 mL) 중에 용해시키고, 내부 온도를 23℃ 미만으로 유지하면서 TEA (86 mL, 20 v/v%)로 처리하였다. Fmoc-아민 6의 소모에 대한 디벤조풀벤 (DBF)의 형성을 HPLC 방법 1을 통해 모니터링하였고 (도 2), 반응은 10시간 내에 완료되었다. 용액에 글루타르산 무수물 (12.8 g, 0.11 mol)을 첨가하고, 중간체 아민 7을 2시간 내에 화합물 8로 전환시켰다. 완결된 후, DMF 및 TEA를 30℃에서 감압 하에 제거하여 조 오일 100 g을 수득하였다. 물 중 화합물 7의 높은 용해도로 인해, 수성 후처리를 사용할 수 없었고, 크로마토그래피가 DBF, TMU 및 글루타르산 무수물을 제거하는 유일한 방법이다. 조 오일 (75 g)을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬(Teledyne ISCO Combi-flash)® 정제 시스템 상에서 3 부분으로 정제하였다. 조 오일 (25 g)을 330 g 실리카 칼럼 상에 로딩하고, 0 - 20% 메탄올/DCM으로부터 30분에 걸쳐 용리시켜 화합물 8 42 g (3 단계에 걸쳐 54% 수율)을 수득하였다. C36H55N4O12에 대한 계산된 질량 = 736.4 m/z. 실측치 [M+H]= 737.0.
Figure pct00107
화합물 8 (42.0 g, 0.057 mol)을 사용 전에 10 부피의 아세토니트릴로 공동-스트리핑하여 크로마토그래피 용매로부터 임의의 잔류 메탄올을 제거하였다. 오일을 DMF (210 mL) 중에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 용액을 4-니트로페놀 (8.7 g, 0.063 moL), 및 이어서 EDC-히드로클로라이드 (12.0 g, 0.063 mol)로 처리하고, 10시간 내에 완결에 도달하는 것으로 밝혀졌다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 내부 온도를 15℃ 미만으로 유지하면서 10 부피 에틸 아세테이트, 및 이어서 10 부피 포화 염화암모늄 용액을 첨가하였다. 층을 분리되도록 하고, 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하였다. 합한 수성 층을 5 부피의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일 (55 g)을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬® 정제 시스템 상에서 3 부분으로 정제하였다. 조 오일 (25 g)을 330 g 실리카 칼럼 상에 로딩하고, 0 - 10% 메탄올/DCM으로부터 30분에 걸쳐 용리시켜 순수한 9 (화합물 22) 22 g (50% 수율)을 수득하였다. C42H59N5O14에 대한 계산된 질량 = 857.4 m/z. 실측치 [M+H]= 858.0.
Figure pct00108
디클로로메탄 (3 부피) 중 에스테르 9 (49.0 g, 57.1 mmol) 및 6-아미노-1-헥산올 (7.36 g, 6.28 mmol)의 용액을 트리에틸아민 (11.56 g, 111.4 mmol)으로 적가 처리하였다. HPLC 방법 1 상에서 화합물 9의 소멸을 관찰함으로써 반응을 모니터링하였고, 이는 10분 내에 완결된 것으로 밝혀졌다. 조 반응 혼합물을 5 부피 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 염화암모늄 (5 부피) 및 염수 (5 부피)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켰다. 조 오일을 텔레다인 이스코 콤비-플래쉬® 정제 시스템 상에서 330 g 실리카 칼럼을 사용하여 정제하였다. 4-니트로페놀을 100% 에틸 아세테이트로 용리시키고, 10을 20% 메탄올/DCM을 사용하여 칼럼으로부터 플러싱하여 무색 오일 (39 g, 81% 수율)을 수득하였다. C42H69N5O12에 대한 계산된 질량 = 836.0 m/z. 실측치 [M+H]= 837.0.
Figure pct00109
알콜 10을 10 부피의 아세토니트릴로 2회 공동-스트리핑하여 크로마토그래피 용매로부터 임의의 잔류 메탄올을 제거하고, 건조 디클로로메탄 (KF < 60 ppm)으로 1회 더 공동-스트리핑하여 미량의 물을 제거하였다. 알콜 10 (2.30 g, 2.8 mmol)을 5 부피 건조 디클로로메탄 (KF < 50 ppm) 중에 용해시키고, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (188 mg, 1.1 mmol)로 처리하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포르아미다이트 (1.00 g, 3.3 mmol)로 적가 처리하였다. 용액을 빙조로부터 제거하고, 20℃에서 교반하였다. 반응은 3 - 6시간 내에 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 포화 중탄산암모늄/염수의 1:1 용액 10 부피로 처리한 다음, 1분에 걸쳐 주위 온도로 가온하고, 20℃에서 추가로 3분 동안 교반되도록 하였다. 2상 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄 10 부피를 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, 포화 중탄산나트륨 용액 10 부피로 세척하여 미반응 비스-인 시약을 가수분해하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 오일로 농축시켜 94 wt% 화합물 14 3.08 g을 수득하였다. C51H86N7O13P에 대한 계산된 질량 = 1035.6 m/z. 실측치 [M+H]= 1036.
H. 표적화 리간드의 접합. 어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 세자리 알킨 관능화 센스 가닥이 표적화 리간드에 접합된다. 하기 실시예는 어닐링된 듀플렉스에 대한 표적화 리간드의 접합을 기재한다: 0.5 M 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 0.5 M의 Cu(II) 술페이트 5수화물 (Cu(II)SO4·5H2O) 및 아스코르브산나트륨의 2 M 용액의 원액을 탈이온수 중에서 제조하였다. 표적화 리간드의 DMSO 중 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 트리-알킨 관능화 듀플렉스 (3 mg, 75 μL, 탈이온수 중 40 mg/mL, ~15,000 g/mol)를 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브에 25 μL의 1 M Hepes pH 8.5 완충제를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, DMSO 35 μL를 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. 표적화 리간드를 반응물에 첨가하고 (6 당량/듀플렉스, 2 당량/알킨, ~15 μL), 용액을 볼텍싱하였다. pH 시험지를 사용하여, pH를 체크하고 pH ~8임을 확인하였다. 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에서, 0.5 M THPTA 50 μL를 0.5 M Cu(II)SO4·5H2O 10 uL와 혼합하고, 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후, THPTA/Cu 용액 (7.2 μL, 6 당량 5:1 THPTA:Cu)을 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 그 직후, 2 M 아스코르베이트 (5 μL, 듀플렉스당 50 당량, 알킨당 16.7)를 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 반응물을 비-변성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다.
실시예 2. MUC5AC RNAi 작용제의 시험관내 시험.
상기 표 8C에 나타낸 특정 화학적으로 변형된 후보 서열 듀플렉스 (표 3에 제시된 안티센스 가닥 서열 및 표 6에서 발견되는 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 말단 캡 부분을 가짐)를 시험관내에서 시험하였다. MUC5AC RNAi 작용제를 실시예 1에 제시된 절차에 따라 제조하였다.
시험관내 MUC5AC RNAi 작용제의 평가를 인간 폐 상피 세포주인 A549 세포의 형질감염에 의해 수행하였다. 세포를 96-웰 포맷으로 웰당 ~7,500개 세포로 플레이팅하고, 표 12에 나타낸 각각의 RNAi 작용제 듀플렉스를 리포펙타민 RNAiMax (써모 피셔) 형질감염 시약을 사용하여 3가지 농도 (10 nM, 1 nM 및 0.1 nM)로 형질감염시켰다. 각각의 MUC5AC RNAi 작용제의 상대 발현을 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 내인성 대조군과 비교함으로써 qRT-PCR에 의해 결정하고, 표 12에 나타낸 바와 같이 비처리된 A549 세포에 대해 정규화하였다 (ΔΔCT 분석).
하기 표 12는 검사될 서열에 대한 AD 듀플렉스 번호, 뿐만 아니라 그 특정한 RNAi 작용제에 의해 표적화되는 유전자 위치를 괄호 안에 열거한다. 따라서, 예를 들어 듀플렉스 ID AD08101의 경우, 0.377의 1 nM에서의 평균 상대 발현은 비처리된 웰 (모의 대조군)에 대해 정규화된 62.3%의 MUC5AC 유전자 녹다운을 나타내고, 0.1 nM에서의 평균 상대 발현은 53.0% (0.470)의 억제를 나타낸다.
표 13. MUC5AC RNAi 작용제의 시험관내 시험.
Figure pct00110
Figure pct00111
실시예 3. MUC5AC RNAi 작용제의 시험관내 시험.
상기 표 8C에 나타낸 특정 화학적으로 변형된 후보 서열 듀플렉스 (표 3에 제시된 안티센스 가닥 서열 및 표 6에서 발견되는 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 말단 캡 부분을 가짐)를 시험관내에서 시험하였다. MUC5AC RNAi 작용제를 실시예 1에 제시된 절차에 따라 제조하였다.
시험관내 MUC5AC RNAi 작용제의 평가를 인간 폐 상피 세포주인 A549 세포의 형질감염에 의해 수행하였다. 세포를 96-웰 포맷으로 웰당 ~7,500개 세포로 플레이팅하고, 표 12에 나타낸 각각의 RNAi 작용제 듀플렉스를 리포펙타민 RNAiMax (써모 피셔) 형질감염 시약을 사용하여 3가지 농도 (10 nM, 1 nM 및 0.1 nM)로 형질감염시켰다. 각각의 MUC5AC RNAi 작용제의 상대 발현을 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 내인성 대조군과 비교함으로써 qRT-PCR에 의해 결정하고, 표 12에 나타낸 바와 같이 비처리된 A549 세포에 대해 정규화하였다 (ΔΔCT 분석).
하기 표 12는 검사될 서열에 대한 AD 듀플렉스 번호, 뿐만 아니라 그 특정한 RNAi 작용제에 의해 표적화되는 유전자 위치를 괄호 안에 열거한다. 따라서, 예를 들어 듀플렉스 ID AD08101의 경우, 0.377의 1 nM에서의 평균 상대 발현은 비처리된 웰 (모의 대조군)에 대해 정규화된 62.3%의 MUC5AC 유전자 녹다운을 나타내고, 0.1 nM에서의 평균 상대 발현은 53.0% (0.470)의 억제를 나타낸다.
표 14. MUC5AC RNAi 작용제의 시험관내 시험.
Figure pct00112
Figure pct00113
실시예 4. 집 먼지 응애 (HDM) 유발 알레르기성 천식 모델.
특정 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 특성을 연구하기 위해, 집 먼지 응애 (HDM) 유발 알레르기성 천식 마우스 모델을 사용하였다. 마우스 Muc5ac 발현을 유도하기 위해, 암컷 Balb/c 마우스 (6-8주령)에게 연속 5일 동안 피펫을 사용하여 비강내로 등장성 염수 25 μL 중 상업적으로 획득한 50 μg 집 먼지 응애 단백질을 투여하였다. 제5회 1일 용량 72시간 후, 마우스를 안락사시키고, mRNA 발현 분석을 위해 전체 폐를 수거하였다. 챌린지되지 않은 나이브 마우스와 비교하여, HDM 챌린지 마우스에서의 마우스 Muc5ac mRNA의 상대 발현이 대략 100배 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 5. HDM 모델에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 기관내 투여.
상기 실시예 4에 기재된 HDM 유발 알레르기성 천식 마우스 모델을 사용하였다. 하기 표 15는 투여 군을 제시한다:
표 15. 실시예 5에 대한 MUC5AC RNAi 작용제 및 투여.
Figure pct00114
상기 표 15에 나타낸 바와 같이, 군 1의 마우스는 전반적으로 치료를 받지 않았다. 군 3, 5, 6, 7 및 8의 마우스에 대해, 연구 제1일, 제3일, 제5일, 및 제8일에 암컷 Balb/c 마우스에게 표 15에 나타낸 바와 같이 기관내 (IT) 투여에 적합한 미세분무기 장치 (펜 센추리, 펜실베니아주 필라델피아)를 통해 50 마이크로리터의 등장성 염수 또는 등장성 염수 중에 제제화된 5.0 mg/kg의 각각의 MUC5AC RNAi 작용제의 단일 용량을 투여하였다.
표 15에 나타낸 바와 같이, 각각의 MUC5AC RNAi 작용제 (군 6, 7 및 8)를 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1, 도 1 참조)에 접합시켰다.
MUC5AC RNAi 작용제 AD07720 및 AD07719에 대한 화학적으로 변형된 서열 (군 7 및 8)이 표 7B (듀플렉스를 나타냄), 표 3 (각각의 안티센스 가닥을 나타냄), 및 표 5 (링커를 갖지만 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1)는 갖지 않는 각각의 센스 가닥을 나타냄)에 나타나 있다.
AD07022는 인간 MUC5AC 유전자와 상동성을 갖지 않는 마우스-특이적 서열을 갖고, 하기와 같이 화학적으로 변형되었다:
Tri-SM6.1-αvβ6-AD07022
변형된 센스 가닥 (5' → 3'):
Tri-SM6.1-αvβ6-(TA14)cscauacagCfAfGfuacaguuacas(invAb) (서열식별번호: 1714)
변형된 안티센스 가닥 (5' → 3'):
cPrpusGfsusAfaCfuGfuAfcUfgCfuGfuAfuGfsg (서열식별번호: 1713)
제8일 내지 제12일 각각에, 군 2 내지 8의 마우스에게 피펫을 사용하여 등장성 염수 25 마이크로리터 (군 2 및 3) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 집 먼지 응애 50 마이크로그램 (표 15에서 HDM으로 지칭됨)을 갖는 단일 용량을 비강내로 (IN) 투여하였다.
마우스를 연구 제15일에 희생시키고, 수집 및 균질화 후에 양쪽 폐로부터 총 RNA를 단리하였다. 마우스 Muc5ac mRNA 발현을 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 마우스 베타-액틴 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/- 95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 16. 실시예 5에서의 희생 시 (제15일) 평균 상대 마우스 MUC5AC mRNA
Figure pct00115
데이터를 비-치료군 (군 1)에 대해 정규화하였다. 상기 표 16의 데이터에 나타낸 바와 같이, HDM 마우스 모델은 HDM에의 노출 후에 MUC5AC 발현의 증가를 촉진하는 것과 관련하여 예상된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 각각 MUC5AC 유전자의 위치 1921을 표적화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 인간 및 마우스 유전자 전사체 둘 다에 대한 상동성을 갖는 군 7 및 8이 RNAi 작용제가 없는 군 4 및 5의 HDM 모델 마우스와 비교하여 MUC5AC 단백질의 매우 최소의 감소만을 제공하였음을 나타내며, 이는 이들 특이적 RNAi 작용제에 대해 단지 최소량의 억제를 나타낸다. 대안적으로, AD07022의 마우스-특이적 RNAi 작용제 (군 6)는 HDM이 MUC5AC RNAi 작용제 없이 투여된 군과 비교하여 Muc5ac 마우스 mRNA 수준의 실질적인 감소를 나타냈다 (단지 13.444).
실시예 6. HDM 모델에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 기관내 투여.
상기 실시예 4에 기재된 HDM 유발 알레르기성 천식 마우스 모델을 사용하였다. 하기 표 17은 투여 군을 제시한다:
표 17. 실시예 6에 대한 MUC5AC RNAi 작용제 및 투여.
Figure pct00116
군 1-10의 마우스에 대해, 연구 제1일, 제3일, 제5일, 및 제8일에 암컷 Balb/c 마우스에게 표 17에 나타낸 바와 같이 기관내 (IT) 투여에 적합한 미세분무기 장치 (펜 센추리, 펜실베니아주 필라델피아)를 통해 50 마이크로리터의 등장성 염수 또는 등장성 염수 중에 제제화된 5.0 mg/kg의 각각의 MUC5AC RNAi 작용제의 단일 용량을 투여하였다. 군 11의 마우스의 경우, MUC5AC RNAi 작용제를 제1일 및 제8일에만 투여하였다.
표 17에 나타낸 바와 같이, 각각의 MUC5AC RNAi 작용제 (군 3-11)를 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1, 도 1 참조)에 접합시켰다. MUC5AC RNAi 작용제 AD08083, AD08084, AD08085, AD08086, AD08087, AD08088 및 AD08089에 대한 화학적으로 변형된 서열 (군 4 내지 10)이 표 7B (듀플렉스를 나타냄), 표 3 (각각의 안티센스 가닥을 나타냄) 및 표 5 (링커를 갖지만 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1)는 갖지 않는 각각의 센스 가닥을 나타냄)에 나타나 있다.
AD07022는 인간 MUC5AC 유전자와 상동성을 갖지 않는 마우스-특이적 서열을 갖고, 상기 실시예 5에 나타낸 바와 같이 화학적으로 변형되었다.
제8일 내지 제12일 각각에, 마우스에게 피펫을 사용하여 등장성 염수 (군 2) 25 마이크로리터 또는 등장성 염수 중에 제제화된 집 먼지 응애 50 마이크로그램 (표 17에서 HDM으로 지칭됨)을 갖는 단일 용량을 비강내로 (IN) 투여하였다.
마우스를 연구 제15일에 희생시키고, 수집 및 균질화 후에 양쪽 폐로부터 총 RNA를 단리하였다. 마우스 Muc5ac mRNA 발현을 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 마우스 베타-액틴 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/- 95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 18. 실시예 6에서의 희생 시 (제15일) 평균 상대 마우스 MUC5AC mRNA
Figure pct00117
데이터를 IT 및 IN 염수-단독 투여 군 (군 1)에 대해 정규화하였다. 상기 표 18의 데이터에 나타낸 바와 같이, HDM 마우스 모델은 HDM에의 노출 후에 MUC5AC 발현의 증가를 촉진하는 것과 관련하여 예상된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 둘 다 MUC5AC 유전자의 위치 9729를 표적화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 인간 및 마우스 유전자 전사체 둘 다에 대한 상동성을 갖는 군 7 및 8이 RNAi 작용제가 없는 군 2의 HDM 모델 마우스와 비교하여 MUC5AC 단백질의 중간 감소만을 제공하였음을 나타내며, 이는 이들 특이적 RNAi 작용제에 대해 단지 중간량의 억제를 나타낸다. 대안적으로, 시험된 나머지 MUC5AC RNAi 작용제 (군 4-6에서 유전자 위치 5029 및 군 9 및 10에서 유전자 위치 15052를 표적화함)는 각각 AD07022의 마우스-특이적 MUC5AC RNAi 작용제 (군 6)와 같이 군 2와 비교하여 실질적인 억제를 나타냈다.
실시예 7. 래트에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 기관내 투여.
상기 실시예 4에 기재된 HDM 유발 알레르기성 천식 마우스 모델을 사용하였다. 하기 표 19는 연구에 포함된 특정 투여 군을 제시한다:
표 19. 실시예 7에 대한 MUC5AC RNAi 작용제 및 투여.
Figure pct00118
군 1-5의 마우스에 대해, 연구 제1일, 제3일, 제5일, 및 제8일에 암컷 Balb/c 마우스에게 표 19에 나타낸 바와 같이 등장성 염수의 기관내 (IT) 투여에 적합한 미세분무기 장치 (펜 센추리, 펜실베니아주 필라델피아)를 통해 50 마이크로리터의 단일 용량 또는 등장성 염수 중에 제제화된 5.0 mg/kg의 각각의 MUC5AC RNAi 작용제를 투여하였다.
표 19에 나타낸 바와 같이, 각각의 MUC5AC RNAi 작용제 (군 3-5)를 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1, 도 1 참조)에 접합시켰다. MUC5AC RNAi 작용제 AD08173 및 AD08174 (군 4 및 5)에 대한 화학적으로 변형된 서열이 표 7B (듀플렉스를 나타냄), 표 3 (각각의 안티센스 가닥을 나타냄), 및 표 5 (링커를 갖지만 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (Tri-SM6.1)를 갖지 않는 각각의 센스 가닥을 제시함)에 나타나 있다. 위치 3535를 표적화하는 서열을 갖는 각각의 MUC5AC RNAi 작용제는 마우스 유전자로부터 중요한 위치인 것으로 이해되는 위치에서 미스매치를 가지며, 따라서 MUC5AC RNAi 작용제는 미스매치를 고려하여 억제 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 것으로 예상된다.
AD07022는 인간 MUC5AC 유전자와 상동성을 갖지 않는 마우스-특이적 서열을 갖고, 상기 실시예 5에 나타낸 바와 같이 화학적으로 변형되었다.
제8일 내지 제12일 각각에, 마우스에게 피펫을 사용하여 등장성 염수 (군 1 단독) 25 마이크로리터 또는 등장성 염수 중에 제제화된 집 먼지 응애 50 마이크로그램 (표 19에서 HDM으로 지칭됨)을 갖는 단일 용량을 비강내로 (IN) 투여하였다.
마우스를 연구 제15일에 희생시키고, 수집 및 균질화 후에 양쪽 폐로부터 총 RNA를 단리하였다. 마우스 Muc5ac mRNA 발현을 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 마우스 베타-액틴 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/- 95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 20. 실시예 7에서의 희생 시 (제15일) 평균 상대 마우스 MUC5AC mRNA
Figure pct00119
데이터를 IT 및 IN 염수-단독 투여 군 (군 1)에 대해 정규화하였다. 상기 나타낸 바와 같이, 군 4 및 5에서의 MUC5AC RNAi 작용제 (인간 유전자의 위치 3535를 표적화함)에 대한 마우스 유전자에 대한 미스매치의 성질을 고려하면, 최소 억제가 예상된다. 상기 표 20의 데이터에 나타낸 바와 같이, HDM 마우스 모델은 군 1 및 2에 나타낸 바와 같이 HDM에 대한 노출 후에 MUC5AC 발현의 증가를 촉진하는 것과 관련하여 예상된 바와 같이 수행하였다. 예상외로, 위치 3535를 표적화하는 MUC5AC RNAi 작용제는 마우스 유전자에 대한 미스매치에도 불구하고 여전히 중간 수준의 억제를 나타냈으며, 이는 이 위치를 표적화하는 MUC5AC RNAi 작용제가 인간 치료 후보로서 생존가능할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. HDM 모델에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 기관내 투여.
상기 실시예 4에 기재된 HDM 유발 알레르기성 천식 마우스 모델을 사용하였다. 하기 표 17은 투여 군을 제시한다:
표 21. 실시예 8에 대한 MUC5AC RNAi 작용제 및 투여.
Figure pct00120
암컷 Balb/c 마우스에게 상기 표 21에 제시된 날짜 및 농도로 기관내 (IT) 투여에 적합한 미세분무기 장치 (펜 센추리, 펜실베니아주 필라델피아)를 통해 50 마이크로리터의 등장성 염수 또는 등장성 염수 중에 제제화된 MUC5AC RNAi 작용제의 단일 용량을 투여하였다.
표 21에 나타낸 바와 같이, 각각의 MUC5AC RNAi 작용제 (군 3-11)를 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (도 1 참조)에 접합시켰다. MUC5AC RNAi 작용제 AD08089에 대한 화학적으로 변형된 서열이 표 7B (듀플렉스를 나타냄), 표 3 (각각의 안티센스 가닥을 나타냄), 및 표 5 (링커를 갖지만 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드는 없는 각각의 센스 가닥을 나타냄)에 나타나 있다.
AD07022는 인간 MUC5AC 유전자와 상동성을 갖지 않는 마우스-특이적 서열을 갖고, 상기 실시예 5에 나타낸 바와 같이 화학적으로 변형되었다.
제7일 내지 제11일 각각에, 마우스에게 피펫을 사용하여 등장성 염수 (군 1) 25 마이크로리터 또는 등장성 염수 중에 제제화된 집 먼지 응애 50 마이크로그램 (표 21에서 HDM으로 지칭됨)을 갖는 단일 용량을 비강내로 (IN) 투여하였다.
마우스를 연구 제14일에 희생시키고, 수집 및 균질화 후에 양쪽 폐로부터 총 RNA를 단리하였다. 마우스 Muc5ac mRNA 발현을 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 마우스 베타-액틴 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/- 95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 22. 실시예 8에서의 희생 시 (제14일) 평균 상대 마우스 MUC5AC mRNA
Figure pct00121
데이터를 IT 및 IN 염수-단독 투여 군 (군 1)에 대해 정규화하였다. 상기 표 22의 데이터에 나타낸 바와 같이, HDM 마우스 모델은 HDM에의 노출 후에 MUC5AC 발현의 증가를 촉진하는 것과 관련하여 예상된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 MUC5AC 유전자의 위치 15052를 표적화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고 인간 및 마우스 유전자 전사체 둘 다에 대한 상동성을 갖는 AD08089가 MUC5AC의 실질적인 억제를 제공하였고, 일반적으로 AD07022의 고활성 마우스-특이적 MUC5AC RNAi 작용제와 대등하였음을 나타낸다.
실시예 9. 시노몰구스 원숭이에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 생체내 흡입 에어로졸화 투여.
연구 제1일에, 수컷 시노몰구스 원숭이에게 제1일, 제8일 및 제15일 각각에 1 mg/kg 폐 침착 용량 (PDD)의 MUC5AC RNAi 작용제 AC001305 또는 AC001306을 단일 용량으로 투여하였다. 진동 메쉬 네뷸라이저 (에어로넵 솔로(Aeroneb Solo))를 사용하여, 에어로졸을 기관내 삽관된 구속된 마취된 원숭이에게 전달하였다. 삽관된 동물을 호흡기 분당 부피를 제어하는 데 사용되는 인공호흡기에 연결하였다. 시험 물품 에어로졸을 노출 시스템과 인-라인 연결된 에어로넵 솔로 메쉬 네뷸라이저를 통해 생성하였다. 필터를 기관내 관의 말단에 위치시키고 노출 과정 동안 에어로졸을 수집함으로써 시스템의 효율을 결정한 에어로졸 시험으로부터 노출 시간을 결정하였다. MUC5AC RNAi 작용제를 등장성 염수 중에 제제화된 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 세자리 소분자 αvβ6 상피 세포 표적화 리간드 (도 1 참조)에 접합시켰다. MUC5AC RNAi 작용제 AC001305 및 AC001306에 대한 화학적으로 변형된 서열을 표 11에 나타낸다. AC001305의 안티센스 가닥 서열은 또한 표 3에서 AM12165로 나타내어지고, AC001306의 안티센스 가닥 서열은 또한 표 3에서 AM12166으로 나타내어지며, 둘 다는 MUC5AC 유전자의 위치 4993을 표적화한다.
투여 군은 하기 표 23에 기재된 바와 같았다:
표 23. 실시예 9에 대한 MUC5AC RNAi 작용제 및 투여
Figure pct00122
군당 2마리의 원숭이에게 투여하였다. 원숭이를 연구 제22일에 희생시키고, 수집 및 균질화 후에 폐 샘플로부터 총 RNA를 단리하였다. 하기 표 24의 데이터는 원위 미측 꼬리엽으로부터 샘플링된 mRNA 발현을 나타낸다. 시노몰구스 원숭이 MUC5AC mRNA 발현을 프로브-기반 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 시노몰구스 원숭이 베타-액틴 발현에 대해 정규화하고, 비히클 대조군의 분율 (기하 평균, +/- 95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 24A. 실시예 9에서의 희생 시 시노몰구스 원숭이 점막 조직 Muc5ac mRNA 상대 발현
Figure pct00123
표 24B. 실시예 9에서의 희생 시 시노몰구스 원숭이 우측 두개 폐문 Muc5ac mRNA 상대 발현
Figure pct00124
표 24C. 실시예 9에서의 희생 시의 시노몰구스 원숭이 우측 두개 중간 기도 Muc5ac mRNA 상대 발현
Figure pct00125
상기 표 24A, 24B 및 24C에 보고된 바와 같은 MUC5AC RNAi 작용제
실시예 10. 양에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 에어로졸화 투여.
흡입 아스카리스 항원에 노출된 양은 문헌 [Abraham et al. (Am Rev Respir Dis. ,1983)]에 나타낸 바와 같이 급성기 반응 (AR), 후기 반응 (LR) 및 기도 과민성 (AHR)을 비롯한 알레르기성 천식의 전형적인 반응을 나타내고, 모델은 표준 관리 요법에 잘 반응하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Caniga, et al., J Inflamm., 2013]). 따라서, 모델은 MUC5AC RNAi 작용제를 사용한 치료 시 기도 역학 및 AHR에 대한 양 Muc5ac (sMuc5ac) mRNA 침묵의 영향을 결정하는 데 사용될 수 있다. 삽관된 양으로의 시험 물품 전달, 아스카리스 수움(Ascaris suum) 항원으로의 챌린지 후의 폐 저항성 (RL)에서의 변화를 검출하는 기도 역학 평가, 및 흡입된 카르바콜에 대한 누적 농도 반응 곡선을 수행함으로써 AHR 평가를 공지된 절차에 따라 수행하였다 (문헌 [Abraham et al., J Clin Invest., 1994]).
아스카리스 수움 챌린지에 대해 이전에 확립된 반응을 갖는 2마리의 아스카리스-감수성 양에게 제1일, 제8일 및 제15일에 1 mg/kg 폐 침착 용량 수준의 AC000480을 투여하였다. AC000480의 화학 구조는 예를 들어 표 11에 나타나 있고, MUC5AC 유전자 상의 위치 3535를 표적화하도록 설계된다. 제21일에, 1x PBS 후 값에 비해 RL을 400%로 증가시킨 (PC400) 누적 카르바콜 농도 (호흡 단위, BU)를 결정함으로써 AHR을 평가하였다 . 제22일에, 양을 아스카리스 수움 추출물로 챌린지하고, RL을 챌린지 8시간 후까지 모니터링하였다. 제23일에, AHR을 제21일과 동일한 방식으로 다시 평가하였다. 효과의 지속기간을 모니터링하기 위해, 양을 제51일에 아스카리스 수움 추출물로 다시 챌린지하고, 제50일 및 제52일에 AHR의 평가와 함께 괄호화하였다.
표 25. 기도 역학 결과
Figure pct00126
표 26: AHR 결과
Figure pct00127
표 25에 나타낸 바와 같이, AC000480을 사용한 치료는 제22일에 챌린지 시 AR 뿐만 아니라 LR의 약화를 유발하였다. 예를 들어, 비치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 126%의 평균 LR 증가를 나타내며, 여기서 제22일 챌린지에서 AC000480 치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 50%의 보다 약화된 LR 증가를 나타낸다. 또한, 제22일 아스카리스 챌린지 24시간 후에, PC400을 생성하는 데 요구되는 동등한 수의 카르바콜 호흡 단위에 의해 나타낸 바와 같이, AC000480 치료된 양 양쪽 모두 아스카리스-유발 기도 과민반응의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AC000480 치료가 없는 대조군 시험에서, 양은 아스카리스 챌린지-후 PC400을 유도하는 데 대략 절반의 양의 카르바콜 호흡 단위를 필요로 하였으며, 이는 기도 과민반응을 나타낸다.
제15일 후에 추가의 투여 없이, 양은 제51일 아스카리스 챌린지 시에 기준선 기도 역학 및 AHR로 복귀하였다.
실시예 11. 양에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 에어로졸화 투여.
상기 실시예 10에 기재된 알레르기성 천식 기도 염증의 양 모델을 사용하였다. 아스카리스 수움 챌린지에 대해 이전에 확립된 반응을 갖는 3마리의 아스카리스 감수성 양에게 제1일, 제8일 및 제15일에 1 mg/kg 폐 침착 용량 수준의 AC000482를 투여하였다. AC000482의 화학 구조는 예를 들어 표 11에 나타나 있고, MUC5AC 유전자 상의 위치 3535를 표적화하도록 설계된다. 제21일에, 1x PBS 후 값에 비해 RL을 400%로 증가시킨 (PC400) 누적 카르바콜 농도 (호흡 단위, BU)를 결정함으로써 AHR을 평가하였다 . 제22일에, 양을 아스카리스 수움 추출물로 챌린지하고, RL을 챌린지 8시간 후까지 모니터링하였다. 제23일에, AHR을 다시 제21일과 같이 평가하였다.
표 27. 기도 역학 결과
Figure pct00128
표 28: AHR 결과
Figure pct00129
표 27에 나타낸 바와 같이, AC000482를 사용한 치료는 제22일에 챌린지 시 AR은 최소 약화를 유발하였지만 LR의 강건한 약화를 유발하였다. 예를 들어, 비치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 121%의 평균 LR 증가를 나타내며, 여기서 제22일 챌린지에서 AC000482 치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 56%의 보다 약화된 LR 증가를 나타낸다. 또한, 제22일 아스카리스 챌린지 24시간 후에, AC000482 치료된 모든 양은 PC400을 생성하는 데 요구되는 동등한 수의 카르바콜 호흡 단위에 의해 나타낸 바와 같이 아스카리스 유발 기도 과민반응의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AC000482 치료가 없는 대조군 시험에서, 양은 아스카리스 챌린지-후 PC400을 유도하는 데 대략 절반의 양의 카르바콜 호흡 단위를 필요로 하였으며, 이는 기도 과민반응을 나타낸다.
실시예 12. 양에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 에어로졸화 투여.
상기 실시예 10에 기재된 알레르기성 천식 기도 염증의 양 모델을 사용하였다. 아스카리스 수움 챌린지에 대해 이전에 확립된 반응을 갖는 6마리의 아스카리스 감수성 양에게 제1일, 제8일 및 제15일에 0.5 mg/kg 폐 침착 용량 수준의 AC000482 (n=3) 또는 0.25 mg/kg 폐 침착 용량 수준의 AC000482를 투여하였다. 제21일에, 1x PBS 후 값에 비해 RL을 400%로 증가시킨 (PC400) 누적 카르바콜 농도 (호흡 단위, BU)를 결정함으로써 AHR을 평가하였다 . 제22일에, 양을 아스카리스 수움 추출물로 챌린지하고, RL을 챌린지 8시간 후까지 모니터링하였다. 제23일에, AHR을 다시 제21일과 같이 평가하였다.
표 29. 기도 역학 결과, 0.5 mg/kg 용량 수준
Figure pct00130
표 30: 기도 역학 결과, 0.25 mg/kg 용량 수준
Figure pct00131
표 31: AHR 결과, 0.5 mg/kg 용량 수준
Figure pct00132
표 32: AHR 결과, 0.25 mg/kg 용량 수준
Figure pct00133
표 29에 나타난 바와 같이, 0.5 mg/kg 용량 수준의 AC000482를 사용한 치료는 제22일에 챌린지 시 AR의 최소 약화를 유발하였지만 LR의 강건한 약화를 유발하였다. 예를 들어, 비치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 125%의 평균 LR 증가를 나타내며, 여기서 제22일 챌린지에서 AC000482 치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 69%의 보다 약화된 LR 증가를 나타낸다. 또한, 제22일 아스카리스 챌린지 24시간 후에, AC000482 치료된 모든 양은 PC400을 생성하는 데 요구되는 유사한 수의 카르바콜 호흡 단위에 의해 나타낸 바와 같이 아스카리스-유발 기도 과민반응의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AC000482 치료가 없는 대조군 시험에서, 양은 아스카리스 챌린지-후 PC400을 유도하는 데 대략 절반의 양의 카르바콜 호흡 단위를 필요로 하였으며, 이는 기도 과민반응을 나타낸다.
표 30에 나타낸 바와 같이, 0.25 mg/kg 용량 수준의 AC000482를 사용한 치료는 제22일에 챌린지 시 AR의 최소 약화를 유발하였지만 LR의 강건한 약화를 유발하였다. 예를 들어, 비치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 122%의 평균 LR 증가를 나타내며, 여기서 제22일 챌린지에서 AC000482 치료된 양은 기준선과 비교하여 6.5시간에 RL에서 83%의 보다 약화된 LR 증가를 나타낸다. 또한, 제22일 아스카리스 챌린지 24시간 후에, AC000482 치료된 모든 양은 PC400을 생성하는 데 요구되는 유사한 수의 카르바콜 호흡 단위에 의해 나타낸 바와 같이 아스카리스-유발 기도 과민반응의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AC000482 치료가 없는 대조군 시험에서, 양은 아스카리스 챌린지-후 PC400을 유도하는 데 대략 절반의 양의 카르바콜 호흡 단위를 필요로 하였으며, 이는 기도 과민반응을 나타낸다.
집합적으로, 결과는 아스카리스 챌린지 후의 기도 역학에 대한 AC000482 치료의 용량-반응성 영향을 입증한다. 결과는 AC000482의 최저 용량에서도, 후기 반응에 대한 영향이 챌린지 24시간 후에 기도 과민반응을 차단하기에 여전히 충분하다는 것을 나타낸다.
실시예 13. 양에서의 MUC5AC RNAi 작용제의 에어로졸화 투여.
상기 실시예 10에 기재된 알레르기성 천식 기도 염증의 양 모델을 사용하였다. 아스카리스 수움 챌린지에 대해 이전에 확립된 반응을 갖는 6마리의 아스카리스 감수성 양에게 제1일, 제8일 및 제15일에 AC000480의 1.0 mg/kg 폐 침착 용량 수준 또는 동일한 표적화 리간드를 포함하지만 RISC 복합체 내로 로딩될 수 없고 따라서 RNA 간섭 유전자 침묵을 매개할 수 없는 음성 대조군 siRNA 접합체의 1.0 mg/kg 폐 침착 용량을 투여하였다. 제21일에, 1x PBS 후 값에 비해 RL을 400%로 증가시킨 (PC400) 누적 카르바콜 농도 (호흡 단위, BU)를 결정함으로써 AHR을 평가하였다 . 제22일에, 양을 아스카리스 수움 추출물로 챌린지하고, RL을 챌린지 8시간 후까지 모니터링하였다. 제23일에, AHR을 다시 제21일과 같이 평가하였다. AC000480을 투여받은 양은 용량 의존성 방식으로 알레르겐-유발 후기 반응 및 기도 과민반응을 약화시킨 반면에, 음성 대조군 접합체의 유사한 노출은 기도 역학에서 알레르겐-유발 변화를 약화시키지 않았다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (65)

  1. 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서,
    표 2 또는 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
    안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
    을 포함하는 RNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 2 또는 표 3에 제공된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 센스 가닥이 표 2 또는 표 4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥이 17개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 안티센스 가닥에 대해 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는 것인 RNAi 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 시클로프로필 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 및 3'-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제.
  7. 제5항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드 또는 그의 조합으로 변형된 것인 RNAi 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3 또는 표 11에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 표 4 또는 표 11에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  10. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3 또는 표 11에 제공된 변형된 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥이 표 4 또는 표 11에 제공된 변형된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 18 내지 30개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 18 내지 30개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 27개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  13. 제12항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  14. 제13항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  15. 제14항에 있어서, 2개의 평활 말단을 갖는 RNAi 작용제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 말단 캡을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  18. 제1항에 있어서, 표 8A, 표 8B, 표 8C, 표 9, 표 10A 또는 표 10B의 듀플렉스 중 어느 하나의 구조를 갖는 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 RNAi 작용제.
  19. 제18항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  20. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
    UUGUAGUAGUCGCAGAACA (서열식별번호: 79); 또는
    UUCUUGUUCAGGCAAAUCA (서열식별번호: 83).
  21. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
    UUGUAGUAGUCGCAGAACAGC (서열식별번호: 1525); 또는
    UUCUUGUUCAGGCAAAUCAGC (서열식별번호: 1535).
  22. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
    UGUUCUGCGACUACUACAA (서열식별번호: 568); 또는
    UGAUUUGCCUGAACAAGAA (서열식별번호: 572).
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  24. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며:
    cPrpusUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1127);
    usUfsgsUfaGfuAfgUfcGfcAfgAfaCfaGfsc (서열식별번호: 1065);
    usUfscsuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1166); 또는
    cPrpuUfcuuguucagGfcAfaAfucagsc (서열식별번호: 1191);
    여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인
    RNAi 작용제.
  25. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지며:
    gscuguucuGfCfGfacuacuacaa (서열식별번호: 1265); 또는
    gscugauUfuGfcCfugaacaagaa (서열식별번호: 1315);
    여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 안티센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인
    RNAi 작용제.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단, 또는 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제.
  28. 제27항에 있어서, 표적화 리간드가 상피 세포 상에 발현된 세포 수용체에 대해 친화도를 갖는 것인 RNAi 작용제.
  29. 제28항에 있어서, 표적화 리간드가 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  30. 제29항에 있어서, 인테그린 표적화 리간드가 αvβ6 인테그린 표적화 리간드인 RNAi 작용제.
  31. 제30항에 있어서, 표적화 리간드가 하기 구조를 포함하는 것인 RNAi 작용제:
    또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는
    또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조를 갖는 표적화 리간드에 접합된 RNAi 작용제:
    또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  33. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 하기 구조를 갖는 것인 RNAi 작용제:
    또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서 은 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 접합된 것인 RNAi 작용제.
  35. 제34항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 접합된 것인 RNAi 작용제.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제를 포함하며, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 뮤신 5AC 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제2 RNAi 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 흡입에 의한 투여를 위해 제제화된 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 계량 흡입기, 제트 네뷸라이저, 진동 메쉬 네뷸라이저 또는 연무 흡입기에 의해 전달되는 조성물.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 나트륨 염인 조성물.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제가 주사용수인 조성물.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제가 등장성 염수인 조성물.
  44. 유효량의 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항의 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 MUC5AC 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 투여 후에 뮤신 5AC 유전자 발현이 적어도 약 30% 억제되는 것인 방법.
  48. MUC5AC 단백질 수준과 연관된 1종 이상의 증상 또는 질환의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료 유효량의 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, MUC5AC 단백질 수준과 연관된 1종 이상의 증상 또는 질환을 치료하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 질환이 점막폐쇄성 폐 질환인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 점막폐쇄성 폐 질환이 천식 (중증 천식 포함), 낭성 섬유증 (CF), 기관지확장증 (NCFB) 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 질환이 천식 (중증 천식 포함)인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 질환이 암인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 암이 폐 선암종, 췌장암, 타액선 암종, 유방암, 담관암종 또는 난소암인 방법.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 5.0 mg의 폐 침착 용량 (PDD)으로 투여되는 것인 방법.
  55. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 2.0 mg의 폐 침착 용량 (PDD)으로 투여되는 것인 방법.
  56. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 5.0 mg의 호흡가능한 전달 용량 (RDD)으로 투여되는 것인 방법.
  57. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 대상체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 2.0 mg의 호흡가능한 전달 용량 (RDD)으로 투여되는 것인 방법.
  58. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제가 2회 이상의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  59. 뮤신 5AC 단백질 수준에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제의 용도.
  60. 뮤신 5AC 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한, 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  61. 뮤신 5AC 유전자 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 증상의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 천식 (중증 천식 포함)인 용도.
  63. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 어닐링시켜 이중-가닥 리보핵산 분자를 형성하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제를 제조하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 센스 가닥이 표적화 리간드를 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 표적화 리간드를 센스 가닥에 접합시키는 것을 포함하는 방법.
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