KR20230064620A - DUX4의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

DUX4의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

RNAi 작용제, RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 억제를 위한 방법이 기재된다. 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제 및 RNAi 작용제 접합체는 DUX4 유전자의 발현을 억제한다. 임의로 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 1종 이상의 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물이 또한 기재된다. 기재된 DUX4 RNAi 작용제의 생체내 골격근 세포로의 전달은 DUX4 유전자 발현의 억제 및 DUX4 수준의 감소를 제공하며, 이는 안면견갑상완 근육 이영양증 (FSHD)을 포함한 특정 골격근-관련 질환 또는 장애를 앓고 있는 인간 대상체를 포함한 대상체에게 치료 이익을 제공할 수 있다.

Description

DUX4의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 그의 조성물, 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/077,272, 및 2021년 6월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/214,742의 이익을 청구하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ASCII 카피는 30679_SEQLIST.txt로 명명되고, 크기는 58 kb이다.
발명의 분야
본 개시내용은 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자 발현의 억제를 위한 RNA 간섭 (RNAi) 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
DUX4는 그의 부분 유전자가 염색체 4 상의 D4Z4 거대위성체 반복 어레이 내에 위치하는 2개의 호메오박스 도메인을 함유하는, 배아발생 동안 정상적으로 발현되는 전사 인자이다. 이는 통상적으로 고환을 제외한 모든 조직에서 메틸화를 통해 엄격하게 후성적으로 억제되고, 성인 골격근에서 공지된 생리학적 기능을 갖지 않는다. DUX4가 골격근에서 저메틸화되고 탈억제되는 조건 하에, DUX4가 발현될 수 있고, 궁극적으로 세포내 및 세포외 신호전달 캐스케이드를 일으켜 근육 변성을 가져오는 비-생리학적 전사체, 긴 비코딩 RNA 또는 안티센스 전사체의 오발현을 촉진할 수 있는 배선 유전자, 면역매개체, 레트로트랜스포손, 내인성 레트로바이러스 요소 및 동원체주변 위성체 HSATII 서열의 전사를 활성화시킬 수 있다. DUX4의 발현은 15,000명 중 1명 내지 20,000명 중 1명에 영향을 미치는 가장 흔한 성인 근병증인 안면견갑상완 근육 이영양증 (FSHD)의 흔한 증상에 원인이 되는 근육 병리상태 및 약화를 유발한다.
FSHD 발병은 비교적 늦고, 전형적인 진단은 20 내지 30세에 발생하며, 진행이 느리고, 근육 약화 중증도가 수년 내지 수십년에 걸쳐 증가한다. FSHD 환자는 통상적으로 안면, 등, 상완, 복부 코어, 골반대 및 다리의 근육에서 비대칭 근육 약화 및 체중 감소를 경험하며, 삶의 질이 유의하게 감소된다. FSHD1 및 FSHD2로 지칭되는 FSHD의 두 주요 형태는 DUX4의 허용 발현에 의해 유발된다. FSHD1은 D4Z4 거대위성체 반복 어레이가 11개 미만의 카피 길이인 경우에 발생한다. 짧은 길이의 어레이는 불충분한 메틸화 및 후성적 억제를 유발하고, DUX4가 근핵에서 산발적으로 발현되도록 하여 상기 언급된 근독성 신호전달 캐스케이드를 유도한다. FSHD2는 D4Z4 거대위성체 반복 어레이의 메틸화 및 억제를 부분적으로 담당하는 염색체의 구조 유지 힌지 도메인 1 (structural maintenance of the chromosomes hinge domain 1, SMCHD1) 유전자에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유발된다. 감소된 SMCHD1 활성은 DUX4의 후성적 탈억제 및 발현을 초래한다.
DUX4가 정상적으로는 성인 골격근에서 발현되지 않고, 골격근에서 공지된 정상적인 생리학적 기능을 갖지 않으며, 발현되는 경우, 근독성 기능의 획득을 유발하기 때문에, 이는 대부분의 양식, 예컨대 소분자 화학적 화합물 또는 항체에 대해 어려운 표적이다. 현재, 골격근에서 DUX4 발현의 근독성 효과를 역전시키거나 예방하는 효과적인 치료법은 없다. DUX4 발현을 억제할 수 있고, FSHD와 연관된 DUX4 발현-관련 근육 변성, 근육 중량 손실, 및 근육 약화를 예방, 정지 및/또는 역전시킬 수 있는 치료제에 대한 필요성이 존재한다.
특히 생체내에서 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 억제할 수 있는 신규 RNA 간섭 (RNAi) 작용제 (본원에서 RNAi 작용제, RNAi 촉발제 또는 촉발제로도 지칭됨), 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제가 필요하다. 추가로, DUX4 단백질 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 호전될 수 있는 질환 또는 장애, 예컨대 안면견갑상완 근육 이영양증 (FSHD)의 치료를 위한 신규 DUX4-특이적 RNAi 작용제의 조성물에 대한 필요가 존재한다.
일반적으로, 본 개시내용은 DUX4 RNAi 작용제, 이러한 RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 및 본원에 기재된 RNAi 작용제 및 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 사용하여 시험관내 및/또는 생체내에서 DUX4 유전자의 발현을 억제하는 방법을 특색으로 한다. 본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제는 DUX4 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 감소, 억제 또는 침묵시킬 수 있다.
기재된 DUX4 RNAi 작용제는, 둘 다 DUX4의 허용 발현에 의해 유발되는 FSHD1 및 FSHD2의 가장 흔한 형태를 포함한 증상 및 질환 예컨대 FSHD의 치유적 치료 (방지, 개입 또는 예방적 치료 포함)를 위한 방법에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 예를 들어 피하 (SQ) 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 (IV) 투여를 사용하여 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물 대상체에게 1종 이상의 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 특색으로 하며, 여기서 RNAi 작용제는 센스 가닥 (또한 패신저 가닥으로 지칭됨) 및 안티센스 가닥 (또한 가이드 가닥으로 지칭됨)을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다. 본원에 기술된 RNAi 작용제 센스 가닥의 길이는 각각 15개 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본원에 기재된 RNAi 작용제 안티센스 가닥의 길이는 각각 17 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 독립적으로 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 독립적으로 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드 길이이다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는, DUX4를 발현하는 세포 예컨대 골격근 세포 (골격근섬유)에 전달 시, 생체내 및/또는 시험관내에서 1개 이상의 DUX4 유전자 전사체의 발현을 억제한다.
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 1 & 서열식별번호: 2, 호모 사피엔스 전사체 변이체 2 참조)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는 표 1에 개시된 서열 중 임의의 것의 서열을 갖는 DUX4 유전자의 부분을 표적화한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 DUX4 유전자의 발현을 선택적으로 및 효율적으로 감소시킬 수 있는 개시된 DUX4 RNAi 작용제 중 1종 이상을 포함하는 제약 조성물을 특색으로 한다. 본원에 기재된 1종 이상의 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준의 감소에 의해 호전될 수 있는 증상 및 질환의 치료 (개입 또는 예방적 치료 또는 억제 포함)에 대해 대상체, 예컨대 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물은 DUX4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
DUX4 RNAi 작용제에 사용될 수 있는 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예가 표 3 및 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 표 5.4에서 제공된다. DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스의 예가 표 5.1, 5.2, 5.3, 및 5.4에서 제공된다. 본원에 개시된 특정 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어질 수 있거나 또는 그에 포함될 수 있는 19-뉴클레오티드 코어 스트레치 서열의 예가 표 2에 제공된다.
본원에 기재된 한 측면은 하기를 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다:
(i) 표 3 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥.
본원에 기재된 또 다른 측면은 하기를 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 기재한다:
(i) 표 3 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥;
(iii) 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖는 센스 가닥에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 센스 가닥에 연결된 PK/PD 조정제.
본원에 기재된 추가 측면에서 하기를 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다:
(i) 표 3 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥;
(iii) 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 센스 가닥에 연결되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK/PD 조정제.
본원에 기재된 또 다른 측면은 하기를 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제를 기재한다:
(i) 표 3 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥;
(ii) 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥;
(iii) 본원의 표 6.2 또는 6.3에 나타낸 화학 구조를 포함하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 표적화 리간드; 및
(iv) 본원의 표 6.5 또는 6.7에 나타낸 화학 구조를 포함하고, 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 PK/PD 조정제.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 DUX4 RNAi 작용제를 대상체, 예컨대 포유동물, 예를 들어 인간 대상체의 골격근 세포에 생체내 전달하는 방법을 특색으로 한다. 또한, 이러한 방법에 사용하기 위한 조성물이 본원에 기재된다.
1종 이상의 DUX4 RNAi 작용제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 RNAi 작용제를 표적화 기에 공유 연결시킴으로써 세포 또는 조직에 전달된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 세포 수용체 리간드를 포함할 수 있다. 표적화 기는 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드에 대해 내부적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다. 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체 (예를 들어, 인테그린 알파-v-베타-6 (αvβ6))에 대한 친화도를 갖는 표적화 리간드의 예가 본원의 표 6.2 및 6.3에 제시된다. 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 특정 표적화 리간드의 합성 및 접합은 실시예 1에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는, RNAi 작용제를 골격근 세포로 향하게 하는 표적화 기 또는 표적화 리간드에 접합되고, 그에 의해 RNAi 작용제가 수용체-매개 세포내이입을 통해 또는 다른 수단에 의해 선택적으로 내재화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 DUX4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 DUX4 RNAi 작용제의 양을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 DUX4 유전자 발현을 억제하는 방법을 특색으로 하고, 여기서 DUX4 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준의 감소에 의해 호전될 수 있는 질환 또는 증상의 치료 (예방적, 개입, 또는 방지적 치료 포함)를 필요로 하는 대상체에게 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 서열 중 임의의 것을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준의 감소에 의해 호전될 수 있는 질환 또는 증상의 치료 (예방적, 개입, 또는 방지적 치료 포함) 방법을 특색으로 한다. 이러한 방법에 사용하기 위한 제약 조성물이 또한 기재된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1개 이상의 연결기 또는 다른 비-뉴클레오티드 기 또는 화합물, 예컨대 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제에 연결된다. PK/PD 조정제는 개선된 세포 수용체 결합, 개선된 세포 흡수 및/또는 다른 수단을 통해 접합된 약물의 순환 시간을 증가시키고/거나 RNAi 작용제의 활성을 증가시킬 수 있다. 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 PK/PD 조정제의 예는 본원의 표 6.5 및 6.7에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표적화 기, 연결기, PK/PD 조정제, 및/또는 또 다른 비-뉴클레오티드 기에 접합된다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표적화 기 및 PK/PD 조정제에 접합된다.
DUX4 RNAi 작용제의 사용은 DUX4 단백질 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 호전될 수 있는 질환 또는 장애의 치유적 (예방적 또는 개입 포함) 치료를 위한 방법을 제공한다. 대상체에게 골격근 세포에 DUX4 RNAi 작용제를 전달하기 위한 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 대상체의 척추주위, 안면, 몸통, 복부 및 사지 근육 조직, 예를 들어 대상체의 삼두근, 이두근, 사두근, 흉근, 비복근, 가자미근, 교근, EDL (장지신근), TA (전경골근), 승모근 및/또는 횡경막에서 DUX4 유전자 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 치료 유효량의 표 2, 표 4.1, 표 4.2, 표 4.3, 표 4.4, 표 4.5, 표 4.6, 또는 표 5.4의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 적어도 부분적으로 DUX4 발현에 의해 매개되는 병리학적 상태, 예컨대 FSHD를 치료하는 방법 (예방적 또는 개입 치료 포함)이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 치료 유효량의 본원의 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 표 3의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 적어도 부분적으로 DUX4 발현에 의해 매개되는 병리학적 상태의 치료 (예방적 또는 개입 치료 포함) 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원의 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4의 서열 중 어느 하나의 핵염기 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 5.4의 서열 중 어느 하나의 핵염기 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 본원의 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 표 5.4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥, 및 표 3 또는 표 5.4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, DUX4 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169);
여기서 상기 각각의 서열은 안티센스 가닥의 위치 1-21 (5' → 3')에 위치된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3')과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82);
cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84);
cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100);
cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101);
cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97);
cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99);
cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75);
usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76);
cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보적이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기를 포함하고:
(i) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(ii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(iii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(iv) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(v) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(vi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(vii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(viii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(ix) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(x) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥; 또는
(xi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기를 포함하고:
(xii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xiii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xiv) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xv) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xvi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xvii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xviii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xix) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xx) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
(xxi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥; 또는
(xxii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 각각의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고; 센스 가닥은 또한 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169);
여기서 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169);
여기서 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하며; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 센스 가닥의 5' 말단 단부에 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖는 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169);
여기서 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부 둘 다에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 센스 가닥은 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 추가로 포함하고; 여기서 각각의 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 위치 1-21에 위치한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164) 및 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA (서열식별번호:183); 또는
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162) 및 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA (서열식별번호:181); 또는
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163) 및 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (서열식별번호:182); 또는
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169) 및 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (서열식별번호:189);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 쌍 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164) 및 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA (서열식별번호:183); 또는
UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162) 및 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA (서열식별번호:181); 또는
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163) 및 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (서열식별번호:182); 또는
UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169) 및 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (서열식별번호:189);
여기서 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 각각의 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 5' 말단 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 여기서 센스 가닥은 또한 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82);
cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84);
cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100);
cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101);
cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97);
cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99);
cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75);
usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76);
cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82);
cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84);
cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100);
cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101);
cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97);
cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99);
cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75);
usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76);
cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87);
여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥을 추가로 포함하고; 여기서 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고; 여기서 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 여기서 센스 가닥은 또한 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고:
usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82); 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149); 또는
cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76) 및
aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148);
cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89) 및
gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87) 및
gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 뉴클레오티드 서열 쌍 (5' → 3') 중 하나로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고:
usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82); 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101) 및
cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149); 또는
cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96) 및
caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76) 및
aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148);
cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89) 및
gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156);
cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87) 및
gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159);
여기서 a, c, g 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부에 역전된 무염기성 잔기를 추가로 포함하고, 센스 가닥은 또한 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 표적화 리간드를 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 여기서 센스 가닥은 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 (5' → 3')로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAAC (서열식별번호:22);
UGAAACCAGAUCUGAAUCC (서열식별번호:10); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUC (서열식별번호:14);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 (5' → 3')로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAAC (서열식별번호:22);
UGAAACCAGAUCUGAAUCC (서열식별번호:10); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUC (서열식별번호:14);
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 각각의 서열은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 1-19 (5' → 3')에 위치된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 각각이 하기 (5' → 3')로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍과 0 또는 1개의 핵염기만큼 상이한 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고:
UAGAAUUUCACGGAAGAAC (서열식별번호:22) 및 GUUCUUCCGUGAAAUUCUA (서열식별번호:50);
UGAAACCAGAUCUGAAUCC (서열식별번호:10) 및 GGAUUCAGAUCUGGUUUCA (서열식별번호:38); 및
UUGAAACCAGAUCUGAAUC (서열식별번호:14) 및 GAUUCAGAUCUGGUUUCAA (서열식별번호:42); 및
여기서 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 각각 독립적으로 변형되거나 또는 비변형될 수 있는 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
본원에 사용된 "RNAi 작용제" ("RNAi 촉발제"로도 지칭됨)는 서열 특이적 방식으로 표적 메신저 mRNA (mRNA)의 mRNA 전사체를 분해하거나 또는 그의 번역을 억제할 수 있는 (예를 들어, 적절한 조건 하에 그를 분해하거나 또는 그의 번역을 억제하는) RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 본원에 사용된 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘 (즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도된 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함)을 통해, 또는 임의의 대안적 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제는, 그 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정한 경로 또는 작용 메카니즘에 얽매이거나 또는 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은 (또는 작은) 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA (즉, DUX4 mRNA)에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "침묵시키다", "감소시키다", "억제하다", "하향-조절하다" 또는 "녹다운시키다"는 주어진 유전자의 발현을 지칭하는 경우, 유전자가 전사되는 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에서 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된 바와 같은 유전자 발현이, 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체가 본원에 기재된 RNAi 작용제로 처리될 때 그렇게 처리되지 않은 제2 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체와 비교하여 감소된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 표준 명명법을 사용하여 일련의 문자로 기재된 핵염기 또는 뉴클레오티드의 연속 또는 순서를 의미한다.
본원에 사용된 "염기", "뉴클레오티드 염기" 또는 "핵염기"는 뉴클레오티드의 성분인 헤테로시클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이고, 1차 퓨린 염기인 아데닌 및 구아닌, 및 1차 피리미딘 염기인 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 핵염기는 비제한적으로 범용 염기, 소수성 염기, 혼재성 염기, 크기-확장 염기, 및 플루오린화 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008] 참조). 이러한 변형된 핵염기 (변형된 핵염기를 포함하는 포스포르아미다이트 화합물 포함)의 합성은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고, 따라서 당 모이어티, 염기 모이어티 및 공유 연결된 기 (연결기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 글리코시드를 지칭하고, 자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기 모이어티를 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오티드 (본원에서 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드로도 지칭됨) 둘 다를 포괄한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드는 단량체 또는 단위로 지칭될 수 있다.
본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은, 제1 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 센스 가닥 또는 표적화된 mRNA)을 제2 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 안티센스 가닥 또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 기재하는 데 사용되는 경우, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 표준 조건 하에 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화 (포유동물의 생리학적 조건 (또는 달리 적합한 생체내 또는 시험관내 조건) 하에 염기 쌍 수소 결합을 형성)하고 듀플렉스 또는 이중 나선 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 혼성화 시험에 가장 적절한 조건의 세트를 선택할 수 있을 것이다. 적어도 상기 혼성화 요건이 충족되는 한, 상보적 서열은 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기 쌍을 포함하고, 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형과 독립적이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 a 및 Af는 U (또는 T)에 상보적이고, 동일성 또는 상보성을 결정할 목적으로 A와 동일하다.
본원에 사용된 "완벽하게 상보적" 또는 "완전히 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 모든 (100%) 염기가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "부분적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아닌 적어도 70%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 상보적"은 핵염기 또는 뉴클레오티드 서열 분자의 혼성화된 쌍에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기 모두가 아닌 적어도 85%가 제2 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 인접 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보적", "완전히 상보적", "부분적으로 상보적" 및 "실질적으로 상보적"은 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 DUX4 mRNA의 서열 사이의 핵염기 또는 뉴클레오티드 매칭과 관련하여 사용된다.
핵산 서열에 적용된 바와 같은 본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"은 뉴클레오티드 서열 (또는 뉴클레오티드 서열의 부분)이 참조 서열과 비교하여 적어도 약 85% 서열 동일성 또는 그 초과, 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 것을 의미한다. 서열 동일성의 백분율은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 비교함으로써 결정된다. 백분율은 동일한 유형의 핵산 염기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본원에 개시된 발명은 본원에 개시된 것들과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개체", "환자" 및 "대상체"는 조류, 인간 및 다른 영장류, 및 상업적으로 관련된 포유동물 또는 동물 모델 예컨대 마우스, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개를 포함한 다른 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 종의 구성원을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 완화 또는 그의 수, 중증도 및/또는 빈도의 경감을 제공하기 위해 취해지는 방법 또는 단계를 의미한다. 본원에 사용된 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 예방, 관리, 예방적 또는 개입 치료, 및/또는 억제 또는 감소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포 내로 도입하는"은 RNAi 작용제를 지칭하는 경우에 RNAi 작용제를 세포 내로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적 전달"은 RNAi 작용제가 예상된 생물학적 활성, 예를 들어 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 갖는 것을 가능하게 하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포에 전달하는 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
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의 사용은 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따른 임의의 기 또는 기들이 그에 연결될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 그의 원자의 성질 또는 결합 순서 또는 그의 원자의 공간 배열이 상이한 화합물을 지칭한다. 그의 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 지칭되고, 비-중첩가능한 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체" 또는 때때로 광학 이성질체로 지칭된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, 구조에서 특정한 입체형태를 갖는 것으로 구체적으로 확인되지 않는 한, 비대칭 중심이 존재하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 다른 입체이성질체 배위를 생성하는 각각의 구조에 대해, 본원에 개시된 각각의 구조는 그의 광학적으로 순수한 및 라세미 형태를 포함한 모든 이러한 가능한 이성질체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 구조는 부분입체이성질체의 혼합물 뿐만 아니라 단일 입체이성질체를 포함하도록 의도된다.
본원의 청구범위에 사용된 어구 "로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에서 사용될 때, 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 화합물 및 조성물이, 화합물 또는 조성물이 위치하는 환경에 따라, 특정 원자 (예를 들어, N, O, 또는 S 원자)를 양성자화 또는 탈양성자화 상태로 가질 수 있음을 용이하게 이해하고 알 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대, 예를 들어 OH, SH, 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있음을 고려한다. 본원의 개시내용은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 개시된 화합물 및 조성물을 환경 (예컨대, pH)에 기초한 그의 양성자화 상태와 무관하게 포괄하는 것으로 의도된다. 상응하게, 불안정한 양성자 또는 염기성 원자를 갖는 본원에 기재된 화합물은 또한 상응하는 화합물의 염 형태를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 화합물은 유리 산, 유리 염기 또는 염 형태일 수 있다. 본원에 기재된 화합물의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 전형적인 제약상 허용되는 염은 나트륨 염의 형태이다.
본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "접합된"은 2개의 화합물 또는 분자 사이의 연결을 지칭하는 경우에 2개의 화합물 또는 분자가 공유 결합에 의해 연결됨을 의미한다. 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "연결된" 및 "접합된"은 임의의 개재 원자 또는 원자 군을 갖거나 갖지 않는 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연결을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "포함한"은 본원에서 어구 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미하도록 사용되고, 그와 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "또는"은 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 본원에서 용어 "및/또는"을 의미하도록 사용되고, 그와 상호교환가능하게 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
값이 명백하게 언급되는 경우에, 언급된 값과 거의 동일한 수량 또는 양인 값이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우에, 그 조합의 요소의 각각의 하위-조합이 또한 구체적으로 개시되고, 본 개시내용의 범주 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소의 군이 개별적으로 개시된 경우, 그의 조합이 또한 개시된다. 본 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시된 경우에, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 그 개시내용의 예가 또한 본원에 개시되고; 본 개시내용의 하나 초과의 요소가 이러한 배제를 가질 수 있고, 이러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 본원에 개시된다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 측면 및 이점은 하기 상세한 설명, 첨부 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1. 실시예 3에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 2. 실시예 4에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 3. 실시예 4에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 4. 실시예 5에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 5. 실시예 6에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 6. 실시예 6에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 7. 실시예 7에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 8. 실시예 7에 보다 상세히 기재된 바와 같이, FSHD-유사 모델 마우스의 로타로드 장치 상에서의 시간을 도시하는 그래프.
도 9. 실시예 8에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 10. 실시예 9에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 11. 실시예 10에 보다 충분히 기재된 바와 같은, FSHD-유사 모델 마우스의 평균 체중을 도시하는 그래프.
도 12. 실시예 10에 보다 상세히 기재된 바와 같이, FSHD-유사 모델 마우스의 로타로드 장치 상에서의 시간을 도시하는 그래프.
도 13. 실시예 11에 보다 충분히 기재된 바와 같은, 환자-유래 근관에서의 DUX4 발현을 도시하는 그래프.
도 14. 실시예 11에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 환자-유래 근관에서 FSHD와 관련된 것으로 공지된 여러 바이오마커 유전자의 상대 유전자 발현을 도시하는 그래프.
도 15a. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 L4 링커를 통해 연결된 αvβ6-SM45b 표적화 리간드, 및 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커를 통해 연결된 LP1b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는, AC000232의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략적 다이어그램. (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
하기 약어가 도 15a 내지 15i에서 사용된다: a, c, g, 및 u는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; o는 포스포디에스테르 연결이고; s는 포스포로티오에이트 연결이고; invAb는 역전된 무염기성 잔기이고 (예를 들어, 표 6.1 참조); cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘 변형된 뉴클레오티드이고 (예를 들어, 표 6.1 참조); αvβ6-SM45b는 SM45b의 소분자 표적화 리간드이고 (예를 들어, 표 6.3 참조); -L4-는 실시예 3에 기재된 바와 같은 구조를 갖는 링커이고; αvβ6-pep1은 αvβ6 펩티드 1 표적화 리간드이고 (예를 들어, 표 6.3 참조); -C6-S-는 표 6.1에 나타낸 바와 같은 연결기이고; (NH-C6)은 표 6.1에 나타낸 바와 같은 연결기이고; LP1b, LP29b, 및 LP38b는 각각 본원의 표 6.7에 기재된 바와 같은 구조를 갖는 PK/PD 조정제이다. (또한, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15b. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 연결된 αvβ6-펩티드 1 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커에 연결된 LP38b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 것으로 나타낸, AC000247의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략적 다이어그램 (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15c. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 L4 링커를 통해 연결된 αvβ6-SM45b 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커를 통해 연결된 LP1b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는, AC000278의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략적 다이어그램. (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15d. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 L4 링커를 통해 연결된 αvβ6-SM45b 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커를 통해 연결된 LP1b의 구조를 갖는, AC000280의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략적 다이어그램. (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조)
도 15e. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 L4 링커를 통해 연결된 αvβ6-SM45b 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커를 통해 연결된 LP1b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는, AC000281의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략적 다이어그램. (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조)
도 15f. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 연결된 αvβ6-펩티드 1 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커에 연결된 LP29b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 것으로 나타낸, AC000446의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략 다이어그램 (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15g. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 연결된 αvβ6-펩티드 1 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커에 연결된 LP29b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 것으로 나타낸, AC000447의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략 다이어그램 (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15h. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 연결된 αvβ6-펩티드 1 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커에 연결된 LP29b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 것으로 나타낸, AC000448의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략 다이어그램 (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 15i. 센스 가닥의 5' 말단에서 (NH2-C6) 연결기에 연결된 αvβ6-펩티드 1 표적화 리간드를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단에서 C6-SS-C6 링커에 연결된 LP28b의 구조를 갖는 PK/PD 조정제를 갖는 것으로 나타낸, AC000449의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 표 5.4 참조)의 개략 다이어그램 (예를 들어, 본원의 실시예 1 및 3 참조).
도 16a 내지 도 16e. 유리 산 형태로 나타낸, AC000446의 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
도 17a 내지 도 17e. 나트륨 염 형태로 나타낸, AC000446의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
도 18a 내지 도 18e. 유리 산 형태로 나타낸, AC000448의 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
도 19a 내지 도 19e. 나트륨 염 형태로 나타낸, AC000448의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
도 20a 내지 도 20e. 유리 산 형태로 나타낸, AC000449의 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
도 21a 내지 도 21e. 나트륨 염 형태로 나타낸, AC000449의 구조를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 접합체의 화학 구조 표현 (예를 들어, 표 5.4 참조).
DUX4 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제 (본원에서 DUX4 RNAi 작용제 또는 DUX4 RNAi 촉발제로 지칭됨)가 본원에 기재된다. 각각의 DUX4 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥은 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안티센스 가닥은 각각 17 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17 내지 27개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19-21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21-26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21-24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 19개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 약 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 23개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 각각 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 센스 가닥은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 안티센스 가닥은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드의 듀플렉스 길이를 갖는다.
DUX4 RNAi 작용제를 형성하는 데 사용된 뉴클레오티드 서열의 예가 표 2, 3, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에서 제공된다. 표 2, 3, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는 RNAi 작용제 듀플렉스의 예가 표 5.1, 5.2, 5.3, 및 5.4에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 완벽한, 실질적 또는 부분적 상보성의 영역 (때때로 "듀플렉스 영역"으로 지칭됨)은 12-26개 (예를 들어, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개) 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 또는 그 부근에서 발생한다 (예를 들어, 이러한 영역은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 완벽하게, 실질적으로 또는 부분적으로 상보적이지 않은 0, 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드만큼 분리될 수 있음).
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 DUX4 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열 (본원에서 "코어 스트레치" 또는 "코어 서열"로도 지칭됨)과 적어도 85% 동일성을 갖는 적어도 12개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열에 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이며, 따라서 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 전형적으로 DUX4 mRNA 표적에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열 (때때로, 예를 들어, 표적 서열로서 지칭됨)과 완벽하게 동일하거나 또는 적어도 약 85% 동일하다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 센스 가닥 코어 스트레치는 21개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 DUX4 mRNA 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치, 및 일부 실시양태에서, 상응하는 센스 가닥 내의 동일한 수의 뉴클레오티드의 코어 스트레치에 대해 적어도 85% 상보성을 갖는 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치는 DUX4 mRNA 표적에 존재하는 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 표적 서열)에 100% (완벽하게) 상보적이거나 또는 적어도 약 85% (실질적으로) 상보적이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 19개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이 안티센스 가닥 코어 스트레치는 23개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 상응하는 안티센스 코어 서열과 동일한 길이일 수 있거나, 또는 상이한 길이일 수 있다.
DUX4 RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 듀플렉스를 형성한다. DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다. 상보적 듀플렉스 영역 내에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 코어 스트레치 서열에 대해 적어도 85% 상보적 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 상응하는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드 서열에 적어도 85% 또는 100% 상보적인 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개 뉴클레오티드의 서열을 함유한다 (즉, DUX4 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 코어 스트레치 서열은 적어도 85% 염기 쌍형성되거나 또는 100% 염기 쌍형성된 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개 뉴클레오티드의 영역을 가짐).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2 또는 표 4.1, 또는 표 4.2, 또는 표 4.3, 또는 표 4.4, 또는 표 4.5, 표 4.6, 또는 표 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 임의로 및 독립적으로 코어 스트레치 서열의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 및 5' 말단 둘 다에 추가의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오티드 (연장물)를 함유할 수 있다. 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우에 DUX4 mRNA 내의 상응하는 서열에 상보적일 수 있거나 상보적이지 않을 수 있다. 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우에 DUX4 mRNA 내의 상응하는 서열과 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 존재하는 경우 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는, 존재하는 경우 상응하는 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나 상보적이지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 연장물은 센스 가닥 코어 스트레치 서열 및/또는 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥 상의 연장물 뉴클레오티드는 상응하는 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장물 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 반대로, 안티센스 가닥 상의 연장물 뉴클레오티드는 상응하는 센스 가닥 내의 코어 스트레치 뉴클레오티드 또는 연장물 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 3' 및 5' 연장물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 한 가닥의 3' 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상이 다른 가닥의 1개 이상의 5' 연장물과 염기 쌍을 형성한다. 다른 실시양태에서, 한 가닥의 3' 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 다른 가닥의 1개 이상의 5' 연장물과 염기 쌍을 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥 및 5' 연장물을 갖는 센스 가닥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 연장물 뉴클레오티드(들)는 쌍형성되지 않고 오버행을 형성한다. 본원에 사용된 "오버행"은 본원에 개시된 RNAi 작용제의 혼성화 또는 듀플렉스화 부분의 일부를 형성하지 않는, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단 단부에 위치된 1개 이상의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드의 스트레치를 지칭한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 DUX4 mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 상응하는 DUX4 mRNA 서열에 상보적이지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 길이의 3' 연장물을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 아데노신, 우라실 또는 티미딘 뉴클레오티드, AT 디뉴클레오티드, 또는 DUX4 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 센스 가닥 연장물은 하기 서열 중 하나를 포함하거나 그로 이루어지지만, 이에 제한되지는 않는다: T, UT, TT, UU, UUT, TTT, 또는 TTTT (각각 5'에서 3'로 열거됨).
센스 가닥은 3' 연장물 및/또는 5' 연장물를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 뉴클레오티드 길이의 5' 연장물을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 연장물 뉴클레오티드 중 1개 이상은 DUX4 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하거나 또는 그와 동일한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 5' 연장물은 하기 서열 중 하나이지만, 이에 제한되지는 않는다: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U, UU (각각 5'에서 3'로 열거됨).
DUX4 RNAi 작용제를 형성하는 데 사용된 서열의 예가 표 2, 3, 및 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에서 제공된다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 3의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3 또는 표 5.4의 변형된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 3, 또는 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 2-15, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 또는 2-21의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 4의 서열 중 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 2-19, 2-20, 2-21, 3-20, 3-21, 또는 4-21의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4.1, 표 4.2, 표 4.3, 표 4.4, 표 4.5, 표 4.6 또는 표 5.4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 둘 다의 단부는 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 단부도 평활-말단이 아니다. 본원에 사용된 "평활 말단"은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인 (상보적 염기-쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단을 지칭한다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양쪽 말단은 풀린 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 말단도 풀린 말단이 아니다. 본원에 사용된 풀린 말단은 쌍으로부터의 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드 (즉, 오버행을 형성하지 않음)가 상보적이지 않지만 (즉, 비-상보적 쌍을 형성함) 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 한 가닥의 말단의 1개 이상의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드는 오버행을 형성한다. 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 존재하여 3' 또는 5' 오버행을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 평활 말단 및 풀린 말단, 평활 말단 및 5' 오버행 말단, 평활 말단 및 3' 오버행 말단, 풀린 말단 및 5' 오버행 말단, 풀린 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 5' 오버행 말단, 2개의 3' 오버행 말단, 5' 오버행 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 풀린 말단, 또는 2개의 평활 말단을 함유한다. 전형적으로, 존재하는 경우, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 3' 말단 단부에 위치한다.
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 또한 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예를 들어 1개 이상의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결과 조합된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 염, 혼합 염 또는 유리-산으로서 제조되거나 또는 제공된다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 나트륨 염으로서 제조된다. 관련 기술분야에 널리 공지된 이러한 형태는 본원에 개시된 본 발명의 범주 내에 있다.
변형된 뉴클레오티드
변형된 뉴클레오티드는, 다양한 올리고뉴클레오티드 구축물에 사용되는 경우에, 세포에서 화합물의 활성을 보존하면서 동시에 이들 화합물의 혈청 안정성을 증가시킬 수 있고, 또한 올리고뉴클레오티드 구축물의 투여 시 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-변형된 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드, 변형된 핵염기-포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체), 잠금 뉴클레오티드, 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-메틸, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 및 시클로프로필 포스포네이트-함유 뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (즉, 5-원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 (2'-메톡시 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2'-플루오로 뉴클레오티드 (본원에서 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로도 지칭됨), 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 (2'-O-(2-메톡시에틸)) 뉴클레오티드 (2'-MOE로도 지칭됨), 2'-아미노 뉴클레오티드 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 1개 초과의 변형이 단일 DUX4 RNAi 작용제 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 하나의 뉴클레오티드에서의 변형은 또 다른 뉴클레오티드에서의 변형과 독립적이다. 다양한 변형된 뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 기재되어 있다.
변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 푸린, (예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 이노신 (하이포크산틴), 크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 (예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬 (예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-술프히드릴, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (예를 들어, 5-브로모), 5-트리플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3' 말단은 "무염기성 부위" 또는 "무염기성 뉴클레오티드"로도 지칭될 수 있는 무염기성 잔기 (Ab)를 포함할 수 있다. 무염기성 잔기 (Ab)는 당 모이어티의 1' 위치에서 핵염기가 결여된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 무염기성 잔기는 뉴클레오티드 서열 내에 내부에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, Ab 또는 AbAb는 안티센스 가닥의 3' 말단에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 말단은 1개 이상의 추가적인 무염기성 잔기 (예를 들어, (Ab) 또는 (AbAb))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, UUAb, UAb 또는 Ab는 센스 가닥의 3' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된, 존재하는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다에서 4개 이하 (즉, 0, 1, 2, 3, 또는 4개)의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 (즉, 비변형)인 RNAi 작용제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 존재하는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 센스 가닥은 센스 가닥에서 2개 이하 (즉, 0, 1, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형된 리보뉴클레오티드인 센스 가닥이다. 본원에 사용된 바와 같이, 존재하는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 안티센스 가닥은 센스 가닥에서 2개 이하 (즉, 0, 1, 또는 2개)의 뉴클레오티드가 비변형 리보뉴클레오티드인 안티센스 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비변형된 리보뉴클레오티드이다. 특정 변형된 뉴클레오티드에 대한 화학 구조는 본원의 표 6.1에 제시된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비-표준 연결 또는 백본 (즉, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 변형된 백본)에 의해 연결된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 포스포로티오에이트 기 (본원에서 소문자 "s"로 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'와 5'-3' 또는 2'-5'와 5'-2' 연결된 역극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 인 원자가 결여된다. 인 원자가 결여된 변형된 뉴클레오시드간 연결은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 백본은 실록산 백본, 술피드 백본, 술폭시드 백본, 술폰 백본, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 알켄-함유 백본, 술파메이트 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 아미드 백본, 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분을 갖는 다른 백본을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있거나, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1, 2, 3, 또는 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 있고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 센스 가닥의 5' 말단에 위치하고, 또 다른 포스포로티오에이트 연결은 센스 가닥의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 사이에 어떠한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결도 포함하지 않지만, 5' 및 3' 말단 둘 다 상의 말단 뉴클레오티드와 임의로 존재하는 역전된 무염기성 잔기 말단 캡 사이에 1, 2 또는 3개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 센스 가닥에 연결된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-3의 뉴클레오티드 사이 및 5' 말단으로부터 위치 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25, 또는 24-26의 뉴클레오티드 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-4 사이에 위치하고, 제4 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 20-21 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 내에 대해 적어도 3 또는 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유한다.
캡핑 잔기 또는 모이어티
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 때때로 관련 기술분야에서 "캡", "말단 캡" 또는 "캡핑 잔기"로 지칭되는 1개 이상의 캡핑 잔기 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "캡핑 잔기"는 본원에 개시된 RNAi 작용제의 뉴클레오티드 서열의 1개 이상의 말단에 혼입될 수 있는 비-뉴클레오티드 화합물 또는 다른 모이어티이다. 캡핑 잔기는 일부 경우에 RNAi 작용제에 특정의 유익한 특성, 예컨대 예를 들어 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 잔기 (invAb) (관련 기술분야에서 "역전된 무염기성 부위"로도 지칭됨)가 캡핑 잔기로서 부가된다 (표 6.1 참조). (예를 들어, 문헌 [F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16]; 미국 특허 번호 5,998,203 참조). 캡핑 잔기는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 역전된 무염기성 잔기 뿐만 아니라 탄소 쇄, 예컨대 말단 C3H7 (프로필), C6H13 (헥실), 또는 C12H25 (도데실) 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 잔기는 센스 가닥의 5' 말단 단부, 3' 말단 단부, 또는 5' 및 3' 말단 단부 둘 다에 존재한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 3' 말단은 캡핑 잔기로서 1개 초과의 역전된 무염기성 데옥시리보스 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 3' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위가 PK/PD 조정제와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에 또는 그 부근에 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 또는 역전된 무염기성 부위를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기 (invAb)가 센스 가닥의 5' 말단에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기가 표적화 리간드와 RNAi 작용제의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 역전된 무염기성 잔기는 포스페이트, 포스포로티오에이트 (예를 들어, 본원에서 (invAb)s로 나타냄), 또는 다른 뉴클레오시드간 연결을 통해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 말단 단부 또는 말단 단부들에 또는 그 부근에 1개 이상의 역전된 무염기성 잔기를 포함하는 것은 RNAi 작용제의 증진된 활성 또는 다른 목적하는 특성을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역전된 무염기성 (데옥시리보스) 잔기는 역전 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 3' 말단, 또는 안티센스 가닥 서열의 3' 말단은 역전된 무염기성 잔기를 포함할 수 있다. 역전된 무염기성 데옥시리보스 잔기에 대한 화학 구조를 하기 표 6.1에 나타낸다.
DUX4 RNAi 작용제
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제 실시양태는 DUX4 유전자 상의 특이적 위치 (즉, DUX4 유전자 전사체 상의 특이적 위치)를 표적화하도록 설계되었다. 본원에 정의된 바와 같이, 안티센스 가닥 서열은 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 유전자와 염기 쌍형성된 경우의 유전자 상의 위치로부터 (3' 말단을 향해) 21개 뉴클레오티드 하류인 위치와 정렬되는 경우에 유전자 상의 특정 위치에서 DUX4 유전자를 표적화하도록 설계된다. 예를 들어, 본원의 표 1 및 2에 예시된 바와 같이, 위치 408에서 DUX4 유전자를 표적화하도록 설계된 안티센스 가닥 서열은 유전자와 염기 쌍형성하는 경우 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기가 DUX4 유전자의 위치 428과 정렬되는 것을 요구한다.
본원에 제공된 바와 같이, 본원에 개시된 구체적 실시양태에 대해, DUX4 RNAi 작용제는 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥 및 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재하는 한, 안티센스 가닥의 위치 1 (5' → 3')의 핵염기가 유전자에 상보적인 것을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, DUX4 유전자의 위치 408을 표적화하도록 설계된 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 경우에, DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 유전자의 위치 428과 정렬되어야 하지만; 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드의 코어 스트레치 서열에 걸쳐 안티센스 가닥 및 유전자의 적어도 85% 상보성 (예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상보성)이 존재한다면, 안티센스 가닥의 5' 말단 핵염기는 DUX4 유전자의 위치 428에 상보적일 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 특히 본원에 개시된 다양한 예에 의해 나타낸 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥에 의한 유전자의 특이적 결합 부위 (예를 들어, DUX4 RNAi 작용제가 위치 408, 위치 1437 또는 일부 다른 위치에서 DUX4 유전자를 표적화하도록 설계되는지)는 DUX4 RNAi 작용제에 의해 달성되는 억제의 수준에 중요하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 표 1에 나타낸 DUX4 서열의 위치에서 또는 그 부근에서 DUX4 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 1에 개시된 표적 DUX4 19량체 서열에 완전히, 실질적으로 또는 적어도 부분적으로 상보적인 코어 스트레치 서열을 포함한다.
표 1. DUX4 19량체 mRNA 표적 서열 (호모 사피엔스 이중 호메오박스 4, 전사 변이체 2, 진뱅크 NM_001293798.2로부터 취함)
Figure pct00002
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5'→3')의 위치 19가 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 1과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5'→3')의 위치 1이 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 19와 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2가 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥 (5' → 3')의 위치 2 내지 18이 표 1에 개시된 19량체 표적 서열의 위치 18 내지 2에 위치한 각각의 상보적 염기 각각과 염기 쌍을 형성할 수 있는 안티센스 가닥을 포함한다.
본원에 개시된 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 DUX4 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 DUX4 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 센스 가닥은 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 1-17, 1-18, 또는 2-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함하는 센스 가닥으로 구성된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 하기 표 2에 나타낸 코어 19량체 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표 2. DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥 및 센스 가닥 코어 스트레치 염기 서열 (N=임의의 핵염기)
Figure pct00003
Figure pct00004
표 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것을 포함하거나 이로 이루어진 센스 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 DUX4 RNAi 작용제는 모두 또는 실질적으로 모두 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 2의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 2의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, 표 2에 개시된 서열에 열거된 각각의 N은 임의의 및 모든 핵염기 (변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 둘 다에서 발견되는 것들 포함)로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적인 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드에 상보적이지 않은 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 동일한 핵염기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표 2에 개시된 서열에 열거된 N 뉴클레오티드는 다른 가닥 상의 상응하는 위치에서의 N 뉴클레오티드와 상이한 핵염기를 갖는다.
특정의 변형된 DUX4 RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥이 표 3 및 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에서 제공된다. 변형된 DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 3에 제공된다. 변형된 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥, 뿐만 아니라 그의 기저 비변형된 핵염기 서열이 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 및 5.4에 제공된다. DUX4 RNAi 작용제를 형성하는 데 있어서, 상기 표 3 및 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4, 뿐만 아니라 표 2에 열거된 각각의 기저 염기 서열 내의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링함으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2, 표 3 또는 표 5.4에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단 2개의 서열이 인접 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 2, 표 3, 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 서열 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 핵염기 서열을 갖는 듀플렉스를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
변형된 뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 가닥의 예가 표 3에서 제공된다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 센스 가닥의 예가 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에서 제공된다.
표 3 및 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 및 5.4에 사용된 바와 같이, 하기 표기법이 변형된 뉴클레오티드, 표적화 기 및 연결기를 나타내는 데 사용된다:
A = 아데노신-3'-포스페이트
C = 시티딘-3'-포스페이트
G = 구아노신-3'-포스페이트
U = 우리딘-3'-포스페이트
I = 이노신-3'-포스페이트
a = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트
as = 2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트
c = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트
cs = 2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트
g = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트
gs = 2'-O-메틸구아노신-3'-포스포로티오에이트
i = 2'-O-메틸이노신-3'-포스페이트
is = 2'-O-메틸이노신-3'-포스포로티오에이트
t = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스페이트
ts = 2'-O-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
u = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트
us = 2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Af = 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트
Afs = 2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트
Cf = 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트
Cfs = 2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트
Gf = 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트
Gfs = 2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트
Tf = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스페이트
Tfs = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트
Uf = 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트
Ufs = 2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트
dT = 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트
AUNA= 2',3'-세코-아데노신-3'-포스페이트
AUNAs = 2',3'-세코-아데노신-3'-포스포로티오에이트
CUNA = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스페이트
CUNAs = 2',3'-세코-시티딘-3'-포스포로티오에이트
GUNA= 2',3'-세코-구아노신-3'-포스페이트
GUNAs = 2',3'-세코-구아노신-3'-포스포로티오에이트
UUNA = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스페이트
UUNAs = 2',3'-세코-우리딘-3'-포스포로티오에이트
a_2N = 표 6.1 참조
a_2Ns = 표 6.1 참조
(invAb) = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'-포스페이트, 표 6.1 참조
(invAb)s = 역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조
s = 포스포로티오에이트 연결
p = 말단 포스페이트 (합성된 바와 같음)
vpdN = 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드
cPrpa = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트 (표 6.1 참조)
cPrpas = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸아데노신-3'- 포스포로티오에이트 (표 6.1 참조)
cPrpu = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트 (표 6.1 참조)
cPrpus = 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트 (표 6.1 참조)
aAlk = 2'-O-프로파르길아데노신-3'-포스페이트, 표 6.1 참조
aAlks = 2'-O-프로파르길아데노신-3'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조
cAlk = 2'-O-프로파르길시티딘-3'-포스페이트, 표 6.1 참조
cAlks = 2'-O-프로파르길시티딘-3'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조
gAlk = 2'-O-프로파르길구아노신-3'-포스페이트, 표 6.1 참조
gAlk = 2'-O-프로파르길구아노신-3'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조
tAlk = 2'-O-프로파르길-5-메틸우리딘-3'-포스페이트, 표 6.1 참조
tAlk = 2'-O-프로파르길-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조
uAlk = 2'-O-프로파르길우리딘-3'-포스페이트, 표 6.1 참조
uAlks = 2'-O-프로파르길우리딘-3'-포스포로티오에이트, 표 6.1 참조.
(Alk-SS-C6) = 표 6.1 참조
(C6-SS-Alk) = 표 6.1 참조
(C6-SS-C6) = 표 6.1 참조
(6-SS-6) = 표 6.1 참조
(C6-SS-Alk-Me) = 표 6.1 참조
(NH2-C6) = 표 6.1 참조
(Alk-cyHex) = 표 6.1 참조
(Alk-cyHex)s = 표 6.1 참조
관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해할 바와 같이, 서열에 의해 (예컨대, 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결 "s"에 의해) 달리 나타내지 않는 한, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함은 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체한다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 올리고뉴클레오티드 서열의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드가 전형적으로 주어진 단량체의 각각의 3' 위치에 생체외 포스페이트 모이어티 대신에 히드록실 (-OH) 기를 가질 것임을 용이하게 이해할 것이다. 더욱이, 통상의 기술자가 용이하게 이해하고 인지할 바와 같이, 본원에 도시된 포스포로티오에이트 화학 구조는 전형적으로 황 원자 상에 음이온을 나타내지만, 본원에 개시된 발명은 모든 포스포로티오에이트 호변이성질체 (예를 들어, 황 원자가 이중-결합을 갖고 음이온이 산소 원자 상에 있는 경우)를 포괄한다. 본원에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이러한 이해는 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제 및 DUX4 RNAi 작용제의 조성물을 기재하는 경우에 사용된다.
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제와 함께 사용된 표적화 기 및 연결기의 특정 예는 하기 표 6.1에 제공된 화학 구조에 포함된다. 각각의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 접합된, 본원에 열거된 임의의 표적화 기 또는 연결기, 뿐만 아니라 다른 표적화 또는 연결기를 가질 수 있다.
표 3. DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
표 4.1. DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00007
(A2N)은 2-아미노아데닌 뉴클레오티드를 나타내고; I는 이노신 (하이포크산틴) 뉴클레오티드를 나타낸다.
상기 표 4.1에 나타낸 바와 같이, 예시적인 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 5' 말단 단부 및 3' 말단 단부 둘 다에 반응성 연결기를 추가로 포함하는 것으로 나타낸다. 예를 들어, 상기 표 4.1에 나타낸 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 (NH2-C6) 연결기를 갖는다. 유사하게, 상기 표 4.1에 나타낸 DUX4 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 부근에 (C6-SS-C6) 연결기를 갖는다. 이러한 반응성 연결기는 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제에 대한 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 PK/PD 조정제의 연결을 용이하게 하도록 위치한다. 연결 또는 접합 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원의 본 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 접합 반응은 아미드 커플링 반응, 마이클 첨가 반응, 히드라존 형성 반응, 및 클릭 화학 고리화첨가 반응을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르로서 합성될 수 있고, 이는 아미노 기 (예를 들어, NH2-C6)와 반응하여 표적화 리간드를 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제에 부착시킨다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 예를 들어 클릭 화학 고리화첨가 반응을 통해 프로파르길 또는 DBCO 기에 접합될 수 있는 아지드로서 합성된다.
추가적으로, 표 4.1에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 센스 가닥의 3' 말단 단부의 dT 뉴클레오티드에 이어서 (3' → 5') 링커 (예를 들어, C6-SS-C6)를 갖도록 합성되었다. 적합하고 상업적으로 입수가능한 dT-로딩된 수지를 사용하여 올리고뉴클레오티드 가닥의 합성을 개시할 수 있다. 이어서, (C6-SS-C6) 링커는, 일부 실시양태에서, 추가의 성분, 예컨대, 예를 들어 PK/PD 조정제 또는 1개 이상의 표적화 리간드에 대한 연결을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, C6-SS-C6은 먼저 무엇보다도 분자로부터 dT 잔기의 절단을 감소시키고, 이는 이어서 목적하는 PK/PD 조정제의 접합을 용이하게 할 수 있다. 하기 표 4.2는 상기 표 4.1에서 확인되지만 3' 말단 dT 뉴클레오티드를 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열을 제시하며, 이는 이들이 생체내 전달되는 경우에 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 서열을 적절하게 반영하기 때문이다.
추가로, 하기 표 4.3은 상기 표 4.1에서 확인되지만 말단 연결기가 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열 (즉, 캡핑기만을 갖는 뉴클레오티드 서열)을 나타낸다.
표 4.2. 3' 말단 dT 없이 나타낸 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00008
(A2N)은 2-아미노아데닌 뉴클레오티드를 나타내고; I는 이노신 (하이포크산틴) 뉴클레오티드를 나타낸다.
표 4.3. 말단 연결기 없이 나타낸 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열
Figure pct00009
(A2N)은 2-아미노아데닌 뉴클레오티드를 나타내고; I는 이노신 (하이포크산틴) 뉴클레오티드를 나타낸다.
표 4.4. 변형된 뉴클레오티드 서열로서만 나타낸 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열 (말단 연결기 또는 역전된 무염기성 캡핑 모이어티 없음)
Figure pct00010
(A2N)은 2-아미노아데닌 뉴클레오티드를 나타내고; I는 이노신 (하이포크산틴) 뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 표적화 리간드 및/또는 PK/PD 조정제가 RNAi 작용제에 연결되거나 또는 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 (또는 표적화 기) 및/또는 PK/PD 조정제는 센스 가닥의 5' 말단, 센스 가닥의 3' 말단, 및/또는 1개 이상의 내부 뉴클레오티드에 연결된다. 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 합성은 반응성 기가 추가의 성분, 예컨대 표적화 리간드 또는 PK/PD 조정제에 대한 연결을 용이하게 하는 데 용이하게 이용가능하도록 설계될 수 있다. 하기 표 4.5는 1종 이상의 표적화 리간드 및/또는 PK/PD 조정제 (집합적으로, Z로서 하기에 나타냄)에 연결된 후의 표 4.1에 상기 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥을 도시한다. 약리학적 모이어티는 하기 실시예 1에 기재된 반응을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제에 연결된다. 표적화 리간드에 대한 접합 후에, 연결기는 구조 (NH-C6), (NH-C6)s 또는 (C6-S)를 가질 수 있으며, 이들 각각의 구조는 하기 표 6.1에 나타낸다.
표 4.5. 표적화 리간드 및/또는 PK/PD 조정제 위치를 나타내는 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열 (Z = 약리학적 모이어티 (예를 들어, 표적화 리간드, 표적화 기, 및/또는 PK/PD 조정제))
Figure pct00011
표 4.6. 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 표적화 리간드 및 3' 말단 단부에 연결된 PK/PD 조정제를 나타내는 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥 서열. (TL = 표적화 리간드; PK = PK/PD 조정제))
Figure pct00012
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제는 안티센스 가닥을 센스 가닥과 어닐링함으로써 형성된다. 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있으며, 단 2개의 서열이 인접 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥은 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것과 0, 1, 2, 또는 3개 뉴클레오티드만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2, 표 3, 또는 표 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24, 또는 2-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 3의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단에서 → 3' 말단) 1-17, 2-17, 3-17, 4-17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4-19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21, 4-21, 1-22, 2-22, 3-22, 4-22, 1-23, 2-23, 3-23, 4-23, 1-24, 2-24, 3-24, 또는 4-24의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 변형된 서열 중 어느 하나의 변형된 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 DUX4 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 DUX4 유전자에 비-상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT (또는 그의 변형된 버전)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 (5' 말단 → 3' 말단)의 위치 1의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 A:U 또는 U:A 염기 쌍을 형성한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제 안티센스 가닥은 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 센스 가닥은 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 (i) 표 2 또는 표 3의 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 2-18 또는 2-19의 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 및 (ii) 표 2 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 5.4의 센스 가닥 서열 중 임의의 것의 뉴클레오티드 (5' 말단 → 3' 말단) 1-17 또는 1-18의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
표 2 또는 표 4에 열거된 서열을 함유하는 센스 가닥은 표 2 또는 표 3에 열거된 서열을 함유하는 임의의 안티센스 가닥에 혼성화될 수 있고, 단 2개의 서열이 인접한 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 적어도 85% 상보성의 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 센스 가닥 및 표 3 또는 표 5.4의 변형된 서열 중 임의의 것의 변형된 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖는다. 특정의 대표적인 서열 쌍은 표 5.1, 5.2, 5.3, 및 5.4에 나타낸 듀플렉스 ID 번호에 의해 예시된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 본원에 나타낸 듀플렉스 식별 번호 중 어느 하나에 의해 나타내어지는 듀플렉스를 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 본원에 나타낸 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것에 의해 나타내어지는 듀플렉스 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 본원에 나타낸 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것에 의해 나타내어지는 듀플렉스 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 및 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 연결기를 포함하며, 여기서 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다 (즉, 접합된다). 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 본원에 나타낸 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 본원에 나타낸 듀플렉스 식별 번호 중 임의의 것의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 변형된 뉴클레오티드 서열 및 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 연결기를 포함하며, 여기서 표적화 리간드, 표적화 기 및/또는 연결기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 공유 연결된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 2 또는 표 5.1 (또는 표 5.2, 표 5.3, 또는 표 5.4)의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 표적화 기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 5.1 (또는 표 5.2, 또는 5.3, 또는 표 5.4)의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 수용체 리간드 표적화 기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 5.1, 5.2, 5.3, 또는 5.4의 안티센스 가닥/센스 가닥 듀플렉스 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 각각 표 6.1에 정의된 바와 같은 (NH2-C6), (C6-NH2), (C6-SS-C6), 또는 (6-SS-6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 연결기를 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 3 또는 표 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 또는 5.4의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 5.1 (또는 표 5.2, 5.3 또는 5.4) 듀플렉스 중 임의의 것의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 인테그린 표적화 기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 5.1 (또는 표 5.2, 5.3, 또는 5.4)의 듀플렉스 중 임의의 것을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
표 5.1. 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00013
표 5.2. 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드 서열에 대한 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 및 서열 ID 번호를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00014
Figure pct00015
* 변형된 SS 서열은 표 4.2로부터 취한다 (제조성을 위해 첨가된 말단 dT 없이 나타냄).
표 5.3. DUX4 유전자 상에 표적화된 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 ID 번호 참조 위치를 갖는 DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스
Figure pct00016
본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 듀플렉스화 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열은 특정 표적화 리간드 및/또는 PK/PD 조정제에 연결될 수 있다. 특정의 예시적인 표적화 리간드 및/또는 PK/PD 조정제는 완전 접합된 듀플렉스를 나타내고 "AC" 식별 접두어를 갖는 하기 표 5.4에 나타낸 바와 같이 연결되었다.
표 5.4. 화학적으로 변형된 안티센스 및 센스 가닥을 갖는 접합체 ID 번호 (링커 및 접합체 포함)
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 염, 혼합 염, 유리-산 또는 유리 염기로서 제조되거나 또는 제공된다. 일부 실시양태에서, XDH RNAi 작용제는 제약상 허용되는 염으로서 제조된다. 일부 실시양태에서, XDH RNAi 작용제는 제약상 허용되는 나트륨 염으로서 제조된다. 관련 기술분야에 널리 공지된 이러한 형태는 본원에 개시된 본 발명의 범주 내에 있다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는 DUX4 유전자를 발현하는 세포에 전달 시, 생체내 및/또는 시험관내에서 1개 이상의 DUX4 유전자의 발현을 억제하거나 또는 녹다운시킨다.
일부 실시양태에서, 상이한 서열을 갖는 적어도 2종의 DUX4 RNAi 작용제의 조합 또는 칵테일을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 DUX4 RNAi 작용제는 각각 개별적으로 및 독립적으로 표적화 기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 DUX4 RNAi 작용제는 각각 표적화 리간드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 표적화 기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 DUX4 RNAi 작용제는 각각 표적화 기에 연결된다.
표적화 기, 연결기, 및 전달 비히클
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표적화 기, 연결기, 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 기를 함유하거나 또는 그에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 표적화, 전달 또는 부착을 증진시킬 수 있다. 연결기의 예는 표 6.1에 제공되고, 표적화 기 또는 표적화 리간드의 예는 표 6.2 및 6.3에 제공된다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 비-뉴클레오티드 기는 링커/연결기를 통해 RNAi 작용제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 불안정성, 절단성 또는 가역성 결합 또는 링커를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착된 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 증진시킨다.
표적화 기 또는 표적화 리간드는 이들이 부착되어 있는 접합체 또는 RNAi 작용제의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체 또는 RNAi 작용제의 세포-특이적 (일부 경우에, 기관 특이적 포함) 분포 및 세포-특이적 (또는 기관 특이적) 흡수를 개선시킨다. 표적화 기는 그것이 지시되는 표적에 대해 1가, 2가, 3가, 4가일 수 있거나, 또는 보다 높은 원자가를 가질 수 있다. 대표적인 표적화 기는, 비제한적으로, 세포 표면 분자에 대한 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대한 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커, 예컨대 PEG 링커, 또는 일부 경우에 링커로서의 역할을 할 수 있는 1, 2 또는 3개의 무염기성 및/또는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기를 사용하여 RNAi 작용제에 연결된다.
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제는 5'-말단 및/또는 3'-말단에 반응성 기, 예컨대 아미노 기 (본원에서 아민으로도 지칭됨)를 갖도록 합성될 수 있다. 반응성 기는 후속적으로 관련 기술분야에 전형적인 방법을 사용하여 표적화 모이어티를 부착시키는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 NH2-C6 기 (본원에서 변형된 서열에서 (NH2-C6)로 나타내어짐)를 갖도록 합성된다. 후속적으로 말단 아미노 기를 반응시켜, 예를 들어 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 1개 이상의 알킨를 갖도록 합성된다. 후속적으로 말단 알킨 기(들)를 반응시켜, 예를 들어 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 2개 이상의 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 RNAi 작용제 상의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "두자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 2개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "세자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 3개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 "네자리" 표적화 기로 지칭되는, 함께 연결된 4개의 표적화 리간드로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드의 사용은 그의 각각의 표면 상에 목적하는 수용체를 갖는 세포에 대한 세포-특이적 표적화를 용이하게 하고, 표적화 리간드의 결합은 그가 연결된 치료제, 예컨대 RNAi 작용제의 세포, 예컨대 골격근 세포 내로의 진입을 용이하게 할 수 있다. 표적화 리간드는 단량체성 또는 1가 (예를 들어, 단일 표적화 모이어티를 가짐) 또는 다량체성 또는 다가 (예를 들어, 다중 표적화 모이어티를 가짐)일 수 있다. 표적화 기는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 RNAi 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 DUX4 RNAi 작용제를 골격근 세포에 생체내 전달하기 위한 제약 조성물을 포함한다. 이러한 제약 조성물은, 예를 들어 표적화 리간드를 포함하는 표적화 기에 접합된 DUX4 RNAi 작용제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 하기 조직 중 하나 이상에서 DUX4 유전자 발현을 감소시킬 수 있다: 척추주위, 안면, 몸통, 복부, 및 예를 들어 삼두근, 이두근, 사두근, 흉근, 비복근, 가자미근, 교근, EDL (장지신근), TA (전경골근), 승모근 및/또는 횡경막에서의 것을 포함한 사지 근육 조직.
일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제에 접합된다. 연결기는 표적화 기, 약동학적 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클에 대한 작용제의 공유 연결을 용이하게 한다. 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥에 연결된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 연결기의 예는 C6-SS-C6, 6-SS-6, 반응성 기 예컨대 1급 아민 (예를 들어, NH2-C6) 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 잔기/뉴클레오티드, 아미노산, 트리-알킨 관능화된 기, 리비톨, 및/또는 PEG 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커 또는 연결기는 1개의 화학적 기 (예컨대 RNAi 작용제) 또는 관심 절편을 또 다른 화학적 기 (예컨대 표적화 기, 약동학적 조정제, 또는 전달 중합체) 또는 관심 절편에 1개 이상의 공유 결합을 통해 연결하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 불안정성 연결은 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 연결에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기 및 아르알키닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 이들 각각은 1개 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 상기 목록은 설명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 기는 추가의 링커의 사용 없이 DUX4 RNAi 작용제에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 존재하는 링커를 용이하게 갖도록 설계되어 DUX4 RNAi 작용제에 대한 연결을 용이하게 하였다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2종 이상의 RNAi 작용제는 동일한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2종 이상의 RNAi 작용제는 상이한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결된다.
표 2, 3, 및 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에 열거된 DUX4 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것은, 변형되든 또는 변형되지 않든, 3' 및/또는 5' 표적화 기(들), 연결기(들), 및/또는 약동학적 조정제(들)를 함유할 수 있다. 3' 또는 5' 표적화 기, 연결기, 또는 약동학적 조정제를 함유하는, 표 3 및 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 및 5.4에 열거되거나 본원에 달리 기재된 임의의 DUX4 RNAi 작용제 서열은 대안적으로 3' 또는 5' 표적화 기, 연결기, 또는 PK/PD 조정제를 함유하지 않을 수 있거나, 또는 표 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 또는 6.7에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 3' 또는 5' 표적화 기, 연결기, 또는 PK/PD 조정제를 함유할 수 있다. 표 5.1 (또는 표 5.2, 5.3 또는 5.4)에 열거된 임의의 DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스는, 변형되든 또는 변형되지 않든, 표 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 또는 6.7에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표적화 기, 연결기 또는 PK/PD 조정제를 추가로 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서 표적화 기, 연결기 및/또는 PK/PD 조정제는 DUX4 RNAi 작용제 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
특정의 변형된 뉴클레오티드 및 연결기의 예가 표 6.1에 제공된다.
표 6.1. 다양한 변형된 뉴클레오티드 및 연결기를 나타내는 구조
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대안적으로, 관련 기술분야에 공지된 다른 연결기가 사용될 수 있다. 다수의 경우에서, 연결기는 상업적으로 입수될 수 있거나, 또는 대안적으로 상업적으로 입수가능한 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 내로 혼입된다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제에 연결된다. 특정 표적화 리간드의 예는 표 6.2에 제공된다:
표 6.2. 표적화 리간드를 나타내는 구조
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또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서
Figure pct00036
는 DUX4 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다. 일부 실시양태에서, PEG 또는 다른 연결기가 RNAi 작용제와 표적화 리간드 사이에 혼입된다.
일부 실시양태에서, 표 6.2의 표적화 기는 본원에 개시된 RNAi 작용제에 대한 1개 이상의 표적화 기를 포함하는 표적화 리간드의 효율적인 커플링을 가능하게 하는 반응성 기를 갖도록 합성된다. 일부 실시양태에서, 표 6.2에서 확인된 표적화 기는 아지드로서 합성되어 RNAi 작용제에 대한 연결을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 표 6.3에 개시된 구조를 갖는 표적화 리간드에 연결된다:
표 6.3. DUX4 RNAi 작용제와의 조합을 위한 예시적인 표적화 리간드.
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또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서
Figure pct00043
는 DUX4 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 RNAi 작용제를 세포 또는 조직에 전달하는데 사용될 수 있다. 전달 비히클은 RNAi 작용제의 세포 또는 조직으로의 전달을 개선시키는 화합물이다. 전달 비히클은 중합체, 예컨대 양친매성 중합체, 막 활성 중합체, 펩티드, 멜리틴 펩티드, 멜리틴-유사 펩티드 (MLP), 지질, 가역적으로 변형된 중합체 또는 펩티드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민을 포함할 수 있거나 또는 이로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, DPC 또는 핵산 전달을 위해 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi 작용제는 또한 표적화 기, 지질 (콜레스테릴 및 콜레스테릴 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 나노입자 내 캡슐화, 리포솜, 미셀, 중합체 또는 DPC에 대한 접합 (예를 들어 WO 2000/053722, WO 2008/022309, WO 2011/104169, 및 WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에, 이온영동에 의해, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다른 전달 비히클 또는 시스템, 예컨대 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 생체접착성 마이크로구체 또는 단백질성 벡터 내로의 혼입에 의해 화학적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 골격근 세포에 대한 친화도를 갖는 항체에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 골격근 세포 또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖는 표적화 리간드에 연결될 수 있다.
약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 또는 대안적으로 1종 이상의 PK/PD 조정제에 연결된다. 본원에 개시된 RNAi 작용제와 함께 사용하기에 적합한 특정 약역학적/약동학적 (PK/PD) 조정제의 예가 표 6.4에 제공된다. 표 6.4에서, PK/PD 조정제는 나타낸 상업적 공급업체로부터 획득하였고, 달리 상업적으로 입수가능한 물질을 사용하여 합성하였다:
표 6.4 예시적인 PK/PD 조정제 화합물
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Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
일부 실시양태에서, 표 6.4의 PK/PD 조정제는 DUX4 RNAi 작용제에 대한 접합 후에 표 6.5에 나타낸 바와 같은 하기 구조를 갖는다:
표 6.5. DUX4 RNAi 작용제에 접합된 예시적인 PK/PD 조정제.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
또는 그의 제약상 허용되는 염, 여기서
Figure pct00056
는 DUX4 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제에 접합될 수 있는 PK/PD 조정제는 표 6.6의 PK/PD 조정제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
표 6.6: DUX4 RNAi 작용제에 접합시키기 위한 예시적인 PK/PD 조정제 (화합물 번호는 구조 앞에 나타냄).
Figure pct00057
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Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
일부 실시양태에서, 표 6.6의 PK/PD 조정제는 DUX4 RNAi 작용제에 대한 접합 후에 표 6.7에 나타낸 바와 같은 하기 구조를 갖는다:
표 6.7. DUX4 RNAi 작용제와 함께 사용하기 위한 예시적인 PK/PD 조정제
Figure pct00068
Figure pct00069
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Figure pct00077
Figure pct00078
여기서 RZ는 DUX4 RNAi 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 1종 이상의 PK/PD 조정제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7종 또는 그 초과의 PK/PD 조정제를 포함한다.
PK/PD 조정제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제에 접합될 수 있다. 여러 PK/PD 조정제 (상기 것들 중 몇몇 포함)는 상업적으로 입수가능하다. 일부 실시양태, 예컨대 표 6.4에 나타낸 화합물 중 몇몇에서, PK/PD 조정제는 말레이미드 모이어티를 포함할 수 있고, 디술피드 연결을 포함하는 RNAi 작용제와 반응하여 PK/PD 조정제를 포함하는 RNAi 작용제를 형성할 수 있다. 디술피드는 환원되고, 마이클-첨가 반응에 의해 말레이미드에 첨가될 수 있다. 예시적인 반응식을 하기에 나타내고:
Figure pct00079
여기서 RZZ는 RNAi 작용제를 포함하고,
Figure pct00080
는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기에 대한 연결 지점을 나타낸다. 상기 반응식의 일부 예에서,
Figure pct00081
는 알킬 기, 예컨대 헥실 (C6H13)에 부착된다.
일부 실시양태에서, PK/PD 조정제 전구체는 술폰 모이어티를 포함할 수 있고, 디술피드와 반응할 수 있다. 예시적인 반응식을 하기에 나타내고:
Figure pct00082
여기서 RZZ는 RNAi 작용제를 포함하고,
Figure pct00083
는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기에 대한 연결 지점을 나타낸다. 상기 반응식의 일부 예에서,
Figure pct00084
는 알킬 기, 예컨대 헥실 (C6H13)에 부착된다.
일부 실시양태에서, PK/PD 조정제 전구체는 아지드 모이어티를 포함할 수 있고, 하기 반응식에 따라 알킨을 포함하는 RNAi 작용제와 반응시켜 RNAi 작용제에 접합된 PK/PD 조정제를 포함하는 화합물을 형성할 수 있다:
Figure pct00085
여기서 RZZ는 RNAi 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, PK/PD 조정제 전구체는 알킨 모이어티를 포함할 수 있고, 하기 반응식에 따라 디술피드를 포함하는 RNAi 작용제와 반응시켜 RNAi 작용제에 접합된 PK/PD 조정제를 포함하는 화합물을 형성할 수 있다:
Figure pct00086
여기서 RZZ는 RNAi 작용제를 포함하고,
Figure pct00087
는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기에 대한 연결 지점을 나타낸다. 상기 반응식의 일부 예에서,
Figure pct00088
는 알킬 기, 예컨대 헥실 (C6H13)에 부착된다.
일부 실시양태에서, PK/PD 조정제는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 말단, 또는 DUX4 RNAi 작용제의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 말단에서 디술피드-함유 모이어티를 갖도록 합성되고, PK/PD 조정제는 상기 나타낸 일반적 합성 반응식을 사용하여 센스 가닥의 3' 말단에 접합될 수 있다.
제약 조성물 및 제제
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 제약 조성물 또는 제제 (본원에서 "의약"으로도 지칭됨)로서 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 DUX4 RNAi 작용제를 포함한다. 이들 제약 조성물은 표적 세포, 세포 군, 조직 또는 유기체에서의 DUX4 mRNA의 발현의 억제에 특히 유용하다. 제약 조성물은 표적 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료될 질환은 FSHD1 및 FSHD2를 포함한 FSHD이다. 제약 조성물은 표적 mRNA의 수준의 감소 또는 표적 유전자의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 치료될 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 표적화 리간드에 연결된 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 (비히클, 담체, 희석제 및/또는 전달 중합체 포함)는 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물에 첨가되어, 인간을 포함한 대상체로의 생체내 전달에 적합한 제약 제제 또는 의약을 형성한다.
일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제 중 1종 이상은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에서 포유동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 1종 이상의 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통해), 및 실질내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물 및 본원에 개시된 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제를 투여함으로써 대상체에서 DUX4 mRNA의 발현을 억제하는 것을 포함하여, 세포, 세포 군, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에서 표적 mRNA의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 적어도 부분적으로 DUX4 발현에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 확인되거나 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1개 이상의 세포 또는 조직에서 DUX4 단백질 수준의 감소로부터 이익을 얻을 상태, 질환 또는 장애를 갖는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 1종 이상의 골격근 질환, 예컨대 FSHD, 예컨대 FSHD1 또는 FSHD2를 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1개 이상의 골격근 질환과 연관된 증상을 앓고 있었다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 기재된 제약 조성물은 DUX4의 발현의 억제로부터 이익을 얻을 대상체에서 임상 제시를 치료 또는 관리하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 치료 또는 예방 유효량의 제약 조성물 중 1종 이상은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 임의의 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 투여는 대상체에서 질환의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 기재된 제약 조성물은 DUX4 mRNA의 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 1종의 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 치료 유효량의 1종 이상의 제약 조성물을 투여함으로써 증상을 치료한다.
투여 경로는 DUX4 RNAi 작용제가 신체와 접촉되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위해 약물, 올리고뉴클레오티드 및 핵산을 투여하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 특정한 경로에 적절하게 맞춰진 제제에서 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 정맥내로, 근육내로, 피내로, 피하로, 관절내로 또는 복강내로, 또는 국소로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 세포, 세포 군, 조직 또는 대상체에게 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 (시험관내 또는 생체내) 전달하기 위해 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 적합한 방법은 본원에 기재된 조성물과 함께 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 전달은 국부 투여 (예를 들어, 직접 주사, 이식, 또는 국소 투여), 전신 투여, 또는 피하, 정맥내, 복강내, 또는 비경구 경로, 예컨대 두개내 (예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 척수강내), 근육내, 경피, 기도 (에어로졸), 비강, 경구, 직장, 또는 국소 (협측 및 설하 포함) 투여에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 투여를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 본원에 기재된 제약 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, SQ 또는 IV 투여에 적합한 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 제약 제제는 수성 인산나트륨 완충제 (예를 들어, 물 중 0.5 mM 일염기성 인산나트륨, 0.5 mM 이염기성 인산나트륨 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제) 중에서 제조될 수 있다.
본원에 사용된 제약 조성물 또는 의약은 약리학적 유효량의 기재된 치료 화합물 중 적어도 1종 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는 활성 제약 성분 (API, 치료 제품, 예를 들어 DUX4 RNAi 작용제)이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공을 보조하고/거나, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 허용성을 보호, 지지 또는 증진시키고/거나, c) 제품 확인을 보조하고/거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전달의 전체 안전성, 유효성의 임의의 다른 속성을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 또는 불활성 물질이 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 전달 중합체, 세제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 계면활성제, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 등장화제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor)® EL™ (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에서, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 필터 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정질 형태, 예를 들어 수성 미세결정질 현탁액 형태일 수 있는 약물의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포솜 제제 또는 생분해성 중합체 시스템은 또한 관절내 및 안구 투여 둘 다를 위한 약물을 제시하는 데 사용될 수 있다.
활성 화합물은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 리포솜 현탁액은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
DUX4 RNAi 작용제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 조성물 중에 제제화될 수 있다. 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제, 진통제, 항히스타민제 또는 항염증제 (예를 들어, 아세트아미노펜, NSAID, 디펜히드라민 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 정의된 RNAi 작용제를 발현하거나 포함하는 세포, 조직 또는 단리된 기관이 "제약 조성물"로서 사용될 수 있는 것으로 또한 구상된다. 본원에 사용된 "약리학적 유효량", "치료 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 RNAi 작용제의 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 RNAi 작용제를 투여하는 것에 더하여 제2 치료제 또는 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 또 다른 DUX4 RNAi 작용제 (예를 들어, DUX4 표적 내의 상이한 서열을 표적화하는 DUX4 RNAi 작용제)이다. 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및/또는 압타머일 수 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제의 유효량은 약 0.0001 내지 약 20 mg/kg 체중/용량, 예를 들어 약 0.5 내지 약 10 mg/kg 체중/용량의 범위일 것이다. 투여되는 양 및 투여 빈도 (예를 들어, 매일, 격주, 매주, 매월, 분기마다, 또는 반년마다)는 아마도 환자의 전반적 건강 상태, 전달되는 화합물의 상대적 생물학적 효능, 약물의 제제, 제제 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 것이다. 또한, 투여되는 초기 투여량이 상기 상위 수준을 넘어 증가되어 목적하는 혈액-수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성할 수 있거나, 또는 초기 투여량이 최적보다 더 작을 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
질환의 치료를 위해 또는 질환의 치료를 위한 의약 또는 조성물의 형성을 위해, DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 본원에 기재된 제약 조성물은 부형제와, 또는 제2 또는 다른 RNAi 작용제, 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 펩티드 및/또는 압타머를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2 치료제 또는 치료와 조합될 수 있다.
기재된 DUX4 RNAi 작용제는, 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트에 첨가되는 경우에, 키트, 용기, 팩 또는 분배기 내로 포장될 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물은, 예를 들어 사전-충전된 시린지 또는 바이알에 포장될 수 있다.
치료 방법 및 발현의 억제
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 투여로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물)를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는 DUX4 mRNA의 발현의 감소 및/또는 억제로부터 이익을 얻을 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 작용제는, 예를 들어 FSHD1 및 FSHD2를 포함한 FSHD를 포함하나 이에 제한되지는 않는 DUX4 단백질 수준의 감소로부터 대상체가 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상체의 치료는 치유적 및/또는 예방적 치료를 포함할 수 있다. 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 1개 이상의 DUX4 RNAi 작용제를 투여한다. 대상체는 인간, 환자, 또는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 성인, 청소년, 소아 또는 유아일 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물의 투여는 인간 또는 동물에게 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제는 대상체에서 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준에 의해 매개되는 적어도 하나의 증상을 치료하는데 사용된다. 대상체에게 치료 유효량의 임의의 1개 이상의 기재된 DUX4 RNAi 작용제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 예방 유효량의 임의의 1개 이상의 기술된 RNAi 작용제가 투여되고, 이에 의해 적어도 하나의 증상을 예방 또는 억제함으로써 대상체를 치료한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 부분적으로 DUX4 유전자 발현에 의해 매개되는 질환, 장애, 상태 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 임의의 DUX4 RNAi 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기 질환, 장애, 상태 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 대상체에서 임상적 제시 또는 병리학적 상태를 치료 또는 관리하는 데 사용되며, 여기서 임상적 제시 또는 병리학적 상태는 적어도 부분적으로 DUX4 발현에 의해 매개된다. 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제 또는 DUX4 RNAi 작용제-함유 조성물 중 1개 이상을 투여한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제를 포함하는 조성물을 치료할 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여되는 대상체의 특정 골격근 세포에서의 DUX4 유전자의 유전자 발현 수준 또는 mRNA 수준은 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여되는 대상체의 DUX4 단백질 수준은 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 대상체에서의 유전자 발현 수준, 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 조직 및/또는 다른 유체에서 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 대상체의 특정 골격근 세포 또는 골격근 조직에서의 DUX4 mRNA 수준은 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 대상체의 골격근 세포 및/또는 골격근 조직에서의 DUX4 단백질의 수준은 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%만큼 감소된다.
본원에 언급된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 대상체의 DUX4 단백질 수준 및/또는 DUX4 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 조직, 혈액, 및/또는 다른 유체 (예를 들어, 혈청)에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 대상체의 DUX4 mRNA의 수준은 1개 이상의 골격근 세포 또는 골격근 조직에서 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 대상체의 골격근 세포의 하위세트에서의 DUX4 mRNA 및/또는 DUX4 단백질의 수준은 DUX4 RNAi 작용제가 투여되기 전의 대상체 또는 DUX4 RNAi 작용제가 제공되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, DUX4 RNAi 작용제는 하기 근육 조직 중 하나 이상에서 DUX4 유전자 발현을 감소시킬 수 있다: 삼두근, 이두근, 사두근, 비복근, 가자미근, 교근 EDL (장지신근), TA (전경골근), 승모근 및/또는 횡경막.
유전자 발현, mRNA, 및 단백질 수준의 감소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 실시예는 대상체에서 DUX4 단백질 수준 및 DUX4 mRNA 수준을 측정하기 위한 적절한 방식을 제공한다. DUX4 mRNA 수준 및/또는 DUX4 단백질 수준의 감소 또는 감소는 본원에서 집합적으로 DUX4의 감소 또는 감소 또는 DUX4 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키는 것으로 지칭된다. 본원에 제시된 실시예는 DUX4 유전자 발현의 억제를 평가하기 위한 공지된 방법을 예시한다.
세포, 조직, 기관 및 비-인간 유기체
본원에 기재된 DUX4 RNAi 작용제 중 적어도 1종을 포함하는 세포, 조직, 기관 및 비-인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직, 기관 또는 비-인간 유기체는 RNAi 작용제를 세포, 조직, 기관 또는 비-인간 유기체에 전달함으로써 제조된다.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기 비제한적 실시예로 예시된다.
실시예
실시예 1. DUX4 RNAi 작용제의 합성.
본원에 개시된 DUX4 RNAi 작용제를 하기에 따라 합성하였다:
A. 합성. DUX4 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥을 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. 규모에 따라, 머메이드(MerMade)96E® (바이오오토메이션(Bioautomation)), 머메이드12® (바이오오토메이션), 또는 OP 파일럿(OP Pilot) 100 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하였다. 제어된 세공 유리 (CPG, 500 Å 또는 600Å, 미국 펜실베니아주 아스톤 소재의 프라임 신테시스(Prime Synthesis)로부터 수득함)로 제조된 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) (미국 위스콘신주 밀워키)으로부터 구입하였다. 구체적으로, 사용된 2'-O-메틸 포스포르아미다이트는 하기를 포함하였다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유하였다. 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-이노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 글렌 리서치 (Va)로부터 구입하였다. 역전된 무염기성 (3'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시리보스-5'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 켐진스(ChemGenes) (미국 매사추세츠주 윌밍톤)로부터 구입하였다. UNA 포스포르아미다이트는 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-2',3'-세코-아데노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-아세틸-2',3'-세코-시토신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-이소부티릴-2',3'-세코-구아노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 및 5'-(4,4'-디메톡시-트리틸)-2',3'-세코-우리딘, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트를 포함한다. 시클로프로필 포스포네이트 포스포르아미다이트를 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/214112 및 문헌 [Erich F. Altenhafer et al., Synthesis of a novel cyclopropyl phosphonate nucleotide as a phosphate mimic, Chemical Communications (June 2021) (DOI:10.1039/d1cc02328d)]에 따라 합성하였다. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트는 또한 상업적으로 구입하였다 (써모피셔).
B. 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호. 고체상 합성의 종료 후에, 건조된 고체 지지체를 물 중 40 중량% 메틸아민의 1:1 부피 용액 및 28% 내지 31% 수산화암모늄 용액 (알드리치(Aldrich))으로 1.5시간 동안 30℃에서 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에서 재구성하였다 (하기 참조).
C. 정제. 조 올리고머를 TSK겔 슈퍼Q-5PW 13 μm 칼럼 및 시마즈 LC-8 시스템을 사용하여 음이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 20 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH 9.0이고, 20% 아세토니트릴을 함유하였고, 완충제 B는 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 완충제 A와 동일하였다. 260 nm에서의 UV 트레이스를 기록하였다. 적절한 분획을 풀링한 다음, 크기 배제 HPLC 상에서 100mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴 또는 여과수의 구동 완충제를 갖는 미세 세파덱스 G-25로 패킹된 지이 헬스케어 XK 16/40 칼럼을 사용하여 구동시켰다. 대안적으로, 풀링된 분획을 탈염시키고, 접선 유동 여과를 통해 적절한 완충제 또는 용매 시스템으로 교환하였다.
D. 어닐링. 상보적 가닥을 1x PBS (포스페이트-완충 염수, 1x, 코닝(Corning), 셀그로) 중 등몰 RNA 용액 (센스 및 안티센스)을 조합함으로써 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 저장하였다. 1x PBS 중에서 UV-Vis 분광계 상에서 용액 흡광도를 측정함으로써 듀플렉스 농도를 결정하였다. 이어서, 260 nm에서의 용액 흡광도에 전환 인자 및 희석 인자를 곱하여 듀플렉스 농도를 결정하였다. 사용된 전환 인자는 0.050 mg/(mL·cm)이거나 또는 실험적으로 결정되었다.
E. RNAi 작용제; (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산에 대한 접합을 위한 SM45-p의 합성
Figure pct00089
실온에서 N2 (g) 하에 DMF 중 화합물 1 (0.50g)의 용액에 Cs2CO3 (0.94g)를 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.49g)를 천천히 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환율을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex에서 EtOAc (0-70%)의 구배로 정제하였으며, 여기서 생성물은 16% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 오일 (0.35g, 45.0% 수율)을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 323.19 m/z, 관찰치 328.38 m/z.
Figure pct00090
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.35g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.078g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.32g, 94.9% 수율)을 수득하였다. 단리가 필요하지 않았다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 309.17 m/z, 관찰치 309.24 m/z.
Figure pct00091
DMF 중 화합물 1 (0.10g) 및 2 (0.049g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.058g)에 이어서 DIPEA (0.079 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬(CombiFlash)®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM에서 DCM 중 20% MeOH (0-70%)의 구배로 정제하였으며, 여기서 생성물은 23% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.088g, 수율 63.6%)을 수득하였다.
Figure pct00092
DCM 중 화합물 1 (0.088g)의 용액에 실온에서 TFA (0.22 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전한 전환이 확인될 때까지 반응물을 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.10g, 수율 113%)을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 814.41 m/z, 관찰치 814.63 m/z.
Figure pct00093
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.10g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0078g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 담황색 고체 (0.104g, 수율 119%)를 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 800.39 m/z, 관찰치 800.76 m/z.
F. RNAi 작용제에 대한 접합을 위한 활성화-에스테르 골격근 세포 수용체 펩티드 (αvβ6 펩티드 1)의 합성
Figure pct00094
상기 기재된 바와 같이 4.1 mmol 규모로 (0.79 mmol/g) 상에 Fmoc-Peg5-CO2H 예비로딩된 2-Cl-Trt 수지를 이용하여 CS 바이오 펩티드 합성기 상에서 일반적 Fmoc 펩티드 화학을 사용하여 수득한 Arg-Gly-Asp(tBu)-Leu-Ala-Abu-Leu-Cit-Aib-Leu-Peg5-CO2-2-Cl-Trt 수지 1의 변형에 의해 펩티드 1을 제조하였다. 수지로부터의 절단 후, 펩티드 6-2를 테트라플루오로페닐 에스테르 6-3으로 전환시키고, 조 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
조 펩티드 6-3을 탈보호 칵테일 TFA/TIS/H2O= 90:5:5 (80 mL)로 1.5시간 동안 처리하여 최종 탈보호를 수행하였다. 반응 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (700 mL)에 적가하고, 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다. 펠릿을 추가의 메틸 tert-부틸 에테르 (500 mL)로 세척하였다. 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 250 x 50 mm, 10 마이크로미터, 60 mL/분, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30-45% ACN 구배, 실행당 조 물질 대략 1 그램)에 의해 정제하여 순수한 펩티드 6-4 4.25 g을 수득하였다.
G. 표적화 리간드의 접합. 어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 아민 관능화 센스 가닥이 직접적으로 또는 링커 예컨대 알킨 관능화 링커 (예를 들어, 표 6.1에 나타낸 바와 같은 DBCO 또는 링커 1-10)의 사용을 통해 표적화 리간드에 접합되고, 이는 이어서 표적화 리간드(들)에 대한 접합을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.
하기는 일반적으로 DBCO 및 링커 1-10을 포함한 활성화된 에스테르 관능화된 링커의 단일 가닥 또는 어닐링된 듀플렉스에 대한 접합을 기재한다: 아민-관능화된 듀플렉스를 90% DMSO/10% H2O 중에 ~50-70 mg/mL로 용해시켰다. 40 당량 트리에틸아민을 첨가한 후, 3 당량 (L4)을 첨가하였다. 반응을 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. 완결되면, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매계에서 2회 침전시키고, 건조시켰다.
i. 프로파르길 링커에 대한 표적화 리간드의 접합
어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 세자리 알킨 관능화된 센스 가닥을 αvβ6 인테그린 리간드에 접합시킨다. 하기 실시예는 어닐링된 듀플렉스에 대한 αvβ6 인테그린 리간드의 접합을 기재한다: 0.5M 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 0.5M의 Cu(II) 술페이트 5수화물 (Cu(II)SO4·5 H2O) 및 아스코르브산나트륨의 2M 용액의 원액을 탈이온수 중에서 제조하였다. DMSO 중 αvβ6 인테그린 리간드의 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 트리-알킨 관능화 듀플렉스 (3mg, 75 μL, 탈이온수 중 40mg/mL, ~15,000 g/mol)를 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브에, 25 μL의 1M Hepes pH 8.5 완충제를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, DMSO 35 μL을 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. αvβ6 인테그린 리간드를 반응물에 첨가하고 (6 당량/듀플렉스, 2 당량/알킨, ~15 μL), 용액을 볼텍싱하였다. pH 시험지를 사용하여, pH를 체크하고, pH ~8인 것으로 확인하였다. 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에서, 0.5M THPTA 50 μL을 0.5M Cu(II)SO4 · 5 H2O 10uL과 혼합하고, 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후, THPTA/Cu 용액 (7.2 μL, 6 당량 5:1 THPTA:Cu)을 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 그 직후에, 2M 아스코르베이트 (5 μL, 듀플렉스당 50 당량, 알킨당 16.7)를 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 반응물을 비-변성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다.
ii. 아민-관능화 센스 가닥에 대한 표적화 리간드의 접합
상기 표 6.1에 나타낸 바와 같이, 하기 절차를 사용하여 활성화된 에스테르-관능화된 표적화 리간드 예컨대 αvβ6 펩티드 1을 아민, 예컨대 C6-NH2, NH2-C6 또는 (NH2-C6)을 포함하는 아민 관능화된 RNAi 작용제에 접합시킬 수 있다.
어닐링되고 동결건조된 RNAi 작용제를 DMSO 및 10% 물 (v/v%) 중에 25 mg/mL로 용해시켰다. 이어서, 50-100 당량 TEA 및 3 당량의 활성화된 에스테르 표적화 리간드를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 1-2시간 동안 교반되도록 하면서 RP-HPLC-MS (이동상 A: 100 mM HFIP, 14 mM TEA; 이동상 B: 아세토니트릴; 칼럼: 엑스브리지 C18)에 의해 모니터링하였다. 반응이 완결된 후, 아세토니트릴 12 mL에 이어서 PBS 0.4 mL를 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리하였다. 고체 펠릿을 수집하고, 1xPBS 0.4 mL 중에 용해시킨 다음, 아세토니트릴 12 mL를 첨가하였다. 생성된 펠릿을 수집하고, 고진공 하에 1시간 동안 건조시켰다.
H. PK/PD 조정제의 합성
PEG48+C22
Figure pct00095
무수 DMF (3 mL) 중 화합물 1 (350 mg, 1.027 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (181 mg, 1.130 mmol, 1.1 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.537 mL, 3.082 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (396 mg, 1.233 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (20 mL)으로 켄칭하고 수층을 디클로로메탄 (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬®에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 4-5% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 483.44, 실측치 483.67.
Figure pct00096
무수 1,4-디옥산 (1 mL) 중 화합물 1 (290 mg, 0.600 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 디옥산 중 HCl 용액 (0.751 mL, 3.003 mmol, 5.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하고, 용매를 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 383.39, 실측치 383.57.
Figure pct00097
무수 DMF (2 mL) 중 화합물 1 (83 mg, 0.0322 mmol, 1.0 당량) 및 화합물 2 (13.5 mg, 0.322 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리에틸아민 (0.014 mL, 0.0967 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하고, 용매를 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 분리하고, 디클로로메탄 중 10-15% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+4H]+/4 698.18, 실측치 698.49, 계산치 [M+3H]+/3 930.58, 실측치 930.61.
LP29-p의 합성
Figure pct00098
DMF 중 화합물 1 (40 mg) 및 2 (334 mg)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (50.1 mg)를 첨가한 다음, 이어서 DIPEA (0.082 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 단리를 위해 직접 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM에서 DCM 중 20% MeOH (0-80%)의 구배로 20-30분에 걸쳐 정제하고, 생성물을 71% B에서 용리시켰다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 백색 유성 잔류물을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 2539.62 m/z, 관찰치 1288.21 (+2/2, +H2O) m/z.
Figure pct00099
화합물 1 (147 mg)에 실온에서 4 M HCl/디옥산 (21.2 mg)을 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전한 전환이 확인될 때까지 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 밤새 농축시켜 오일을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 2439.57 m/z, 관찰치 611.16 (+4/4) m/z.
Figure pct00100
무수 중 화합물 1 (143 mg) 및 NEt3 (0.024 mL)의 용액. DCM을 제조하고, 폭기 질소 분위기 하에 교반하였다. 이어서, 화합물 2 (23.4 mg)를 반응 혼합물에 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다.
반응 혼합물을 단리를 위해 직접 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM에서 DCM 중 20% MeOH (0-100% B)의 구배로 용리시켰다. 생성물은 54% B에서 용리되었다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 5506.42 m/z, 관찰치 1854.41 (+3/3, +H2O) m/z.
LP38-p의 합성
Figure pct00101
DMF 중 화합물 1 (35 mg) 및 2 (299 mg)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (43.8 mg)를 첨가한 다음, 이어서 DIPEA (0.071 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 단리를 위해 직접 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM에서 DCM 중 20% MeOH (0-100%)의 구배로 20-30분에 걸쳐 정제하였으며, 여기서 생성물은 56% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 백색 유성 잔류물을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 2539.62 m/z, 관찰치 1288.07 (+2/2, +H2O) m/z.
Figure pct00102
화합물 1 (186 mg)에 실온에서 4 M HCl/디옥산 (26.7 mg)을 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전한 전환이 확인될 때까지 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 밤새 농축시켜 오일을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 2439.57 m/z, 관찰치 1220.97 (+2/2) m/z.
Figure pct00103
DMF 중 화합물 1 (181 mg), TBTU (24 mg), 및 DIEA (0.033 mL)의 용액에 주위 조건 하에 2 (8.7 mg)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 단리를 위해 직접 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM에서 DCM 중 20% MeOH (0-100%)의 구배로 20-30분에 걸쳐 정제하였으며, 여기서 생성물은 65% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 백색 유성 잔류물을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 5089.22 m/z, 관찰치 1036.24 (+5/5, +H2O) m/z.
Figure pct00104
화합물 1 (130 mg)에 4 M HCl/디옥산 (9.3 mg)을 실온에서 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전한 전환이 확인될 때까지 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 밤새 농축시켜 오일을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 4989.17m/z, 관찰치 1248.58 (+4/4) m/z.
Figure pct00105
N2(g)를 살포하면서 무수 DCM 중 화합물 1 (128 mg) 및 NEt3 (0.018 mL)의 용액을 실온에서 제조하였다. 이어서, 화합물 2 (10.3 mg)를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 교반되도록 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 직접 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM에서 20% MeOH/DCM (0-100%)의 구배로 30분에 걸쳐 정제하였으며, 여기서 생성물은 100% B에서 용리되었다. 생성물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 5299.28 m/z, 관찰치 1786.62 (+3/3, +H2O) m/z.
LP238-p의 합성
Figure pct00106
무수 DMF (80 mL) 중 화합물 1 (5.00 g, 22.50 mmol) 및 Cs2CO3 (25.66 g, 78.75 mmol)의 현탁액에 메틸 아이오다이드 (4.20 mL, 67.50 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응물을 물 (200 mL)로 켄칭하고, 혼합물을 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 화합물 2를 담황색 고체, 5.41 g, 96%로서 수득하였다. 화합물 2를 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: [M+H] 계산치 251.05, 실측치 251.18.
Figure pct00107
THF/H2O (50 mL/50 mL) 중 화합물 2 (5.41 g, 21.62 mmol)의 용액에 실온에서 LiOH (2.59 g, 108.08 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 진공 하에 THF를 제거한 후, pH를 [C] HCl에 의해 ~2로 조정하였다. 이어서, EtOAc (3 x 60 mL)를 사용하여 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 화합물 3을 회백색 고체, 5 g, 98%로서 수득하였다. 화합물 3을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H] 237.03, 실측치 237.26.
Figure pct00108
THF/DMF (80 mL/20 mL) 중 화합물 3 (5.81 g, 24.60 mmol)의 용액에 실온에서 EDC (7.07 g, 36.90 mmol), DMAP (0.30 g, 2.46 mmol) 및 화합물 4 (6.13 g, 36.90 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거한 후, 잔류물을 120 g 칼럼 상에 로딩하고, 화합물 5를 헥산 중 0-50% EtOAc로 용리시켰다. 화합물 5를 백색 고체, 9.36 g, 99%로서 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H] 385.03, 실측치 385.46.
Figure pct00109
DCM (110 mL) 중 화합물 5 (2.29 g, 5.96 mmol)의 용액에 0℃에서 70% m-CPBA (5.14 g, 27.79 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 또 다른 1.8 g의 m-CPBA를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 여과한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 DCM/EtOAc (50 mL/50 mL)로부터 2회 재결정화하였다. 화합물 6을 백색 침상 결정으로서 수득하였다 (1.93 g, 78%). LC-MS: 계산치 [M+H] 417, 실측치 417.
Figure pct00110
DCM (100 mL) 중 화합물 7 (10.00 g, 4.34 mmol)의 용액에 0℃에서 팔미토일 클로라이드 (1.31 g, 4.78 mmol) 및 TEA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 0-20% MeOH를 사용하여 정제하였다. 화합물 8을 백색 고체, 10.0 g, 90%로서 수득하였다.
Figure pct00111
화합물 8 (9.56 g, 3.76 mmol)을 4N HCl/디옥산 25 mL 중에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 제거하고, 잔류물을 진공 하에 2시간 동안 건조시켰다. 잔류물을 150 mL DCM 중에 재용해시키고, TEA를 첨가하고, 이어서 화합물 9 (1.10 g, 1.79 mmol), 및 COMU (1.69 g, 3.94 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 표준 후처리 (1N HCl, 포화 중탄산 염수 세척) 후, DCM을 제거하였다. 화합물 10을 120 g 칼럼에 의해 DCM 중 0-20% MeOH를 사용하여 정제하여 5.90 g, 60%를 수득하였다.
Figure pct00112
화합물 10 (4.50 g, 0.82 mmol)을 4N HCl/디옥산 20 mL 중에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 제거하고, 잔류물을 진공 하에 2시간 동안 건조시켰다. 잔류물을 100 mL DCM 중에 재용해시키고, TEA를 첨가하고, 이어서 화합물 6 (0.69g, 1.65 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TEA를 1H HCl 세척에 의해 제거하고, 유기 층을 농축시켰다. 조 LP238-p를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 0-20% MeOH를 사용하여 정제하였다. LP238-p 2.80 g (60%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
I. RNAi 작용제에 대한 PK/PD 조정제의 접합
어닐링 전 또는 후 및 1개 이상의 표적화 리간드의 접합 전 또는 후에, 1개 이상의 지질 PK/PD 조정제 전구체는 본원에 개시된 RNAi 작용제에 연결될 수 있다. 하기는 지질 PK/PD 조정제 전구체를 본원에 도시된 실시예에 제시된 구축물에 연결하는 데 사용되는 일반적 접합 과정을 기재한다.
A. 말레이미드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체의 접합
하기는 디술피드의 디티오트레이톨 환원에 이어서 각각의 말레이미드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체의 티올-마이클 첨가를 수행함으로써 말레이미드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체를 RNAi 작용제의 (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 관능화 센스 가닥에 연결하는 데 사용되는 일반적 방법을 기재한다: 바이알에서, 관능화 센스 가닥을 멸균수 중에 50mg/mL로 용해시켰다. 이어서, 20 당량의 각각의 0.1M Hepes pH 8.5 완충제 및 디티오트레이톨을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 반응하도록 한 다음, 접합체를 아세토니트릴 및 PBS 중에 침전시키고, 고체를 펠릿으로 원심분리하였다.
펠릿을 30 mg/mL의 고체 농도로 DMSO/물의 70/30 혼합물에 넣었다. 이어서, 말레이미드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체를 1.5 당량으로 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시켰다. 생성물을 AEX-HPLC (이동상 A: 25 mM 트리스 pH=7.2, 1 mM EDTA, 50% 아세토니트릴; 이동상 B: 25 mM 트리스 pH=7.2, 1 mM EDTA, 500 mM NaBr, 50% 아세토니트릴; 고체상 TSK겔-30; 1.5 cmx10 cm.) 상에서 정제하였다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하고, 멸균수로 2x10 mL 교환을 사용하여 3K 스핀 칼럼으로 탈염시켰다. 고체 생성물을 동결건조를 사용하여 건조시키고, 추후 사용을 위해 저장하였다.
B. 술폰-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체의 접합
바이알에서, 관능화된 센스 가닥을 멸균수 중에 50mg/mL로 용해시켰다. 이어서, 20 당량의 각각의 0.1M Hepes pH 8.5 완충제 및 디티오트레이톨을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 반응하도록 한 다음, 접합체를 아세토니트릴 및 PBS 중에 침전시키고, 고체를 펠릿으로 원심분리하였다.
펠릿을 30 mg/mL의 고체 농도로 DMSO/물의 70/30 혼합물에 넣었다. 이어서, 술폰-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체를 1.5 당량으로 첨가하였다. 바이알을 N2로 퍼징하고, 교반하면서 40℃로 가열하였다. 혼합물을 1시간 동안 반응시켰다. 생성물을 AEX-HPLC (이동상 A: 25 mM 트리스 pH=7.2, 1 mM EDTA, 50% 아세토니트릴; 이동상 B: 25 mM 트리스 pH=7.2, 1 mM EDTA, 500 mM NaBr, 50% 아세토니트릴; 고체상 TSK겔-30; 1.5 cmx10 cm.) 상에서 정제하였다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하고, 멸균수로 2x10 mL 교환을 사용하여 3K 스핀 칼럼으로 탈염시켰다. 고체 생성물을 동결건조를 사용하여 건조시키고, 추후 사용을 위해 저장하였다.
C. 아지드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체의 접합
Cu(I)가 로딩된 TG-TBTA 수지 1 몰 당량을 유리 바이알에 칭량하였다. 바이알을 N2로 15분 동안 퍼징하였다. 이어서, 관능화된 센스 가닥을 별도의 바이알에서 멸균수 중에 100 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 이어서, 2 당량의 아지드-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체 (DMF 중 50 mg/mL)를 바이알에 첨가하였다. 이어서, TEA, DMF 및 물을 최종 반응 조건이 33 mM TEA, 60% DMF, 및 접합된 생성물 20 mg/mL일 때까지 첨가하였다. 이어서, 용액을 시린지를 통해 수지와 함께 바이알로 옮겼다. N2 퍼징을 제거하고, 바이알을 밀봉하고, 40℃에서 교반 플레이트로 이동시켰다. 혼합물을 16시간 동안 반응하도록 하였다. 수지를 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하였다.
생성물을 AEX 정제 (이동상 A: 25 mM 트리스 pH=7.2, 1mM EDTA, 50% 아세토니트릴; 이동상 B: 25mM 트리스 pH=7.2, 1mM EDTA, 500mM NaBr, 50% 아세토니트릴 고체상 TSK겔-30; 1.5 cmx10 cm.)를 사용하여 정제하였다. 아세토니트릴을 회전 증발기를 사용하여 제거하고, 멸균수로 2x10 mL 교환을 사용하여 3K 스핀 칼럼으로 탈염시켰다. 고체 생성물을 동결건조를 사용하여 건조시키고, 추후 사용을 위해 저장하였다.
D. 알킨-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체의 접합
하기는 디술피드의 디티오트레이톨 환원에 이어서 알킨-함유 PK/PD 조정제 전구체의 첨가를 수행함으로써 활성화된 알킨-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체를 RNAi 작용제의 (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 관능화된 센스 가닥에 연결하는 데 사용되는 일반적 방법을 기재한다: 바이알에서, (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 관능화된 센스 가닥을 포함하는 siRNA 10 mg을 멸균수 중에 50 mg/mL로 용해시켰다. 이어서, 20 당량의 각각의 0.1M Hepes pH 8.5 완충제 및 디티오트레이톨 (멸균수 중 1M)을 첨가하였다. 혼합물을 하기 공식을 사용하여 1시간 동안 반응되도록 한 다음, 엑스브리지 BEH C4 칼럼 상에서 100mM HFIP, 14 mM, 및 TEA의 이동상 A, 및 아세토니트릴의 이동상 B를 사용하여 정제하였으며, 여기서 %B는 이동상 B의 양을 나타내고, 나머지는 이동상 A이다.
Figure pct00113
생성물을 아세토니트릴 12 mL 및 1XPBS 0.4mL를 첨가함으로써 1회 침전시키고, 생성된 고체를 펠릿으로 원심분리하였다. 펠릿을 0.4 mL 1XPBS 및 12 mL의 아세토니트릴 중에 재용해시켰다. 펠릿을 고진공 하에 1시간 동안 건조시켰다.
펠릿을 30 mg/mL의 고체 농도의 DMSO/물의 70/30 혼합물로 바이알에 넣었다. 이어서, 알킨-함유 지질 PK/PD 조정제 전구체를 siRNA에 비해 2 당량으로 첨가하였다. 이어서, 10 당량의 TEA를 첨가하였다. 바이알을 N2를 사용하여 퍼징하고, 반응 혼합물을 교반하면서 40℃로 가열하였다. 혼합물을 1시간 동안 반응시켰다. 생성물을 하기 공식을 사용하여 25mM 트리스 pH=7.2, 1mM EDTA, 50% 아세토니트릴의 이동상 A, 및 25mM 트리스 pH=7.2, 1mM EDTA, 500mM NaBr, 50% 아세토니트릴의 이동상 B를 사용하는 TSK겔-30 패킹된 칼럼, 1.5cm x 10 cm을 사용하는 음이온-교환 HPLC를 사용하여 정제하였으며, 여기서 %B는 이동상 B의 양을 나타내고, 나머지는 이동상 A이다.
Figure pct00114
생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 아세토니트릴을 회전 증발기를 사용하여 제거하였다. 생성물을 멸균수로 2 x 10 mL 교환을 사용하여 3K 스핀 칼럼으로 탈염시켰다. 이어서, 생성물을 동결건조를 사용하여 건조시키고, 추후 사용을 위해 저장하였다.
J. 링커 4의 합성
Figure pct00115
DMF 중 화합물 1 (3.00 g)의 용액에 Cs2CO3 (7.71 g)를 실온에서 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (1.85 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 N2 (g) 하에 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 완전한 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (5 x 10 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL) 및 염수 (8 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex에서 EtOAc (0-30%)의 구배로 정제하였으며, 여기서 생성물은 14% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 191.06 m/z, 관찰치 191.23 m/z.
Figure pct00116
1:1 THF/물 중 화합물 1 (2.87 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (1.08g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 반응물을 교반하였다. 잔류 출발 물질을 EtOAc를 통해 추출한 다음, 수성 상을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 백색 고체로서 분쇄하고, 진공 상에서 여과하고, 물로 세척하였다. 그의 습윤/점착성 성질로 인해, 용매를 필요로 하여 고체를 둥근 바닥 플라스크로 옮기고; 물질을 MeOH 및 DCM을 통해 옮겼다. 어느 하나 및 조합에서의 불량한 용매화로 인해, 물질은 Na2SO4 상에서 건조될 수 없었고, 상응하게 단지 진공 하에 농축시켜 백색의 솜털모양 결정질 고체를 제공하였다. 단리가 필요하지 않았다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 177.05 m/z, 관찰치 177.19 m/z.
Figure pct00117
N2(g) 하에 DMF (10.0 mL) 중 화합물 1 (1.00 g) 및 2 (1.04 g)의 용액에 실온에서 EDC (1.20 g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 LC-MS에 의해 완전한 전환이 관찰될 때까지 교반되도록 하였다. 밤새 교반한 후 생성물을 성공적으로 관찰할 수 없었기 때문에, 반응 혼합물을 NaHCO3로 켄칭하였고, 이때 석출이 이어졌다. 침전물을 LC-MS를 통해 출발 물질을 함유하는 것으로 확인하고, 진공 하에 여과하고, MeOH/DCM 중에 재현탁시키려고 시도한 다음, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 혼합물을 DMF 중에 재용해시키고, Na2SO4 상에서 건조시키고, DMF로 헹구면서 진공 하에 여과하였다. EDC를 여과물 (반응 혼합물)로 판독하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 반응 혼합물을 직접 농축시키고, 단리를 위해 MeOH 및 PhMe와 공비혼합하였다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM에서 20% MeOH/DCM (0-15% B)의 구배로 용리시켰다. 생성물을 0% B에서 용리시켜 백색 고체를 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 325.04 m/z, 관찰치 325.35 m/z.
실시예 2. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델 (FLExDUX4/HSA-MCM)
생체내에서 DUX4 RNAi 작용제를 평가하기 위해, FSHD의 트랜스제닉 모델을 사용하였다. FLExDUX4 마우스 (B6(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm1.1(DUX4*)Plj/J)를 상업적으로 획득하고, 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories) (JAX)에 의해 HSA-MCM 마우스 (Tg(ACTA1-cre/Esr1*)2Kesr/J)와 교배시켜 타목시펜의 투여 시 골격근에서 인간 DUX4를 발현하는 동형접합 자손을 생산하였다.
FLExDUX4 마우스 배경: FLExDUX4 마우스를 cre-의존성 일원 유전자 스위치 (FLEx) 시스템을 사용하여 생성하였다. 이 DUX4 조건부 대립유전자를 보유하는 동형접합체 마우스는 생존가능하고 가임이다. 2개 세트의 비상용성 외향 재조합 부위 (loxP 및 lox511)가 엑손 1-3 및 둘 다의 인트론을 포함한 역전된 인간 DUX4 서열에 플랭킹된다. DUX4 유전자는 여러 대안적 mRNA 스플라이싱 변이체를 코딩한다. 유전성 근육 장애인 안면견갑상완 근육 이영양증 (FSHD)은 DUX4-전장 (DUX4-fl) mRNA 이소형에 의해 코딩된 DUX4의 발현에 의해 유발된다. 본원에서 이전에 언급된 바와 같이, 쌍형성된 호메오박스 도메인 전사 인자를 코딩하는 DUX4-fl mRNA는 전형적으로 건강한 근육에서 발현되지 않는다. 그러나, FSHD에서, DUX4-fl의 희귀 발현 (근섬유의 1% 미만에서임)은 아폽토시스, 분화 결함, 근육 위축, 및 산화성 스트레스에 대한 감수성을 포함한 발병 이벤트 캐스케이드를 개시한다. 전반적으로, FSHD는 얼굴, 견갑골, 및 상완의 골격근에 우세하게 영향을 미치지만, 복부, 골반대, 및 하퇴의 근육에 영향을 미칠 수 있으며 궁극적으로 환자의 ~20%가 보행을 상실하는, 천천히 진행되는 근육 이영양증을 특징으로 한다.
DUX4 프로모터는 짧은 비-병원성 이소형 (DUX4-s) 및 보다 긴 세포독성 이소형 (DUX4-fl)의 발현을 구동시킨다. 이 계통은 2개의 DUX4-s mRNA에 대한 5' 스플라이싱 공여자 부위에 4개의 점 돌연변이를 함유하여, 짧은 이소형의 발현을 제거하고, 병원성 DUX4-fl mRNA 이소형만을 생성한다.
이러한 구축물이 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌 내로의 삽입을 위해 표적화되었기 때문에, DUX4-fl 발현은 조직(들)이 Cre 레콤비나제를 발현하는지에 의해 결정된다. Cre 레콤비나제를 발현하는 마우스와 교배되는 경우, 생성된 자손은 loxP 또는 lox511 부위가 재조합되어, 인간 DUX4-fl 서열의 역위를 일으킬 것이고, 센스 배향으로 끝난다.
반접합 및 동형접합 마우스는 Cre 레콤비나제의 부재 하에 낮은 수준의 DUX4-fl 발현을 갖는다. 이들 마우스는 탈모증, 및 연령에 따른 연변, 염증 및 근육 약화를 나타낸다. 동형접합이 보다 영향을 받으며, 암컷과 비교하여 수컷에서 보다 영향을 받는다.
HSA-MCM 마우스 배경: HSA-MCM 마우스는 인간 ACTA1 (액틴, 알파 1, 골격근) 프로모터의 제어 하에 MerCreMer 이중 융합 단백질을 발현한다. 이형접합 마우스는 생존가능하고 가임이다. 동형접합체 또한 생존가능하지만, 유의하게 생식능 감소를 나타낸다. 중요하게는, MerCreMer 이중 융합 단백질은 CreMer 단일 융합 단백질과 비교하여 덜 혼란스러운 실질적으로 보다 큰 Cre 레콤비나제 활성을 갖는다. HSA-MCM 마우스를 loxP-플랭킹된 서열을 함유한 마우스와 함께 교배하는 경우, 타목시펜-유도성 Cre-매개된 재조합은 자손의 사지, 얼굴/혀 및 횡경막의 골격근에서 플록싱된 서열의 결실을 유발한다.
MerCreMer 이중 융합 단백질은 돌연변이된 뮤린 에스트로겐 수용체 (mer) 리간드 결합 도메인 (아미노산 281-599, G525R)이 각각의 말단에 플랭킹된 Cre 레콤비나제로 이루어지고; 이는 생리학적 농도에서 그의 천연 리간드 (17β-에스트라디올)에는 결합하지 않지만 합성 에스트로겐 수용체 리간드 4-히드록시타목시펜 (OHT 또는 타목시펜)에 결합하고, 보다 적은 감도로 ICI 182780에 결합할 것이다. 세포질로 제한하면, MerCreMer은 타목시펜에 대한 노출 후에만 핵 구획에 대한 접근을 획득할 수 있다.
DUX4 발현의 타목시펜 유도: 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)을 경구 위관영양을 통해 매주 2 또는 3회 투여하여 연구 지속기간 (일반적으로 18 내지 31일) 동안 골격근에서 DUX4 발현 증가를 유도하였다.
체중 평가: DUX4 발현 증가는 FSHD의 이 동물 모델에서 근육 소모 및 체중 감소를 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본원에 개시된 실시예의 경우, 타목시펜 또는 RNAi 작용제 투여일 및 조직 수거일을 포함한 다양한 연구의 지속기간 전반에 걸쳐 체중을 기록하였다. 체중을 타목시펜 투여 첫날, 및 옥수수 오일 (타목시펜을 함유하지 않음) 및 염수 (RNAi 작용제를 함유하지 않음)를 투여한 "기준선" 대조군의 평균 체중에 대해 정규화하였다.
대운동 협응 평가: 타목시펜 또는 RNAi 작용제의 투여 전 1주 동안, 마우스를 상업적으로 획득한 로타로드 장치에 적어도 5회 적응시켰다. 타목시펜 및/또는 RNAi 작용제를 투여하면, 매 평가일에 5회 시도의 평균을 취함으로써 매주 적어도 2회 로타로드 장치를 사용하여 대운동 협응을 평가하였다.
조직 수집: 마우스를 3-4% 이소플루란으로 마취시키고, 방혈을 통해 안락사시켰다. 유전자 발현 분석을 위해 의도된 관심 조직을 수거하고, 액체 질소에서 급속 동결시킨 다음, -80℃에서 저장하였다. 조직검사를 위해 의도된 관심 조직을 포르말린에 고정시킨 다음, 파라핀 왁스에 포매시키고, 조직화학적 또는 면역조직화학적 프로토콜을 통해 염색하였다.
유전자 발현 분석: 전체 동결 조직을 프리셀리스(Precellys) 조직 균질화 시스템 (베르틴(Bertin))을 사용하여 균질화하고, RNA를 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출을 통해 단리하였다. 추출된 RNA를 사용하여 슈퍼스크립트(SuperScript)™ 빌로(VILO)™ cDNA 합성 키트 (써모)를 사용하여 상보적 DNA를 합성하고, DUX4 발현을 QX200 액적 디지털 PCR (바이오-라드(Bio-Rad))을 사용하여 측정하였다. Wfdc3 및 Myo1g 발현을 관심 유전자를 검출하도록 설계된 택맨 프라이머/프로브 세트 (써모-피셔)를 사용하는 퀀트플렉스7 qRT-PCR (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 시스템을 사용하여 측정하였다. 유전자 발현을 참조 유전자 (예를 들어 Arl1) 및 옥수수 오일 (타목시펜을 함유하지 않음) 및 염수 (RNAi 작용제를 함유하지 않음)가 투여된 "기준선" 대조군의 평균에 대해 정규화하였다.
마우스 근육에서의 DUX4 활성의 바이오마커로서의 WAP-유형 4-디술피드 코어 도메인 3 (Wfdc3) 발현: WAP-유형 4-디술피드 코어 도메인 3은 과다발현된 DUX4-fl 단백질의 널리 문서화된 직접 뮤린 표적이다. Wfdc3의 유전자 발현을 측정하고 (상기 기재된 바와 같은 qRT-PCR을 사용함), 수집된 근육 조직에서 DUX4 활성의 바이오마커로서 사용하였다.
마우스 근육에서의 DUX4 활성의 바이오마커로서의 미오신 1G (Myo1g) 발현: Myo1g은 과다발현된 DUX4-fl 단백질의 널리 문서화된 직접 뮤린 표적이다. Myo1g의 유전자 발현을 측정하고 (상기 기재된 바와 같이 qRT-PCR을 사용함), 수집된 근육 조직에서 DUX4 활성의 바이오마커로서 사용하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
실시예 3. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서의 DUX4 RNAi 작용제의 생체내 투여
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 투여하여 (제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 7. 실시예 3에 대한 투여 군.
Figure pct00118
Figure pct00119
실시예 2의 RNAi 작용제 (군 3-10)는 DUX4 유전자 (즉, mRNA 전사체)를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 링커 L4에 대한 접합을 용이하게하고, 이는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대해 친화도를 갖는 소분자인 표적화 리간드 (본원에서 "골격근 세포 수용체 소분자"로 지칭됨)에 접합될 수 있다. 링커를 센스 가닥에 접합시키고 표적화 리간드를 링커에 접합시키는 절차는 상기 실시예 1에 제공된다.
DUX4 RNAi 작용제를 골격근 세포에 대한 친화도를 갖는 소분자 표적화 리간드 SM45b에 연결시켰다. DUX4 RNAi 작용제를 하기 화학 구조를 갖는 화합물에 연결시켰다:
Figure pct00120
표적화 리간드 SM45-p를 링커 L4에 대한 편리한 커플링을 가능하게 하는 아지드로서 합성하였다. 링커 L4를 원래 하기 구조를 갖는 테트라플루오로페닐 (TFP)에스테르 관능화된 화합물로서 합성하였다:
Figure pct00121
TFP 에스테르 반응성 기를 먼저 센스 가닥의 5' 말단 상의 말단 아민 (NH2-C6)에 연결시켰다. 이어서, SM45의 아지드를 링커 (L4)의 알킨에 커플링시켰다.
실시예 2에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제에 대한 접합을 용이하게 하였다. 비스(PEG47+C22) 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 하기 구조를 갖는 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다:
Figure pct00122
말레이미드는 말단 3' 디술피드 결합을 환원시키고 말단 3' 티올에 마이클 첨가를 수행함으로써 센스 가닥의 3' 말단에 연결하였다. 본원에 기재된 바와 같이, PK/PD 조정제는 개선된 세포 수용체 결합, 개선된 세포 흡수 및/또는 다른 수단을 통해 접합된 약물의 순환 시간을 증가시키고/거나 RNAi 작용제의 활성을 증가시킬 수 있다. 표적화 리간드 및 PK/PD 조정제에 접합 시, DUX4 RNAi 작용제 센스 가닥은 표 4.5에 나타낸 바와 같은 일반적 구조를 가졌다.
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
단지 3마리의 마우스에게 투여된 군 1 (n=3)을 제외하고, 각각의 군에서 5마리의 마우스에게 투여하였다 (n=5). 제21일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다.
수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸다:
표 8.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00123
표 8.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00124
표 8.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 EDL (장지신근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00125
표 8.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00126
표 8.5 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00127
표 8.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 가자미근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00128
표 8.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00129
표 8.8. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00130
표 8.9. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00131
본원에 논의된 바와 같이, Wfdc3 전사체 수준은 DUX4 단백질 활성 수준에 대한 바이오마커로서의 역할을 한다. 수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 전사체 수준을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 9.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00132
표 9.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00133
표 9.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 EDL (장지신근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00134
표 9.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00135
표 9.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00136
표 9.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 가자미근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00137
표 9.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00138
표 9.8. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00139
표 9.9. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 3의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00140
추가로, 체중 측정을 제4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20 및 21일에 수행하였다. 체중의 보존은 예방 효과의 지표가 될 수 있다. 제4일 (타목시펜 투여 전) 및 기준선에 대해 정규화된 바와 같은 체중이 도 1에 나타낸다.
상기 나타낸 DUX4 RNAi 작용제의 경우, AD07218 (군 3)은 유전자의 위치 408에서 DUX4 유전자 (즉, DUX4 mRNA 전사체)를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07219 및 AD07275 (군 4 및 5)는 유전자의 위치 409에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07220 및 AD07276 (군 6 및 7)은 유전자의 위치 1437에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07221 및 AD07277 (군 8 및 9)은 유전자의 위치 1518에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07396 (군 10)은 유전자의 위치 1496에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
상기 표의 데이터가 나타내는 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제는 FSHD-유사 마우스 모델에서 DUX4 유전자 발현의 감소를 제공하며, 위치 408, 409 및 1437을 표적화하는 DUX4 RNAi 작용제는 특히 DUX4 유전자 발현의 실질적인 억제를 입증한다. 예를 들어, 표 8.1 - 8.9에 나타낸 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제가 투여된 군 3, 5, 및 7에서의 DUX4의 상대 발현은 모든 근육에서 타목시펜 군보다 훨씬 아래로, 그리고 기준선 군 이하로 유지되었고, 이는 예방 효과를 나타낸다. 상기 효과는 표 9.1 - 9.9에 나타낸 바와 같이 군 5 및 7에서 Wfdc3 발현의 극적인 증가의 방지 및 군 5 및 7에서 체중 감소의 방지에 의해 확인되었다 (도 1).
실시예 4. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 (즉, 제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) 투여하여 DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 10. 실시예 4의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00141
Figure pct00142
실시예 4의 RNAi 작용제 (군 3-13)는 DUX4 유전자 (즉, DUX4 mRNA 전사체)를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 골격근 세포 수용체 소분자 표적화 리간드 SM45에 대한 접합을 용이하게 한다. 표적화 리간드 SM45를 링커 L4에 대한 편리한 커플링을 가능하게 하는 아지드로서 합성하였다. (예를 들어, SM45 및 L4에 대한 구조적 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
실시예 2에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제 비스(PEG47+C22)에 대한 접합을 용이하게 하였다. (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
단지 4마리의 마우스에게 투여된 군 1 (n=4)을 제외하고, 각각의 군에서 5마리의 마우스에게 투여하였다 (n=5). 제22일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다.
체중 측정은 제1, 4, 7, 8, 10, 12, 14, 18, 21, 및 22일에 취하였고, 상기 언급된 바와 같이 체중 보존은 근육 소모에 대한 예방 효과의 지표가 될 수 있다. 군 10 (AD07394), 군 11 (AD07395), 군 12 (AD07398), 및 군 13 (AD07399)의 RNAi 작용제는 양성 대조군 (타목시펜 투여 단독)과 비교하여 허용되는 체중 보존을 나타내지 않았고, 따라서 추가의 평가는 이들 군에 대해 이루어지지 않았다. 추가로, 군 8 (AD07514) 및 군 13 (AD07399)은 둘 다 체중 유지의 일부 예방적 효과를 나타내었지만, 체중은 DUX4 유전자의 동일한 위치를 표적화하는 여러 다른 RNAi 작용제보다 더 감소하였고, 따라서 추가의 평가는 이들 군에 대해서도 이루어지지 않았다. 제4일 (타목시펜 투여 전) 및 기준선에 대해 정규화된 바와 같은 체중이 도 2 및 3에 제시된다.
수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현은 군 1-7 및 9에 대한 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸다:
표 11.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00143
표 11.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00144
표 11.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00145
표 11.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00146
표 11.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00147
표 11.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00148
표 11.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00149
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준은 군 1-7 및 9에 대한 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 유사하게 결정되었다:
표 12.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00150
표 12.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00151
표 12.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00152
표 12.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00153
표 12.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00154
표 12.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00155
표 12.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 4의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00156
상기 나타낸 DUX4 RNAi 작용제에 대해, AD07276, AD07510, AD07511, AD07512, AD07513, AD07514, AD07515 (군 3-9)는 유전자의 위치 1437에서 DUX4 유전자 (즉, DUX4 mRNA 전사체)를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07394 및 AD07395 (군 10 및 11)는 유전자의 위치 1433에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07398 및 AD07399 (군 12 및 13)는 유전자의 위치 1522에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
상기 표의 데이터가 나타내는 바와 같이, 유전자의 위치 1437을 표적화하는 DUX4 RNAi 작용제는 FSHD-유사 마우스 모델에서 DUX4 유전자 발현의 감소를 제공한다. 특히 주목할 것은, AD07511이 투여된 마우스로부터 검정된 7개의 근육 중 7개에서 DUX4 유전자 발현 수준이 기준선 미만인 것으로 관찰되었고, Wfdc3 유전자 발현 수준이 기준선 훨씬 미만인 것으로 관찰되었다 (표 11.1 - 11.7 및 12.1 - 12.7 참조).
실시예 5. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 투여하여 (제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 13. 실시예 5의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00157
실시예 5의 RNAi 작용제 (군 3-8)는 DUX4 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 골격근 세포 수용체 소분자 표적화 리간드 SM45에 대한 접합을 용이하게 하였다. 표적화 리간드 SM45를 링커 L4에 대한 편리한 커플링을 가능하게 하는 아지드로서 합성하였다. (예를 들어, SM45 및 L4에 대한 구조적 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
실시예 2에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제 비스(PEG47+C22)에 대한 접합을 용이하게 하였다. (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
각각의 군에서 5마리의 마우스에게 투여하였다 (n=5). 제22일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다.
체중 측정은 제1, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 및 21일에 취하였고, 상기 언급된 바와 같이 체중 보존은 근육 소모에 대한 예방 효과의 지표가 될 수 있다. 군 3 (AD07218), 군 5 (AD07775), 및 군 7 (AD07777)의 RNAi 작용제는 체중 유지에 대한 일부 예방 효과를 나타냈다. 그러나, AD07274, AD07776 및 AD07778의 DUX4 RNAi 작용제가 타목시펜의 투여 후 동물 체중 유지와 관련하여 시험된 RNAi 작용제 중 최상으로 수행하였고, 이들을 추가의 평가에 적용하였다. 제4일 (타목시펜 투여 전) 및 기준선에 대해 정규화된 바와 같은 체중을 도 4에 나타낸다.
수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현은 군 1, 2, 4, 6 및 8에 대한 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸다:
표 14.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00158
표 14.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00159
표 14.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00160
표 14.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00161
표 14.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00162
표 14.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00163
표 14.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00164
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준은 군 1, 2, 4, 6, 및 8에 대한 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 유사하게 결정되었다:
표 15.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00165
표 15.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00166
표 15.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00167
표 15.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00168
표 15.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00169
표 15.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00170
표 15.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00171
상기 나타낸 모든 DUX4 RNAi 작용제에 대해, RNAi 작용제는 유전자의 위치 408에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다. 본원에 나타낸 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제가 관련 파라미터에서 실질적인 감소를 나타내었으며, AD07776 및 AD07778은 DUX4 및 Wfdc3 유전자 발현을 감소시키는 데 특정한 효력을 가졌다.
실시예 6. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 투여하여 (제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 16. 실시예 6의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00172
Figure pct00173
실시예 6의 RNAi 작용제 (군 3-14)는 DUX4 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 각각의 표적화 리간드에 대한 접합을 용이하게 하였다.
군 3-12의 경우, 표적화 리간드 SM45를 링커 L4에 대한 편리한 커플링을 가능하게 하는 아지드로서 합성하였다. (예를 들어, SM45 및 L4에 대한 구조적 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
군 13-14의 경우, 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖는 펩티드를 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합시켰다. 골격근 세포 수용체 펩티드 (펩티드 1)를 센스 가닥의 5' 말단에서 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 아미드 커플링 반응을 통해 RNAi 작용제에 연결시켰다. αvβ6 펩티드 1은 하기 구조에 의해 나타내어진다:
Figure pct00174
여기서
Figure pct00175
는 (반응성 아민 (NH2-C6) 링커를 통한) RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
실시예 6에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제에 대한 접합을 용이하게 하였다.
군 3-12의 경우, 비스(PEG47+C22) 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다 (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
군 13-14의 경우, LP38b 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 하기 구조를 갖는 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다:
Figure pct00176
여기서 R은 RNAi 작용제의 잔기이다. 말레이미드는 말단 3' 디술피드 결합을 환원시키고 말단 3' 티올에 마이클 첨가를 수행함으로써 센스 가닥의 3' 말단에 연결하였다.
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
각각의 군 (n=6)에서 6마리의 마우스에게 투여하였다. 제22일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다.
체중 측정은 제1, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 및 22일에 취하였고, 도 5 (1 mg/kg) 및 도 6 (5 mg/kg)에 나타낸 바와 같이, 제4일 (타목시펜 투여 전) 및 기준선에 대해 정규화하였다. 체중은 1 또는 5 mg/kg RNAi 작용제로 처리된 모든 군에서 양성 대조군 수준 초과로 보존되었다. 특히 주목할 것은, AD07511, AD07776 및 AD07778로 처리된 동물이 1 및 5 mg/kg 둘 다에서 기준선과 등가인 수준으로 체중을 유지하였다는 것이다.
특정 군에 대해, 수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 검사하였다:
표 17.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00177
표 17.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00178
표 17.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00179
표 17.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00180
표 17.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00181
표 17.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 5의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00182
표 17.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00183
억제 수준을 추가로 예시하기 위해, 상기 표 17.1 내지 17.7의 데이터를 단지 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교하여, 다양한 군에 대한 DUX4 녹다운 또는 감소 (상대 발현 아님)의 %를 제시하였다:
표 18.1. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 이두근에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00184
표 18.2. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 횡경막에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00185
표 18.3. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 비복근에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00186
표 18.4. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 교근에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00187
표 18.5. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00188
표 18.6. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 승모근에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00189
표 18.7. 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교한 실시예 6의 마우스에 대한 삼두근에서의 DUX4 녹다운의 백분율 (군 2).
Figure pct00190
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 19.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00191
표 19.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00192
표 19.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00193
표 19.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00194
표 19.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00195
표 19.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00196
표 19.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00197
상기 데이터 표에 나타낸 DUX4 RNAi 작용제의 경우, AD07511은 유전자의 위치 1437에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD077778은 유전자의 위치 408에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
상기 나타낸 바와 같이, 이들 DUX4 RNAi 작용제 둘 다는 체중을 보존하였고, DUX4 유전자 발현의 의미있는 감소를 나타냈다.
실시예 7. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 투여하여 (제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 20. 실시예 7의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00198
실시예 7의 RNAi 작용제 (군 3-6)는 DUX4 유전자를 표적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 펩티드 1로 지칭되는 골격근 세포 수용체 펩티드에 대한 접합을 용이하게 하였다 (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 6 참조).
실시예 7에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제 (LP38b)에 대한 접합을 용이하게 하였다. (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 6 참조).
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
상기 나타낸 DUX4 RNAi 작용제에 대해, AD07511 (군 3 및 4)은 유전자의 위치 1437에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD07776 (군 5 및 6)은 유전자의 위치 408에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
체중 측정을 제1, 3, 4, 5, 8, 10, 11, 12, 15, 17, 18, 및 19일에 수행하고, 도 7에 나타낸 바와 같이 제1일 (타목시펜 투여전) 및 기준선에 대해 정규화하였다. 체중은 1 또는 5 mg/kg RNAi 작용제로 처리된 모든 군에서 양성 대조군 수준 초과로 보존되었다.
각각의 군 (n=6)에서 6마리의 마우스에게 투여하였다. 제19일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다. 수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현은 비복근 및 삼두근에 대해 하기 표에 나타낸다:
표 21.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00199
표 21.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00200
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준을 다양한 비복근 및 삼두근에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 22.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00201
표 22.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00202
억제 수준을 추가로 예시하기 위해, 상기 표 22.1 및 22.2의 데이터를 단지 양성 대조군 (타목시펜 단독)과 비교하였으며, 이는 다양한 군에 대해 하기 상대 억제 수준을 나타낸다:
표 23.1. 양성 대조군 (군 2)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 비복근에서의 상대 평균 Wfdc3 발현.
Figure pct00203
표 23.2. 양성 대조군 (군 2)에 대해 정규화된 실시예 7의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00204
실시예 7의 마우스를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 로타로드 장치에 추가로 적용하여 대운동 협응 평가를 수행하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 연구 기간 전반에 걸쳐 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 동물 (군 3-6)은 타목시펜이 투여되지 않은 음성 대조군 염수 군과 유사하게 로타로드 장치에 대한 그의 균형 및 대운동 기능을 유지할 수 있었다. 반대로, 타목시펜을 투여받았지만 DUX4 RNAi 작용제는 투여받지 않은 동물은 약 제11일에 시작하여 로타로드 장치로부터 훨씬 더 빨리 떨어지기 시작하였으며, 이는 근육 기능의 상실을 나타낸다.
상기 나타낸 데이터에 의해 입증된 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제 둘 다는 DUX4 RNAi 작용제가 투여된 모델 마우스에서 DUX4 유전자 발현의 실질적인 억제, 및 대운동 기능 및 체중의 보존을 나타낸다.
실시예 8. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 DUX4 RNAi 작용제를 평가하였다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 DUX4 RNAi 작용제를 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
연구 제1일에, 마우스에게 등장성 염수 (비히클 대조군) 또는 등장성 염수 중에 제제화된 DUX4 RNAi 작용제를 목 및 어깨 영역 상의 느슨한 피부 영역 내로 피부와 근육 사이에 주사하였다 (즉, 피하 주사). 제4일에 시작하여, 옥수수 오일 (음성 대조군) 또는 옥수수 오일 중에 용해된 타목시펜 (1 mg/mL)의 100 μL/20g 마우스의 경구 위관영양을 1주에 3회 투여하여 (제4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 및 19일) DUX4의 발현 증가를 유도하였다. 투여 요법 및 세부사항은 하기 표에 제시된다:
표 24. 실시예 8의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00205
실시예 8의 RNAi 작용제 (군 3-8)는 DUX4 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 각각의 표적화 리간드 또는 링커에 대한 접합을 용이하게 하였다.
군 3-4의 경우, 선택된 표적화 리간드는 링커 L4에 대한 편리한 커플링을 가능하게 하는 아지드로서 합성된 소분자 골격근 수용체 SM45b였다. (예를 들어, SM45-p 및 L4에 대한 구조적 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
군 5-8의 경우, 펩티드 1을 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합시켰다. 펩티드 1을 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 아미드 커플링 반응을 통해 (NH2-C6) 관능화된 RNAi 작용제에 연결하였다 (구조 정보에 대해서는 실시예 6 참조).
실시예 6에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제에 대한 접합을 용이하게 하였다.
군 3-4의 경우, 비스(PEG47+C22) 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다 (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 3 참조).
군 5-6의 경우, LP29b 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 하기 구조를 갖는 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다:
Figure pct00206
여기서 R은 DUX4 RNAi 작용제를 포함한다
(C6-SS-C6) 관능기의 말단 3' 디술피드 결합을 환원시키고 마이클 첨가를 통해 LP29-p의 말레이미드를 말단 3' 티올에 커플링시킴으로써 LP29-p를 센스 가닥의 3' 말단에 연결시켰다. 군 7-8의 경우, LP38b 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다. (예를 들어, 구조 정보 및 관련 정보에 대해서는 상기 실시예 6 참조).
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전히 변형된 접합체를 나타냄).
12마리의 마우스 (n=12)를 갖는 양성 대조군 (타목시펜 및 염수, DUX4 RNAi 작용제는 투여하지 않음)을 제외하고, 각각의 군 (n=9)에서 9마리의 마우스에게 투여하였다. 제22일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다.
체중 측정을 제1, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 17, 19 및 22일에 수행하고, 도 9에 나타낸 바와 같이 제4일 (타목시펜 투여전) 및 기준선에 대해 정규화하였다.
수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 검사하였다:
표 25.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00207
표 25.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00208
표 25.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00209
표 25.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00210
표 25.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00211
표 25.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00212
표 25.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 8의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00213
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 26.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00214
표 26.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 횡경막에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00215
표 26.3. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00216
표 26.4. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00217
표 26.5. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00218
표 26.6. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00219
표 26.7. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 6의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00220
상기 데이터 표에 나타낸 DUX4 RNAi 작용제의 경우, AD07511은 유전자의 위치 1437에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; AD077778은 유전자의 위치 408에서 DUX4 유전자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
상기 나타낸 바와 같이, 이들 DUX4 RNAi 작용제 둘 다는 검사된 3가지 포맷 각각에서 DUX4 유전자 발현의 의미있는 감소를 나타낸다.
실시예 9. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하였다. 평가된 DUX4 RNAi 작용제는 펩티드 1의 표적화 리간드 및 PK/PD 조정제 LP29b에 연결된 DUX4 RNAi 작용제 AD07778이었으며 (완전 변형 및 접합된 센스 및 안티센스 가닥 구조에 대해서는 표 5.4의 AC000448 참조), 이는 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
본 연구의 목적은 FLExDUX4/HSA-MCM 마우스에서 매주 2회 피하 용량에 이어 매주 피하 용량 후 DUX4 mRNA 발현의 녹다운, DUX4 단백질 활성의 바이오마커의 감소, 및 약역학적 효과에 대한 본 DUX4 RNAi 작용제의 용량 반응 및 시기 효과를 평가하는 것이었다.
2가지 투여 전략을 연구에 사용하였다: 예방 및 개입.
예방 전략 동안 (하기 군 C 및 D), 타목시펜 투여 개시 2일 이내에 DUX4 RNAi 작용제를 투여하였다. 이러한 방식으로, DUX4 발현이 유도되고 증가함에 따라 DUX4 RNAi 작용제는 골격근 세포 (근섬유)에 전달되는 것으로 여겨졌다.
개입 전략 동안 (하기 군 E), DUX4 RNAi 작용제를 FSHD-유사 표현형의 징후 (타목시펜 투여의 개시 후 제10일까지) 후에 투여하였다. 이러한 방식으로, DUX4 발현이 이미 근독성 효과를 발휘하기 시작한 후에 DUX4 RNAi 작용제를 근섬유에 전달하였다.
투여 요법 및 세부사항은 하기 표 27에 제시된다:
표 27. 실시예 9의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00221
각각의 마우스에게 옥수수 오일 대조군 또는 1 mg/mL 타목시펜 용액을 경구 위관영양을 통해 20 g 체중당 100 μL (5 mg/kg)의 용량 부피로 제1주 동안 1주 2회 및 제2주 내지 제4주 동안 1주 3회 투여하였다.
실시예 9의 RNAi 작용제 (군 C, D 및 E)는 DUX4 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성하고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 각각의 표적화 리간드 또는 링커에 대한 접합을 용이하게 하였다. 펩티드 1을 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합시켰다. 펩티드 1을 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 아미드 커플링 반응을 통해 (NH2-C6) 관능화된 RNAi 작용제에 연결하였다 (구조 정보에 대해서는 실시예 6 참조).
실시예 6에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제에 대한 접합을 용이하게 하였다. LP29b 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 하기 구조를 갖는 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다:
Figure pct00222
여기서 R은 DUX4 RNAi 작용제를 포함한다.
말레이미드 LP29-p는 말단 3' 디술피드 결합을 환원시키고 말단 3' 티올에 마이클 첨가를 수행함으로써 센스 가닥의 3' 말단에 연결하여 RNAi 작용제를 합성하였다.
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전 변형된 접합체를 나타냄).
군 A (n=6)에서 6마리의 마우스에게 투여하였고, 이는 타목시펜을 수반하지 않았다. 군 B, C, D, 및 E에서 10마리의 마우스에게 투여하였다 (n=10).
타목시펜 및 RNAi 작용제 투여일 (제1, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 24, 26, 29, 및 31일)에 체중을 측정하였다. 개별 분산을 제어하기 위해, 각각의 개별 동물의 체중을 제1일에 대해 정규화하고, 이어서 기준선 군의 체중의 평균에 대해 각각의 시점에서 정규화하였다. 이원 ANOVA에 이은 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 각각의 시점에서 군 체중 사이의 유의차를 결정하였다.
체중은 제10일까지 군 사이에 유의하게 상이하지 않았다. 제10일에, 타목시펜 단독을 투여한 동물은 기준선에 비해 더 낮은 체중을 갖는 경향이 있었고, 제3일에 시작하여 1 또는 5 mg/kg의 RNAi 작용제가 투여된 것보다 유의하게 더 낮은 체중을 가졌다 (군 C 및 D; 각각 p=0.0294, p = 0.0010, 및 p = 0.0012). 제12일까지, 타목시펜 단독을 투여한 동물 (군 B) 및 제10일에 처음으로 타목시펜 및 5 mg/kg RNAi 작용제를 투여한 군 (군 E)은 기준선 동물 (군 A) 및 제3일에 1 또는 5 mg/kg을 투여한 동물 (군 C 및 D)과 비교하여 유의하게 더 낮은 체중을 가졌다. 제17일에, 군 E에서 투여된 동물에 대해 체중 감소가 정지된 한편, 타목시펜 단독을 투여한 동물 (군 B)에 대해서는 체중 감소가 계속되었다. 군 E 평균 체중은 제3일에 시작하여 기준선 및 1 또는 5 mg/kg DUX4 RNAi 작용제를 투여한 동물보다 유의하게 더 낮았지만 (군 A, C 및 D; 모든 각각의 비교에 대해 p < 0.05), 이는 또한 타목시펜 단독을 투여한 동물의 평균 체중보다 유의하게 더 높았다 (군 B, p = 0.0003). 제22일 후, 제10일에 시작하여 DUX4 RNAi 작용제를 투여한 군 E의 동물에 대한 체중은 제31일까지 군 C 및 D와 통계적으로 동등하게 유지되었다.
제31일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다. 수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현을 다양한 근육 유형에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 검사하였다:
표 28.1. 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 이두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00223
표 28.2. 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00224
표 28.3. 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 교근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00225
표 28.4. 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 TA (전경골근)에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00226
표 28.5 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 승모근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00227
표 28.6. 기준선 (군 A)에 대해 정규화된 실시예 9의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00228
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준 및 Myo1g mRNA 전사체 수준을 다양한 근육 유형에 대해 유사하게 결정하였다. 모든 개별 및 군 Wfdc3 및 Myo1g 상대 발현 값을 기준선 군 (군 A)으로부터의 각각의 평균 상대 발현 수준에 대해 정규화하였다. 타목시펜 투여 (군 B)는 평가된 모든 근육에서 Wfdc3 (4.891 - 11.772배) 및 Myo1g (2.139 - 12.744배) 발현의 극적이고 유의한 증가를 발생시켰다 (모든 각각의 비교에 대해 p < 0.001). 타목시펜-유도된 동물에서, 제3일에 시작하여 (군 C 및 D) 및 제10일에 시작하여 (군 E) 1 또는 5 mg/kg으로 투여된 DUX4 RNAi 작용제 펩티드 1-AD07778-LP29는 Wfdc3 및 Myo1g 발현 증가를 방지하거나 또는 상대적 Wfdc3 및 Myo1g 발현을 기준선 이하로 감소시켰다. DUX4 RNAi 작용제의 투여는 용량 수준 또는 투여 시기에 상관없이 타목시펜 단독 (군 B)보다 유의하게 더 낮은 Wfdc3 및 Myo1g 평균 상대 발현 수준을 생성하였다 (군 C, D 및 E; 모든 각각의 비교에 대해 p < 0.0001).
추가로, 조직 샘플의 조직학을 분석하였다. 근육 절편을 수거일에 수집된 포르말린-고정된 비복근, TA 및 삼두근으로부터 절단하고, H&E 및 PSR을 사용하여 염색하였다. 비복근, TA, 및 삼두근에서, 타목시펜의 투여는 중심에 위치한 핵의 극적인 증가를 유도하였으며, 이는 FLExDUX4/HSA-MCM 동물 (군 B)에서의 활성 근육 복구, 및 섬유증을 나타낸다. 일반적으로, 타목시펜 단독을 투여한 동물 (군 B)과 비교한 경우, 타목시펜 및 DUX4 RNAi 작용제-처리된 동물 (군 C, D, 및 E)로부터의 근육 절편에서 보다 적은 중심 핵 및 보다 적은 섬유증이 관찰되었다. 실제로, 군 C, D 및 E의 동물로부터의 근육 절편은 기준선 군 (군 A)의 것과 유사한 형태를 가졌다. 군 E의 동물 (제1일에 시작하여 타목시펜을 투여한 다음, 제10일에 시작하여 DUX4 RNAi 작용제를 투여함)은 군 C 및 D의 것보다 약간 더 많은 섬유증을 나타내는 경향이 있었다.
본원에 나타낸 바와 같이, 예방 또는 개입 전략을 사용하여 투여된 DUX4 RNAi 작용제는, DUX4 발현 수준을 기준선으로 복귀시키고, DUX4 표적 유전자 및 DUX4 활성의 마커 (Wfdc3 및 Myo1g)의 발현 증가를 예방 또는 감소시키고, 체중 감소를 예방하고 체중을 기준선 수준으로 복귀시키고, 근독성의 징후 (섬유증, 중심 핵 증가, 혈청 크레아티닌 키나제 상승, 근육 중량 감소-9개 근육 중 4개)를 감소시킴으로써, 타목시펜을 경구 위관영양을 통해 투여한 경우 FLExDUX4/HSA-MCM 트랜스제닉 마우스 모델에서 관찰된 FSHD-유사 표현형을 호전시키기에 충분하였다.
실시예 10. FSHD-유사 트랜스제닉 마우스에서 DUX4를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 투여
실시예 2에 기재된 바와 같은 FSHD-유사 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하였다. 평가된 DUX4 RNAi 작용제는 펩티드 1의 표적화 리간드 및 PK/PD 조정제 LP29b에 연결된 DUX4 RNAi 작용제 AD07778이었으며 (완전 변형 및 접합된 센스 및 안티센스 가닥 구조에 대해서는 표 5.4의 AC000448 참조), 이는 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
투여 요법 및 세부사항은 하기 표 29에 제시된다:
표 29. 실시예 10의 마우스에 대한 투여 군.
Figure pct00229
각각의 마우스에게 옥수수 오일 대조군 또는 1 mg/mL 타목시펜 용액을 경구 위관영양을 통해 20 g 체중당 100 μL (5 mg/kg)의 용량 부피로 제1주 동안 1주 2회 및 제2주 내지 제4주 동안 1주 3회 투여하였다.
실시예 10의 RNAi 작용제 (군 2 및 4-6)는 DUX4 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성되고, 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하여 각각의 표적화 리간드 또는 링커에 대한 접합을 용이하게 하였다. 펩티드 1을 DUX4 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합시켰다. 펩티드 1을 센스 가닥의 5' 말단 단부에서 아미드 커플링 반응을 통해 (NH2-C6) 관능화된 RNAi 작용제에 연결하였다 (구조 정보에 대해서는 실시예 6 참조).
실시예 6에서의 DUX4 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 3' 말단 단부에 디술피드 관능기 (C6-SS-C6)를 갖도록 합성하여 PK/PD 조정제에 대한 접합을 용이하게 하였다. LP29b 모이어티를 센스 가닥의 3' 말단 단부에 부착시켜 하기 구조를 갖는 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제로서 제공하였다:
Figure pct00230
여기서 R은 DUX4 RNAi 작용제를 포함한다.
말레이미드 LP29-p는 말단 3' 디술피드 결합을 환원시키고 말단 3' 티올에 마이클 첨가를 수행함으로써 센스 가닥의 3' 말단에 연결하여 RNAi 작용제를 합성하였다.
변형된 RNAi 작용제 뉴클레오티드 서열을 본원에서 표 3, 표 4.1, 표 4.6, 및 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 및 표 5.4에 나타낸 바와 같이 합성하였다 (완전 변형된 접합체를 나타냄).
군 1 (n=6)에서 6마리의 마우스에게 투여하고, 군 2 (n=10)에서 10마리의 마우스에게 투여하고, 군 3-5 (n=8) 각각에서 8마리의 마우스에게 투여하였다.
제26일에, 동물을 희생시키고, 근육을 수거하고, 처리하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라 분석하였다. 수거된 조직에서의 평균 상대 DUX4 발현은 비복근 및 삼두근에 대해 하기 표에 나타낸다:
표 30.1 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00231
표 30.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 DUX4 발현.
Figure pct00232
수거된 조직에서의 평균 상대 Wfdc3 mRNA 전사체 수준을 다양한 비복근 및 삼두근에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 31.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00233
표 31.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Wfdc3 발현.
Figure pct00234
수거된 조직에서의 평균 상대적 Myo1g mRNA 전사체 수준을 다양한 비복근 및 삼두근에 대해 하기 표에 나타낸 바와 같이 유사하게 결정하였다:
표 32.1. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 비복근에서의 평균 상대 Myo1g 발현.
Figure pct00235
표 32.2. 기준선 (군 1)에 대해 정규화된 실시예 10의 마우스에 대한 삼두근에서의 평균 상대 Myo1g 발현.
Figure pct00236
실시예 10의 마우스를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 로타로드 장치에 추가로 적용하여 대운동 협응 평가를 수행하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 연구 지속기간 전반에 걸쳐 DUX4 RNAi 작용제를 투여한 동물 (군 3-5)은 로타로드 장치 상에서의 그의 균형 및 대운동 기능을, 타목시펜을 투여하지 않은 음성 대조군 염수 군 (군 1)과 보다 유사하게 유지할 수 있었다. 반대로, 타목시펜을 투여하였지만 DUX4 RNAi 작용제는 투여하지 않은 동물 (군 2)은 오랫동안 균형 및 운동 기능을 유지할 수 없었고, 제11일까지 훨씬 더 빨리 로타로드 장치로부터 떨어지기 시작하였으며 (군 1, 3 및 4와 비교하여), 이는 군 2의 동물에서 근육 기능의 상실을 나타낸다. 제10일까지 타목시펜을 투여하였지만 DUX4 RNAi 작용제는 투여하지 않은 동물 (군 5)은 유사하게 오랫동안 균형 및 운동 기능을 유지할 수 없었고, 제11일까지 보다 빨리 로타로드 장치에서 떨어지기 시작하였으나; DUX4 RNAi 작용제 투여 (제10일 시작) 후, 제15일까지 이들 동물은 군 1, 3 및 4의 동물과 대등한 시간 동안 로타로드 장치 상에 머물기에 충분한 균형 및 운동 기능을 유지할 수 있었으며, 이는 군 5의 동물에서의 근육 기능의 초기 상실이 DUX4 RNAi 작용제의 투여에 의해 역전된 것을 을 나타낸다.
상기 나타낸 데이터에 의해 입증된 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제는 모델 마우스에서 DUX4 유전자 발현의 실질적 억제 및 대운동 기능 보존 또는 역전된 대운동 기능 상실 (제15일 즈음에 시작하여 군 5에 의해 나타낸 바와 같음)을 나타냈다.
실시예 11. 환자-유래 근관에서의 시험관내 억제 DUX4 RNAi 작용제
동결된 비형질전환 FSHD 환자-유래 근모세포를 코리엘 의학 연구소(Coriell Institute for Medical Research, 뉴저지주 캠던)의 NIGMS 인간 유전 세포 저장소로부터 획득하였다. 시험관내에서 근관으로의 분화시, 이들 세포는 비교적 높은 수준의 DUX4 및 DUX4 단백질의 표적 유전자를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이어서, FSHD 환자-유래 근모세포를 확장시키고, 시험관내 근관으로 분화시켰다.
본 연구의 목적은 형질감염 후 FSHD 환자-유래 근관에서 DUX4 mRNA 발현의 녹다운 및 DUX4 단백질 활성의 바이오마커의 감소에 대한 이 DUX4 RNAi 작용제의 용량 반응을 평가하는 것이었다.
FSHD 환자-유래 근모세포를 확장시키고, 시험관내에서 근관으로 분화시켰다. DUX4 RNAi 작용제를 상업적으로 입수가능한 리포펙타민 형질감염 시약 (RNAiMAX; 써모)을 사용하여 분화 근관 내로 형질감염시켰다. 성숙한 근관 형태가 관찰되면 근관 배양물을 수거하고, DUX4 및 DUX4 표적 유전자 상대 발현을 조사하였다.
환자-유래 근관에서 평가된 DUX4 RNAi 작용제는 펩티드 1의 표적화 리간드 및 PK/PD 조정제 LP29b에 연결된 DUX4 RNAi 작용제 AD07778이었으며 (완전 변형 및 접합된 센스 및 안티센스 가닥 구조에 대해서 표 5.4의 AC000448 참조), 이는 관련 기술분야에 공지되고 본원의 실시예 1에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다.
DUX4 RNAi 작용제를 1.0, 10, 및 100 nM 농도에서 시험하였다. "스크램블된 대조군"을 또한 평가하였으며, 이는 펩티드 1의 표적화 리간드 및 PK/PD 조정제 LP29b에 연결된 DUX4 RNAi 작용제 AD07778과 동일한 표적화 리간드 및 PK/PD 변형제를 포함하지만, 스크램블된 대조군은 활성을 갖지 않고 DUX4 유전자 발현을 억제하지 않을 것으로 예상되는 방식으로 변형되었다.
도 11은 DUX4 RNAi 작용제를 사용한 환자-유래 근관의 용량-의존성 억제를 보여주며, 이는 DUX4 RNAi 작용제가 인간 근육 세포에서 DUX4 mRNA의 제거에 의해 DUX4 단백질 발현을 감소시키는 데 효과적임을 시사한다. 데이터를 "스크램블된 대조군"에 대해 정규화하였다.
추가적으로, DUX4 발현의 특정 바이오마커를 평가하여 이들이 DUX4 RNAi 작용제에 의해 어떻게 영향을 받는지를 결정하였다. 이들은 CCNA1, KHDC1L, LEUTX, MDB3L2, PRAMEF2, PRAMEF6, SLC2A3, SLC34A2, TRIM43 및 ZSCAN4를 포함한다. 이들 유전자는 DUX4 전사 인자의 공지된 유전자 표적이며, 그의 발현 증가가 FSHD 환자 근육 생검에서 DUX4 발현 증가의 마커로서 특징화되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, DUX4 RNAi 작용제가 투여된 세포는 또한 이들 FSHD 바이오마커 유전자에 대한 발현 수준의 감소를 나타냈다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARROWHEAD PHARMACEUTICALS, INC. <120> RNAi Agents for Inhibiting Expression of DUX4, Compositions thereof, and Methods of Use <130> 30679-WO <150> 63/214,742 <151> 2021-06-24 <150> 63/077,272 <151> 2020-09-11 <160> 239 <210> 1 <211> 1574 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Homo sapiens double homeobox 4, transcript variant 2, gene transcript, version NM_001293798.2 <400> 1 atggccctcc cgacaccctc ggacagcacc ctccccgcgg aagcccgggg acgaggacgg 60 cgacggagac tcgtttggac cccgagccaa agcgaggccc tgcgagcctg ctttgagcgg 120 aacccgtacc cgggcatcgc caccagagaa cggctggccc aggccatcgg cattccggag 180 cccagggtcc agatttggtt tcagaatgag aggtcacgcc agctgaggca gcaccggcgg 240 gaatctcggc cctggcccgg gagacgcggc ccgccagaag gccggcgaaa gcggaccgcc 300 gtcaccggat cccagaccgc cctgctcctc cgagcctttg agaaggatcg ctttccaggc 360 atcgccgccc gggaggagct ggccagagag acgggcctcc cggagtccag gattcagatc 420 tggtttcaga atcgaagggc caggcacccg ggacagggtg gcagggcgcc cgcgcaggca 480 ggcggcctgt gcagcgcggc ccccggcggg 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cccaggtacc agcagacctg 1380 cgcgcagtgc gcaccccggc tgacgtgcaa gggagctcgc tggcctctct gtgcccttgt 1440 tcttccgtga aattctggct gaatgtctcc ccccaccttc cgacgctgtc taggcaaacc 1500 tggattagag ttacatctcc tggatgatta gttcagagat atattaaaat gccccctccc 1560 tgtggatcct atag 1574 <210> 2 <211> 1574 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <223> Homo sapiens double homeobox 4, transcript variant 2, gene transcript, version NM_001293798.3 <400> 2 atggccctcc cgacaccctc ggacagcacc ctccccgcgg aagcccgggg acgaggacgg 60 cgacggagac tcgtttggac cccgagccaa agcgaggccc tgcgagcctg ctttgagcgg 120 aacccgtacc cgggcatcgc caccagagaa cggctggccc aggccatcgg cattccggag 180 cccagggtcc agatttggtt tcagaatgag aggtcacgcc agctgaggca gcaccggcgg 240 gaatctcggc cctggcccgg gagacgcggc ccgccagaag gccggcgaaa gcggaccgcc 300 gtcaccggat cccagaccgc cctgctcctc cgagcctttg agaaggatcg ctttccaggc 360 atcgccgccc gggaggagct ggccagagag acgggcctcc cggagtccag gattcagatc 420 tggtttcaga atcgaagggc caggcacccg ggacagggtg gcagggcgcc cgcgcaggca 480 ggcggcctgt 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cccggggatc ccagagccgg cccaggtacc agcagacctg 1380 cgcgcagtgc gcaccccggc tgacgtgcaa gggagctcgc tggcctctct gtgcccttgt 1440 tcttccgtga aattctggct gaatgtctcc ccccaccttc cgacgctgtc taggcaaacc 1500 tggattagag ttacatctcc tggatgatta gttcagagat atattaaaat gccccctccc 1560 tgtggatcct atag 1574 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> DUX4 gene transcript (mRNA) target sequence <400> 3 ggauucagau cugguuuca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> DUX4 gene transcript (mRNA) target sequence <400> 4 gauucagauc ugguuucaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> DUX4 gene transcript (mRNA) target sequence <400> 5 ccuuguucuu ccgugaaau 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> DUX4 gene transcript (mRNA) target sequence <400> 6 guucuuccgu gaaauucua 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> DUX4 gene transcript (mRNA) target sequence <400> 7 accuggauua gaguuacau 19 <210> 8 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sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <220> <221> modified_base <222> 16 <223> n = 2'-O-methylinosine-3'-phosphate <400> 204 caggauucag aucugnuuuc a 21 <210> 205 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 205 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 206 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 206 caggauucag aucugguuuc a 21 <210> 207 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 207 aggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 208 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 208 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 209 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 209 uccuggauga uuaguucaga a 21 <210> 210 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 210 gcccuuguuc uuccgugaaa u 21 <210> 211 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <220> <221> modified_base <222> 1 <223> n = 2'-O-methyl-2-aminoadenosine-3'-phosphate <400> 211 naaccuggau uagaguuaca u 21 <210> 212 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 212 ggaugauuag uucagagaua u 21 <210> 213 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 213 guguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 214 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 214 guguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 215 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 216 aggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 217 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 218 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <220> <221> modified_base <222> 16 <223> n = 2'-O-methylinosine-3'-phosphate <400> 219 caggauucag aucugnuuuc a 21 <210> 220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 220 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 221 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 222 caggauucag aucugguuuc a 21 <210> 223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 223 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 224 caggauucag aucugguuuc a 21 <210> 225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 225 aggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 226 uccuggauga uuaguucaga a 21 <210> 227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <220> <221> modified_base <222> 1 <223> n = 2'-O-methyl-2-aminoadenosine-3'-phosphate <400> 227 naaccuggau uagaguuaca u 21 <210> 228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 228 guguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 229 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 229 guguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 230 gcccuuguuc uuccgugaaa u 21 <210> 231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 231 ggaugauuag uucagagaua u 21 <210> 232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 232 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 233 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 233 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 234 gggauucaga ucugguuuca a 21 <210> 235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 235 cuguucuucc gugaaauucu a 21 <210> 236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 236 caggauucag aucugguuuc a 21 <210> 237 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 237 caggauucag aucugguuuc a 21 <210> 238 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <220> <221> modified_base <222> 1 <223> n = 2-aminoadenine-containing nucleotide <400> 238 nggauucaga ucugguuuca at 22 <210> 239 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand underlying base sequence <220> <221> modified_base <222> 1 <223> n = 2-aminoadenine-containing nucleotide <400> 239 nggauucaga ucugguuuca a 21

Claims (56)

  1. 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서:
    i. 표 2, 표 3, 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥; 및
    ii. 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
    을 포함하는 RNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 2, 표 3, 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2-18을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 센스 가닥이 표 2, 표 4.1, 표 4.2, 표 4.3, 표 4.4, 표 4.5, 표 4.6, 또는 표 5.4에 제공된 서열 중 어느 하나와 0 또는 1개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 17개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 안티센스 가닥에 대해 적어도 85% 상보성인 영역을 갖는 것인 RNAi 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DUX4 RNAi 작용제의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 변형된 뉴클레오시드 연결을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체, 잠금 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 역전된 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 시클로프로필 포스포네이트-함유 뉴클레오티드, 및 3'-O-메틸 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제.
  7. 제5항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합인 RNAi 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 표 4.1, 표 4.2, 표 4.3, 표 4.4, 표 4.5, 표 4.6 또는 표 5.4에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  10. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 표 3에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 표 4.1, 표 4.2, 표 4.3, 표 4.4, 표 4.5, 표 4.6 또는 표 5.4에 제공된 변형된 서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  13. 제12항에 있어서, 표적화 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 발현된 세포 수용체에 대한 친화도를 갖는 것인 RNAi 작용제.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 하기로 이루어진 군 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제:
    Figure pct00237

    Figure pct00238

    Figure pct00239

    Figure pct00240

    Figure pct00241

    Figure pct00242

    Figure pct00243

    여기서
    Figure pct00244
    는 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 약동학적/약역학적 (PK/PD) 조정제에 추가로 연결된 RNAi 작용제.
  17. 제16항에 있어서, PK/PD 조정제가 센스 가닥에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  18. 제17항에 있어서, PK/PD 조정제가 센스 가닥의 3' 말단 단부에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, PK/PD 조정제가 하기로 이루어진 군 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제:
    Figure pct00245

    Figure pct00246

    Figure pct00247

    Figure pct00248

    Figure pct00249

    Figure pct00250

    여기서
    Figure pct00251
    는 RNAi 작용제에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PK/PD 조정제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 RNAi 작용제:
    Figure pct00252

    Figure pct00253

    Figure pct00254

    Figure pct00255

    Figure pct00256

    Figure pct00257

    여기서 RZ는 RNAi 작용제를 포함한다.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥이 17 내지 30개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  22. 제21항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  23. 제22항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 RNAi 작용제.
  24. 제23항에 있어서, 2개의 평활 말단을 갖는 RNAi 작용제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 말단 캡을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1 또는 2개의 역전된 무염기성 데옥시리보스 잔기를 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제:
    UAGAAUUUCACGGAAGAAC (서열식별번호:22);
    UGAAACCAGAUCUGAAUCC (서열식별번호:10);
    UUGAAACCAGAUCUGAAUC (서열식별번호:14);
    UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (서열식별번호:164);
    UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (서열식별번호:162);
    UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (서열식별번호:163); 및
    UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (서열식별번호:169).
  28. 제27항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제:
    usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82);
    cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84);
    cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100);
    cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101);
    cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97);
    cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99);
    cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75);
    usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96);
    cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76);
    cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89); 및
    cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87);
    여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신, 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신, 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 센스 가닥 상의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
  30. 제29항에 있어서, 센스 가닥이 하기 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') 중 하나와 0 또는 1개 뉴클레오티드만큼 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고:
    caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147);
    aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148)
    cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149);
    gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156); 및
    gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159);
    여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신, 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신, 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인
    RNAi 작용제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하며:
    (i) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:82)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (ii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:84)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (iii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:100)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (iv) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (서열식별번호:101)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (서열식별번호:149)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (v) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:97)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (vi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:99)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (vii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (서열식별번호:75)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (viii) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (서열식별번호:96)으로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') caggauucAfGfAfucugguuuca (서열식별번호:147)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (ix) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (서열식별번호:76)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:148)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    (x) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (서열식별번호:89)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (서열식별번호:156)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥; 또는
    (xi) 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (서열식별번호:87)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 안티센스 가닥, 및 변형된 뉴클레오티드 서열 (5' → 3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (서열식별번호:159)로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 센스 가닥;
    여기서 a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신, 및 2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 2'-플루오로 시티딘, 2'-플루오로 구아노신, 및 2'-플루오로 우리딘을 나타내고; cPrpu는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘을 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 여기서 각각의 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 단부 및 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기를 추가로 임의로 포함하고; 센스 가닥은 또한 센스 가닥의 5' 말단 단부에 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 표적화 리간드를 임의로 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 골격근 세포 및/또는 골격근 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 친화도를 갖고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 3' 말단 단부에서 역전된 무염기성 잔기에 공유 연결된 PK/PD 조정제를 추가로 임의로 포함하는 것인
    RNAi 작용제.
  32. 제1항에 있어서, 표 5.1, 표 5.2, 표 5.3, 또는 표 5.4의 듀플렉스 중 어느 하나의 구조를 갖는 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되는 RNAi 작용제.
  33. 제32항에 있어서, 센스 가닥이 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 역전된 무염기성 데옥시리보스 잔기를 추가로 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  34. 제33항에 있어서, 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 작용제.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥이 표적화 리간드에 연결된 것인 RNAi 작용제.
  36. 제35항에 있어서, 표적화 리간드가 골격근 세포 상에 발현된 세포 수용체에 대한 친화도를 갖는 것인 RNAi 작용제.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 표적화 리간드가 표 6.2 또는 표 6.3에 제시된 구조를 갖는 화합물을 포함하는 것인 RNAi 작용제.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 염인 RNAi 작용제.
  39. 제38항에 있어서, 나트륨 염 형태인 RNAi 작용제.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제를 포함하고, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  41. 세포 내로 유효량의 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제40항의 조성물을 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 DUX4 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, DUX4 유전자 발현이 적어도 약 40% 억제되는 것인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, DUX4 단백질 수준이 적어도 약 40%만큼 감소되는 것인 방법.
  46. DUX4 단백질 수준의 감소, DUX4 mRNA 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 호전될 수 있는 1종 이상의 증상 또는 질환의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 치료 유효량의 제40항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, DUX4 단백질 수준의 감소, DUX4 mRNA 수준의 감소에 의해 적어도 부분적으로 호전될 수 있는 1종 이상의 증상 또는 질환을 치료하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 질환이 FSHD인 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, DUX4 유전자 발현이 대상체의 척추주위, 안면, 몸통, 복부 및 사지 근육 조직 중 1종 이상에서 감소되는 것인 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, DUX4 유전자 발현이 대상체의 삼두근, 이두근, 사두근, 비복근, 가자미근, EDL (장지신근), TA (전경골근) 또는 횡경막 중 1종 이상에서 감소되는 것인 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 작용제를 약 0.5 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg 체중의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, RNAi 작용제를 피하 (SQ) 주사에 의해 투여하는 것인 방법.
  52. 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준의 감소 또는 DUX4 mRNA 수준의 감소, 또는 둘 다에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료를 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 RNAi 작용제 또는 제40항에 따른 조성물의 용도.
  53. 적어도 부분적으로 DUX4 단백질 수준의 감소 또는 DUX4 mRNA 수준의 감소, 또는 둘 다에 의해 매개되는 질환, 장애, 또는 증상의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제40항에 따른 조성물의 용도.
  54. 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서:
    i. 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:2의 부분에 적어도 부분적으로 상보적인 18 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제;
    ii. 골격근 세포에 대한 친화도를 갖는, RNAi 작용제에 연결된 표적화 리간드; 및
    iii. RNAi 작용제에 연결된 PK/PD 조정제
    를 포함하는 조성물.
  55. 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서:
    i. 서열식별번호: 1의 15개의 인접 뉴클레오티드의 스트레치와 0, 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥; 및
    ii. 센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥
    을 포함하는 RNAi 작용제.
  56. 이중 호메오박스 4 (DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제로서:
    i. 서열식별번호: 1의 15개의 인접 뉴클레오티드의 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적인 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥; 및
    ii. 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥
    을 포함하는 RNAi 작용제.
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