JP2023501246A - ベータＥＮａＣの発現を阻害するＲＮＡｉ剤、その組成物および使用方法 - Google Patents

ベータＥＮａＣの発現を阻害するＲＮＡｉ剤、その組成物および使用方法 Download PDF

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Abstract

RNAi剤、RNAi剤を含む組成物、およびベータENaC (SCNN1B)遺伝子を阻害する方法について記載する。本明細書に開示のベータENaC RNAi剤およびRNAi剤の複合体は、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する。１種以上のベータENaC RNAi剤を含み、１種以上のさらなる治療剤を任意に含む医薬組成物についても記載する。記載のベータENaC RNAi剤を上皮細胞、たとえば肺上皮細胞にインビボで送達することで、ベータENaC遺伝子発現の阻害およびENaC活性が低下し、それにより、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む様々な疾患の処置について対象（ヒト対象を含む）に治療上の利益を付与する。【選択図】図２２

Description

本出願は、2020年5月14日出願の米国仮特許出願第63/024,722号および2019年10月29日出願の米国仮特許出願第62/927,637号の優先権を主張する。同出願の内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は配列表を含む。その配列表はASCII形式で提出されたものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ASCIIコピーは30678-WO_SEQLIST.txtと名付けられ、65 kbの大きさである。
本開示は、ベータENaC遺伝子発現を阻害するためRNA干渉(RNAi)剤、たとえば二本鎖RNAi剤、ベータENaC RNAi剤を含む組成物、およびそれらの使用方法に関する。
脊椎動物のアミロライド感受性上皮性ナトリウムチャネル（「ENaC」または「アミロライド感受性ナトリウムチャネル」）は、デジェネリン／ENaCチャネルスーパーファミリーのメンバーであり、２つの膜貫通ドメイン、細胞内NおよびC末端、ならびにフーリンプロテアーゼの基質である大きな細胞外ループを特徴とする。このチャネルは、３つの別個の遺伝子SCNN1A (アルファ)、SCNN1B (ベータ)、およびSCNN1G (ガンマ)によりコードされる３つの相同サブユニット（アルファ(α)、ベータ(β)、およびガンマ(γ))で構成されるヘテロ三量体複合体である。十分なチャネル活性には３つのサブユニットすべてが必要である。SCNN1Dによりコードされる第４のサブユニット（デルタ(δ)）は、精巣および卵巣で発現され、機能面ではそれらの組織内のアルファ(α)サブユニットに代わることができる可能性がある。
ENaCは、上皮細胞の頂端膜、特に肺、腎遠位曲尿細管、胃腸(GI)管、生殖器系、および目の眼表面上皮で発現される。これらの上皮で、ENaCは細胞外ナトリウムイオンの流入を媒介し、ナトリウムイオンは次いで基底外側ナトリウム・カリウムATPアーゼにより細胞から能動輸送され、それにより浸透圧濃度勾配が確立され、上皮内腔の水が間質内に吸収される。腎臓では、ENaCは電解質平衡および血圧に関与し、アミロライドなどの全身の小分子利尿剤の標的である。肺では、気道上皮ENaCが肺の水分補給および粘液線毛クリアランスの調節に重要な役割を果たす。
SCNN1A、SCNN1B、またはSCNN1Gの機能喪失変異を有する１型偽性低アルドステロン症(PHA)患者は、過剰な気道表面液を産生し、有意に高い粘液線毛クリアランス率を有する。一方、気道上皮ENaC活性は、あらゆる遺伝子型の嚢胞性線維症(CF)患者で有意に上昇する。嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)塩素イオンチャネル活性の低下と共に、ENaC活性の増加はCF肺疾患患者における気道乾燥および粘液線毛静止の根底にある主な発症機序である。
当初は吸入小分子ENaC阻害剤がCFの処置に有望であったが、その臨床開発は、肺での作用持続期間が短いことや、腎臓ENaCの阻害に関連するオン・ターゲット毒性（高カリウム血症）により制限されてきた（たとえば、O’Riordan et al., 27 J. Aerosol Med. & Pulmonary Drug Dev., 200-208 (2014)を参照のこと）。
ベータENaC遺伝子（すなわちSCNN1B）の発現を阻害することができる特定のRNAi剤が以前に特定されている（たとえば米国特許第8,344,127号に開示されたものなど）。しかし、別の配列や特定の化学修飾を有するその他のRNAi剤構築物が、より有効な治療薬に使用することのできるさらに優れた治療特性を持つ可能性がある。ベータENaC関連疾患および障害の処置に十分な、より優れた効力を持つベータENaC RNAi剤が依然として必要である。
ベータENaC（すなわちSCNN1B）遺伝子の発現を選択的かつ効率的に阻害することができる新規のRNA干渉(RNAi)剤（RNAi剤、RNAiトリガー、またはトリガーという）、たとえば二本鎖RNAi剤が依然として必要である。また、ENaC活性の増加に関連する疾患もしくは障害、および／またはENaC活性の低下に少なくとも部分的に媒介される可能性のある疾患もしくは障害を処置するための新規のベータENaC特異的RNAi剤の組成物が必要である。
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のヌクレオチド配列および化学修飾、さらにはベータENaC RNAi剤をインビボで選択的かつ効率的に送達するのに適した特定の特異的標的リガンドと組み合わせることは、以前に開示済みまたは当技術分野で公知のものとは異なる。本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、ベータENaC遺伝子の発現の非常に強力で効率的な阻害を提供する。
一般に、本開示はベータENaC遺伝子に特異的なRNAi剤、ベータENaC RNAi剤を含む組成物、さらには、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤やベータENaC RNAi 剤を含む組成物を用いてベータENaC遺伝子の発現をインビトロおよび／またはインビボで阻害する方法を特徴とする。本明細書に記載のベータENaC RNAi剤は、ベータENaC遺伝子の発現を選択的かつ効率的に低下させて対象（たとえば、ヒトまたは動物の対象）のENaCレベルを下げる、対象のENaC活性を下げる、あるいは対象のENaCレベルとENaC活性の両方を下げることができる。
記載のベータENaC RNAi剤を、ENaC活性レベルの増加または上昇（enhanced or elevated）に関連する症状および疾患の治療処置（予防（preventative）処置または予防（prophylactic）処置を含む）方法に使用することができる。症状および疾患としては、様々な呼吸器疾患、たとえば嚢胞性線維症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全、および肺がん嚢胞性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、COPDに罹患している対象では、後天性CFTRおよびENaC機能障害が気道内の粘膜の乾燥や肺の毒素および感染病原体の排除能力の低下に関与することが知られている。
記載のベータENaC RNAi剤を、たとえば眼表面上皮（結膜上皮など）のENaC活性レベルの増加または上昇に関連する症状および疾患の治療処置（予防処置を含む）方法（ドライアイ症候群などの眼疾患および障害の治療など）に使用することができる。
一局面では、本開示は、ベータENaC (SCNN1B)遺伝子の発現を阻害するRNAi剤を特徴とする。ここで、このRNAi剤はセンス鎖（パッセンジャー鎖ともいう）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖ともいう）を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、部分的、実質的、または完全に互いに相補的であってもよい。本明細書に記載のRNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さは、それぞれ16～49ヌクレオチド長であってもよい。実施態様によっては（In some embodiments）、センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して17～26ヌクレオチド長であってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して21～26ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して21～24ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖はいずれも21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、アンチセンス鎖は独立して18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖は独立して16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、または49ヌクレオチド長である。本明細書に記載のRNAi剤は、ベータENaCを発現する細胞、たとえば肺上皮細胞に送達されるとインビボおよび／またはインビトロで１つ以上のベータENaC遺伝子の発現を阻害する。
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、ヒトベータENaC遺伝子を標的とする（たとえば配列番号1を参照のこと）。実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、表1に開示の配列のいずれかの配列を有するベータENaC遺伝子の一部を標的とする。
別の局面では、本開示は、ベータENaC遺伝子の発現を選択的かつ効率的に低下させることができる開示のベータENaC RNAi剤のうちの１種以上を含む組成物（医薬組成物など）を特徴とする。本明細書に記載の１種以上のベータENaC RNAi剤を含む組成物を、ENaC活性の増加または上昇（本明細書では、ENaC活性レベルの増加またはENaC活性レベルの上昇ともいう）に関連する症状および疾患の処置（予防処置または阻害を含む）のために対象（たとえばヒトまたは動物の対象）に投与することができる。
ベータENaC RNAi剤に使用することができるベータENaC RNAi剤センス鎖およびアンチセンス鎖の例を表3および4に示す。ベータENaC RNAi剤二本鎖の例を表5Aおよび5Bに示す。本明細書に開示の特定のベータENaC RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を構成するあるいはそれらに含まれてもよい19ヌクレオチドのコアストレッチ配列の例を表2に示す。
別の局面では、本開示はベータENaC RNAi剤を対象（たとえば哺乳動物）の上皮細胞にインビボで送達する方法を特徴とする。このような方法に使用される組成物も本明細書に記載する。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を対象にインビボで肺上皮細胞に送達する方法を本明細書に開示する。実施態様によっては、対象はヒト対象である。
本明細書に開示の方法は、１種以上のベータENaC RNAi剤を当技術分野で公知の任意の好適な手段で対象（たとえばヒトまたは動物の対象）に投与することを含む。局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかに応じて、１種以上のベータENaC RNAi剤を含む本明細書に開示の医薬組成物をいくつかの方法で投与することができる。投与は、たとえば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、皮下（たとえば埋込型装置による）、および実質内投与であってもよいが、これらに限定されない。実施態様によっては、本明細書に記載の医薬組成物を吸入（たとえば乾燥粉剤吸入またはエアロゾル吸入）、鼻腔内投与、気管内投与、または口咽頭吸入投与により投与する。
実施態様によっては、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤は肺上皮のベータENaC遺伝子の発現を阻害することが望ましく、そのために投与は（たとえば定量吸入器などの吸入装置、またはジェット式もしくは振動式メッシュ噴霧器などの噴霧器、またはソフトミスト吸入器による）吸入である。
当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を用いて、１種以上のベータENaC RNAi剤を標的細胞または組織に送達することができる。実施態様によっては、RNAi剤を標的基に共有結合させることでベータENaC RNAi剤を細胞または組織に送達する。実施態様によっては、この標的基は細胞受容体リガンド、たとえばインテグリン標的リガンドを包含し得る。インテグリンは、細胞と細胞外基質(ECM)との接着を促す膜貫通受容体のファミリーである。特に、インテグリンベータ-v-ベータ-6 (αvβ6)は、ECMタンパク質およびTGF-ベータ潜在関連ペプチド(LAP)の受容体であることが知られている上皮特異的インテグリンであり、様々な細胞や組織で発現される。インテグリンαvβ6は、損傷した肺上皮では非常に増加することが知られている。実施態様によっては、インテグリンαvβ6に親和性を持つインテグリン標的リガンドに本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を結合させる。本明細書で言及する場合、「αvβ6インテグリン標的リガンド」は、それが接着されたRNAi剤の所望の細胞および／または組織への（すなわちインテグリンαvβ6発現細胞への）標的化および送達を促すリガンドとして使用することができる、インテグリンαvβ6に親和性を持つ化合物である。実施態様によっては、複数のαvβ6インテグリン標的リガンドまたはαvβ6インテグリン標的リガンドのクラスターをベータENaC RNAi剤に結合させる。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤-αvβ6インテグリン標的リガンド複合体を受容体依存性エンドサイトーシスまたは他の手段で肺上皮細胞により選択的に内部移行する。
αvβ6インテグリン標的リガンドを含むベータENaC RNAi剤を送達するのに有用な標的基の例は、たとえば国際特許出願公開第WO 2018/085415号および国際特許出願公開第WO 2019/089765号に開示されている。これらの内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
標的基をベータENaC RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3′または5′末端に連結してもよい。実施態様によっては、標的基をセンス鎖の3′または5′末端に連結する。実施態様によっては、標的基をセンス鎖の5′末端に連結する。実施態様によっては、標的基をRNAi剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖内部のヌクレオチドに連結する。実施態様によっては、リンカーを介して標的基をRNAi剤に連結する。
別の局面では、本開示は、表5Aおよび5Bに開示の二本鎖構造を有する１種以上のベータENaC RNAi剤を含む組成物を特徴とする。
ベータENaC RNAi剤の使用により、ENaC活性の低下により治療効果を付与することができる疾患または障害の（予防を含む）治療処置の方法が得られる。本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を様々な呼吸器疾患、たとえば嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全、および肺がん嚢胞性線維症の処置に用いてもよい。ベータENaC RNAi剤を様々な眼疾患および眼障害、たとえばドライアイの処置にさらに用いてもよい。このような処置方法は、上昇または増加したENaC活性レベルを有するヒトまたは動物にベータENaC RNAi剤を投与することを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；および
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；および
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と1個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべては修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；および
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、上記各配列はアンチセンス鎖の1～21位（5'→3'）に位置する。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)；
usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)；
usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)；
usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)；
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)；
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)；
cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)；および
cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と1個以下のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、
配列中、a、c、g、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し；sはホスホロチオアート結合を示す。センス鎖はアンチセンス鎖と少なくとも実質的に相補的である。当業者はよく分かっていることだが、本明細書に開示の修飾ヌクレオチド配列に示されるようにホスホロチオアート結合を含めることにより、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合が置換される（たとえば、すべてのヌクレオシド間結合を示す図21A～21Lを参照のこと）。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
(i)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (配列番号234)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(ii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cscuacaguGfAfCfuacaacacia (配列番号235)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(iii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (配列番号236)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(iv)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(v)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usggggagaUfCfAfucauciacuu (配列番号238)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(vi)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(vii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(viii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(ix)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(x)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；あるいは
(xi)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖、および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号241)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖を含み、
配列中、a、c、g、i、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルイノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し；sはホスホロチオアート結合を示す。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
(i)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (配列番号234)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(ii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cscuacaguGfAfCfuacaacacia (配列番号235)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(iii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (配列番号236)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(iv)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(v)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）usggggagaUfCfAfucauciacuu (配列番号238)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(vi)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(vii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(viii)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(ix)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；
(x)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖；あるいは
(xi)修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖および修飾ヌクレオチド配列（5'→3'）gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号241)からなる、それから本質的になる、またはそれを含むセンス鎖を含み、
配列中、a、c、g、i、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルイノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し、sはホスホロチオアート結合を示す。各センス鎖はヌクレオチド配列の3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、このベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれにおいても、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、
このベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれにおいても、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、センス鎖はヌクレオチド配列の3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、
このベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれにおいても、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり；センス鎖はヌクレオチド配列の3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含み；各アンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の1～21位に位置する。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は、
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)およびCGUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号217)；または
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)およびCCUACAGUGACUACAACACIA (配列番号219)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)およびGGGAGAAAUACUGCAACAACA (配列番号222)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)およびGCAACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号223)；または
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)およびUGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (配列番号224)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)およびGCAACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号227)；または
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)およびCUUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号245)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)およびGC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号229)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)およびGC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号230)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）
のヌクレオチド配列（5'→3'）対のうちの１つと0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれにおいても、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は、
UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)およびCGUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号217)；または
UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)およびCCUACAGUGACUACAACACIA (配列番号219)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)およびGGGAGAAAUACUGCAACAACA (配列番号222)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)およびGCAACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号223)；または
AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)およびUGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (配列番号224)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)およびGCAACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号227)；または
UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)およびCUUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号245)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)およびGC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号229)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)およびGC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号230)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）
のヌクレオチド配列（5'→3'）対のうちの１つと0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれにおいても、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)；
usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)；
usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)；
usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)；
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)；
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)；
cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)；および
cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)
のヌクレオチド配列（5'→3'）のうちの１つと0または1個のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、
配列中、a、c、g、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し、sはホスホロチオアート結合を示し；このベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；センス鎖のすべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)；
usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)；
usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)；
usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)；
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)；
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)；
cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)；および
cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)
のヌクレオチド配列（5'→3'）のうちの１つの配列と0または1個のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含む。配列中、a、c、g、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し、sはホスホロチオアート結合を示し；このベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；センス鎖のすべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり；センス鎖はヌクレオチド配列の3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は、
usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)および
csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (配列番号234)；
usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)および
cscuacaguGfAfCfuacaacacia (配列番号235)；
usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)および
gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (配列番号236)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)；
asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)および
usggggagaUfCfAfucauciacuu (配列番号238)；
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)；
cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)；
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)；
cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)；または
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号241)
のヌクレオチド配列（5'→3'）対のうちの１つと0または1個のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含み、
配列中、a、c、g、i、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルイノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し、sはホスホロチオアート結合を示す。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖は、
usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)および
csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (配列番号234)；
usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)および
cscuacaguGfAfCfuacaacacia (配列番号235)；
usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)および
gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (配列番号236)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)；
asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)および
usggggagaUfCfAfucauciacuu (配列番号238)；
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)；
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)；
cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)；
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)および
gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)；
cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)；または
cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)および
gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号241)
のヌクレオチド配列（5'→3'）対のうちの１つの配列対と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含み、
配列中、a、c、g、i、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルイノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し、sはホスホロチオアート結合を示し、センス鎖はヌクレオチド配列の3'末端に逆位脱塩基残基をさらに含み、センス鎖は5'末端に共有結合した標的リガンドも含み、この標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (配列番号60)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGA (配列番号27)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUA (配列番号30)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (配列番号53)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、
AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (配列番号60)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGA (配列番号27)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUA (配列番号30)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (配列番号53)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含み、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、：
AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (配列番号60)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15)；
UUGUUGUAGUCACUGUAGA (配列番号27)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUA (配列番号30)；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (配列番号53)；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16)
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。各配列はアンチセンス鎖の1～19位（5'→3'）に位置する。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖はそれぞれ、
UUGUUGUAGUCACUGUAGA (配列番号27)およびUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号80)；または
UCGUGUUGUAGUCACUGUA (配列番号30)およびUACAGUGACUACAACACIA (配列番号86)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (配列番号53) および GAGAAAUACUGCAACAACA (配列番号106)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15) および AACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号68)；または
AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (配列番号60) および GGGAGAUCAUCAUCIACUU (配列番号115)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）; または
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16) および AACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号69)；または
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15) および (A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号242)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）；または
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16) および (A2N)ACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号243)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）対と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含む。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、このアンチセンス鎖およびセンス鎖はそれぞれ、
UUGUUGUAGUCACUGUAGA (配列番号27)およびUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号80)；
UCGUGUUGUAGUCACUGUA (配列番号30)およびUACAGUGACUACAACACIA (配列番号86)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；
UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (配列番号53)およびGAGAAAUACUGCAACAACA (配列番号106)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15)およびAACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号68)；
AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (配列番号60)およびGGGAGAUCAUCAUCIACUU (配列番号115)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16)およびAACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号69)；
AGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号15)および(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号242)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）；ならびに
UGUUGAAGAUGUAACAGUU (配列番号16)および(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号243)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列（5'→3'）対と0または1個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含む。すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、それぞれが独立に修飾または未修飾であってもよい連結されたヌクレオシドの重合体を意味する。
本明細書で使用される場合、「RNAi剤」（「RNAiトリガー」ともいう）は、標的メッセンジャーRNA(mRNA)のmRNA転写物の翻訳を配列特異的な様式で低減または阻害する（たとえば適切な条件で低減または阻害する）ことができるRNAまたはRNA様の（たとえば化学修飾RNA）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物を意味する。本明細書で使用される場合、RNAi剤は、RNA干渉機構（すなわち、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構(RNA誘導サイレンシング複合体すなわちRISC)との相互作用によりRNA干渉を誘導すること）により動作してもよいし、任意の代替的な機構または経路により動作してもよい。RNAi剤は、この用語が本明細書で使用される場合、主にRNA干渉機構により動作すると考えられるが、開示のRNAi剤はいかなる特定の経路または作用機序にも制約または限定されない。本明細書に開示のRNAi剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖で構成され、低分子（または小分子）干渉RNA (siRNA)、二本鎖RNA (dsRNA)、マイクロRNA (miRNA)、低分子ヘアピン型RNA (shRNA)、およびダイサー基質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のRNAi剤のアンチセンス鎖は、標的とされるmRNA（すなわちベータENaC mRNA）と少なくとも部分的に相補的である。RNAi剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチドおよび／または１つ以上の非ホスホジエステル結合を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、所定の遺伝子の発現に言及する場合の「発現抑制する」、「低下させる」、「阻害する」、「減少させる」、または「ノックダウンする」という用語は、その遺伝子が転写された細胞、細胞群、組織、器官、または対象内で遺伝子から転写されるRNAのレベルまたはmRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質サブユニットのレベルで測定したその遺伝子の発現が、細胞、細胞群、組織、器官、または対象を本明細書に記載のRNAi剤で処置した場合に、そのように処置されていない第二の細胞、細胞群、組織、器官、または対象と比較して低下することを意味する。
本明細書で使用される場合、「配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸塩基またはヌクレオチドの連続または順序を意味し、標準の命名法を用いて文字の連続で記載される。
本明細書で使用される場合、「塩基」、「ヌクレオチド塩基」、または「核酸塩基」は、ヌクレオチドの成分である複素環ピリミジンまたはプリン化合物であり、主要なプリン塩基アデニンおよびグアニン、ならびに主要なピリミジン塩基シトシン、チミン、およびウラシルを含む。核酸塩基は、限定されるわけではないが、汎用塩基、疎水性塩基、乱雑（promiscuous）塩基、拡大塩基、およびフッ素化塩基を含むようにさらに修飾されていてもよい（たとえば、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008を参照のこと）。このような修飾核酸塩基（修飾核酸塩基を含むホスホラミダイト化合物を含む）の合成は当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、第１の核酸塩基またはヌクレオチド配列（たとえば、RNAi剤のセンス鎖または標的化されたmRNA）を第２の核酸塩基またはヌクレオチド配列（たとえば、RNAi剤のアンチセンス鎖または一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）との関連で記述するのに使用される場合の「相補的」という用語は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと特定の標準的条件でハイブリダイズし（哺乳動物の生理学的条件（あるいは他の好適なインビボまたはインビトロの条件）で塩基対水素結合を形成し）て二本鎖または二重らせん構造を形成する能力を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション試験に最適の条件のセットを選択することができる。相補配列は、ワトソン-クリック塩基対または非ワトソン-クリック塩基対を含み、少なくとも上記のハイブリダイゼーション要件が満たされる程度で、天然もしくは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体を含む。配列同一性または相補性は、修飾とは無関係である。たとえば、本明細書で定義されるaおよびAfは、同一性または相補性を決定する目的では、U（またはT）と相補的であり、Aと同一である。
本明細書で使用される場合、「完全に（perfectly）相補的」または「完全に（fully）相補的」は、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基のすべて（100%）が第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列のすべてを含んでもよいし、一部を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「部分的に相補的」は、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基の少なくとも70%（ただしすべてではない）が第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列のすべてを含んでもよいし、一部を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」は、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基の少なくとも85%（ただしすべてではない）が第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列のすべてを含んでもよいし、一部を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「相補的」、「完全に相補的」、「部分的に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、RNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはRNAi剤のアンチセンス鎖とベータENaC mRNAの配列との間の核酸塩基またはヌクレオチドの一致について使用される。
本明細書で使用される場合、核酸配列に用いられる「実質的に同一」または「実質的に同一であること」という用語は、ヌクレオチド配列（またはヌクレオチド配列の一部）が、参照配列と比較して少なくとも約85%の配列同一性またはそれより高い（たとえば少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも99%の）同一性を有することを意味する。配列同一性のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウで比較して決定される。パーセンテージは、同じ型の核酸塩基が両配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めて計算される。本明細書に開示の発明は、本明細書に開示のものと実質的に同一のヌクレオチド配列を包含する。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」などの用語は、対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度、および／または頻度の緩和または軽減を得るために取られる方法または工程を意味する。本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」は、予防、管理、予防処置、ならびに／または対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度、および／もしくは頻度の阻害もしくは減少を包含し得る。
本明細書で使用される場合、RNAi剤に言及する場合の「細胞への導入」という語句は、RNAi剤を細胞内に機能的に送達することを意味する。「機能的送達」という語句は、RNAi剤が期待される生物活性、たとえば遺伝子発現の配列特異的な阻害を有することができるような様式で、RNAi剤を細胞内に送達することを意味する。
特に記述しない限り、本明細書で使用される記号
Figure 2023501246000002
 の使用は、本明細書に記載の発明の範囲に従って任意の基をそれに連結してもよいことを意味する。
本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、同一の分子式を有するが性質またはその原子の結合の配列もしくは空間内のその原子の配置は異なる化合物を指す。空間内のその原子の配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。互いに鏡像ではない立体異性体を「ジアステレオマー」、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体を「エナンチオマー」または場合によって光学異性体と呼ぶ。４個の同一でない置換基に結合した炭素原子を「キラル中心」と呼ぶ。
本明細書で使用される場合、特定の配座を有すると構造中で具体的に特定しない限り、不斉中心が存在することでエナンチオマー、ジアステレオマー、または他の立体異性配置を生じる各構造について、本明細書に開示の各構造は、そのような可能な異性体すべて（その光学的に純粋な形態およびラセミ形態を含む）を表すことが意図される。たとえば、本明細書に開示の構造は、単一の立体異性体と同様にジアステレオマーの混合物も包含することが意図される。
本明細書の特許請求の範囲で使用される場合、「からなる(consisting of)」という語句は、特許請求の範囲で特定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書の特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる(consisting essentially of)」という語句は、特許請求の範囲を、特定された材料または工程、および特許請求された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないものに限定する。
当業者であれば容易に理解・認識することだが、本明細書に開示の化合物および組成物は、その化合物または組成物が置かれる環境に応じて、プロトン化または脱プロトン化された状態の特定の原子（たとえば、N、O、またはS原子）を有してもよい。したがって、本明細書で使用される場合、本明細書に開示の構造は、特定の官能基、たとえばOH、SH、またはNHなどがプロトン化または脱プロトン化されていてもよいことを想定している。当業者であれば容易に理解するように、本明細書の開示は、開示される化合物および組成物を環境（pHなど）に基づくそれらのプロトン化の状態に関係なく包含するよう意図されている。なお、同様に、不安定なプロトンまたは塩基性原子を有する本明細書に記載の化合物は、対応する化合物の塩形態も表す。本明細書に記載の化合物は、遊離酸、遊離塩基、または塩形態であってもよい。なお、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容される塩は本発明の範囲内である。
本明細書で使用される場合、２つの化合物または分子間の接続に言及する場合の「連結された」または「結合された」という用語は、２つの化合物または分子が共有結合されていることを意味する。記述しない限り、本明細書で使用される「連結された」および「結合された」という用語は、任意の介在する原子または原子群の有無にかかわらず第１の化合物と第２の化合物との間の接続を指してもよい。
本明細書で使用される場合、「含む(including)」という用語は、「含むが、限定されるものではない(including but not limited to)」という語句を意味するよう本明細書で使用され、それと互換的に使用される。「または、もしくは、あるいは(or)」という用語は、文脈上そうでないことが明確に示されない限り、「および、ならびに／または、もしくは、あるいは(and/or)」を意味するように本明細書で使用され、それと互換的に使用される。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するまたは等価である方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め本明細書が優先される。また、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
本発明の他の目的、特徴、局面、および利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。
図１は、本明細書でトリ-SM2と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図２は、本明細書でトリ-SM1と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図３は、本明細書でトリ-SM6.1と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図４は、本明細書でトリ-SM9と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図５は、本明細書でトリ-SM6と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図６は、本明細書でトリ-SM8と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図７は、本明細書でトリ-SM10と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図８は、本明細書でトリ-SM11と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの化学構造を表す。
図９は、ベータENaC RNAi剤AD06598をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例６にさらに詳細に記載する）。
図１０は、ベータENaC RNAi剤AD07217をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-7」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例８および１１にさらに詳細に記載する）。
図１１は、ベータENaC RNAi剤AD07099をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-5」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例７および１１にさらに詳細に記載する）。
図１２は、ベータENaC RNAi剤AD07255をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-16」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例１０にさらに詳細に記載する）。
図１３は、ベータENaC RNAi剤AD07253をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-14」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例１０にさらに詳細に記載する）。
図１４は、ベータENaC RNAi剤AD07252をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-13」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例１０にさらに詳細に記載する）。
図１５は、ベータENaC RNAi剤AD07251をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-12」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例９にさらに詳細に記載する）。
図１６は、ベータENaC RNAi剤AD07250をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-11」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例９にさらに詳細に記載する）。
図１７は、ベータENaC RNAi剤AD07240をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-10」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例９にさらに詳細に記載する）。
図１８は、ベータENaC RNAi剤AD06599をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-9」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例８にさらに詳細に記載する）。
図１９は、ベータENaC RNAi剤AD07217をセンス鎖の5'末端でシステイン-マレイミドリンカーを用いて三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-8」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例８にさらに詳細に記載する）。
図２０は、ベータENaC RNAi剤AD06598をセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合し（「APERC-2」と呼ぶ）等張生理食塩水に配合したものを投与されたヒツジの粘液線毛クリアランスレベルである（実施例７にさらに詳細に記載する）。
図２１Ａは、ベータENaC RNAi剤AD06495（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。 図２１Ａ～２１Ｌで、以下の略語を用いる。a、c、g、およびuは、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドである。Af、Cf、Gf、およびUfは、2'-フルオロ修飾ヌクレオチドである。oはホスホジエステル結合である。sはホスホロチオアート結合である。invAbは逆位脱塩基残基（表６を参照のこと）である。a_2Nは2'-O-メチル-2-アミノアデノシン修飾ヌクレオチド（表６を参照のこと）である。cPrpaは5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシン修飾ヌクレオチド（表６を参照のこと）である。cPrpuは5'-シクロプロピルホスホナート-2′-O-メチルウリジン修飾ヌクレオチドである。
図２１Ｂは、ベータENaC RNAi剤AD06497（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｃは、ベータENaC RNAi剤AD06501（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｄは、ベータENaC RNAi剤AD06598（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｅは、ベータENaC RNAi剤AD06599（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｆは、ベータENaC RNAi剤AD07099（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｇは、ベータENaC RNAi剤AD07217（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(NH2-C6)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｈは、ベータENaC RNAi剤AD07482（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｉは、ベータENaC RNAi剤AD07250（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｊは、ベータENaC RNAi剤AD07240（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｋは、ベータENaC RNAi剤AD07453（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(NH2-C6)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２１Ｌは、ベータENaC RNAi剤AD07255（表3、4、5A、5Bを参照のこと）の修飾センス鎖およびアンチセンス鎖の模式図であり、センス鎖の5'末端に、１つ以上の標的リガンド（たとえば、本明細書の図１～８に示すものなど）との連結を促す(TriAlk14)連結基（化学構造については表６を参照のこと）が配置されている。
図２２は、TriAlk14足場連結基と連結した、本明細書のトリ-SM6.1と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンド（本明細書で(TriSM6.1-avb6-TA14)と記載される）の遊離酸形態での化学構造を表す。ここで、
Figure 2023501246000003
 はベータENaC RNAi剤を含む。
図２３は、システイン-マレイミドリンカーをさらに含むTriAlk14足場連結基と連結した、本明細書のトリ-SM6.1と呼ばれる三座配位αvβ6上皮細胞標的リガンドの遊離酸形態での化学構造を表す。ここで、
Figure 2023501246000004
 はベータENaC RNAi剤を含む。
図２４は、ベータENaC RNAi剤を遺伝子導入した培養一次正常ヒト気管支上皮細胞におけるヒトベータENaC (SCNN1B)の相対的mRNA発現（実施例１２でさらに詳細に記載する）を示す（誤差棒は図示なし）。
図２５Ａ～２５Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD07482（「APERC-7」と呼ぶ）の遊離酸形態で示した化学構造を表す。
図２６Ａ～２６Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD07482（「APERC-7」と呼ぶ）のナトリウム塩形態で示した化学構造を表す。
図２７Ａ～２７Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD07099（「APERC-5」と呼ぶ）の遊離酸形態で示した化学構造を表す。
図２８Ａ～２８Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD07099（「APERC-5」と呼ぶ）のナトリウム塩形態で示した化学構造を表す。
図２９Ａ～２９Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD06599（「APERC-9」と呼ぶ）の遊離酸形態で示した化学構造を表す。
図３０Ａ～３０Ｄは、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）と結合したベータENaC RNAi剤AD06599（「APERC-9」と呼ぶ）のナトリウム塩形態で示した化学構造を表す。
RNAi剤
ベータENaC (すなわちSCNN1B)遺伝子の発現を阻害するRNAi剤（本明細書ではベータENaC RNAi剤またはベータENaC RNAiトリガーという）を本明細書に記載する。本明細書に開示の各ベータENaC RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ16～49ヌクレオチド長であってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立に18～27ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖はいずれも、それぞれ21～26ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ21～24ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立に19～21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖は約19ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は約21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖は約21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は約23ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖は23ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖はいずれも、それぞれ21ヌクレオチド長である。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立に16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、または39ヌクレオチド長である。実施態様によっては、二本鎖RNAi剤は、約16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドの二本鎖長を有する。
ベータENaC RNAi剤を形成するのに用いられるヌクレオチド配列の例を表2、3、および4に示す。表2、3、および4のセンス鎖およびアンチセンス鎖配列を含むRNAi剤二本鎖の例を表5Aおよび5Bに示す。
実施態様によっては、センス鎖とアンチセンス鎖との間の完全、実質的、または部分的な相補性の領域は16～26（たとえば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26）ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'末端またはその付近に存在する（たとえば、この領域は完全、実質的、または部分的に相補的でない0、1、2、3、または4ヌクレオチド分だけアンチセンス鎖の5'末端から離れていてもよい）。
本明細書に記載のベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、ベータENaC mRNA中の同じヌクレオチド数のコアストレッチ配列（本明細書で「コアストレッチ」または「コア配列」ともいう）と少なくとも85%の同一性を有する少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む。実施態様によっては、センス鎖コアストレッチ配列はアンチセンス鎖のコアストレッチ配列と100%（完全に）相補的または少なくとも約85%（実質的に）相補的であり、したがって、センス鎖コアストレッチ配列は典型的には、ベータENaC mRNA標的に存在する同じ長さのヌクレオチド配列（場合によっては、たとえば標的配列と呼ぶ）と完全に同一であるか、少なくとも約85%同一である。実施態様によっては、このセンス鎖コアストレッチは16、17、18、19、20、21、22、または23ヌクレオチド長である。実施態様によっては、このセンス鎖コアストレッチは17ヌクレオチド長である。実施態様によっては、このセンス鎖コアストレッチは19ヌクレオチド長である。
本明細書に記載のベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、ベータENaC mRNA中の同じヌクレオチド数のコアストレッチ、および対応するセンス鎖中の同じヌクレオチド数のコアストレッチと少なくとも85%の相補性を有する少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む。実施態様によっては、アンチセンス鎖コアストレッチはベータENaC mRNA標的に存在する同じ長さのヌクレオチド配列（たとえば標的配列）と100%（完全に）相補的または少なくとも約85%（実質的に）相補的である。実施態様によっては、このアンチセンス鎖コアストレッチは16、17、18、19、20、21、22、または23ヌクレオチド長である。実施態様によっては、このアンチセンス鎖コアストレッチは19ヌクレオチド長である。実施態様によっては、このアンチセンス鎖コアストレッチは17ヌクレオチド長である。センス鎖コアストレッチ配列は、対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。
ベータENaC RNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖はアニールして二本鎖を形成する。ベータENaC RNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖は、互いに部分的に相補的であっても、実質的に相補的であっても、完全に相補的であってもよい。相補的二本鎖領域内で、センス鎖コアストレッチ配列はアンチセンスコアストレッチ配列と少なくとも85%相補的または100% 相補的である。実施態様によっては、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の対応する16、17、18、19、20、21、22、または23ヌクレオチドの配列と少なくとも85%または100%相補的な少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、または少なくとも23ヌクレオチドの配列を含む（すなわち、ベータENaC RNAi剤のセンスおよびアンチセンスコアストレッチ配列は、少なくとも85%が対の塩基である、または100%が対の塩基である、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、または少なくとも23ヌクレオチドの領域を有する）。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表２または表３のアンチセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表２または表４のセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。
実施態様によっては、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は独立に、コアストレッチ配列の3'末端、5'末端、または3'末端と5'末端の両方に1、2、3、4、5、または6個の付加ヌクレオチド（伸長部）を含んでもよい。アンチセンス鎖の付加ヌクレオチド（存在する場合）は、ベータENaC mRNA中の対応する配列と相補的であってもなくてもよい。センス鎖の付加ヌクレオチド（存在する場合）は、ベータENaC mRNA中の対応する配列と同一であってもなくてもよい。アンチセンス鎖の付加ヌクレオチド（存在する場合）は、対応するセンス鎖の付加ヌクレオチド（存在する場合）と相補的であってもなくてもよい。
本明細書で使用される場合、伸長部は、センス鎖コアストレッチ配列および／またはアンチセンス鎖コアストレッチ配列の5'および／または3'末端に1、2、3、4、5、または6個のヌクレオチドを含む。センス鎖の伸長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中のヌクレオチド（コアストレッチ配列ヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチド）と相補的であってもなくてもよい。反対に、アンチセンス鎖の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のヌクレオチド（コアストレッチヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチド）と相補的であってもなくてもよい。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖はいずれも3'および5'末端伸長部を含む。実施態様によっては、一方の鎖の3'末端伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は他方の鎖の１つ以上の5'末端伸長ヌクレオチドと塩基対を形成する。他の実施態様では、一方の鎖の3'末端伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は他方の鎖の１つ以上の5'末端伸長ヌクレオチドと塩基対を形成しない。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、3'末端伸長部を有するアンチセンス鎖および5'末端伸長部を有するセンス鎖を有する。実施態様によっては、伸長ヌクレオチドは対にならず突出部を形成する。本明細書で使用される場合、「突出部」は、センス鎖またはアンチセンス鎖の末端に位置する、本明細書に開示のRNAi剤のハイブリッド形成部または二本鎖形成部の一部を形成しない１個以上の不対ヌクレオチドの一続きを意味する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、1、2、3、4、5、または6ヌクレオチド長の3'末端伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施態様では、ベータENaC RNAi剤 は、1、2、または3ヌクレオチド長の3'末端伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。実施態様によっては、アンチセンス鎖の伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は、対応するベータENaC mRNA配列と相補的なヌクレオチドを含む。実施態様によっては、アンチセンス鎖の伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は、対応するベータENaC mRNA配列と相補的でないヌクレオチドを含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の3'末端伸長部を有するセンス鎖を含む。実施態様によっては、センス鎖の伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は、アデノシン、ウラシル、もしくはチミジンヌクレオチド、ATジヌクレオチド、またはベータENaC mRNA配列中のヌクレオチドに対応するか同一のヌクレオチドを含む。実施態様によっては、センス鎖3'末端伸長部は以下の配列、すなわちT、UT、TT、UU、UUT、TTT、またはTTTT（それぞれ、5'→3'で列記）のうちの１つを含む、あるいはそれからなるが、これらに限定されない。
センス鎖は3'末端伸長部および／または5'末端伸長部を有してもよい。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、1、2、3、4、5、または6ヌクレオチド長の5'末端伸長部を有するセンス鎖を含む。実施態様によっては、センス鎖の伸長ヌクレオチドのうちの１つ以上は、ベータENaC mRNA配列中のヌクレオチドに対応するか同一のヌクレオチドを含む。
ベータENaC RNAi剤を形成するのに用いられる配列の例を表2、3、および4に示す。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2または3の配列のいずれかの配列を含む。特定の実施態様では、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表3の修飾配列のいずれか１つを含む、あるいはそれからなる。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2または3中のいずれかの配列のヌクレオチド1～17、2～15、2～17、1～18、2～18、1～19、2～19、1～20、2～20、1～21、または2～21（5'末端→3'末端）の配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2または4の配列のいずれかの配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2または4中のいずれかの配列のヌクレオチド1～18、1～19、1～20、1～21、2～19、2～20、2～21、3～20、3～21、または4～21（5'末端→3'末端）の配列を含む。特定の実施態様では、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表4の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含む、あるいはそれからなる。
実施態様によっては、本明細書に記載のRNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖は同じ数のヌクレオチドを含む。実施態様によっては、本明細書に記載のRNAi剤のセンス鎖とアンチセンス鎖は異なる数のヌクレオチドを含む。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖5′末端とアンチセンス鎖3′末端は平滑末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖3′末端とアンチセンス鎖5′末端は平滑末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤の両方の末端は平滑末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤のいずれの末端も平滑末端ではない。本明細書で使用される場合、「平滑末端」は、２つのアニールされた鎖の末端ヌクレオチドが相補的である（相補的塩基対を形成する）二本鎖RNAi剤の末端を意味する。
実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖5′末端とアンチセンス鎖3′末端は、ほつれた(frayed)末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖3′末端とアンチセンス鎖5′末端はほつれた末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤の両方の末端はほつれた末端を形成する。実施態様によっては、RNAi剤のいずれの末端もほつれた末端を形成しない。本明細書で使用される場合、「ほつれた末端」は、２つのアニールされた鎖の末端ヌクレオチドが対を形成する（すなわち、突出部を形成しない）が相補的ではない（すなわち、非相補的な対を形成する）二本鎖RNAi剤の末端を意味する。実施態様によっては、二本鎖RNAi剤の一方の鎖の末端の１つ以上の不対ヌクレオチドは突出部を形成する。不対ヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖上で3'末端または5'末端突出部を形成してもよい。実施態様によっては、RNAi剤は、平滑末端およびほつれた末端、平滑末端および5′突出末端、平滑末端および3′突出末端、ほつれた末端および5′突出末端、ほつれた末端および3′突出末端、２つの5′突出末端、２つの3′突出末端、5′突出末端および3′突出末端、２つのほつれた末端、または２つの平滑末端を含む。典型的には、突出部（存在する場合）は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の3'末端に位置する。
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。本明細書に開示のベータENaC RNAi剤はさらに、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合（たとえば、１つ以上のホスホロチオアート結合）で構成されていてもよい。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は１つ以上の修飾ヌクレオチドおよび１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。実施態様によっては、2′-修飾ヌクレオチドを修飾されたヌクレオシド間結合と組み合わせる。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を塩、混合塩、または遊離酸として調製または提供する。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤をナトリウム塩として調製する。当技術分野で公知のこのような形態は本明細書に開示の発明の範囲内である。
修飾ヌクレオチド
様々なオリゴヌクレオチド構築物に用いる場合、修飾ヌクレオチドは、細胞内での化合物の活性を保つと同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることができ、さらには、そのオリゴヌクレオチド構築物を投与したときにヒトにおいてインターフェロン活性を発動させる可能性を最小限にすることができる。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」はリボヌクレオチド（2′-ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。実施態様によっては、少なくとも50%（たとえば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%）のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、脱塩基（abasic）ヌクレオチド、2′-修飾ヌクレオチド、逆位（inverted）ヌクレオチド、修飾核酸塩基含有ヌクレオチド、架橋化ヌクレオチド（bridged nucleotides）、ペプチド核酸(PNA)、2′,3′-セコヌクレオチド模倣体（非架橋型核酸塩基アナログ（unlocked nucleobase analogues））、架橋型ヌクレオチド（locked nucleotides）、3′-O-メトキシ(2′ヌクレオシド間結合)ヌクレオチド、2'-F-アラビノヌクレオチド、5'-Me、2'-フルオロヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホナートデオキシリボヌクレオチド、ビニルホスホナート含有ヌクレオチド、およびシクロプロピルホスホナート含有ヌクレオチドを包含し得るが、これらに限定されない。2′-修飾ヌクレオチド（すなわち、5員の糖環の2'位に水酸基以外の基を有するヌクレオチド）としては、2′-O-メチルヌクレオチド（2′-メトキシヌクレオチドともいう）、2′-フルオロヌクレオチド（本明細書で2′-デオキシ-2′-フルオロヌクレオチドともいう）、2′-デオキシヌクレオチド、2′-メトキシエチル（2′-O-2-メトキシルエチル）ヌクレオチド（2′-MOEともいう）、2′-アミノヌクレオチド、および2′-アルキルヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。所定の化合物のすべての位置が一様に修飾されている必要はない。反対に、２つ以上の修飾を１つのベータENaC RNAi剤、さらにはそのうちの１つのヌクレオチドに取り入れてもよい。当技術分野で公知の方法でベータENaC RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を合成かつ／または修飾することができる。１個のヌクレオチドの修飾は、別のヌクレオチドの修飾とは独立である。
修飾核酸塩基としては、合成および天然の核酸塩基、たとえば5-位置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換プリン（たとえば、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、または5-プロピニルシトシン）、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-アルキル（たとえば、6-メチル、6-エチル、6-イソプロピル、または6-n-ブチル）誘導体、アデニンおよびグアニンの2-アルキル（たとえば、2-メチル、2-エチル、2-イソプロピル、または2-n-ブチル）および他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル、シトシン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、6-アゾチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-スルフヒドリル、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、ならびに他の8位置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ（たとえば、5-ブロモ）、5-トリフルオロメチル、ならびに他の5-位置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、ならびに3-デアザアデニンが挙げられる。
実施態様によっては、アンチセンス鎖の5'末端および／または3'末端は脱塩基残基(Ab)（「脱塩基部位」または「脱塩基ヌクレオチド」と呼ぶこともある）を含んでもよい。脱塩基残基(Ab)は、糖部分の1'位の核酸塩基を欠失しているヌクレオチドまたはヌクレオシドである（たとえば、米国特許第5,998,203号を参照のこと）。実施態様によっては、脱塩基残基をヌクレオチド配列内部に配置してもよい。実施態様によっては、AbまたはAbAbをアンチセンス鎖の3'末端に付加してもよい。実施態様によっては、センス鎖の5'末端は１つ以上の追加の脱塩基残基（たとえば、(Ab)または(AbAb)）を含んでもよい。実施態様によっては、UUAb、UAb、またはAbをセンス鎖の3'末端に付加する。実施態様によっては、脱塩基（デオキシリボース）残基をリビトール（脱塩基リボース）残基で置き換えてもよい。
実施態様によっては、RNAi剤のすべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、存在する実質的にすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるRNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、4個以下（すなわち、0、1、2、3、または4個）のヌクレオチドがリボヌクレオチド（すなわち非修飾）であるRNAi剤である。本明細書で使用される場合、存在する実質的にすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるセンス鎖は、センス鎖中の2個以下（すなわち、0、1、または2個）のヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチドであるセンス鎖である。本明細書で使用される場合、存在する実質的にすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるアンチセンスセンス鎖は、センス鎖中の2個以下（すなわち、0、1、または2個）のヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチドであるアンチセンス鎖である。実施態様によっては、RNAi剤の1個以上のヌクレオチドは非修飾リボヌクレオチドである。特定の修飾ヌクレオチドの化学構造を本明細書の表６に示す。
修飾ヌクレオシド間結合
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤の１個以上のヌクレオチドは非標準の結合または骨格（すなわち修飾ヌクレオシド間結合または修飾骨格）で連結されている。修飾ヌクレオシド間結合または骨格としては、限定されるものではないが、ホスホロチオアート基（本明細書では、小文字の「ｓ」と表す）、キラルホスホロチオアート、チオホスファート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキル-ホスホトリエステル、アルキルホスホナート（たとえば、メチルホスホナートまたは3'-アルキレンホスホナート）、キラルホスホナート、ホスフィナート、ホスホルアミダート（たとえば、3'-アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、またはチオノホスホルアミダート）、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノ結合、通常の3'-5'結合を有するボラノホスファート、ボラノホスファートの2'-5’結合アナログ、ヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3’に、または2'-5'から5'-2’に連結された反転極性（inverted polarity）を有するボラノホスファートが挙げられる。一部の実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合または骨格は、リン原子を持たない。リン原子を持たない修飾ヌクレオシド間連結としては、限定されるものではないが、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間結合が挙げられる。実施態様によっては、修飾ヌクレオシド間骨格としては、限定されるものではないが、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファマート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホナートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ2成分を有する他の骨格が挙げられる。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は1、2、3、4、5、または6個のホスホロチオアート結合を含んでもよく、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は1、2、3、4、5、または6個のホスホロチオアート結合を含んでもよく、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖は独立に1、2、3、4、5、または6個のホスホロチオアート結合を含んでもよい。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は1、2、3、または4個のホスホロチオアート結合を含んでもよく、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は1、2、3、または4個のホスホロチオアート結合を含んでもよく、あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖は独立に1、2、3、または4個のホスホロチオアート結合を含んでもよい。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は少なくとも2個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。実施態様によっては、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、センス鎖の3'末端から1～3位のヌクレオチドの間にある。実施態様によっては、1個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合はセンス鎖ヌクレオチド配列の5'末端にあり、もう1個のホスホロチオアート結合はセンス鎖ヌクレオチド配列の3'末端に存在する。実施態様によっては、2個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合はセンス鎖の5'末端に位置し、もう1個のホスホロチオアート結合はセンス鎖の3'末端に位置する。実施態様によっては、センス鎖はヌクレオチド間にホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含まないが、5'末端および3'末端の両方の末端ヌクレオチドの間に1、2、または3個のホスホロチオアート結合、および任意に存在する逆位脱塩基残基末端キャップを含む。実施態様によっては、標的リガンドをホスホロチオアート結合によりセンス鎖に連結する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は4個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。実施態様によっては、この4個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合はアンチセンス鎖の5'末端から1～3位のヌクレオチドの間、および5'末端から19～21、20～22、21～23、22～24、23～25、または24～26位のヌクレオチドの間にある。実施態様によっては、3個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合はアンチセンス鎖の5'末端から1～4位の間に位置し、第4のホスホロチオアートヌクレオシド間結合はアンチセンス鎖の5'末端から20～21位の間に位置する。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は少なくとも3個または4個のホスホロチオアートヌクレオシド間結合をアンチセンス鎖に含む。
キャッピング残基または部分
実施態様によっては、センス鎖は１つ以上のキャッピング残基または部分（当技術分野では場合によって「キャップ」、「末端キャップ」、または「キャッピング残基」と呼ぶ）を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「キャッピング残基」は、本明細書に開示のRNAi剤のヌクレオチド配列の１つ以上の末端に組み込むことができる非ヌクレオチド化合物または他の部分である。キャッピング残基は、場合によっては、特定の有益な特性、たとえばエキソヌクレアーゼ分解からの保護などをRNAi剤に付与することができる。実施態様によっては、逆位脱塩基残基(invAb)（当技術分野では「逆位脱塩基部位」ともいう）をキャッピング残基として付加する（表Aを参照のこと）（たとえば、F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16を参照のこと）。キャッピング残基は一般に当技術分野で公知であり、たとえば逆位脱塩基残基、さらには炭素鎖、たとえば末端C3H7（プロピル）、C6H13（ヘキシル）、またはC12H25（ドデシル）基が挙げられる。実施態様によっては、キャッピング残基はセンス鎖の5'末端、3'末端、5'末端と3'末端の両方のいずれに存在してもよい。実施態様によっては、センス鎖の5'末端および／または3'末端は、2個以上の逆位脱塩基デオキシリボース部分をキャッピング残基として含んでもよい。
実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基(invAb)をセンス鎖の3'末端に付加する。実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基(invAb)をセンス鎖の5'末端に付加する。実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基すなわち逆位脱塩基部位を標的リガンドとRNAi剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入する。実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基すなわち逆位脱塩基部位をRNAi剤のセンス鎖の単数または複数の末端（terminal end or terminal ends）でまたはその付近に含むことにより、RNAi剤のより高い活性または他の所望の特性が得られる。
実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基(invAb)をセンス鎖の5'末端に付加する。実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基を標的リガンドとRNAi剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入してもよい。ホスファート、ホスホロチオアート（たとえば、本明細書で(invAb)sと示す）、または他のヌクレオシド間結合により逆位脱塩基残基を連結してもよい。実施態様によっては、１つ以上の逆位脱塩基残基をRNAi剤のセンス鎖の一方もしくは両方の末端またはその付近に含むことにより、RNAi剤のより高い活性または他の所望の特性が得られる場合がある。実施態様によっては、逆位脱塩基（デオキシリボース）残基を逆位リビトール（脱塩基リボース）残基で置き換えてもよい。実施態様によっては、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の3'末端またはアンチセンス鎖配列の3'末端は逆位脱塩基残基を含んでもよい。逆位脱塩基デオキシリボース残基の化学構造を下の表6に示す。
ベータENaC RNAi剤
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、ベータENaC遺伝子（たとえば配列番号1 (GenBank NM_000336.2)、配列番号2 (GenBank NM_000336.3)）の特定の位置を標的とするように設計される。本明細書で定義される場合、アンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の5'末端核酸塩基がベータENaC遺伝子との塩基対形成のときに遺伝子上の所定の位置から（3'末端に向かって）19ヌクレオチド下流である位置と整列したときにベータENaC遺伝子の遺伝子上のその所定の位置を標的とするように設計される。たとえば、本明細書で表1および2に示すように、ベータENaC遺伝子の987位を標的とするように設計されたアンチセンス鎖配列は、その遺伝子との塩基対形成のとき、アンチセンス鎖の5'末端核酸塩基がベータENaC遺伝子の1005位と整列する必要がある。
本明細書で提供する場合、ベータENaC RNAi剤はアンチセンス鎖の1位（5'→3'）の核酸塩基が遺伝子と相補的であることを必要としない（ただし、少なくとも16個の連続するヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子の少なくとも85%の相補性（たとえば、少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の相補性）があるという条件で）。たとえば、ベータENaC遺伝子の987位を標的とするように設計された本明細書に開示のベータENaC RNAi剤の場合、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖の5'末端核酸塩基は遺伝子の1005位と整列しなければならない。しかし、アンチセンス鎖の5'末端核酸塩基はベータENaC遺伝子の1005位と相補的であってもよいが、そうである必要はない（ただし、少なくとも16個の連続するヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子の少なくとも85%の相補性（たとえば、少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%の相補性）があるという条件で）。特に本明細書に開示の様々な実施例により示されるように、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖による遺伝子の結合の特異的部位は、（たとえば、そのベータENaC RNAi剤がベータENaC遺伝子の987位、1296位、1798位、または他の何らかの位置を標的とするように設計されていようが）ベータENaC RNAi剤が達成する阻害のレベルにとって重要な因子である。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、ベータENaC遺伝子の、表1に示すベータENaC配列の位置またはその付近を標的とする。実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表１に開示する標的ベータENaCの19塩基長配列と完全、実質的、または少なくとも部分的に相補的なコアストレッチ配列を含む。
Figure 2023501246000005
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖の19位（5'→3'）が表1に開示の19塩基長の標的配列の1位と塩基対形成することができるアンチセンス鎖を含む。実施態様によっては、ベータENaC剤は、アンチセンス鎖の1位（5'→3'）が表1に開示の19塩基長の標的配列の19位と塩基対形成することができるアンチセンス鎖を含む。
実施態様によっては、ベータENaC剤は、アンチセンス鎖の2位（5'→3'）が表1に開示の19塩基長の標的配列の18位と塩基対形成することができるアンチセンス鎖を含む。実施態様によっては、ベータENaC剤は、アンチセンス鎖の2～18位（5'→3'）が表1に開示の19塩基長の標的配列の18～2位に位置する各相補的塩基のそれぞれと塩基対形成することができるアンチセンス鎖を含む。
本明細書に開示のRNAi剤の場合、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はベータENaC遺伝子と完全に相補的であっても、ベータENaC遺伝子と非相補的であってもよい。実施態様によっては、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はU、A、またはdTである。実施態様によっては、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はセンス鎖とA:UまたはU:A塩基対を形成する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2または表3中のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド2～18または2～19（5'末端→3'末端）の配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2または表4中のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド1～17、1～18、または2～18（5'末端→3'末端）の配列を含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、(i)表2または表3のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド2～18または2～19（5'末端→3'末端）の配列を含むアンチセンス鎖、ならびに(ii)表2または表4中のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド1～17または1～18（5'末端→3'末端）の配列を含むセンス鎖で構成されている。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は以下の表２に示す19塩基長のコアヌクレオチド配列を含む。
Figure 2023501246000006
Figure 2023501246000007
Figure 2023501246000008
表2のヌクレオチド配列を含む、またはそれらからなるベータENaC RNAi剤センス鎖およびアンチセンス鎖は修飾ヌクレオチドであっても非修飾ヌクレオチドであってもよい。実施態様によっては、表2のヌクレオチド配列のいずれかを含む、またはそれからなるセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するベータENaC RNAi剤は、すべてまたは実質的にすべて修飾ヌクレオチドである。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2のアンチセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2のセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。
本明細書で使用される場合、表2に開示の配列に示されるNはそれぞれ、任意のあらゆる核酸塩基から独立に選択されてもよい（修飾および非修飾ヌクレオチドのいずれに見られるものも含む）。実施態様によっては、表2に開示の配列に示されるNヌクレオチドは、もう一方の鎖の対応する位置にあるNヌクレオチドと相補的な核酸塩基を有する。実施態様によっては、表2に開示の配列に示されるNヌクレオチドは、もう一方の鎖の対応する位置にあるNヌクレオチドと相補的でない核酸塩基を有する。実施態様によっては、表2に開示の配列に示されるNは、もう一方の鎖の対応する位置にあるNヌクレオチドと同じ核酸塩基を有する。実施態様によっては、表2に開示の配列に示されるNは、もう一方の鎖の対応する位置にあるNヌクレオチドと異なる核酸塩基を有する。
特定の修飾ベータENaC RNAi剤センス鎖およびアンチセンス鎖を表3および表4に示す。修飾ベータENaC RNAi剤アンチセンス鎖およびその基礎の非修飾核酸塩基配列を表3に示す。修飾ベータENaC RNAi剤センス鎖およびその基礎の非修飾核酸塩基配列を表4に示す。ベータENaC RNAi剤の形成において、上の表2ならびに表3および4に示す各基礎塩基配列中のヌクレオチドのそれぞれは、修飾ヌクレオチドであってもよい。
アンチセンス鎖をセンス鎖をアニールすることで本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を形成する。表2または表4に示す配列を含むセンス鎖を表2または表3に示す配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズしてもよい（ただし、２つの配列が、連続する16、17、18、19、20、または21ヌクレオチドの配列にわたる少なくとも85%の相補性の領域を有するという条件で）。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は表２または表３の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表2、表3、または表4の配列のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸塩基配列を有する二本鎖を含むか、それからなる。
修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖の例を表3に示す。修飾ヌクレオチドを含むセンス鎖の例を表4に示す。
表3および4で使用される場合、修飾ヌクレオチド、標的基、および連結基を示すのに以下の記号を用いる。
A =アデノシン-3'-ホスファート
C =シチジン-3'-ホスファート
G =グアノシン-3'-ホスファート
U =ウリジン-3'-ホスファート
I =イノシン-3'-ホスファート
a = 2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスファート
as = 2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスホロチオアート
c = 2'-O-メチルシチジン-3'-ホスファート
cs = 2'-O-メチルシチジン-3'-ホスホロチオアート
g = 2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスファート
gs = 2'-O-メチルグアノシン-3'-ホスホロチオアート
i = 2'-O-メチルイノシン-3'-ホスファート
is = 2'-O-メチルイノシン-3'-ホスホロチオアート
t = 2'-O-メチル-５－メチルウリジン-3'-ホスファート
ts = 2'-O-メチル-５－メチルウリジン-3'-ホスホロチオアート
u = 2'-O-メチルウリジン-3'-ホスファート
us = 2'-O-メチルウリジン-3'-ホスホロチオアート
Af = 2'-フルオロアデノシン-3'-ホスファート
Afs = 2'-フルオロアデノシン-3'-ホスホロチオアート（phosporothioate）
Cf = 2'-フルオロシチジン-3'-ホスファート
Cfs = 2'-フルオロシチジン-3'-ホスホロチオアート
Gf = 2'-フルオログアノシン-3'-ホスファート
Gfs = 2'-フルオログアノシン-3'-ホスホロチオアート
Tf = 2'-フルオロ-5'-メチルウリジン-3'-ホスファート
Tfs = 2'-フルオロ-5'-メチルウリジン-3'-ホスホロチオアート
Uf = 2'-フルオロウリジン-3'-ホスファート
Ufs = 2'-フルオロウリジン-3'-ホスホロチオアート
dT = 2'-デオキシチミジン-3'-ホスファート
AUNA = 2',3'-セコアデノシン-3'-ホスファート
AUNAs = 2',3'-セコアデノシン-3'-ホスホロチオアート
CUNA = 2',3'-セコシチジン-3'-ホスファート
CUNAs = 2',3'-セコシチジン-3'-ホスホロチオアート
GUNA = 2',3'-セコグアノシン-3'-ホスファート
GUNAs = 2',3'-セコグアノシン-3'-ホスホロチオアート
UUNA = 2',3'-セコウリジン-3'-ホスファート
UUNAs = 2',3'-セコウリジン-3'-ホスホロチオアート
a_2N = 表6を参照のこと
a_2Ns = 表6を参照のこと
(invAb) = 逆位の脱塩基デオキシリボヌクレオチド-5'-ホスファート（表6を参照のこと）
(invAb)s = 逆位の脱塩基デオキシリボヌクレオチド-5'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
s =ホスホロチオアート結合
p =末端ホスファート（合成）
vpdN = ビニルホスホナートデオキシリボヌクレオチド
cPrpa = 5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
cPrpas = 5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシン-3'- ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
cPrpu = 5’-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
cPrpus = 5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
aAlk = 2'-O-プロパルギルアデノシン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
aAlks = 2'-O-プロパルギルアデノシン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
cAlk = 2'-O-プロパルギルシチジン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
cAlks = 2'-O-プロパルギルシチジン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
gAlk = 2'-O-プロパルギルグアノシン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
gAlks = 2'-O-プロパルギルグアノシン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
tAlk = 2'-O-プロパルギル-5-メチルウリジン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
tAlks = 2'-O-プロパルギル-5-メチルウリジン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
uAlk = 2'-O-プロパルギルウリジン-3'-ホスファート（表6を参照のこと）
uAlks = 2'-O-プロパルギルウリジン-3'-ホスホロチオアート（表6を参照のこと）
(Alk-SS-C6) =表6を参照のこと
(C6-SS-Alk) =表6を参照のこと
(C6-SS-C6) =表6を参照のこと
(6-SS-6) =表6を参照のこと
(C6-SS-Alk-Me) =表6を参照のこと
(NH2-C6) =表6を参照のこと
(TriAlk#) =表6を参照のこと
(TriAlk#)s =表6を参照のこと
当業者であれば容易に理解するように、配列によって（たとえば、ホスホロチオアート結合「s」によってなど）そうでないと示されない限り、オリゴヌクレオチドに存在する場合、ヌクレオチド単量体は5'-3'-ホスホジエステル結合により相互に連結されている。当業者であれば明確に理解しているように、本明細書に開示の修飾ヌクレオチド配列に示されるホスホロチオアート結合を含むことにより、典型的にオリゴヌクレオチドに存在するホスホジエステル結合を置き換える。さらに、当業者であれば容易に理解するように、所定のオリゴヌクレオチド配列の3'末端の末端ヌクレオチドは、エクスビボでは典型的にはホスファート部分の代わりに所定の単量体の各3'位にヒドロキシル（-OH）基を有する。また、本明細書に開示の実施態様に関して、5'→3'で各鎖を見た場合、逆位脱塩基残基は、デオキシリボースの3'位が各鎖上の先行する単量体の3'末端で連結されるように挿入される（たとえば、表6を参照のこと）。さらに、当業者であれば容易に理解・認識するように、本明細書に示すホスホロチオアート化学構造は、典型的には硫黄原子上の陰イオンを示すが、本明細書に開示の発明はすべてのホスホロチオアート互変異性体（たとえば、硫黄原子が二重結合を有し、陰イオンが酸素原子であるもの）を包含する。本明細書で特に明示的に示さない限り、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤およびベータENaC RNAi剤の組成物について説明するときには当業者のこのような理解を用いる。
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤 と共に使用される特定の標的基および連結基の例は、下の表6に示す化学構造に含まれている。各センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、本明細書に示す任意の標的基または連結基、および他の標的基または連結基を配列の5'末端および／または3'末端に結合して有してもよい。
Figure 2023501246000009
Figure 2023501246000010
Figure 2023501246000011
Figure 2023501246000012
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニールして形成される。表2または表4に示す配列を含むセンス鎖を、表2または表3に示す配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズしてもよい（ただし、２つの配列が、連続する16、17、18、19、20、または21ヌクレオチドの配列にわたる少なくとも85%の相補性の領域を有するという条件で）。
上の表4に示すように、特定のベータENaC RNAi剤ヌクレオチド配列の例は、センス鎖の5'末端および3'末端の一方または両方に反応性連結基をさらに含むことが示されている。たとえば、上の表4に示すベータENaC RNAi剤 センス鎖配列の多くは(NH2-C6)連結基または(TriAlk14)連結基をヌクレオチド配列の5'末端に有する。同様に、上の表4に示すいくつかのベータENaC RNAi剤センス鎖ヌクレオチド配列の例は(6-SS-6)または(C6-SS-C6)連結基をヌクレオチド配列の3'末端に有する。このような反応性連結基を配置して標的リガンド、標的基、および／またはPK/PD調節剤を本明細書に開示のベータENaC RNAi剤に連結しやすくする。連結または結合反応は当技術分野で周知であり、２つの分子または反応物の間に共有結合を形成させる。本明細書の発明の範囲で用いるのに好適な結合反応としては、限定されるものではないが、アミドカップリング反応、マイケル付加反応、ヒドラゾン形成反応、逆電子要請型Diels-Alder付加環化反応、オキシムライゲーション、および銅(I)触媒型または歪促進型アジド-アルキン付加環化反応が挙げられる。
実施態様によっては、標的リガンド、たとえば本明細書に開示の実施例および図で示すインテグリン標的リガンドを、反応性アミノ基（たとえばNH2-C6）で置換されて標的リガンドを本明細書に開示のベータENaC RNAi剤と結合することができる活性化エステル、たとえばテトラフルオロフェニル(TFP)エステルとして合成してもよい。実施態様によっては、たとえば銅(I)触媒型または歪促進型アジド-アルキン付加環化反応によりプロパルギル（たとえばTriAlk14）またはDBCO基に結合させることができるアジドとして標的リガンドを合成する。
また、上の表4に示す特定のヌクレオチド配列を、センス鎖の3'末端でdTヌクレオチド、続いて（3'→5'）リンカー（たとえば、C6-SS-C6）と合成した（たとえば、AM10033-SS、AM10293-SS、AM10364-SS、およびAM10365-SSを参照のこと）。リンカーは、実施態様によっては、追加成分（たとえば、PK/PD 調節剤または１つ以上の標的リガンドなど）との連結を促進することができる。本明細書に記載のとおり、まずC6-SS-C6のジスルフィド結合が還元されて分子からdTが除去されることにより、次いで所望のPK/PD調節剤の結合を促すことができる。したがって、末端dTヌクレオチドは完全に結合した構築物の一部ではない。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表3のアンチセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表4のセンス鎖配列のいずれかと0、1、2、または3個のヌクレオチドが異なる。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は表2または表3の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2または表3中のいずれかの配列のヌクレオチド1～17、2～17、1～18、2～18、1～19、2～19、1～20、2～20、1～21、2～21、1～22、2～22、1～23、2～23、1～24、または2～24（5'末端→3'末端）の配列を含む。特定の実施態様では、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表3の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含む、あるいはそれからなる。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は表2または表4の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2または表4中のいずれかの配列のヌクレオチド1～17、2～17、3～17、4～17、1～18、2～18、3～18、4～18、1～19、2～19、3～19、4～19、1～20、2～20、3～20、4～20、1～21、2～21、3～21、4～21、1～22、2～22、3～22、4～22、1～23、2～23、3～23、4～23、1～24、2～24、3～24、または4～24（5'末端→3'末端）の配列を含む。特定の実施態様では、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表3の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含む、あるいはそれからなる。
本明細書に開示のRNAi剤の場合、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はベータENaC遺伝子と完全に相補的であっても、ベータENaC遺伝子と非相補的であってもよい。実施態様によっては、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はU、A、またはdT（あるいはU、A、またはdTの修飾型）である。実施態様によっては、アンチセンス鎖の1位のヌクレオチド（5'末端→3'末端）はセンス鎖とA:UまたはU:A塩基対を形成する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のアンチセンス鎖は、表2または表3中のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド2～18または2～19（5'末端→3'末端）の配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤のセンス鎖は、表2または表4中のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド1～17または1～18（5'末端→3'末端）の配列を含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、(i)表2または表3中のいずれかのアンチセンス鎖配列のヌクレオチド2～18または2～19（5'末端→3'末端）の配列を含むアンチセンス鎖、および(ii)表2または表4中のいずれかのセンス鎖配列のヌクレオチド1～17または1～18（5'末端→3'末端）の配列を含むセンス鎖を含む。
表2または表4に示す配列を含むセンス鎖を、表2または表3に示す配列を含む任意のアンチセンス鎖とハイブリダイズしてもよい（ただし、２つの配列が、連続する16、17、18、19、20、または21ヌクレオチドの配列にわたる少なくとも85%の相補性の領域を有するという条件で）。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は表4の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるセンス鎖、および表3の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるアンチセンス鎖を有する。特定の代表的な配列の組合せを、表5Aおよび5Bに示す二本鎖識別(ID)番号で例示する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれか１つで表される二本鎖を含む、それからなる、あるいはそれから本質的になる。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれかからなる。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、ならびに標的基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基を含み、この標的基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基をセンス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合で連結（すなわち結合）する。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列を含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は本明細書に示す二本鎖識別番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列、ならびに標的基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基を含み、この標的基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基はセンス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合している。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表2または表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、標的基をさらに含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表2または表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、1つ以上のαvβ6インテグリン標的リガンドをさらに含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表2または表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、インテグリン標的リガンドである標的基をさらに含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表2または表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、１つ以上のαvβ6インテグリン標的リガンドまたはαvβ6インテグリン標的リガンドのクラスター（たとえば、三座配位αvβ6 インテグリン標的リガンド）をさらに含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は、表5Aおよび5Bのアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、インテグリン標的リガンドをさらに含む。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は表5Aおよび5Bの二本鎖のいずれかを含む、それからなる、あるいはそれから本質的になる。
Figure 2023501246000013
Figure 2023501246000014
Figure 2023501246000015
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を塩、混合塩、または遊離酸として調製または提供する。本明細書に記載のRNAi剤は、ベータENaC遺伝子を発現する細胞に送達されると、インビボおよび／またはインビトロで1つ以上のベータENaC遺伝子の発現を阻害すなわちノックダウンする。
標的基、連結基、薬物動態／薬力学(PK/PD)調節剤、および送達担体
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤は１つ以上の非ヌクレオチド基を含む、あるいはそれと結合されており、その例としては、限定されるものではないが、標的基、連結基、薬物動態／薬力学(PK/PD)調節剤、送達重合体、または送達担体が挙げられる。非ヌクレオチド基はRNAi剤の標的、送達、または結合を強化することができる。センス鎖および／またはアンチセンス鎖の3'末端および／または5'末端に非ヌクレオチド基を共有結合してもよい。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤はセンス鎖の3'末端および／または5'末端に連結された非ヌクレオチド基を含む。実施態様によっては、非ヌクレオチド基はベータENaC RNAi剤のセンス鎖の5'末端に連結されている。非ヌクレオチド基を直接RNAi剤に連結してもよいし、リンカー／連結基を介して連結してもよい。実施態様によっては、非ヌクレオチド基は不安定、切断可能、もしくは可逆的な結合またはリンカーによりRNAi剤に連結されている。
実施態様によっては、非ヌクレオチド基は、それが結合したRNAi剤または複合体の薬物動態または生体内分布特性を強化し、その複合体の細胞または組織特異的な分布および細胞特異的な取込みを改善する。実施態様によっては、非ヌクレオチド基はRNAi剤の飲食作用を強化する。
標的基または標的部分は、それらが結合した複合体またはRNAi剤の薬物動態または生体内分布特性を強化し、その複合体またはRNAi剤の細胞特異的（場合によっては器官特異的を含む）な分布および細胞特異的（または器官特異的）な取込みを改善する。標的基は、それが指向する標的に対して一価、二価、三価、四価であってもよく、それ以上の価数を有してもよい。代表的な標的基としては、限定されるものではないが、細胞表面分子との親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、および細胞表面分子との親和性を有する抗体模倣体が挙げられる。実施態様によっては、標的基はリンカー、たとえばPEGリンカー、あるいは場合によってリンカーとして機能することができる１つ、２つ、もしくは３つの脱塩基および／またはリビトール（脱塩基リボース）残基を用いてRNAi剤に連結されている。
リンカーを伴って、あるいは伴わずに、表2、3、および4に開示のいずれかのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の5'末端または3'末端に標的基を結合してもよい。標的基を伴って、あるいは伴わずに、表2、3、および4に開示のいずれかのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の5'末端または3'末端にリンカーを結合してもよい。
反応基、たとえばアミノ基（本明細書でアミンともいう）を5'末端および／または3'末端に有する本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を合成してもよい。その後、反応基を用いて、当技術分野で典型的な方法で標的部分を結合することができる。
たとえば、実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖の5'末端にNH2-C6基を有する本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を合成する。その後、末端アミノ基を反応させて、たとえばαvβ6 インテグリン標的リガンドを含む基との複合体を形成することができる。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖の5'末端に１つ以上のアルキン基を有する本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を合成する。その後、末端アルキン基を反応させて、たとえばαvβ6 インテグリン標的リガンドを含む基との複合体を形成することができる。
実施態様によっては、標的基はインテグリン標的リガンドを含む。実施態様によっては、インテグリン標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドである。αvβ6インテグリン標的リガンドを用いることにより、それぞれの表面上にαｖβ６を有する細胞に対する細胞特異的標的化が促進され、インテグリン標的リガンドの結合により、それが連結したRNAi剤などの治療剤の細胞、たとえば上皮細胞（たとえば、肺上皮細胞および腎上皮細胞が挙げられる）への進入を促進することができる。インテグリン標的リガンドは、単量体もしくは一価（たとえば、単一のインテグリン標的部分を有する）であってもよいし、多量体または多価（たとえば、複数のインテグリン標的部分を有する）であってもよい。当技術分野で公知の方法で標的基をRNAiオリゴヌクレオチドの3'末端および／または5'末端に結合することができる。αvβ6インテグリン標的リガンドなどの標的基の調製は、たとえば、国際特許出願公開第WO 2018/085415号および国際特許出願公開第WO 2019/089765号に記載されており、各文献の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
実施態様によっては、さらなるリンカーを用いずに標的基をベータENaC RNAi剤に連結する。実施態様によっては、容易に存在してベータENaC RNAi剤との連結を促進するリンカーを有する標的基を設計する。実施態様によっては、2種以上のRNAi剤を組成物中に含む場合、同じリンカーを用いてその2種以上のRNAi剤をそのそれぞれの標的基と連結してもよい。実施態様によっては、2種以上のRNAi剤を組成物中に含む場合、異なるリンカーを用いてその2種以上のRNAi剤をそのそれぞれの標的基と連結する。
実施態様によっては、連結基をRNAi剤に連結する。連結基は、薬剤を標的基、薬物動態調節剤、送達重合体、または送達担体と共有結合しやすくする。RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3'末端および／または5'末端に連結基を連結してもよい。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖に連結基を連結する。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖の5'末端または3'末端に連結基を結合する。実施態様によっては、RNAi剤のセンス鎖の5'末端に連結基を結合する。連結基の例としては、限定はされないが、C6-SS-C6、6-SS-6、反応基、たとえば１級アミン（たとえばNH2-C6）、ならびにアルキン、アルキル基、脱塩基残基／ヌクレオチド、アミノ酸、トリアルキン官能化基、リビトール、および／またはPEG基が挙げられる。特定の連結基の例を表6に示す。
リンカーまたは連結基は、目的の一方の化学基（RNAi剤など）またはセグメントを目的の別の化学基（標的基、薬物動態調節剤、もしくは送達重合体など）またはセグメントに、１つ以上の共有結合により連結する2個の原子間の接続である。不安定な連結は不安定な結合を含む。連結は、必要に応じて、連結された2個の原子間の距離を長くするスペーサーを含んでもよい。スペーサーはさらに、連結に柔軟性および／または長さを加えてもよい。スペーサーとしては、限定されないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基が挙げられ、それぞれ、１つ以上のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含んでもよい。スペーサー基は当技術分野で周知であり、先の列挙は明細書の範囲を限定することを意図するものではない。実施態様によっては、ポリエチレングリコール(PEG)部分、あるいは12個以上の炭素原子を有する疎水性基（コレステロールまたはパルミトイルなど）にベータENaC RNAi剤を結合する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を1種以上の薬物動態／薬力学(PK/PD)調節剤に連結する。PK/PD調節剤は、細胞受容体結合の改善、細胞取込の改善、および／または他の手段により、結合した薬物の循環時間を長くし、かつ／またはRNAi剤の活性を高めることができる。RNAi剤と共に用いるのに適した様々なPK/PD調節剤が当技術分野で公知である。実施態様によっては、PK/PD調節剤はコレステロールまたはコレステリル誘導体であってもよく、状況によっては、PK/PD調節剤はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、またはアラルキニル基で構成されてもよく、各基は鎖状、分岐状、あるいは環状であってもよく、かつ／または置換されていてもされていなくてもよい。実施態様によっては、これらの部分に対する結合の位置は、センス鎖の5’末端または3'末端、センス鎖の任意の所定のヌクレオチドのリボース環の2'位にあり、および／またはセンス鎖の任意の位置のホスファートもしくはホスホロチオアート骨格に結合される。
表2、3、および4に示すベータENaC RNAi剤ヌクレオチド配列はいずれも、修飾されていてもいなくても、3'末端および／もしくは5'末端標的基、連結基、ならびに／またはPK/PD 調節剤を含んでもよい。表3および4に示す、あるいはそれ以外で本明細書中に記載の、3'末端もしくは5'末端標的基、連結基、および／またはPK/PD調節剤を含むベータENaC RNAi剤ヌクレオチド配列はいずれも、代替的には3'末端もしくは5'末端標的基、連結基、またはPK/PD調節剤を含まなくてもよいし、異なる3'末端もしくは5'末端標的基、連結基、または薬物動態調節剤を含んでもよい。薬物動態調節剤としては、限定されないが、表6に記載のものが挙げられる。表5Aおよび5Bに示すベータENaC RNAi剤二本鎖はいずれも、修飾の有無にかかわらず、標的基または連結基（表6に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含んでもよく、この標的基または連結基をベータENaC RNAi剤二本鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖の3'末端または5'末端に結合してもよい。
特定の修飾ヌクレオチド、キャッピング部分、および連結基の例を表6に示す。
Figure 2023501246000016
Figure 2023501246000017
Figure 2023501246000018
Figure 2023501246000019
Figure 2023501246000020
Figure 2023501246000021
Figure 2023501246000022
Figure 2023501246000023
Figure 2023501246000024
Figure 2023501246000025
Figure 2023501246000026
Figure 2023501246000027
Figure 2023501246000028
あるいは、当技術分野で公知の他の連結基を用いてもよい。多くの場合、連結基は市販で入手可能であり、あるいは市販のヌクレオチドホスホラミダイトに組み込まれる（たとえば、国際特許出願公開第WO 2019/161213号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を標的リガンドまたは薬物動態／薬力学(PK/PD)調節剤と結合せずに（「裸の(naked)」または「裸のRNAi剤」という）送達する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を標的基、連結基、PK 調節剤、および／または別の非ヌクレオチド基に結合して、選択した細胞または組織、たとえば上皮細胞にインビボでベータENaC RNAi剤を送達しやすくする。実施態様によっては、インテグリン標的リガンドを含む標的基にベータENaC RNAi剤を結合する。実施態様によっては、このインテグリン標的リガンドはαvβ6 インテグリン標的リガンドである。実施態様によっては、標的基は１つ以上のαvβ6インテグリン標的リガンドを含む。
実施態様によっては、細胞または組織にRNAi剤を送達するのに送達担体を用いてもよい。送達担体は、細胞または組織へのRNAi剤の送達を改善する化合物である。送達担体は、重合体（両親媒性重合体など）、膜活性重合体、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド(MLP)、脂質、可逆的に修飾された重合体もしくはペプチド、または可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、あるいはこれらからなってもよいが、これらに限定されない。
実施態様によっては、RNAi剤を脂質、ナノ粒子、重合体、リポソーム、ミセル、DPC、または当技術分野で核酸送達に利用可能な他の送達系と組み合わせてもよい。また、RNAi剤を標的基、脂質（コレステリルおよびコレステリル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない）に化学結合してもよく、イオン泳動または当技術分野で利用可能な他の送達担体もしくは送達系、たとえばハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体付着性微小球、またはタンパク質性ベクターへの組込みにより、ナノ粒子、リポソーム、ミセルに被包してもよく、重合体またはDPCに結合してもよい（たとえば、WO 2000/053722、WO 2008/022309、WO 2011/104169、およびWO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141を参照のこと。各文献は参照により本明細書に組み込まれる）。実施態様によっては、RNAi剤を肺上皮細胞との親和性を有する抗体と結合してもよい。実施態様によっては、RNAi剤を肺上皮細胞または肺上皮細胞に存在する受容体との親和性を有する標的リガンドと連結してもよい。
医薬組成物および製剤
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を医薬組成物または製剤（本明細書では「医薬」ともいう）として調製してもよい。実施態様によっては、医薬組成物は、少なくとも１種のベータENaC RNAi剤を含む。これらの医薬組成物は、標的細胞、細胞群、組織、または生体中でのベータENaC mRNAの発現の阻害に特に有用である。この医薬組成物を用いて、標的mRNAのレベルの低下または標的遺伝子の発現の阻害から利益を得る、疾患、障害、または病気を有する対象を処置することができる。この医薬組成物を使用して、標的mRNAのレベルの低下または標的遺伝子の発現の阻害から利益を得る、疾患または障害を発症するリスクがある対象を処置することができる。一実施態様では、この方法は、本明細書に記載の標的リガンドに連結されたベータENaC RNAi剤を処置対象に投与することを含む。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を含む医薬組成物に１つ以上の医薬的に許容される賦形剤（溶媒（vehicles）、担体（carriers）、希釈剤、および／または送達重合体などが挙げられる）を添加して、ヒトを含む対象へのインビボでの送達に適した医薬製剤または医薬を形成する。
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を含む医薬組成物および方法は、治療有効量の本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を対象に投与して対象中のベータENaC mRNAの発現を阻害するなどにより、細胞、細胞群、細胞群、組織、器官、または対象における標的mRNAのレベルを低下させる。実施態様によっては、対象は、少なくとも部分的にENaC発現により媒介される疾患または障害を有すると以前に特定または診断されたことがある。実施態様によっては、対象は、１つ以上の細胞または組織でENaC活性が増加していると以前に特定または診断されたことがある。実施態様によっては、対象は、１つ以上の呼吸器疾患、たとえば、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全、および肺がん嚢胞性線維症を有すると以前に診断されたことがある。実施態様によっては、対象は、１つ以上の眼疾患、たとえばドライアイを有すると以前に診断されたことがある。実施態様によっては、対象は、ENaC活性の増加と関連する、またはそれにより引き起こされる１つ以上の呼吸器疾患と関連する症状に罹患したことがある。
本開示の実施態様は、ベータENaC RNAi剤を肺上皮細胞にインビボで送達するための医薬組成物を包含する。このような医薬組成物としては、たとえば、インテグリン標的リガンドを含む標的基に結合したベータENaC RNAi剤を挙げることができる。実施態様によっては、インテグリン標的リガンドはαvβ6インテグリンリガンドで構成される。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を含む記載される医薬組成物を、ENaCの発現の阻害から利益を得る対象の臨床症状を処置または管理するために使用する。実施態様によっては、治療または予防有効量の医薬組成物の１つ以上をそのような処置を必要とする対象に投与する。実施態様によっては、開示のベータENaC RNAi剤のいずれかの投与を用いて対象における疾患の症状の数、重症度、および／または頻度を下げることができる。
実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を必要に応じて１種以上の（すなわち第2、第3などの）治療薬と組み合わせる。第2の治療薬は、別のベータENaC RNAi剤（たとえば、ベータENaC遺伝子中の異なる配列を標的とするベータENaC RNAi剤）であってもよい。実施態様によっては、第2の治療薬は、アルファENaC遺伝子を標的とするRNAi剤であってもよい。さらなる治療薬は、小分子薬物、抗体、抗体断片、および／またはアプタマーであってもよい。１種以上のさらなる治療薬の有無にかかわらず、ベータENaC RNAi剤を１種以上の賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。
ベータENaC RNAi剤を含む記載される医薬組成物を用いて、ベータENaC mRNAの発現の低下または阻害から利益を得る、疾患または障害を有する対象の少なくとも１つの症状を処置することができる。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を含む治療有効量の１つ以上の医薬組成物を対象に投与することにより症状を処置する。他の実施態様では、予防有効量の１つ以上のベータENaC RNAi剤を対象に投与することにより少なくとも１つの症状を予防または阻害する。
実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤の１つ以上を医薬的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与する。実施態様によっては、哺乳動物はヒトである。
投与経路は、ベータENaC RNAi剤が身体と接触する経路である。一般に、哺乳動物の処置のために薬物、オリゴヌクレオチド、および核酸を投与する方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物の投与に応用可能である。特定の経路に対して適切に調整した調製物中で、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を任意の好適な経路で投与することができる。したがって、実施態様によっては、本明細書に記載の医薬組成物を吸入、鼻内投与、気管内投与、または口咽頭吸入投与により投与する。実施態様によっては、医薬組成物を注射により、たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節内、もしくは腹腔内または局所投与してもよい。
当技術分野で公知のオリゴヌクレオチド送達技術を用いて本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を含む医薬組成物を細胞、細胞群、組織、または対象に送達することができる。一般に、核酸分子を送達するための当技術分野で認識される任意の好適な方法（インビトロまたはインビボ）を、本明細書に記載の組成物と共に使用するために適合させることができる。たとえば、送達は、局所投与（たとえば、直接的注射、埋込み、もしくは局所投与）、全身投与、または皮下、静脈、腹腔、もしくは非経口経路（頭蓋内（たとえば、脳室内、実質内および髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、経口、直腸、もしくは局所（頬側および舌下を含む）投与を含む、）によるものであってもよい。実施態様によっては、吸入、鼻内投与、口咽頭吸入投与、または気管内投与により組成物を投与する。たとえば、実施態様によっては、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤が肺上皮のベータENaC遺伝子の発現を阻害することが望ましく、そのために（たとえば定量吸入器などの吸入装置、またはジェット式もしくは振動式メッシュ噴霧器などの噴霧器、またはソフトミスト吸入器による）吸入による投与が特に好適かつ有利である。
実施態様によっては、本明細書に記載の医薬組成物は１種以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。本明細書に記載の医薬組成物は対象への投与のために製剤化される。
本明細書で使用される場合、医薬組成物または医薬は、薬理学的有効量の記載される治療化合物の少なくとも１つ、および１種以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。医薬的に許容される賦形剤（賦形剤）は、薬物送達系に意図的に含まれる医薬有効成分（API、治療生成物、たとえばベータENaC RNAi剤）以外の物質である。賦形剤は、意図される投薬量で治療効果を発揮しない、または発揮することを意図されていない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達系の加工を補助、ｂ）APIの安定性、生物学的利用率、もしくは患者の許容性を保護、支援、もしくは増強、ｃ）生成物の識別を補助、かつ／またはｄ）保存もしくは使用中にAPIの送達の全体的な安全性、有効性の任意の他の特性を増強するように作用することができる。医薬的に許容される賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。
賦形剤としては、限定されるものではないが、吸収促進剤、接着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝化剤、担体、被覆剤、着色料、送達増強剤、送達重合体、洗浄剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、矯味矯臭剤、流動促進剤、保水剤、潤滑剤、油、重合体、保存剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖、界面活性剤、懸濁化剤、徐放基質、甘味料、増粘剤、等張剤、溶媒、撥水剤、および湿潤剤が挙げられる。
注射用の使用に適した医薬組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合）もしくは分散物、および滅菌注射溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor（登録商標）ELTM (BASF、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が挙げられる。それは、製造および保存条件で安定で、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存されるべきである。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、ならびにその好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であってもよい。たとえば、レシチンなどの被覆の使用、必要とされる粒径の維持（分散物の場合）、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより、注射用組成物の持続的吸収を得ることができる。
必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組合せと共に必要量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込んだ後に滅菌濾過を行って、滅菌注射溶液を調製してもよい。一般には、塩基性分散媒および上に列挙した中の必要な他の成分を含む滅菌溶媒に活性化合物を組み込んで分散物を調製する。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法としては真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、これにより、活性成分および所望の追加成分の粉剤が、事前に滅菌濾過されたそれらの溶液から得られる。
関節内投与に適した製剤は、微結晶形態、たとえば水性の微結晶性懸濁液の形態になり得る薬物の滅菌水性調製物の形態であってもよい。リポソーム製剤または生分解性ポリマー系を使用して関節内投与と経眼投与の両用の薬物を提供してもよい。
適切な溶媒中に所望の量の活性化合物を組み込んだ後に滅菌濾過を行うことにより、吸入投与に適した製剤を調製してもよい。一般には、吸入投与用の製剤は、生理的pHの滅菌溶液であり、低粘度（<5cP）を有する。塩を製剤に添加して張度を平衡化してもよい。場合によっては、界面活性剤または共溶媒を添加して活性化合物の溶解度を上げ、エアロゾル特性を改善してもよい。場合によっては、賦形剤を添加して粘度を調節し、噴霧される液滴の大きさおよび分布を確保してもよい。
実施態様によっては、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を含む吸入投与に適した医薬製剤を水性リン酸ナトリウム緩衝剤溶液に調製（たとえば、ベータENaC RNAi剤を0.5 mMリン酸一ナトリウム溶液、0.5 mMリン酸二ナトリウム溶液、水溶液に配合）してもよい。
身体からの急速な除去から化合物を保護する担体を加えて活性化合物を調製してもよい（たとえば、埋込物およびマイクロカプセル化した送達系などの徐放性製剤）。エチレン酢酸ビニル、無水物重合体、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかである。リポソーム懸濁液を医薬的に許容される担体として用いてもよい。当業者に公知の方法、たとえば米国特許第4,522,811号に記載の方法に従ってこれらを調製することができる。
投与しやすく、また投薬量を均一にするために、ベータENaC RNAi剤を単位剤形の組成物に製剤化してもよい。単位剤形は、処置対象に対する一回の投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を付与するよう計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形に関する仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成する治療効果、ならびに個体の処置のために当該活性化合物を配合する技術分野における本来の制限により決定され、それらに直接依存する。
医薬組成物は、医薬組成物中に一般に見られる他の追加成分を含んでもよい。そのような追加成分としては、限定されるものではないが、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、または抗炎症剤（たとえば、抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）が挙げられる。本明細書で定義されるRNAi剤を発現する、または含む細胞、組織、または単離された器官を「医薬組成物」として用いてもよいことも想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」は、薬理学的、治療的、または予防的結果を付与するRNAi剤の量を指す。
実施態様によっては、本明細書に開示の方法は、本明細書に開示のRNAi剤を投与することに加え、第２の治療剤または処置を施す工程をさらに含む。実施態様によっては、第２の治療剤は別のベータENaC RNAi剤（たとえば、ベータENaC標的中の異なる配列を標的とするベータENaC RNAi剤）である。他の実施態様では、第２の治療剤は小分子薬物、抗体、抗体断片、および／またはアプタマーであってもよい。
実施態様によっては、異なる配列を有する少なくとも２種のベータENaC RNAi剤の組合せまたは混合物を含む組成物を本明細書に記載する。実施態様によっては、この２つ以上のベータENaC RNAi剤をそれぞれ別個かつ独立に標的基に連結する。実施態様によっては、インテグリン標的リガンドを含むかそれからなる標的基にこの２つ以上のベータENaC RNAi剤をそれぞれ連結する。態様によっては、αvβ6インテグリン標的リガンドを含むかそれからなる標的基にこの２つ以上のベータENaC RNAi剤をそれぞれ連結する。
ベータENaC RNAi剤を肺上皮細胞に送達するための組成物を本明細書に記載する。さらに、ベータENaC RNAi剤を細胞、たとえば腎上皮細胞および／または胃腸管もしくは生殖器系の上皮細胞、および／または目の眼表面の上皮細胞にインビボで送達するための組成物を本明細書に一般に記載する。
一般に、本明細書に開示のベータENaC RNAi剤の有効量は、約0.0001～約20 mg/kgの体重／蓄積用量（of body weight/deposited dose）、たとえば約0.001～約5 mg/kgの体重／蓄積用量の範囲にある。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤の有効量は、約0.01 mg/kg～約3.0 mg/kgの体重／蓄積用量の範囲にある。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤の有効量は、約0.03 mg/kg～約2.0 mg/kgの体重／蓄積用量の範囲にある。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤の有効量は、体重あたりの蓄積用量である約0.01～約1.0 mg/kgの範囲にある。実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤の有効量は、体重あたりの蓄積用量である約0.50～約1.0 mg/kgの範囲にある。投与される量は、患者の全体的な健康状態、送達される化合物の相対的な生物学的効能、薬物の製剤、製剤中の賦形剤の有無および種類、ならびに投与経路などの要因に依存する可能性もある。また、なお、投与される初期投薬量を、所望の血中濃度もしくは組織中濃度を迅速に達成するために上記の上限値以上に増やしてもよく、あるいは初期投薬量は最適投薬量よりも小さくてもよい。実施態様によっては、投与を１日１回行う。実施態様によっては、投与を週に１回行う。さらなる実施態様では、投与を2週間に１回、3週間に１回、月に１回、または四半期に１回（すなわち3か月に１回）行ってもよい。
疾患の処置のため、または疾患を処置するための医薬もしくは組成物の形成のために、ベータENaC RNAi剤を含む本明細書に記載の医薬組成物を賦形剤、または第２の治療剤または処置（第２のもしくは他のRNAi剤、小分子薬物、抗体、抗体断片、ペプチド、および／またはアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせてもよい。
医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントに加える場合、記載のベータENaC RNAi剤をキット、容器、パック、またはディスペンサーに包装してもよい。本明細書に記載の医薬組成物を乾燥粉剤もしくはエアロゾル吸入器、他の定量吸入器、噴霧器、予め充填済みの注射器、またはバイアルに包装してもよい。
処置および発現阻害の方法
本明細書に開示のベータENaC RNAi剤を用いて、RNAi剤の投与から利益を得る、疾患または障害を有する対象（たとえば、ヒトまたは他の哺乳動物）を処置することができる。実施態様によっては、本明細書に開示のRNAi剤を用いて、ベータENaC mRNAの発現の減少および／または阻害から利益を得る対象（たとえば、ヒト）を処置することができる。
実施態様によっては、本明細書に開示のRNAi剤を用いて、対象（たとえば、ヒト）がENaCチャネル活性の低下から利益を得る疾患または障害（たとえば、限定されるものではないが、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全、および／もしくは肺がん嚢胞性線維症、ならびに／またはドライアイなどが挙げられる）を有する対象を処置することができる。対象の処置は、治療的および／または予防的処置を包含し得る。治療有効量の本明細書に記載の任意の１種以上のベータENaC RNAi剤を対象に投与する。対象は、ヒト、患者、またはヒト患者であってもよい。対象は、成人、青年、小児、または幼児であってもよい。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、ヒトに対してであっても動物に対してであってもよい。
ENaC活性の増加は、気道表面の液体の脱水を促進し、粘液線毛クリアランスを損なうことが知られている。実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を用いて、対象における少なくとも部分的にENaC活性レベルにより媒介される少なくとも１つの症状を処置する。治療有効量の任意の１種以上の記載のベータENaC RNAi剤を対象に投与する。実施態様によっては、予防有効量の任意の１種以上の記載のRNAi剤を対象に投与して、少なくとも１つの症状を予防または阻害することにより対象を処置する。
特定の実施態様では、本開示は、処置を必要とする患者における少なくとも部分的にベータENaC遺伝子発現により媒介される疾患、障害、病気、または病的状態を処置する方法であって、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤のいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。
実施態様によっては、ベータENaC RNAi剤を用いて対象における臨床症状または病的状態を処置または管理する。ここで、臨床症状または病的状態は、少なくとも部分的にENaC発現により媒介される。治療有効量の本明細書に記載のベータENaC RNAi剤またはベータENaC RNAi剤を含む組成物の１種以上を対象に投与する。実施態様によっては、方法は、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を含む組成物を処置対象に投与することを含む。
さらなる局面では、本開示は、ENaC活性の増加または上昇により引き起こされる疾患または症状の処置（予防処置を含む）の方法を特徴とし、この方法は、表2または表3の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むベータENaC RNAi剤を必要な対象に投与することを含む。このような方法に用いる組成物も本明細書に記載する。
記載のベータENaC RNAi剤および／またはベータENaC RNAi剤を含む組成物を、ENaC活性レベルの増加または上昇により引き起こされる疾患または病気の治療処置の方法に用いてもよい。このような方法は、本明細書に記載のベータENaC RNAi剤を対象（たとえば、ヒトまたは動物の対象）に投与することを含む。
別の局面では、本開示は、少なくとも部分的にベータENaC発現により媒介される病的状態（病気または疾患など）の処置（予防処置を含む）の方法であって、表2または表3の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含む治療有効量のRNAi剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
実施態様によっては、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表2または表3の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むRNAi剤を細胞に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、少なくとも部分的にベータENaC発現により媒介される病的状態の処置（予防処置を含む）の方法であって、表2または表4の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含む治療有効量のRNAi剤を対象に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表2または表4の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含むRNAi剤を細胞に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、少なくとも部分的にベータENaC発現により媒介される病的状態の処置（予防処置を含む）の方法であって、表4の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖および表3の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含む治療有効量のRNAi剤を対象に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表4の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖および表3の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むRNAi剤を細胞に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表4の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるセンス鎖および表3の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるアンチセンス鎖を含むベータENaC RNAi剤を対象に投与することを含む方法を本明細書に開示する。他の実施態様では、ベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表4の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるセンス鎖および表3の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるアンチセンス鎖を含むベータENaC RNAi剤を対象に投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、細胞内のベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、表5Aおよび5Bに示す二本鎖のうちの１つの二本鎖構造を含む１種以上のベータENaC RNAi剤を投与することを含む方法を本明細書に開示する。
実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の特定の上皮細胞におけるベータENaC遺伝子の遺伝子発現レベルおよび／またはmRNAレベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または99%より多く低下する。実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の特定の上皮細胞におけるENaCレベルまたはENaCチャネル活性レベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または99%より多く低下する。対象における遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、および／またはmRNAレベルは、対象の細胞、細胞群、および／または組織中で低下してもよい。実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の特定の上皮細胞におけるベータENaC mRNAレベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%低下する。実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の特定の上皮細胞におけるENaCヘテロ三量体タンパク質複合体のレベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%低下する。対象におけるENaCレベルは、対象の細胞、細胞群、組織、血液、および／または他の液体中で低下してもよい。たとえば、実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の肺上皮細胞におけるベータENaC mRNAおよび／またはENaCヘテロ三量体タンパク質複合体のレベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%低下する。実施態様によっては、記載のベータENaC RNAi剤を投与された対象の肺上皮細胞、たとえば気道上皮細胞のサブセットにおけるベータENaC mRNAおよび／またはENaC ヘテロ三量体タンパク質複合体および／またはENaCチャネル活性のレベルは、そのベータENaC RNAi剤を投与される前の対象またはそのベータENaC RNAi剤を投与されない対象に対して、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%低下する。
遺伝子発現、mRNA、およびタンパク質レベルの低下を当技術分野で公知の任意の方法で評価することができる。ベータENaC mRNAレベル、ENaCチャネル活性レベル、および／またはENaCヘテロ三量体タンパク質複合体レベルの低下または減少を、本明細書では集合的に、ベータENaCの低下もしくは減少、またはベータENaC遺伝子の発現の阻害もしくは低下と呼ぶ。本明細書に記載の実施例は、ベータENaC遺伝子発現の阻害を評価するための公知の方法を例示する。
細胞、組織、器官、および非ヒト生物
本明細書に記載のベータENaC RNAi剤の少なくとも１種を含む細胞、組織、器官、または非ヒト生物が想定される。細胞、組織、器官、または非ヒト生物は、RNAi剤を細胞、組織、器官、または非ヒト生物に送達することにより作製される。
以下、上で示した実施態様および項目を下記の非限定的な実施例により例示する。
実施例１．ベータENaC RNAi剤の合成
表5Aおよび5Bに示すベータENaC RNAi剤二本鎖を以下に従って合成した。
Ａ．合成。ベータENaC RNAi剤のセンスおよびアンチセンス鎖を、オリゴヌクレオチド合成に用いられる固相上でホスホラミダイト技術に従って合成した。規模に応じて、MerMade96E（登録商標）(Bioautomation)、MerMade12（登録商標）(Bioautomation)、またはOP Pilot 100 (GE Healthcare)を用いた。制御細孔ガラス製の固相担体（CPG、500オングストローム または600オングストローム、Prime Synthesis（米国ペンシルベニア州アストン）から入手）上で合成を実施した。すべてのRNAおよび2'-修飾RNAホスホラミダイトをThermo Fisher Scientific（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。具体的には、使用した2'-O-メチルホスホラミダイトには以下のもの、すなわち、(5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-メチル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシ-トリチル-N4-(アセチル)-2'-O-メチル-シチジン-3'-O-(2－シアノエチル-N,N-ジイソプロピル-アミノ) ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-メチル-グアノシン-3'-O-(2－シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、および5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-ウリジン-3'-O-(2－シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトが含まれていた。2'-デオキシ-2'-フルオロ-ホスホラミダイトは、2'-O-メチルRNAアミダイトと同じ保護基を有していた。5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-イノシン-3'-O-(２－シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトをGlen Research (バージニア州)から購入した。逆位脱塩基(3'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシリボース-5'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトをChemGenes (米国マサチューセッツ州ウィルミントン)から購入した。以下のUNAホスホラミダイト、すなわち、5'-(4,4'-ジメトキシトリチル)-N6-(ベンゾイル)-2',3'-セコアデノシン、2'-ベンゾイル-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト、5'-(4,4'-ジメトキシトリチル)-N-アセチル-2',3'-セコシトシン、2'-ベンゾイル-3'-[(２－シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト、5'-(4,4'-ジメトキシトリチル)-N-イソブチリル-2',3'-セコグアノシン、2'-ベンゾイル-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト、および5'-(4,4'-ジメトキシ-トリチル)-2',3'-セコウリジン、2'-ベンゾイル-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N- ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトを使用した。TFAアミノ結合ホスホラミダイトも市販で購入した(ThermoFisher)。国際特許出願公開第WO 2017/214112号に従い、シクロプロピルホスホナート系ホスホラミダイト（cyclopropyl phosphonate phosphoramidites）を合成した。
トリアルキン含有ホスホラミダイトを無水ジクロロメタンまたは無水アセトニトリル（50 mM）、他のすべてのアミダイトを無水アセトニトリル（50 mM）に溶解し、分子ふるい（3Å）を加えた。5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール（BTT、250 mMアセトニトリル溶液）または5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETT、250mMアセトニトリル溶液）を活性剤溶液として用いた。カップリング時間は、10分（RNA）、90秒（2’O-Me）、および60秒（2’F）であった。ホスホロチオアート結合を導入するために、3-フェニル1,2,4-ジチアゾリン-5-オン（POS、PolyOrg, Inc.（米国マサチューセッツ州レミンスター）から入手）の100 mM無水アセトニトリル溶液を用いた。
あるいは、合成後にトリアルキン部分を導入した（下のＥ項を参照のこと）。この経路については、一級アミンを含む5’末端および／または3’末端ヌクレオチドを用いてセンス鎖を官能化した。TFAアミノ結合ホスホラミダイトを無水アセトニトリル（50 mM）に溶解し、分子ふるい（3Å）を加えた。5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール（BTT、250 mMアセトニトリル溶液）または5-エチルチオ-1H-テトラゾール（ETT、250mMアセトニトリル溶液）を活性剤溶液として用いた。カップリング時間は、10分（RNA）、90秒（2’O-Me）、および60秒（2’F）であった。ホスホロチオアート結合を導入するために、3-フェニル1,2,4-ジチアゾリン-5-オン（POS、PolyOrg, Inc.（米国マサチューセッツ州レミンスター）から入手）の100 mM無水アセトニトリル溶液を用いた。
Ｂ．担体に結合したオリゴマーの切断および脱保護。固相合成の完了後、乾燥させた固相担体を、40重量%のメチルアミン水溶液と28%～31%の水酸化アンモニウム溶液（Aldrich）の１：１容量の溶液で、30℃で1.5時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残留物を水中で再構成した（以下を参照のこと）。
Ｃ．精製。TSKgel SuperQ-5PW 13μmカラムおよびShimadzu LC-8システムを用いる陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、粗オリゴマーを精製した。緩衝液Aは、20 mM Tris、5mM EDTA（pH9.0）であり、20%のアセトニトリルを含んでいた。緩衝液Bは緩衝液Aと同じものに1.5 Mの塩化ナトリウムを加えたものであった。260 nmでのUVトレースを記録した。適切な画分をプールした後、100 mMの重炭酸アンモニウム（pH6.7）と20%のアセトニトリルまたは濾過水の泳動用緩衝液を用いて、Sephadex G-25 fineを充填したGE Healthcare XK 16/40カラムによるサイズ排除HPLCで泳動させた。あるいは、プールした画分を脱塩し、接線流濾過により適切な緩衝液または溶媒系に変えた。
Ｄ．アニーリング。等モル濃度のRNA（センスおよびアンチセンス）の１倍PBS（リン酸緩衝生理食塩水、１倍、Corning、Cellgro）溶液を組み合わせて相補鎖を混合し、RNAi剤を形成した。一部のRNAi剤を凍結乾燥し、－15～－25℃で保存した。１倍PBS中でUV-Vis分光光度計で溶液の吸光度を測定して二本鎖の濃度を決定した。次いで、260 nmでの溶液の吸光度に換算係数(0.050 mg/(mL・cm))および希釈係数を乗じ、二本鎖濃度を決定した。
Ｅ．トリアルキンリンカーの結合。実施態様によっては、トリアルキンリンカーをホスホラミダイトとして樹脂上のRNAi剤のセンス鎖に結合する（トリアルキンリンカーホスホラミダイトの例の合成については実施例1G、ホスホラミダイトの結合については実施例1Aを参照のこと）。他の実施態様では、以下に説明するように、アニーリングの前または後に、樹脂から切断した後にセンス鎖にトリアルキンリンカーを結合してもよい。実施態様によっては、5'末端または3'末端をアミン官能化したセンス鎖をトリアルキンリンカーと結合する。本明細書に開示の構築物を形成するのに用いることができるトリアルキンリンカーの構造例は以下のとおりである。
Figure 2023501246000029
 アニールした二本鎖にトリアルキンリンカーを結合するため、アミン官能化した二本鎖を90% DMSO/10% H2Oに約50～70 mg/mLで溶解した。40当量のトリエチルアミンを加えた後、3当量のトリアルキン-PNPを加えた。完了したら、複合体を1×リン酸緩衝生理食塩水／アセトニトリル（1:14の比）の溶媒系で2回沈殿させ、乾燥させた。
Ｆ．標的リガンドSM6.1の合成
((S)-3-(4-(4-((14-アジド-3,6,9,12-テトラオキサテトラデシル)オキシ)ナフタレン-１-イル)フェニル)-3-(2-(4-((4-メチルピリジン-2-イル)アミノ)ブタンアミド)アセトアミド)プロパン酸)
Figure 2023501246000030
化合物5 ((4-メチルピリジン-2-イル)カルバミン酸tert-ブチル) (0.501 g、2.406 mmol、1当量)をジメチルホルムアミド（DMF）(17 mL)に溶解した。この混合物に、NaH (0.116 mg、3.01 mmol、1.25当量、60%油分散液)を加えた。混合物を10分間撹拌した後、化合物20 (4-ブロモ酪酸エチル(0.745 g、3.82 mmol、0.547 mL)) (Sigma 167118)を加えた。3時間後、反応液をエタノール(18 mL)で反応停止させ、濃縮した。濃縮物をDCM (50 mL)に溶解し、飽和NaCl水溶液で洗浄し(50 mLで1回)、Na2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をシリカカラムで精製した（濃度勾配：DCM中0～5%メタノール）。
Figure 2023501246000031
化合物21 (0.80 g、2.378 mmol)をアセトン：0.1 M NaOH [1:1] (100 mL)に溶解した。反応を薄層クロマトグラフィー（TLC）（5% 酢酸エチル・ヘキサン溶液）で監視した。有機物を濃縮して取り除き、残留物を0.3 Mクエン酸(40 mL)でpH3～4に酸性化した。生成物をDCMで抽出した(75 mLで3回)。有機物をプールし、Na2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成物をそれ以上精製せずに使用した。
Figure 2023501246000032
化合物22 (1.1 g、3.95 mmol、1当量)、化合物45 (595 mg、4.74 mmol、1.2当量)、およびTBTU (1.52 g、4.74 mmol、1.2当量)の無水DMF溶液(10 mL)に、ジイソプロピルエチルアミン(2.06 mL、11.85 mmol、3当量)を0℃で加えた。反応混合物を室温に温め、3時間撹拌した。反応を飽和NaHCO3溶液(10 mL)で停止させた。水相を酢酸エチルで抽出し(10 mLで3回)、有機相を合わせ、無水Na2SO4で乾燥し、濃縮した。シリカゲルを固定相として用いるCombiFlash（登録商標）で生成物を分離した（LC-MS: [M+H]+ 計算値366.20、測定値367）。
Figure 2023501246000033
化合物61 (2 g、8.96 mmol、1当量)および化合物62 (2.13 mL、17.93 mmol、2当量)の無水DMF (10 mL)溶液に、K2CO3 (2.48 g、17.93 mmol、2当量)を0℃で加えた。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した。反応を水(10 mL)で停止させた。水相を酢酸エチルで抽出し(10 mLで3回)、有機相を合わせ、無水Na2SO4で乾燥し、濃縮した。シリカゲルを固定相として用いるCombiFlash（登録商標）で生成物を分離した。
Figure 2023501246000034
化合物60 (1.77 g、4.84 mmol、1当量)のTHF (5 mL)・H2O (5 mL)溶液に、水酸化リチウム一水和物(0.61 g、14.53 mmol、3当量)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温に温め、3時間撹拌した後、反応混合物をHCl (6N)でpH3.0に酸性化した。水相を酢酸エチルで抽出し(20 mLで3回)、有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濃縮した（LC-MS: [M+H]+ 計算値352.18、測定値352）。
Figure 2023501246000035
化合物63 (1.88 g、6.0 mmol、1.0当量)の無水THF (20 mL)溶液に、n-BuLiのヘキサン溶液(3.6 mL、9.0 mmol、1.5当量)を-78℃で一滴ずつ加えた。さらに1時間、-78℃で反応を維持した。次いでホウ酸トリイソプロピル(2.08 mL、9.0 mmol、1.5当量)を-78℃で混合物に加えた。次いで反応物を室温に温め、さらに1時間撹拌した。反応を飽和NH4Cl溶液(20 mL)で停止させ、pHを3に調整した。水相をEtOAcで抽出し(20 mLで3回)、有機相を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。
Figure 2023501246000036
化合物12 (300 mg、0.837 mmol、1.0当量)、化合物65 (349 mg、1.256 mmol、1.5当量)、XPhos Pd G2 (13 mg、0.0167 mmol、0.02当量)、およびK3PO4 (355 mg、1.675mmol、2.0当量)を丸底フラスコで混合した。フラスコをセプタム付きスクリューキャップで密閉した後、窒素置換した（この工程を合計3回繰り返した）。次いで、THF (8 mL)および水(2 mL)を注射器で加えた。混合物に20分間かけて窒素充填し、室温で一晩、反応を維持した。反応を水(10 mL)で停止させ、水相を酢酸エチルで抽出した(10 mLで3回)。有機相をNa2SO4で乾燥し、濃縮し、シリカゲルを固定相として用いるCombiFlash（登録商標）で精製し、15% EtOAc・ヘキサン溶液で溶出した（LC-MS: [M+H]+ 計算値512.24、測定値512.56）。
Figure 2023501246000037
化合物66 (858 mg、1.677 mmol、1.0当量)を氷浴で冷却した。HClのジオキサン(8.4 mL、33.54 mmol、20当量)溶液をフラスコに加えた。反応物を室温に温め、さらに1時間撹拌した。溶媒を回転蒸発器で除去し、生成物をそれ以上精製せず、そのまま使用した（LC-MS: [M+H]+計算値412.18、測定値412.46）。
Figure 2023501246000038
化合物64 (500 mg、1.423 mmol、1当量)、化合物67 (669 mg、1.494 mmol、1.05当量)、およびTBTU (548 mg、0.492 mmol、1.2当量)の無水DMF (15 mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.744 mL、4.268 mmol、3当量)を0℃で加えた。反応混合物を室温に温め、さらに1時間撹拌した。反応を飽和NaHCO3水溶液(10 mL)で停止させ、生成物を酢酸エチルで抽出した(20 mLで3回)。有機相を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。シリカゲルを固定相として用いるCombiFlash（登録商標）で生成物を精製し、3～4%メタノール・DCM溶液で溶出した。収率は96.23%であった（LC-MS: [M+H]+ 計算値745.35、測定値746.08）。
Figure 2023501246000039
化合物68 (1.02 g、1.369 mmol、1当量)の酢酸エチル(10 mL)溶液に、10% Pd/C (0.15 g、50% H2O)を室温で加えた。反応混合物を室温に温め、反応をLC-MSで監視した。室温で一晩、反応を維持した。固体をセライト（登録商標）で濾過し、溶媒を回転蒸発器で除去した。生成物をそれ以上精製せずにそのまま使用した（LC-MS: [M+H]+ 計算値655.31、測定値655.87）。
Figure 2023501246000040
化合物69 (100 mg、0.152 mmol、1当量)およびアジド-PEG5-OTs (128 mg、0.305 mmol、2当量)の無水DMF (2 mL)溶液に、K2CO3 (42 mg、0.305 mmol、2当量)を0℃で加えた。反応混合物を80℃で6時間撹拌した。反応を飽和NaHCO3溶液で停止させ、水層を酢酸エチルで抽出した(10 mLで3回)。有機相を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濃縮した（LC-MS: [M+H]+ 計算値900.40、測定値901.46）。
Figure 2023501246000041
化合物72 (59 mg、0.0656 mmol、1.0当量)のTHF (2 mL)・水(2 mL)溶液に、水酸化リチウム(5 mg、0.197 mmol、3.0当量)を室温で加えた。混合物を室温でさらに1時間撹拌した。HCl (6N)でpHを3.0に調整し、水相を酢酸エチルで抽出した(10 mLで3回)。有機相を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。残留物にTFA (0.5 mL)およびDCM (0.5 mL)を加え、この混合物を室温でさらに3時間撹拌した。溶媒を回転蒸発器で除去した（LC-MS: [M+H]+ 計算値786.37、測定値786.95）。
Ｇ．TriAlk 14の合成
上の表6に示すTriAlk14および(TriAlk14)sを以下に示す合成経路で合成してもよい。標準のオリゴヌクレオチド合成技術で化合物14をホスホラミダイトとしてセンス鎖に付加してもよいし、アミドカップリング反応でアミンを含むセンス鎖に化合物22を結合してもよい。
Figure 2023501246000042
3Lのジャケット付き反応装置に、500 mLのDCMおよび4 (75.0 g、0.16 mol)を加えた。反応物の内部温度を0℃に冷却し、TBTU (170.0 g、0.53 mol)を加えた。次に、懸濁液をアミン5 (75.5 g、0.53 mol)を滴下して処理し、内部温度を5℃未満に維持した。次いで反応物をDIPEA（72.3 g、0.56 mol）でゆっくりと処理し、内部温度を5℃未満に維持した。加え終わると、反応物を1時間かけて23℃まで温め、3時間撹拌した。3種の試薬すべての10％のキッカーチャージ（kicker charge）を追加し、さらに3時間撹拌した。4の残りが1％未満になったときに反応を完了と見なした。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し(500 mLで2回)、飽和重炭酸ナトリウム溶液(500 mL)で１回洗浄した。次いで有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状にした。未精製油の質量は188 gであり、QNMRで72%の6を含んでいた。未精製油を次の工程に移した。C46H60N4O11の質量の計算値=845.0m/z、[M+H]測定値=846.0。
Figure 2023501246000043
72重量%の化合物6 (86.0 g、0.10 mol)を含む121.2 gの未精製油をDMF (344mL)に溶解し、TEA (86 mL、20 v/v%)で処理し、内部温度を23℃未満に維持した。Fmoc-アミン6の消費量に対するジベンゾフルベン（DBF）の形成をHPLC方法1（図2）で監視し、反応は10時間以内に完了した。この溶液にグルタル酸無水物(12.8 g、0.11 mol)を加え、2時間以内に中間体アミン7は化合物8に変換された。完了したら、DMFおよびTEAを30℃で減圧除去し、100 gの未精製油を得た。化合物7の水への溶解度が高いため、水系の手法を用いることができず、クロマトグラフィーがDBF、TMU、および無水グルタル酸を除去する唯一の方法である。未精製油(75 g)をTeledyne ISCO Combi-flash（登録商標）精製システムで3回に分けて精製した。未精製油(25 g)を330 gシリカカラムに充填し、0～20％のメタノール・DCMから30分かけて溶出し、42 gの化合物8（3工程で収率54%）を得た（C36H55N4O12の質量計算値=736.4m/z、[M+H]測定値=737.0）。
Figure 2023501246000044
化合物8 (42.0 g、0.057 mol)を、使用前に10倍容量のアセトニトリルで同時除去してクロマトグラフィー溶媒から残留メタノールをすべて除去した。油をDMF (210 mL)に再溶解し、0℃に冷却した。この溶液を4-ニトロフェノール(8.7 g、0.063 mol)、続いてEDC-塩酸塩(12.0 g、0.063 mol)で処理し、10時間以内に完了したことを確認した。溶液を0℃に冷却し、10倍容量の酢酸エチル、続いて10倍容量の飽和塩化アンモニウム溶液を加え、内部温度を15℃未満に維持した。層を分離させ、酢酸エチル層を食塩水で洗浄した。合わせた水層を5倍容量の酢酸エチルで2回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状にした。未精製油(55 g)をTeledyne ISCO Combi-Flash（登録商標）精製システムで3回に分けて精製した。未精製油(25 g)を330 gシリカカラムに充填し、0～10％のメタノール・DCMから30分かけて溶出し、22 gの純粋な9（化合物22）（収率50%）を得た（C42H59N5O14の質量計算値=857.4m/z、[M+H]測定値=858.0）。
Figure 2023501246000045
エステル9 (49.0 g、57.1 mmol)および6-アミノ-１-ヘキサノール(7.36 g、6.28 mmol)のジクロロメタン（3倍容量）溶液を、トリエチルアミン(11.56g、111.4 mmol)を滴下して処理した。HPLC法1で化合物9の消失を観察して反応を監視し、10分で完了したことを確認した。粗反応混合物を5倍容量のジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム(5倍容量)および食塩水(5倍容量)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状にした。未精製油を330 gシリカカラムを用いてTeledyne ISCO Combi-Flash（登録商標）精製システムで精製した。4-ニトロフェノールを100%酢酸エチルで溶出し、20％メタノール・DCMでカラムから10を洗い流して無色の油(39 g、収率81%)を得た（C42H69N5O12の質量計算値=836.0m/z、[M+H]測定値=837.0）。
Figure 2023501246000046
アルコール10を10倍容量のアセトニトリルで２回同時除去してクロマトグラフィー溶媒から残留メタノールをすべて除去し、5倍容量の乾燥ジクロロメタンでさらに１回同時除去して(KF < 60 ppm)微量の水を除去した。アルコール10 (2.30 g、2.8 mmol)を5倍容量の乾燥ジクロロメタンに溶解し(KF < 50 ppm)、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(188 mg、1.1 mmol)で処理した。この溶液を0℃に冷却し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホラミダイト(1.00 g、3.3 mmol)を滴下して処理した。溶液を氷浴から出し、20℃で撹拌した。反応が3～6時間以内に完了したことを確認した。反応混合物を0℃に冷却し、10倍容量の飽和重炭酸アンモニウム／食塩水の1:1溶液で処理し、次いで１分間かけて周囲温度に温め、20℃でさらに3分間撹拌した。二相性混合物を分液漏斗に移し、10倍容量のジクロロメタンを加えた。有機層を分離し、10倍容量の飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄して未反応のビス－亜リン試薬を加水分解した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、油に濃縮して、94wt%の化合物14 (3.08 g)を得た。C51H86N7O13Pの質量計算値= 1035.6m/z、[M+H]測定値=1036。
Ｈ．標的リガンドの結合。アニーリングの前後いずれかに、5'末端または3'末端を三座配位アルキンで官能化したセンス鎖を標的リガンドに結合する。以下の例では、アニール済みの二重鎖への標的リガンドの結合について説明する。0.5 Mトリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)、0.5 M硫酸Cu (II)五水和物(Cu(II)SO4・5H2O)、および2Mアスコルビン酸ナトリウム溶液の脱イオン水溶液の原液を調製した。標的リガンドのDMSO溶液(75 mg/mL)を作製した。トリアルキン官能化二本鎖（3 mg、75 μL、脱イオン水溶液40 mg/mL、約15,000 g/mol）を含む1.5 mL遠心分離管に、25 μLの1Mヘペス緩衝液(pH 8.5)を加える。ボルテックス後、35 μLのDMSOを加え、溶液をボルテックスする。反応物に標的リガンドを加え(6当量/二重鎖、2当量/アルキン、約15 μL)、溶液をボルテックスする。pH紙を用いてpHを調べ、pHが約8であることを確認した。別の1.5 mL遠心分離管で50 μLの0.5M THPTAを10 μLの0.5 M Cu(II) SO4・5H2Oと混合し、ボルテックスし、室温で5分間保温した。5分後、THPTA/Cu溶液（7.2 μL、6当量、THPTA:Cu = 5:1）を反応バイアルに加え、ボルテックスした。その後すぐに、2Mアスコルビン酸塩(5 μL、50当量/二本鎖、16.7当量/アルキン）を反応バイアルに加え、ボルテックスした。反応が完了すると（典型的には0.5～1時間で完了する）、非変性陰イオン交換クロマトグラフィーで反応物を直ちに精製した。
実施例２．ラットにおけるベータENaC RNAi剤のインビボ気管内投与
試験１日目、雄のスプラーグ・ドーリーラットに、気管内(IT)投与に適したマイクロ噴霧装置（Penn Century、ペンシルベニア州フィラデルフィア）で200マイクロリットルの等張生理食塩水、または0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、もしくは2 mg/kgのベータENaC RNAi剤AD06284、または0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、もしくは2 mg/kgのベータENaC RNAi剤AD06285（各RNAi剤を標的リガンドに連結せず、等張生理食塩水に配合した）を投与した。各群4匹のラットに投与した。試験8日目にラットを屠殺し、採取し均質化した後の両肺から全RNAを単離した。プローブを用いる定量PCRでラットベータENaC (SCNN1B) mRNA発現を定量し、ラットGAPDH発現に対して正規化し、溶媒対照群に対する割合で表した（幾何平均、+/-95%信頼区間）。
Figure 2023501246000047
実施例３．ラットにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤のインビボ気管内投与
試験１日目、雄のスプラーグ・ドーリーラットに、気管内(IT)投与に適したマイクロ噴霧装置（Penn Century、ペンシルベニア州フィラデルフィア）で200マイクロリットルの等張生理食塩水、または0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、もしくは2 mg/kgの、センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ－SM6.1、図３を参照のこと）と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD06284を投与した。各群5匹のラットに投与した。試験8日目にラットを屠殺し、採取し均質化した後の両肺から全RNAを単離した。プローブを用いる定量PCRでラットベータENaC (SCNN1B) mRNA発現を定量し、ラットGAPDH発現に対して正規化し、溶媒対照群に対する割合で表した（幾何平均、+/-95%信頼区間）。
Figure 2023501246000048
実施例４．ラットにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤のインビボ気管内投与
試験１日目、雄のスプラーグ・ドーリーラットに、気管内(IT)投与に適したマイクロ噴霧装置（Penn Century、ペンシルベニア州フィラデルフィア）で200マイクロリットルの等張生理食塩水（溶媒、対照群として使用）、または表9に示す以下の投与群に従って以下のベータENaC RNAi剤のうちの１つを投与した。
Figure 2023501246000049
各群5匹のラットに投与した(n=5)。試験8日目にラットを屠殺し、採取し均質化した後の両肺から全RNAを単離した。プローブを用いる定量PCRでラットベータENaC (SCNN1B) mRNA発現を定量し、ラットGAPDH発現に対して正規化し、溶媒対照群に対する割合で表した（幾何平均、+/-95%信頼区間）。
Figure 2023501246000050
実施例５．ラットにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤のインビボ気管内投与
試験１日目、雄のスプラーグ・ドーリーラットに、気管内(IT)投与に適したマイクロ噴霧装置（Penn Century、ペンシルベニア州フィラデルフィア）で200マイクロリットルの等張生理食塩水（溶媒、対照群として使用）、または表11に示す以下の投与群に従って以下のベータENaC RNAi剤のうちの１つを投与した。
Figure 2023501246000051
各群5匹のラットに投与した(n=5)。上の表11のスケジュールに従い、試験8日目、15日目、または22日目にラットを屠殺し、採取し均質化した後の両肺から全RNAを単離した。プローブを用いる定量PCRでラットベータENaC (SCNN1B) mRNA発現を定量し、GAPDH発現に対して正規化し、溶媒対照群に対する割合で表した（幾何平均、+/-95%信頼区間）。
Figure 2023501246000052
実施例６．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
粘液線毛クリアランス(MCC)は嚢胞性線維症(CF)患者において肺機能(FEV1)の改善と相関することがわかっている。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、試験1日目、2日目、3日目の連続3日間にわたり、正常なヒツジに蓄積用量0.22 mg/kgまたは0.5 mg/kgの、センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD06598（図9および20ではAPERC-2と呼ばれる）のエアロゾルを一日に１回、吸入させた（すなわち、合計で3回の投与）。10 mg/mLの濃度で17.5 mL (0.5 mg/kg)または8.75 mL (0.22 mg/kg)の投与容量のベータENaC RNAi剤AD06598をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。各群3頭のヒツジを試験した(n = 3)。17日目（最終投与の2週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
図9に示すように、ベータENaC RNAi剤の投与は投与の2週間後、用量依存的に、基準測定値を超えるMCCの増加を示した。確認されたMCCの加速は気道の水分補給の改善と一致する。
実施例７．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
ヒツジの粘液線毛クリアランス(MCC)モデルでベータENaC RNAi剤を評価した。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、正常なヒツジに蓄積用量0.5 mg/kgの1)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD06598（APERC-2と呼ぶ）のエアロゾル、または2)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07099（APERC-5と呼ぶ）のエアロゾルを１回、吸入させた。10 mg/mLの濃度で17.5 mLの投与容量の各ベータENaC RNAi剤をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。1頭のヒツジをAPERC-2で試験し(n = 1)、3頭のヒツジをAPERC-5群で試験した(n = 3)。14日目（単回投与の2週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
たとえば、完全に結合しアニールした場合、APERC-2は以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖構造を有する。
修飾センス鎖(5’→3’)：
(TriSM6.1-avb6-TA14)gscaacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) (配列番号246)
修飾アンチセンス鎖(5’→3’)：
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)
（(TriSM6.1-avb6-TA14)の構造については、図２２を参照のこと）
センス鎖の基礎塩基配列(5’→ 3’)：
GCAACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号223)
アンチセンス鎖の基礎塩基配列(5’→3’)：
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)
さらに、たとえば、完全に結合しアニールした場合、APERC-5は以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖構造を有する。
修飾センス鎖(5’→3’)：
(TriSM6.1-avb6-TA14)gscaacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb) (配列番号187)
修飾アンチセンス鎖(5’→3’)：
cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)
(TriSM6.1-avb6-TA14) の構造については、図２２を参照のこと。APERC-5の完全な化学構造については、図27A～27D（遊離酸）および28A～28D（ナトリウム塩）を参照のこと。
センス鎖の基礎塩基配列(5’→3’)
GCAACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号227)
アンチセンス鎖の基礎塩基配列(5’→3’)
UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
図20に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD06598 (APERC-2)の投与は投与の2週間後、基準測定値を超えるMCCの増加を示した。たとえば、0.5 mg/kg のAPERC-2の単回投与の結果、14日目には2時間（120分）後の時点で基準に対して76%増加した（図20を参照のこと）。
また、図11に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07099 (APERC-5)の投与も、投与の2週間後、基準測定値を超えるMCCの増加を示した。たとえば、0.5 mg/kg のAPERC-5の単回投与の結果、14日目には2時間後のスキャン時点で基準に対して124%増加した（図１１を参照のこと）。
実施例８．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
ヒツジの粘液線毛クリアランス(MCC)モデルでベータENaC RNAi剤を評価した。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、正常なヒツジに蓄積用量0.5 mg/kgの1)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07217（APERC-7と呼ぶ）のエアロゾル、または2)システイン－マレイミドリンカーをさらに含む、センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07217（APERC-8と呼ぶ）のエアロゾル（システイン－マレイミドリンカーを含むαvβ6上皮細胞標的リガンドトリ-SM6.1の化学構造については、図23を参照のこと）、または3)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD06599（APERC-9と呼ぶ）のエアロゾルを１回、吸入させた。10 mg/mLの濃度で17.5 mLの投与容量の各ベータENaC RNAi剤をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。3頭のヒツジに投与した(n = 3)APERC-7を除き、各群1頭のヒツジを試験した(n = 1)。14日目（単回投与の2週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
たとえば、完全に結合しアニールした場合、APERC-7は以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖構造を有する。
修飾センス鎖(5’→3’)：
(TriSM6.1-avb6-TA14)gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) (配列番号188)
修飾アンチセンス鎖(5’→3’)：
asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)
(TriSM6.1-avb6-TA14) の構造については、図２２を参照のこと。APERC-7の完全な化学構造については、図25A～25D（遊離酸）および26A～26D（ナトリウム塩）を参照のこと。
センス鎖の基礎塩基配列(5’→3’)
GC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号229)
アンチセンス鎖の基礎塩基配列(5’→3’)
AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)
センス鎖(上の表5Aおよび5BのAD07482)の5'末端の官能化TriAlk14基を用いてAPERC-7の結合構築物を合成することができる。あるいは、センス鎖(AD07217)の5'末端のNH2-C6基を化合物22に結合して（上の実施例１のEパート）構造が同一の中間体を生成することができる。いずれの方法を用いても同じ最終構築物を得ることができる。
図10に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07217 (APERC-7)の投与は投与の2週間後、基準測定値を超えるMCCの増加を示し、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して78%の増加を示した。
同様に、図19に示すように、システイン－マレイミドリンカーを含む三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07217 (APERC-8)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して110%の増加を示した。
図18に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD06599 (APERC-9)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して58%の増加を示した。
実施例９．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
ヒツジの粘液線毛クリアランス(MCC)モデルでベータENaC RNAi剤を評価した。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、正常なヒツジに蓄積用量0.5 mg/kgの1)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07240（APERC-10と呼ぶ）のエアロゾル、または2)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07250（APERC-11と呼ぶ）のエアロゾル、または3)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07251（APERC-12と呼ぶ）のエアロゾルを１回、吸入させた。10 mg/mLの濃度で17.5 mLの投与容量の各ベータENaC RNAi剤をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。各群1頭のヒツジを試験した(n = 1)。14日目（単回投与の2週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
図17に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07240 (APERC-10)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して82%の増加を示した。図16に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07250 (APERC-11)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して134%の増加を示した。図15に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07251 (APERC-12)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して102%の増加を示した。
実施例１０．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
ヒツジの粘液線毛クリアランス(MCC)モデルでベータENaC RNAi剤を評価した。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイド吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、正常なヒツジに蓄積用量0.5 mg/kgの1)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07252（APERC-13と呼ぶ）のエアロゾル、または2)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07253（APERC-14と呼ぶ）のエアロゾル、または3)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07255（APERC-16と呼ぶ）のエアロゾルを１回、吸入させた。10 mg/mLの濃度で17.5 mLの投与容量の各ベータENaC RNAi剤をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。各群1頭のヒツジを試験した(n = 1)。14日目（単回投与の2週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
図17に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07252 (APERC-13)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して62%の増加を示した。図16に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07253 (APERC-14)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して94%の増加を示した。図15に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07255 (APERC-16)の投与は、14日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して102%の増加を示した。
実施例１１．ヒツジにおける上皮細胞標的リガンド結合ベータENaC RNAi剤の噴霧投与
ヒツジの粘液線毛クリアランス(MCC)モデルでベータENaC RNAi剤を評価した。最初に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを吸入させた後に2時間にわたりガンマ線画像化してMCCを正常なヒツジで測定し、基準値を確立した。基準の確立から3日後に開始し、正常なヒツジに蓄積用量0.5 mg/kgの1)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07217（APERC-7と呼ぶ）のエアロゾル、または2)センス鎖5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)と結合し等張生理食塩水に配合したベータENaC RNAi剤AD07099（APERC-5と呼ぶ）のエアロゾルを１回、吸入させた。10 mg/mLの濃度で17.5 mLの投与容量の各ベータENaC RNAi剤をエアロゾル化し、経鼻挿管によりヒツジに投与した。各群2頭のヒツジを試験した(n = 2)。21日目（単回投与の3週間後）に、エアロゾル化したテクネチウム標識硫黄コロイドを再度ヒツジに吸入させた後、2時間にわたりガンマ線画像化した。
図10に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07217 (APERC-7)の投与は、21日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して17%の増加を示し続けた。また、図11に示すように、三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド(トリ-SM6.1)に結合したベータENaC RNAi剤AD07099 (APERC-5)の投与は、21日目、2時間後のスキャン時点で基準に対して56%の増加を示し続けた。
実施例１２．ベータENaC RNAi剤を遺伝子導入した培養初代正常ヒト気管支上皮細胞における相対的なヒトベータENaC (SCNN1B) mRNA発現
正常なヒトの肺の初代気管支上皮細胞を、96ウェル組織培養プレート（10,000細胞／ウェル）で培養した。RNAiMAX遺伝子導入試薬を用いて、以下、すなわち：センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）に結合したベータENaC RNAi剤AD06598（APERC-2と呼ぶ）、センス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）に結合したベータENaC RNAi剤AD07099（APERC-5と呼ぶ）、またはセンス鎖の5'末端で三座配位小分子αvβ6上皮細胞標的リガンド（トリ-SM6.1）に結合したベータENaC RNAi剤AD07217（APERC-7と呼ぶ）を細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の48時間後、全RNAを単離し、Cells-to-CT抽出で細胞からcDNAを生成し、プローブを用いる定量PCRでSCNN1B mRNA発現を定量し、ラットGAPDH発現に対して正規化し、リポフェクタミンのみ（遺伝子導入なし）の対照群に対する割合として表した（幾何平均、+/-95%信頼区間）。図24に示すように、開示のベータENaC RNAi剤の遺伝子導入により、培養した正常ヒト気管支上皮細胞ではSCNN1B mRNA発現の強力な用量依存的サイレンシングが得られた。
他の実施態様
本発明についてその詳細な説明と併せて説明したが、なお、以上の説明は本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義される。他の局面、利点、および変形例は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (61)

  1. ベータENaC遺伝子の発現を阻害するRNAi剤であって、
    表2または表3に示す配列のうちいずれか１つの配列と0または1個のヌクレオチドが異なる少なくとも17個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；および
    前記アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖
    を含むRNAi剤。
  2. 前記アンチセンス鎖は表2または表3に示す配列のうちいずれか１つの配列のヌクレオチド2～18を含む、請求項１に記載のRNAi剤。
  3. 前記センス鎖は、表2または表4に示す配列のうちいずれか１つの配列と0または1個のヌクレオチドが異なる少なくとも17個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は前記17個の連続するヌクレオチドにおいて前記アンチセンス鎖と少なくとも85%相補性である領域を有する、請求項１または２に記載のRNAi剤。
  4. 前記ベータENaC RNAi剤の少なくとも１つのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである、または修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  5. 前記ヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべてが修飾ヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  6. 前記修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-フルオロヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、2',3'-セコ-ヌクレオチド模倣体、架橋型ヌクレオチド、2'-F-アラビノヌクレオチド、2'-メトキシエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、リビトール、逆位ヌクレオチド、逆位2'-O-メチルヌクレオチド、逆位2'-デオキシヌクレオチド、2'-アミノ修飾ヌクレオチド、2'-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホナート含有ヌクレオチド、シクロプロピルホスホナート含有ヌクレオチド、および3'-O-メチルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４～５のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  7. 前記ヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべてが2'-O-メチルヌクレオチド、2'-フルオロヌクレオチド、またはそれらの組合せで修飾されている、請求項５に記載のRNAi剤。
  8. 前記アンチセンス鎖は表3に示す修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  9. 前記センス鎖は表4に示す修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  10. 前記アンチセンス鎖は表3に示す修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は表4に示す修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のRNAi剤。
  11. 前記センス鎖は18～30ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖は18～30ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  12. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖はそれぞれ18～27ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のRNAi剤。
  13. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖はそれぞれ18～24ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のRNAi剤。
  14. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖はそれぞれ21ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のRNAi剤。
  15. ２つの平滑末端を有する、請求項１４に記載のRNAi剤。
  16. 前記センス鎖は１つまたは２つの末端キャップを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  17. 前記センス鎖は１つまたは２つの逆位脱塩基残基を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  18. 前記RNAi剤は、表5Aおよび5Bの二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖で構成される、請求項１に記載のRNAi剤。
  19. 前記ヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべてが修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載のRNAi剤。
  20. 以下の配列、すなわち：
    AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (配列番号194)；
    AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号195)；
    UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (配列番号198)；
    UUGUUGUAGUCACUGUAGAAG (配列番号244)；
    UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (配列番号199)；
    UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (配列番号201)；または
    UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (配列番号203)
    のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含むアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載のRNAi剤。
  21. 前記センス鎖は、以下の配列、すなわち：
    CGUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号217)；
    CCUACAGUGACUACAACACIA (配列番号219)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；
    GGGAGAAAUACUGCAACAACA (配列番号222)；
    GCAACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号223)；
    UGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (配列番号224)（配列中、Iはイノシン（ヒポキサンチン）ヌクレオチドを表す）；
    GCAACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号227)；
    CUUCUACAGUGACUACAACAA (配列番号245)；
    GC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACU (配列番号229)（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）；または
    GC(A2N)ACUGUUACAUCUUCAACA (配列番号230)、（配列中、A2Nは2-アミノアデニン含有ヌクレオチドを表す）
    のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む、請求項２０に記載のRNAi剤。
  22. 前記ヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべてが修飾ヌクレオチドである、請求項２０または２１に記載のRNAi剤。
  23. 以下の配列、すなわち：
    asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (配列番号126)；
    asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号127)；
    usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (配列番号130)；
    usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (配列番号131)；
    usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (配列番号135)；
    cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号138)；
    cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号150)；
    cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号153)；または
    cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (配列番号154)；
    のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるアンチセンス鎖を含み、
    配列中、a、c、g、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し；sはホスホロチオアート結合を示し；
    前記センス鎖のヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべては修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のRNAi剤。
  24. 前記センス鎖は、以下の配列、すなわち：
    csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (配列番号234)；
    cscuacaguGfAfCfuacaacacia (配列番号235)；
    gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (配列番号236)；
    gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号237)；
    usggggagaUfCfAfucauciacuu (配列番号238)；
    gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号239)；
    gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (配列番号240)；または
    gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (配列番号241)
    のうちの１つのヌクレオチド配列（5'→3'）と0または1個のヌクレオチドが異なる修飾ヌクレオチド配列を含み、それからなり、またはそれから本質的になり、
    配列中、a、c、g、i、およびuは、それぞれ2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルイノシン、および2'-O-メチルウリジンを表し；Af、Cf、Gf、およびUfは、それぞれ2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロシチジン、2'-フルオログアノシン、および2'-フルオロウリジンを表し；cPrpaおよびcPrpuは、それぞれ5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルアデノシンおよび5'-シクロプロピルホスホナート-2'-O-メチルウリジンを表し；sはホスホロチオアート結合を示し；
    前記アンチセンス鎖のヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべては修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のRNAi剤。
  25. 前記センス鎖は、前記ヌクレオチド配列の3'末端、前記ヌクレオチド配列の5'末端、またはその両方に逆位脱塩基残基をさらに含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  26. 前記RNAi剤は標的リガンドに連結されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  27. 前記標的リガンドは上皮細胞で発現される細胞受容体に親和性を持つ、請求項２６に記載のRNAi剤。
  28. 前記標的リガンドはインテグリン標的リガンドを含む、請求項２７に記載のRNAi剤。
  29. 前記インテグリン標的リガンドはαvβ6インテグリン標的リガンドである、請求項２８に記載のRNAi剤。
  30. 前記標的リガンドは以下の構造：
    Figure 2023501246000053
     またはその医薬的に許容される塩を含み、
    Figure 2023501246000054
    はRNAi剤との結合点を示す、請求項２９に記載のRNAi剤。
  31. 前記標的リガンドは以下の構造：
    Figure 2023501246000055
    Figure 2023501246000056
    Figure 2023501246000057
    Figure 2023501246000058
    Figure 2023501246000059
    Figure 2023501246000060
    Figure 2023501246000061
    Figure 2023501246000062
    Figure 2023501246000063
     からなる群から選択される構造を有し、
    Figure 2023501246000064
     はRNAi剤との結合点を示す、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  32. 前記標的リガンドは前記センス鎖に結合している、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のRNAi剤。
  33. 前記標的リガンドは前記センス鎖の5'末端に結合している、請求項３２に記載のRNAi剤。
  34. 請求項１～３３のいずれか一項に記載のRNAi剤を含み、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物。
  35. アルファENaC (SCNN1A)、ベータENaC (SCNN1B)、またはガンマENaC (SCNN1G)の発現を阻害することができる第２のRNAi剤をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
  36. １種以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 吸入投与用に製剤化される、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 定量吸入器、ジェット式噴霧器、振動式メッシュ噴霧器、またはソフトミスト吸入器により送達される、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記RNAi剤はナトリウム塩である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記医薬的に許容される賦形剤は注射用の水である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記医薬的に許容される賦形剤は緩衝生理食塩溶液である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 細胞中のベータENaC遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１～３３のいずれか一項に記載の有効量のRNAi剤または請求項３４～４１のいずれか一項に記載の組成物を細胞に導入することを含む、方法。
  43. 前記細胞は対象内にある、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象はヒト対象である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記RNAi剤の投与後にベータENaC遺伝子発現が少なくとも約30%阻害される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. ENaC活性レベルの増加または上昇に関連する１つ以上の症状または疾患を処置する方法であって、その処置を必要なヒト対象に治療有効量の請求項３４～４１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  47. 前記疾患は呼吸器疾患である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記呼吸器疾患は、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全、または肺がん嚢胞性線維症である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記疾患は慢性閉塞性肺疾患(COPD)である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記疾患は眼疾患である、請求項４６に記載の方法。
  51. 前記眼疾患はドライアイ症候群である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記RNAi剤は前記対象の体重に対し約0.01 mg/kg～約5.0 mg/kgの蓄積用量で投与される、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記RNAi剤は前記対象の体重に対し約0.03 mg/kg～約2.0 mg/kgの蓄積用量で投与される、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記RNAi剤は２つ以上の用量で投与される、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 少なくとも部分的にENaC活性および／またはベータENaC遺伝子発現により媒介される疾患、障害、または症状の処置のための、請求項１～３３のいずれか一項に記載のRNAi剤の使用。
  56. 少なくとも部分的にENaC活性および／またはベータENaC遺伝子発現により媒介される疾患、障害、または症状の処置のための、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  57. 少なくとも部分的にENaC活性および／またはベータENaC遺伝子発現により媒介される疾患、障害、または症状を処置する医薬の製造のための、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  58. 前記疾患は慢性閉塞性肺疾患(COPD)である、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の使用。
  59. センス鎖とアンチセンス鎖とをアニールして二本鎖のリボ核酸分子を形成することを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のRNAi剤の作製方法。
  60. 前記センス鎖は標的リガンドを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記センス鎖に標的リガンドを結合させることを含む、請求項６０に記載の方法。
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