TW202130809A - 用於抑制β-ENaC表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法 - Google Patents

用於抑制β-ENaC表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明描述用於抑制β-ENaC (SCNN1B)基因之RNAi藥劑、包括RNAi藥劑之組合物，及方法。本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑及RNAi藥劑結合物抑制β-ENaC基因之表現。亦描述包括一或多種β-ENaC RNAi藥劑，視情況與一或多種另外治療劑之醫藥組合物。將該等描述之β-ENaC RNAi藥劑活體內遞送至上皮細胞(諸如肺上皮細胞)提供β-ENaC基因表現之抑制及ENaC活性之降低，其可提供治療益處於個體，包括人類個體。

Description

用於抑制β-ENaC表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法
本發明係關於用於抑制β-ENaC基因表現之RNA干擾(RNAi)藥劑(例如，雙股RNAi藥劑)、包括β-ENaC RNAi藥劑之組合物及其使用方法。
脊椎動物胺氯吡脒敏感性上皮鈉通道(「ENaC」或「胺氯吡脒敏感性鈉通道」)為退化蛋白/ENaC通道超家族中之成員，其特徵為兩個跨膜結構域(細胞內N端及C端)及為弗林(furin)蛋白酶之受質的較大細胞外環。通道為由三個同源次單元(α (alpha)、β (beta)及γ (gamma))構成之異三聚體複合物，該等次單元由三種不同基因SCNN1A (α)、SCNN1B (β)及SCNN1G (γ)編碼。所有三種次單元對於完整通道活性而言係必需的。由SCNN1D編碼之第四次單元(δ (delta))表現於睪丸及卵巢中，且可能夠在功能上取代彼等組織中之α (alpha)次單元。
ENaC表現於上皮細胞之頂端膜上，特定言之表現於肺、腎遠曲小管、腸胃(GI)道、生殖道及眼睛中之眼表上皮中。在此等上皮中，ENaC通道介導細胞外鈉離子之流入，該等鈉離子接著藉由基側鈉/鉀ATP酶而主動地自細胞運輸，從而建立滲透梯度且使得上皮細胞腔中的水吸收至間質中。在腎臟中，ENaC介導電解質平衡及血壓，且為諸如胺氯吡脒之全身性小分子利尿劑的目標。在肺中，氣道上皮ENaC在調節肺水合作用及黏液纖毛清除中起重要作用。
攜帶SCNN1A、SCNN1B或SCNN1G功能缺失型突變之1型假性醛固酮過少症(PHA)患者產生過量的氣道表面液體且具有顯著較高之黏液纖毛清除率。相反，在所有基因型之囊性纖維化(CF)患者中，氣道上皮ENaC活性顯著升高。增強的ENaC活性以及降低的囊性纖維化跨膜傳導調節因子(CFTR)氯通道活性為CF肺病患者之氣道脫水及黏液纖毛鬱積潛在的主要致病機制。
吸入性小分子ENaC抑制劑在CF之治療中已展示出初步之前景，但其臨床研發已由於在肺中之較短作用持續時間及與抑制腎ENaC相關之靶上毒性(高鉀血症)而受限。(參見例如，O'Riordan等人, 27 J. Aerosol Med. & Pulmonary Drug Dev., 200-208 (2014))。
先前已鑑定出能夠抑制β-ENaC基因(亦即，SCNN1B)表現之某些RNAi藥劑，諸如揭示於例如美國專利第8,344,127號中之彼等藥劑。然而，具有某些修飾之其他構築體可具有可用於更有效的治療中之優良治療特性。對於用於治療β-ENaC相關之疾病及病症具有更大效能之其他β-ENaC RNAi藥劑存在需求。
對於能夠選擇性地且有效地抑制β-ENaC (亦即，SCNN1B)基因表現之新穎RNA干擾(RNAi)藥劑(稱為RNAi藥劑，RNAi觸發劑或觸發劑)，例如雙股RNAi藥劑持續存在需求。此外，對於用於治療與ENaC活性增強相關之疾病或病症及/或可至少部分地藉由ENaC活性降低介導之疾病或病症的新穎β-ENaC特異性RNAi藥劑之組合物存在需求。
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑之核苷酸序列及化學修飾，以及其與適用於選擇性地且有效地活體內遞送β-ENaC RNAi藥劑之某些特異性靶向配位體的組合不同於先前所揭示或此項技術中已知之彼等者。本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑提供對β-ENaC基因表現之高效及有效抑制。
一般而言，本發明提供β-ENaC基因特異性RNAi藥劑、包括β-ENaC RNAi藥劑之組合物及使用本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑及包括β-ENaC RNAi藥劑之組合物在活體外及/或活體內抑制β-ENaC基因表現之方法。本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑能夠選擇性地且有效地降低β-ENaC基因之表現，且藉此降低個體中之ENaC含量、降低個體中之ENaC活性，或降低個體中之ENaC含量及ENaC活性兩者，該個體例如人類或動物個體。
所描述之β-ENaC RNAi藥劑可用於與ENaC活性水準增強或升高相關的症狀及疾病之治療性治療(包括預防性或防治性治療)之方法中，該等症狀及疾病包括(但不限於)各種呼吸道疾病，諸如囊性纖維化、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、原發性纖毛運動障礙及肺癌囊性纖維化。舉例而言，在患有囊性纖維化(CF)之個體中，已知提高的ENaC活性促使氣道中之黏液變乾及肺清除毒素及感染劑之能力降低。此外，亦已知遺傳功能不良之ENaC基因的CF個體已展示較輕度之肺病，進而提供抑制ENaC活性可有益之另外證據。
所描述之β-ENaC RNAi藥劑亦可用於例如與眼表上皮(諸如結膜上皮)中之ENaC活性水準增強或升高相關的症狀及疾病之治療性治療(包括防治性或預防性治療)，包括用於諸如乾眼症候群之眼部疾病及病症之治療。
在一個態樣中，本發明提供用於抑制β-ENaC (SCNN1B)基因表現之RNAi藥劑，其中RNAi藥劑包括有義股(亦稱為隨從股)及反義股(亦稱為引導股)。有義股及反義股可彼此部分、實質上或完全互補。本文所描述之RNAi藥劑有義股及反義股之長度各自可為16至49個核苷酸長。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為17至26個核苷酸。有義股及反義股可為相同長度或不同長度。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為21至26個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為21至24個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度皆為21個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度獨立地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度獨立地為16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。本文所描述之RNAi藥劑在遞送至表現β-ENaC之細胞(諸如肺上皮細胞)時活體內及/或活體外抑制一或多種β-ENaC基因之表現。
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑靶向人類β-ENaC基因(參見例如SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑靶向具有表1中所揭示序列中之任一者之序列的β-ENaC基因之一部分。
在另一態樣中，本發明提供包括醫藥組合物之組合物，該組合物包括能夠選擇性地且有效地降低β-ENaC基因表現之所揭示的β-ENaC RNAi藥劑中之一或多者。可向個體(諸如人類或動物個體)投與包括本文所描述之一或多種β-ENaC RNAi藥劑之組合物，以用於治療(包括防治性治療或抑制)與ENaC活性增強或升高(本文中亦稱為ENaC通道活性水準增強或ENaC通道活性水準升高)相關的症狀及疾病。
可用於β-ENaC RNAi藥劑中之β-ENaC RNAi藥劑有義股及反義股之實例提供於表3及表4中。β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體之實例提供於表5A及表5B中。可由本文所揭示之某些β-ENaC RNAi藥劑之有義股及反義股組成或可包括於其中的19個核苷酸核心延伸序列之實例提供於表2中。
在另一態樣中，本發明提供用於將β-ENaC RNAi藥劑活體內遞送至諸如哺乳動物之個體中之上皮細胞的方法。本文亦描述用於此類方法中之組合物。在一些實施例中，本文揭示用於將β-ENaC RNAi藥劑活體內遞送至個體之肺上皮細胞的方法。在一些實施例中，個體為人類個體。
本文所揭示之方法包括藉由此項技術中已知之任何適合的方式向個體(例如，人類或動物個體)投與一或多種β-ENaC RNAi藥劑。包括一或多種β-ENaC RNAi藥劑之本文所揭示之醫藥組合物可根據是否需要局部或全身治療而以多種方式投與。投藥可為(但不限於)例如靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、真皮下(例如經由植入裝置)及腦實質內投藥。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物係藉由吸入(諸如乾粉吸入或氣霧劑吸入)、鼻內投藥、氣管內投藥或口咽吸氣投藥來投與。
在一些實施例中，期望本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑抑制肺上皮中之β-ENaC基因表現，其中藉由吸入(例如，藉由吸入器裝置(諸如定量給藥吸入器)或噴霧器(諸如噴射式或振動式網孔噴霧器)或軟霧吸入器)進行投藥。
可使用此項技術中已知之任何寡核苷酸遞送技術將一或多種β-ENaC RNAi藥劑遞送至目標細胞或組織。在一些實施例中，藉由將RNAi藥劑共價連接至靶向基團來將β-ENaC RNAi藥劑遞送至細胞或組織。在一些實施例中，靶向基團可包括細胞受體配位體，諸如整合素靶向配位體。整合素為有助於細胞-細胞外基質(ECM)黏附之跨膜受體家族。特定言之，整合素β-v-β-6 (αvβ6)為一種上皮特異性整合素，已知其為ECM蛋白質及TGF-β潛伏相關肽(LAP)之受體，且表現於各種細胞及組織中。已知整合素αvβ6在受損肺上皮中顯著上調。在一些實施例中，本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑連接至對整合素αvβ6具有親和力之整合素靶向配位體。如本文中所提及，「αvβ6整合素靶向配位體」為對整合素αvβ6具有親和力之化合物，其可用作配位體以促進將其所連接之RNAi藥劑靶向且遞送至所需細胞及/或組織(亦即，至表現整合素αvβ6之細胞)。在一些實施例中，多種αvβ6整合素靶向配位體或αvβ6整合素靶向配位體叢集連接至β-ENaC RNAi藥劑。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑-αvβ6整合素靶向配位體結合物係經由受體介導之內飲作用或藉由其他方式選擇性地由肺上皮細胞內化。
適用於遞送包括αvβ6整合素靶向配位體之β-ENaC RNAi藥劑的靶向基團之實例揭示於例如國際專利申請公開案第WO 2018/085415號及國際專利申請公開案第WO 2019/089765號中，其中之每一者的內容以全文引用之方式併入本文中。
靶向基團可連接至β-ENaC RNAi藥劑之有義股或反義股的3'或5'端。在一些實施例中，靶向基團連接至有義股之3'或5'端。在一些實施例中，靶向基團連接至有義股之5'端。在一些實施例中，靶向基團內部連接至RNAi藥劑之有義股及/或反義股上之核苷酸。在一些實施例中，靶向基團經由連接子連接至RNAi藥劑。
在另一態樣中，本發明提供包括具有表5A及表5B中所揭示之雙螺旋結構的一或多種β-ENaC RNAi藥劑之組合物。
β-ENaC RNAi藥劑之用途提供用於治療性(包括防治性)治療疾病或病症之方法，其中ENaC活性之降低可提供治療益處。本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑可用於治療各種呼吸道疾病，包括囊性纖維化、慢性支氣管炎、非囊性纖維化支氣管擴張、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、原發性纖毛運動障礙及肺癌囊性纖維化。β-ENaC RNAi藥劑可進一步用於治療例如各種眼部疾病及病症，諸如乾眼症。此類治療方法包括向ENaC活性水準升高或增強之人類或動物投與β-ENaC RNAi藥劑。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)；及 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差不超過1個核苷酸之核苷酸序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)；及 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)； 其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)；及 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)； 其中上文各別序列位於反義股之位置1-21 (5' à 3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差不超過1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)； usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及 cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；及 cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義股與反義股至少實質上互補。如一般熟習此項技術者將清楚地理解，包括如本文所揭示之經修飾核苷酸序列中所展示之硫代磷酸酯鍵替代通常存在於寡核苷酸中的磷酸二酯鍵(參見例如展示所有核苷間鍵聯之圖21A至圖21L)。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括： (i)        由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5′ à 3′) csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (SEQ ID NO:234)； (ii)      由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cscuacaguGfAfCfuacaacacia (SEQ ID NO:235)； (iii)    由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5′ à 3′) gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (SEQ ID NO:236)； (iv)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； (v)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usggggagaUfCfAfucauciacuu (SEQ ID NO:238)； (vi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； (vii)   由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； (viii)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； (ix)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； (x)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)；或 (xi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:241)； 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括： (i)        由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (SEQ ID NO:234)； (ii)      由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cscuacaguGfAfCfuacaacacia (SEQ ID NO:235)； (iii)    由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (SEQ ID NO:236)； (iv)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； (v)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') usggggagaUfCfAfucauciacuu (SEQ ID NO:238)； (vi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； (vii)   由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； (viii)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； (ix)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； (x)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)；或 (xi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾核苷酸序列(5' à 3') gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:241)； 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中各別有義股在核苷酸序列之3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO: 198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO: 199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO: 201)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 203)； 其中β-ENaC RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；且其中反義股及有義股兩者上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO: 198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO: 199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO: 201)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 203)； 其中β-ENaC RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；其中反義股及有義股兩者上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO: 198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO: 199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO: 201)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 203)； 其中β-ENaC RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；其中反義股及有義股兩者上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體；且其中各別反義股序列位於反義股之位置1-21處。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股及有義股，其中反義股及有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5' à 3')對中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)及CGUCUACAGUGACUACAACAA (SEQ ID NO:217)；或 UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)及CCUACAGUGACUACAACACIA (SEQ ID NO:219)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)及GGGAGAAAUACUGCAACAACA (SEQ ID NO:222)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)及GCAACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:223)；或 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)及UGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (SEQ ID NO:224)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)及GCAACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:227)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)及GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:229)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)及GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:230)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸； 其中反義股及有義股兩者上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股及有義股，其中反義股及有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5' à 3')對中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)及CGUCUACAGUGACUACAACAA (SEQ ID NO:217)；或 UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)及CCUACAGUGACUACAACACIA (SEQ ID NO:219)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)及GGGAGAAAUACUGCAACAACA (SEQ ID NO:222)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)及GCAACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:223)；或 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)及UGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (SEQ ID NO:224)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)及GCAACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:227)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)及GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:229)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)及GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:230)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸； 其中反義股及有義股兩者上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸；且其中有義股在3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)； usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及 cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；及 cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中β-ENaC RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；且其中有義股上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)； usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及 cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；及 cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中β-ENaC RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；且其中有義股上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股及有義股：與以下核苷酸序列對(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)及 csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (SEQ ID NO:234)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)及 cscuacaguGfAfCfuacaacacia (SEQ ID NO:235)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)及 gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (SEQ ID NO:236)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)；或 asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)及 usggggagaUfCfAfucauciacuu (SEQ ID NO:238)； cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:241)； 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股及有義股：以下核苷酸序列對(5' à 3')中之一者： usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)及 csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (SEQ ID NO:234)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)及 cscuacaguGfAfCfuacaacacia (SEQ ID NO:235)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)及 gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (SEQ ID NO:236)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)；或 asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)及 usggggagaUfCfAfucauciacuu (SEQ ID NO:238)； cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)及 gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)及 gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:241)； 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中有義股在核苷酸序列之3'端末端處進一步包括倒置無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'端末端之靶向配位體，其中靶向配位體包含αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股，該反義股包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (SEQ ID NO:60)； AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 15)； UUGUUGUAGUCACUGUAGA (SEQ ID NO: 27)； UCGUGUUGUAGUCACUGUA (SEQ ID NO: 30)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (SEQ ID NO: 53)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 16)。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股，該反義股包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (SEQ ID NO:60)； AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 15)； UUGUUGUAGUCACUGUAGA (SEQ ID NO: 27)； UCGUGUUGUAGUCACUGUA (SEQ ID NO: 30)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (SEQ ID NO: 53)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 16)； 其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股，該反義股包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (SEQ ID NO:60)； AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 15)； UUGUUGUAGUCACUGUAGA (SEQ ID NO: 27)； UCGUGUUGUAGUCACUGUA (SEQ ID NO: 30)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (SEQ ID NO: 53)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO: 16)； 其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸，且其中各別序列位於反義股之核苷酸位置1-19 (5' à 3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股及有義股，其各自包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列對(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UUGUUGUAGUCACUGUAGA (SEQ ID NO:27)及UCUACAGUGACUACAACAA (SEQ ID NO:80)；或 UCGUGUUGUAGUCACUGUA (SEQ ID NO:30)及UACAGUGACUACAACACIA (SEQ ID NO:86)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (SEQ ID NO:53)及GAGAAAUACUGCAACAACA (SEQ ID NO:106)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:15)及AACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:68)；或 AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (SEQ ID NO:60)及GGGAGAUCAUCAUCIACUU (SEQ ID NO:115)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:16)及AACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:69)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:15)及(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:242)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:16)及(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:243)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑包括反義股及有義股，其各自包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列對(5' à 3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UUGUUGUAGUCACUGUAGA (SEQ ID NO:27)及UCUACAGUGACUACAACAA (SEQ ID NO:80)；或 UCGUGUUGUAGUCACUGUA (SEQ ID NO:30)及UACAGUGACUACAACACIA (SEQ ID NO:86)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGUUGCAGUAUUUCUC (SEQ ID NO:53)及GAGAAAUACUGCAACAACA (SEQ ID NO:106)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:15)及AACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:68)；或 AAGUCGAUGAUGAUCUCCC (SEQ ID NO:60)及GGGAGAUCAUCAUCIACUU (SEQ ID NO:115)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:16)及AACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:69)；或 AGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:15)及(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:242)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUU (SEQ ID NO:16)及(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:243)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；及 其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
如本文所使用，術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」意謂所連接之核苷的聚合物，其中之每一者可獨立地經修飾或未經修飾。
如本文所使用，「RNAi藥劑」(亦稱為「RNAi觸發劑」)意謂含有RNA或類RNA (例如，經化學修飾之RNA)寡核苷酸分子之組合物，該寡核苷酸分子能夠以序列特異性方式降低或抑制(例如，在適當條件下降低或抑制)目標mRNA之信使RNA (mRNA)轉錄物的轉譯。如本文所使用，RNAi藥劑可經由RNA干擾機制(亦即，經由與哺乳動物細胞之RNA干擾路徑機制(RNA誘導沈默複合物或RISC)之相互作用誘導RNA干擾)或藉由任何替代性機制或路徑來起作用。儘管咸信RNAi藥劑(如彼術語在本文中所使用)主要經由RNA干擾機制起作用，但所揭示之RNAi藥劑不藉由任何特定路徑或作用機制結合或受限於任何特定路徑或作用機制。本文所揭示之RNAi藥劑包含有義股及反義股，且包括(但不限於)：短(或小)干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及內切酶受質(dicer substrate)。本文所描述之RNAi藥劑之反義股與所靶向之mRNA (亦即，β-ENaC mRNA)至少部分互補。RNAi藥劑可包括一或多種經修飾核苷酸及/或一或多種非磷酸二酯鍵。
如本文所使用，當參考給定基因之表現時，術語「沈默」、「降低」、「抑制」、「下調」或「阻斷基因表現」意謂當用本文所描述之RNAi藥劑治療細胞、細胞群、組織、器官或個體時，與未經歷該治療之第二細胞、細胞群、組織、器官或個體相比，基因之表現降低，如藉由其中基因經轉錄之細胞、細胞群、組織、器官或個體中自基因轉錄之RNA含量或自mRNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質次單元之含量所量測。
如本文所使用，術語「序列」及「核苷酸序列」意謂使用標準命名法用一連串字母描述之核鹼基或核苷酸的連續或次序。
如本文所使用，「鹼基」、「核苷酸鹼基」或「核鹼基」係作為核苷酸之組分的雜環嘧啶或嘌呤化合物，且包括主要嘌呤鹼基腺嘌呤及鳥嘌呤以及主要嘧啶鹼基胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。核鹼基可進一步經修飾以包括(但不限於)通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴展鹼基及氟化鹼基。(參見例如，Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P.編 Wiley-VCH, 2008)。此類經修飾核鹼基(包括包含經修飾核鹼基之胺基磷酸酯化合物)之合成係此項技術中已知的。
如本文所使用且除非另外指示，否則術語「互補」在用於相對於第二核鹼基或核苷酸序列(例如，RNAi藥劑反義股或單股反義寡核苷酸)描述第一核鹼基或核苷酸序列(例如，RNAi藥劑有義股或靶向mRNA)時，意謂包括第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在某些標準條件下與包括第二核苷酸序列之寡核苷酸雜交(在哺乳動物生理條件(或其他適合之活體內或活體外條件)下形成鹼基對氫鍵)及形成雙螺旋體或雙螺旋結構之能力。一般熟習此項技術者將能夠選擇最適合於雜交測試之條件組。至少在滿足以上雜交要求之範圍內，互補序列包括沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pairs)或非沃森-克里克鹼基對且包括天然或經修飾核苷酸或核苷酸模擬物。序列一致性或互補性與修飾無關。舉例而言，出於判定一致性或互補性之目的，如本文所定義之a及Af與U (或T)互補且與A一致。
如本文所使用，「完美互補」或「完全互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的所有(100%)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，「部分互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少70% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，「實質上互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少85% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，術語「互補」、「完全互補」、「部分互補」及「實質上互補」係關於RNAi藥劑之有義股與反義股之間或RNAi藥劑之反義股與β-ENaC mRNA之序列之間的核鹼基或核苷酸匹配而使用。
如本文所使用，適用於核酸序列之術語「實質上一致」或「實質一致性」意謂核苷酸序列(或核苷酸序列之一部分)相較於參考序列具有至少約85%序列一致性或更高，例如至少90%、至少95%或至少99%一致性。序列一致性之百分比係藉由在比較窗口內比較兩個最佳比對序列來測定。藉由如下步驟計算百分比：測定兩個序列中存在之相同類型的核酸鹼基的位置數以得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100以得到序列一致性之百分比。本文所揭示之發明涵蓋與本文所揭示之彼等者實質上一致的核苷酸序列。
如本文所使用，術語「治療(treat/treatment)」及類似者意謂用於提供個體中之疾病之一或多種症狀的數目、嚴重程度及/或頻率之減輕或緩解的方法或步驟。如本文所使用，「治療(treat/treatment)」可包括個體之疾病之一或多種症狀的數目、嚴重程度及/或頻率之預防、管理、防治性治療及/或抑制或減少。
如本文所使用，當提及RNAi藥劑時，片語「引入至細胞中」意謂將RNAi藥劑功能性遞送至細胞中。片語「功能性遞送」意謂以使RNAi藥劑能夠具有預期生物活性(例如，基因表現之序列特異性抑制)的方式將RNAi藥劑遞送至細胞中。
除非另外陳述，否則使用如本文所使用之符號
Figure 02_image001
意謂根據本文所描述之發明範疇任何一或多個基團可與其連接。
如本文所使用，術語「異構體」係指具有相同分子式，但在性質或其原子之結合序列或其原子在空間中之排列方面不同的化合物。在其原子於空間中之排列方面不同之異構體稱為「立體異構體」。彼此不為鏡像之立體異構體稱為「非對映異構體」且為不可重疊鏡像之立體異構體稱為「對映異構體」或有時稱為光學異構體。結合至四個不相同取代基之碳原子稱為「對掌性中心」。
如本文所使用，除非在結構中特定鑑別為具有特定構形，否則對於其中存在不對稱中心且因此產生對映異構體、非對映異構體或其他立體異構構型之各結構，本文所揭示之各結構意欲表示所有此類可能的異構體，包括其光學純及外消旋形式。舉例而言，本文所揭示之結構意欲涵蓋非對映異構體之混合物以及單一立體異構體。
如在本文申請專利範圍中所使用，片語「由…組成」不包括申請專利範圍中未指定之任何元件、步驟或成分。當用於本文之申請專利範圍中時，片語「基本上由…組成」將申請專利範圍之範疇限制於指定材料或步驟及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的彼等材料或步驟。
一般熟習此項技術者將容易理解及瞭解，本文所揭示之化合物及組合物可具有呈質子化或去質子化狀態之某些原子(例如，N、O或S原子)，其取決於化合物或組合物所置放的環境。因此，如本文所使用，本文所揭示之結構設想某些官能基，諸如(例如) OH、SH或NH可經質子化或去質子化。本文中之揭示內容意欲涵蓋所揭示之化合物及組合物而與其基於環境(諸如pH)之質子化狀態無關，如一般熟習此項技術者將容易地理解。對應地，具有不穩定質子或鹼性原子的本文所描述之化合物亦應理解為表示對應化合物之鹽形式。本文所描述之化合物可呈游離酸、游離鹼或鹽形式。本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽應理解為在本發明之範疇內。
如本文所使用，當參考兩種化合物或分子之間的連接時，術語「連接」或「結合」意謂兩種化合物或分子藉由共價鍵接合。除非加以陳述，否則如本文所使用之術語「連接」及「結合」可指第一化合物與第二化合物之間在存在或不存在任何插入原子或原子基團之情況下的連接。
如本文所使用，術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與該片語互換使用。除非上下文另外明確說明，否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與術語「及/或」互換使用。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者通常理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等的方法及材料可用於實踐或測試本發明，但適合之方法及材料描述如下。所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考案均以全文引用之方式併入。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為准。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
本發明之其他目標、特徵、態樣及優勢將自以下實施方式、附圖及申請專利範圍而變得顯而易見。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式提交且在此以全文引用之方式併入。ASCII複本名為30678-P2_SEQLIST.txt且大小為65 kb。RNAi 藥劑
本文描述用於抑制β-ENaC (亦即，SCNN1B)基因表現之RNAi藥劑(本文中稱為β-ENaC RNAi藥劑或β-ENaC RNAi觸發劑)。本文所揭示之各β-ENaC RNAi藥劑包含有義股及反義股。有義股及反義股之長度各自可為16至49個核苷酸。有義股及反義股可為相同長度或其可為不同長度。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自獨立地為18至27個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股兩者之長度各自為21-26個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自為21-24個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自獨立地為19-21個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約19個核苷酸，而反義股之長度為約21個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約21個核苷酸，而反義股之長度為約23個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為23個核苷酸且反義股之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股兩者之長度各自為21個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑有義股及反義股之長度各自獨立地為16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個核苷酸。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑具有約16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸之雙螺旋長度。
用於形成β-ENaC RNAi藥劑之核苷酸序列之實例提供於表2、表3及表4中。包括表2、表3及表4中之有義股及反義股序列的RNAi藥劑雙螺旋體之實例展示於表5A及表5B中。
在一些實施例中，有義股與反義股之間的完全、實質或部分互補性區域之長度為16-26 (例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)個核苷酸，且存在於反義股之5'端或附近(例如，此區域可與反義股之5'端間隔0、1、2、3或4個不完全、實質上或部分互補的核苷酸)。
本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑之有義股包括至少16個與β-ENaC mRNA中具有相同數目個核苷酸的核心延伸序列(在本文中亦稱為「核心延伸段」或「核心序列」)具有至少85%一致性之連續核苷酸。在一些實施例中，有義股核心延伸序列與反義股中之核心延伸序列100% (完全)互補或至少約85% (實質上)互補，且因此有義股核心延伸序列通常與β-ENaC mRNA目標中存在之相同長度的核苷酸序列(時常稱為例如目標序列)完全一致或至少約85%一致。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為17個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心延伸段之長度為19個核苷酸。
本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑之反義股包括至少16個與β-ENaC mRNA中具有相同數目個核苷酸的核心延伸段及對應有義股中具有相同數目個核苷酸之核心延伸段具有至少85%互補性之連續核苷酸。在一些實施例中，反義股核心延伸段與β-ENaC mRNA目標中存在之相同長度的核苷酸序列(例如，目標序列)100% (完全)互補或至少約85% (實質上)互補。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心延伸段之長度為17個核苷酸。有義股核心延伸序列可具有與對應反義核心序列相同的長度或其可為不同長度。
β-ENaC RNAi藥劑有義股及反義股黏接形成雙螺旋體。β-ENaC RNAi藥劑之有義股及反義股可彼此部分、實質上或完全互補。在互補雙螺旋區內，有義股核心延伸序列與反義核心延伸序列至少85%互補或100%互補。在一些實施例中，有義股核心延伸序列含有至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸之序列，該序列與反義股核心延伸序列之對應16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸序列至少85%或100%互補(亦即，β-ENaC RNAi藥劑之有義及反義核心延伸序列具有至少85%鹼基配對或100%鹼基配對的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸之區域)。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的反義股與表2或表3中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑之有義股與表2或表4中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，有義股及/或反義股在核心延伸序列之3'端、5'端或3'及5'端兩者處可視情況且獨立地含有另外1、2、3、4、5或6個核苷酸(延伸部分)。反義股另外核苷酸(若存在)可與或可不與β-ENaC mRNA中之對應序列互補。有義股另外核苷酸(若存在)可與或可不與β-ENaC mRNA中之對應序列一致。反義股另外核苷酸(若存在)可與或可不與對應有義股之另外核苷酸(若存在)互補。
如本文所使用，延伸部分在有義股核心延伸序列及/或反義股核心延伸序列之5'及/或3'端處包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。有義股上之延伸部分核苷酸可與或可不與對應反義股中之核苷酸(核心延伸序列核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。相反，反義股上之延伸部分核苷酸可與或可不與對應有義股中之核苷酸(核心延伸段核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股與反義股兩者含有3'及5'延伸部分。在一些實施例中，一條股之3'延伸部分核苷酸中之一或多者與另一條股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在其他實施例中，一條股之3'延伸部分核苷酸中之一或多者不與另一條股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑具有含有3'延伸部分之反義股及含有5'延伸部分之有義股。在一些實施例中，延伸部分核苷酸不配對且形成突出物(overhang)。如本文所使用，「突出物」係指位於有義股或反義股之末端處的一或多個不成對的核苷酸延伸段，其不形成本文所揭示之RNAi藥劑之雜交部分或雙螺旋部分的部分。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之3'延伸部分的反義股。在其他實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有長度為1、2或3個核苷酸之3'延伸部分的反義股。在一些實施例中，反義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含與對應β-ENaC mRNA序列互補之核苷酸。在一些實施例中，反義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含不與對應β-ENaC mRNA序列互補之核苷酸。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4或5個核苷酸之3'延伸部分的有義股。在一些實施例中，有義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸或與β-ENaC mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。在一些實施例中，3'有義股延伸部分包括以下序列中之一者或由其組成，但不限於：T、UT、TT、UU、UUT、TTT、或TTTT (各自5'至3'列出)。
有義股可具有3'延伸部分及/或5'延伸部分。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之5'延伸部分的有義股。在一些實施例中，有義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含與β-ENaC mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。
用於形成β-ENaC RNAi藥劑之序列之實例提供於表2、表3及表4中。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包括表2或表3中之序列中之任一者的序列。在某些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表3中之經修飾序列中之任一者或由其組成。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包括表2或表3中之序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21之序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包括表2或表4中之序列中之任一者的序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包括表2或表4中之序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-18、1-19、1-20、1-21、2-19、2-20、2-21、3-20、3-21或4-21之序列。在某些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包含表4中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列或由其組成。
在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有相同數目個核苷酸。在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有不同數目個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之末端皆非鈍端。如本文所使用，「鈍端」係指其中兩個所黏接股之末端核苷酸互補(形成互補鹼基對)的雙股RNAi藥劑之一端。
在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成綻開端(frayed end)。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成綻開端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成綻開端。在一些實施例中，RNAi藥劑之任一端皆非綻開端。如本文所使用，綻開端(frayed end)係指雙股RNAi藥劑之末端，其中兩個黏接股之末端核苷酸形成對(亦即不形成突出物)但並不互補(亦即形成非互補對)。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑之一股之末端的一或多個不成對核苷酸形成突出物。不成對核苷酸可位於有義股或反義股上，從而產生3'或5'突出物。在一些實施例中，RNAi藥劑含有：鈍端及綻開端、鈍端及5'突出端、鈍端及3'突出端、綻開端及5'突出端、綻開端及3'突出端、兩個5'突出端、兩個3'突出端、5'突出端及3'突出端、兩個綻開端，或兩個鈍端。通常，突出物(若存在)位於有義股、反義股或有義股及反義股兩者之3'端末端處。
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑亦可包含一或多個經修飾核苷酸。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑可進一步包含一或多個經修飾核苷間鍵聯，例如一或多個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑含有一或多個經修飾核苷酸及一或多個經修飾核苷間鍵聯。在一些實施例中，2'-經修飾核苷酸與經修飾核苷間鍵聯組合。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑以鈉鹽形式製備。此項技術中所熟知之此類形式在本文所揭示發明之範疇內。經修飾核苷酸
當用於各種寡核苷酸構築體中時，經修飾核苷酸可保存細胞中化合物之活性，同時增加此等化合物之血清穩定性，且亦可最小化在投與寡核苷酸構築體時人類中活化干擾素活性之可能性。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑含有一或多個經修飾核苷酸。如本文所使用，「經修飾核苷酸」為除核糖核苷酸(2'-羥基核苷酸)以外之核苷酸。在一些實施例中，至少50% (例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之核苷酸為經修飾核苷酸。如本文所使用，經修飾核苷酸可包括(但不限於)：去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸、2'-經修飾核苷酸、倒置核苷酸、包含經修飾核鹼基之核苷酸、橋接核苷酸、肽核酸(PNA)、2',3'-開環核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物)、鎖核苷酸、3'-O-甲氧基(2'核苷間鍵聯)核苷酸、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、5'-Me、2'-氟核苷酸、N-𠰌啉基核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸、含有膦酸乙烯酯之核苷酸及含有膦酸環丙酯之核苷酸。2'-經修飾核苷酸(亦即，在五員糖環之2'位置處具有除羥基以外之基團的核苷酸)包括(但不限於) 2'-O-甲基核苷酸(亦稱為2'-甲氧基核苷酸)、2'-氟核苷酸(在本文中亦稱為2'-去氧-2'-氟核苷酸)、2'-去氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(亦稱為2'-MOE)、2'-胺基核苷酸及2'-烷基核苷酸。給定化合物之所有位置無需經均一修飾。相反，超過一種修飾可併入單一β-ENaC RNAi藥劑或甚至其單一核苷酸中。β-ENaC RNAi藥劑有義股及反義股可藉由此項技術中已知之方法合成及/或修飾。一個核苷酸處之修飾獨立於另一核苷酸處之修飾。
經修飾核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-經取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及經N-2、N-6及O-6經取代嘌呤(例如，2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基(例如，6-甲基、6-乙基、6-異丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基(例如，2-甲基、2-乙基、2-異丙基或2-正丁基)及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫氫基、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-經取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(例如，5-溴)、5-三氟甲基及其他5-經取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，反義股之5'及/或3'端可包括無鹼基殘基(Ab)，其亦可稱為「無鹼基位點」或「無鹼基核苷酸」。無鹼基殘基(Ab)為在糖部分之1'位置處不具有核鹼基之核苷酸或核苷。(參見例如美國專利第5,998,203號)。在一些實施例中，無鹼基殘基可置放於核苷酸序列內部。在一些實施例中，Ab或AbAb可添加至反義股之3'端。在一些實施例中，有義股之5'端可包括一或多個另外無鹼基殘基(例如，(Ab)或(AbAb))。在一些實施例中，將UUAb、UAb或Ab添加至有義股之3'端。在一些實施例中，無鹼基(去氧核糖)殘基可經核糖醇(無鹼基核糖)殘基置換。
在一些實施例中，RNAi藥劑之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。如本文所使用，其中存在的實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸之RNAi藥劑係有義股及反義股兩者中之四個或更少(亦即，0、1、2、3或4)個核苷酸為核糖核苷酸(亦即，未經修飾)的RNAi藥劑。如本文所使用，其中存在的實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸之有義股係有義股中之兩個或更少(亦即，0、1或2)個核苷酸為未經修飾核糖核苷酸的有義股。如本文所使用，其中存在的實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸之反義股係反義股中之兩個或更少(亦即，0、1或2)個核苷酸為未經修飾核糖核苷酸的反義股。在一些實施例中，RNAi藥劑之一或多個核苷酸為未經修飾之核糖核苷酸。某些經修飾核苷酸之化學結構闡述於本文表6中。經修飾之核苷間鍵聯
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之一或多個核苷酸藉由非標準鍵或主鏈(亦即，經修飾之核苷間鍵聯或經修飾之主鏈)連接。經修飾之核苷間鍵聯或主鏈包括(但不限於)硫代磷酸酯基(本文中表示為小寫字母「s」)、對掌性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸烷基酯(例如，膦酸甲酯或3'-伸烷基膦酸酯)、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(例如，3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯或硫羰基胺基磷酸酯)、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、N-𠰌啉基鍵、具有正常3'-5'鍵之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物或具有倒置極性之硼烷磷酸酯，其中相鄰核苷單元對使3'-5'連接至5'-3'或使2'-5'連接至5'-2'。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵聯或主鏈不具有磷原子。不具有磷原子之經修飾核苷間鍵聯包括(但不限於)短鏈烷基或環烷基糖間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵聯或一或多個短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷間主鏈包括(但不限於)矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含有烯烴之主鏈、胺基磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈及其他具有混合N、O、S及CH2 組分之主鏈。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，β-ENaC RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，β-ENaC RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股含有至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵聯係在有義股之3'端之位置1-3處的核苷酸之間。在一些實施例中，一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯在有義股核苷酸序列之5'端處，且另一硫代磷酸酯鍵在有義股核苷酸序列之3'端處。在一些實施例中，兩個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於有義股之5'端處，且另一硫代磷酸酯鍵在有義股之3'端處。在一些實施例中，有義股不包括核苷酸之間的任何硫代磷酸酯核苷間鍵聯，但在5'及3'端兩者上之末端核苷酸之間含有一個、兩個或三個硫代磷酸酯鍵且視情況存在倒置無鹼基殘基端帽。在一些實施例中，靶向配位體經由硫代磷酸酯鍵連接至有義股。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係在反義股之5'端之位置1-3的核苷酸之間及在5'端之位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26的核苷酸之間。在一些實施例中，三個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於反義股之5'端之位置1-4之間，且第四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯位於反義股之5'端之位置20-21之間。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑在反義股中含有至少三個或四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。封端殘基或部分
在一些實施例中，有義股可包括一或多個封端殘基或部分，在此項技術中時常稱為「帽」、「端帽」或「封端殘基」。如本文所使用，「封端殘基」為非核苷酸化合物，或可在本文所揭示之RNAi藥劑之核苷酸序列的一或多個端併入之其他部分。在一些情況下，封端殘基可提供RNAi藥劑某些有益性質，諸如防止核酸外切酶降解。在一些實施例中，添加倒置無鹼基殘基(invAb) (在此項技術中亦稱為「倒置無鹼基位點」)作為封端殘基(參見表A)。(參見例如F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16)。封端殘基為此項技術中通常已知的，且包括例如倒置無鹼基殘基以及碳鏈，諸如末端C3 H7 (丙基)、C6 H13 (己基)或C12 H25 (十二烷基)基團。在一些實施例中，在有義股之5'端、3'端或5'及3'端兩端存在封端殘基。在一些實施例中，有義股之5'端及/或3'端可包括超過一個倒置無鹼基去氧核糖部分作為封端殘基。
在一些實施例中，將一或多個倒置無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之3'端。在一些實施例中，將一或多個倒置無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，將一或多個倒置無鹼基殘基或倒置無鹼基位點插入靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。在一些實施例中，在或接近RNAi藥劑之有義股之一或多個端包括一或多個倒置無鹼基殘基或倒置無鹼基位點可增強RNAi藥劑之活性或其他所需性質。
在一些實施例中，將一或多個倒置無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，可將一或多個倒置無鹼基殘基插入於靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。倒置無鹼基殘基可經由磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵(例如，本文中展示為(invAb)s))或其他核苷間鍵聯連接。在一些實施例中，在RNAi藥劑之有義股之一或多個端子末端或其附近包括一或多個倒置無鹼基殘基可允許增強RNAi藥劑之活性或其他所需特性。在一些實施例中，倒置無鹼基(去氧核糖)殘基可經倒置核糖醇(無鹼基核糖)殘基置換。在一些實施例中，反義股核心延伸序列之3'端或反義股序列之3'端可包括倒置無鹼基殘基。倒置無鹼基去氧核糖殘基之化學結構展示於下表6中。β -ENaC RNAi 藥劑
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑經設計以靶向β-ENaC基因上之特定位置(例如，SEQ ID NO:1 (GenBank NM_000336.2)、SEQ ID NO:2 (GenBank NM_000336.3))。如本文所定義，反義股序列經設計以當反義股之5'端核鹼基在與基因鹼基配對時與基因上給定位置下游(朝向3'端) 19個核苷酸的位置對準時，靶向基因上給定位置之β-ENaC基因。舉例而言，如本文中表1及表2中所說明，經設計以靶向位置987之β-ENaC基因的反義股序列需要在與基因鹼基配對時，反義股之5'端核鹼基與β-ENaC基因之位置1005對準。
如本文所提供，β-ENaC RNAi藥劑不需要反義股之位置1 (5' à 3')處的核鹼基與基因互補，其限制條件為在至少16個連續核苷酸之核心延伸序列內反義股與基因存在至少85%互補性(例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補性)。舉例而言，對於本文所揭示之設計成靶向β-ENaC基因之位置987的β-ENaC RNAi藥劑，β-ENaC RNAi藥劑之反義股之5'端核鹼基必須與該基因之位置1005對準；然而，反義股之5'端核鹼基可以但非必需與β-ENaC基因之位置1005互補，其限制條件為在至少16個連續核苷酸之核心延伸序列內反義股與基因存在至少85%互補性(例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100互補性)。此外，如本文所揭示之各種實例所展示，β-ENaC RNAi藥劑之反義股結合基因之特定位點(例如，β-ENaC RNAi藥劑經設計以靶向位置987、位置1296、位置1798抑或一些其他位置之β-ENaC基因)係藉由β-ENaC RNAi藥劑達成抑制程度的重要因素。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑靶向表1中所展示之β-ENaC序列之位置或其附近的β-ENaC基因。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑之反義股包括與表1中所揭示之目標β-ENaC 19-聚體序列完全、實質上或至少部分互補的核心延伸序列。表 1. β-ENaC 19-聚體mRNA目標序列(獲自智人(homo sapiens )鈉通道上皮1β次單元(SCNN1B)，GenBank NM_000336.2 (SEQ ID NO:1))[1]
SEQ ID No. β-ENaC 19- 聚體 目標序列 (5 ′ → 3′) SEQ ID NO: 1 上之序列之對應位置 靶向基因位置( 如本文中所提及)
3 ACCCCUGGUCCUUAUUGAU 620-638 620
4 CCCUGGUCCUUAUUGAUGA 622-640 622
5 AACUGUUACAUCUUCAACU 987-1005 987
6 UCUACAGUGACUACAACAC 1294-1312 1294
7 UACAGUGACUACAACACGA 1296-1314 1296
8 UUCCAAGACCACAUGAUCC 1347-1365 1347
9 UCCAAGACCACAUGAUCCG 1348-1366 1348
10 GUGGGGAGAAAUACUGCAA 1405-1423 1405
11 GGAGAAAUACUGCAACAAC 1409-1427 1409
12 GAGAAAUACUGCAACAACC 1410-1428 1410
13 AUCACCCUGAGCAGGAAGG 1629-1647 1629
14 GGGAGAUCAUCAUCGACUU 1798-1816 1798
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置19 (5′à3′)能夠與表1中所揭示之19-聚體目標序列之位置1形成鹼基對。在一些實施例中，β-ENaC藥劑包括反義股，其中反義股之位置1 (5′à3′)能夠與表1中所揭示之19-聚體目標序列之位置19形成鹼基對。
在一些實施例中，β-ENaC藥劑包括反義股，其中反義股之位置2 (5′ à 3′)能夠與表1中所揭示之19-聚體目標序列之位置18形成鹼基對。在一些實施例中，β-ENaC藥劑包括反義股，其中反義股之位置2至18 (5' à 3')能夠與位於表1中所揭示之19-聚體目標序列之位置18至2處的各別互補鹼基中之每一者形成鹼基對。
對於本文所揭示之RNAi藥劑，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸可與β-ENaC基因完全互補，或可與β-ENaC基因不互補。在一些實施例中，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸為U、A或dT。在一些實施例中，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19之序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi有義股包含表2或表4中之有義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17、1-18或2-18之序列。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含：(i)反義股，其包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19之序列；及(ii)有義股，其包含表2或表4中之有義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17或1-18之序列。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包括下表2中所展示之核心19-聚體核苷酸序列。表 2. β-ENaC RNAi藥劑反義股及有義股核心延伸段鹼基序列(N=任何核鹼基；I=肌苷核苷酸)。
SEQ ID NO:. 反義股鹼基序列 (5 ′ → 3′) ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:. 有義股鹼基序列 (5 ′ → 3′) ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO: 1 上之識別序列之對應位置 靶向基因位置
15 AGUUGAAGAUGUAACAGUU 68 AACUGUUACAUCUUCAACU 987-1005 987
16 UGUUGAAGAUGUAACAGUU 69 AACUGUUACAUCUUCAACA 987-1005 987
17 NGUUGAAGAUGUAACAGUU 70 AACUGUUACAUCUUCAACN 987-1005 987
18 NGUUGAAGAUGUAACAGUN 71 NACUGUUACAUCUUCAACN 987-1005 987
19 AUCAAUAAGGACCAGGGGU 72 ACCCCUGGUCCUUAUUGAU 620-638 620
20 UUCAAUAAGGACCAGGGGU 73 ACCCCUGGUCCUUAUUGAA 620-638 620
21 NUCAAUAAGGACCAGGGGU 74 ACCCCUGGUCCUUAUUGAN 620-638 620
22 NUCAAUAAGGACCAGGGGN 75 NCCCCUGGUCCUUAUUGAN 620-638 620
23 UCAUCAAUAAGGACCAGGG 76 CCCUGGUCCUUAUUGAUGA 622-640 622
24 NCAUCAAUAAGGACCAGGG 77 CCCUGGUCCUUAUUGAUGN 622-640 622
25 NCAUCAAUAAGGACCAGGN 78 NCCUGGUCCUUAUUGAUGN 622-640 622
26 GUGUUGUAGUCACUGUAGA 79 UCUACAGUGACUACAACAC 1294-1312 1294
27 UUGUUGUAGUCACUGUAGA 80 UCUACAGUGACUACAACAA 1294-1312 1294
28 NUGUUGUAGUCACUGUAGA 81 UCUACAGUGACUACAACAN 1294-1312 1294
29 NUGUUGUAGUCACUGUAGN 82 NCUACAGUGACUACAACAN 1294-1312 1294
30 UCGUGUUGUAGUCACUGUA 83 UACAGUGACUACAACACGA 1296-1314 1296
31 NCGUGUUGUAGUCACUGUA 84 UACAGUGACUACAACACGN 1296-1314 1296
32 NCGUGUUGUAGUCACUGUN 85 NACAGUGACUACAACACGN 1296-1314 1296
33 UCGUGUUGUAGUCACUGUA 86 UACAGUGACUACAACACIA 1296-1314 1296
34 NCGUGUUGUAGUCACUGUA 87 UACAGUGACUACAACACIN 1296-1314 1296
35 NCGUGUUGUAGUCACUGUN 88 NACAGUGACUACAACACIN 1296-1314 1296
36 GGAUCAUGUGGUCUUGGAA 89 UUCCAAGACCACAUGAUCC 1347-1365 1347
37 UGAUCAUGUGGUCUUGGAA 90 UUCCAAGACCACAUGAUCA 1347-1365 1347
38 UGAUCAUGUGGUCUUGGAA 91 UUCCAAGACCACAUIAUCA 1347-1365 1347
39 NGAUCAUGUGGUCUUGGAA 92 UUCCAAGACCACAUGAUCN 1347-1365 1347
40 NGAUCAUGUGGUCUUGGAN 93 NUCCAAGACCACAUGAUCN 1347-1365 1347
41 CGGAUCAUGUGGUCUUGGA 94 UCCAAGACCACAUGAUCCG 1348-1366 1348
42 UGGAUCAUGUGGUCUUGGA 95 UCCAAGACCACAUGAUCCA 1348-1366 1348
43 NGGAUCAUGUGGUCUUGGA 96 UCCAAGACCACAUGAUCCN 1348-1366 1348
44 NGGAUCAUGUGGUCUUGGN 97 NCCAAGACCACAUGAUCCN 1348-1366 1348
45 UUGCAGUAUUUCUCCCCAC 98 GUGGGGAGAAAUACUGCAA 1405-1423 1405
46 NUGCAGUAUUUCUCCCCAC 99 GUGGGGAGAAAUACUGCAN 1405-1423 1405
47 NUGCAGUAUUUCUCCCCAN 100 NUGGGGAGAAAUACUGCAN 1405-1423 1405
48 GUUGUUGCAGUAUUUCUCC 101 GGAGAAAUACUGCAACAAC 1409-1427 1409
49 UUUGUUGCAGUAUUUCUCC 102 GGAGAAAUACUGCAACAAA 1409-1427 1409
50 NUUGUUGCAGUAUUUCUCC 103 GGAGAAAUACUGCAACAAN 1409-1427 1409
51 NUUGUUGCAGUAUUUCUCN 104 NGAGAAAUACUGCAACAAN 1409-1427 1409
52 GGUUGUUGCAGUAUUUCUC 105 GAGAAAUACUGCAACAACC 1410-1428 1410
53 UGUUGUUGCAGUAUUUCUC 106 GAGAAAUACUGCAACAACA 1410-1428 1410
54 NGUUGUUGCAGUAUUUCUC 107 GAGAAAUACUGCAACAACN 1410-1428 1410
55 NGUUGUUGCAGUAUUUCUN 108 NAGAAAUACUGCAACAACN 1410-1428 1410
56 CCUUCCUGCUCAGGGUGAU 109 AUCACCCUGAGCAGGAAGG 1629-1647 1629
57 UCUUCCUGCUCAGGGUGAU 110 AUCACCCUGAGCAGGAAGA 1629-1647 1629
58 NCUUCCUGCUCAGGGUGAU 111 AUCACCCUGAGCAGGAAGN 1629-1647 1629
59 NCUUCCUGCUCAGGGUGAN 112 NUCACCCUGAGCAGGAAGN 1629-1647 1629
60 AAGUCGAUGAUGAUCUCCC 113 GGGAGAUCAUCAUCGACUU 1798-1816 1798
61 UAGUCGAUGAUGAUCUCCC 114 GGGAGAUCAUCAUCGACUA 1798-1816 1798
62 AAGUCGAUGAUGAUCUCCC 115 GGGAGAUCAUCAUCIACUU 1798-1816 1798
63 UAGUCGAUGAUGAUCUCCC 116 GGGAGAUCAUCAUCIACUA 1798-1816 1798
64 NAGUCGAUGAUGAUCUCCC 117 GGGAGAUCAUCAUCGACUN 1798-1816 1798
65 NAGUCGAUGAUGAUCUCCC 118 GGGAGAUCAUCAUCIACUN 1798-1816 1798
66 NAGUCGAUGAUGAUCUCCN 119 NGGAGAUCAUCAUCGACUN 1798-1816 1798
67 NAGUCGAUGAUGAUCUCCN 120 NGGAGAUCAUCAUCIACUN 1798-1816 1798
包含表2中之核苷酸序列或由其組成之β-ENaC RNAi藥劑有義股及反義股可為經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，具有包含表2中之核苷酸序列中之任一者或由其組成的有義股及反義股序列之β-ENaC RNAi藥劑為所有或實質上所有經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的反義股與表2中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的有義股與表2中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
如本文所使用，表2中所揭示之序列中所列的各N可獨立地選自任何及所有核鹼基(包括經修飾及未經修飾之核苷酸兩者上發現之彼等核鹼基)。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸不互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸相同的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸不同的核鹼基。
某些經修飾之β-ENaC RNAi藥劑有義股及反義股提供於表3及表4中。經修飾之β-ENaC RNAi藥劑反義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表3中。經修飾之β-ENaC RNAi藥劑有義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表4中。在形成β-ENaC RNAi藥劑時，表3及表4以及上表2中所列的各基礎鹼基序列中的各核苷酸可為經修飾核苷酸。
本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2或表4中所列序列之有義股可與含有表2或表3中所列序列之任何反義股雜交，只要兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列上具有至少85%互補之區域。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之序列中之任一者的核苷酸序列。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含以下或由以下組成：具有表2、表3或表4中之序列中之任一者的有義股及反義股之核鹼基序列的雙螺旋體。
含有經修飾核苷酸之反義股之實例提供於表3中。含有經修飾核苷酸之有義股之實例提供於表4中。
如表3及表4中所使用，以下記法用於指示經修飾核苷酸、靶向基團及鍵聯基團： A             = 腺苷-3'-磷酸酯 C             = 胞苷-3'-磷酸酯 G             = 鳥苷-3'-磷酸酯 U             =  尿苷-3'-磷酸酯 I              =  肌苷-3'-磷酸酯 a              =  2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯 as             =  2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯 c              =  2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯 cs             =  2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯 g              = 2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯 gs            =  2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯 i              = 2'-O-甲基肌苷-3'-磷酸酯 is             =  2'-O-甲基肌苷-3'-硫代磷酸酯 t              =  2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯 ts             =  2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 u              =  2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯 us            =  2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 Af            =  2'-氟腺苷-3'-磷酸酯 Afs          =  2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯 Cf            =  2'-氟胞苷-3'-磷酸酯 Cfs           =  2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯 Gf            =  2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯 Gfs          =  2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯 Tf            =  2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-磷酸酯 Tfs           =  2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 Uf            =  2'-氟尿苷-3'-磷酸酯 Ufs          =  2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯 dT            =  2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯 AUNA =  2',3'-開環-腺苷-3'-磷酸酯 AUNA s =  2',3'-開環-腺苷-3'-硫代磷酸酯 CUNA =  2',3'-開環-胞苷-3'-磷酸酯 CUNA s =  2',3'-開環-胞苷-3'-硫代磷酸酯 GUNA =  2',3'-開環-鳥苷-3'-磷酸酯 GUNA s =  2',3'-開環-鳥苷-3'-硫代磷酸酯 UUNA =  2',3'-開環-尿苷-3'-磷酸酯 UUNA s =  2',3'-開環-尿苷-3'-硫代磷酸酯 a_2N        =  參見表6 a_2Ns       =  參見表6 (invAb)    =  倒置無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-磷酸酯，參見表6 (invAb)s   =  倒置無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-硫代磷酸酯，參見表6 s              =  硫代磷酸酯鍵 p              =  末端磷酸酯(如所合成) vpdN        =  膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸 cPrpa        =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯(參見表6) cPrpas      =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯(參見表6) cPrpu       =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯(參見表6) cPrpus      =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯(參見表6) aAlk         =  2'-O-炔丙基腺苷-3'-磷酸酯，參見表6 aAlks       =  2'-O-炔丙基腺苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6 cAlk         =  2'-O-炔丙基胞苷-3'-磷酸酯，參見表6 cAlks       =  2'-O-炔丙基胞苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6 gAlk         = 2'-O-炔丙基鳥苷-3'-磷酸酯，參見表6 gAlks       =  2'-O-炔丙基鳥苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6 tAlk         =  2'-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯，參見表6 tAlks        =  2'-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6 uAlk         =  2'-O-炔丙基尿苷-3'-磷酸酯，參見表6 uAlks       =  2'-O-炔丙基尿苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6 (Alk-SS-C6)  =  參見表6 (C6-SS-Alk)  =  參見表6 (C6-SS-C6)   =  參見表6 (6-SS-6)       =  參見表6 (C6-SS-Alk-Me) =   參見表6 (NH2-C6)    =   參見表6 (TriAlk#)     =   參見表6 (TriAlk#)s   =   參見表6
如一般熟習此項技術者將容易地理解，除非藉由序列(諸如(例如)藉由硫代磷酸酯鍵「s」)另外指明，否則當存在於寡核苷酸中時，核苷酸單體藉由5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接。如一般熟習此項技術者將清楚地理解，包括如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示之硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中通常存在之磷酸二酯鍵。此外，一般熟習此項技術者將容易地理解，給定寡核苷酸序列之3'端的末端核苷酸通常將在給定單體之各別3'位置處具有羥基(-OH)而非離體磷酸酯部分。另外，對於本文所揭示之實施例，當觀察各別股5' à 3'時，插入倒置無鹼基殘基使得去氧核糖之3'位置連接在各別股上之前述單體的3'端處(參見例如表6)。此外，如一般技術者將容易地理解及瞭解，雖然本文中所描繪之硫代磷酸酯化學結構通常展示陰離子位於硫原子上，但本文所揭示之發明涵蓋所有硫代磷酸酯互變異構體(例如，其中硫原子具有雙鍵且陰離子位於氧原子上)。本文中除非另外明確指示，否則在描述本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑及β-ENaC RNAi藥劑之組合物時使用一般熟習此項技術者的此類理解。
與本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑一起使用的靶向基團及鍵聯基團之某些實例包括在下表6中所提供之化學結構中。各有義股及/或反義股可具有本文所列之任何靶向基團或鍵聯基團，以及與序列之5'端及/或3'端結合的其他靶向基團或鍵聯基團。表 3. β-ENaC RNAi藥劑反義股序列
AS 股ID 經修飾之反義股(5′ → 3') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列(5′ → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM08374-AS asUfscsAfaUfaaggaCfcAfgGfgGfuGfsu 121 AUCAAUAAGGACCAGGGGUGU 189
AM08376-AS usGfsasUfcAfuguggUfcUfuGfgAfaGfsc 122 UGAUCAUGUGGUCUUGGAAGC 190
AM08378-AS usGfsgsAfuCfaugugGfuCfuUfgGfaAfsg 123 UGGAUCAUGUGGUCUUGGAAG 191
AM08380-AS usUfsgsCfaGfuauuuCfuCfcCfcAfcGfsg 124 UUGCAGUAUUUCUCCCCACGG 192
AM08382-AS usCfsusUfcCfugcucAfgGfgUfgAfuCfsc 125 UCUUCCUGCUCAGGGUGAUCC 193
AM08732-AS asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 126 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA 194
AM08736-AS asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 127 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM08747-AS asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcusu 128 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCUU 196
AM08757-AS usCfsasUfcAfaUfaAfgGfaCfcAfgGfgGfsu 129 UCAUCAAUAAGGACCAGGGGU 197
AM08759-AS usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg 130 UUGUUGUAGUCACUGUAGACG 198
AM08761-AS usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg 131 UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG 199
AM08763-AS usCfsgsUfgUfUUNA GfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg 132 UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG 199
AM08765-AS usGfsasUfcAfuGfuGfgUfcUfuGfgAfaGfsc 133 UGAUCAUGUGGUCUUGGAAGC 190
AM08767-AS usUfsusGfuUfgCfaGfuAfuUfuCfuCfcCfsc 134 UUUGUUGCAGUAUUUCUCCCC 200
AM08769-AS usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc 135 UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC 201
AM09703-AS asGfsusUfgAfagaugUfaGfcAfgUfuGfsc 136 AGUUGAAGAUGUAGCAGUUGC 202
AM09758-AS cPrpusCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg 137 UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG 199
AM09764-AS cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 138 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 203
AM09691-AS asGfsusugAfaGfAfuguaAfcAfguugsc 139 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM09692-AS asGfsusugAfagauguaAfcAfguugsc 140 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM09693-AS asGfsusugAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 141 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM09695-AS asGfsusUfgAfAUNAgaugUfaAfcAfgUfuGfsc 142 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM09927-AS cPrpusGfsusUfgAfAUNAgaugUfaAfcAfgUfuGfsc 143 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 203
AM09984-AS usAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 144 UAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA 206
AM09985-AS cPrpusAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 145 UAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA 206
AM09986-AS asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfuCfcCfsa 146 AAGUCGAUGAUGAUCUUCCCA 207
AM09988-AS asAfsgsUfuGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 147 AAGUUGAUGAUGAUCUCCCCA 208
AM09990-AS asAfsgsUfcGfAUNAUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 148 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA 209
AM09992-AS asAfsgsucgaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa 149 AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA 194
AM09994-AS cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 150 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 203
AM09996-AS cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaGfcAfgUfuGfsc 151 UGUUGAAGAUGUAGCAGUUGC 210
AM09997-AS cPrpuGfuUfgAfagaugUfaGfcAfgUfuGfsc 152 UGUUGAAGAUGUAGCAGUUGC 210
AM10004-AS cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 153 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10005-AS cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 154 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10150-AS usGfsusUfgAfagaugUfaGfcAfgUfuGfsc 155 UGUUGAAGAUGUAGCAGUUGC 210
AM10170-AS asGfsusUfgaagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 156 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10171-AS asGfsusugaagaugUfaAfcAfgUfuGfsc 157 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10172-AS asGfsusugaagaugUfaAfcAfgUfugsc 158 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10173-AS asGfsusugaagaugUfaAfcAfguugsc 159 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
AM10174-AS asGfsusugaagauguaAfcAfguugsc 160 AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC 195
表 4. β-ENaC藥劑有義股序列
股ID 經修飾之有義股(5′ → 3') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列(5′ → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM08373-SS (NH2-C6)s(invAb)sacaccccuGfGfUfccuuauugaus(invAb) 161 ACACCCCUGGUCCUUAUUGAU 211
AM08375-SS (NH2-C6)s(invAb)sgcuuccaaGfAfCfcacaugaucas(invAb) 162 GCUUCCAAGACCACAUGAUCA 212
AM08377-SS (NH2-C6)s(invAb)scuuccaagAfCfCfacaugauccas(invAb) 163 CUUCCAAGACCACAUGAUCCA 213
AM08379-SS (NH2-C6)s(invAb)sccguggggAfGfAfaauacugcaas(invAb) 164 CCGUGGGGAGAAAUACUGCAA 214
AM08381-SS (NH2-C6)s(invAb)sgGfaucaccCfUfGfagcaggaagas(invAb) 165 GGAUCACCCUGAGCAGGAAGA 215
AM08756-SS (TriAlk14)asccccuggUfCfCfuuauugaugas(invAb) 166 ACCCCUGGUCCUUAUUGAUGA 216
AM08758-SS (TriAlk14)csgucuacaGfUfGfacuacaacaas(invAb) 167 CGUCUACAGUGACUACAACAA 217
AM08760-SS (TriAlk14)cscuacaguGfAfCfuacaacacgas(invAb) 168 CCUACAGUGACUACAACACGA 218
AM08762-SS (TriAlk14)cscuacaguGfAfCfuacaacacias(invAb) 169 CCUACAGUGACUACAACACIA 219
AM08764-SS (TriAlk14)gscuuccaaGfAfCfcacauiaucas(invAb) 170 GCUUCCAAGACCACAUIAUCA 220
AM08766-SS (TriAlk14)gsgggagaaAfUfAfcugcaacaaas(invAb) 171 GGGGAGAAAUACUGCAACAAA 221
AM08768-SS (TriAlk14)gsggagaaaUfAfCfugcaacaacas(invAb) 172 GGGAGAAAUACUGCAACAACA 222
AM08939-SS (TriAlk14)gscaacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) 173 GCAACUGUUACAUCUUCAACU 223
AM08940-SS (TriAlk14)usggggagaUfCfAfucauciacuus(invAb) 174 UGGGGAGAUCAUCAUCIACUU 224
AM08941-SS (TriAlk14)gsggagaUfCfAfucauciacuuuus(invAb) 175 GGGAGAUCAUCAUCIACUUUU 225
AM09705-SS (TriAlk14)gscaacugcUfAfCfaucuucaacus(invAb) 176 GCAACUGCUACAUCUUCAACU 226
AM09763-SS (TriAlk14)gscaacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb) 177 GCAACUGUUACAUCUUCAACA 227
AM09765-SS (NH2-C6)gscaacuguUfAfCfaucAlkuuAlkcaAlkacAlkas(invAb) 178 GCAACUGUUACAUCUUCAACA 227
AM09964-SS (NH2-C6)gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) 179 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU 229
AM09995-SS (TriAlk14)gcaacuguUfAfCfaucuucaaca(invAb) 180 GCAACUGUUACAUCUUCAACA 227
AM10006-SS (TriAlk14)gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb) 181 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA 230
AM10033-SS (NH2-C6)s(invAb)sgcaacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb)(C6-SS-C6)dT 182 GCAACUGUUACAUCUUCAACUT 231
AM10293-SS (NH2-C6)s(invAb)sgcaacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb)(C6-SS-C6)dT 183 GCAACUGUUACAUCUUCAACAT 232
AM10319-SS (TriAlk14)gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) 184 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU 229
AM10364-SS (NH2-C6)s(invAb)sgscaacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb)(C6-SS-C6)dT 185 GCAACUGUUACAUCUUCAACAT 232
AM10365-SS (NH2-C6)s(invAb)sgsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb)(C6-SS-C6)dT 186 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACUT 233
(A2N ) =含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；I =次黃嘌呤(肌苷)核苷酸
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2或表4中所列序列之有義股可與含有表2或表3中所列序列之任何反義股雜交，只要兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列上具有至少85%互補之區域。
如上表4中所展示，某些實例β-ENaC RNAi藥劑核苷酸序列展示在有義股之5'端子末端及3'端子末端中之一者或兩者處進一步包括反應性鍵聯基團。舉例而言，上表4中展示之許多β-ENaC RNAi藥劑有義股序列在核苷酸序列之5'端處具有(NH2-C6)鍵聯基團或(TriAlk14)鍵聯基團。類似地，上表4中展示之幾個實例β-ENaC RNAi藥劑有義股核苷酸序列在核苷酸序列之3'端處具有(6-SS-6)或(C6-SS-C6)鍵聯基團。此類反應性鍵聯基團經定位以促進靶向配位體、靶向基團及/或PK/PD調節劑與本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑之連接。鍵聯或結合反應為此項技術中所熟知且使得在兩種分子或反應物之間形成共價鍵。本發明之範疇中使用之適合結合反應包括(但不限於)醯胺偶合反應、邁克爾加成反應(Michael addition reaction)、腙形成反應、倒置需求狄爾斯-阿爾德環加成反應(inverse-demand Diels-Alder cycloaddition reaction)、肟接合及銅(I)-催化或應力促進之疊氮化合物-炔烴環加成反應。
在一些實施例中，靶向配位體(諸如本文所揭示之實例及圖中所展示之整合素靶向配位體)可以活化之酯(諸如四氟苯基(TFP)酯)形式合成，該等酯可藉由反應性胺基(例如，NH2-C6)取代以將靶向配位體連接至本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向配位體係以疊氮化合物形式合成，該等疊氮化合物可例如經由銅(I)-催化或應力促進之疊氮化合物-炔烴環加成反應結合至炔丙基(例如，TriAlk14)或DBCO基團。
另外，上表4中展示之某些核苷酸序列係在有義股之3'端子末端處與dT核苷酸，隨後與(3' à 5')連接子(例如，C6-SS-C6) (參見例如，AM10033-SS、AM10293-SS、AM10364-SS及AM10365-SS)合成。在一些實施例中，連接子可促進與另外組分，諸如(例如) PK/PD調節劑或一或多個靶向配位體之連接。如本文所描述，首先還原C6-SS-C6之二硫鍵，自分子移除dT，其接著可促進所需PK/PD調節劑之結合。末端dT核苷酸因此不係完全結合之構築體的一部分。
在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的反義股與表3中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的有義股與表4中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之序列中之任一者的核苷酸序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24或2-24之序列。在某些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表3中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列或由其組成。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包含表2或表4中之序列中之任一者的核苷酸序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包含表2或表4中之序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21、4-21、1-22、2-22、3-22、4-22、1-23、2-23、3-23、4-23、1-24、2-24、3-24或4-24之序列。在某些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑有義股包含表3中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列或由其組成。
對於本文所揭示之RNAi藥劑，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸可與β-ENaC基因完全互補，或可與β-ENaC基因不互補。在一些實施例中，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸為U、A或dT (或U、A或dT之經修飾型式)。在一些實施例中，反義股之位置1 (5'端à3'端)處的核苷酸與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19之序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi有義股包含表2或表4中之有義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17或1-18之序列。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包括：(i)反義股，其包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19之序列；及(ii)有義股，其包含表2或表4中之有義股序列中之任一者的核苷酸(5'端à3'端) 1-17或1-18之序列。
含有表2或表4中所列序列之有義股可與含有表2或表3中所列序列之任何反義股雜交，只要兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列上具有至少85%互補之區域。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑具有由表4中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列組成之有義股，及由表3中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列組成之反義股。某些代表性序列對由表5A及表5B中展示之雙螺旋體ID編號例示。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：由本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示的雙螺旋體。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑係由本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者組成。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股核苷酸序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股核苷酸序列以及靶向基團、鍵聯基團及/或其他非核苷酸基團，其中靶向基團、鍵聯基團及/或其他非核苷酸基團共價連接(亦即，結合)至有義股或反義股。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包括本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股經修飾核苷酸序列。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股經修飾核苷酸序列以及靶向基團、鍵聯基團及/或其他非核苷酸基團，其中靶向基團、鍵聯基團及/或其他非核苷酸基團共價連接至有義股或反義股。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表2或表5A及5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含靶向基團。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表2或表5A及5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含一或多個αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表2或表5A及5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含為整合素靶向配位體之靶向基團。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表2或表5A及5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含一或多個αvβ6整合素靶向配位體或αvβ6整合素靶向配位體叢集(例如，三齒αvβ6整合素靶向配位體)。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表5A及表5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的經修飾核苷酸序列之反義股及有義股。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含具有表5A及5B之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的經修飾核苷酸序列之反義股及有義股，且進一步包含整合素靶向配位體。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：表5A及5B之雙螺旋體中之任一者。表 5A. 具有對應有義股及反義股ID編號之β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體
雙螺旋體ID 反義股ID 有義股ID
AD06283 AM08374-AS AM08373-SS
AD06284 AM08376-AS AM08375-SS
AD06285 AM08378-AS AM08377-SS
AD06286 AM08380-AS AM08379-SS
AD06287 AM08382-AS AM08381-SS
AD06494 AM08757-AS AM08756-SS
AD06495 AM08759-AS AM08758-SS
AD06496 AM08761-AS AM08760-SS
AD06497 AM08761-AS AM08762-SS
AD06498 AM08763-AS AM08760-SS
AD06499 AM08765-AS AM08764-SS
AD06500 AM08767-AS AM08766-SS
AD06501 AM08769-AS AM08768-SS
AD06598 AM08736-AS AM08939-SS
AD06599 AM08732-AS AM08940-SS
AD06600 AM08747-AS AM08941-SS
AD07054 AM09703-AS AM08939-SS
AD07055 AM09703-AS AM09705-SS
AD07095 AM09758-AS AM08762-SS
AD07099 AM09764-AS AM09763-SS
AD07100 AM09764-AS AM09765-SS
AD07217 AM08736-AS AM09964-SS
AD07240 AM09994-AS AM09763-SS
AD07241 AM09994-AS AM09995-SS
AD07242 AM09996-AS AM09763-SS
AD07243 AM09997-AS AM09763-SS
AD07244 AM09997-AS AM09995-SS
AD07250 AM10004-AS AM08939-SS
AD07251 AM10005-AS AM08939-SS
AD07252 AM10004-AS AM09964-SS
AD07253 AM10005-AS AM09964-SS
AD07254 AM09764-AS AM10006-SS
AD07255 AM09994-AS AM10006-SS
AD07280 AM08736-AS AM10033-SS
AD07281 AM10004-AS AM10033-SS
AD07351 AM10150-AS AM09763-SS
AD07473 AM09764-AS AM10293-SS
AD07482 AM08736-AS AM10319-SS
AD07506 AM09764-AS AM10364-SS
AD07507 AM08736-AS AM10365-SS
表 5B. 具有對應有義股及反義股ID編號及經修飾及未經修飾核苷酸序列之序列ID編號之β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體。
雙螺旋體 AS ID AS 經修飾SEQ ID NO: AS 未經修飾SEQ ID NO: SS ID SS 經修飾SEQ ID NO: SS 未經修飾SEQ ID NO:
AD06283 AM08374-AS 121 189 AM08373-SS 161 211
AD06284 AM08376-AS 122 190 AM08375-SS 162 212
AD06285 AM08378-AS 123 191 AM08377-SS 163 213
AD06286 AM08380-AS 124 192 AM08379-SS 164 214
AD06287 AM08382-AS 125 193 AM08381-SS 165 215
AD06494 AM08757-AS 129 197 AM08756-SS 166 216
AD06495 AM08759-AS 130 198 AM08758-SS 167 217
AD06496 AM08761-AS 131 199 AM08760-SS 168 218
AD06497 AM08761-AS 131 199 AM08762-SS 169 219
AD06498 AM08763-AS 132 199 AM08760-SS 168 218
AD06499 AM08765-AS 133 190 AM08764-SS 170 220
AD06500 AM08767-AS 134 200 AM08766-SS 171 221
AD06501 AM08769-AS 135 201 AM08768-SS 172 222
AD06598 AM08736-AS 127 195 AM08939-SS 173 223
AD06599 AM08732-AS 126 194 AM08940-SS 174 224
AD06600 AM08747-AS 128 196 AM08941-SS 175 225
AD07054 AM09703-AS 136 202 AM08939-SS 173 223
AD07055 AM09703-AS 136 202 AM09705-SS 176 226
AD07095 AM09758-AS 137 199 AM08762-SS 169 219
AD07099 AM09764-AS 138 203 AM09763-SS 177 227
AD07100 AM09764-AS 138 203 AM09765-SS 178 227
AD07217 AM08736-AS 127 195 AM09964-SS 179 229
AD07240 AM09994-AS 150 203 AM09763-SS 177 227
AD07241 AM09994-AS 150 203 AM09995-SS 180 227
AD07242 AM09996-AS 151 210 AM09763-SS 177 227
AD07243 AM09997-AS 152 210 AM09763-SS 177 227
AD07244 AM09997-AS 152 210 AM09995-SS 180 227
AD07250 AM10004-AS 153 195 AM08939-SS 173 223
AD07251 AM10005-AS 154 195 AM08939-SS 173 223
AD07252 AM10004-AS 153 195 AM09964-SS 179 229
AD07253 AM10005-AS 154 195 AM09964-SS 179 229
AD07254 AM09764-AS 138 203 AM10006-SS 181 230
AD07255 AM09994-AS 150 203 AM10006-SS 181 230
AD07280 AM08736-AS 127 195 AM10033-SS 182 231
AD07281 AM10004-AS 153 195 AM10033-SS 182 231
AD07351 AM10150-AS 155 210 AM09763-SS 177 227
AD07473 AM09764-AS 138 203 AM10293-SS 183 232
AD07482 AM08736-AS 127 195 AM10319-SS 184 229
AD07506 AM09764-AS 138 203 AM10364-SS 185 232
AD07507 AM08736-AS 127 195 AM10365-SS 186 233
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。本文所描述之RNAi藥劑在遞送至表現β-ENaC基因之細胞後，在活體內及/或活體外抑制或阻斷一或多個β-ENaC基因之表現。靶向基團、鍵聯基團、藥物動力學 / 藥力學 (PK/PD) 調節劑及遞送媒劑
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑含有一或多種非核苷酸基團或與一或多種非核苷酸基團結合，該一或多種非核苷酸基團包括(但不限於)靶向基團、鍵聯基團、藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑、遞送聚合物或遞送媒劑。非核苷酸基團可增強RNAi藥劑之靶向、遞送或連接。非核苷酸基團可共價鍵聯至有義股及/或反義股之3'及/或5'端。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑含有鍵聯至有義股之3'及/或5'端之非核苷酸基團。在一些實施例中，非核苷酸基團鍵聯至β-ENaC RNAi藥劑有義股之5'端。非核苷酸基團可經由連接子/鍵聯基團而直接地或間接地鍵聯至RNAi藥劑。在一些實施例中，非核苷酸基團經由不穩定可裂解或可逆鍵或連接子鍵聯至RNAi藥劑。
在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi藥劑或其所連接之結合物的藥物動力學或生物分佈特性，以改良結合物之細胞特異性或組織特異性分佈及細胞特異性攝取。在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi藥劑之內飲作用。
靶向基團或靶向部分增強結合物或其所連接之RNAi藥劑的藥物動力學或生物分佈特性，以改良結合物或RNAi藥劑之細胞特異性(在一些情況下包括器官特異性)分佈及細胞特異性(或器官特異性)攝取。靶向基團可為單價、二價、三價、四價或具有更高價數，以用於其所針對之目標。代表性靶向基團包括(但不限於)對細胞表面分子具有親和力之化合物、對細胞表面分子具有親和力之細胞受體配位體、半抗原、抗體、單株抗體、抗體片段及抗體模擬物。在一些實施例中，靶向基團使用連接子鍵聯至RNAi藥劑，該連接子諸如PEG連接子或一個、兩個或三個無鹼基及/或核糖醇(無鹼基核糖)殘基，該等殘基在一些情況下可充當連接子。
靶向基團在存在或不存在連接子之情況下可連接至表2、表3及表4中所揭示之有義股及/或反義股中之任一者的5'或3'端。連接子在存在或不存在靶向基團之情況下可附接至表2、表3及表4中所揭示之有義股及/或反義股中之任一者的5'或3'端。
本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑可經合成在5'端及/或3'端處具有反應性基團，諸如胺基(在本文中亦稱為胺)。反應性基團隨後可用於使用此項技術中典型之方法連接靶向部分。
舉例而言，在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑經合成在RNAi藥劑之有義股的5'端處具有NH2 -C6 基團。末端胺基隨後可反應以與例如包括αvβ6整合素靶向配位體之基團形成結合物。在一些實施例中，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑經合成在RNAi藥劑之有義股的5'端處具有一或多個炔烴基團。末端炔基隨後可反應以與例如包括αvβ6整合素靶向配位體之基團形成結合物。
在一些實施例中，靶向基團包含整合素靶向配位體。在一些實施例中，整合素靶向配位體為αvβ6整合素靶向配位體。αvβ6整合素靶向配位體之使用促進對其各別表面上具有αvβ6之細胞的細胞特異性靶向，且整合素靶向配位體之結合可促進其所連接之治療劑(諸如RNAi藥劑)進入細胞中，諸如上皮細胞，包括肺上皮細胞及腎上皮細胞。整合素靶向配位體可為單體或單價的(例如，具有單一整合素靶向部分)或多聚或多價的(例如，具有多個整合素靶向部分)。靶向基團可使用此項技術中已知之方法連接至RNAi寡核苷酸之3'及/或5'端。靶向基團(諸如αvβ6整合素靶向配位體)之製備描述於例如國際專利申請公開案第WO 2018/085415號及國際專利申請公開案第WO 2019/089765號，其中之每一者的內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，靶向基團在不使用另外連接子之情況下連接至β-ENaC RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向基團經設計成具有容易存在的連接子以促進與β-ENaC RNAi藥劑之連接。在一些實施例中，當組合物中包括兩種或更多種RNAi藥劑時，兩種或更多種RNAi藥劑可使用相同連接子連接至其各別靶向基團。在一些實施例中，當組合物中包括兩種或更多種RNAi藥劑時，兩種或更多種RNAi藥劑使用不同連接子連接至其各別靶向基團。
在一些實施例中，鍵聯基團結合至RNAi藥劑。鍵聯基團促進藥劑與靶向基團、藥物動力學調節劑、遞送聚合物或遞送媒劑之共價連接。鍵聯基團可連接至RNAi藥劑有義股或反義股之3'及/或5'端。在一些實施例中，鍵聯基團連接至RNAi藥劑有義股。在一些實施例中，鍵聯基團結合至RNAi藥劑有義股之5'或3'端。在一些實施例中，鍵聯基團結合至RNAi藥劑有義股之5'端。鍵聯基團之實例包括(但不限於)：C6-SS-C6；6-SS-6；反應性基團，諸如一級胺(例如，NH2-C6)及炔烴；烷基；無鹼基殘基/核苷酸；胺基酸；三炔烴官能化基團；核糖醇；及/或PEG基團。某些鍵聯基團之實例提供於表6中。
連接子或鍵聯基團為兩個原子之間的連接部分，其經由一或多個共價鍵將一個相關化學基團(諸如RNAi藥劑)或片段連接至另一相關化學基團(諸如靶向基團、藥物動力學調節劑或遞送聚合物)或片段。不穩定連接含有不穩定鍵。連接可視情況包括使兩個接合原子之間的距離增加的間隔基。間隔基可進一步增加連接之可撓性及/或長度。間隔基包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基；其中之每一者可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣類。間隔基團為此項技術中所熟知且前述清單並不意謂限制本說明書之範疇。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑與聚乙二醇(PEG)部分結合，或與具有12個或更多個碳原子之疏水性基團(諸如膽固醇或軟脂醯基)結合。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑連接至一或多種藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑。PK/PD調節劑可經由改善細胞受體結合、改良細胞攝取及/或其他方式來增加結合藥物之循環時間及/或增加RNAi藥劑之活性。適合於與RNAi藥劑一起使用之各種PK/PD調節劑為此項技術中已知的。在一些實施例中，PK/PD調節可為膽固醇或膽固醇基衍生物，或在一些情況下PK/PD調節劑可包含烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基或芳炔基，其中之每一者可為直鏈、分支鏈、環狀及/或經取代或未經取代的。在一些實施例中，此等部分之連接位置在有義股之5'或3'端處，在有義股之任何給定核苷酸之核糖環的2'位置處，及/或在有義股之任何位置處連接至磷酸酯或硫代磷酸酯主鏈。
表2、表3及表4中所列之β-ENaC RNAi藥劑核苷酸序列中之任一者(無論經修飾或未經修飾)可含有一或多個3'及/或5'靶向基團、鍵聯基團及/或PK/PD調節劑。表3及表4中所列或本文另外所描述之含有3'或5'靶向基團、鍵聯基團及/或PK/PD調節劑的β-ENaC RNAi藥劑序列中之任一者可替代地不含有3'或5'靶向基團、鍵聯基團或PK/PD調節劑，或可含有不同的3'或5'靶向基團、鍵聯基團或藥物動力學調節劑，包括(但不限於)表6中描繪之彼等。表5A及表5B中所列之β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體中之任一者(無論經修飾或未經修飾)可進一步包含靶向基團或鍵聯基團，包括(但不限於)表6中描繪之彼等，且靶向基團或鍵聯基團可連接至β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體之有義股或反義股之3'或5'端。
某些經修飾核苷酸、封端部分及鍵聯基團之實例提供於表6中。表 6. 表示各種經修飾核苷酸、封端部分及鍵聯基團之結構
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當位於內部時：
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( invAb)
當位於內部時：
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( invAb)s
當位於3'端末端時：
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( invAb)
當位於寡核苷酸之3'端末端時：
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(C6-SS-C6)
當位於內部時：
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(C6-SS-C6)
當位於3'端末端時：
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(6-SS-6)
當位於寡核苷酸內部時：
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(6-SS-6)
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替代地，可使用此項技術中已知之其他鍵聯基團。在許多情況下，鍵聯基團可商業地獲得或替代地併入至商業上可獲得之核苷酸胺基磷酸酯中。(參見例如國際專利申請公開案第WO 2019/161213號，其以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，在不與靶向配位體或藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑結合之情況下遞送β-ENaC RNAi藥劑(稱為「裸」或「裸RNAi藥劑」)。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑結合至靶向基團、鍵聯基團、PK調節劑及/或另一非核苷酸基團以促進將β-ENaC RNAi藥劑遞送至所選細胞或組織，例如活體內上皮細胞。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑結合至靶向基團，其中靶向基團包括整合素靶向配位體。在一些實施例中，整合素靶向配位體為αvβ6整合素靶向配位體。在一些實施例中，靶向基團包括一或多種αvβ6整合素靶向配位體。
在一些實施例中，遞送媒劑可用於將RNAi藥劑遞送至細胞或組織。遞送媒劑為改良RNAi藥劑遞送至細胞或組織之化合物。遞送媒劑可包括(但不限於)以下或由以下組成：聚合物，諸如兩性聚合物、膜活性聚合物、肽、蜂毒素肽、蜂毒素樣肽(MLP)、脂質、經可逆修飾之聚合物或肽或經可逆修飾之膜活性多元胺。
在一些實施例中，RNAi藥劑可與脂質、奈米顆粒、聚合物、脂質體、微胞、DPC或此項核酸遞送之技術中可利用之其他遞送系統組合。RNAi藥劑亦可以化學方式結合至靶向基團、脂質(包括(但不限於)膽固醇基及膽固醇基衍生物)，藉由離子導入療法或藉由併入至此項技術中可利用之其他遞送媒劑或系統(諸如水凝膠、環糊精、生物可降解奈米膠囊、生物黏附微球體或蛋白質載體)中來囊封於奈米顆粒、脂質體、微胞中，結合至聚合物或DPC (參見例如WO 2000/053722、WO 2008/022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其中之每一者以引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，RNAi藥劑可結合至對肺上皮細胞具有親和力之抗體。在一些實施例中，RNAi藥劑可連接至對肺上皮細胞具有親和力之靶向配位體或存在於肺上皮細胞上之受體。醫藥組合物及調配物
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑可以醫藥組合物或調配物(在本文中亦稱為「藥劑」)之形式製備。在一些實施例中，醫藥組合物包括至少一種β-ENaC RNAi藥劑。此等醫藥組合物尤其適用於抑制目標細胞、細胞群、組織或生物體中之β-ENaC mRNA表現。醫藥組合物可用於治療患有將得益於目標mRNA含量之降低或目標基因表現之抑制的疾病、病症或病況的個體。醫藥組合物可用於治療處於罹患將得益於目標mRNA之含量降低或目標基因表現之抑制的疾病或病症之風險的個體。在一個實施例中，方法包括向待治療之個體投與連接至如本文所描述之靶向配位體的β-ENaC RNAi藥劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(包括媒劑、載劑、稀釋劑及/或遞送聚合物)添加至包括β-ENaC RNAi藥劑之醫藥組合物中，藉此形成適合於活體內遞送至個體(包括人類)之醫藥調配物或藥劑。
本文所揭示之包括β-ENaC RNAi藥劑之醫藥組合物及方法降低細胞、細胞群、細胞群、組織、器官或個體中之目標mRNA含量，包括藉由向個體投與治療有效量之本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑，藉此抑制個體中之β-ENaC mRNA表現。在一些實施例中，個體已事先鑑定或診斷為患有至少部分地由ENaC表現介導之疾病或病症。在一些實施例中，個體已事先鑑定或診斷為在一或多種細胞或組織中具有增強的ENaC活性。在一些實施例中，個體已事先診斷為患有一或多種呼吸道疾病，諸如囊性纖維化、慢性支氣管炎、非囊性纖維化支氣管擴張、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、原發性纖毛運動障礙，及肺癌囊性纖維化。在一些實施例中，個體已事先診斷為患有一或多種眼病，諸如乾眼症。在一些實施例中，個體已患有與一或多種呼吸道疾病相關之症狀，該一或多種呼吸道疾病與增強的ENaC活性相關或由其引起。
本發明之實施例包括用於將β-ENaC RNAi藥劑遞送至活體內肺上皮細胞之醫藥組合物。此類醫藥組合物可包括例如β-ENaC RNAi藥劑結合至包含整合素靶向配位體之靶向基團。在一些實施例中，整合素靶向配位體包含αvβ6整合素配位體。
在一些實施例中，所描述之包括β-ENaC RNAi藥劑之醫藥組合物用於治療或處理可得益於抑制ENaC表現之個體的臨床表現。在一些實施例中，向需要此類治療之個體投與治療或防治有效量的一或多種醫藥組合物。在一些實施例中，投與所揭示之β-ENaC RNAi藥劑中之任一者可用於降低個體中疾病症狀之數目、嚴重程度及/或頻率。
在一些實施例中，所描述之β-ENaC RNAi藥劑視情況與一或多種另外(亦即第二、第三等)治療劑組合。第二治療劑可為另一β-ENaC RNAi藥劑(例如靶向β-ENaC基因內之不同序列的β-ENaC RNAi藥劑)。在一些實施例中，第二治療劑可為靶向α-ENaC基因之RNAi藥劑。另外治療劑亦可為小分子藥物、抗體、抗體片段及/或適體。β-ENaC RNAi藥劑與或不與一或多種另外治療劑可與一或多種賦形劑組合以形成醫藥組合物。
包括β-ENaC RNAi藥劑之所描述醫藥組合物可用於治療患有將得益於降低或抑制β-ENaC mRNA表現之疾病或病症的個體之至少一種症狀。在一些實施例中，向個體投與治療有效量之一或多種包括β-ENaC RNAi藥劑之醫藥組合物，藉此治療該症狀。在其他實施例中，向個體投與防治有效量之一或多種β-ENaC RNAi藥劑，藉此預防或抑制至少一種症狀。
在一些實施例中，在醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑中向哺乳動物投與所描述β-ENaC RNAi藥劑中之一或多者。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
投藥路徑為藉以使β-ENaC RNAi藥劑與身體接觸之路徑。一般而言，投與藥物、寡核苷酸及核酸以用於治療哺乳動物之方法為此項技術中所熟知且可應用於投與本文所描述之組合物。本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑可經由任何適合途徑以根據特定途徑適當調整之製劑形式投與。因此，在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物係經由吸入、鼻內投藥、氣管內投藥或口咽吸氣投藥來進行投與。在一些實施例中，醫藥組合物可藉由注射(例如靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、關節內或腹膜內或表面地)投與。
包括本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑之醫藥組合物可使用此項技術中已知之寡核苷酸遞送技術遞送至細胞、細胞群、組織或個體。一般而言，此項技術中公認用於遞送核酸分子(活體外或活體內)之任何適合方法均適合與本文所描述之組合物一起使用。舉例而言，可藉由以下方式進行遞送：局部投藥(例如直接注射、植入或表面投藥)、全身性投藥或皮下、靜脈內、腹膜內或非經腸途徑，包括顱內(例如，室內、腦實質內及鞘內)、肌肉內、經皮、氣道(氣霧劑)、經鼻、經口、經直腸或表面(包括經頰及舌下)投藥。在一些實施例中，組合物係經由吸入、鼻內投藥、口咽吸氣投藥或氣管內投藥來投與。舉例而言，在一些實施例中，期望本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑抑制肺上皮中之β-ENaC基因表現，其中經由吸入(例如，藉由吸入器裝置(諸如定量給藥吸入器)或噴霧器(諸如噴射式或振動式網孔噴霧器)或軟霧吸入器)進行投藥係尤其適合且有利的。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。本文所描述之醫藥組合物經調配以用於向個體進行投藥。
如本文所使用，醫藥組合物或藥劑包括藥理學有效量之所描述治療性化合物中之至少一者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為有意地包括於藥物遞送系統中之除活性醫藥成分(API，治療性產品，例如β-ENaC RNAi藥劑)外之物質。賦形劑在預期劑量下不發揮或不意欲發揮治療作用。賦形劑可用於a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支援或增強API之穩定性、生物可用性或患者接受性，c)有助於產物鑑別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括(但不限於)：吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、洗滌劑、聚葡萄糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油、聚合物、防腐劑、鹽水、鹽、溶劑、糖類、界面活性劑、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、驅水劑及濕潤劑。
適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投藥，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。其應在製造及儲存條件下穩定，且應保護其免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇)及其適合之混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)及氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合(視需要)併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入至含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加任何來自其先前無菌過濾溶液之另外所需成分的散劑。
適用於關節內投藥之調配物可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質調配物或可生物降解聚合物系統亦可用於使藥物用於關節內及經眼投藥。
適合於吸入投藥之調配物可藉由將所需量之活性化合物併入適當溶劑中，隨後無菌過濾來製備。一般而言，用於吸入投藥之調配物為處於生理pH之無菌溶液且具有低黏度(＜ 5 cP)。可向調配物中添加鹽以平衡張力。在一些情況下，可添加界面活性劑或共溶劑以增加活性化合物溶解度且改良氣霧劑特性。在一些情況下，可添加賦形劑以控制黏度，從而確保噴霧液滴之大小及分佈。
在一些實施例中，包括適用於吸入投藥之本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的醫藥調配物可在水性磷酸鈉緩衝液中製備(例如，在含0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉之水中調配之β-ENaC RNAi藥劑)。
活性化合物可用將防止化合物自體內快速排除之載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法將為熟習此項技術者顯而易見的。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。
β-ENaC RNAi藥劑可調配於單位劑型之組合物中以便於投藥及給藥均一性。單位劑型係指適合作為單位劑量用於待治療個體之物理離散單元；各單元含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療效果的預定量之活性化合物。本發明之單位劑型之規格由以下因素規定且直接取決於以下因素：活性化合物之獨特特徵及待實現之治療效果，及混配此類用於治療個體之活性化合物的技術中固有之限制。
醫藥組合物可含有通常見於醫藥組合物中之其他另外組分。此類另外組分包括(但不限於)：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑(例如，抗組胺劑、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設想表現或包含本文所定義之RNAi藥劑的細胞、組織或經分離之器官可用作「醫藥組合物」。如本文所使用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡稱「有效量」係指產生藥理學、治療性或預防性結果之RNAi藥劑之量。
在一些實施例中，除了投與本文所揭示之RNAi藥劑以外，本文所揭示之方法進一步包含投與第二治療劑或治療之步驟。在一些實施例中，第二治療劑為另一種β-ENaC RNAi藥劑(例如，靶向β-ENaC目標內之不同序列之β-ENaC RNAi藥劑)。在其他實施例中，第二治療劑可為小分子藥物、抗體、抗體片段及/或適體。
在一些實施例中，本文描述包括至少兩種具有不同序列之β-ENaC RNAi藥劑之組合或混合物的組合物。在一些實施例中，兩種或更多種β-ENaC RNAi藥劑各自分別且獨立地連接至靶向基團。在一些實施例中，兩種或更多種β-ENaC RNAi藥劑各自連接至包括整合素靶向配位體或由其組成之靶向基團。在一些實施例中，兩種或更多種β-ENaC RNAi藥劑各自連接至包括αvβ6整合素靶向配位體或由其組成之靶向基團。
本文描述用於將β-ENaC RNAi藥劑遞送至肺上皮細胞之組合物。此外，本文通常描述用於將β-ENaC RNAi藥劑活體內遞送至細胞(包括腎上皮細胞及/或GI或生殖道中之上皮細胞及/或眼睛中之眼表上皮細胞)之組合物。
一般而言，本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑的有效量將在約0.0001至約20 mg/kg體重/沈積劑量，例如約0.001至約3 mg/kg體重/沈積劑量之範圍內。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有效量將在約0.01至約2.0 mg/kg體重/沈積劑量之範圍內。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有效量將在約0.01至約1.0 mg/kg體重/劑量之範圍內。在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑之有效量將在約0.50至約1.0 mg/kg體重/劑量之範圍內。投藥量亦將可能視諸如患者之整體健康狀況、所遞送之化合物之相關生物學功效、藥物之調配物、調配物中賦形劑之存在及類型及投藥途徑的變數而定。此外，應理解可提高所投與之初始劑量以超出以上上限含量而快速獲得所需血液含量或組織含量，或初始劑量可小於最佳值。在一些實施例中，每天投與劑量。在一些實施例中，每週投與劑量。在其他實施例中，每兩週、每三週、每月一次或每季度一次(亦即，每三個月一次)投與劑量。
為了治療疾病或形成用於治療疾病之藥劑或組合物，本文所描述之包括β-ENaC RNAi藥劑的醫藥組合物可與賦形劑或第二治療劑或治療組合，包括(但不限於)：第二或其他RNAi藥劑、小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。
當添加至醫藥學上可接受之賦形劑或佐劑中時，所描述之β-ENaC RNAi藥劑可封裝至套組、容器、封裝物或分配器中。本文所描述之醫藥組合物可封裝於乾粉或氣霧劑吸入器、其他定量給藥吸入器、噴霧器、預填充注射器或小瓶中。治療方法及表現抑制
本文所揭示之β-ENaC RNAi藥劑可用於治療患有將得益於投與RNAi藥劑之疾病或病症的個體(例如，人類或其他哺乳動物)。在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑可用於治療將得益於β-ENaC mRNA表現降低及/或抑制的個體(例如，人類)。
在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑可用於治療患有個體將得益於ENaC通道活性降低的疾病或病症之個體(例如，人類)，該疾病或病症包括(但不限於)例如囊性纖維化、慢性支氣管炎、非囊性纖維化支氣管擴張、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、原發性纖毛運動障礙及/或肺癌囊性纖維化及/或乾眼症。個體之治療可包括治療性及/或防治性治療。向個體投與治療有效量之本文所描述之任何一或多種β-ENaC RNAi藥劑。個體可為人類、患者或人類患者。個體可為成年人、青年、兒童或嬰兒。可向人類或動物投與本文所描述之醫藥組合物。
已知增加的ENaC活性促進氣道表面液體脫水且減少黏液纖毛清除。在一些實施例中，所描述之β-ENaC RNAi藥劑用於治療個體中至少部分地由ENaC活性水準介導之至少一種症狀。向個體投與治療有效量之所描述之β-ENaC RNAi藥劑中之任一者或多者。在一些實施例中，向個體投與防治有效量之所描述的RNAi藥劑中之任一者或多者，從而藉由預防或抑制至少一種症狀來治療個體。
在某些實施例中，本發明提供治療有需要之患者之至少部分地由β-ENaC基因表現介導的疾病、病症、病況或病理狀態之方法，其中該等方法包括向患者投與本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑中之任一者。
在一些實施例中，β-ENaC RNAi藥劑用於治療或管理個體中之臨床表現或病理狀態，其中臨床表現或病理狀態至少部分地由ENaC表現介導。向個體投與治療有效量之本文所描述的β-ENaC RNAi藥劑或含有β-ENaC RNAi藥劑之組合物中之一或多者。在一些實施例中，方法包含向待治療之個體投與包含本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑的組合物。
在另一態樣中，本發明提供治療(包括防治性或預防性治療)由ENaC活性增強或升高引起之疾病或症狀之方法，該等方法包含向有需要之個體投與β-ENaC RNAi藥劑，其包括包含表2或表3中之序列中之任一者的序列之反義股。本文亦描述用於此類方法中之組合物。
所描述之β-ENaC RNAi藥劑及/或包括β-ENaC RNAi藥劑之組合物可用於治療性治療由ENaC活性水準增強或升高引起之疾病或病況的方法中。此類方法包括向個體(例如，人類或動物個體)投與如本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑。
在另一態樣中，本發明提供用於治療(包括防治性治療)至少部分地由β-ENaC表現介導之病理狀態(諸如病況或疾病)的方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之RNAi藥劑，其包括包含表2或表3中之序列中之任一者的序列之反義股。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投與RNAi藥劑，其包括包含表2或表3中之序列中之任一者的序列之反義股。
在一些實施例中，本文揭示用於治療(包括防治性治療)至少部分地由β-ENaC表現介導之病理狀態的方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之RNAi藥劑，其包括包含表2或表4中之序列中之任一者的序列之有義股。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包含向細胞投與RNAi藥劑，其包括包含表2或表4中之序列中之任一者的序列之有義股。
在一些實施例中，本文揭示用於治療(包括防治性治療)至少部分地由β-ENaC表現介導之病理狀態的方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之RNAi藥劑，其包括包含表4中之序列中之任一者的序列之有義股及包含表3中之序列中之任一者的序列之反義股。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投與RNAi藥劑，其包括包含表4中之序列中之任一者的序列之有義股及包含表3中之序列中之任一者的序列之反義股。
在一些實施例中，本文揭示抑制β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包括向個體投與β-ENaC RNAi藥劑，其包括由表4中之序列中之任一者的核鹼基序列組成之有義股及由表3中之序列中之任一者的核鹼基序列組成之反義股。在其他實施例中，本文揭示抑制β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包括向個體投與β-ENaC RNAi藥劑，其包括由表4中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列組成之有義股及由表3中之經修飾序列中之任一者的經修飾序列組成之反義股。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中β-ENaC基因表現之方法，其中該等方法包括投與一或多種包含闡述於表5A及表5B中之雙螺旋體中之一者的雙螺旋結構的β-ENaC RNAi藥劑。
在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的某些上皮細胞中之β-ENaC基因之基因表現量及/或mRNA含量降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的某些上皮細胞中之ENaC含量或ENaC通道活性水準降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在個體之細胞、細胞群及/或組織中，個體中之基因表現量、蛋白質含量及/或mRNA含量可降低。在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，已投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的某些上皮細胞中之β-ENaC mRNA含量降低至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，已投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的某些上皮細胞中之ENaC異三聚體蛋白質複合物之含量降低至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在個體之細胞、細胞群、組織、血液及/或其他體液中，個體中之ENaC含量可降低。舉例而言，在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，已投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的肺上皮細胞中之β-ENaC mRNA及/或ENaC異三聚體蛋白質複合物之含量降低至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在一些實施例中，相對於投與β-ENaC RNAi藥劑之前的個體或未接受β-ENaC RNAi藥劑之個體，已投與所描述β-ENaC RNAi藥劑之個體的肺上皮細胞亞群(諸如氣道上皮細胞)中之β-ENaC mRNA及/或ENaC異三聚體蛋白質複合物之含量及/或ENaC通道活性水準降低至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。
基因表現量、mRNA含量及蛋白質含量之降低可藉由此項技術中已知之任何方法來評定。β-ENaC mRNA含量、ENaC通道活性水準及/或ENaC異三聚體蛋白質複合物含量之減少或降低在本文中統稱為β-ENaC之減少或降低或者抑制或降低β-ENaC基因表現。本文所闡述之實例說明用於評定β-ENaC基因表現之抑制的已知方法。細胞、組織、器官及非人類生物體
涵蓋包括本文所描述之β-ENaC RNAi藥劑中之至少一者的細胞、組織、器官及非人類生物體。藉由將RNAi藥劑遞送至細胞、組織、器官或非人類生物體來製得細胞、組織、器官或非人類生物體。
上文所提供之實施例及事項現藉由以下非限制性實例說明。實例 實例 1. 合成 β -ENaC RNAi 藥劑 。
展示於表5A及表5B中之β-ENaC RNAi藥劑雙螺旋體係根據以下合成：
A.合成 . 根據寡核苷酸合成中使用之固相胺基磷酸酯技術合成β-ENaC RNAi藥劑之有義股及反義股。視規模而定，使用MerMade96E® (Bioautomation)、MerMade12® (Bioautomation)或OP Pilot 100 (GE Healthcare)。在由受控微孔玻璃(CPG，500 Å或600 Å，獲自Prime Synthesis, Aston, PA, USA)製成之固體載體上進行合成。所有RNA及2'-經修飾RNA胺基磷酸酯係購自Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA)。特定言之，所使用之2'-O-甲基胺基磷酸酯包括以下：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6 -(苯甲醯基)-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基磷酸酯、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N4 -(乙醯基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基-胺基)胺基磷酸酯、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N2 -(異丁醯基)-2'-O-甲基-鳥苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基磷酸酯及5'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基磷酸酯。2'-去氧-2'-氟-胺基磷酸酯帶有與2'-O-甲基RNA胺基酸酯相同之保護基。5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-肌苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基磷酸酯係購自Glen Research (Virginia)。倒置無鹼基(3'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-去氧核糖-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基磷酸酯係購自ChemGenes (Wilmington, MA, USA)。使用以下UNA胺基磷酸酯：5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲醯基)-2',3'-開環-腺苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-乙醯基-2',3'-開環-胞嘧啶、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異-丙基)]-胺基磷酸酯、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-異丁醯基-2',3'-開環-鳥苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯及5'-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基)-2',3'-開環-尿苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異-丙基)]-胺基磷酸酯。TFA胺基連接臂(aminolink)胺基磷酸酯亦係商購的(ThermoFisher)。根據國際專利申請公開案第WO 2017/214112號合成膦酸環丙酯胺基磷酸酯。
將含有三炔烴之胺基磷酸酯溶解於無水二氯甲烷或無水乙腈(50 mM)中，同時將所有其他胺基酸酯溶解於無水乙腈(50 mM)中且添加分子篩(3Å)。5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT，250 mM於乙腈中)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT，250 mM於乙腈中)用作活化劑溶液。偶合時間為10分鐘(RNA)、90秒(2' O-Me)及60秒(2' F)。為了引入硫代磷酸酯鍵，使用3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，獲自PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA)於無水乙腈中之100 mM溶液。
替代地，在合成後引入三炔烴部分(參見以下部分E)。對於此途徑，有義股經含有一級胺之5'及/或3'端核苷酸官能化。將TFA胺基連接臂胺基磷酸酯溶解於無水乙腈(50 mM)中且添加分子篩(3Å)。5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT，250 mM於乙腈中)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT，250 mM於乙腈中)用作活化劑溶液。偶合時間為10分鐘(RNA)、90秒(2' O-Me)及60秒(2' F)。為了引入硫代磷酸酯鍵，使用3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，獲自PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA)於無水乙腈中之100 mM溶液。
B. 載體結合寡聚物之裂解及去除保護 . 在完成固相合成之後，將乾燥之固體載體在30℃下用40 wt%甲胺/水與28%至31%氫氧化銨溶液(Aldrich)之1:1體積溶液處理1.5小時。將溶液蒸發且將固體殘餘物於水中復原(參見下文)。
C. 純化 . 使用TSKgel SuperQ-5PW 13 µm管柱及Shimadzu LC-8系統，藉由陰離子交換HPLC來純化粗寡聚物。緩衝液A為20 mM Tris、5 mM EDTA pH 9.0且含有20%乙腈，且緩衝液B在添加1.5 M氯化鈉之情況下與緩衝液A相同。記錄260 nm下之UV跡線。合併適當溶離份，接著使用裝填有Sephadex G-25細粒及100 mM碳酸氫銨，pH 6.7與20%乙腈或過濾水之操作緩衝液的GE Healthcare XK 16/40管柱進行尺寸排阻HPLC。替代地，將合併之溶離份去鹽且經由切向流過濾將其交換至適當緩衝液或溶劑系統中。
D. 黏接 . 藉由將等莫耳RNA溶液(有義股及反義股)合併於1× PBS (磷酸鹽緩衝鹽水，1×，Corning，Cellgro)中來使互補股混合以形成RNAi藥劑。將一些RNAi藥劑凍乾且儲存在−15至−25℃下。藉由在1× PBS中在UV-Vis光譜儀上量測溶液吸光度來測定雙螺旋體濃度。接著將260 nm下之溶液吸光度乘以換算因數(0.050 mg/(mL∙cm))及稀釋因數以測定雙螺旋體濃度。
E. 三 炔烴連接子之結合 . 在黏接之前或之後，5'或3'胺官能化之有義股結合至三炔烴連接子。可用於形成本文所揭示之構築體的實例三炔烴連接子結構如下：
Figure 02_image093
。以下描述三炔烴連接子與所黏接雙螺旋體之結合：將胺官能化之雙螺旋體以約50-70 mg/mL溶解於90% DMSO/10% H2 O中。添加40當量三乙胺，隨後添加3當量三炔烴-PNP。一旦完成，則將結合物在1×磷酸鹽緩衝鹽水/乙腈(1:14比率)之溶劑系統中沈澱兩次，且乾燥。
F. 合成靶向配位體 SM6.1 ((S)-3-(4-(4-((14- 疊氮基 -3,6,9,12- 四氧雜十四烷基 ) 氧基 ) 萘 -1- 基 ) 苯基 )-3-(2-(4-((4- 甲基吡啶 -2- 基 ) 胺基 ) 丁醯胺基 ) 乙醯胺基 ) 丙酸 )
Figure 02_image095
將化合物5 (第三丁基(4-甲基吡啶-2-基)胺基甲酸酯) (0.501 g，2.406 mmol，1當量)溶解於DMF (17 mL)中。向混合物中添加NaH (0.116 mg，3.01 mmol，1.25當量，於油中之60%分散液)。攪拌混合物10 min，隨後添加化合物20 (4-溴丁酸乙酯(0.745 g，3.82 mmol，0.547 mL)) (Sigma 167118)。在3小時之後，將反應物用乙醇(18 mL)淬滅且濃縮。將濃縮物溶解於DCM (50 mL)中且用飽和NaCl水溶液(1 × 50 mL)洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。在矽膠管柱(梯度0-5%甲醇/DCM)上純化產物。
Figure 02_image097
將化合物21 (0.80 g，2.378 mmol)溶解於100 mL丙酮:0.1 M NaOH [1:1]中。藉由TLC (5%乙酸乙酯/己烷)監測反應。濃縮有機物，且用0.3 M檸檬酸(40 mL)將殘餘物酸化至pH 3-4。用DCM (3 × 75 mL)萃取產物。將有機物合併，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。產物不經進一步純化即使用。
Figure 02_image099
在0℃下，向化合物22 (1.1 g，3.95 mmol，1當量)、化合物45 (595 mg，4.74 mmol，1.2當量)及TBTU (1.52 g，4.74 mmol，1.2當量)於無水DMF (10 mL)中之溶液中添加二異丙基乙胺(2.06 mL，11.85 mmol，3當量)。使反應混合物升溫至室溫且攪拌3小時。藉由飽和NaHCO3 溶液(10 mL)淬滅反應物。將水相用乙酸乙酯(3 × 10 mL)萃取，且將有機相合併，經無水Na2 SO4 乾燥且濃縮。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相來分離產物。LC-MS：計算值[M+H]+ 366.20，實驗值367。
Figure 02_image101
在0℃下，向化合物61 (2 g，8.96 mmol，1當量)及化合物62 (2.13 mL，17.93 mmol，2當量)於無水DMF (10 mL)中之溶液中添加K2 CO3 (2.48 g，17.93 mmol，2當量)。使反應混合物升溫至室溫且攪拌隔夜。藉由水(10 mL)淬滅反應物。將水相用乙酸乙酯(3 × 10 mL)萃取，且將有機相合併，經無水Na2 SO4 乾燥且濃縮。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相來分離產物。
Figure 02_image103
在0℃下，向化合物60 (1.77 g，4.84 mmol，1當量)於THF (5 mL)及H2 O (5 mL)中之溶液中逐份添加單水合氫氧化鋰(0.61 g，14.53 mmol，3當量)。使反應混合物升溫至室溫。在室溫下攪拌3小時之後，將反應混合物藉由HCl (6 N)酸化至pH 3.0。將水相用乙酸乙酯(3 × 20 mL)萃取，且將有機層合併，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。LC-MS：計算值[M+H]+ 352.18，實驗值352。
Figure 02_image105
在-78℃下，向化合物63 (1.88 g，6.0 mmol，1.0當量)於無水THF (20 mL)中之溶液中逐滴添加含n-BuLi之己烷 (3.6 mL，9.0 mmol，1.5當量)。將反應物在-78℃下再保持1小時。接著在-78℃下將硼酸三異丙酯(2.08 mL，9.0 mmol，1.5當量)添加至混合物中。接著使反應升溫至室溫且再攪拌1小時。藉由飽和NH4 Cl溶液(20 mL)淬滅反應物且將pH調節至3。將水相用EtOAc (3 × 20 mL)萃取，且將有機相合併，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。
Figure 02_image107
將化合物12 (300 mg，0.837 mmol，1.0當量)、化合物65 (349 mg，1.256 mmol，1.5當量)、XPhos Pd G2 (13 mg，0.0167 mmol，0.02當量)及K3 PO4 (355 mg，1.675 mmol，2.0當量)混合於圓底燒瓶中。燒瓶用螺帽隔片密封，且接著抽真空且用氮氣回填(重複此過程總共3次)。接著，經由注射器添加THF (8 mL)及水(2 mL)。將混合物用氮氣鼓泡20 min且將反應物在室溫下保持隔夜。將反應物(10 mL)用水淬滅，且將水相用乙酸乙酯(3 × 10 mL)萃取。有機相經Na2 SO4 乾燥，濃縮且經由CombiFlash®使用矽膠作為固定相純化，且用15% EtOAc/己烷溶離。LC-MS：計算值[M+H]+ 512.24，實驗值512.56。
Figure 02_image109
將化合物66 (858 mg，1.677 mmol，1.0當量)藉由冰浴冷卻。將含HCl之二㗁烷(8.4 mL，33.54 mmol，20當量)添加至燒瓶中。使反應升溫至室溫且再攪拌1小時。藉由旋轉式蒸發器移除溶劑且產物不經進一步純化即直接使用。LC-MS：計算值[M+H]+ 412.18，實驗值412.46。
Figure 02_image111
在0℃下，向化合物64 (500 mg，1.423 mmol，1當量)、化合物67 (669 mg，1.494 mmol，1.05當量)及TBTU (548 mg，0.492 mmol，1.2當量)於無水DMF (15 mL)中之溶液中添加二異丙基乙胺(0.744 mL，4.268 mmol，3當量)。使反應混合物升溫至室溫且再攪拌1小時。藉由飽和NaHCO3 水溶液(10 mL)淬滅反應物且用乙酸乙酯(3 × 20 mL)萃取產物。將有機相合併，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。將產物藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相純化且用3-4%甲醇/DCM溶離。產率為96.23%。LC-MS：計算值[M+H]+ 745.35，實驗值746.08。
Figure 02_image113
在室溫下，向化合物68 (1.02 g，1.369 mmol，1當量)於乙酸乙酯(10 mL)中之溶液中添加10% Pd/C (0.15 g，50% H2 O)。使反應混合物升溫至室溫且藉由LC-MS監測反應。將反應物在室溫下保持隔夜。經由Celite®濾出固體且藉由旋轉式蒸發器移除溶劑。產物不經進一步純化即直接使用。LC-MS：[M+H]+ 655.31，實驗值655.87。
Figure 02_image115
在0℃下，向化合物69 (100 mg，0.152 mmol，1當量)及疊氮基-PEG5 -OTs (128 mg，0.305 mmol，2當量)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加K2 CO3 (42 mg，0.305 mmol，2當量)。將反應混合物在80℃下攪拌6小時。藉由飽和NaHCO3 溶液淬滅反應物且用乙酸乙酯(3 × 10 mL)萃取水層。將有機相合併，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。LC-MS：計算值[M+H]+ 900.40，實驗值901.46。
Figure 02_image117
在室溫下，向化合物72 (59 mg，0.0656 mmol，1.0當量)於THF (2 mL)及水(2 mL)中之溶液中添加氫氧化鋰(5 mg，0.197 mmol，3.0當量)。將混合物在室溫下再攪拌1小時。藉由HCl (6N)將pH調節至3.0，且用EtOAc (3 × 10 mL)萃取水相。將有機相合併，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。將TFA (0.5 mL)及DCM (0.5 mL)添加至殘餘物中且將混合物在室溫下再攪拌3小時。藉由旋轉式蒸發器移除溶劑。LC-MS：計算值[M+H]+ 786.37，實驗值786.95。
G. 合成 TriAlk 14
可使用以下展示之合成途徑合成如上表6中所展示之TriAlk14及(TriAlk14)s。可使用標準寡核苷酸合成技術將化合物14作為胺基磷酸酯添加至有義股中，或可在醯胺偶合反應中將化合物22結合至包含胺之有義股。
Figure 02_image119
向3-L夾套反應器中添加500 mL DCM及4 (75.0 g，0.16 mol)。將反應物之內部溫度冷卻至0℃且添加TBTU (170.0 g，0.53 mol)。接著用胺5 (75.5 g，0.53 mol)逐滴處理懸浮液，保持內部溫度低於5℃。接著用DIPEA (72.3 g，0.56 mol)緩慢處理反應物，保持內部溫度低於5℃。在添加完成之後，使反應物在1小時內升溫至23℃，且使其攪拌3小時。添加所有三種試劑之10%助促進劑(kicker charge)且使其再攪拌3小時。當剩餘＜1%之4 時，認為反應完成。將反應混合物用飽和氯化銨溶液(2 × 500 mL)洗滌且用飽和碳酸氫鈉溶液(500 mL)洗滌一次。接著將有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮為油狀物。粗油之質量為188 g，根據QNMR，其含有72%之6 。將粗油送至下一步驟。C46 H60 N4 O11 之質量計算值= 845.0 m/z。實驗值[M+H] = 846.0。
Figure 02_image121
將121.2 g含有72 wt%化合物6 (86.0 g，0.10 mol)之粗油溶解於DMF (344 mL)中且用TEA (86 mL，20 v/v%)處理，保持內部溫度低於23℃。經由HPLC方法1監測二苯并富烯(DBF)之形成相對於Fmoc-胺6 之消耗(圖2)且反應在10小時內完成。向溶液中添加戊二酸酐(12.8 g，0.11 mol)且將中間物胺7 在2小時內轉化為化合物8 。完成後，在30℃下減壓移除DMF及TEA，產生100 g粗油。由於化合物7 於水中之高溶解度，不可使用水處理，且層析為移除DBF、TMU及戊二酸酐之唯一方式。將粗油(75 g)分三份在Teledyne ISCO Combi-flash®純化系統上進行純化。將粗油(25 g)負載至330 g矽膠管柱上且由0-20%甲醇/DCM在30分鐘內溶離，產生42 g之化合物8 (54%產率，歷經3個步驟)。C36 H55 N4 O12 之質量計算值= 736.4 m/z。實驗值[M+H] = 737.0。
Figure 02_image123
將化合物8 (42.0 g，0.057 mol)在使用之前用10體積之乙腈共汽提以自層析溶劑移除任何殘餘甲醇。將油再溶解於DMF (210 mL)中且冷卻至0℃。溶液用4-硝基苯酚(8.7 g，0.063 mol)，隨後用EDC-鹽酸鹽(12.0 g，0.063 mol)處理，且發現在10小時內達到完成。將溶液冷卻至0℃且添加10體積乙酸乙酯，隨後添加10體積飽和氯化銨溶液，保持內部溫度低於15℃。使各層分離且用鹽水洗滌乙酸乙酯層。將合併之水層用5體積乙酸乙酯萃取兩次。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮為油狀物。將粗油(55 g) 分三份在Teledyne ISCO Combi-Flash®純化系統上進行純化。將粗油(25 g)負載至330 g矽膠管柱上且由0-10%甲醇/DCM在30分鐘內溶離，產生22 g之純9 ( 化合物 22) (50%產率)。C42 H59 N5 O14 之質量計算值= 857.4 m/z。實驗值[M+H] = 858.0。
Figure 02_image125
將酯9 (49.0 g，57.1 mmol)及6-胺基-1-己醇(7.36 g，6.28 mmol)於二氯甲烷(3體積)中之溶液用三乙胺(11.56 g，111.4 mmol)逐滴處理。藉由觀測HPLC方法1中化合物9之消失來監測反應，且發現在10分鐘內完成。將粗反應混合物用5體積二氯甲烷稀釋且用飽和氯化銨(5體積)及鹽水(5體積)洗滌。將有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮為油狀物。在Teledyne ISCO Combi-flash®純化系統上使用330 g矽膠管柱來純化粗油。將4-硝基苯酚用100%乙酸乙酯溶離且使用20%甲醇/DCM自管柱沖洗10 ，產生無色油狀物(39 g，81%產率)。C42 H69 N5 O12 之質量計算值= 836.0 m/z。實驗值[M+H] = 837.0。
Figure 02_image127
將醇10 用10體積之乙腈共汽提兩次以自層析溶劑移除任何殘餘甲醇，且再次用無水二氯甲烷(KF ＜ 60 ppm)共汽提以移除痕量水。將醇10 (2.30 g，2.8 mmol)溶解於5體積無水二氯甲烷(KF ＜ 50 ppm)中且用二異丙銨四氮唑(188 mg，1.1 mmol)處理。將溶液冷卻至0℃且用2-氰基乙基N,N,N',N'-四異丙基胺基磷酸酯(1.00 g，3.3 mmol)逐滴處理。將溶液自冰浴移除且在20℃下攪拌。發現反應在3-6小時內完成。將反應混合物冷卻至0℃且用10體積之飽和碳酸氫銨/鹽水之1:1溶液處理，且接著在1分鐘內升溫至環境溫度且使其在20℃下再攪拌3分鐘。將兩相混合物轉移至分液漏斗且添加10體積之二氯甲烷。將有機層分離，且用10體積之飽和碳酸氫鈉溶液洗滌以水解未反應之雙磷試劑。將有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮為油狀物，產生3.08 g之94 wt%化合物14。C51 H86 N7 O13 P之質量計算值= 1035.6 m/z。實驗值[M+H] = 1036。
H. 靶向配位體之結合 .  在黏接之前或在黏接之後，5'或3'三齒炔烴官能化之有義股結合至靶向配位體。以下實例描述靶向配位體與經黏接雙螺旋體之結合：在去離子水中製備0.5 M參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA)、0.5 M五水合硫酸Cu(II) (Cu(II)SO4 ·5H2 O)及2 M抗壞血酸鈉溶液之儲備溶液。製備靶向配位體之75 mg/mL DMSO溶液。在含有三炔烴官能化之雙螺旋體(3 mg，75 µL，40 mg/mL於去離子水中，約15,000 g/mol)之1.5 mL離心管中，添加25 µL的1 M Hepes pH 8.5緩衝液。在渦旋之後，添加35 µL之DMSO且將溶液渦旋。將靶向配位體添加至反應物(6當量/雙螺旋體，2當量/炔烴，約15 µL)中，且將溶液渦旋。使用pH紙檢測pH，且確認pH為約8。在另一1.5 mL離心管中，將50 µL之0.5 M THPTA與10 µL之0.5 M Cu(II)SO4 ·5H2 O混合，渦旋，且在室溫下培育5 min。在5分鐘之後，將THPTA/Cu溶液(7.2 µL，6當量5:1 THPTA:Cu)添加至反應小瓶中，且渦旋。緊接著，將2 M抗壞血酸酯(5 µL，每雙螺旋體50當量，每炔烴16.7)添加至反應小瓶且渦旋。一旦反應完成(通常在0.5-1 h內完成)，即立刻藉由非變性陰離子交換層析純化反應物。 實例 2. β -ENaC RNAi 藥劑於大鼠中之活體內氣管內投藥 . 在研究第1天，雄性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)係經由適合於氣管內(IT)投藥之微型噴霧器裝置(Penn Century，Philadelphia，PA)投與200微升等張性鹽水或0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2 mg/kg之β-ENaC RNAi藥劑AD06284或0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2 mg/kg之β-ENaC RNAi藥劑AD06285 (各RNAi藥劑不連接至靶向配位體且調配於等張性鹽水中)。每組對四(4)隻大鼠進行給藥。在研究第8天處死大鼠，且在收集及均質化兩個肺之後分離總RNA。大鼠β-ENaC (SCNN1B) mRNA表現係藉由基於探針之定量PCR進行定量，標準化為大鼠GAPDH表現，且表示為媒劑對照組之分數(幾何平均值，+/- 95%信賴區間)。表 7. 實例2中處死時(第8天)之平均相對大鼠β-ENaC mRNA表現
組ID 平均相對r β-ENaC mRNA 表現 ( 各組之n=4) 低 ( 誤差) 高 ( 誤差)
第1 組 (等張性鹽水) 1.000 0.125 0.143
第2 組 (0.5 mg/kg AD06284) 0.734 0.039 0.041
第3 組 (1.0 mg/kg AD06284) 0.876 0.162 0.199
第4 組 (2.0 mg/kg AD06284) 0.641 0.126 0.156
第5 組 (0.5 mg/kg AD06285) 0.962 0.065 0.070
第6 組 (1.0 mg/kg AD06285) 0.926 0.118 0.135
第7 組 (2.0 mg/kg AD06285) 0.774 0.146 0.180
實例 3 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於大鼠中之活體內氣管內投藥 .
在研究第1天，雄性史泊格多利大鼠係經由適合於氣管內(IT)投藥之微型噴霧器裝置(Penn Century，Philadelphia，PA)投與200微升等張性鹽水，或在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1，參見圖3)之0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2.0 mg/kg之β-ENaC RNAi藥劑AD06284。每組對五(5)隻大鼠進行給藥。在研究第8天處死大鼠，且在收集及均質化兩個肺之後分離總RNA。大鼠β-ENaC (SCNN1B) mRNA表現係藉由基於探針之定量PCR進行定量，標準化為大鼠GAPDH表現，且表示為媒劑對照組之分數(幾何平均值，+/- 95%信賴區間)。表 8. 實例3中處死時(第8天)之平均相對rβ-ENaC mRNA表現
組ID 平均相對rβ-ENaC mRNA 表現 ( 各組之n=5) 低 ( 誤差) 高 ( 誤差)
第1 組 (等張性鹽水) 1.000 0.062 0.066
第2 組 (0.5 mg/kg AD06284) 0.984 0.339 0.518
第3 組 (1.0 mg/kg AD06284) 0.859 0.128 0.151
第4 組 (2.0 mg/kg AD06284) 0.901 0.345 0.560
實例 4. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於大鼠中之活體內氣管內投藥 .
在研究第1天，根據表9中所述之以下給藥組，雄性史泊格多利大鼠係經由適合於氣管內(IT)投藥之微型噴霧器裝置(Penn Century，Philadelphia，PA)投與200微升適用作對照之等張性鹽水媒劑或以下β-ENaC RNAi藥劑中之一者：表 9. 實例4中之大鼠給藥組
組 RNAi 藥劑及劑量
1 等張性鹽水(無RNAi藥劑)
2 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06284。
3 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06499。
4 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06494。
5 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06495。
6 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06496。
7 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06497。
8 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06498。
9 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.5 mg/kg之AD06501。
(Tri-SM6.1之化學結構參見例如圖3)。
各組對五(5)隻大鼠進行給藥(n=5)。在研究第8天處死大鼠，且在收集及均質化兩個肺之後分離總RNA。大鼠β-ENaC (SCNN1B) mRNA表現係藉由基於探針之定量PCR進行定量，標準化為大鼠GAPDH表現，且表示為媒劑對照組之分數(幾何平均值，+/- 95%信賴區間)。表 10. 實例4中處死時(第8天)之平均相對rβ-ENaC mRNA表現
組ID 平均相對rβ-ENaC mRNA 表現 低 ( 誤差) 高 ( 誤差)
第1 組 (等張性鹽水) 1.000 0.161 0.192
第2 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06284) 0.877 0.173 0.216
第3 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06499) 0.827 0.130 0.154
第4 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06494) 0.623 0.072 0.081
第5 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06495) 0.887 0.083 0.092
第6 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06496) 0.775 0.092 0.104
第7 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06497) 0.558 0.057 0.064
第8 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06498) 0.873 0.070 0.076
第9 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06501) 0.750 0.152 0.190
實例 5. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於大鼠中之活體內氣管內投藥 .
在研究第1天，根據表11中所述之以下給藥組，雄性史泊格多利大鼠係經由適合於氣管內(IT)投藥之微型噴霧器裝置(Penn Century，Philadelphia，PA)投與200微升適用作對照之等張性鹽水媒劑或以下β-ENaC RNAi藥劑中之一者：表 11. 實例5中之大鼠給藥組
組 RNAi 藥劑及劑量 收集日
1 等張性鹽水(無RNAi藥劑) 第8天
2 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之1.0 mg/kg之AD06497。 第8天
3 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之1.0 mg/kg之AD06497。 第15天
4 在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之1.0 mg/kg之AD06497。 第22天
(Tri-SM6.1之化學結構參見例如圖3)。
各組對五(5)隻大鼠進行給藥(n=5)。在根據上表11中之時程在第8天、第15天或第22天處死大鼠，且在收集及均質化兩個肺之後分離總RNA。β-ENaC (SCNN1B) mRNA表現係藉由基於探針之定量PCR進行定量，標準化為GAPDH表現，且表示為媒劑對照組之分數(幾何平均值，+/- 95%信賴區間)。表 12. 實例5中處死時之平均相對rENaC mRNA表現
組ID 平均相對r β-ENaC mRNA 表現 低 ( 誤差) 高 ( 誤差)
第1 組 (等張性鹽水，第8天收集) 1.000 0.099 0.110
第2 組 (1.0 mg/kg Tri-SM6.1-AD06497，第8天收集) 0.491 0.035 0.037
第3 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06497，第15天收集) 0.497 0.061 0.070
第4 組 (0.5 mg/kg Tri-SM6.1-AD06497，第22天收集) 0.436 0.062 0.073
實例 6. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
黏液纖毛清除(MCC)已展示為與囊性纖維化(CF)患者中肺功能(FEV1 )改善相關。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊在研究第1天、第2天及第3天之三個連續日(亦即，三個總劑量)內接受在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之0.22 mg/kg或0.5 mg/kg之霧化的β-ENaC RNAi藥劑AD06598 (在圖9及圖20中稱為APERC-2)之單一每天吸入劑量。將給藥體積為17.5 mL (0.5 mg/kg)或8.75 mL (0.22 mg/kg)濃度為10 mg/mL之β-ENaC RNAi藥劑AD06598霧化且經由鼻插管向綿羊投與。測試各組中之三隻綿羊(n=3)。在第17天(在最終劑量之後兩週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
如圖9中所展示，投與β-ENaC RNAi藥劑劑量依賴性地展示在給藥之後兩週MCC增加超過基線量測值。觀察到之MCC增加與改善之氣道水合作用一致。 實例 7. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
在綿羊黏液纖毛清除(MCC)模型中評估β-ENaC RNAi藥劑。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊接受0.5 mg/kg之以下單一吸入劑量：1)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD06598 (稱為APERC-2)；或2)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (稱為APERC-5)。將給藥體積為17.5 mL，濃度為10 mg/mL之各各別β-ENaC RNAi藥劑霧化且經由鼻插管向綿羊投與。用APERC-2測試一隻綿羊(n=1)，且在APERC-5組中測試三隻綿羊(n=3)。在第14天(在單次劑量之後兩週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
舉例而言，當完全結合及黏接時，APERC-2具有以下有義股及反義股結構：經修飾有義股 (5' à3') ： (TriSM6.1-avb6-TA14)gscaacuguUfAfCfaucuucaacas(invAb) (SEQ ID NO: 187)經修飾反義股 (5' à3') ： cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO: 138) 對於(TriSM6.1-avb6-TA14)之結構，參見圖22。有義股基礎鹼基序列 (5' à3') GCAACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO: 227)反義股基礎鹼基序列 (5' à3') UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 203)
如圖20中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD06598 (APERC-2)展示在給藥之後兩週MCC增加超過基線量測值。舉例而言，在2小時時間點(120分鐘)，單一0.5 mg/kg劑量之APERC-2導致第14天比基線增加76%。(參見圖20)。
此外，如圖11中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (APERC-5)亦展示在給藥之後兩週MCC增加超過基線量測值。舉例而言，在兩小時時間點，單一0.5 mg/kg劑量之APERC-5導致第14天比基線增加124%。(參見圖11)。 實例 8. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
在綿羊黏液纖毛清除(MCC)模型中評估β-ENaC RNAi藥劑。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊接受0.5 mg/kg之以下單一吸入劑量：1)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (稱為APERC-7)；或2)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至進一步包括半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺連接子之三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (稱為APERC-8) (包括半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺連接子之αvβ6上皮細胞靶向配位體Tri-SM6.1之化學結構參見圖23)；或3)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD06599 (稱為APERC-9)。將給藥體積為17.5 mL，濃度為10 mg/mL之各別β-ENaC RNAi藥劑霧化且經由鼻插管向綿羊投與。除APERC-7向三隻綿羊(n=3)投與之外，測試各組中之一隻綿羊(n=1)。在第14天(在單次劑量之後兩週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
舉例而言，當完全結合及黏接時，APERC-7具有以下有義股及反義股結構：經修飾有義股 (5' à 3') ： (TriSM6.1-avb6-TA14)gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacus(invAb) (SEQ ID NO: 188)經修飾反義股 (5' à 3') ： asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO: 127) 對於(TriSM6.1-avb6-TA14)之結構，參見圖22。有義股基礎鹼基序列 (5' à 3') GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO: 229)反義股基礎鹼基序列 (5' à 3') AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO: 195)
可使用有義股之5'端處官能化之TriAlk14基團合成APERC-7之結合構築體(上表5A及表5B中之AD07482)。替代地，有義股之5'端處的NH2 -C6 基團(AD07217)可與化合物22 (上文實例1，部分e)偶合以產生結構上相同之中間物。使用任一方法，可獲得相同之最終構築體。
如圖10中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (APERC-7)展示在給藥之後兩週MCC增加超過基線量測值，在兩小時時間點第14天比基線增加78%。
類似地，如圖19中所展示，投與結合至具有半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺連接子之三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (APERC-8)在兩小時時間點展示第14天比基線增加110%。
如圖18中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD06599 (APERC-9)在兩小時時間點展示第14天比基線增加58%。 實例 9. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
在綿羊黏液纖毛清除(MCC)模型中評估β-ENaC RNAi藥劑。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊接受0.5 mg/kg之以下單一吸入劑量：1)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07240 (稱為APERC-10)；或2)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07250 (稱為APERC-11)；或3)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07251 (稱為APERC-12)。將給藥體積為17.5 mL，濃度為10 mg/mL之各各別β-ENaC RNAi藥劑霧化且經由鼻插管向綿羊投與。測試各組中之一隻綿羊(n=1)。在第14天(在單次劑量之後兩週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
如圖17中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07240 (APERC-10)在兩小時時間點展示第14天比基線增加82%。如圖16中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07250 (APERC-11)在兩小時時間點展示第14天比基線增加134%。且如圖15中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07251 (APERC-12)在兩小時時間點展示第14天比基線增加102%。 實例 10. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
在綿羊黏液纖毛清除(MCC)模型中評估β-ENaC RNAi藥劑。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊接受0.5 mg/kg之以下單一吸入劑量：1)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07252 (稱為APERC-13)；或2)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07253 (稱為APERC-14)；或3)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07255 (稱為APERC-16)。將給藥體積為17.5 mL，濃度為10 mg/mL之各各別β-ENaC RNAi藥劑霧化且經由鼻插管向綿羊投與。測試各組中之一隻綿羊(n=1)。在第14天(在單次劑量之後兩週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
如圖17中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07252 (APERC-13)在兩小時時間點展示第14天比基線增加62%。如圖16中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07253 (APERC-14)在兩小時時間點展示第14天比基線增加94%。且如圖15中所展示，投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07255 (APERC-16)在兩小時時間點展示第14天比基線增加102%。 實例 11. 結合至上皮細胞靶向配位體之 β -ENaC RNAi 藥劑於 綿羊中之霧化投藥 .
在綿羊黏液纖毛清除(MCC)模型中評估β-ENaC RNAi藥劑。首先在正常綿羊中藉由吸入霧化之鎝標記之硫膠體量測MCC，隨後在兩小時內進行伽瑪成像以建立基線水準。在建立基線之後三天開始，正常綿羊接受0.5 mg/kg之以下單一吸入劑量：1)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (稱為APERC-7)；或2)在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之霧化β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (稱為APERC-5)。將給藥體積為17.5 mL，濃度為10 mg/mL之各各別β-ENaC RNAi藥劑霧化且經由鼻插管向綿羊投與。測試各組中之兩隻綿羊(n=2)。在第21天(在單次劑量之後三週)，再次向綿羊吸入投與霧化之鎝標記之硫膠體，隨後在兩小時內進行伽瑪成像。
如圖10中所展示，第21天投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (APERC-7)繼續展示在兩小時時間點比基線增加17%。且如圖11中所展示，第21天投與結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (APERC-5)繼續展示在兩小時時間點比基線增加56%。其他實施例
應理解，雖然本發明已結合其實施方式描述，但前述描述意欲說明且不限制本發明之範疇，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍之範疇界定。其他態樣、優勢及修改係在以下申請專利範圍之範疇內。
圖 1. 本文中稱為Tri-SM2之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 2. 本文中稱為Tri-SM1之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 3. 本文中稱為Tri-SM6.1之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 4. 本文中稱為Tri-SM9之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 5. 本文中稱為Tri-SM6之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 6. 本文中稱為Tri-SM8之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 7. 本文中稱為Tri-SM10之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 8. 本文中稱為Tri-SM11之三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示。
圖 9. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD06598的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例6中更全面描述。
圖 10. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (稱為「APERC-7」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例8及11中更全面描述。
圖 11. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (稱為「APERC-5」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例7及11中更全面描述。
圖 12. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07255 (稱為「APERC-16」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例10中更全面描述。
圖 13. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07253 (稱為「APERC-14」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例10中更全面描述。
圖 14. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07252 (稱為「APERC-13」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例10中更全面描述。
圖 15. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07251 (稱為「APERC-12」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例9中更全面描述。
圖 16. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07250 (稱為「APERC-11」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例9中更全面描述。
圖 17. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07240 (稱為「APERC-10」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例9中更全面描述。
圖 18. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD06599 (稱為「APERC-9」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例8中更全面描述。
圖 19. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至具有半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺連接子之三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (稱為「APERC-8」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例8中更全面描述。
圖 20. 投與在等張性鹽水中調配的在有義股之5'端末端處結合至三齒小分子αvβ6上皮細胞靶向配位體(Tri-SM6.1)之β-ENaC RNAi藥劑AD06598 (稱為「APERC-2」)的綿羊中之黏液纖毛清除水準，如實例7中更全面描述。
圖 21A. β-ENaC RNAi藥劑AD06495 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。 以下縮寫用於圖21A至圖21L中：a、c、g及u為2'-O-甲基修飾之核苷酸；Af、Cf、Gf及Uf為2'-氟修飾之核苷酸；o為磷酸二酯鍵；s為硫代磷酸酯鍵；invAb為倒置無鹼基殘基(參見表6)；a_2N為2'-O-甲基-2-胺基腺苷修飾之核苷酸(參見表6)；cPrpa為5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷修飾之核苷酸(參見表6)，且cPrpu為5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷修飾之核苷酸。
圖 21B. β-ENaC RNAi藥劑AD06497 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21C. β-ENaC RNAi藥劑AD06501 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21D. β-ENaC RNAi藥劑AD06598 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21E. β-ENaC RNAi藥劑AD06599 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21F. β-ENaC RNAi藥劑AD07099 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21G. β-ENaC RNAi藥劑AD07217 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(NH2-C6)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21H. β-ENaC RNAi藥劑AD07482 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21I. β-ENaC RNAi藥劑AD07250 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21J. β-ENaC RNAi藥劑AD07240(參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21K . β-ENaC RNAi藥劑AD07453 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(NH2-C6)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 21L. β-ENaC RNAi藥劑AD07255 (參見表3、表4、表5A及表5B)之經修飾有義股及反義股之示意圖，其中(TriAlk14)鍵聯基團(化學結構參見表6)位於有義股之5'端末端以促進與一或多個靶向配位體之連接，諸如(例如)本文圖1至圖8中所描繪的彼等。
圖 22. 呈游離酸形式之連接至TriAlk14骨架鍵聯基團之本文中稱為Tri-SM6.1的三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示(本文中描述為(TriSM6.1-avb6-TA14))，其中
Figure 02_image003
包含β-ENaC RNAi藥劑。
圖 23. 呈游離酸形式之進一步包括半胱胺酸-順丁烯二醯亞胺連接子之連接至TriAlk14骨架鍵聯基團的本文中稱為Tri-SM6.1的三齒αvβ6上皮細胞靶向配位體之化學結構表示，其中
Figure 02_image005
包含β-ENaC RNAi藥劑。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (59)

  1. 一種用於抑制β-ENaC基因表現之RNAi藥劑，其包含： 反義股，其包含與表2或表3中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸；及 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表2或表3中所提供之序列中之任一者的核苷酸2-18。
  3. 如請求項1或請求項2之RNAi藥劑，其中該有義股包含與表2或表4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，且其中該有義股在該17個連續核苷酸內具有與該反義股至少85%互補之區域。
  4. 如請求項1至3中任一項之RNAi藥劑，其中該β-ENaC RNAi藥劑之至少一個核苷酸為經修飾核苷酸或包括經修飾核苷間鍵聯。
  5. 如請求項1至3中任一項之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
  6. 如請求項4至5中任一項之RNAi藥劑，其中該經修飾核苷酸係選自由以下組成之群：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2',3'-開環(seco)核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2'-F-阿拉伯糖核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、倒置(inverted)核苷酸、倒置2'-O-甲基核苷酸、倒置2'-去氧核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-烷基修飾之核苷酸、N-𠰌啉基(morpholino)核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸、含有膦酸環丙酯之核苷酸，及3'-O-甲基核苷酸。
  7. 如請求項5之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有核苷酸經2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸或其組合修飾。
  8. 如請求項1至7中任一項之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3中所提供之經修飾序列中之任一者的核苷酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含表4中所提供之經修飾序列中之任一者的核苷酸序列。
  10. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3中所提供之經修飾序列中之任一者的核苷酸序列，且該有義股包含表4中所提供之經修飾序列中之任一者的核苷酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑連接至靶向配位體。
  12. 如請求項11之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含整合素靶向配位體。
  13. 如請求項12之RNAi藥劑，其中該整合素靶向配位體為αvβ6整合素靶向配位體。
  14. 如請求項13之RNAi藥劑，其中該αvβ6整合素靶向配位體具有圖1至8之結構中任一者所表示的結構。
  15. 如請求項11至14中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體結合至該有義股。
  16. 如請求項15之RNAi藥劑，其中該靶向配位體結合至該有義股之5'端。
  17. 如請求項1至16中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股之長度為18至30個核苷酸，且該反義股之長度為18至30個核苷酸。
  18. 如請求項17之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為18至27個核苷酸。
  19. 如請求項18之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為18至24個核苷酸。
  20. 如請求項19之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21個核苷酸。
  21. 如請求項20之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑具有兩個鈍端。
  22. 如請求項1至21中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個端帽。
  23. 如請求項1至22中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個倒置無鹼基殘基。
  24. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑包含有義股及反義股，形成具有表5A及5B中之雙螺旋體中任一者之結構的雙螺旋體(duplex)。
  25. 如請求項24之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
  26. 如請求項24至25中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑之該有義股連接至靶向配位體。
  27. 如請求項26之RNAi藥劑，其中該靶向配位體對表現於上皮細胞上之細胞受體具有親和力。
  28. 如請求項26至27中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體對αvβ6整合素受體具有親和力。
  29. 如請求項26至28中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含結構：
    Figure 03_image129
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image131
    指示與該RNAi藥劑之連接點。
  30. 如請求項1之RNAi藥劑，其包含由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： AAGUCGAUGAUGAUCUCCCCA (SEQ ID NO:194)； AGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:195)； UUGUUGUAGUCACUGUAGACG (SEQ ID NO:198)； UCGUGUUGUAGUCACUGUAGG (SEQ ID NO:199)； UGUUGUUGCAGUAUUUCUCCC (SEQ ID NO:201)；或 UGUUGAAGAUGUAACAGUUGC (SEQ ID NO:203)。
  31. 如請求項30之RNAi藥劑，其中該有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： CGUCUACAGUGACUACAACAA (SEQ ID NO:217)；或 CCUACAGUGACUACAACACIA (SEQ ID NO:219)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 GGGAGAAAUACUGCAACAACA (SEQ ID NO:222)；或 GCAACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:223)；或 UGGGGAGAUCAUCAUCIACUU (SEQ ID NO:224)，其中I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸；或 GCAACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:227)；或 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACU (SEQ ID NO:229)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸；或 GC(A2N )ACUGUUACAUCUUCAACA (SEQ ID NO:230)，其中A2N 表示含2-胺基腺嘌呤之核苷酸。
  32. 如請求項30或31之RNAi藥劑，其中所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
  33. 如請求項1之RNAi藥劑，其包含反義股，該反義股包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： asAfsgsUfcGfaUfgAfuGfaUfcUfcCfcCfsa (SEQ ID NO:126)； asGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:127)； usUfsgsUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfaCfsg (SEQ ID NO:130)； usCfsgsUfgUfuGfuAfgUfcAfcUfgUfaGfsg (SEQ ID NO:131)； usGfsusUfgUfuGfcAfgUfaUfuUfcUfcCfsc (SEQ ID NO:135)；及 cPrpusGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:138)； cPrpuGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:150)； cPrpasGfsusUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:153)；或 cPrpaGfuUfgAfagaugUfaAfcAfgUfuGfsc (SEQ ID NO:154)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵聯；且其中該有義股上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
  34. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該有義股包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與以下核苷酸序列(5' à 3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾核苷酸序列： csgucuacaGfUfGfacuacaacaa (SEQ ID NO:234)； cscuacaguGfAfCfuacaacacia (SEQ ID NO:235)； gsggagaaaUfAfCfugcaacaaca (SEQ ID NO:236)；或 gscaacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:237)； usggggagaUfCfAfucauciacuu (SEQ ID NO:238)； gscaacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:239)； gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaacu (SEQ ID NO:240)； gsca_2NacuguUfAfCfaucuucaaca (SEQ ID NO:241) 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；cPrpa及cPrpu分別表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷或尿苷，且s表示硫代磷酸酯鍵聯；且其中該反義股上之所有或實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸。
  35. 如請求項30至34中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股在核苷酸序列之3'端、核苷酸序列之5'端或兩者進一步包括倒置無鹼基殘基。
  36. 如請求項30至35中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑之該有義股連接至靶向配位體。
  37. 如請求項36之RNAi藥劑，其中該靶向配位體對整合素αvβ6具有親和力。
  38. 如請求項37之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含結構：
    Figure 03_image133
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image135
    指示與該RNAi藥劑之連接點。
  39. 一種組合物，其包含如請求項1至38中任一項之RNAi藥劑，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  40. 如請求項39之組合物，其進一步包含能夠抑制α-ENaC (SCNN1A)、β-ENaC (SCNN1B)或γ-ENaC (SCNN1G)表現之第二RNAi藥劑。
  41. 如請求項39至40中任一項之組合物，其進一步包含一或多種另外治療劑。
  42. 如請求項39之組合物，其中該組合物經調配用於吸入投藥。
  43. 如請求項42之組合物，其中該組合物係藉由定量給藥吸入器、噴射式噴霧器、振動式網孔噴霧器或軟霧(soft mist)吸入器遞送。
  44. 一種用於抑制細胞中之β-ENaC基因表現之方法，該方法包含向細胞中引入有效量的如請求項1至38中任一項之RNAi藥劑或如請求項39至43中任一項之組合物。
  45. 如請求項44之方法，其中該細胞係在個體內。
  46. 如請求項45之方法，其中該個體為人類個體。
  47. 如請求項44至46中任一項之方法，其中在投與該RNAi藥劑後，抑制該β-ENaC基因表現至少約30%。
  48. 一種治療與ENaC活性水準增強或升高相關之一或多種症狀或疾病之方法，該方法包含向有需要之人類個體投與治療有效量之如請求項39至43中任一項之組合物。
  49. 如請求項48之方法，其中該疾病為呼吸道疾病。
  50. 如請求項49之方法，其中該呼吸道疾病為囊性纖維化、慢性支氣管炎、非囊性纖維化支氣管擴張、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、原發性纖毛運動障礙，或肺癌囊性纖維化。
  51. 如請求項50之方法，其中該疾病為慢性阻塞性肺病(COPD)。
  52. 如請求項48之方法，其中該疾病為眼病。
  53. 如請求項52之方法，其中該眼病為乾眼症候群。
  54. 如請求項48至53中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以約0.01 mg/kg該個體體重至約2.0 mg/kg該個體體重之劑量投與。
  55. 如請求項44至54中任一項之方法，其中該RNAi藥劑係以兩或更多劑量投與。
  56. 一種如請求項1至38中任一項之RNAi藥劑之用途，其用於治療至少部分地由ENaC活性及/或β-ENaC基因表現介導之疾病、病症或症狀。
  57. 一種如請求項39至43中任一項之組合物之用途，其用於治療至少部分地由ENaC活性及/或β-ENaC基因表現介導之疾病、病症或症狀。
  58. 一種如請求項39至43中任一項之組合物之用途，其用於製造用以治療至少部分地由ENaC活性及/或β-ENaC基因表現介導之疾病、病症或症狀的藥劑。
  59. 如請求項56至58中任一項之用途，其中該疾病為慢性阻塞性肺病(COPD)。 [1]當本文提及基因位置時，申請人使用GenBank NM_000336.2作為人類SCNN1B之參考基因。在2020年2月3日左右，基因序列更新為NM_000336.3 (SEQ ID NO:2)。雖然引用更新之基因將改變識別為上表1中引用之「靶向基因位置」及下表2中引用之「靶向基因位置」的編號，但此不對用於本文所揭示之RNAi藥劑中的核苷酸序列造成影響。
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