TW202202153A - 用於抑制ＰＮＰＬＡ３表現之ＲＮＡｉ劑、其醫藥組成物及使用方法 - Google Patents

用於抑制ＰＮＰＬＡ３表現之ＲＮＡｉ劑、其醫藥組成物及使用方法 Download PDF

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濤 裴
昭 徐
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Abstract

本揭露關於能夠抑制含馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)樣磷脂酶域蛋白3 (PNPLA3)基因表現之RNAi劑（例如，雙股RNAi劑）。亦揭示者為包括PNPLA3 RNAi劑之醫藥組成物及其使用方法。本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑可偶聯至靶向配體以促進遞送至細胞，包括遞送至肝細胞。PNPLA3 RNAi劑之體內遞送提供PNPLA3基因表現之抑制。該等PNPLA3 RNAi劑可用於PNPLA3相關疾病及病症，包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝纖維化、及酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）之治療方法。

Description

用於抑制PNPLA3表現之RNAi劑、其醫藥組成物及使用方法
本揭露關於用於抑制含馬鈴薯塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3 (Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3, PNPLA3)之RNA干擾(RNAi)劑（例如，雙股RNAi劑）、包括PNPLA3 RNAi劑之醫藥組成物、及其使用方法。
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)為世界上最常見的慢性肝病，並且估計會影響世界人口的大約20%。在一些個體中，異位脂肪在肝臟中之累積（稱為皮脂腺病）會引起發炎及肝細胞損傷，導致稱為非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)之較晚期階段疾病。NAFH之治療經常指向體重減輕及繼發病況之治療，諸如胰島素抗性或異常血脂症。
馬鈴薯塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3 (PNPLA3)是一種第II型跨膜蛋白，其會在各種細胞（包括在肝臟中）中表現。在肝細胞中，PNPLA3會在內質網及脂質膜上表現，並且主要展現三酸甘油酯水解活性。
本發明代表一種降低PNPLA3水平及治療肝臟疾病（諸如NAFLD）之新穎方法。
本文揭示用於抑制PNPLA3基因表現之RNAi劑，其包含反義股(antisense strand)及正義股(sense strand)，該反義股包含與SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任一序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸(contiguous nucleotide)；該正義股包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
在一些實施例中，該反義股包含SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任一序列的核苷酸2至18。
在一些實施例中，該正義股包含與SEQ ID NO: 2、3、4、9至20、214、219、及220之任一正義股序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸之核苷酸序列；且其中該正義股在該17個連續核苷酸上具有與該反義股具有至少85%互補性之區域。
在一些實施例中，該RNAi劑之至少一個核苷酸係經修飾之核苷酸或包括經修飾之核苷間鍵聯(internucleoside linkage)。
根據一些實施例，該RNAi劑之該正義股及/或反義股的所有或實質上所有該等核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，該經修飾之核苷酸係選自由下列所組成之群組：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、2′-去氧核苷酸、2′,3′-斷核苷酸(seco nucleotide)模擬物、鎖核苷酸(locked nucleotid)、2′-F-阿拉伯糖核苷酸(arabino nucleotide)、2′-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸(abasic nucleotide)、核糖醇、反向核苷酸(inverted nucleotide)、反向2′-O-甲基核苷酸、反向2′-去氧核苷酸、2′-胺基-經修飾之核苷酸、2′-烷基-經修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸、及3′-O-甲基核苷酸。
在其他實施例中，所有或實質上所有該等經修飾之核苷酸係2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、或其組合。
在一些實施例中，該反義股由下列所組成、基本上由下列所組成、或包含下列：SEQ ID NO: 90、95、及102之任一經修飾之反義股序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，該正義股由下列所組成、基本上由下列所組成、或包含下列：SEQ ID NO: 131、136、及137之任何經修飾之正義股序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，該反義股包含SEQ ID NO: 90、95、及102之任一經修飾之序列的核苷酸序列且該正義股包含SEQ ID NO: 131、136、及137之任一經修飾之序列的核苷酸序列。
在其他實施例中，該RNAi劑係鍵聯至靶向配體(targeting ligand)。在一些實施例中，該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。在又其他實施例中，該靶向配體包含(NAG37)或(NAG37)s之結構。在進一步實施例中，該靶向配體係鍵聯至該正義股。在一些實施例中，該靶向配體係鍵聯至該正義股之5′末端。
在一些實施例中，該靶向正義股的長度係介於18與30個核苷酸之間，而該反義股的長度係介於18與30個核苷酸之間。在其他實施例中，該靶向正義股及該反義股的長度各自係介於18與27個核苷酸之間。在其他實施例中，該靶向正義股及該反義股的長度各自係介於18與24個核苷酸之間。在仍其他實施例中，正義股及該反義股的長度各自係21個核苷酸。
在一些實施例中，該等RNAi劑具有兩個鈍端。
在一些實施例中，該正義股包含一或兩個端帽。在其他實施例中，該正義股包含一或兩個反向無鹼基殘基(inverted abasic residue)。
在一些實施例中，該等RNAi劑包含形成雙鏈體序列之正義股及反義股，該雙鏈體序列具有SEQ ID NO:（176及214）；（90及131）；（181及219）；（95及136）；（188及220）及/或（102及137）。
在一些實施例中，該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。
在一些態樣中，本文中所提供之RNAi劑包含反義股，該反義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 90、95及102之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列；其中a、c、g、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該正義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，所揭示之正義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 214、219及256之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列；其中a、c、g、i、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該反義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。在其他實施例中，該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。在其他實施例中，該等RNAi劑之該正義股係鍵聯至靶向配體。
在一些實施例中，該靶向配體對於去唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體具有親和力。在一些實施例中，該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
在進一步實施例中，該靶向配體包含：
Figure 02_image001
、或
Figure 02_image003
。
在進一步實施例中，該反義股由SEQ ID NO: 90、95、及102之經修飾之核苷酸序列所組成且該正義股由SEQ ID NO: 131、136、及137之經修飾之核苷酸序列所組成；其中a、c、g、及u分別係2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別係2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s係硫代磷酸酯鍵聯；(invAb)係反向無鹼基去氧核糖殘基；且(NAG37)s具有下列化學結構：
Figure 02_image003
。
本文中亦揭示包含所揭示之RNAi劑的組成物，其中該等組成物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
本文中亦提供用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法，該等方法包含將有效量的所揭示RNAi劑或所揭示組成物引入細胞中。
在一些實施例中，該細胞係在對象內。在一些實施例中，該對象係人類對象。
在其他實施例中，PNPLA3基因表現係遭抑制達至少約30%。在一些實施例中，PNPLA3基因表現在肝細胞之細胞質中係遭抑制達至少約50%。
本文中進一步提供治療PNPLA3相關疾病或病症之方法，該等方法包含向有此需要之人類對象投予治療有效量的所揭示之組成物。
在一些實施例中，該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、酒精性脂肪肝病、或肝硬化。
在一些實施例中，該等RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量投予。
在其他實施例中，該RNAi劑係以二或更多個劑量投予。
本文中亦提供所揭示之RNAi劑或所揭示之組成物用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀的用途。
在一些實施例中，該症狀係肝硬化。
本文中進一步提供所揭示之RNAi劑或所揭示之組成物用於製備用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀之醫藥組成物的用途。
在一些實施例中，該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、或酒精性或非酒精性肝病（諸如肝硬化）。在一些實施例中，該RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量投予。
所揭露之方法藉由參考下面的詳細描述結合附圖（其形成本揭露的一部分）可以更容易地理解。應當理解的是所揭露之方法不限於本文中所描述及/或顯示之特定方法，且本文中使用之用語目的是僅僅以示例的方式描述具體實施例並且不意圖限制所要求保護的方法。
應當理解的是，為了清楚起見在本文中於不同實施例的內文中描述的所揭露之方法的某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反地，為了簡潔起見於單一實施例的內文中所述之方法的各種特徵亦可單獨或以任何次組合來提供。
定義
如本文中所使用，「RNAi劑(RNAi agent)」（亦稱為「RNAi觸發物(RNAi trigger)」）意指含有RNA或RNA樣（例如，經化學修飾之RNA）寡核苷酸分子之組成物，該寡核苷酸分子能夠以序列特異性方式降低或抑制（例如，在適當條件下降低或抑制）目標mRNA之傳訊RNA (mRNA)轉錄本的轉譯。如本文中所使用，RNAi劑可透過下列起作用：RNA干擾機制（亦即，透過與哺乳動物細胞之RNA干擾途徑機關（RNA誘導型靜默化複合物(RNA-induced silencing complex)，或稱RISC）的交互作用誘導RNA干擾）；或任何替代的（多種）機制或（多種）途徑。雖然據信RNAi劑（如該用語在本文中使用者）主要透過RNA干擾機制起作用，所揭示之RNAi劑未受到任何具體作用路徑或機制的約束或限制。本文中所揭示之RNAi劑包含正義股及反義股，且包括但不限於：短（或小）干擾RNA (short interfering RNA, siRNA)、雙股RNA (double-stranded RNA, dsRNA)、微小RNA (micro RNA, miRNA)、短小髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)、及切丁酶(dicer)受質。本文中所述之RNAi劑的反義股係與所靶向之mRNA（即，PNPLA3 mRNA）至少部分互補。RNAi劑可包含一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個非磷酸二酯鍵聯。
如本文中所使用，用語「靜默(silence)」、「降低(reduce)」、「抑制(inhibit)」、「向下調控(down-regulate)」、或「減少(knockdown)」在指稱給定基因的表現時，意指該基因之表現（如藉由自該基因所轉錄得到之RNA的水平、在該基因轉譯之細胞群、組織、器官、或對象中自該mRNA所轉譯得到之多肽、蛋白質、或蛋白質次單元的水平所測得）當該細胞、細胞群、組織、器官、或對象係經本文中所述之RNAi劑治療時，相較於尚未經過如此治療的第二細胞、細胞群、組織、器官、或對象有所降低。
如本文中所使用，用語「序列(sequence)」及「核苷酸序列(nucleotide sequence)」意指使用標準命名法以一連串字母描述的核鹼基或核苷酸之次序或順序。核酸分子可包含未經修飾及/或經修飾之核苷酸。核苷酸序列可包含未經修飾及/或經修飾之核苷酸。
如本文中所使用，「鹼基(base)」、「核苷酸鹼基(nucleotide base)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核鹼基(nucleobase)」係一種雜環嘧啶或嘌呤化合物，其係多核苷酸之成分，並且包括主要嘌呤鹼基腺嘌呤及鳥嘌呤，以及主要嘧啶鹼基胞嘧啶、胸腺嘧啶、及尿嘧啶。核苷酸可未經修飾。核苷酸可進一步經修飾以包括但不限於通用鹼基、疏水性鹼基、混交性鹼基(promiscuous base)、大小擴展鹼基(size-expanded base)、及氟化鹼基。（參見例如，Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008）。此類經修飾之核苷酸（包括包括經修飾之核苷酸的亞磷醯胺(phosphoramidite)化合物）的合成在所屬技術領域中係已知的。
如本文中所使用，且除非另有指示，用語「互補(complementary)」在用於相對於第二核鹼基或核苷酸序列（例如，RNAi劑反義股或單股反義寡核苷酸）而描述第一核鹼基或核苷酸序列（例如，RNAi劑正義股或所靶向之mRNA）時，意指包括該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包括該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交(hybridize)（在哺乳動物生理條件（或另外的體內或體外合適條件）下形成鹼基對氫鍵）及在某些標準條件下形成雙鏈體(duplex)或雙螺旋結構的能力。所屬技術領域中具有通常知識者會能夠選擇最適用於雜交測試之條件組。互補序列包括華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對或非華生-克里克鹼基對，且包括包括天然或經修飾的核苷酸或核苷酸模擬物，其至少達到符合上述雜合要求的程度。序列同一性或互補性係獨立於修飾。例如，為了判定同一性或互補性之目的，a及Af（如本文中所定義）係與U（或T）互補並與A同一。
如本文中所使用，「完美互補(perfectly complementary)」或「完全互補(fully complementary)」意指在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的所有(100%)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目鹼基雜交。連續序列可包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文中所使用，「部分互補(partially complementary)」意指在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少70%（但非所有）鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目鹼基雜交。連續序列可包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文中所使用，「實質互補(partially complementary)」意指在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少85%（但非所有）鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目鹼基雜交。連續序列可包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文中所使用，用語「互補」、「完全互補」、「部分互補」、及「實質互補」係關於RNAi劑之正義股與反義股之間、或RNAi劑之反義股與PNPLA3 mRNA之序列之間的核鹼基或核苷酸匹配而使用。
如本文中所使用，用語「實質同一(substantially identical)」或「實質同一性(substantially identity)」當應用於核酸序列時，意指核苷酸序列（或核苷酸序列之一部分）相較於參考序列具有至少約85%序列同一性或更多，例如至少90%、至少95%、或至少99%同一性。序列同一性百分比係藉由在比較窗(comparison window)上比較兩個最佳對準序列來判定。百分比係計算如下：判定兩者序列中發生相同類型核酸鹼基的位置數以產生匹配位置數，將該匹配位置數除以比較窗中之位置總數，並將其結果乘以100以產生序列同一性百分比。本文中所揭示之發明涵蓋與本文中所揭示者實質同一的核苷酸序列。
如本文中所使用，用語「個體(individual)」、「患者(patient)」、及「對象(subject)」可互換使用以指稱任何動物物種之成員，包括但不限於鳥類、人類、及其他靈長類動物，包括市售之相關哺乳動物或動物模型，諸如小鼠、大鼠、猴、牛、豬、馬、羊、貓、及狗。較佳地，對象係人類。
如本文中所使用，用語「治療(treat/treatment)」及類似者意指提供對象中疾病之一或多種症狀的數目、嚴重性、及/或頻率之緩解或減輕所採取之方法或步驟。如本文中所使用，「治療」可包括對象中疾病之一或多種症狀的數目、嚴重性、及/或頻率之預防、管理、疾病預防治療、及/或抑制、或降低。
如本文中所使用，片語「引入細胞中(introducing into a cell)」在指稱RNAi劑時，意指將該RNAi劑功能性地遞送至細胞中。片語「功能性遞送(functional delivery)」意指以使得該RNAi劑能夠具有預期生物活性（例如，基因表現之序列特異性抑制）的方式，將該RNAi劑遞送至細胞。
除非另有陳述，否則如本文中所使用之符號
Figure 02_image005
的使用表示，任何基團或多種基團可根據本文所述之發明之範疇鍵聯至其上。
如本文中所使用，用語「異構物(isomer)」係指具有相同分子式之化合物，但其原子鍵結的性質或序列或其原子在空間中的排列有所不同。它們的原子在空間中排列不同之異構物稱為「立體異構物(stereoisomer)」。彼此非為鏡像的立體異構物稱為「非鏡像異構物(diastereoisomer)」，而為不可重疊鏡像之立體異構物稱為「鏡像異構物(enantiomer)」，或者有時稱為光學異構物。鍵結至四個非相同取代基的碳原子稱為「掌性中心(chiral center)」。
如本文中所使用，除非在結構中經具體識別為具有具體構形，否則就不對稱中心存在而因此產生鏡像異構物、非鏡像異構物、或其他立體異構組態之各結構而言，本文所揭示之各結構意欲表示所有此類可能異構物，其包括其光學上純的形式及外消旋形式。例如，本文所揭示之結構意欲涵蓋非鏡像異構物以及單一立體異構物之混合物。
如本文中所使用，用語「包含(comprising)」、「包括(including)」、含有(containing)、或「特徵在於(characterized by)」係互換式、涵括式、開放式的且不排除額外、未敘述之元件或方法步驟。用語「包含」在本文中之任何敘述（尤其是在組成物之組分的描述中或在裝置之元件的描述中），應理解為涵蓋由所敘述組分或元件所組成或基本上由所敘述組分或元件所組成之該等組成物及方法。
如本文之請求項中所使用，片語「由……組成(consisting of)」排除請求項中未指明的任何元件、步驟、或成分。當用於本文之請求項時，片語「基本上由……組成(consisting essentially of)」將請求項之範疇限制在所指明的材料或步驟及不實質影響所請發明的（多個）基本及新穎特徵者。
所屬技術領域中具有通常知識者會易於了解並領會，本文所揭示之化合物及組成物可具有處於質子化或去質子化狀態的某些原子（例如N、O、或S原子），其取決於該化合物或組成物所位在的環境。因此，如本文中所使用，本文所揭示之結構設想到某些官能基（諸如例如OH、SH、或NH）可質子化或去質子化。本文之揭露意欲涵蓋所揭示之化合物及組成物（無論其基於環境（諸如pH）的質子化狀態為何），其會由所屬技術領域中具有通常知識者易於了解。相應地，具有不穩定質子或鹼性原子的本文中所述之化合物亦應理解為代表對應化合物之鹽形式。本文中所述之化合物可呈游離酸、游離鹼、或鹽形式。本文中所述之化合物的醫藥上可接受之鹽應理解為在本發明之範疇內。
如本文中所使用，當指稱兩個化合物或分子之間的連接時，用語「鍵聯(linked)」或「偶聯(conjugated)」意指兩個化合物或分子係藉由共價鍵來接合。除非有陳述，如本文中所使用，用語「鍵聯」及「偶聯」可指第一化合物與第二化合物之間的連接，無論是有還是無任何中介原子或原子群。
如本文中所使用，用語「包括」在本文中係用於意指片語「包括但不限於(including not limited to)」且可與其互換使用。用語「或(or)」在本文中係用於意指用語「及/或(and/or)」且可與其互換使用，除非上下文另有明確指示。
除非另有定義，本文中所使用之所有技術與科學用語的意義，均與所屬技術領域中具有通常知識者所共同了解的意義相同。雖然類似或等效於本文所述者之方法及材料可用於本發明之實務或測試中，下文描述了合適的方法及材料。本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利、及其他參考文獻，其全文均以引用方式併入。在衝突情況下，將以本說明書（包括定義）為考量。此外，材料、方法、及實例僅具說明性，不意欲具限制性
本發明之其他目的、特徵、態樣、及優點將由於下列實施方式（隨同圖式）及請求項而清楚易見。 實施方式 RNAi 劑
本文中描述用於抑制PNPLA3基因表現之RNAi劑（本文中稱為PNPLA3 RNAi劑或PNPLA3 RNAi觸發物）。各PNPLA3 RNAi劑包含正義股及反義股。正義股及反義股的長度各自可係16至49個核苷酸。正義股及反義股可係相同長度，或者其等可係不同長度。在一些實施例中，正義股及反義股的長度各自獨立地係18至27個核苷酸。在一些實施例中，兩者正義股及反義股的長度各自係21至26個核苷酸。在一些實施例中，正義股及反義股的長度各自係21至24個核苷酸。在一些實施例中，正義股及反義股的長度各自獨立地係19至21個核苷酸。在一些實施例中，正義股長度係約19個核苷酸，而反義股長度係約21個核苷酸。在一些實施例中，正義股長度係約21個核苷酸，而反義股長度係約23個核苷酸。在一些實施例中，正義股長度係23個核苷酸，而反義股長度係21個核苷酸。在一些實施例中，兩者正義股及反義股的長度各自係21個核苷酸。在一些實施例中，RNAi劑正義股及反義股的長度各自獨立地係16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39個核苷酸。在一些實施例中，雙股RNAi劑具有約16、17、18、19、20、21、22、23、或24個核苷酸的雙鏈體長度。
用於形成PNPLA3 RNAi劑之核苷酸序列的實例係提供於表2、表3、及表4中。包括表2、表3、及表4中之正義股及反義股序列的RNAi劑雙鏈體之實例係示於表5A及表5B中。
在一些實施例中，在正義股與反義股之間具完美、實質、或部分互補性的區域長度一般係16至26（例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26）個核苷酸且發生在反義股之5′端處或附近（例如，此區域可以0、1、2、3、或4個非完美、實質、或部分互補之核苷酸而與反義股之5′端隔開）。
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑的正義股包括與PNPLA3 mRNA中之相同數目核苷酸核心伸長序列（在本文中亦稱為「核心伸長」或「核心序列」）具有至少85%同一性的至少16個連續核苷酸。在一些實施例中，正義股核心伸長序列與反義股中之核心伸長序列係100%（完美）互補或至少約85%（實質）互補，因此正義股核心伸長序列一般與PNPLA3 mRNA目標中存在之相同長度核苷酸序列（有時例如稱為目標序列）完美同一或至少約85%同一。在一些實施例中，此正義股核心伸長的長度係16、17、18、19、20、21、22、或23個核苷酸。在一些實施例中，此正義股核心伸長的長度係17個核苷酸。在一些實施例中，此正義股核心伸長的長度係19個核苷酸。
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑的反義股包括與PNPLA3 mRNA中之相同數目核苷酸核心伸長或與對應正義股中之相同數目核苷酸核心伸長具有至少85%互補性的至少16個連續核苷酸。在一些實施例中，反義股核心伸長與PNPLA3 mRNA目標中存在之相同長度核苷酸序列（例如，目標序列）係100%（完美）互補或至少約85%（實質）互補。在一些實施例中，此反義股核心伸長的長度係16、17、18、19、20、21、22、或23個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長的長度係19個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長的長度係17個核苷酸。正義股核心伸長序列的長度可與對應的反義股核心序列相同，或者其長度可係不同。
PNPLA3 RNAi劑正義股及反義股會黏合以形成雙鏈體。PNPLA3 RNAi劑之正義股及反義股可彼此部分、實質、或完全互補。在互補的雙鏈體區域內，正義股核心伸長序列與反義股核心伸長序列係至少85%互補或100%互補。在一些實施例中，正義股核心伸長序列含有至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、或至少23個核苷酸之序列，該序列與反義股核心伸長序列之對應16、17、18、19、20、21、22、或23個核苷酸序列係至少85%或100%互補（亦即，PNPLA3 RNAi劑之正義股核心伸長序列及反義股核心伸長序列具有至少85%鹼基配對或100%鹼基配對之至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、或至少23個核苷酸的區域）。
在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的反義股與表2或表3中任何反義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑之正義股與表2或表4中任何正義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。
在一些實施例中，正義股及/或反義股可選地且獨立地可在核心伸長序列之3′端、5′端、或3′及5′端兩者含有額外1、2、3、4、5、或6個核苷酸（延伸）。反義股之額外核苷酸（若存在）可或可不與PNPLA3 mRNA中之對應序列互補。正義股之額外核苷酸（若存在）可或可不與PNPLA3 mRNA中之對應序列同一。反義股之額外核苷酸（若存在）可或可不與對應正義股序列之額外核苷酸（若存在）互補。
如本文中所使用，在正義股核心伸長序列及/或反義股核心伸長序列之5′及/或3′端處，延伸包含之1、2、3、4、5、或6個核苷酸。在正義股上之延伸核苷酸可或可不與在對應反義股中之核苷酸（核心伸長序列核苷酸或延伸核苷酸）互補。相反地，在反義股上之延伸核苷酸可或可不與在對應正義股中之核苷酸（核心伸長核苷酸或延伸核苷酸）互補。在一些實施例中，RNAi劑之正義股及反義股兩者含有3′及5′延伸。在一些實施例中，一股之3′延伸核苷酸之一或多者與另一股之5′延伸核苷酸之一或多者形成鹼基對。在其他實施例中，一股之3′延伸核苷酸之一或多者不與另一股之一或多種5′延伸核苷酸形成鹼基對。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑具有：反義股，其具有3′延伸；及正義股，其具有5′延伸。在一些實施例中，（多個）延伸核苷酸係未配對且形成突出。如本文中所使用，「突出(overhang)」係指一或多個未配對核苷酸之伸長，該等未配對核苷酸位於未形成本文中所揭示之RNAi劑的雜交或雙鏈化部分之一部分的正義股或反義股之末端。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含具有3′延伸之反義股，該3′延伸的長度係1、2、3、4、5、或6個核苷酸。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含具有3′延伸之反義股，該3′延伸的長度係1、2、或3個核苷酸。在一些實施例中，反義股延伸核苷酸之一或多者包含與對應PNPLA3 mRNA序列互補的核苷酸。在一些實施例中，反義股延伸核苷酸之一或多者包含非與對應PNPLA3 mRNA序列互補的核苷酸。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含具有3′延伸之正義股，該3′延伸的長度係1、2、3、4、或5個核苷酸。在一些實施例中，正義股延伸核苷酸之一或多者包含腺苷、尿嘧啶、或胸腺嘧啶核苷酸、AT二核苷酸、或與PNPLA3 mRNA序列中核苷酸對應或同一的核苷酸。在一些實施例中，3′正義股延伸包括下列序列中一者或由下列序列中一者所組成，但不限於：T、UT、TT、UU、UUT、TTT、或TTTT（各自以5′至3′列出）。
正義股可具有3′延伸及/或5′延伸。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含具有5′延伸之正義股，該5′延伸的長度係1、2、3、4、5、或6個核苷酸。在一些實施例中，正義股延伸核苷酸之一或多者包含與PNPLA3 mRNA序列中核苷酸對應或相同的核苷酸。
用於形成PNPLA3 RNAi劑之序列的實例係提供於表2、表3、及表4中。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包括表2或表3中任何序列之序列。在某些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表3中任一經修飾之序列或由表3中任一經修飾之序列所組成。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包括表2或表3中任何序列之核苷酸（由5′端→3′端）1至17、2至15、2至17、1至18、2至18、1至19、2至19、1至20、2至20、1至21、或2至21的序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包括表2或表4中任何序列之序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包括表2或表4中任何序列之核苷酸（由5′端→3′端）1至18、1至19、1至20、1至21、或2至19、2至20、2至21、3至20、3至21、或4至21的序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包含表4中任一經修飾之序列的經修飾之序列或由表4中任一經修飾之序列的經修飾之序列所組成。
在一些實施例中，本文所述之RNAi劑之正義股及反義股含有相同數目的核苷酸。在一些實施例中，本文所述之RNAi劑之正義股及反義股含有不同數目的核苷酸。在一些實施例中，RNAi劑之正義股5′端及反義股3′端形成鈍端(blunt end)。在一些實施例中，RNAi劑之正義股3′端及反義股5′端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi劑之兩端皆形成鈍端。在一些實施例中，RNAi劑之兩端皆非鈍端。如本文中所使用，「鈍端(blunt end)」係指雙股RNAi劑之一端，其中兩個黏合股之末端核苷酸係互補的（形成互補的鹼基對）。
在一些實施例中，RNAi劑之正義股5′端及反義股3′端形成翻口端(frayed end)。在一些實施例中，RNAi劑之正義股3′端及反義股5′端形成翻口端。在一些實施例中，RNAi劑之兩端皆形成翻口端。在一些實施例中，RNAi劑之兩端皆非翻口端。如本文中所使用，翻口端(frayed end)係指雙股RNAi劑之一端，其中兩個黏合股之末端核苷酸形成一對（亦即，並未形成突出(overhang)），但並非互補的（亦即，形成非互補對）。在一些實施例中，雙股RNAi劑之一股的末端處的一或多個未配對核苷酸形成突出。未配對核苷酸可在正義股或反義股上，並產生3′或5′突出。在一些實施例中，RNAi劑含有：鈍端及翻口端、鈍端及5′突出端、鈍端及3′突出端、翻口端及5′突出端、翻口端及3′突出端、兩個5′突出端、兩個3′突出端、5′突出端及3′突出端、兩個翻口端、或兩個鈍端。一般而言，當存在時，突出係位於正義股、反義股、或正義股及反義股兩者之3′末端。
本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑亦可包含一或多個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑之正義股的實質上所有核苷酸及反義股的實質上所有核苷酸均係經修飾之核苷酸。本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑可進一步包含一或多個經修飾之核苷間鍵聯，例如一或多個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑含有一或多個經修飾之核苷酸及一或多個經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施例中，2′-經修飾之核苷酸係與經修飾之核苷間鍵聯組合。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑係製備或提供為鹽、混合鹽、或游離酸。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑係製備為鈉鹽。所屬技術領域中所熟知之此類形式係在本文中所揭示之發明的範疇內。經修飾的核苷酸
當在各種寡核苷酸建構體中使用時，經修飾之核苷酸可在細胞中保存化合物的活性，同時增加此等化合物的血清穩定性，且亦可在投予該寡核苷酸建構體後將在人類中活化干擾素活性的可能性降到最低。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑含有一或多個經修飾之核苷酸。如本文中所使用，「經修飾之核苷酸(modified nucleotide)」係核糖核苷酸（2′-羥基核苷酸）以外的核苷酸。在一些實施例中，至少50%（例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）的核苷酸係經修飾之核苷酸。如本文中所使用，經修飾之核苷酸可包括但不限於去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸、2′-經修飾之核苷酸、反向核苷酸、包含經修飾之核鹼基的核苷酸、橋聯核苷酸、肽核酸(PNA)、2′,3′-斷核苷酸模擬物（非鎖核鹼基類似物）、鎖核苷酸、3′-O-甲氧基（2′核苷間鍵聯之）核苷酸、2′-F-阿拉伯糖核苷酸、5′-Me、2′-氟核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、及含膦酸環丙酯之核苷酸。2′-經修飾之核苷酸（即在五員糖環之2′位置處具有羥基以外之基團的核苷酸）包括但不限於2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸（在本文中亦稱為2′-去氧-2′-氟核苷酸）、2′-去氧核苷酸、2′-甲氧基乙基（2′-O-2-甲氧基乙基）核苷酸（亦稱為2′-MOE）、2′-胺基核苷酸、及2′-烷基核苷酸。給定化合物之所有位置沒有必要進行均等修飾。反之，可將多於一個修飾結合於單一PNPLA3 RNAi劑中或甚至結合至其單一核苷酸中。PNPLA3 RNAi劑正義股及反義股可藉由所屬技術領域中已知的方法來合成及/或修飾。在一個核苷酸處之修飾係獨立於在另一個核苷酸處之修飾。
經修飾之核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-經取代之嘧啶、6-氮嘧啶及N-2、N-6及O-6經取代之嘌呤（例如，2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、或5-丙炔基胞嘧啶）、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基（例如，6-甲基、6-乙基、6-異丙基、或6-正丁基）衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基（例如，2-甲基、2-乙基、2-異丙基、或2-正丁基）及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶(pseudouracil)）、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-氫硫基、8-硫烷基、8-經羥基及其他8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵（例如，5-溴）、5-三氟甲基及其他5-經取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤及8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，反義股之5′及/或3′端可包括無鹼基殘基(Ab)，其亦可稱為「無鹼基位點(abasic site)」或「無鹼基核苷酸(abasic nucleotide)」。無鹼基殘基(Ab)係在糖部份之1′位置缺乏核鹼基的核苷酸或核苷。（參見例如美國專利第5,998,203號）。在一些實施例中，可將無鹼基殘基內置於核苷酸序列中。在一些實施例中，可將Ab或AbAb添加至反義股之3′端。在一些實施例中，正義股之5′端可包括一或多個額外無鹼基殘基（例如(Ab)或(AbAb)）。在一些實施例中，將UUAb、UAb、或Ab添加至正義股之3′端。在一些實施例中，可將無鹼基（去氧核糖）殘基置換成核糖醇（無鹼基核糖）殘基。
在一些實施例中，RNAi劑的所有或實質所有核苷酸係經修飾的核苷酸。如本文中所使用，實質上所有存在的核苷酸係經修飾之核苷酸的RNAi劑，係一種在係為核糖核苷酸（亦即，未經修飾）之正義股及反義股中皆具有四或更少個（亦即，0、1、2、3、或4個）核苷酸的RNAi劑。如本文中所使用，實質上所有存在的核苷酸係經修飾之核苷酸的正義股，係一種在係為未經修飾之核糖核苷酸的正義股中具有二或更少個（亦即，0、1、或2個）核苷酸的正義股。如本文中所使用，實質上所有存在的核苷酸係經修飾之核苷酸的反義股，係一種在係為未經修飾之核糖核苷酸的正義股中具有二或更少個（亦即，0、1、或2個）核苷酸的反義股。在一些實施例中，RNAi劑之一或多個核苷酸係未經修飾之核糖核苷酸。經修飾之核苷間鍵聯
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑之一或多個核苷酸係藉由非標準鍵聯或主鏈（亦即，經修飾之核苷間鍵聯或經修飾之主鏈）來鍵聯。經修飾之核苷間鍵聯或主鏈包含但不限於：硫代磷酸酯基團（在本文中以小寫字母「s」表示）、掌性硫代磷酸酯、硫磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸烷基酯（例如，膦酸甲酯或3′-伸烷基膦酸酯(3′-alkylene phosphonate)）、掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯（例如，3′-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯、或硫羰基胺基磷酸酯）、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、N-嗎啉基鍵聯、具有正常3′-5′鍵聯之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2′-5′鍵聯之類似物、或具有反向極性之硼烷磷酸酯（其中相鄰核苷單元對係以3′-5′鍵聯至5′-3′或以2′-5′鍵聯至5′-2′）。在一些實施例中，經修飾的核苷間鍵聯或主鏈不含磷原子。不含磷原子的經修飾的核苷間鍵聯包括但不限於：短鏈烷基或環烷基糖間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵聯、或一或多種短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯。在一些實施例中，經修飾的核苷間主鏈包括但不限於：矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基(formacetyl)及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含有烯烴之主鏈、胺磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈、及其他具有混合的N、O、S、及CH2 組分之主鏈。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑之正義股可含有1、2、3、4、5、或6個硫代磷酸酯鍵聯，PNPLA3 RNAi劑之反義股可含有1、2、3、4、5、或6個硫代磷酸酯鍵聯，或者正義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3、4、5、或6個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑之正義股可含有1、2、3、或4個硫代磷酸酯鍵聯，PNPLA3 RNAi劑之反義股可含有1、2、3、或4個硫代磷酸酯鍵聯，或者正義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3、或4個硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股含有至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵聯係在來自正義股之3′端之位置1至3處的核苷酸之間。在一些實施例中，一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係在正義股核苷酸序列之5′端，而另一個硫代磷酸酯鍵聯係在正義股核苷酸序列之3′端。在一些實施例中，二個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係位於正義股之5′端，而另一個硫代磷酸酯鍵聯係在正義股之3′端。在一些實施例中，正義股在核苷酸之間不包括任何硫代磷酸酯核苷間鍵聯，但在5′及3′兩者上的末端核苷酸之間含有一個、兩個、或三個硫代磷酸酯鍵聯及可選地存在的反向無鹼基殘基端帽(terminal cap)。在一些實施例中，靶向配體係經由硫代磷酸酯鍵聯來鍵聯至正義股。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係在來自反義股之5′端之位置1至3處的核苷酸之間，且在來自5′端之位置19至21、20至22、21至23、22-24、23至25、或24至26處的核苷酸之間。在一些實施例中，三個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係位於來自反義股之5′端的位置1至4之間，而第四個硫代磷酸酯核苷間鍵聯係位於來自反義股之5′端的位置20至21之間。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑在反義股中含有至少三個或四個磷酸酯核苷間鍵聯。加帽殘基或部份
在一些實施例中，正義股可包括一或多個加帽(capping)殘基或部份，有時在所屬技術領域中稱為「帽(cap)」、「端帽(terminal cap)」、或「加帽殘基(capping residue)」。如本文中所使用，「加帽殘基」係一種非核苷酸化合物或其他部份，其可結合在本文中所揭示之RNAi劑的核苷酸序列之一或多個末端。在一些情況下，加帽殘基可為RNAi劑提供某些有益性質，諸如例如對於核酸外切酶降解之保護。在一些實施例中，反向無鹼基殘基(invAb)（在所屬技術領域中亦稱為「反向無鹼基位點」）係作為加帽殘基而添加。（參見例如，F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16）。加帽殘基通常在所屬技術領域中係已知的，並且包括例如反向無鹼基殘基以及碳鏈，諸如末端C3 H7 （丙基）、C6 H13 （己基）、或C12 H25 （十二基）基團。在一些實施例中，加帽殘基係存在於正義股之5′末端、3′末端、或5′及3′末端兩者。在一些實施例中，正義股之5′端及/或3′端可包括多於一個反向無鹼基去氧核糖部份作為加帽殘基。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至正義股之3′端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至正義股之5′端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點插在RNAi劑之正義股的靶向配體與核苷酸序列之間。在一些實施例中，在RNAi劑之正義股的末端或多個末端處或附近包括一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點會讓RNAi劑之活性或其他所欲性質得以增強。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至正義股之5′端。在一些實施例中，可將一或多個反向無鹼基殘基插在RNAi劑之正義股的靶向配體與核苷酸序列之間。反向無鹼基殘基可經由磷酸酯、硫代磷酸酯（例如，本文中示為(invAb)s）、或其他核苷間鍵聯來鍵聯。在一些實施例中，在RNAi劑之正義股的末端或多個末端處或附近包括一或多個反向無鹼基殘基可讓RNAi劑之活性或其他所欲性質得以增強。在一些實施例中，反向無鹼基（去氧核糖）殘基可置換成反向核糖醇（無鹼基核糖）殘基。在一些實施例中，反義股核心伸長序列之3′端或反義股序列之3′端可包括反向無鹼基殘基。反向無鹼基去氧核糖殘基之化學結構係示於下表6中。PNPLA3 RNAi 劑
本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑係設計為靶向PNPLA3基因（例如，SEQ ID NO: 1）上之目標特異性位置。 NM_025225.2智人馬鈴薯塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3 (PNPLA3)，mRNA (SEQ ID NO: 1)： ATGGTCCGAGGGGGGCGGGGCTGACGTCGCGCTGGGAATGCCCTGGCCGAGACACTGAGGCAGGGTAGAGAGCGCTTGCGGGCGCCGGGCGGAGCTGCTGCGGATCAGGACCCGAGCCGATTCCCGATCCCGACCCAGATCCTAACCCGCGCCCCCGCCCCGCCGCCGCCGCCATGTACGACGCAGAGCGCGGCTGGAGCTTGTCCTTCGCGGGCTGCGGCTTCCTGGGCTTCTACCACGTCGGGGCGACCCGCTGCCTGAGCGAGCACGCCCCGCACCTCCTCCGCGACGCGCGCATGTTGTTCGGCGCTTCGGCCGGGGCGTTGCACTGCGTCGGCGTCCTCTCCGGTATCCCGCTGGAGCAGACTCTGCAGGTCCTCTCAGATCTTGTGCGGAAGGCCAGGAGTCGGAACATTGGCATCTTCCATCCATCCTTCAACTTAAGCAAGTTCCTCCGACAGGGTCTCTGCAAATGCCTCCCGGCCAATGTCCACCAGCTCATCTCCGGCAAAATAGGCATCTCTCTTACCAGAGTGTCTGATGGGGAAAACGTTCTGGTGTCTGACTTTCGGTCCAAAGACGAAGTCGTGGATGCCTTGGTATGTTCCTGCTTCATCCCCTTCTACAGTGGCCTTATCCCTCCTTCCTTCAGAGGCGTGCGATATGTGGATGGAGGAGTGAGTGACAACGTACCCTTCATTGATGCCAAAACAACCATCACCGTGTCCCCCTTCTATGGGGAGTACGACATCTGCCCTAAAGTCAAGTCCACGAACTTTCTTCATGTGGACATCACCAAGCTCAGTCTACGCCTCTGCACAGGGAACCTCTACCTTCTCTCGAGAGCTTTTGTCCCCCCGGATCTCAAGGTGCTGGGAGAGATATGCCTTCGAGGATATTTGGATGCATTCAGGTTCTTGGAAGAGAAGGGCATCTGCAACAGGCCCCAGCCAGGCCTGAAGTCATCCTCAGAAGGGATGGATCCTGAGGTCGCCATGCCCAGCTGGGCAAACATGAGTCTGGATTCTTCCCCGGAGTCGGCTGCCTTGGCTGTGAGGCTGGAGGGAGATGAGCTGCTAGACCACCTGCGTCTCAGCATCCTGCCCTGGGATGAGAGCATCCTGGACACCCTCTCGCCCAGGCTCGCTACAGCACTGAGTGAAGAAATGAAAGACAAAGGTGGATACATGAGCAAGATTTGCAACTTGCTACCCATTAGGATAATGTCTTATGTAATGCTGCCCTGTACCCTGCCTGTGGAATCTGCCATTGCGATTGTCCAGAGACTGGTGACATGGCTTCCAGATATGCCCGACGATGTCCTGTGGTTGCAGTGGGTGACCTCACAGGTGTTCACTCGAGTGCTGATGTGTCTGCTCCCCGCCTCCAGGTCCCAAATGCCAGTGAGCAGCCAACAGGCCTCCCCATGCACACCTGAGCAGGACTGGCCCTGCTGGACTCCCTGCTCCCCCAAGGGCTGTCCAGCAGAGACCAAAGCAGAGGCCACCCCGCGGTCCATCCTCAGGTCCAGCCTGAACTTCTTCTTGGGCAATAAAGTACCTGCTGGTGCTGAGGGGCTCTCCACCTTTCCCAGTTTTTCACTAGAGAAGAGTCTGTGAGTCACTTGAGGAGGCGAGTCTAGCAGATTCTTTCAGAGGTGCTAAAGTTTCCCATCTTTGTGCAGCTACCTCCGCATTGCTGTGTAGTGACCCCTGCCTGTGACGTGGAGGATCCCAGCCTCTGAGCTGAGTTGGTTTTATGAAAAGCTAGGAAGCAACCTTTCGCCTGTGCAGCGGTCCAGCACTTAACTCTAATACATCAGCATGCGTTAATTCAGCTGGTTGGGAAATGACACCAGGAAGCCCAGTGCAGAGGGTCCCTTACTGACTGTTTCGTGGCCCTATTAATGGTCAGACTGTTCCAGCATGAGGTTCTTAGAATGACAGGTGTTTGGATGGGTGGGGGCCTTGTGATGGGGGGTAGGCTGGCCCATGTGTGATCTTGTGGGGTGGAGGGAAGAGAATAGCATGATCCCACTTCCCCATGCTGTGGGAAGGGGTGCAGTTCGTCCCCAAGAACGACACTGCCTGTCAGGTGGTCTGCAAAGATGATAACCTTGACTACTAAAAACGTCTCCATGGCGGGGGTAACAAGATGATAATCTACTTAATTTTAGAACACCTTTTTCACCTAACTAAAATAATGTTTAAAGAGTTTTGTATAAAAATGTAAGGAAGCGTTGTTACCTGTTGAATTTTGTATTATGTGAATCAGTGAGATGTTAGTAGAATAAGCCTTAAAAAAAAAAAAATCGGTTGGGTGCAGTGGCACACGGCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTTGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGTCTGGCCAACATAGCAAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTATCTGGGCATGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCTATTCGGAAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCGGTGAGCTGAGATTGCACCATTTCATTCCAGCCTGGGCAACATGAGTGAAAGTCTGACTCAAAAAAAAAAAATTTAAAAAACAAAATAATCTAGTGTGCAGGGCATTCACCTCAGCCCCCCAGGCAGGAGCCAAGCACAGCAGGAGCTTCCGCCTCCTCTCCACTGGAGCACACAACTTGAACCTGGCTTATTTTCTGCAGGGACCAGCCCCACATGGTCAGTGAGTTTCTCCCCATGTGTGGCGATGAGAGAGTGTAGAAATAAAGAC
如本文中所定義，反義股序列係設計為靶向PNPLA3基因且靶向該基因之給定位置，並且是當鹼基配對至該基因時，在反義股之5′末端核鹼基係與該基因上之該位置下游（朝向3′端）19個核苷酸處的位置對齊時靶向該位置。例如，如表1及表2中所示，設計在位置2180靶向PNPLA3基因之反義股序列需要當鹼配對至該基因時，反義股之5′末端核鹼基係與PNPLA3基因之位置2198對齊。
如本文中所提供，PNPLA3 RNAi劑不需要反義股之位置1 (5′→3′)處的核鹼基與該基因互補，前提是該反義股與該基因在跨至少16個連續核苷酸之核心伸長序列上有至少85%互補性（例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互補性）。例如，針對設計靶向PNPLA3基因之2180位置的本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑之反義股的5′末端核鹼基必須與該基因之位置2198對齊；然而，該反義股之5′末端核鹼基可與但不需要與PNPLA3基因之位置2200互補，前提是該反義股與該基因在跨至少16個連續核苷酸之核心伸長序列上有至少85%互補性（例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互補性）。如藉由本文中所揭示之各種實例（以及其他事物）所示，PNPLA3 RNAi劑之反義股對該基因之特定位點結合（例如，無論PNPLA3 RNAi劑是設計在位置2180、在位置1586，在位置1179、或在一些其他位置處靶向PNPLA3基因）對於該PNPLA3 RNAi劑所達成之抑制程度而言是重要的。
在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑靶向PNPLA3基因且靶向表1中所示之PNPLA3基因序列位置處或附近。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的反義股包括核心伸長序列，其與表1中所揭示之目標PNPLA3 19-mer序列完全、實質、或至少部分互補。表 1. PNPLA3 19-mer mRNA目標序列（取自智人馬鈴薯塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3 (PNPLA3)，mRNA，GenBank NM_025225.2 (SEQ ID NO:1)）1
SEQ ID No. PNPLA3 19-mer 目標序列 (5 ′ → 3 ′ ) SEQ ID NO: 1 上之序列對應位置 所靶向之基因位置 ( 如本文中所參照 )
2 ACCUUUUUCACCUAACUAA 2180-2198 2180
3 CUUUCCCAGUUUUUCACUA 1586-1604 1586
4 GGUGGAUACAUGAGCAAGA 1179-1197 1179
5 GGUCCAAAGACGAAGUCGU 571-589 571
6 AACGUACCCUUCAUUGAUG 687-705 687
7 CUGAGUUGGUUUUAUGAAA 1746-1764 1746
8 AGCAAGAUUUGCAACUUGC 1191-1209 1191
1 當參照本文之基因位置時，申請人使用Genebank NM_025225.2作為人類PNPLA3之參考基因。在2020年2月9日時或左右，該基因序列已更新為NM_025225.3。雖然參照更新後之基因會改變上表1中標示為「所靶向之基因位置」的編號，但這對用於本文中所揭示之RNAi劑中的核苷酸序列沒有影響。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括反義股，其中該反義股之位置19 (5′→3′)能夠與表1中所揭示之19-mer目標序列之位置1形成鹼基對。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括反義股，其中該反義股之位置1 (5′→3′)能夠與表1中所揭示之19-mer目標序列之位置19形成鹼基對。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括反義股，其中該反義股之位置2 (5′→3′)能夠與表1中所揭示之19-mer目標序列之位置18形成鹼基對。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括反義股，其中該反義股之位置2至18 (5′→3′)能夠與位於表1中所揭示之19-mer目標序列之位置18至2處的各別互補鹼基之各者形成鹼基對。
針對本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）可與PNPLA3基因完美互補，或者可與PNPLA3基因非互補。在一些實施例中，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）係U、A、或dT。在一些實施例中，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）與正義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表2或表3中任何反義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）2至18、2至19、2至20、或2至21的序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi正義股包含表2或表4中任何正義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）3至21、2至21、1至21、3至20、2至20、1至20、3至19、2至19、1至19、3至18、2至18、或1至18的序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任何反義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）2至18、2至19、2至20、或2至21的序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi正義股包含SEQ ID NO: 2、3、4、9至20、214、219、及220之任何正義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）3至21、2至21、1至21、3至20、2至20、1至20、3至19、2至19、1至19、3至18、2至18、或1至18的序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含(i)表2或表3中任何反義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）2至18、2至19、2至20、或2至21的序列，及(ii)表2或表4中任何正義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）3至21、2至21、1至21、3至20、2至20、1至20、3至19、2至19、1至19、3至18、2至18、或1至18的序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含(i)反義股，其包含SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任何反義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）2至18、2至19、2至20、或2至21的序列，及(ii)正義股，其包含SEQ ID NO: 2、3、4、9至20、214、219、及220之任何正義股序列之核苷酸（由5′端→3′端）3至21、2至21、1至21、3至20、2至20、1至20、3至19、2至19、1至19、3至18、2至18、或1至18的序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括下表2中所示之核心19-mer核苷酸序列。表 2. PNPLA3 RNAi劑反義股及正義股核心伸長鹼基序列（N=任何核鹼基；I =次黃嘌呤（肌苷核苷酸；(A2N ) = 2-胺基腺嘌呤核苷酸）
SEQ ID No. 反義股鹼基序列 (5 ′ → 3 ′ ) （顯示為未經修飾之核苷酸序列） SEQ ID No. 正義股鹼基序列 (5 ′ → 3 ′ ) （顯示為未經修飾之核苷酸序列） SEQ ID NO: 1 上之經識別序列對應位置 所靶向之基因位置
46 UUAGUUAGGUGAAAAAGGU 2 ACCUUUUUCACCUAACUAA 2180-2198 2180
47 NUAGUUAGGUGAAAAAGGU 9 ACCUUUUUCACCUAACUAN 2180-2198 2180
48 NUAGUUAGGUGAAAAAGGN 10 NCCUUUUUCACCUAACUAN 2180-2198 2180
49 UUAGUUAGGUGAAAAAGGU 11 ACCUUUUUCACCUAACU(A2N )A 2180-2198 2180
50 NUAGUUAGGUGAAAAAGGU 12 ACCUUUUUCACCUAACU(A2N )N 2180-2198 2180
51 NUAGUUAGGUGAAAAAGGN 13 NCCUUUUUCACCUAACU(A2N )N 2180-2198 2180
52 UAGUGAAAAACUGGGAAAG 3 CUUUCCCAGUUUUUCACUA 1586-1604 1586
53 NAGUGAAAAACUGGGAAAG 14 CUUUCCCAGUUUUUCACUN 1586-1604 1586
54 NAGUGAAAAACUGGGAAAN 15 NUUUCCCAGUUUUUCACUN 1586-1604 1586
55 UCUUGCUCAUGUAUCCACC 4 GGUGGAUACAUGAGCAAGA 1179-1197 1179
56 NCUUGCUCAUGUAUCCACC 16 GGUGGAUACAUGAGCAAGN 1179-1197 1179
57 NCUUGCUCAUGUAUCCACN 17 NGUGGAUACAUGAGCAAGN 1179-1197 1179
58 UCUUGCUCAUGUAUCCACC 18 GGUGGAUACAUGAICAAGA 1179-1197 1179
59 NCUUGCUCAUGUAUCCACC 19 GGUGGAUACAUGAICAAGN 1179-1197 1179
60 NCUUGCUCAUGUAUCCACN 20 NGUGGAUACAUGAICAAGN 1179-1197 1179
61 ACGACUUCGUCUUUGGACC 5 GGUCCAAAGACGAAGUCGU 571-589 571
62 UCGACUUCGUCUUUGGACC 21 GGUCCAAAGACGAAGUCGA 571-589 571
63 NCGACUUCGUCUUUGGACC 22 GGUCCAAAGACGAAGUCGN 571-589 571
64 NCGACUUCGUCUUUGGACN 23 NGUCCAAAGACGAAGUCGN 571-589 571
65 ACGACUUCGUCUUUGGACC 24 GGUCCAAAGACGAAGUCIU 571-589 571
66 UCGACUUCGUCUUUGGACC 25 GGUCCAAAGACGAAGUCIA 571-589 571
67 NCGACUUCGUCUUUGGACC 26 GGUCCAAAGACGAAGUCIN 571-589 571
68 NCGACUUCGUCUUUGGACN 27 NGUCCAAAGACGAAGUCIN 571-589 571
69 ACGACUUCGUCUUUGGACC 28 GGUCCAAAGACIAAGUCIU 571-589 571
70 UCGACUUCGUCUUUGGACC 29 GGUCCAAAGACIAAGUCIA 571-589 571
71 NCGACUUCGUCUUUGGACC 30 GGUCCAAAGACIAAGUCIN 571-589 571
72 NCGACUUCGUCUUUGGACN 31 NGUCCAAAGACIAAGUCIN 571-589 571
73 ACGACUUCGUCUUUGGACC 32 GGUCCAAAGACGAAIUCGU 571-589 571
74 UCGACUUCGUCUUUGGACC 33 GGUCCAAAGACGAAIUCGA 571-589 571
75 NCGACUUCGUCUUUGGACC 34 GGUCCAAAGACGAAIUCGN 571-589 571
76 NCGACUUCGUCUUUGGACN 35 NGUCCAAAGACGAAIUCGN 571-589 571
257 CAUCAAUGAAGGGUACGUU 6 AACGUACCCUUCAUUGAUG 687-705 687
78 UAUCAAUGAAGGGUACGUU 36 AACGUACCCUUCAUUGAUA 687-705 687
77 NAUCAAUGAAGGGUACGUU 37 AACGUACCCUUCAUUGAUN 687-705 687
79 NAUCAAUGAAGGGUACGUN 38 NACGUACCCUUCAUUGAUN 687-705 687
258 UUUCAUAAAACCAACUCAG 7 CUGAGUUGGUUUUAUGAAA 1746-1764 1746
80 NUUCAUAAAACCAACUCAG 39 CUGAGUUGGUUUUAUGAAN 1746-1764 1746
81 NUUCAUAAAACCAACUCAN 40 NUGAGUUGGUUUUAUGAAN 1746-1764 1746
82 GCAAGUUGCAAAUCUUGCU 8 AGCAAGAUUUGCAACUUGC 1191-1209 1191
83 UCAAGUUGCAAAUCUUGCU 41 AGCAAGAUUUGCAACUUGA 1191-1209 1191
84 UCAAGUUGCAAAUCUUGCG 42 CGCAAGAUUUGCAACUUGA 1191-1209 1191
85 NCAAGUUGCAAAUCUUGCU 43 AGCAAGAUUUGCAACUUGN 1191-1209 1191
86 NCAAGUUGCAAAUCUUGCG 44 CGCAAGAUUUGCAACUUGN 1191-1209 1191
87 NCAAGUUGCAAAUCUUGCN 45 NGCAAGAUUUGCAACUUGN 1191-1209 1191
包含表2中之序列或由表2中之序列所組成之PNPLA3 RNAi劑正義股及反義股可係經修飾之核甘酸或未經修飾之核甘酸。在一些實施例中，具有包含表2中之序列或由表2中之序列所組成之正義股及反義股的PNPLA3 RNAi劑全皆係或實質上全皆係經修飾之核甘酸。
在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的反義股與表2中任何反義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的反義股與SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任何反義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的正義股與表2中任何正義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的正義股與SEQ ID NO: 2、3、4、9至20、214、219、及220之任何正義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。
如本文中所使用，表2中所揭示之序列中所列示的各N可獨立地選自任何及所有核鹼基（包括在經修飾及未經修飾之核苷酸兩者上所發現者）。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列示的N核苷酸在其他股上之對應位置處具有與該N核苷酸互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列示的N核苷酸在其他股上之對應位置處具有與該N核苷酸非互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列示的N核苷酸在其他股上之對應位置處具有與該N核苷酸相同的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列示的N核苷酸在其他股上之對應位置處具有與該N核苷酸不同的核鹼基。
某些經修飾之PNPLA3 RNAi劑反義股序列（以及其下層未經修飾序列）係提供於表3中。某些經修飾之PNPLA3 RNAi劑正義股序列（以及其下層未經修飾序列）係提供於表4中。在形成PNPLA3 RNAi劑時，上表3及表4（以及表2）中所列示之各下層鹼基序列中的各核苷酸可係經修飾之核苷酸。
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑係藉由黏合反義股與正義股來形成。含有表2或表4中所列示之序列的正義股可與含有表2或表3中所列示之序列的任何反義股雜交，前提是這兩個序列在連續16、17、18、19、20、或21個核苷酸序列上具有至少約85%互補性的區域。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表2或表3中任何序列之核苷酸序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含雙鏈體或由雙鏈體所組成，該雙鏈體具有表2、表3、或表4中任何序列之正義股及反義股的核鹼基序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含雙鏈體或由雙鏈體所組成，該雙鏈體具有SEQ ID NO:（176及214）；（90及131）；（181及219）；（95及136）；（188及220）及/或（102及137）。在一些實施例中，包含SEQ ID NO:（176及214）；（90及131）；（181及219）；（95及136）；（188及220）或（102及137）之PNPLA3 RNAi劑雙鏈體序列係製備或提供為鈉鹽、混合鹽、或游離酸。
含有經修飾之核苷酸的反義股之實例係提供於表3中。含有經修飾之核苷酸的正義股之實例係提供於表4中。
如表3及表4中所使用，下列符號係用於指示經修飾之核苷酸及鍵聯基。 A              =    腺苷-3′-磷酸酯； C              =    胞苷-3′-磷酸酯； G              =    鳥苷-3′-磷酸酯； U              =    尿苷-3′-磷酸酯 I               =    肌苷-3′-磷酸酯 a               =    2′-O-甲基腺苷-3′-磷酸酯 as             =    2′-O-甲基腺苷-3′-硫代磷酸酯 c               =    2′-O-甲基胞苷-3′-磷酸酯 cs             =    2′-O-甲基胞苷-3′-硫代磷酸酯 g               =    2′-O-甲基鳥苷-3′-磷酸酯 gs             =    2′-O-甲基鳥苷-3′-硫代磷酸酯 t                =    2′-O-甲基-5-甲基尿苷-3′-磷酸酯 ts              =    2′-O-甲基-5-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯 u               =    2′-O-甲基尿苷-3′-磷酸酯 us             =    2′-O-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯 g               =    2′-O-甲基肌苷-3′-磷酸酯 gs             =    2′-O-甲基肌苷-3′-硫代磷酸酯 Af            =    2′-氟腺苷-3′-磷酸酯 Afs           =    2′-氟腺苷-3′-硫代磷酸酯 Cf             =    2′-氟胞苷-3′-磷酸酯 Cfs           =    2′-氟胞苷-3′-硫代磷酸酯 Gf            =    2′-氟鳥苷-3′-磷酸酯 Gfs           =    2′-氟鳥苷-3′-硫代磷酸酯 Tf             =    2′-氟-5′-甲基尿苷-3′-磷酸酯 Tfs           =    2′-氟-5′-甲基尿苷-3′-硫代磷酸酯 Uf            =    2′-氟尿苷-3′-磷酸酯 Ufs           =    2′-氟尿苷-3′-硫代磷酸酯 AUNA =    2′,3′-斷(sec)-腺苷-3′-磷酸酯，參見表6 AUNA s          =    2′,3′-斷-腺苷-3′-硫代磷酸酯，參見表6 CUNA =    2′,3′-斷-胞苷-3′-磷酸酯，參見表6 CUNA s           =    2′,3′-斷-胞苷-3′-硫代磷酸酯，參見表6 GUNA =    2′,3′-斷-鳥苷-3′-磷酸酯，參見表6 GUNA s          =    2′,3′-斷-鳥苷-3′-硫代磷酸酯，參見表6 UUNA =    2′,3′-斷-尿苷-3′-磷酸酯，參見表6 UUNA s          =    2′,3′-斷-尿苷-3′-硫代磷酸酯，參見表6 a_2N        =    2′-O-甲基-2-胺基腺苷-3′-磷酸酯，參見表6 a_2Ns       =    2′-O-甲基-2-胺基腺苷-3′-硫代磷酸酯，參見表6 (invAb)    =    反向無鹼基去氧核糖核苷酸，參見表6 (invAb)s   =    反向無鹼基去氧核糖核苷酸-5′- 硫代磷酸酯，見表6
如所屬技術領域中具有通常知識者所會輕易瞭解，除非另以序列指示（諸如例如，以硫代磷酸酯鍵聯「s」），否則當單體存在於寡核苷酸中時，該等單體係藉由5′-3′-磷酸二酯鍵來互相鍵聯。如所屬技術領域中具有通常知識者所會清楚瞭解，如本文中所揭示之經修飾之核苷酸序列中所示的硫代磷酸酯鍵聯的涵括一般會存在於寡核苷酸中。再者，所屬技術領域中具有通常知識者會輕易瞭解，給定寡核苷酸序列之3′端的末端核苷酸一般會在給定單體之各別3´́位置處具有羥基(-OH)，而不是磷酸酯部份（在離體條件下）。此外，針對本文中所揭示之實施例，當以5′→3′方向觀看各別股時，反向無鹼基殘基之插入會使得去氧核糖之3′位置係鍵聯在各別股上之前向單體的3′端（參見例如，表6）。而且，如具有通常知識者所會輕易瞭解及認知，雖然本文中所繪示之硫代磷酸酯化學結構一般在硫原子上顯示陰離子，但本文中所揭示之發明涵蓋所有硫代互變異構物（例如，其中硫原子具有雙鍵且陰離子係在氧原子上）。除非本文中另有明確指示，否則所屬技術領域中具有通常知識者的此等瞭解係在描述本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑及PNPLA3 RNAi劑之組成物時獲得利用。
與本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑搭配使用的靶向配體、靶向基團、及鍵聯基的某些實例係提供於下表6中。更具體而言，靶向基團及鍵聯基（其等一起可形成靶向配體）包括(NAG37)及(NAG37)s，其等之化學結構係提供於下表6中。各正義股及/或反義股可具有本文中所列示之任何靶向配體、靶向基團、或鍵聯基，以及其他偶聯至該序列之5′及/或3′端的其他基團。表 3. PNPLA3 RNAi劑反義股序列
反義股 ID ： 經修飾之反義股 (5 ′ → 3 ′ ) SEQ ID NO. 下層鹼基序列 (5 ′ → 3 ′ ) （顯示為未經修飾之核苷酸序列） SEQ ID NO.
J1M00002-AS usCfsasUfcAfaUfgAfaGfgGfuAfcGfuUfsg 88 UCAUCAAUGAAGGGUACGUUG 174
J1M00004-AS usCfsasUfcAfaUfgAfaGfgGfuAfcGfuCfsg 89 UCAUCAAUGAAGGGUACGUCG 175
J1M00006-AS usAfsgsUfgAfaAfaAfcUfgGfgAfaAfgGfsu 90 UAGUGAAAAACUGGGAAAGGU 176
J1M00008-AS usAfsgsUfgAfaAfaAfcUfgGfgAfaAfgGfsg 91 UAGUGAAAAACUGGGAAAGGG 177
J1M00010-AS asAfsasUfcUfuGfcUfcAfuGfuAfuCfcAfsc 92 AAAUCUUGCUCAUGUAUCCAC 178
J1M00012-AS usAfscsUfuGfaCfuUfuAfgGfgCfaGfaUfsg 93 UACUUGACUUUAGGGCAGAUG 179
J1M00014-AS usAfscsUfuGfaCfuUfuAfgGfgCfaGfaCfsg 94 UACUUGACUUUAGGGCAGACG 180
J1M00016-AS usUfsasGfuUfaGfgUfgAfaAfaAfgGfuGfsu 95 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGU 181
J1M00020-AS usCfsusUfgCfuCfaUfgUfaUfcCfaCfcUfsg 96 UCUUGCUCAUGUAUCCACCUG 182
J1M00023-AS asCfsgsAfcUfuCfgUfcUfuUfgGfaCfcGfsa 97 ACGACUUCGUCUUUGGACCGA 183
J1M00025-AS usAfsusCfaAfuGfaAfgGfgUfaCfgUfuGfsg 98 UAUCAAUGAAGGGUACGUUGG 184
J1M00027-AS usCfscsAfaAfuAfuCfcUfcGfaAfgGfcAfsg 99 UCCAAAUAUCCUCGAAGGCAG 185
J1M00029-AS usUfsgsAfaAfaAfcUfgGfgAfaAfgGfuGfsg 100 UUGAAAAACUGGGAAAGGUGG 186
J1M00031-AS usUfscsAfuAfaAfaCfcAfaCfuCfaGfcUfsc 101 UUCAUAAAACCAACUCAGCUC 187
J1M00032-AS usCfsusUfgCfUUNA CfaUfgUfaUfcCfaCfcUfsg 102 UCUUGCUCAUGUAUCCACCUG 188
J1M00034-AS asGfsasAfcGfUUNA UfuUfcCfcCfaUfcAfgAfsc 103 AGAACGUUUUCCCCAUCAGAC 189
J1M00036-AS asGfsasAfcGfUUNA UfuUfcCfcCfaUfcAfgusu 104 AGAACGUUUUCCCCAUCAGUU 190
J1M00038-AS usAfscsAfcCfagaacGfuUfuUfcCfcCfsa 105 UACACCAGAACGUUUUCCCCA 191
J1M00040-AS usGfsasAfaGfUUNA CfaGfaCfaCfcAfgAfaCfsg 106 UGAAAGUCAGACACCAGAACG 192
J1M00042-AS usAfsasGfgGfUUNA AfcGfuUfgUfcAfcUfcAfsc 107 UAAGGGUACGUUGUCACUCAC 193
J1M00046-AS usAfscsUfuUfagggcAfgAfuGfuCfgUfsg 108 UACUUUAGGGCAGAUGUCGUG 194
J1M00050-AS usGfsusAfgCfaAfgUfuGfcAfaAfuCfuCfsg 109 UGUAGCAAGUUGCAAAUCUCG 195
J1M00052-AS asCfsgsAfcUfUUNA CfgUfcUfuUfgGfaCfcGfsa 110 ACGACUUCGUCUUUGGACCGA 196
J1M00057-AS asCfsasAfgAfuCfuGfaGfaGfgAfcCfuGfsc 111 ACAAGAUCUGAGAGGACCUGC 197
J1M00059-AS usCfsasAfuGfaAfgGfgUfaCfgUfuGfuCfsg 112 UCAAUGAAGGGUACGUUGUCG 198
J1M00063-AS asAfsusCfuUfgCfuCfaUfgUfaUfcCfaCfsc 113 AAUCUUGCUCAUGUAUCCACC 199
J1M00072-AS usUfsgsUfcAfuUfuCfcCfaAfcCfaGfcUfsg 114 UUGUCAUUUCCCAACCAGCUG 200
J1M00074-AS usAfsgsUfgAfaAfaAfcUfgGfgAfaAfgGfsc 115 UAGUGAAAAACUGGGAAAGGC 201
J1M00077-AS usCfsusUfgCfuCfaUfgUfaUfcCfaCfcUfsu 116 UCUUGCUCAUGUAUCCACCUU 202
J1M00079-AS usCfsusUfgCfuCfaUfgUfaUfcCfaCfcUfsc 117 UCUUGCUCAUGUAUCCACCUC 203
J1M00082-AS usUfsasGfuUfaGfgUfgAfaAfaAfgGfuGfsc 118 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGC 204
J1M00113-AS cPrpusUfsasGfuUfaGfgUfgAfaAfaAfgGfuGfsu 119 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGU 205
J1M00114-AS usUfsasGfuUUNA aGfgUfgAfaAfaAfgGfuGfsu 120 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGU 205
J1M00115-AS usUfsasGfuUfAUNA GfgUfgAfaAfaAfgGfuGfsu 121 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGU 205
J1M00116-AS usUfsasGfuUfaGUNA gUfgAfaAfaAfgGfuGfsu 122 UUAGUUAGGUGAAAAAGGUGU 205
J1M00121-AS asUfscsCfaAfaUfaUfcCfuCfgAfaGfgCfsa 123 AUCCAAAUAUCCUCGAAGGCA 206
J1M00123-AS usCfsasUfgUfaUfcCfaCfcUfuUfgUfcUfsu 124 UCAUGUAUCCACCUUUGUCUU 207
J1M00125-AS usGfscsAfaAfuCfuUfgCfuCfaUfgUfaUfsc 125 UGCAAAUCUUGCUCAUGUAUC 208
J1M00127-AS usCfsasAfgUfuGfcAfaAfuCfuUfgCfuCfsa 126 UCAAGUUGCAAAUCUUGCUCA 209
J1M00129-AS usCfsasAfgUfuGfcAfaAfuCfuUfgCfuCfsg 127 UCAAGUUGCAAAUCUUGCUCG 210
J1M00133-AS usUfsusCfaUfaAfaAfcCfaAfcUfcAfgCfsu 128 UUUCAUAAAACCAACUCAGCU 211
表 4. PNPLA3 RNAi劑正義股序列
正義股 ID ： 經修飾之正義股 (5 ′ → 3 ′ ) SEQ ID NO. 下層鹼基序列 (5 ′ → 3 ′ ) （顯示為未經修飾之核苷酸序列） SEQ ID NO.
J1M00001-SS (NAG37)s(invAb)scaacguacCfCfUfucauugaugas(invAb) 129 CAACGUACCCUUCAUUGAUGA 212
J1M00003-SS (NAG37)s(invAb)scgacguacCfCfUfucauugaugas(invAb) 130 CGACGUACCCUUCAUUGAUGA 213
J1M00005-SS (NAG37)s(invAb)saccuuuccCfAfGfuuuuucacuas(invAb) 131 ACCUUUCCCAGUUUUUCACUA 214
J1M00007-SS (NAG37)s(invAb)scccuuuccCfAfGfuuuuucacuas(invAb) 132 CCCUUUCCCAGUUUUUCACUA 215
J1M00009-SS (NAG37)s(invAb)sguggauacAfUfGfagcaagauuus(invAb) 133 GUGGAUACAUGAGCAAGAUUU 216
J1M00011-SS (NAG37)s(invAb)scaucugccCfUfAfaagucaaguas(invAb) 134 CAUCUGCCCUAAAGUCAAGUA 217
J1M00013-SS (NAG37)s(invAb)scgucugccCfUfAfaagucaaguas(invAb) 135 CGUCUGCCCUAAAGUCAAGUA 218
J1M00015-SS (NAG37)s(invAb)sacaccuuuUfUfCfaccuaacuaas(invAb) 136 ACACCUUUUUCACCUAACUAA 219
J1M00019-SS (NAG37)s(invAb)scagguggaUfAfCfaugagcaagas(invAb) 137 CAGGUGGAUACAUGAGCAAGA 220
J1M00021-SS (NAG37)s(invAb)scagguggaUfAfCfaugaicaagas(invAb) 138 CAGGUGGAUACAUGAICAAGA 221
J1M00022-SS (NAG37)s(invAb)sucgguccaAfAfGfacgaagucius(invAb) 139 UCGGUCCAAAGACGAAGUCIU 222
J1M00024-SS (NAG37)s(invAb)sccaacguaCfCfCfuucauugauas(invAb) 140 CCAACGUACCCUUCAUUGAUA 223
J1M00026-SS (NAG37)s(invAb)scugccuucGfAfGfgauauuuigas(invAb) 141 CUGCCUUCGAGGAUAUUUIGA 224
J1M00028-SS (NAG37)s(invAb)sccaccuuuCfCfCfaguuuuucaas(invAb) 142 CCACCUUUCCCAGUUUUUCAA 225
J1M00030-SS (NAG37)s(invAb)sgagcugagUfUfGfguuuuaugaas(invAb) 143 GAGCUGAGUUGGUUUUAUGAA 226
J1M00033-SS (NAG37)s(invAb)sgucugaugGfGfGfaaaacguucus(invAb) 144 GUCUGAUGGGGAAAACGUUCU 227
J1M00035-SS (NAG37)s(invAb)scugaugGfGfGfaaaacguucuuus(invAb) 145 CUGAUGGGGAAAACGUUCUUU 228
J1M00037-SS (NAG37)s(invAb)suggggaaaAfCfGfuucugiuguas(invAb) 146 UGGGGAAAACGUUCUGIUGUA 229
J1M00039-SS (NAG37)s(invAb)scguucuggUfGfUfcugacuuucas(invAb) 147 CGUUCUGGUGUCUGACUUUCA 230
J1M00041-SS (NAG37)s(invAb)sgugagugaCfAfAfcguacccuuas(invAb) 148 GUGAGUGACAACGUACCCUUA 231
J1M00045-SS (NAG37)s(invAb)scacgacauCfUfGfcccuaaaguas(invAb) 149 CACGACAUCUGCCCUAAAGUA 232
J1M00049-SS (NAG37)s(invAb)scgagauuuGfCfAfacuuicuacas(invAb) 150 CGAGAUUUGCAACUUICUACA 233
J1M00051-SS (NAG37)s(invAb)sucgguccaAfAfGfacgaagucgus(invAb) 151 UCGGUCCAAAGACGAAGUCGU 234
J1M00053-SS (NAG37)s(invAb)sucgguccaAfAfGfacgaaiucgus(invAb) 152 UCGGUCCAAAGACGAAIUCGU 235
J1M00054-SS (NAG37)s(invAb)sccaccuuuUfUfCfaccuaacua_2Nas(invAb) 153 CCACCUUUUUCACCUAACU(A2N )A 236
J1M00056-SS (NAG37)s(invAb)sgcagiuccUfCfUfcagaucuugus(invAb) 154 GCAGIUCCUCUCAGAUCUUGU 237
J1M00058-SS (NAG37)s(invAb)scgacaacgUfAfCfccuucauugas(invAb) 155 CGACAACGUACCCUUCAUUGA 238
J1M00062-SS (NAG37)s(invAb)sgguggauaCfAfUfgagcaagauus(invAb) 156 GGUGGAUACAUGAGCAAGAUU 239
J1M00071-SS (NAG37)s(invAb)scagcugguUfGfGfgaaaugacaas(invAb) 157 CAGCUGGUUGGGAAAUGACAA 240
J1M00073-SS (NAG37)s(invAb)sgccuuuccCfAfGfuuuuucacuas(invAb) 158 GCCUUUCCCAGUUUUUCACUA 241
J1M00076-SS (NAG37)s(invAb)saagguggaUfAfCfaugaicaagas(invAb) 159 AAGGUGGAUACAUGAICAAGA 242
J1M00078-SS (NAG37)s(invAb)sgagguggaUfAfCfaugaicaagas(invAb) 160 GAGGUGGAUACAUGAICAAGA 243
J1M00080-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NagguggaUfAfCfaugaicaagas(invAb) 161 (A2N )AGGUGGAUACAUGAICAAGA 244
J1M00081-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccuuuUfUfCfaccuaacuaas(invAb) 162 GCACCUUUUUCACCUAACUAA 245
J1M00083-SS (NAG37)s(invAb)sgcaccuuuUfUfCfaccuaacua_2Nas(invAb) 163 GCACCUUUUUCACCUAACUAA 246
J1M00084-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NcaccuuuUfUfCfaccuaacuaas(invAb) 164 (A2N )CACCUUUUUCACCUAACUAA 247
J1M00117-SS (NAG37)s(invAb)sacaccuuuUfUfCfaccuaacua_2Nas(invAb) 165 ACACCUUUUUCACCUAACU(A2N )A 248
J1M00118-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NcaccuuuUfUfCfaccuaacua_2Nas(invAb) 166 (A2N )CACCUUUUUCACCUAACUAA 249
J1M00119-SS (NAG37)s(invAb)sacAfcCfuUfuUfUfCfaccuaacuaas(invAb) 167 ACACCUUUUUCACCUAACUAA 250
J1M00120-SS (NAG37)s(invAb)sugccuucgAfGfGfauauuuggaus(invAb) 168 UGCCUUCGAGGAUAUUUGGAU 251
J1M00122-SS (NAG37)s(invAb)sa_2NagacaaaGfGfUfggauacaugas(invAb) 169 (A2N )AGACAAAGGUGGAUACAUGA 252
J1M00124-SS (NAG37)s(invAb)sga_2NuacaugAfGfCfaagauuugcas(invAb) 170 G(A2N )UACAUGAGCAAGAUUUGCA 253
J1M00126-SS (NAG37)s(invAb)sugagcaagAfUfUfugcaacuugas(invAb) 171 UGAGCAAGAUUUGCAACUUGA 254
J1M00128-SS (NAG37)s(invAb)scgagcaagAfUfUfugcaacuugas(invAb) 172 CGAGCAAGAUUUGCAACUUGA 255
J1M00132-SS (NAG37)s(invAb)sagcugaguUfGfGfuuuuaugaaas(invAb) 173 AGCUGAGUUGGUUUUAUGAAA 256
(A2N ) = 2-胺基腺嘌呤核苷酸；I =次黃嘌呤（肌苷）核苷酸
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑係藉由黏合反義股與正義股來形成。含有表2或表4中所列示之序列的正義股可與含有表2或表3中所列示之序列的任何反義股雜交，前提是這兩個序列在連續16、17、18、19、20、或21個核苷酸序列上具有至少約85%互補性的區域。
在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的反義股與表3中任何反義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的正義股與表4中任何正義股序列有0、1、2、或3個核苷酸不同。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表2或表3中任何序列之核苷酸序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表2或表3中任何序列之核苷酸（由5′端→3′端）1至17、2至17、1至18、2至18、1至19、2至19、1至20、2至20、1至21、或2至21的序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑反義股包含表3中任一經修飾之序列的經修飾之序列或由表4中任一經修飾之序列的經修飾之序列所組成。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包含表2或表4中任何序列之核苷酸序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包含表2或表4中任何序列之核苷酸（由5′端→3′端）1至17、2至17、3至17、4至17、1至18、2至18、3至18、4至18、1至19、2至19、3至19、4至19、1至20、2至20、3至20、4至20、1至21、2至21、3至21、或4至21之序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑正義股包含表4中任一經修飾之序列的經修飾之序列或由表4中任一經修飾之序列的經修飾之序列所組成。
針對本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）可與PNPLA3基因完美互補，或者可與PNPLA3基因非互補。在一些實施例中，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）係U、A、或dT（或其經修飾之版本）。在一些實施例中，在反義股之位置1處的核苷酸（由5′端→3′端）與正義股形成A:U或U:A鹼基對。
含有表2或表4中所列示之序列的正義股可與含有表2或表3中所列示之序列的任何反義股雜交，前提是這兩個序列在連續16、17、18、19、20、或21個核苷酸序列上具有至少約85%互補性的區域。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑具有由表4中任何經修飾之序列的經修飾之序列所組成的正義股，以及由表3中任何經修飾之序列的經修飾之序列所組成的反義股。某些代表性序列配對係以表5A及表5B中所示之雙鏈體ID No.來例示。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：由本文中所提出之任一雙鏈體ID No.所代表的雙鏈體。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含由本文中所提出之任何雙鏈體ID No.所代表的正義股及反義股核苷酸序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含由本文中所提出之任何雙鏈體ID No.所代表的正義股及反義股核苷酸序列及靶向基團及/或鍵聯基，其中該靶向基團及/或鍵聯基係共價鍵聯（亦即，偶聯）至該正義股或該反義股。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包括由本文中所提出之任何雙鏈體ID No.的正義股及反義股經修飾之核苷酸序列。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含由本文中所提出之任何雙鏈體ID No.的正義股及反義股經修飾之核苷酸序列及靶向基團及/或鍵聯基，其中該靶向基團及/或鍵聯基係共價鍵聯至該正義股或該反義股。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含反義股及正義股，該反義股及正義股具有表2或表5A及表5B之任何反義股/正義股雙鏈體的核苷酸序列，且進一步包含靶向基團或靶向配體。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含反義股及正義股，該反義股及正義股具有表2或表5A及表5B之任何反義股/正義股雙鏈體的核苷酸序列，且進一步包含去唾液酸糖蛋白受體配體靶向基團。
靶向基團（在具有或不具有連接子下）可鍵聯至表2、表3、及表4所揭示之任何正義股及/或反義股之5′或3′端。連接子（在具有或不具有靶向基團下）可附接至表2、表3、及表4所揭示之任何正義股及/或反義股之5′或3′端。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含反義股及正義股，該反義股及正義股具有表2或表5A及表5B之任何反義股/正義股雙鏈體的核苷酸序列，且進一步包含選自由：(NAG37)及(NAG37)s所組成之群組的靶向配體，各如表6中所定義。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含反義股及正義股，該反義股及正義股具有表3或表4中之任何反義股及/或正義股核苷酸序列的經修飾之核苷酸序列。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含反義股及正義股，該反義股及正義股具有任何雙鏈體表5A及表5B之任何反義股及/或正義股核苷酸序列的經修飾之核苷酸序列，且進一步包含去唾液酸糖蛋白受體配體靶向基團。
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：表5A及5B之任何雙鏈體。表 5A. PNPLA3 RNAi劑雙鏈體以及對應之正義股及反義股ID編號
雙鏈體ID 反義股ID 正義股ID   雙鏈體ID 反義股ID 正義股ID
J1D00001 J1M00002-AS J1M00001-SS   J1D00041 J1M00074-AS J1M00073-SS
J1D00002 J1M00004-AS J1M00003-SS   J1D00043 J1M00077-AS J1M00076-SS
J1D00003 J1M00006-AS J1M00005-SS   J1D00044 J1M00079-AS J1M00078-SS
J1D00004 J1M00008-AS J1M00007-SS   J1D00045 J1M00077-AS J1M00080-SS
J1D00005 J1M00010-AS J1M00009-SS   J1D00046 J1M00082-AS J1M00081-SS
J1D00006 J1M00012-AS J1M00011-SS   J1D00047 J1M00082-AS J1M00083-SS
J1D00007 J1M00014-AS J1M00013-SS   J1D00048 J1M00016-AS J1M00084-SS
J1D00008 J1M00016-AS J1M00015-SS   J1D00074 J1M00113-AS J1M00015-SS
J1D00010 J1M00020-AS J1M00019-SS   J1D00075 J1M00114-AS J1M00015-SS
J1D00011 J1M00020-AS J1M00021-SS   J1D00076 J1M00115-AS J1M00015-SS
J1D00012 J1M00023-AS J1M00022-SS   J1D00077 J1M00116-AS J1M00015-SS
J1D00013 J1M00025-AS J1M00024-SS   J1D00078 J1M00016-AS J1M00117-SS
J1D00014 J1M00027-AS J1M00026-SS   J1D00079 J1M00016-AS J1M00118-SS
J1D00015 J1M00029-AS J1M00028-SS   J1D00080 J1M00016-AS J1M00119-SS
J1D00016 J1M00031-AS J1M00030-SS   J1D00081 J1M00121-AS J1M00120-SS
J1D00017 J1M00032-AS J1M00019-SS   J1D00082 J1M00123-AS J1M00122-SS
J1D00018 J1M00034-AS J1M00033-SS   J1D00083 J1M00125-AS J1M00124-SS
J1D00019 J1M00036-AS J1M00035-SS   J1D00084 J1M00127-AS J1M00126-SS
J1D00020 J1M00038-AS J1M00037-SS   J1D00085 J1M00129-AS J1M00128-SS
J1D00021 J1M00040-AS J1M00039-SS   J1D00087 J1M00133-AS J1M00132-SS
J1D00022 J1M00042-AS J1M00041-SS        
J1D00024 J1M00046-AS J1M00045-SS        
J1D00026 J1M00050-AS J1M00049-SS        
J1D00027 J1M00052-AS J1M00051-SS        
J1D00028 J1M00052-AS J1M00022-SS        
J1D00029 J1M00023-AS J1M00053-SS        
J1D00032 J1M00057-AS J1M00056-SS        
J1D00033 J1M00059-AS J1M00058-SS        
J1D00035 J1M00063-AS J1M00062-SS        
J1D00040 J1M00072-AS J1M00071-SS        
表 5B. PNPLA3 RNAi劑雙鏈體以及對應正義股及反義股ID編號與經修飾及未經修飾之核苷酸序列的序列ID編號。
雙鏈體 AS ID AS 經修飾之SEQ ID NO: AS 未經修飾之SEQ ID NO: SS ID SS 經修飾之SEQ ID NO: SS 未經修飾之SEQ ID NO:
J1D00001 J1M00002-AS 88 174 J1M00001-SS 129 212
J1D00002 J1M00004-AS 89 175 J1M00003-SS 130 213
J1D00003 J1M00006-AS 90 176 J1M00005-SS 131 214
J1D00004 J1M00008-AS 91 177 J1M00007-SS 132 215
J1D00005 J1M00010-AS 92 178 J1M00009-SS 133 216
J1D00006 J1M00012-AS 93 179 J1M00011-SS 134 217
J1D00007 J1M00014-AS 94 180 J1M00013-SS 135 218
J1D00008 J1M00016-AS 95 181 J1M00015-SS 136 219
J1D00010 J1M00020-AS 96 182 J1M00019-SS 137 220
J1D00011 J1M00020-AS 96 183 J1M00021-SS 138 221
J1D00012 J1M00023-AS 97 184 J1M00022-SS 139 222
J1D00013 J1M00025-AS 98 185 J1M00024-SS 140 223
J1D00014 J1M00027-AS 99 186 J1M00026-SS 141 224
J1D00015 J1M00029-AS 100 187 J1M00028-SS 142 225
J1D00016 J1M00031-AS 101 188 J1M00030-SS 143 226
J1D00017 J1M00032-AS 102 189 J1M00019-SS 137 220
J1D00018 J1M00034-AS 103 190 J1M00033-SS 144 227
J1D00019 J1M00036-AS 104 191 J1M00035-SS 145 228
J1D00020 J1M00038-AS 105 192 J1M00037-SS 146 229
J1D00021 J1M00040-AS 106 193 J1M00039-SS 147 230
J1D00022 J1M00042-AS 107 194 J1M00041-SS 148 231
J1D00024 J1M00046-AS 108 195 J1M00045-SS 149 232
J1D00026 J1M00050-AS 109 196 J1M00049-SS 150 233
J1D00027 J1M00052-AS 110 197 J1M00051-SS 151 234
J1D00028 J1M00052-AS 110 198 J1M00022-SS 152 222
J1D00029 J1M00023-AS 97 183 J1M00053-SS 153 235
J1D00032 J1M00057-AS 111 199 J1M00056-SS 154 237
J1D00033 J1M00059-AS 112 200 J1M00058-SS 155 238
J1D00035 J1M00063-AS 113 201 J1M00062-SS 156 239
J1D00040 J1M00072-AS 114 202 J1M00071-SS 157 240
J1D00041 J1M00074-AS 115 203 J1M00073-SS 158 241
J1D00043 J1M00077-AS 116 204 J1M00076-SS 159 242
J1D00044 J1M00079-AS 117 205 J1M00078-SS 160 243
J1D00045 J1M00077-AS 116 206 J1M00080-SS 161 244
J1D00046 J1M00082-AS 118 207 J1M00081-SS 162 245
J1D00047 J1M00082-AS 118 207 J1M00083-SS 163 246
J1D00048 J1M00016-AS 95 181 J1M00084-SS 164 247
J1D00074 J1M00113-AS 119 210 J1M00015-SS 136 219
J1D00075 J1M00114-AS 120 211 J1M00015-SS 136 219
J1D00076 J1M00115-AS 121 212 J1M00015-SS 136 219
J1D00077 J1M00116-AS 122 213 J1M00015-SS 136 219
J1D00078 J1M00016-AS 95 181 J1M00117-SS 165 248
J1D00079 J1M00016-AS 95 181 J1M00118-SS 166 249
J1D00080 J1M00016-AS 95 181 J1M00119-SS 167 250
J1D00081 J1M00121-AS 123 206 J1M00120-SS 168 251
J1D00082 J1M00123-AS 124 207 J1M00122-SS 169 252
J1D00083 J1M00125-AS 125 208 J1M00124-SS 170 253
J1D00084 J1M00127-AS 126 209 J1M00126-SS 171 254
J1D00085 J1M00129-AS 127 210 J1M00128-SS 172 255
J1D00087 J1M00133-AS 128 211 J1M00132-SS 173 256
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑係製備或提供為鹽、混合鹽、或游離酸。本文中所述之RNAi劑在遞送至表現PNPLA3基因之細胞後會體內及/或體外抑制或減少一或多種PNPLA3基因的表現。靶向配體或基團、鍵聯基、及遞送媒劑
在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑係偶聯至一或多個非核苷酸基團，包括但不限於靶向基團、鍵聯基、靶向配體、遞送聚合物、或遞送媒劑。非核苷酸基團可增強RNAi劑的靶向、遞送、或附接。靶向基團及鍵聯基之實例係提供於表6中。非核苷酸基團可與正義股及/或反義股之3′及/或5′端共價鍵聯。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑含有鍵聯至正義股之3′及/或5′端的非核苷酸基團。在一些實施例中，非核苷酸基團係鍵聯至PNPLA3 RNAi劑正義股之5′端。非核苷酸基團可經由連接子/鍵聯基直接或間接鍵聯至RNAi劑。在一些實施例中，非核苷酸基團係經由不穩定、可切割、或可逆的鍵結或連接子鍵聯至RNAi劑。
在一些實施例中，非核苷酸基團增強了RNAi劑或其所附接之偶聯物的藥物動力學或生物分佈性質，從而改善RNAi劑或偶聯物之細胞或組織特異性分佈及細胞特異性攝取。在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi劑的胞吞(endocytosis)。
靶向基團或靶向部份增強了其所附接之偶聯物或RNAi劑的藥物動力學或生物分佈性質，從而改善偶聯物或RNAi劑之細胞特異性（包括，在一些情況下，器官特異性）分佈及細胞特異性（或器官特異性）攝取。靶向基團對於其所指向之目標可係單價、二價、三價、四價的、或具有更高價數。代表性靶向基團包括但不限於對細胞表面分子具有親和力之化合物、細胞受體配體、不全抗原、抗體、單株抗體、抗體片段、及對細胞表面分子具有親和力之抗體模擬物。
在一些實施例中，靶向基團係使用連接子來鍵聯至RNAi劑，諸如PEG連接子或一、二、或三個之無鹼基及/或核糖醇（無鹼基核糖）殘基，其在一些情況下可作為連接子。在一些實施例中，靶向配體包含半乳糖衍生物團簇。
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑可合成為在5′-端及/或3′-端具有反應性基團，諸如胺基（在本文中亦稱為胺）。反應性基團後續可使用所屬技術領域中之典型方法而用於附接靶向部份。
在一些實施例中，靶向基團包含去唾液酸糖蛋白受體配體。如本文中所使用，去唾液酸糖蛋白受體配體是一種含有對去唾液酸糖蛋白受體具有親和性之部份的配體。如本文中所述，去唾液酸糖蛋白受體在肝細胞上有高度表現。在一些實施例中，去唾液酸糖蛋白受體配體包括一或多種半乳糖衍生物或由其組成。如本文中所使用，用語半乳糖衍生物包括以下兩者：半乳糖；及半乳糖衍生物，其對去唾液酸糖蛋白受體所具有的親和力等於或大於半乳糖的親和力。半乳糖衍生物包括但不限於：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺、及N-異丁醯基半乳糖胺（參見例如S.T. Iobst and K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686）。有用於寡核苷酸及其他分子在體內靶向肝臟之半乳糖衍生物、及半乳糖衍生物團簇，係所屬技術領域中已知的（參見例如Baenziger and Fiete、1980、Cell、22、611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。
半乳糖衍生物已用於透過其與在肝細胞表面上表現的去唾液酸糖蛋白受體結合，在體內將分子靶向肝細胞。去唾液酸糖蛋白受體配體與（多個）去唾液酸糖蛋白受體的結合有利於細胞特異性靶向至肝細胞及分子胞吞於肝細胞中。去唾液酸糖蛋白受體配體可係單體的（例如，具有單一半乳糖衍生物，亦稱為單價或單牙的）或多聚體的（例如，具有多種半乳糖衍生物）。可使用所屬技術領域中已知的方法，將半乳糖衍生物或半乳糖衍生物團簇附接至RNAi劑之正義股或反義股的3′或5′端。靶向配體（諸如半乳糖衍生物團簇）的製備係描述於例如Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2018/044350號及Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2017/156012號，這兩者係以引用方式全文併入本文中。
如本文中所使用，半乳糖衍生物團簇包含具有二至四個末端半乳糖衍生物的分子。末端半乳糖衍生物透過其C-1碳附接至分子。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇係半乳糖衍生物三聚體（亦稱為三觸角型半乳糖衍生物或三價半乳糖衍生物）。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇包含N-乙醯基-半乳糖胺。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇包含三個N-乙醯基-半乳糖胺。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇係半乳糖衍生物四聚體（亦稱為四觸角型半乳糖衍生物或四價半乳糖衍生物）。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇包含四個N-乙醯基-半乳糖胺。
如本文中所使用，半乳糖衍生物三聚體含有三個半乳糖衍生物，其各自鍵聯至中央分支點。如本文中所使用，半乳糖衍生物四聚體含有四個半乳糖衍生物，其各自鍵聯至中央分支點。半乳糖衍生物可透過醣類之C-1碳附接至中央分支點。在一些實施例中，半乳糖衍生物係經由連接子或間隔子鍵聯至分支點。在一些實施例中，連接子或間隔子係可撓性親水性間隔子，諸如PEG基團（參見例如，美國專利第5,885,968號；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。在一些實施例中，PEG間隔子係PEG3 間隔子。分支點可係允許三個半乳糖衍生物附接且進一步允許分支點附接至RNAi劑的任何小分子。分支點基團之實例係二離胺酸或二麩胺酸。分支點附接至RNAi劑可透過連接子或間隔子發生。在一些實施例中，連接子或間隔子包含可撓性親水性間隔子，諸如但不限於PEG間隔子。在一些實施例中，連接子包含剛性連接子，諸如環狀基團。在一些實施例中，半乳糖衍生物包含N-乙醯基-半乳糖胺或由其組成。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇包含半乳糖衍生物四聚體，其可係例如N-乙醯基-半乳糖胺四聚體。
本揭露之實施例包括用於將PNPLA3 RNAi劑體內遞送至肝細胞之醫藥組成物。此類醫藥組成物可包括例如偶聯至半乳糖衍生物團簇之PNPLA3 RNAi劑。在一些實施例中，半乳糖衍生物團簇包含半乳糖衍生物三聚體（其可係例如N-乙醯基-半乳糖胺三聚體）或半乳糖衍生物四聚體，其可係例如N-乙醯基-半乳糖胺四聚體。
靶向配體或靶向基團可鍵聯至本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的正義股或反義股之3′或5′端。
靶向配體包括但不限於如表6中所定義之(NAG37)及(NAG37)s。其他靶向基團及靶向配體（包括半乳糖團簇靶向配體）在所屬技術領域中係已知的。
在一些實施例中，鍵聯基係偶聯至RNAi劑。鍵聯基有利於該劑共價鍵聯至靶向基團、遞送聚合物、或遞送媒劑。鍵聯基可鍵聯至RNAi劑正義股或反義股之3′及/或5′端。在一些實施例中，鍵聯基係鍵聯至RNAi劑正義股。在一些實施例中，鍵聯基係與RNAi劑正義股之5′或3′端偶聯。在一些實施例中，鍵聯基係與RNAi劑正義股之5′端偶聯。鍵聯基之實例可包括但不限於反應性基團，諸如一級胺及炔、烷基、無鹼基核苷酸、核糖醇（無鹼基核糖）、及/或PEG基團。
在一些實施例中，靶向基團係內部鍵聯至RNAi劑之正義股及/或反義股上的核苷酸。在一些實施例中，靶向基團係經由連接子(linker)鍵聯至RNAi劑。
連接子或鍵聯基係在兩個原子之間的連接，該連接經由一或多種共價鍵，將一個化學基團（諸如RNAi劑）或受關注區段鍵聯至另一個化學基團（諸如靶向基團或遞送聚合物）或受關注區段。不穩定鍵聯含有不穩定鍵結。鍵聯可選地可包括間隔子，其會增加在兩個連接原子之間的距離。間隔子可進一步增加鍵聯的可撓性及/或長度。間隔子包括但不限於烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、及芳炔基；其各者可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸、及醣類。間隔子基團係所屬技術領域中所熟知，且前述清單不意欲限制說明之範疇。
在一些實施例中，當將二或更多種PNPLA3 RNAi劑包括在單一組成物中時，各RNAi劑可鍵聯至同一個靶向基團或兩個不同的靶向基團（亦即，具有不同化學結構之靶向基團）。在一些實施例中，靶向基團係在不使用額外連接子的情況下，鍵聯至本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑。在一些實施例中，靶向基團本身係設計為具有連接子或其他促進偶聯輕易存在之位點。在一些實施例中，當將二或更多種PNPLA3 RNAi劑包括在單一分子中時，各RNAi劑可利用同一個連接子或不同的連接子（亦即，具有不同化學結構之連接子）。
表2、表3、或表4中所列示之任何PNPLA3 RNAi劑核苷酸序列（無論是經修飾還是未經修飾的）可含有3′及/或5′（多個）靶向基團及/或（多個）鍵聯基。含有3′或5′靶向基團或鍵聯基之表3或表4中所列示（或另外在本文中所述）之任何PNPLA3 RNAi劑序列，可替代地不含3′或5′靶向基團或鍵聯基，或者可含有不同的3′或5′靶向基團或鍵聯基，包括但不限於表6中所描述者。表5A及表5B中所列示之任何PNPLA3 RNAi劑雙鏈體（無論是經修飾還是未經修飾的）可進一步包含靶向基團或鍵聯基（包括但不限於表6中所描述者），而且靶向基團或鍵聯基可附接至PNPLA3 RNAi劑雙鏈體之正義股或反義股的3′或5′端。
靶向基團及鍵聯基（當組合時可形成靶向配體）係提供於表6中。表4提供PNPLA3 RNAi劑正義股的數個實施例，該等正義股具有鍵聯至5′或3′端之靶向基團或鍵聯基。表 6. 代表各種經修飾之核苷酸、靶向配體或靶向基團、加帽殘基、及鍵聯基的結構
Figure 02_image007
cPrpus		  
Figure 02_image009
cPrpu
Figure 02_image011
a_2N		  
Figure 02_image013
a_2Ns
Figure 02_image015
AUNA 		 
Figure 02_image017
AUNA s
Figure 02_image019
CUNA 		 
Figure 02_image021
CUNA s
Figure 02_image023
GUNA 		 
Figure 02_image025
GUNA s
Figure 02_image027
UUNA 		 
Figure 02_image029
UUNA s
當位於內部時：
Figure 02_image031
( invAb)
當位於內部時：
Figure 02_image033
( invAb)s
當位於3′末端時：
Figure 02_image035
( invAb)
Figure 02_image037
(NAG37)
Figure 02_image039
(NAG37)s  
在表6中之各個以上結構中，NAG包含所會附接之N-乙醯基-半乳糖胺或另一種半乳糖衍生物，如所屬技術領域中具有通常知識者在考慮到以上結構及本文中所提供之說明下所會瞭解。
各(NAGx)可經由磷酸酯基（如在(NAG37)中）、或硫代磷酸酯基（如在(NAG37)s中）、或另一個鍵聯基來附接至PNPLA3 RNAi劑。
Figure 02_image041
Figure 02_image043
磷酸酯基                    硫代磷酸酯基 可使用所屬技術領域中已知的其他鍵聯基。
在一些實施例中，遞送媒劑可用於將RNAi劑遞送至細胞或組織。遞送媒劑係改善RNAi劑至細胞或組織的遞送之化合物。遞送媒劑可包括下列或由下列組成，但不限於：聚合物，諸如兩親性聚合物、膜活性聚合物、肽、蜂毒肽、類蜂毒肽(melittin-like peptide, MLP)、脂質、經可逆修飾的聚合物或肽、或經可逆修飾的膜活性多胺。在一些實施例中，RNAi劑可與下列組合：脂質、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC、或所屬技術領域中可用之其他遞送系統。RNAi劑亦可化學偶聯至靶向基團、脂質（包括但不限於膽固醇及膽固醇基衍生物）、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC（參見例如WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169、及WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其各者係以引用之方式併入本文中）、水凝膠、環糊精、生物可分解奈米囊、及生物黏著性微球、蛋白質載體、或其他如所屬技術領域中已知及可得之適用於核酸或寡核苷酸遞送的遞送系統。醫藥組成物及配方
本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑可製備為醫藥組成物或配方（在本文中亦稱為「藥劑」）。在一些實施例中，醫藥組成物包括至少一種PNPLA3 RNAi劑。此等醫藥組成物係具體有用於抑制目標細胞、細胞群、組織、或生物體中之目標mRNA表現。
醫藥組成物可用於治療患有疾病、病症、或病況之對象，該對象會受益於目標PNPLA3 mRNA水平之降低或目標基因表現之抑制。醫藥組成物可用於治療具有發展疾病、病症、或病況之風險的對象，該對象會受益於目標mRNA水平之降低或目標基因表現之抑制。在一個實施例中，該方法包括向所欲治療之對象投予如本文中所述之鍵聯至靶向配體的PNPLA3 RNAi劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥上可接受之賦形劑（包括媒劑、載劑、稀釋劑、及/或遞送聚合物）添加至包括PNPLA3 RNAi劑之醫藥組成物，從而形成適用於體內遞送至對象（包括人類）之醫藥配方或藥劑。
本文中所揭示之包括PNPLA3 RNAi劑的醫藥組成物及方法可降低細胞、細胞群、組織、器官、或對象中之目標mRNA水平，包括藉由向該對象投予治療有效量的本文中所述之PNPLA3 RNAi劑，從而抑制該對象中之PNPLA3 mRNA表現。在一些實施例中，該對象先前已識別或診斷出在所靶向之細胞或組織中具有目標基因之病原性向上調控。在一些實施例中，該對象先前已識別或診斷出具有NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（諸如肝硬化）。在一些實施例中，該對象患有與NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（諸如肝硬化）相關聯之症狀。
在一些實施例中，包括PNPLA3 RNAi劑之所述醫藥組成物係用於治療或管理與NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）及/或PNPLA3在對象中之過度表現相關聯的臨床表現。在一些實施例中，向需要此類治療之對象投予治療（包括疾病預防）有效量的一或多種醫藥組成物。在一些實施例中，任何所揭示之PNPLA3 RNAi劑的投予可用於減少對象中疾病症狀之數目、嚴重性、及/或頻率。
包括PNPLA3 RNAi劑之所述醫藥組成物可用於治療患有疾病或病症之對象中的至少一種症狀，該對象會受益於PNPLA3 mRNA表現之降低或抑制。在一些實施例中，該對象係經投予治療有效量的一或多種包括PNPLA3 RNAi劑之醫藥組成物，從而治療該症狀。在其他實施例中，該對象係經投予疾病預防有效量的一或多種PNPLA3 RNAi劑，從而預防或抑制該至少一種症狀。
投予途徑係藉以使PNPLA3 RNAi劑與身體接觸之路徑。大致上，投予藥物及寡核苷酸與核酸以用於治療哺乳動物之方法係所屬技術領域中所熟知的，且可應用於投予本文中所述之組成物。本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑可以經由任何合適途徑在製劑中投予，該製劑係針對該特定途徑加以適當調整。因此，本文所述之醫藥組成物可藉由注射投予，例如靜脈內、肌內、皮內、皮下、關節內、或腹膜內注射投予。在一些實施例中，本文中所述之醫藥組成物係經由皮下注射來投予。
可使用所屬技術領域中已知的寡核苷酸遞送技術，將包括本文中所述之PNPLA3 RNAi劑的醫藥組成物遞送至細胞、細胞群、組織、或對象。大致上，所屬技術領域中認知用於遞送核酸分子（體外或體內）之任何合適方法可經調適，以用於與本文中所述之組成物搭配使用。例如，遞送可藉由局部(local)投予（例如，直接注射、植入、或外用(topical)投予）、全身性投予、或皮下、靜脈內、腹膜內、或非經腸途徑，包括顱內（例如，室內(intraventricular)、實質內(intraparenchymal)、及鞘內）、肌內、經皮、呼吸道（氣霧劑）、經鼻、口服、經直腸、或外用（包括經頰及舌下）投予。在某些實施例中，組成物係藉由皮下或靜脈內輸注或注射投予。
在一些實施例中，本文中所述之醫藥組成物包含一或多種醫藥上可接受之賦形劑。本文中所述之醫藥組成物係經配製以用於向對象投予。
如本文中所使用，醫藥組成物或藥劑包括藥理有效量的至少一種所述治療化合物及一或多種醫藥上可接受之賦形劑。醫藥上可接受之賦形劑（多種賦形劑）係活性醫藥成分（API，治療產品，例如PNPLA3 RNAi劑）以外之物質，其係刻意包括在藥物遞送系統中。賦形劑在預期劑量下不會發揮或不意欲發揮治療效應。賦形劑可發揮下列作用：a)在製造期間協助處理藥物遞送系統；b)保護、支持或增強API之穩定性、生體可用率、或患者接受性；c)協助產物識別；及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之整體安全性、有效性的任何其他屬性。醫藥上可接受的賦形劑可係或可非惰性物質。
賦形劑包括但不限於：吸收增強劑、抗黏劑、消泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、洗滌劑、葡聚糖(dextran)、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑(extender)、填料、調味、助流劑、保濕劑、潤滑劑、油、聚合物、保存劑、鹽水、鹽、溶劑、糖、界面活性劑、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、撥水劑(water-repelling agent)、及濕潤劑。
適用於可注射使用之醫藥組成物包括無菌水溶液（其中具水溶性）或分散液，以及用於即席製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。針對靜脈內投予，合適的載體包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, NJ)、或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。合適載劑應在製造與儲存的條件下具有穩定性，且應在不受到微生物（諸如細菌及真菌）污染作用下保存。載劑可係含有下列之溶劑或分散介質：例如，水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇）、及其合適混合物。適當流動性可例如藉由使用塗層（諸如卵磷脂）、在分散液的情況下藉由維持所需粒徑、且藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況中，較佳的是在組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露醇、山梨醇）、或氯化鈉。可注射組成物之延長吸收可藉由在組成物中包括延遲吸收之試劑例（例如，單硬脂酸鋁及明膠）來實現。
無菌的可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與以上列舉之一種或組成成分（視需要）一起摻入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。通常，分散液係藉由將活性化合物摻入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有基本分散介質及來自以上所列舉者之必需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，產生活性成分加上其先前無菌過濾溶液之任何額外所欲成分的粉劑。
在一些實施例中，適用於皮下投予的包括本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的醫藥配方可製備於磷酸鈉緩衝水溶液（例如，配製於0.5 mM磷酸二氫鈉，0.5 mM磷酸氫二鈉中，於水中之PNPLA3 RNAi劑）中。
適用於關節內投予之配方可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質體配方或生物可降解聚合物系統亦可用於呈現藥物以用於關節內及眼用投予。
亦可製備適用於口服投予本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑的配方。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑係經口服投予。在一些實施例中，本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑係配製於用於口服投予之膠囊中。
活性化合物可用將防止化合物自身體快速排除的載劑來製備，諸如控制釋放型配方（包括植入物及微膠囊化遞送系統）。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)及聚乳酸。用於製備此類配方之方法，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言將係顯而易知者。脂質體懸浮液亦可用於作為醫藥上可接受的載劑。此等可根據所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法製備，例如，如美國專利第4,522,811號所述。
PNPLA3 RNAi劑可以劑量單位形式配製於組成物中以方便投予及統一劑量。劑量單位形式係指適合作為單位劑量用於欲治療的患者的物理離散單位；各單位含有預定量之活性化合物，該量經計算以與所需醫藥載劑聯合產生所欲治療效果。用於本揭露之劑量單位形式之規格取決並直接依賴於：活性化合物的獨特特徵及欲達到的治療效應，及在所屬技術領域中複合用於治療個體之此類活性化合物的固有限制。
醫藥組成物可含有醫藥組成物中常見的其他額外組分。此類額外組分包括但不限於止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑、止痛劑、抗組織胺、或消炎劑（例如，乙醯胺酚、NSAID、苯海拉明(diphenhydramine)等）。亦預想到表現或包含本文中所定義之RNAi劑的細胞、組織或經分離之器官可用作為「醫藥組成物」。如本文中所使用，「藥理有效量(pharmacologically effective amount)」、「治療有效量(therapeutically effective amount)」、或單純「有效量(effective amount)」係指可產生藥理性、治療性或預防性結果的RNAi劑之量。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法進一步包含除了投予本文中所揭示之RNAi劑以外尚投予第二治療劑或治療的步驟。在一些實施例中，第二治療劑係另一種PNPLA3 RNAi劑（例如，靶向PNPLA3目標內之不同序列的PNPLA3 RNAi劑）。在其他實施例中，第二治療劑可為小分子藥物、抗體、抗體片段、或適體(aptamer)。
在一些實施例中，所述（多種）PNPLA3 RNAi劑係可選地與一或多種額外治療劑組合。PNPLA3 RNAi劑及額外治療劑可在單一組成物中投予，或者其等可分開投予。在一些實施例中，一或多種額外治療劑係以單獨劑量形式與RNAi劑分開投予（例如，PNPLA3 RNAi試劑係藉由皮下注射來投予，而涉及治療給藥方案之額外治療劑則係口服投予）。在一些實施例中，所述（多種）PNPLA3 RNAi劑係經由皮下注射來向有此需要之對象投予，而一或多種可選的額外治療劑則係口服投予，其一起提供用於NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）相關聯之疾病及病況的治療方案。在一些實施例中，所述（多種）PNPLA3 RNAi劑係經由皮下注射來向有此需要之對象投予，而一或多種可選的額外治療劑則係經由分開的皮下注射來投予。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑及一或多種額外治療劑係組合成單一劑量形式（例如，配製成單一組成物以用於皮下注射之「雞尾酒配方(cocktail)」）。PNPLA3 RNAi劑（連同或未連同一或多種額外治療劑）可與一或多種賦形劑組合以形成醫藥組成物。
大致上，PNPLA3 RNAi劑的有效量將在約0.1至約100 mg/kg體重/劑量（例如，約1.0至約50 mg/kg體重/劑量）之範圍內。在一些實施例中，活性化合物的有效量將在每次劑量約0.25至約5 mg/kg體重之範圍內。在一些實施例中，活性成分的有效量將在每次劑量約0.5至約4 mg/kg體重之範圍內。給藥可每週、每兩週、每個月、或以任何其他間隔進行，取決於所投予之PNPLA3 RNAi劑的劑量、特定PNPLA3 RNAi劑之活性水平、及對於特定對象之所欲抑制水平。本文中之實例在某些動物物種中顯示合適的抑制水平。投予量亦將取決於諸如下列變數：患者的整體健康狀態、所遞送之化合物的相對生物效力、藥物配方、配方中之賦形劑的存在與類型、以及投予途徑。此外，應瞭解，可將初始投予劑量增加至超出以上上限水平以快速達到所欲血液水平或組織水平，或者初始劑量可小於最佳者。
為了治療疾病或為了形成用於治療疾病之藥劑或組成物，本文中所述之包括PNPLA3 RNAi劑之醫藥組成物可與賦形劑或與第二治療劑或第二治療組合，該第二治療劑或第二治療包括但不限於：第二或其他RNAi劑、小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。
當將所述PNPLA3 RNAi劑添加至醫藥上可接受之賦形劑或佐劑時，其可包裝至套組、容器、藥包(pack)、或分配器中。本文中所述之醫藥組成物可包裝於預填充之針筒、筆式注射器、自動注射器、輸注袋/裝置、或小瓶。治療及抑制表現之方法
本文中所揭示之PNPLA3 RNAi劑可用於治療患有疾病或病症之對象（例如，人類或其他哺乳動物），該對象會受益於該RNAi劑之投予。在一些實施例中，本文中所揭示之RNAi劑可用於治療對象（例如，人類），該對象會受益於PNPLA3 mRNA表現及/或PNPLA3蛋白水平之降低及/或抑制，例如，已診斷有或正遭受與NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）相關聯之症狀的對象。
在一些實施例中，對象係經投予治療有效量的任一或多種PNPLA3 RNAi劑。對象之治療可包括治療性及/或疾病預防性之治療。對象係經投予治療有效量的本文中所述之任一或多種PNPLA3 RNAi劑。對象可係人類、患者、或人類患者。對象可係成年人、青少年、兒童、或嬰兒。可向人類或動物投予本文中所述之醫藥組成物。
本文中所述之PNPLA3 RNAi劑可用於治療患有PNPLA3相關之疾病或病症或患有至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病或病症的對象中之至少一種症狀。在一些實施例中，PNPLA3 RNAi劑係用於治療或管理患有疾病或病症之對象的臨床呈現，該對象會受益於或至少部分由於PNPLA3 mRNA之降低而獲得調解。對象係經投予治療有效量的一或多種本文中所述之PNPLA3 RNAi劑或含有PNPLA3 RNAi劑的組成物。在一些實施例中，本文中所揭示之方法包含向所欲治療的對象投予包含本文中所述之PNPLA3 RNAi劑的組成物。在其他實施例中，對象係經投予疾病預防有效量的一或多種所述PNPLA3 RNAi劑，從而藉由預防或抑制至少一種症狀而治療該對象。
在某些實施例中，本揭露提供用於治療有此需要之患者中的至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、病況、或病理狀態的方法，其中該等方法包括向該患者投予本文中所述之任何PNPLA3 RNAi劑。
在一些實施例中，相對於在經投予所述PNPLA3 RNAi劑前之對象或相對於未接受所述PNPLA3 RNAi劑之對象，經投予所述PNPLA3 RNAi劑之對象中的PNPLA3基因之基因表現水平及/或mRNA水平係降低達至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%、或大於99%。在該對象之細胞、細胞群、及/或組織中，該對象中之基因表現水平及/或mRNA水平可降低。在一些實施例中，相對於在經投予PNPLA3 RNAi劑前之對象或相對於未接受PNPLA3 RNAi劑之對象，PNPLA3基因表現在肝細胞之細胞質中係遭抑制達至少約50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%，或大於70%。
在一些實施例中，相對於在經投予所述PNPLA3 RNAi劑前之對象或相對於未接受所述PNPLA3 RNAi劑之對象，已投予所述PNPLA3 RNAi劑之對象中的PNPLA3蛋白水平係降低達至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或大於99%。在對象之細胞、細胞群、組織、血液、及/或其他流體中，該對象中之蛋白質水平可降低。
PNPLA3 mRNA水平及PNPLA3蛋白水平之降低可藉由所屬技術領域中已知的任何方法來評估。如本文中所使用，PNPLA3 mRNA水平及/或蛋白水平之降低或減少在本文中統稱為PNPLA3之降低或減少或抑制或降低PNPLA3表現。本文所提出之實例說明用於評估PNPLA3基因表現之抑制的已知方法。所屬技術領域中具有通常知識者會進一步知悉用於體內及/或體外評估PNPLA3基因表現之抑制的合適方法。
在一些實施例中，本文中揭示由NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）所造成之疾病、病症、或症狀的治療（包括疾病預防性或預防性治療）方法，其中該等方法包括向有此需要之對象投予治療有效量的PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括與具有表1中之序列的PNPLA3 mRNA之部分至少部分互補的反義股。在一些實施例中，本文中揭示由NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）所造成之疾病或症狀的治療（包括疾病預防性或預防性治療）方法，其中該等方法包括向有此需要之對象投予治療有效量的PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括反義股及正義股，該反義股包含表2或表3中之任何序列的序列，該正義股包含與該反義股至少部分互補的表2或表4中之任何序列。在一些實施例中，本文中揭示由NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）所造成之疾病或症狀的治療（包括疾病預防性或預防性治療）方法，其中該等方法包括向有此需要之對象投予治療有效量的PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括正義股及反義股，該正義股包含表2或表4中之任何序列，該反義股包含與該正義股至少部分互補的表2或表3中之任何序列的序列。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法，其中該等方法包括向該細胞投予PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括與具有表1中之序列的PNPLA3 mRNA之部分至少部分互補的反義股。在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投予PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括反義股及正義股，該反義股包含表2或表3中之任何序列的序列，該正義股包含與該反義股至少部分互補的表2或表4中之任何序列。在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法，其中該等方法包括投予PNPLA3 RNAi劑，該PNPLA3 RNAi劑包括正義股及反義股，該正義股包含表2或表4中之任何序列，該反義股包含與該正義股至少部分互補的表2或表3中之任何序列的序列。
PNPLA3 RNAi劑的使用提供了用於治療性（包括疾病預防性）治療與NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）及/或增強或升高之PNPLA3表現相關聯的疾病/病症之方法。所述PNPLA3 RNAi劑會介導RNA干擾以抑制生產PNPLA3蛋白所必需之一或多種基因的表現。PNPLA3 RNAi劑亦可用於治療或預防各種疾病、病症、或病況，包括NAFLD、NASH、肝纖維化、及/或酒精性或非酒精性肝病（包括肝硬化）。此外，描述了用於在體內將PNPLA3 RNAi劑遞送至肝細胞之組成物。細胞、組織、器官、及非人類生物體
預想到包括至少一種本文中所述之PNPLA3 RNAi劑的細胞、組織、器官、及非人類生物體。該細胞、組織、器官、或非人類生物體係藉由將RNAi劑遞送至該細胞、組織、器官、或非人類生物體來製造。 說明性實施例
此處提供所揭示技術之說明性實施例。這些實施例僅係說明性的，並且不會限制本揭露或本文中所隨附之申請專利範圍的範疇。
實施例1.一種用於抑制PNPLA3基因表現之RNAi劑，其包含： 反義股，其包含與SEQ ID NO: 46至87、174至211、及257至258之任一序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸；該正義股包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
實施例2.如實施例1所述之RNAi劑，其中該反義股包含SEQ ID NO: 46至87、174至211、及257至258之任一序列的核苷酸2至18。
實施例3.如實施例1或實施例2所述之RNAi劑，其中該正義股包含與SEQ ID NO: 2至45及212至256之任一正義股序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸之核苷酸序列；且其中該正義股在該17個連續核苷酸上具有與該反義股至少85%互補性之區域。
實施例4.如實施例1至3中任一者所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之至少一個核苷酸係經修飾之核苷酸或包括經修飾之核苷間鍵聯。
實施例5.如實施例1至3中任一者所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之該正義股及/或反義股的所有或實質上所有該等核苷酸係經修飾之核苷酸。
實施例6.如實施例4至5中任一者所述之RNAi劑，其中該經修飾之核苷酸係選自由下列所組成之群組：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、2′-去氧核苷酸、2′,3′-斷核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2′-F-阿拉伯糖核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2′-O-甲基核苷酸、反向2′-去氧核苷酸、2′-胺基-經修飾之核苷酸、2′-烷基-經修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸、及3′-O-甲基核苷酸。
實施例7.如實施例5所述之RNAi劑，其中所有或實質上所有該等經修飾之核苷酸係2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、或其組合。
實施例8.如實施例1至7中任一者所述之RNAi劑，其中該反義股包含SEQ ID NO: 88至128之任一經修飾之反義股序列的核苷酸序列。
實施例9.如實施例1至8中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股包含SEQ ID NO: 129至173之任一經修飾之正義股序列的核苷酸序列。
實施例10.如實施例1所述之RNAi劑，其中該反義股包含SEQ ID NO: 88至128之任一經修飾之序列的核苷酸序列且該正義股包含SEQ ID NO: 129至173之任一經修飾之序列的核苷酸序列。
實施例11.如實施例1至10中任一者所述之RNAi劑，其中該RNAi劑係鍵聯至靶向配體。
實施例12.如實施例11所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
實施例13.如實施例11或12所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含(NAG37)或(NAG37)s之結構。
實施例14.如實施例11至14中任一者所述之RNAi劑，其中該靶向配體係鍵聯至該正義股。
實施例15.如實施例15所述之RNAi劑，其中該靶向配體係鍵聯至該正義股之5′末端。
實施例16.如實施例1至16中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股的長度係介於18與30個核苷酸之間，而該反義股的長度係介於18與30個核苷酸之間。
實施例17.如實施例17所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自介於18與27個核苷酸之間。
實施例18.如實施例18所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自介於18與24個核苷酸之間。
實施例19.如實施例19所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自係21個核苷酸。
實施例20.如實施例17至20中任一者所述之RNAi劑，其中該RNAi劑具有兩個鈍端。
實施例21.如實施例1至21中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股包含一或兩個端帽。
實施例22.如實施例1至22中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股包含一或兩個反向無鹼基殘基。
實施例23.如實施例1所述之RNAi劑，其中該RNAi劑包含正義股及反義股，該正義股及該反義股形成具有如表5B中所列示之SEQ ID NO的任一雙鏈體之雙鏈體序列。
實施例24.如實施例1至23中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。
實施例25.如實施例1所述之RNAi劑，其包含反義股，該反義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 88至128之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列；其中a、c、g、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該正義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。
實施例26.如實施例1所述之RNAi劑，其中該正義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 129至173之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列；其中a、c、g、i、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肝苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該反義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。
實施例27.如實施例24至26中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。
實施例28.如實施例24至27中任一者所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之該正義股係鍵聯至靶向配體。
實施例29.如實施例28所述之RNAi劑，其中該靶向配體對於去唾液酸糖蛋白受體具有親和力。
實施例30.如實施例29所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
實施例31.如實施例1所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含：
Figure 02_image001
、或
Figure 02_image003
實施例32.如實施例1所述之RNAi劑，其中該反義股由SEQ ID NO: 88至128之經修飾之核苷酸序列所組成，該正義股由SEQ ID NO: 129至173之經修飾之核苷酸序列所組成，其中a、c、g、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別係2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s係硫代磷酸酯鍵聯；(invAb)係反向無鹼基去氧核糖殘基；且(NAG37)s具有下列化學結構：
Figure 02_image003
實施例33.一種包含如實施例1至32中任一者所述之RNAi劑的組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
實施例34.一種用於抑制細胞中之PNPLA3基因表現之方法，該方法包含將有效量的如實施例1至32中任一者所述之RNAi劑或如實施例33中任一者所述之組成物引入細胞中。
實施例35.如實施例34所述之方法，其中該細胞係在對象內。
實施例36.如實施例35所述之方法，其中該對象係人類對象。
實施例37.如實施例34至36中任一者所述之方法，其中該PNPLA3基因表現係遭抑制達至少約30%。
實施例38.一種治療PNPLA3相關疾病或病症之方法，該方法包含向有此需要之人類對象投予治療有效量的如實施例33所述之組成物。
實施例39.如實施例38所述之方法，其中該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、酒精性脂肪肝病、或肝硬化。
實施例40.如實施例34至39中任一者所述之方法，其中該RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量來投予。
實施例41.如實施例34至40中任一者所述之方法，其中該RNAi劑係以二或更多個劑量來投予。
實施例42.一種如實施例1至32中任一者所述之RNAi劑或如實施例33所述之組成物用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀的用途。
實施例43.如實施例42之所述之用途，其中該症狀係肝硬化。
實施例44.一種如實施例1至32中任一者所述之RNAi劑或如實施例33所述之組成物用於製備用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀之醫藥組成物的用途。
實施例45.一種如實施例42至44中任一者所述之RNAi劑的用途，其中該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、或酒精性或非酒精性肝病，諸如肝硬化。
實施例46.一種如實施例33所述之組成物的用途，其中該RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量來投予。
上文提供之實施例及項目現以下列非限制性實例來說明。實例 實例 1. PNPLA3 RNAi 劑之合成。
上表5A及表5B中所示之PNPLA3 RNAi劑雙鏈體係根據下列一般程序來合成：A. 合成。
RNAi劑之正義股及反義股係根據用於寡核苷酸合成中之亞磷醯胺(phosphoramidite)技術在固相上合成。此類標準合成在所屬技術領域中係普遍已知的。視規模而定，使用MerMade96E® (Bioautomation)、MerMade12® (Bioautomation)、或OP Pilot 100 (GE Healthcare)。在由可控孔徑玻璃（controlled pore glass, CPG, 500 Å或600 Å，獲自Prime Synthesis, Aston, PA, USA）製成之固相撐體(solid support)上進行合成。將位於各別股之3′端的單體附接至固相撐體以作為合成之起始點。所有RNA及2′-經修飾之RNA亞磷醯胺係購自Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA)或Hongene Biotech (Shanghai, PRC)。2′-O-甲基亞磷醯胺包括下列：(5′-O-二甲氧基三苯甲基-N6 -(苯甲醯基)-2′-O-甲基-腺苷-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺、5′-O-二甲氧基-三苯甲基-N4 -(乙醯基)-2′-O-甲基-胞苷-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙基-胺基)亞磷醯胺、(5′-O-二甲氧基三苯甲基-N2- (異丁醯基)-2′-O-甲基-鳥苷-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺、及5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-尿苷-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺。2′-去氧-2′-氟-亞磷醯胺帶有與2′-O-甲基亞醯胺(2′-O-methyl amidite)相同的保護基。5′-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-2′,3′-斷-尿苷、2′-苯甲醯基-3′-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺亦購自Thermo Fisher Scientific或Hongene Biotech。5′-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基-肌苷-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺係購自Glen Research (Virginia)或Hongene Biotech。反向無鹼基(3′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-去氧核糖-5′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺係購自ChemGenes (Wilmington, MA, USA)或SAFC (St Louis, MO, USA)。5′-O-二甲氧基三苯甲基-N2 ,N6 -(苯氧基乙酸酯)-2′-O-甲基-二胺基嘌呤-3′-O-(2-氰乙基-N,N-二異丙胺基)亞磷醯胺係購自ChemGenes或Hongene Biotech。
將含有靶向配體之亞磷醯胺溶解於無水二氯甲烷或無水乙腈(50 mM)中，同時將所有其他亞醯胺溶解於無水乙腈(50 mM)中，或者將無水二甲基丙烯醯胺及分子篩(3 Å)加入。使用5-苄硫基-1H-四唑（BTT，於乙腈中為250 mM）或5-乙硫基-1H-四唑（ETT，於乙腈中為250 mM）作為活化劑溶液。偶合時間係12 min (RNA)、15 min（靶向配體）、90 sec (2′OMe)、及60 sec (2′F)。為了引入硫代磷酸酯鍵聯，採用100 mM的3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮（POS，獲自PolyOrg, Inc., Leominster, MA, USA）於無水乙腈中之溶液。除非是特別標示為不存在靶向配體之「裸」RNAi試劑，否則下列實例中所合成及測試之各個PNPLA3 RNAi劑雙鏈體採用N-乙醯基-半乳糖胺，如表6中所提出之靶向配體化學結構中的「NAG」。B. 撐體結合之寡聚物的裂解與去保護。
在完成固相合成之後，在30℃下用40 wt. %甲胺水溶液與28%氫氧化銨溶液(Aldrich)之1:1體積溶液處理經乾燥的固體撐體1.5小時。將溶液蒸發，並將固體殘渣重構(reconstituted)於水中（見下文）。C. 純化。
使用TSKgel SuperQ-5PW 13 µm管柱與Shimadzu LC-8系統，以陰離子交換HPLC純化粗製寡聚物。緩衝液A係20 mM Tris、5 mM EDTA (pH 9.0)且含有20%乙腈，且緩衝液B與緩衝液A相同，其中添加了1.5 M氯化鈉。記錄在260 nm處之UV跡線。儲集適當流份，然後在粒徑篩析HPLC上運行，其使用填充有Sephadex G-25（細）之GE Healthcare XK 26/40管柱，並使用過濾DI水或100 mM碳酸氫銨(pH 6.7)及20%乙腈之運行緩衝液。D. 黏合。
在1×磷酸鹽緩衝鹽水(Corning, Cellgro)中組合等莫耳RNA溶液（正義及反義）來混合互補股，以形成RNAi劑。將一些RNAi劑冷凍乾燥且儲存在−15至−25℃下。藉由在UV-可見光光譜儀上（於1×磷酸鹽緩衝鹽水中）測量溶液吸光度，判定雙鏈體濃度。然後，將在260 nm處的溶液吸光度乘以換算因數及稀釋因數，以判定雙鏈體濃度。所使用之轉換係數係0.050 mg/(mL•cm)，或者係由實驗判定之消光係數來計算。實例 2. PNPLA3-SEAP 小鼠模型。
為了評估某些PNPLA3 RNAi劑，使用PNPLA3-SEAP小鼠模型。將六至八週齡雌性C57BL/6白化小鼠或ICR小鼠（視可得性而定）藉由流體動力尾靜脈注射用質體來短暫體內轉染，在PNPLA3 RNAi劑或對照組投予前至少29天投予。製備兩種類型的SEAP質體。第一種質體含有人類PNPLA3 cDNA序列(GenBank NM_025225.2 (SEQ ID NO:1))，其係插入SEAP（分泌人類胎盤鹼性磷酸酶）報導基因的3′ UTR中。由於發覺到全長轉錄本隨時間過去之不穩定性，因此合成包括人類PNPLA3 cDNA序列之截短版本（具體而言為GenBank NM_025225.2之核苷酸501至2210）的第二質體。選擇這兩個質體中之一者來轉染至小鼠中。將50 µg的各別質體（於林格氏液(Ringer′s Solution)中，以佔動物體重之10%的總體積）經由尾靜脈注射至小鼠中，以產生PNPLA3-SEAP模型小鼠。透過27號(gauge)針頭，以5至7秒注射該溶液，如先前所述(Zhang G et al.，「High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA.」Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, p1735-1737.)。PNPLA3 RNAi劑所致之PNPLA3表現抑制會導致伴隨之SEAP表現抑制，此SEAP表現抑制為所測量者。在投予治療前（在第-7天與給藥前第1天之間），血清中之SEAP表現水平係藉由Phospha-Light™ SEAP Reporter Gene Assay System (Invitrogen)來測量，然後將小鼠根據平均SEAP水平來分組。
用2至3%異氟烷將小鼠麻醉，然後自頜下區域收集血液樣本至血清分離管(Sarstedt AG & Co.、Nümbrecht、Germany)中。讓血液在環境溫度下凝集20分鐘。將管子以8,000 ×g離心3分鐘以分離血清並儲存在4℃。血清係藉由Phospha-Light™ SEAP Reporter Gene Assay System (Invitrogen)並根據製造商之指示來收集與測量。可將每隻動物之血清SEAP水平相對於用媒劑對照組注射的小鼠對照組進行標準化，以解釋此模型中非治療相關的PNPLA3表現下降。為此，先將每隻動物在某一時間點上的之SEAP水平除以該隻動物中之治療前（第−1天）表現水平，以判定「相對於治療前進行標準化(normalized to pre-treatment)」之表現的比值。接著，將個別動物之「相對於治療前進行標準化」的比值除以正常媒劑對照組中所有小鼠之平均「相對於治療前標準化」的比值，以將特定時間點時的表現相對於對照組進行標準化。替代地，每隻動物之血清SEAP水平係單純藉由相對於治療前水平進行標準化來評估。實例 3. PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
使用以上實例2中所述之PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有全長人類PNPLA3轉錄本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有3.0 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表7。表 7. 實例3的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置（在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 688 3.0 mg/kg J1D00001 第1天單次注射
3 688 3.0 mg/kg J1D00002 第1天單次注射
4 1586 3.0 mg/kg J1D00004 第1天單次注射
5 2180 3.0 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
6 1179 3.0 mg/kg J1D00010 第1天單次注射
7 1179 3.0 mg/kg J1D00011 第1天單次注射
8 571 3.0 mg/kg J1D00012 第1天單次注射
9 1745 3.0 mg/kg J1D00016 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00001（第2組）及J1D00002（第3組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置688處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00004（第4組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1586處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第5組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00010（第6組）及J1D00011（第7組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1179處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00012（第8組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置571處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00016（第9組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1745處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表8及表9中：表 8. 在來自實例3之全長轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 0.402 0.136 0.398 0.097 0.285 0.159
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00001) 0.325 0.120 0.260 0.129 0.144 0.068
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00002) 0.279 0.076 0.237 0.114 0.174 0.019
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00004) 0.186 0.055 0.145 0.065 0.073 0.038
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.160 0.027 0.115 0.034 0.073 0.026
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00010) 0.298 0.054 0.299 0.104 0.203 0.084
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.264 0.052 0.194 0.077 0.095 0.054
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00012) 0.170 0.047 0.159 0.053 0.113 0.045
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00016) 0.302 0.108 0.246 0.079 0.162 0.054
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 9. 在來自實例3之全長轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.339 1.000 0.244 1.000 0.558
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00001) 0.809 0.298 0.655 0.325 0.505 0.240
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00002) 0.693 0.190 0.597 0.288 0.610 0.067
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00004) 0.462 0.136 0.365 0.163 0.258 0.132
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.399 0.066 0.289 0.085 0.257 0.092
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00010) 0.742 0.133 0.751 0.262 0.715 0.296
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.657 0.130 0.487 0.194 0.332 0.189
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00012) 0.422 0.117 0.399 0.133 0.397 0.157
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00016) 0.752 0.270 0.619 0.198 0.567 0.188
實例 4.PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
使用以上實例2中所述之PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有全長人類PNPLA3轉錄本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有3.0 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表10。表 10. 實例4的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 2180 3.0 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
3 886 3.0 mg/kg J1D00014 第1天單次注射
4 1584 3.0 mg/kg J1D00015 第1天單次注射
5 553 3.0 mg/kg J1D00021 第1天單次注射
6 680 3.0 mg/kg J1D00022 第1天單次注射
7 1182 3.0 mg/kg J1D00005 第1天單次注射
8 746 3.0 mg/kg J1D00024 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第2組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00014（第3組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置886處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00015（第4組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1584處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00021（第5組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置553處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00022（第6組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置680處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00005（第7組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1182處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00024（第8組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置746處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表11及表12中：表 11. 在來自實例4之全長轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 0.857 0.471 1.737 0.769 0.260 0.148
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.344 0.128 0.679 0.375 0.095 0.044
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00014) 1.221 0.267 2.307 0.878 0.363 0.192
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00015) 0.424 0.078 0.885 0.279 0.130 0.030
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00021) 0.832 0.299 1.891 0.903 0.320 0.141
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00022) 0.527 0.259 1.223 0.547 0.190 0.097
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00005) 0.817 0.323 1.291 0.618 0.235 0.149
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00024) 0.700 0.143 2.079 0.821 0.470 0.207
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 12. 在來自實例4之全長轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.550 1.000 0.443 1.000 0.568
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.401 0.149 0.391 0.216 0.367 0.170
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00014) 1.426 0.312 1.328 0.505 1.397 0.737
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00015) 0.495 0.091 0.510 0.160 0.500 0.117
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00021) 0.971 0.349 1.089 0.520 1.231 0.541
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00022) 0.615 0.302 0.704 0.315 0.732 0.371
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00005) 0.954 0.377 0.743 0.356 0.905 0.574
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00024) 0.817 0.167 1.197 0.473 1.808 0.796
實例 5 .PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
如實例2中所述使用PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有人類PNPLA3轉錄本之截短版本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有3.0 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表13。表 13. 實例5的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 571 3.0 mg/kg J1D00012 第1天單次注射
3 571 3.0 mg/kg J1D00027 第1天單次注射
4 571 3.0 mg/kg J1D00028 第1天單次注射
5 571 3.0 mg/kg J1D00029 第1天單次注射
6 1179 3.0 mg/kg J1D00011 第1天單次注射
7 1179 3.0 mg/kg J1D00017 第1天單次注射
8 1586 3.0 mg/kg J1D00004 第1天單次注射
9 1586 3.0 mg/kg J1D00003 第1天單次注射
10 1586 3.0 mg/kg J1D00041 第1天單次注射
11 2180 3.0 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00012（第2組）、J1D00027（第3組）、J1D00028（第4組）、J1D00029（第5組）各自包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置571處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00011（第6組）及J1D00017（第7組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1179處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00004（第8組）、J1D00003（第9組）、及J1D00041（第10組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1586處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第11組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表14及表15中：表 14. 在來自實例5之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 0.772 0.173 0.746 0.164 0.446 0.258 0.677 0.725
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00012) 0.150 0.073 0.109 0.056 0.130 0.063 0.235 0.151
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00027) 0.132 0.104 0.132 0.084 0.199 0.126 0.249 0.190
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00028) 0.190 0.078 0.194 0.083 0.294 0.074 0.328 0.089
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00029) 0.173 0.090 0.108 0.035 0.090 0.033 0.161 0.107
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.296 0.138 0.192 0.138 0.175 0.061 0.279 0.069
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00017) 0.204 0.113 0.085 0.049 0.151 0.054 0.317 0.088
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00004) 0.073 0.058 0.066 0.094 0.083 0.120 0.141 0.198
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00003) 0.065 0.018 0.026 0.007 0.024 0.007 0.039 0.008
第10 組 (3.0 mg/kg J1D00041) 0.079 0.034 0.037 0.029 0.060 0.039 0.073 0.018
第11 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.142 0.048 0.091 0.071 0.216 0.235 0.285 0.219
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 15. 在來自實例5之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.224 1.000 0.220 1.000 0.578 1.000 1.071
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00012) 0.194 0.094 0.146 0.075 0.290 0.142 0.346 0.222
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00027) 0.172 0.134 0.177 0.113 0.445 0.283 0.368 0.280
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00028) 0.246 0.101 0.260 0.112 0.659 0.167 0.484 0.131
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00029) 0.225 0.117 0.145 0.047 0.203 0.074 0.237 0.158
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.383 0.179 0.257 0.185 0.391 0.136 0.412 0.101
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00017) 0.265 0.147 0.114 0.066 0.339 0.120 0.467 0.129
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00004) 0.095 0.075 0.089 0.126 0.186 0.268 0.208 0.293
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00003) 0.084 0.023 0.035 0.010 0.054 0.015 0.057 0.012
第10 組 (3.0 mg/kg J1D00041) 0.094 0.041 0.048 0.037 0.126 0.081 0.102 0.025
第11 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.169 0.057 0.119 0.092 0.451 0.491 0.397 0.305
各給藥組（亦即，第2組至第11組）中之各PNPLA3 RNAi劑相較於媒劑對照組（第1組）在所有測量時間點皆顯示SEAP之降低。實例 6.PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
如實例2中所述使用PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有人類PNPLA3轉錄本之截短版本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有3.0 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表16。表 16. 實例6的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 2180 3.0 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
3 2180 3.0 mg/kg J1D00046 第1天單次注射
4 2180 3.0 mg/kg J1D00047 第1天單次注射
5 2180 3.0 mg/kg J1D00048 第1天單次注射
6 1179 3.0 mg/kg J1D00011 第1天單次注射
7 1179 3.0 mg/kg J1D00043 第1天單次注射
8 1179 3.0 mg/kg J1D00044 第1天單次注射
9 1179 3.0 mg/kg J1D00045 第1天單次注射
10 544 3.0 mg/kg J1D00020 第1天單次注射
11 1195 3.0 mg/kg J1D00026 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第2組）、J1D00046（第3組）、J1D00047（第4組）、及J1D00048（第5組）各自包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00011（第6組）、J1D00043（第7組）、J1D00044（第8組）、及J1D00045（第9組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1179處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00020（第10組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置544處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00026（第11組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1195處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表17及表18中：表 17. 在來自實例6之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.434 0.237 1.189 0.385 0.616 0.022 1.323 0.693
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.328 0.215 0.356 0.186 0.329 0.129 1.342 0.529
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00046) 0.254 0.240 0.356 0.478 0.303 0.338 0.370 0.210
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00047) 0.219 0.080 0.127 0.042 0.106 0.017 0.488 0.072
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00048) 0.153 0.055 0.158 0.064 0.175 0.078 0.463 0.126
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.782 0.468 0.874 0.597 0.461 0.361 0.714 0.582
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00043) 0.713 0.539 0.981 0.784 0.939 0.725 1.364 0.975
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00044) 0.683 0.113 0.539 0.143 0.355 0.096 0.891 0.217
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00045) 0.479 0.309 0.547 0.101 0.383 0.201 0.935 0.361
第10 組 (3.0 mg/kg J1D00020) 0.726 0.575 0.906 0.856 0.506 0.376 1.255 1.244
第11 組 (3.0 mg/kg J1D00026) 0.590 0.431 0.395 0.434 0.351 0.322 0.703 0.293
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 18. 在來自實例6之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.165 1.000 0.323 1.000 0.035 1.000 0.524
第2 組 (3.0 mg/kg J1D00008) 0.229 0.150 0.299 0.156 0.535 0.209 1.014 0.400
第3 組 (3.0 mg/kg J1D00046) 0.177 0.167 0.299 0.402 0.492 0.549 0.280 0.159
第4 組 (3.0 mg/kg J1D00047) 0.153 0.056 0.107 0.035 0.173 0.028 0.369 0.055
第5 組 (3.0 mg/kg J1D00048) 0.107 0.038 0.133 0.054 0.283 0.127 0.350 0.095
第6 組 (3.0 mg/kg J1D00011) 0.545 0.326 0.735 0.502 0.749 0.586 0.540 0.440
第7 組 (3.0 mg/kg J1D00043) 0.497 0.375 0.825 0.660 1.524 1.177 1.031 0.737
第8 組 (3.0 mg/kg J1D00044) 0.476 0.079 0.453 0.120 0.576 0.157 0.674 0.164
第9 組 (3.0 mg/kg J1D00045) 0.334 0.215 0.460 0.085 0.621 0.327 0.706 0.272
第10 組 (3.0 mg/kg J1D00020) 0.506 0.401 0.762 0.720 0.822 0.611 0.949 0.940
第11 組 (3.0 mg/kg J1D00026) 0.411 0.300 0.333 0.365 0.569 0.523 0.531 0.222
實例 7.PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
如實例2中所述使用PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有人類PNPLA3轉錄本之截短版本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有1.5 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表19。表 19. 實例7的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 2180 1.5 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
3 538 1.5 mg/kg J1D00018 第1天單次注射
4 538 1.5 mg/kg J1D00019 第1天單次注射
5 687 1.5 mg/kg J1D00013 第1天單次注射
6 751 1.5 mg/kg J1D00006 第1天單次注射
7 751 1.5 mg/kg J1D00007 第1天單次注射
8 1181 1.5 mg/kg J1D00035 第1天單次注射
9 685 1.5 mg/kg J1D00033 第1天單次注射
10 373 1.5 mg/kg J1D00032 第1天單次注射
11 1837 1.5 mg/kg J1D00040 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第2組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D000018（第3組）及J1D00019（第4組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置538處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00013（第5組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置687處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D000006（第6組）及J1D00007（第7組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置751處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00035（第8組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1181處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00033（第9組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置685處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00032（第10組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置373處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00040（第11組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1837處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表20及表21中：表 20. 在來自實例7之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 0.302 0.188 0.192 0.105 0.209 0.194 0.167 0.145
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.083 0.035 0.113 0.105 0.127 0.105 0.148 0.119
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00018) 0.505 0.344 0.561 0.425 0.455 0.295 0.424 0.283
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00019) 0.293 0.152 0.329 0.169 0.337 0.215 0.291 0.203
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00013) 0.101 0.099 0.084 0.065 0.076 0.061 0.110 0.115
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00006) 0.221 0.140 0.265 0.265 0.218 0.232 0.126 0.191
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00007) 0.257 0.102 0.237 0.172 0.162 0.082 0.177 0.088
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00035) 0.548 0.504 0.344 0.278 0.406 0.361 0.413 0.395
第9 組 (1.5 mg/kg J1D00033) 0.481 0.154 0.270 0.126 0.204 0.114 0.258 0.115
第10 組 (1.5 mg/kg J1D00032) 0.687 0.145 0.831 0.243 0.639 0.270 0.464 0.093
第11 組 (1.5 mg/kg J1D00040) 0.237 0.101 0.190 0.085 0.182 0.100 0.162 0.137
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 21. 在來自實例7之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.621 1.000 0.549 1.000 0.927 1.000 0.868
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.275 0.117 0.588 0.547 0.606 0.503 0.887 0.710
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00018) 1.673 1.139 2.924 2.217 2.175 1.408 2.536 1.691
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00019) 0.969 0.502 1.713 0.879 1.611 1.028 1.737 1.214
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00013) 0.335 0.327 0.440 0.341 0.364 0.293 0.657 0.686
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00006) 0.730 0.462 1.383 1.379 1.043 1.108 0.753 1.144
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00007) 0.850 0.339 1.234 0.894 0.772 0.393 1.057 0.527
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00035) 1.814 1.669 1.794 1.451 1.939 1.724 2.471 2.365
第9 組 (1.5 mg/kg J1D00033) 1.592 0.509 1.409 0.658 0.974 0.545 1.541 0.685
第10 組 (1.5 mg/kg J1D00032) 2.274 0.479 4.330 1.265 3.050 1.292 2.772 0.559
第11 組 (1.5 mg/kg J1D00040) 0.784 0.335 0.991 0.445 0.870 0.476 0.967 0.817
實例 8.PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
如實例2中所述使用PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有人類PNPLA3轉錄本之截短版本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有1.5 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），根據下表22。表 22. 實例8的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 2180 1.5 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
3 2180 1.5 mg/kg J1D00074 第1天單次注射
4 2180 1.5 mg/kg J1D00075 第1天單次注射
5 2180 1.5 mg/kg J1D00076 第1天單次注射
6 2180 1.5 mg/kg J1D00077 第1天單次注射
7 2180 1.5 mg/kg J1D00078 第1天單次注射
8 2180 1.5 mg/kg J1D00048 第1天單次注射
9 2180 1.5 mg/kg J1D00079 第1天單次注射
10 2180 1.5 mg/kg J1D00080 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。各組（亦即，第2組至第10組）中之PNPLA3 RNAi劑各自包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表23及表24中：表 23. 在來自實例8之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.134 0.219 0.851 0.295 0.826 0.637 0.759 0.471
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.367 0.080 0.267 0.138 0.374 0.202 0.410 0.309
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00074) 0.205 0.063 0.211 0.072 0.276 0.108 0.396 0.182
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00075) 0.705 0.202 0.673 0.370 0.634 0.415 0.571 0.427
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00076) 0.484 0.312 0.307 0.200 0.315 0.301 0.260 0.189
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00077) 0.445 0.293 0.290 0.186 0.400 0.329 0.310 0.207
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00078) 0.190 0.099 0.153 0.122 0.289 0.292 0.291 0.255
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00048) 0.341 0.194 0.389 0.306 0.345 0.089 0.418 0.232
第9 組 (1.5 mg/kg J1D00079) 0.213 0.105 0.174 0.189 0.285 0.249 0.311 0.248
第10 組 (1.5 mg/kg J1D00080) 0.270 0.143 0.277 0.159 0.439 0.309 0.525 0.411
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 24. 在來自實例8之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.193 1.000 0.347 1.000 0.771 1.000 0.620
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.324 0.071 0.314 0.162 0.453 0.245 0.540 0.408
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00074) 0.181 0.056 0.248 0.085 0.334 0.131 0.522 0.240
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00075) 0.621 0.178 0.791 0.435 0.768 0.503 0.752 0.563
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00076) 0.426 0.275 0.361 0.235 0.382 0.365 0.343 0.250
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00077) 0.393 0.258 0.341 0.219 0.484 0.398 0.409 0.273
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00078) 0.168 0.087 0.180 0.144 0.350 0.353 0.384 0.337
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00048) 0.300 0.171 0.457 0.359 0.418 0.108 0.551 0.306
第9 組 (1.5 mg/kg J1D00079) 0.188 0.093 0.204 0.222 0.345 0.301 0.410 0.327
第10 組 (1.5 mg/kg J1D00080) 0.238 0.126 0.326 0.187 0.531 0.374 0.692 0.542
各給藥組（亦即，第2組至第10組）中之各PNPLA3 RNAi劑相較於相較於媒劑對照（第1組）在所有測量時間點皆顯示SEAP之降低。實例 9.PNPLA3 RNAi 劑在 PNPLA3-SEAP 小鼠中之體內測試。
如實例2中所述使用PNPLA3-SEAP小鼠模型，並且使用含有人類PNPLA3轉錄本之截短版本的質體。在第1天，每隻小鼠係給予200 µl/20 g動物重量之單次皮下投予，其含有1.5 mg/kg (mpk)的PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或媒劑對照組（無RNAi劑之鹽水），其包括根據下表25之給藥組。表 25. 實例9的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 第1天單次注射
2 2180 1.5 mg/kg J1D00008 第1天單次注射
3 887 1.5 mg/kg J1D00081 第1天單次注射
4 1185 1.5 mg/kg J1D00083 第1天單次注射
5 1191 1.5 mg/kg J1D00084 第1天單次注射
6 1191 1.5 mg/kg J1D00085 第1天單次注射
7 1746 1.5 mg/kg J1D00087 第1天單次注射
8 1173 1.5 mg/kg J1D00082 第1天單次注射
PNPLA3 RNAi劑之各者包括經修飾之核苷酸，該等經修飾之核苷酸係在正義股之5′末端偶聯至包括三個N-乙醯基-半乳糖胺基團之靶向配體（三牙配體），其具有如本文中之雙鏈體結構中所提出的經修飾之序列。（參見表3至表5以瞭解與PNPLA3 RNAi劑相關之特定修飾及結構資訊，包括(NAG37)s配體）。PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第2組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00081（第3組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置887處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00083（第4組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1185處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00084（第5組）及J1D00085（第6組）各自包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1191處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00087（第7組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1746處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00082（第8組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1173處的表現之核苷酸序列。（參見例如，SEQ ID NO:1及表2以瞭解所參照之PNPLA3基因）。
在皮膚與肌肉之間進行注射（亦即，皮下注射），其進入頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。對各組中之四(4)隻小鼠進行測試(n=4)。在第-1天（治療前）、第8天、第15天、第22天、及第29天收集血清，並依據以上實例2所提出之程序來判定SEAP表現水平。來自實驗的數據係示於下表26及表27中：表 26. 在來自實例9之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 0.668 0.265 0.578 0.386 0.522 0.289 1.227 1.269
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.236 0.177 0.149 0.116 0.448 0.343 0.822 0.725
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00081) 0.339 0.160 0.254 0.179 0.320 0.192 0.529 0.330
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00083) 0.524 0.404 0.332 0.304 0.375 0.227 0.564 0.517
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00084) 0.304 0.200 0.158 0.142 0.185 0.167 0.343 0.364
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00085) 0.506 0.241 0.320 0.241 0.355 0.220 0.718 0.497
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00087) 0.170 0.069 0.122 0.092 0.252 0.102 0.549 0.028
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00082) 0.508 0.302 0.454 0.308 0.488 0.361 0.914 0.661
*如在以上實例2中所注意到，媒劑對照組（第1組）中SEAP隨時間之逐漸降低是由於小鼠細胞中之SEAP報導基因的損失（因為動物中之自然細胞複製），而不是任何抑制化合物的結果。表 27. 在來自實例9之截短轉錄本PNPLA3-SEAP小鼠中相對於治療前（第-1天）及媒劑對照組進行標準化之平均SEAP
  第8 天 第15 天 第22 天 第29 天
分組ID Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-) Avg SEAP Std Dev (+/-)
第1 組 （鹽水媒劑） 1.000 0.397 1.000 0.668 1.000 0.553 1.000 1.034
第2 組 (1.5 mg/kg J1D00008) 0.353 0.265 0.259 0.201 0.860 0.658 0.669 0.591
第3 組 (1.5 mg/kg J1D00081) 0.507 0.240 0.440 0.310 0.613 0.369 0.431 0.269
第4 組 (1.5 mg/kg J1D00083) 0.784 0.604 0.574 0.526 0.719 0.435 0.459 0.421
第5 組 (1.5 mg/kg J1D00084) 0.455 0.300 0.273 0.246 0.355 0.320 0.279 0.297
第6 組 (1.5 mg/kg J1D00085) 0.757 0.360 0.555 0.418 0.681 0.421 0.585 0.405
第7 組 (1.5 mg/kg J1D00087) 0.255 0.103 0.211 0.160 0.483 0.195 0.448 0.022
第8 組 (1.5 mg/kg J1D00082) 0.759 0.452 0.786 0.534 0.935 0.693 0.745 0.539
實例 10.PNPLA3 RNAi 劑在食蟹獼猴中之體內測試。
在食蟹獼猴(cyno)中評估PNPLA3 RNAi劑劑J1D00003、J1D00008、及J1D00017。在各組的第1天及第43天，各組四隻食蟹獼猴(n=4)係經投予0.4 mL/kg（大約1.5 mL體積，視於動物重量而定）之皮下注射，其含有4.0 mg/kg (10 mg/mL)的各別PNPLA3 RNAi劑（配製於鹽水中）或無RNAi劑之鹽水媒劑以作為對照組（參見下表28）。表 28. 實例10的所靶向之位置及給藥分組
分組 所靶向之基因位置 （在 SEQ ID NO: 1 內） RNAi 劑及劑量 給藥方案（在第 1 天及第 43 天）
1 N/A 鹽水（無RNAi劑） 單一皮下注射
2 1586 4.0 mg/kg J1D00003 單一皮下注射
3 2180 4.0 mg/kg J1D00008 單一皮下注射
4 1179 4.0 mg/kg J1D00017 單一皮下注射
PNPLA3 RNAi劑包括經修飾之核苷酸及三牙含N-乙醯基-半乳糖胺之靶向配體((NAG37)s)，該靶向配體係偶聯至正義股之5′末端，如表3至表6中所示。PNPLA3 RNAi劑J1D00003（第2組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1586處的表現之核苷酸序列；PNPLA3 RNAi劑J1D00008（第3組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置2180處的表現之核苷酸序列；且PNPLA3 RNAi劑J1D00017（第4組）包括設計用以抑制PNPLA3基因在該基因之位置1179處的表現之核苷酸序列；
在第-13天（給藥前）、15天、29、57、及76天，採取肝臟活組織切片。在每次活組織切片收集當天，將食蟹獼猴麻醉並使用腹腔鏡術來取出兩個肝組織樣本，各約80 mg至120 mg。接著將活組織切片均質化，然後藉由RT-qPCR測量食蟹獼猴肝臟中之PNPLA3 mRNA水平。接著將所得值相對於給藥前（在此情況下，在第-13天）PNPLA3 mRNA測量值進行標準化。所得mRNA數據係呈現於下表29中：表 29. 來自實例10針對各分組相對於給藥前（第-13天）進行標準化之PNPLA3 mRNA水平(n=4)
  第 15 天 第 29 天
相對 PNPLA3 mRNA 表現 低誤差 高誤差 相對 PNPLA3 mRNA 表現 低誤差 高誤差
第 1 組：鹽水 0.768 0.144 0.178 0.616 0.138 0.178
第 2 組： J1D00003 0.624 0.222 0.345 0.468 0.178 0.287
第 3 組： J1D00008 0.486 0.065 0.074 0.455 0.120 0.164
第 4 組： J1D00017 0.671 0.211 0.307 0.517 0.088 0.105
  第 57 天 第 76 天
相對 PNPLA3 mRNA 表現 低誤差 高誤差 相對 PNPLA3 mRNA 表現 低誤差 高誤差
第 1 組：鹽水 1.037 0.313 0.448 0.569 0.121 0.153
第 2 組： J1D00003 0.449 0.176 0.290 0.649 0.321 0.636
第 3 組： J1D00008 0.526 0.062 0.070 0.631 0.085 0.099
第 4 組： J1D00017 0.795 0.217 0.298 0.824 0.221 0.301
實例 11. PNPLA3 RNAi 劑 J1D00008 在食蟹獼猴中之體內測試。
此研究之目的在於評估RNAi劑J1D00008在食蟹獼猴(cyno)肝臟中之WT PNPLA3 mRNA的減少深度及持續期間。每隻動物之減少程度係相對於得自在給藥前所執行之肝臟活組織切片的基線測量值進行標準化。
材料及方法
研究1：將食蟹獼猴依體重（2至5 kg）分成鹽水組（第1組）或RNA治療組（第2至4組），每組n=4。在第1天及第43天以4 mg/kg（在0.4 ml/kg鹽水中）對食蟹獼猴皮下給藥兩次。在進行活組織切片及抽血之前，使食蟹獼猴禁食整夜至少12小時。在給藥前及測試第15、29、57、及76天自所有動物收集肝臟活組織切片樣本。針對每隻動物，收集肝臟活組織切片樣本（2次，每次大約100 mg）以藉由qPCR及原位雜交(in situ hybridization, ISH)來進行PNPLA3 mRNA定量。在給藥前及給藥後第15、29、57、及76天自股靜脈收集血液。針對所有動物、分組、及時間點，將RNA自左側肝葉單離出來以執行qRT-PCR，將數據相對於持家基因(ARFGAP2)進行標準化，並且將相對表現與基線/給藥前活組織切片作比較。在研究結束時，在來自第1組及第3組之左側及右側及中間肝葉中測量PNPLA3表現，以確認表現沒有肝葉間之變化，並且左側肝葉具有代表性。執行食蟹獼猴肝臟活組織切片的基於RNAscope®之原位雜交檢定(ACDbio, Newark, CA)。採用基於影像的定量軟體分析（HALO™軟體系統，Indica Labs, Albuquerque, NM）來定量給定肝細胞群中之總PNPLA3 mRNA複本數。
研究2：如研究1中所述執行第二次非人類靈長類動物研究，並且有下列修改或增加。將食蟹獼猴依體重（2至5 kg）分成兩個RNAi治療組，每組n=10。在第1天及第29天以4 mg/kg（在鹽水中）對動物皮下給藥並追蹤57天。
結果
從研究1中，藉由PCR所得之PNPLA3表現測量值係示於圖1中（針對RNAi劑J1D00008）。在相對於基線及持家基因進行標準化後，PNPLA3 mRNA在各別時間點下降達51%、55%、47%、及37%。在這些結果之後，執行原位雜交(ISH)以評估PNPLA3 mRNA之細胞內（細胞質的對上核的）分布。觀察到大約50%的全細胞PNPLA3 mRNA係分配在核內。此表示RNAi劑J1D00008顯著降低了蛋白轉譯位點（亦即，肝細胞細胞質）之PNPLA3 mRNA，但qPCR會低估全細胞水平之減少，這是由於造成干擾之殘餘核PNPLA3 mRNA池所致。因而對細胞質PNPLA3 mRNA減少進行定量。
在來自經RNAi劑J1D00008處理之食蟹獼猴的肝臟活組織切片上執行的ISH顯示，大量的殘餘PNPLA3 mRNA留在細胞核中，從而支持此池會干擾全肝臟中之減少結果（如由qPCR所評估）。
ISH影像之定量顯示，在RNAi劑J1D00008治療下，在全部76天內，PNPLA3 mRNA在細胞質中降低達44至63%（表30）。由於GalNAc-RNAi劑（諸如RNAi劑J1D00008）會特異性地於肝細胞之細胞質中介導目標mRNA之降解，PNPLA3減少之全肝定量會由於來自非所靶向之細胞類型（例如星形及庫弗(Kupffer)細胞）的PNPLA3 mRNA之相對貢獻而遭到稀釋。因此，執行基於模型之分析以評估PNPLA3 mRNA特異性地於肝細胞之細胞質中的降低，其針對外加肝細胞PNPLA3 mRNA表現進行修正。表31列示在模型中所採用之相關肝臟生理學假設。
表30. 全肝臟細胞質及核PNPLA3表現相對於研究#1中之基線（第-13天）的ISH影像定量
時間 ( 天數 ) 核 PNPLA3 mRNA ( 每個細胞之平均轉錄本 ) 相對表現 相對減少 細胞質 PNPLA3 mRNA ( 每個細胞之平均轉錄本 ) 相對表現 相對減少
-13 0.52 ± 0.21 n/a n/a 0.62 ± 0.27 n/a n/a
15 0.43± 0.15 0.84 0.16 0.20 ± 0.04 0.37 0.63
29 0.40 ± 0.13 0.85 0.15 0.21 ± 0.05 0.38 0.62
57 0.53 ± 0.24 1.08 -0.08 0.29 ± 0.11 0.50 0.50
76 0.70 ± 0.28 1.45 -0.45 0.33 ± 0.10 0.56 0.44
數據係相對於基線之平均值± SD (n=4)
表31. 模型中所採用之相關肝臟生理學參數。
細胞型 肝臟組成 (%)
肝細胞 85
星形細胞(HSC) 8
庫弗細胞（其他者…） 7
細胞型 相對 PNPLA3 mRNA
肝細胞 1x
星形細胞(HSC) 2x
庫弗細胞（其他者…） 1x
使用此模型，在投予單一4 mg/kg SC劑量的RNAi劑J1D00008後，PNPLA3 mRNA在第15天在肝細胞之細胞質中降低達81%而在第29天則為78%。當在研究2中重複此模型時，分別在第15天及第29天達到66%及65%之PNPLA3 mRNA降低。針對用RNAi劑J1D00008測試之所有NHP (n=14)的平均值，PNPLA3 mRNA在第15天及第29天在肝細胞之細胞質中降低達70%（圖2）。實例 12. 安全性
在大鼠及獼猴中分別以至多500 mg/kg及300 mg/kg之劑量評估RNAi劑J1D00008投予之非臨床安全性歷時至多3個月。在這兩個物種中，RNAi劑J1D00008具有良好耐受性，並且直到所評估之最高劑量均沒有觀察到不良毒性徵象。其他實施例
應了解雖然本發明已連同其實施方式闡明，上述說明僅意欲用於闡釋而非限制本發明之範疇，本發明之範疇係依所附之申請專利範圍之範疇所界定。其他態樣、優點及修改均落於以下申請專利範圍的範疇內。
無
［圖1］係繪示PNPLA3之基線相對全肝臟表現的圖形，其係藉由PCR得到並且來自RNAi劑治療之非人類靈長類動物(NHP)。研究#1：數據係幾何平均值± SD (n=4)。
［圖2］係繪示肝細胞之細胞質中PNPLA3 mRNA減少之平均值的圖形，其係藉由定量ISH得到並且為所有測試動物（研究#1及研究#2）之間的平均值。研究#2：數據係平均值± SD (n=14)。
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Claims (46)

  1. 一種用於抑制PNPLA3基因表現之RNAi劑，其包含： 反義股，其包含與SEQ ID NO: 46至60、176、181及188之任一序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸；及 正義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
  2. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該反義股包含SEQ ID NO: 46至60、176、181、及188之任一序列的核苷酸2至18。
  3. 如請求項1或請求項2所述之RNAi劑，其中該正義股包含與SEQ ID NO: 2、3、4、9至20、214、219及220之任一正義股序列有0或1個核苷酸不同的至少17個連續核苷酸之核苷酸序列；且其中該正義股在該17個連續核苷酸上具有與該反義股至少85%互補性之區域。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之至少一個核苷酸係經修飾之核苷酸或包括經修飾之核苷間鍵聯。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之該正義股及/或反義股的所有或實質上所有該等核苷酸係經修飾之核苷酸。
  6. 如請求項4至5中任一項所述之RNAi劑，其中該經修飾之核苷酸係選自由下列所組成之群組：2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、2′-去氧核苷酸、2′,3′-斷(seco)核苷酸模擬物、鎖核苷酸、2′-F-阿拉伯糖核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2′-O-甲基核苷酸、反向2′-去氧核苷酸、2′-胺基-經修飾之核苷酸、2′-烷基-經修飾之核苷酸、嗎啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸、及3′-O-甲基核苷酸。
  7. 如請求項5所述之RNAi劑，其中所有或實質上所有該等經修飾之核苷酸係2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、或其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之RNAi劑，其中該反義股由下列所組成、基本上由下列所組成、或包含下列：SEQ ID NO: 90、95及102之任一經修飾之反義股序列的核苷酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之RNAi劑，其中該正義股由下列所組成、基本上由下列所組成、或包含下列：SEQ ID NO: 131、136及137之任一經修飾之正義股序列的核苷酸序列。
  10. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該反義股包含SEQ ID NO: 90、95及102之任一經修飾之序列的核苷酸序列且該正義股包含SEQ ID NO: 131、136及137之任一經修飾之序列的核苷酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之RNAi劑，其中該RNAi劑係鍵聯至靶向配體。
  12. 如請求項11所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
  13. 如請求項11或12所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含(NAG37)或(NAG37)s之結構。
  14. 如請求項11至13中任一項所述之RNAi劑，其中該靶向配體係鍵聯至該正義股。
  15. 如請求項14所述之RNAi劑，其中該靶向配體係鍵聯至該正義股之5′末端。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之RNAi劑，其中該正義股的長度係介於18與30個核苷酸之間，且該反義股的長度係介於18與30個核苷酸之間。
  17. 如請求項16所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自介於18與27個核苷酸之間。
  18. 如請求項17所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自介於18與24個核苷酸之間。
  19. 如請求項18所述之RNAi劑，其中該正義股及該反義股的長度各自係21個核苷酸。
  20. 如請求項16至19中任一項所述之RNAi劑，其中該RNAi劑具有兩個鈍端。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之RNAi劑，其中該正義股包含一或兩個端帽。
  22. 如請求項1至22中任一項所述之RNAi劑，其中該正義股包含一或兩個反向無鹼基殘基。
  23. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該RNAi劑包含形成雙鏈體序列之正義股及反義股，該雙鏈體序列具有SEQ ID NO:（176及214）；（90及131）；（181及219）；（95及136）；（188及220）及/或（102及137）。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之RNAi劑，其中該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。
  25. 如請求項1所述之RNAi劑，其包含反義股，該反義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 90、95及102之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列； 其中a、c、g、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該正義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。
  26. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該正義股包含下列、由下列所組成、或基本上由下列所組成：與SEQ ID NO: 214、219及256之核苷酸序列中一者有0或1個核苷酸不同的經修飾之核苷酸序列； 其中a、c、g、i、及u分別代表2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別代表2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s代表硫代磷酸酯鍵聯；且其中該反義股上之所有或實質上所有核苷酸係經修飾之核苷酸。
  27. 如實施例24至26中任一者所述之RNAi劑，其中該正義股進一步在該核苷酸序列之3′末端、在該核苷酸序列之5′端、或在這兩者包括反向無鹼基殘基。
  28. 如請求項24至27中任一項所述之RNAi劑，其中該RNAi劑之該正義股係鍵聯至靶向配體。
  29. 如請求項28所述之RNAi劑，其中該靶向配體對於去唾液酸糖蛋白受體具有親和力。
  30. 如請求項29所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。
  31. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該靶向配體包含：
    Figure 03_image001
    、或
    Figure 03_image003
    。
  32. 如請求項1所述之RNAi劑，其中該反義股由SEQ ID NO: 90、95及102之經修飾之核苷酸序列所組成且該正義股由SEQ ID NO: 131、136及137之經修飾之核苷酸序列所組成； 其中a、c、g、及u分別係2′-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；Af、Cf、Gf、及Uf分別係2′-氟腺苷、胞苷、鳥苷、及尿苷；s係硫代磷酸酯鍵聯；(invAb)係反向無鹼基去氧核糖殘基；且(NAG37)s具有下列化學結構：
    Figure 03_image003
    。
  33. 一種包含如請求項1至32中任一項所述之RNAi劑的組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
  34. 一種用於抑制細胞中之PNPLA3基因表現之方法，該方法包含將有效量的如請求項1至32中任一項所述之RNAi劑或如請求項33所述之組成物引入細胞中。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該細胞係在對象內。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該對象係人類對象。
  37. 如請求項34至36中任一項所述之方法，其中該PNPLA3基因表現係遭抑制達至少約30%。
  38. 一種治療PNPLA3相關疾病或病症之方法，該方法包含向有此需要之人類對象投予治療有效量的如請求項33所述之組成物。
  39. 如請求項38所述之方法，其中該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、酒精性脂肪肝病、或肝硬化。
  40. 如請求項34至39中任一項所述之方法，其中該RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量來投予。
  41. 如請求項34至40中任一項所述之方法，其中該RNAi劑係以二或更多個劑量來投予。
  42. 一種如請求項1至32中任一項所述之RNAi劑或如請求項33所述之組成物用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀的用途。
  43. 如請求項42之所述之用途，其中該症狀係肝硬化。
  44. 一種如請求項1至32中任一項所述之RNAi劑或如請求項33所述之組成物用於製備用於治療至少部分由PNPLA3基因表現所介導之疾病、病症、或症狀之醫藥組成物的用途。
  45. 如請求項42至44中任一項所述之用途，其中該疾病係NAFLD、NASH、肝纖維化、或酒精性或非酒精性肝病，諸如肝硬化。
  46. 如請求項42至45中任一項所述之用途，其中該RNAi劑係以約0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg該人類對象體重之劑量來投予。
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