TW201918555A - 用於抑制去唾液酸醣蛋白受體1表現之RNAi試劑及組合物 - Google Patents

用於抑制去唾液酸醣蛋白受體1表現之RNAi試劑及組合物 Download PDF

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Abstract

本文描述用於抑制去唾液酸醣蛋白受體1 (ASGR1)基因表現之組合物及方法。描述用於抑制ASGR1基因表現之RNA干擾(RNAi)試劑，例如雙鏈RNAi試劑及RNAi試劑-靶向配位體結合物。亦描述包含一或多種ASGR1RNAi試劑之醫藥組合物，其視情況具有一或多種額外治療劑。該等ASGR1RNAi試劑可用於各種疾病及病狀之治療方法中，該等疾病及病狀諸如與非HDL膽固醇(非HDL-C)含量提高、LDL膽固醇(LDL-C)含量提高、總膽固醇含量提高及/或三酸甘油酯(TG)含量提高相關之心血管代謝疾病。

Description

用於抑制去唾液酸醣蛋白受體1表現之RNAi試劑及組合物
本發明係關於用於抑制去唾液酸醣蛋白受體1 (ASGR1 )基因表現之RNA干擾(RNAi)試劑，例如雙鏈RNAi試劑；包括ASGR1 RNAi試劑之組合物；及其使用方法。
去唾液酸醣蛋白受體1 (ASGR1，亦稱為ASGPR、ASGPR1、HL-1及CLEC4H1)此前已知為Ashwell-Morell受體。ASGR1為發揮結合、內化及自去唾液酸醣蛋白循環清除之主要生理作用的跨膜蛋白。ASGR1藉由去唾液酸醣蛋白受體1基因(ASGR1 基因)主要表現於肝臟中。
影響冠狀動脈疾病及心肌梗塞之非HDL膽固醇含量及風險之變體之全基因組關聯研究已鑑別ASGR1 中之序列變體。導致ASGR1單倍不足之del12ASGR1 序列變體已報導與非HDL膽固醇降低及冠狀動脈疾病及心肌梗塞風險降低有關(Nioi, Sigurdsson等人,N. Engl. J. Med. 2016,374 , 2131-41)。如藉由del12載體中之ASGR1含量降低約50%所預測，鹼性磷酸酶(ALP或ALKP)及維生素B12 含量提高，因為此等蛋白質均為去唾液酸醣蛋白受體之受質。因此減少ASGR1蛋白質已顯現為治療心血管疾病之有前景的目標。能夠靶向ASGR1 基因及降低ASGR1蛋白質含量之治療劑代表治療心血管疾病，包括冠狀動脈疾病之新穎方式。
存在對能夠選擇性地且高效地抑制ASGR1 基因表現之新穎ASGR1 特異性RNA干擾(RNAi)試劑(本文中亦稱為RNAi試劑、RNAi觸發劑或觸發劑)，例如雙鏈RNAi試劑之需求。另外，存在對用於治療(包括預防性治療)尤其與非HDL膽固醇(非HDL-C)含量提高、LDL膽固醇(LDL-C)含量提高、總膽固醇含量提高及/或三酸甘油酯(TG)含量提高相關之疾病的新穎ASGR1 特異性RNAi試劑之組合物之需求。
一般而言，本發明提供新穎ASGR1 基因特異性RNAi試劑；包括ASGR1 基因特異性RNAi試劑之組合物；及活體內及/或活體外使用ASGR1 基因特異性RNAi試劑抑制ASGR1 基因表現之方法；及包括本文所描述之ASGR1 基因特異性RNAi試劑之組合物。本文進一步描述至少部分地由ASGR1 基因表現介導之疾病或病症之治療方法，該等方法包括向個體投與本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑中之一或多者。
本文所描述之ASGR1 基因特異性RNAi試劑能夠選擇性地且高效地減少ASGR1 基因表現。本文所描述之ASGR1 RNAi試劑由此能夠降低個體，例如人類或動物個體中之非HDL膽固醇含量及/或LDL膽固醇含量及/或總膽固醇含量及/或三酸甘油酯含量。本文所描述之ASGR1 RNAi試劑亦可影響與動脈粥樣硬化及/或血管疾病相關之其他內源性因素。舉例而言，所描述之ASGR1 RNAi試劑可用於與異常血清脂蛋白含量相關之症狀及疾病之治療性治療及/或預防的方法中，該等症狀及疾病包括(但不限於)肥胖症、代謝症候群、高脂質血症、高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、異常脂質及/或膽固醇代謝、動脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、外周血管疾病、腦血管疾病及其他代謝相關病症及疾病。在一些實施例中，本文所揭示之方法包括向個體投與一或多種ASGR1 RNAi試劑。本文所描述之一或多種ASGR1 RNAi試劑可藉由此項技術中已知之任何適合的方法，諸如皮下注射或靜脈內投與向個體投與。
在一個態樣中，本發明提供包含能夠選擇性地且高效地減少或抑制ASGR1 基因表現之一或多種ASGR1 RNAi試劑之組合物。在一些實施例中，本文所揭示之包含一或多種ASGR1 RNAi試劑之組合物能夠降低個體中之ASGR1蛋白質含量。在一些實施例中，本文所揭示之包含一或多種ASGR1 RNAi試劑之組合物能夠降低個體中之ASGR1 mRNA之含量。包含一或多種ASGR1 RNAi試劑之組合物可向個體，諸如人類或動物個體投與以用於治療及/或預防與非HDL-C含量提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高相關之症狀及疾病。
本文所描述之ASGR1 RNAi試劑包括有義鏈(亦稱為隨從鏈)及反義鏈(亦稱為引導鏈)。有義鏈及反義鏈可彼此部分、實質上或完全互補。本文所描述之RNAi試劑有義鏈及反義鏈之長度各自可為16至30個核苷酸。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈獨立地為17至26個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈獨立地為21至26個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈獨立地為21至24個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈皆為21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及/或反義鏈獨立地為16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長度。有義鏈及反義鏈可為相同長度或不同長度。本文所描述之RNAi試劑在遞送至表現ASGR1 之細胞後活體內或活體外抑制一或多種ASGR1 基因表現。
本文所描述之ASGR1 RNAi試劑之有義鏈包括至少16個連續核苷酸，其與ASGR1 mRNA中相同數目核苷酸之核心伸長序列(在本文中亦稱為「核心伸長段」或「核心序列」)具有至少85%一致性。在一些實施例中，與ASGR1 mRNA中之序列具有至少85%一致性的有義鏈核心伸長段為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸長度。在一些實施例中，此有義鏈核心伸長段為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸長度。在一些實施例中，此有義鏈核心伸長段為17個核苷酸長度。在一些實施例中，此有義鏈核心伸長段為19個核苷酸長度。
ASGR1 RNAi試劑之反義鏈包括至少16個連續核苷酸，其與ASGR1 mRNA中相同數目核苷酸之核心伸長段及對應有義鏈中相同數目核苷酸之核心伸長段具有至少85%互補性。在一些實施例中，與ASGR1 mRNA中之序列或對應有義鏈具有至少85%互補性之反義鏈核心核苷酸伸長段為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸長度。在一些實施例中，此反義鏈核心伸長段為17個核苷酸長度。在一些實施例中，此反義鏈核心伸長段為19個核苷酸長度。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑經設計以靶向具有表1中所揭示之序列中之任一者之序列的ASGR1 基因部分。
本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑中可包括之ASGR1 RNAi試劑有義鏈及反義鏈之實例提供於表2、表3及表4中。ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體之實例提供於表5中。由本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之有義鏈及反義鏈組成或包括於其中之19個核苷酸核心延伸段序列之實例提供於表2中。
在另一態樣中，本發明提供用於活體內將ASGR1 RNAi試劑遞送至個體，諸如哺乳動物之肝細胞之方法。本文中亦描述在此類方法中使用之組合物。一或多種ASGR1 RNAi試劑可使用此項技術中已知之任何寡核苷酸遞送技術遞送至靶細胞或組織。核酸遞送方法包括(但不限於)：藉由囊封於脂質體中；藉由離子導入療法(iontophoresis)；或藉由併入其他媒劑中，其他媒劑諸如水凝膠、環糊精、生物可降解奈米膠囊及生物黏附微球、蛋白質載體或Dynamic Polyconjugates™ (DPC) (參見例如WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185，其各自以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑藉由使RNAi試劑共價與靶向基團連接或結合而遞送至靶細胞或組織。在一些實施例中，靶向基團包括、由以下組成或主要由以下組成：抗體，諸如單株抗體。(參見例如國際專利申請公開案第WO 2018/039647號，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，靶向基團由如去唾液酸醣蛋白受體配位體(亦即，包括對去唾液酸醣蛋白受體具有親和力之化合物之配位體)組成，主要由該配位體組成或包含該配位體。在一些實施例中，去唾液酸醣蛋白受體配體包括、由以下組成或基本上由以下組成：半乳糖或半乳糖衍生物簇。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑連接至包含半乳糖衍生物N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包括N-乙醯基-半乳胺糖三聚體或N-乙醯基-半乳胺糖四聚體。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇為N-乙醯基-半乳胺糖三聚體或N-乙醯基-半乳胺糖四聚體。在一些實施例中，與包括N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體結合的ASGR1 RNAi試劑係由肝臟細胞(liver cell)且尤其肝細胞(hepatocyte)經由受體介導之內飲作用或藉由其他手段而被選擇性內化。適用於遞送RNAi試劑之靶向基團之實例揭示於例如Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2018/044350號及第WO 2017/156012號中，其以全文引用之方式併入本文中。
靶向基團可連接至ASGR1 RNAi試劑之有義鏈或反義鏈的3'或5'端。在一些實施例中，靶向基團連接至有義鏈之3'或5'端。在一些實施例中，目標基團內部連接至RNAi試劑之有義鏈及/或反義鏈上的核苷酸。在一些實施例中，目標基團連接至有義鏈之5'端。在一些實施例中，靶向基團經由連接子連接至RNAi試劑。
含或不含連接子之靶向基團可連接至表2、表3及表4中所揭示之有義鏈及/或反義鏈中之任一者的5'端或3'端。含或不含靶向基團之連接子可附接至表2、表3及表4中所揭示之有義鏈及/或反義鏈中之任一者的5'端或3'端。
在一些實施例中，本文描述包括一或多種具有表5中所揭示之雙螺旋結構之ASGR1 RNAi試劑的組合物。
在另一態樣中，本文描述包括一或多種所描述之ASGR1 RNAi試劑，視情況以及一或多種額外(亦即，第二、第三等)治療劑之醫藥組合物。額外治療劑可為其他ASGR1 RNAi試劑(例如靶向ASGR1 基因內之不同序列之ASGR1 RNAi試劑)。額外治療劑亦可為小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。ASGR1 RNAi試劑在具有或不具有一或多種額外治療劑之情況下可與一或多種賦形劑組合以形成醫藥組合物。所描述之ASGR1 RNAi試劑可視情況與呈單一劑型的一或多種額外治療劑組合(亦即，混合液包括於單一注射液中)。在一些實施例中，包括一或多種所描述之ASGR1 RNAi試劑，視情況以及一或多種額外(亦即，第二、第三等)治療劑之醫藥組合物可調配於醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑中。在一些實施例中，可向個體，諸如哺乳動物投與此等組合物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
在一些實施例中，所描述之ASGR1 RNAi試劑可與一或多種視情況選用之額外治療劑分開投與。在一些實施例中，所描述之ASGR1 RNAi試劑經由皮下注射向有需要之個體投與，且一或多種視情況選用之額外治療劑經口投與，其一起提供與非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高相關之疾病及病狀之治療方案。在一些實施例中，所描述之ASGR1 RNAi試劑經由皮下注射向有需要之個體投與，且一或多種視情況選用之額外治療劑經由單獨皮下注射投與。
在一些實施例中，本文描述包括至少兩種具有不同核苷酸序列之ASGR1 RNAi試劑之組合或混合液的組合物。在一些實施例中，兩種或多於兩種不同ASGR1 RNAi試劑各自單獨地且獨立地連接至靶向基團。在一些實施例中，兩種或多於兩種不同ASGR1 RNAi試劑各自單獨地且獨立地連接至包括靶向配位體或由靶向配位體組成之靶向基團，該等靶向配位體包括一或多種靶向去唾液酸醣蛋白受體之部分。在一些實施例中，兩種或多於兩種不同ASGR1 RNAi試劑各自連接至包括靶向配位體或由靶向配位體組成之靶向基團，該等靶向配位體包括一或多種半乳糖衍生物。在一些實施例中，兩種或多於兩種不同ASGR1 RNAi試劑各自連接至包括靶向配位體或由靶向配位體組成之靶向基團，該等靶向配位體包括一或多種N-乙醯基-半乳胺糖。在一些實施例中，當兩種或多於兩種RNAi試劑包括於組合物中時，RNAi試劑中之每一者獨立地連接至相同靶向基團。在一些實施例中，當兩種或多於兩種RNAi試劑包括於組合物中時，RNAi試劑中之每一者獨立地連接至不同靶向基團，諸如具有不同化學結構之靶向基團。
在一些實施例中，靶向基團在不使用額外連接子之情況下連接至ASGR1 RNAi試劑。在一些實施例中，靶向基團經設計以具有容易存在的連接子以促進連接至ASGR1 RNAi試劑。在一些實施例中，當兩種或多於兩種RNAi試劑包括於組合物中時兩種或多於兩種RNAi試劑可使用相同連接子連接至其對應靶向基團。在一些實施例中，當兩種或多於兩種RNAi試劑包括於組合物中時，兩種或多於兩種RNAi試劑使用不同連接子連接至其對應靶向基團。
在另一態樣中，本發明提供起因於或可歸因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或症狀的治療方法(包括預防或預防性治療)，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其具有包含表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括向細胞投與ASGR1 RNAi試劑，其包括包含表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示起因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或症狀之治療或預防方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其具有包含表2或表4中之序列中任一者之序列的有義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其具有包含表2或表4中之序列中任一者之序列的有義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之ASGR1 RNAi試劑，其包括：包含表4中之序列中任一者之序列的有義鏈；及包含表3中之序列中任一者之序列的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其包括由表4中之序列中任一者之核鹼基序列組成的有義鏈及由表3中之序列中任一者之核鹼基序列組成的反義鏈。在其他實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其包括由表4中之修飾序列中任一者之修飾序列組成的有義鏈及由表3中之修飾序列中任一者之修飾序列組成的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中之ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與一或多種具有表5中之雙螺旋體中任一者之雙螺旋結構的ASGR1 RNAi試劑。
在另一態樣中，本發明提供起因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或症狀的治療方法(包括預防性或防治性治療)，其中該等方法包括投與具有反義鏈之ASGR1 RNAi試劑，該反義鏈與具有表1中所列出之序列中之任一者的ASGR1 mRNA部分至少部分互補。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中之ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與具有反義鏈之ASGR1 RNAi試劑，該反義鏈與具有表1中所列出之序列中任一者之ASGR1 mRNA部分至少部分互補。
在一些實施例中，本文揭示起因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或症狀之治療或預防方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其具有：包括表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈；及與反義鏈至少部分互補、包括表2或表4中之序列中任一者的有義鏈。
在一些實施例中，本文揭示起因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或症狀之治療或預防方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其具有：包括表2或表4中之序列中任一者之有義鏈；及與有義鏈至少部分互補、包括表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其包括：包含表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈；及與反義鏈至少部分互補、包括表2或表4中之序列中任一者的有義鏈。
在一些實施例中，本文揭示抑制ASGR1 基因表現之方法，其中該等方法包括投與ASGR1 RNAi試劑，其包括：包含表2或表4中之序列中任一者之有義鏈；及與有義鏈至少部分互補、包括表2或表3中之序列中任一者之序列的反義鏈。
在一些實施例中，本文揭示用於抑制細胞中之ASGR1 基因表現之組合物，該組合物包含本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之任一者。
在一些實施例中，本文揭示用於將ASGR1 RNAi試劑活體內遞送至肝細胞之組合物，其中該組合物包括結合或連接至靶向基團之ASGR1 RNAi試劑。在一些實施例中，靶向基團為去唾液酸醣蛋白受體配位體。在一些實施例中，描述用於將ASGR1 RNAi試劑活體內遞送至肝細胞之組合物，其中該等組合物包括連接至包含N-乙醯基-半乳胺糖之靶向配位體之ASGR1 RNAi試劑。
在一些實施例中，以醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑形式向諸如哺乳動物之個體投與所描述之ASGR1 RNAi試劑中之一或多者。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
使用ASGR1 RNAi試劑提供疾病/病症之治療性及/或預防性治療之方法，該等疾病/病症與非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高及/或ASGR1 表現增強或提高相關。所描述之ASGR1 RNAi試劑可介導RNA干擾以抑制生產ASGR1蛋白質所需之一或多種基因之表現。ASGR1 RNAi試劑亦可用於治療或預防與異常血清脂蛋白含量相關之各種疾病或病症，包括(但不限於)肥胖症、代謝症候群、高脂質血症、高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、異常脂質及/或膽固醇代謝、動脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、外周血管疾病、腦血管疾病及其他代謝相關病症及疾病。本文所描述之ASGR1 RNAi試劑亦可影響與動脈粥樣硬化及/或血管疾病相關之其他內源性因素。另外，描述用於將ASGR1 RNAi試劑活體內遞送至肝細胞之組合物。
包含一或多種ASGR1 RNAi試劑之醫藥組合物可以多種方法投與，視是否需要局部或全身性治療而定。投與可為(但不限於)靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、真皮下(例如經由植入裝置)及腦實質內投與。在一些實施例中，藉由皮下注射投與本文所描述之醫藥組合物。
所描述之ASGR1 RNAi試劑及/或包括ASGR1 RNAi試劑之組合物可用於起因於非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高之疾病或病況之治療性治療方法中。此類方法包括向個體，例如人類或動物個體投與如本文所描述之ASGR1 RNAi試劑。
在一些實施例中，本文所描述之ASGR1 RNAi試劑可包括一或多個靶向基團，其具有結構(NAG25)、(NAG25)s、(NAG26)、(NAG26)s、(NAG27)、(NAG27)s、(NAG28)、(NAG28)s、(NAG29)、(NAG29)s、(NAG30)、(NAG30)s、(NAG31)、(NAG31)s、(NAG32)、(NAG32)s、(NAG33)、(NAG33)s、(NAG34)、(NAG34)s、(NAG35)、(NAG35)s、(NAG36)、(NAG36)s、(NAG37)、(NAG37)s、(NAG38)、(NAG38)s、(NAG39)、(NAG39)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所描述之ASGR1 RNAi試劑在有義鏈之5'端處包括一個靶向基團，其具有結構(NAG25)、(NAG25)s、(NAG26)、(NAG26)s、(NAG27)、(NAG27)s、(NAG28)、(NAG28)s、(NAG29)、(NAG29)s、(NAG30)、(NAG30)s、(NAG31)、(NAG31)s、(NAG32)、(NAG32)s、(NAG33)、(NAG33)s、(NAG34)、(NAG34)s、(NAG35)、(NAG35)s、(NAG36)、(NAG36)s、(NAG37)、(NAG37)s、(NAG38)、(NAG38)s、(NAG39)、(NAG39)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列，其中SEQ ID NO: 3位於反義鏈之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。如一般熟習此項技術者將清楚理解，如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示，包括硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中典型地所存在的磷酸二酯鍵(參見例如展示所有核苷間鍵的圖1A至圖1M)。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 4)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。如一般熟習此項技術者將清楚理解，如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示，包括硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中典型地所存在的磷酸二酯鍵(參見例如展示所有核苷間鍵的圖1A至圖1M)。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 4)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列，其中SEQ ID NO: 6位於反義鏈之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。如一般熟習此項技術者將清楚理解，如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示，包括硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中典型地所存在的磷酸二酯鍵(參見例如展示所有核苷間鍵的圖1A至圖1M)。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列，其中SEQ ID NO: 8位於反義鏈之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO: 7)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO: 7)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO: 9)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO: 9)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列，其中SEQ ID NO:11位於反義鏈之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與(5'à3') UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO:27)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列，其中SEQ ID NO:27位於反義鏈之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)之差異不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：核苷酸序列(5'à3') usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵，且其中有義鏈與反義鏈至少實質上互補。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 12)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。(I表示肌苷核苷酸。)在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 12)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 13)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；一由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 13)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO: 14)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。(I表示肌苷核苷酸。)在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACCUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO:14)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO: 15)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。(I表示肌苷核苷酸。)在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:15)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO: 16)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。(I表示肌苷核苷酸。)在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:16)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO: 17)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:17)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') GCGUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO: 18)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') GCGUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:18)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO: 31)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。(I表示肌苷核苷酸。)在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:31)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO: 33)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CGGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO: 33)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CCUCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO: 35)之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與核苷酸序列(5'à3') UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：與核苷酸序列(5'à3') CCUCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:35)之差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO: 19)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO: 19)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 4)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 4)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO: 22)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO: 22)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO: 7)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO: 24)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO: 7)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO: 24)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO: 9)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO: 9)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)，其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO: 10)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO: 2)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO: 5)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)，其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括：由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)；及由以下組成、主要由以下組成或包含以下之有義鏈：經修飾之核苷酸序列(5'→3') ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)，且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之核苷酸序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO:3)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO:6)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO:8)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO:11)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO:27)；
其中ASGR1 RNAi試劑進一步包括與反義鏈至少部分互補之有義鏈；且其中該反義鏈及該有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之核苷酸序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO:3)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO:6)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO:8)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO:11)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO:27)；
其中ASGR1 RNAi試劑進一步包括與反義鏈至少部分互補之有義鏈；其中該反義鏈及該有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之核苷酸序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO:3)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO:6)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO:8)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO:11)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO:27)；
其中ASGR1 RNAi試劑進一步包括與反義鏈至少部分互補之有義鏈；其中該反義鏈及該有義鏈全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體；且其中對應的反義鏈序列位於反義鏈之位置1-21處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈及有義鏈，其中該反義鏈及該有義鏈由以下組成、主要由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'à3')對中之一者之差異為0或1個核苷酸之核苷酸序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 12)，其中I表示肌苷核苷酸；
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 13)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO:14)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:15)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)及ACGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:16)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)及ACGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:17)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)及GCGUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:18)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:31)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO: 33)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)及CCUCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:35)；
其中該反義鏈及該有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈及有義鏈，其中該反義鏈及該有義鏈由以下組成、主要由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'à3')對中之一者之差異為0或1個核苷酸之核苷酸序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 12)，其中I表示肌苷核苷酸；
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 13)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO: 3)及ACCUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO:14)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:15)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)及ACGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:16)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO: 8)及ACGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:17)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO: 11)及GCGUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:18)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:31)，其中I表示肌苷核苷酸；
AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO: 6)及CGGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO: 33)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO: 27)及CCUCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:35)；
其中該反義鏈及該有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列：
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)；
usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)；
asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)；或
usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)
其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中ASGR1 RNAi試劑進一步包括與反義鏈至少部分互補之有義鏈；且其中有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列：
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)；
usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)；
asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)；或
usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)
其中ASGR1 RNAi試劑進一步包括與反義鏈至少部分互補之有義鏈；其中有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈及有義鏈：與以下成對核苷酸序列(5'à3')中之一者之差異為0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列：
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO:19)；
usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)及
accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)；
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)；
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO:22)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)及
acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:24)；
asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)及
acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及
gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及
gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10) 及
accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)或
usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)及
ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)；
其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；且s表示硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括由以下組成、主要由以下組成或包含以下之反義鏈及有義鏈：以下成對核苷酸序列(5'à3')中之一者：
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO:19)；
usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)及
accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)；
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)；
usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及
accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO:22)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)及
acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:24)；
asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)及
acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及
gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及
gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)；
asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及
accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)；
asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及
cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)；或
usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)及
ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)；
其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中該有義鏈進一步包括核苷酸序列之3'末端及5'末端處之反向無鹼基殘基，且該有義鏈亦包括共價連接至3'末端及/或5'末端之靶向配位體。在某些實施例中，靶向配位體選自(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)及(NAG37)s，各自如本文表6中所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCAC (SEQ ID NO:133)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGA (SEQ ID NO:239)。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCAC (SEQ ID NO:133)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGA (SEQ ID NO:239)；且
其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCAC (SEQ ID NO:133)；或
UGAAAUAAAUUAAAGGAGA (SEQ ID NO:239)；且
其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:133或SEQ ID NO:239分別位於反義鏈之核苷酸位置1-19 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈及有義鏈，其各自包括與選自由以下組成之群的成對核苷酸序列(5'à3')之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 253)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 250)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO: 257)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:316)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:312)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCAC (SEQ ID NO:133)及GUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:304)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:852)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:312)；
UGAAAUAAAUUAAAGGAGA (SEQ ID NO:239)及UCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:414)；其中I表示肌苷核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈及有義鏈，其各自包括與選自由以下組成之群的成對核苷酸序列(5'→3')之差異為0或1個核鹼基之核鹼基序列：
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO: 253)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO: 250)；
UACUCCUUGGUCAUGAUAG (SEQ ID NO:87)及CUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO: 257)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:316)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:312)；
ACUUCAUCUUUCUUCCCAC (SEQ ID NO:133)及GUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:304)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:852)；
AGCGACUUCAUCUUUCUUC (SEQ ID NO:141)及GAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:312)；
UGAAAUAAAUUAAAGGAGA (SEQ ID NO:239)及UCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:414)；其中I表示肌苷核苷酸，且其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所描述之包含一或多種ASGR1 RNAi試劑之組合物可封裝於套組、容器、藥包、分配器、預填藥注射器或小瓶中。在一些實施例中，本文所描述之組合物非經腸投與。
本發明之其他目標、特徵、態樣及優勢自以下實施方式、附圖及申請專利範圍將變得顯而易知。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年2月26日申請之美國臨時專利申請案第62/635,277號、2017年12月21日申請之美國臨時專利申請案第62/608,606號及2017年10月17日申請之美國臨時專利申請案第62/573,206號的優先權，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式提交且以全文引用之方式併入本文中。ASCII拷貝命名為30653-WO1_SEQLIST.txt且大小為226 kb。
定義
如本文所使用，術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」意謂所連接之核苷之聚合物，其中之每一者可獨立地經修飾或未經修飾。
如本文所使用之「RNAi試劑」(亦稱為「RNAi觸發劑」)意謂含有RNA或類RNA (例如經化學修飾之RNA)寡核苷酸分子之組合物，其能夠以序列特異性方式降低或抑制(例如在適當條件下降低或抑制)靶mRNA之信使RNA (mRNA)轉錄物的轉譯。如本文所使用，RNAi試劑可經RNA干擾機制(亦即，經與哺乳動物細胞之RNA干擾路徑機制(RNA誘導之沉默複合物或RISC)之相互相用誘導RNA干擾)或藉由任何替代性機制或路徑來起作用。儘管咸信RNAi試劑(如該術語在本文中所使用)主要經由RNA干擾機制起作用，但所揭示之RNAi試劑不藉由任何特定路徑或作用機制結合或受限於任何特定路徑或作用機制。本文所揭示之RNAi試劑包含有義鏈及反義鏈，且包括(但不限於)：短(或小)干擾RNA (siRNA)、雙鏈RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及切丁酶受質(dicer substrate)。本文所描述之RNAi試劑之反義鏈與所靶向之mRNA (亦即，ASGR1 mRNA)至少部分互補。RNAi試劑可包括一或多種經修飾之核苷酸及/或一或多種非磷酸二酯鍵。
如本文所使用，當參考給定基因之表現時，術語「沉默」、「降低」、「抑制」、「下調」或「阻斷基因表現」意謂當用本文所描述之RNAi試劑治療細胞、細胞群、組織、器官或個體時，與未經歷該治療之第二細胞、細胞群、組織、器官或個體相比，基因之表現降低，如藉由其中基因經轉錄之細胞、細胞群、組織、器官或個體中自基因轉錄之RNA含量或自mRNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質次單元之含量所量測。
如本文所使用，術語「序列」及「核苷酸序列」意謂使用標準命名法用一連串字母描述的核鹼基或核苷酸的連續或順序。
如本文所使用之「鹼基」、「核苷酸鹼基」或「核鹼基」係作為核苷酸組分之雜環嘧啶或嘌呤化合物，且包括主要嘌呤鹼基腺嘌呤及鳥嘌呤以及主要嘧啶鹼基胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。核鹼基可進一步經修飾以包括(但不限於)通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴展鹼基及氟化鹼基。(參見例如Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P.編Wiley-VCH, 2008)。此類經修飾核鹼基(包括含有經修飾核鹼基之亞胺基磷酸酯化合物)之合成係此項技術中已知的。
如本文所使用且除非另外指示，否則術語「互補」在用於相對於第二核鹼基或核苷酸序列(例如RNAi試劑反義鏈或單鏈反義寡核苷酸)描述第一核鹼基或核苷酸序列(例如RNAi試劑有義鏈或所靶向之mRNA)時，意謂包括第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在某些標準條件下與包括第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜交(在哺乳動物生理學條件(或類似的活體外條件)下形成鹼基對氫鍵)及形成雙螺旋或雙螺旋結構之能力。至少在滿足以上雜交要求之範圍內，互補序列包括瓦生-克里克鹼基對(Watson-Crick base pairs)或非瓦生-克里克鹼基對且包括天然或經修飾之核苷酸或核苷酸模擬物。序列一致性或互補性與修飾無關。舉例而言，出於判定一致性或互補性之目的，如本文所定義之a及Af與U (或T)互補，且與A一致。
如本文所使用，「完美互補」或「完全互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的所有(100%)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，「部分互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少70% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，「實質上互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少85% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文所使用，術語「互補」、「完全互補」、「部分互補」及「實質上互補」相對於RNAi試劑之有義鏈及反義鏈之間或RNAi試劑之反義鏈及ASGR1 mRNA序列之間的核鹼基或核苷酸匹配使用。
如本文所使用，如應用於核酸序列之術語「實質上一致」或「實質上一致性」意謂核苷酸序列(或核苷酸序列之一部分)具有相比於參考序列至少約85%序列一致性或大於85%，例如至少90%、至少95%或至少99%一致性。序列一致性之百分比係藉由在比較窗口內比較兩個最佳比對序列來測定。該百分比計算如下：測定兩個序列中存在相同類型核酸鹼基之位置的數目，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。本文所揭示之發明涵蓋與本文所揭示之彼等者實質上相同的核苷酸序列。
如本文所使用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及其類似術語意謂用於提供個體疾病之一或多個症狀之發生次數、嚴重程度及/或發生頻率的減輕或緩解之方法或步驟。如本文所使用，「治療」可包括個體之疾病之一或多個症狀之發生次數、嚴重程度及/或發生頻率的預防性治療、管理、防治性治療及/或抑制或減少。
如本文所使用，當提及RNAi試劑時，片語「向細胞中引入」意謂將RNAi試劑功能性遞送至細胞中。片語「功能性遞送」意謂將RNAi試劑以該RNAi試劑能夠具有預期生物活性(例如，基因表現之序列特異性抑制)的方式遞送至細胞中。
除非另外說明，否則使用如本文所用之符號意謂根據本文所描述之發明之範疇任何基團可與其連接。
如本文所使用，術語「異構體」係指具有相同分子式，但在性質或其原子結合序列或空間中其原子之配置方面不同的化合物。原子空間排列方面存在不同之異構體稱為「立體異構體」。彼此不為鏡像之立體異構體稱為「非對映異構體」且不重疊鏡像之立體異構體稱為「對映異構體」或有時稱為光學異構體。結合於四個不相同的取代基之碳原子稱為「對掌性中心」。
如本文所使用，除非在結構中特定鑑別為具有特定構形，否則對於其中存在不對稱中心且因此產生對映異構體、非對映異構體或其他立體異構配置之每個結構，本文所揭示之每個結構意欲表示所有此類有可能的異構體，包括其光學純及外消旋形式。舉例而言，本文所揭示之結構意欲涵蓋非對映異構體之混合物以及單一立體異構體。
如在本發明申請專利範圍中所使用，片語「由……組成」不包括申請專利範圍中未說明的任何元件、步驟或成分。當用於本文申請專利範圍中時，片語「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限制於指定材料或步驟及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的材料或步驟。
一般熟習此項技術者將容易理解且瞭解，本文所揭示之化合物及組合物可具有質子化或去質子化狀態下的某些原子(例如N、O或S原子)，視化合物或組合物所處環境而定。因此，如本文所使用，本文所揭示之結構涵蓋可經質子化或去質子化之某些官能基，諸如OH、SH或NH。本文中之揭示內容意欲涵蓋本發明化合物及組合物而與其基於環境(諸如pH值)之質子化狀態無關，如一般熟習此項技術者可容易地理解。
如本文中所使用，當參考兩種化合物或分子之間的連接時，術語「連接」或「結合」意謂兩種化合物或分子藉由共價鍵接合。除非加以陳述，否則如本文所使用之術語「連接」及「結合」可指第一化合物與第二化合物之間在存在或不存在任何插入原子或原子基團的情況下的連接。
如本文所使用，術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與該片語互換使用。術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與術語「及/或」互換使用，除非上下文另外明確說明。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有如一般熟習此項技術者通常理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料可用於實踐或測試本發明，但適合的方法及材料描述如下。所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
RNAi 試劑
本文描述用於抑制ASGR1 基因表現之RNAi試劑(在本文中稱為ASGR1 RNAi試劑或ASGR1 RNAi觸發劑)。各ASGR1 RNAi試劑包含有義鏈及反義鏈。有義鏈及反義鏈各自可為16至30個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈各自可為17至26個核苷酸長度。有義鏈及反義鏈可為相同長度或其可為不同長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈各自獨立地為17-21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈各自為21-26個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈為約19個核苷酸長度，而反義鏈為約21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈為約21個核苷酸長度，而反義鏈為約23個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈為23個核苷酸長度且反義鏈為21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈皆各自為21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈及反義鏈皆各自為26個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈為22個核苷酸長度且反義鏈為21個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈為19個核苷酸長度且反義鏈為21個核苷酸長度。在一些實施例中，RNAi試劑有義鏈及反義鏈各自獨立地為17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個核苷酸長度。
在一些實施例中，雙鏈RNAi試劑具有約16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸之雙螺旋體長度。有義鏈與反義鏈之間的此完美或實質性互補性區域典型地為15-26個(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個)核苷酸長度，且存在於反義鏈之5'端或其附近(例如，此區域可與反義鏈之5'端間隔0、1、2、3或4個不完美或實質上互補之核苷酸)。
有義鏈及反義鏈各自含有長度為16至23個核鹼基之核心伸長序列。反義鏈核心伸長序列與ASGR1 mRNA標靶中存在之核苷酸序列(有時成為例如靶序列) 100% (完美)互補或至少約85% (實質上)互補。有義鏈核心伸長序列與反義鏈中之核心伸長序列100% (完美)互補或至少約85% (實質上)互補，且因此有義鏈核心伸長序列與ASGR1 mRNA標靶中存在之核苷酸序列(靶序列)完美一致或至少約85%一致。有義鏈核心伸長序列可具有與相應反義核心序列相同的長度或其可為不同長度。在一些實施例中，反義鏈核心伸長序列為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸長度。在一些實施例中，有義鏈核心伸長序列為16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸長度。
用於形成ASGR1 RNAi試劑之有義鏈及反義鏈核苷酸序列之實例提供於表2、表3及表4中。表3及4中包括有義鏈及反義鏈序列之RNAi試劑雙螺旋體之實例顯示於表5中。
ASGR1 RNAi試劑有義鏈及反義鏈黏接形成雙螺旋體。ASGR1 RNAi試劑之有義鏈及反義鏈可彼此部分、實質上或完全互補。在互補雙螺旋區內，有義鏈核心伸長序列與反義核心伸長序列至少85%互補或100%互補。在一些實施例中，有義鏈核心伸長序列含有與反義鏈核心伸長序列之對應16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸序列至少85%或100%互補的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸序列(亦即，ASGR1 RNAi試劑之有義及反義核心延伸段序列具有至少85%鹼基配對或100%鹼基配對之至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸區域)。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之反義鏈與表2或表3中之反義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之有義鏈與表2或表4中之有義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。
有義鏈及/或反義鏈在核心伸長序列的3'端、5'端處或3'及5'端兩者處可視情況及獨立地含有額外1、2、3、4、5或6個核苷酸(延伸部分)。反義鏈額外核苷酸(若存在)可或可不與ASGR1 mRNA中之對應序列互補。有義鏈額外核苷酸(若存在)可或可不與ASGR1 mRNA中之對應序列一致。反義鏈額外核苷酸(若存在)可或可不與對應有義鏈額外核苷酸(若存在)互補。
如本文所使用，延伸部分在有義鏈核心伸長序列及/或反義鏈核心伸長序列之5'及/或3'端處包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。有義鏈上之延伸部分核苷酸可或可不與對應反義鏈中之核苷酸(核心伸長序列核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。相反，反義鏈上之延伸部分核苷酸可或可不與對應有義鏈中之核苷酸(核心伸長段核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。在一些實施例中，RNAi試劑之有義鏈及反義鏈含有3'及5'延伸部分。在一些實施例中，一個鏈之一或多個3'延伸部分核苷酸與另一鏈之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在其他實施例中，一個鏈之一或多個3'延伸部分核苷酸不與另一鏈之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑具有含有3'延伸部分之反義鏈及含有5'延伸部分之有義鏈。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1、2、3、4、5或6個核苷酸長度之3'延伸部分之反義鏈。在其他實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1、2或3個核苷酸長度之3'延伸部分之反義鏈。在一些實施例中，一或多個反義鏈延伸部分核苷酸包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或與對應ASGR1 mRNA序列互補之核苷酸。在一些實施例中，3'反義鏈延伸部分包括(但不限於)以下序列中之一者或由其組成：AUA、UGCUU、CUG、UG、UGCC、CUGCC、CGU、CUU、UGCCUA、CUGCCU、UGCCU、UGAUU、GCCUAU、T、TT、U、UU (各自5'至3'列出)。
在一些實施例中，反義鏈之3'端可包括額外無鹼基殘基或位點(Ab)。「無鹼基殘基」或「無鹼基位點」為在糖之1'位置處沒有核鹼基之核苷酸或核苷。在一些實施例中，Ab或AbAb可添加至反義鏈之3'端。在一些實施例中，無鹼基殘基可添加為反向無鹼基殘基(參見表6)。(參見例如F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16)。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1、2、3、4或5個核苷酸長度之5'延伸部分之反義鏈。在其他實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1或2個核苷酸長度之5'延伸部分之反義鏈。在一些實施例中，一或多個反義鏈延伸部分核苷酸包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或與對應ASGR1 mRNA序列互補之核苷酸。在一些實施例中，5'反義鏈延伸部分包括(但不限於)以下序列中之一者或由其組成：UA、TU、U、T、UU、TT、CUC (各自5'至3'列出)。反義鏈可具有任一個上述3'延伸部分與任一個所描述之5'反義鏈延伸部分(若存在)之組合。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1、2、3、4或5個核苷酸長度之3'延伸部分之有義鏈。在一些實施例中，一或多個有義鏈延伸部分核苷酸包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸，或與ASGR1 mRNA序列中之核苷酸對應的核苷酸。在一些實施例中，3'有義鏈延伸部分包括(但不限於)以下序列中之一者或由其組成：T、UT、TT、UU、UUT、TTT、或TTTT (各自5'至3'列出)。
在一些實施例中，有義鏈之3'端可包括其他無鹼基殘基。在一些實施例中，UUAb、UAb或Ab可添加至有義鏈之3'端。在一些實施例中，添加至有義鏈之3'端之一或多個無鹼基殘基可為反向的(invAb)。在一些實施例中，可將一或多個反向無鹼基殘基插入於靶向配位體與RNAi試劑之有義鏈的核鹼基序列之間。在一些實施例中，在RNAi試劑之有義鏈之末端或末端附近包括一或多個反向無鹼基殘基能夠增強RNAi試劑之活性或其他所需特性。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有1、2、3、4、5或6個核苷酸長度之5'延伸部分之有義鏈。在一些實施例中，一或多個有義鏈延伸部分核苷酸包含尿嘧啶或腺苷核苷酸或與ASGR1 mRNA序列中之核苷酸對應的核苷酸。在一些實施例中，有義鏈5'延伸部分可為(但不限於)以下序列中之一者：CA、AUAGGC、AUAGG、AUAG、AUA、A、AA、AC、GCA、GGCA、GGC、UAUCA、UAUC、UCA、UAU、U、UU (各自5'至3'列出)。有義鏈可具有3'延伸部分及/或5'延伸部分。
在一些實施例中，有義鏈之5'端可包括一或多種額外無鹼基殘基(例如(Ab)或(AbAb))。在一些實施例中，添加至有義鏈之5'端之一或多個無鹼基殘基可為反向的(例如invAb)。在一些實施例中，可將一或多個反向無鹼基殘基插入於靶向配位體與RNAi試劑之有義鏈的核鹼基序列之間。在一些實施例中，在RNAi試劑之有義鏈之末端或末端附近包括一或多個反向無鹼基殘基能夠增強RNAi試劑之活性或其他所需特性。
在一些實施例中，有義鏈核心伸長序列之3'端或有義鏈序列之3'端可包括反向無鹼基殘基(invAb (參見表6))。在一些實施例中，有義核心伸長段之5'端或有義鏈序列之5'端可包括反向無鹼基位點或殘基。在一些實施例中，有義鏈核心伸長序列之3'及5'端均可包括反向無鹼基殘基。在一些實施例中，有義鏈序列之3'及5'端均可包括反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，反義鏈核心伸長序列之3'端或反義鏈序列之3'端可包括反向無鹼基殘基(invAb (參見表6))。在一些實施例中，反義核心伸長段之5'端或反義鏈序列之5'端可包括反向無鹼基位點或殘基。在一些實施例中，反義鏈核心伸長序列之3'及5'端均可包括反向無鹼基殘基。在一些實施例中，反義鏈序列之3'及5'端均可包括反向無鹼基殘基。
用於形成ASGR1 RNAi試劑之序列之實例提供於表2、表3及表4中。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包括表2或表3中之序列中任一者之序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包括表2或表3中之序列中任一者之核苷酸1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24、2-24、1-25、2-25、1-26或2-26之序列。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含以下或由以下組成：表3中之經修飾之序列中任一者之經修飾之序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包括表2或表4中之序列中任一者之序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包括表2或表4中之序列中任一者之核苷酸1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24、1-25、1-26、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、2-24、2-25、2-26、3-20、3-21、3-22、3-23、3-24、3-25、3-26、4-21、4-22、4-23、4-24、4-25、4-26、5-22、5-23、5-24、5-25、5-26、6-23、6-24、6-25、6-26、7-24、7-25、7-25、8-25、8-26之序列。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包含以下或由以下組成：表4中之經修飾之序列中任一者之經修飾之序列。
在一些實施例中，本文所描述之RNAi試劑之有義鏈及反義鏈含有相同數目的核苷酸。在一些實施例中，本文所描述之RNAi試劑之有義鏈及反義鏈含有不同數目的核苷酸。在一些實施例中，RNAi試劑之有義鏈5'端及反義鏈3'端形成鈍端。。在一些實施例中，RNAi試劑之有義鏈3'端及反義鏈5'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi試劑之兩端均形成鈍端。在一些實施例中，RNAi試劑之兩端均非鈍端。如本文所用，鈍端係指雙鏈RNAi試劑之一端，其中兩個所黏接鏈之末端核苷酸互補(形成互補鹼基對)。
在一些實施例中，RNAi試劑之有義鏈5'端及反義鏈3'端形成磨損端。在一些實施例中，RNAi試劑之有義鏈3'端及反義鏈5'端形成磨損端。在一些實施例中，RNAi試劑之兩端均形成磨損端。在一些實施例中，RNAi試劑之末端均非磨損端。如本文所使用，磨損端係指雙鏈RNAi試劑之一端，其中兩個黏接鏈之末端核苷酸形成對(亦即，不形成突出端)，但並不互補(亦即，形成非互補對)。如本文所使用，突出端為位於雙鏈RNAi試劑之一個鏈之末端的一或多個未配對核苷酸之伸長段。未配對核苷酸可位於有義鏈或反義鏈上，建立3'或5'突出端。在一些實施例中，RNAi試劑含有：鈍端及磨損端、鈍端及5'突出端、鈍端及3'突出端、磨損端及5'突出端、磨損端及3'突出端、兩個5'突出端、兩個3'突出端、5'突出端及3'突出端、兩個磨損端或兩個鈍端。
核苷酸鹼基(或核鹼基)為雜環嘧啶或嘌呤化合物，其為所有核酸之成分且包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)。如本文所使用，術語「核苷酸」可包括經修飾之核苷酸(諸如核苷酸模擬物、無鹼基位點或殘基(Ab)或替代性置換部分)。當用於多種聚核苷酸或寡核苷酸構築體中時，經修飾之核苷酸可保存細胞中化合物之活性，同時增加此等化合物之血清穩定性，且亦可最小化在投與聚核苷酸或寡核苷酸構築體時人類中活化干擾素活性之可能性。
在一些實施例中，製備ASGR1 RNAi試劑或以鹽、混合鹽或游離酸形式提供。在一些實施例中，將ASGR1 RNAi試劑製備為鈉鹽。此類形式屬於本文所揭示之發明範疇內。
經修飾之核苷酸
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑含有一或多個經修飾之核苷酸。如本文所使用，「經修飾之核苷酸」為除核糖核苷酸(2'-羥基核苷酸)以外的核苷酸。在一些實施例中，至少50% (例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，經修飾之核苷酸包括(但不限於)：去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸(本文中表示為Ab)、2'-經修飾之核苷酸、3'至3'鍵(反向)核苷酸(本文中表示為invdN、invN、invn、invAb)、包含經修飾之核鹼基的核苷酸、橋接核苷酸、肽核酸(PNA)、2',3'開環核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物，本文中表示為NUNA 或NUNA)、鎖定核苷酸(本文中表示為NLNA 或NLNA)、3'-O-甲氧基(2'核苷間鍵)核苷酸(本文中表示為3'-OMen)、2'-F-阿糖核苷酸(本文中表示為NfANA或NfANA )、5’-Me, 2’-氟基核苷酸(本文中表示為5Me-Nf)、嗎啉基核苷酸、膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸(本文中表示為vpdN)、含有膦酸乙烯酯之核苷酸及含有膦酸環丙酯之核苷酸(cPrpN)。2'-經修飾之核苷酸(亦即，在五員糖環之2'位置處具有除羥基外的基團之核苷酸)包括(但不限於)2'O甲基核苷酸(本文中表示為核苷酸序列中之小寫字母'n')、2'-去氧-2'-氟核苷酸(本文中表示為Nf，本文中亦表示為2'-氟核苷酸)、2'-去氧核苷酸(本文中表示為dN)、2'-甲氧基乙基(2'-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(本文中表示為NM或2'-MOE)、2'-胺基核苷酸及2'-烷基核苷酸。給定化合物之所有位置無需經均一修飾。相反地，多於一個改變可併入單一ASGR1 RNAi試劑或甚至其單核苷酸中。ASGR1 RNAi試劑有義鏈及反義鏈可藉由此項技術中已知之方法合成及/或修飾。一個核苷酸上之修飾獨立於另一核苷酸上之修飾。
經修飾核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶及經N-2、N-6及O-6取代的嘌呤(例如2胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5羥基甲基胞嘧啶、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-異丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-異丙基或2-正丁基)及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、胞嘧啶、5丙炔基尿嘧啶、5丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4硫代尿嘧啶、8-鹵基、8胺基、8-硫氫基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(例如5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶、7甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7去氮鳥嘌呤、7去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，RNAi試劑之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，所存在的實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸的RNAi試劑為在有義鏈及反義鏈中有四個或更少個(亦即0、1、2、3或4個)核苷酸為核糖核苷酸的RNAi試劑。如本文所使用，所存在的實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸的有義鏈為在有義鏈中有兩個或更少個(亦即0、1或2個)核苷酸為核糖核苷酸的有義鏈。如本文所使用，所存在的實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸的反義有義鏈為在有義鏈中有兩個或更少個(亦即0、1或2個)核苷酸為核糖核苷酸的反義鏈。在一些實施例中，RNAi試劑之一或多個核苷酸為核糖核苷酸。
經修飾之核苷間鍵
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑之一或多個核苷酸藉由非標準鍵或主鏈(亦即，經修飾之核苷間鍵或經修飾之主鏈)連接。經修飾之核苷間鍵或主鏈包括(但不限於)硫代磷酸酯基(本文中表示為小寫字母「s」)、對掌性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、膦酸烷基酯(例如膦酸甲酯或3'-伸烷基膦酸酯)、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(例如3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯或硫羰基胺基磷酸酯)、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、N-嗎啉基鍵、具有正常3'-5'鍵之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物或具有反向極性之硼烷磷酸酯，其中相鄰核苷單元對使3'-5'連接至5'-3'或使2'-5'連接至5'-2'。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵或主鏈不具有磷原子。不具有磷原子之經修飾之核苷間鍵包括(但不限於)短鏈烷基或環烷基糖間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵、或一或多個短鏈雜原子或雜環糖間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷間主鏈包括(但不限於)矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含有烯烴之主鏈、胺基磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈及其他具有混合N、O、S及CH2 組分之主鏈。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑之有義鏈可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，ASGR1 RNAi試劑之反義鏈可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，或有義鏈及反義鏈皆可獨立地含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑之有義鏈可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，ASGR1 RNAi試劑之反義鏈可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，或有義鏈及反義鏈皆可獨立地含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈含有至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自有義鏈之3'端之位置1-3處的核苷酸之間。在一些實施例中，至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自有義鏈之5'端之位置1-3、2-4、3-5、4-6、4-5或6-8處的核苷酸之間。在一些實施例中，一個硫代磷酸酯核苷間鍵位於有義鏈之5'端，且另一硫代磷酸酯鍵位於有義鏈之3'端。在一些實施例中，兩個硫代磷酸酯核苷間鍵位於有義鏈之5'端，且另一硫代磷酸酯鍵位於有義鏈之3'端。在一些實施例中，有義鏈不包括核苷酸之間的任何硫代磷酸酯核苷間鍵，但含有5'及3'端上之末端核苷酸之間的一個、兩個或三個硫代磷酸酯鍵且視情況存在反向無鹼基殘基端帽。在一些實施例中，靶向配位體經由硫代磷酸酯鍵連接至有義鏈。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義鏈之5'端之位置1-3處的核苷酸之間及自5'端之位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26處的核苷酸之間。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑含有有義鏈中之至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵及反義鏈中之三個或四個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義鏈之5'端之位置1-3處的核苷酸之間及自5'端之位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26處的核苷酸之間。在一些實施例中，三個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義鏈之5'端之位置1-4之間，且第四個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義鏈之5'端之位置20-21之間。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑在反義鏈中含有至少三個或四個硫代磷酸酯核苷間鍵。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑含有一或多個經修飾之核苷酸及一或多個經修飾之核苷間鍵。在一些實施例中，2'經修飾之核苷與經修飾之核苷間鍵組合。
ASGR1 RNAi 試劑
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑靶向表1中所示之ASGR1 基因之位置處或附近的ASGR1 基因。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之反義鏈包括與表1中所揭示之靶ASGR1 19-聚體序列完全、實質上或至少部分互補的核心伸長序列。
表1. ASGR1 19-聚體mRNA靶序列(取自人類ASGR1 (轉錄物變體1) cDNA，GenBank NM_001671.4 (SEQ ID NO: 1))。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其中反義鏈之位置19 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19-聚體靶序列之位置1形成鹼基對。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其中反義鏈之位置1 (5´→3´)能夠與表1中所揭示之19-聚體靶序列之位置19形成鹼基對。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其中反義鏈之位置2 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19-聚體靶序列之位置18形成鹼基對。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包括反義鏈，其中反義鏈之位置2至18 (5'→3')能夠與位於表1中所揭示之19-聚體靶序列之位置18至2處之對應互補鹼基中之每一者形成鹼基對。
對於本文所揭示之RNAi試劑，反義鏈之位置1 (5'端→3'端)處之核苷酸可與ASGR1 基因完美互補，或可與ASGR1 基因非互補。在一些實施例中，反義鏈之位置1 (5'端→3'端)處之核苷酸為U、A或dT (或其經修飾之型式)。在一些實施例中，反義鏈之位置1 (5'端→3'端)處之核苷酸與有義鏈形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含表2或表3中之反義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端→3'端) 2-18或2-19的序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi有義鏈包含表2或表4中之有義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端→3'端) 1-17、1-18或2-18之序列。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含：(i)包含表2或表3中之反義鏈序列中任一者的核苷酸(5'端→3'端) 2-18或2-19之序列的反義鏈；及(ii)包含表2或表4中之有義鏈序列中任一者的核苷酸(5'端→3'端) 1-17、1-18或2-18之序列的有義鏈。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑在有義鏈、反義鏈或有義鏈及反義鏈兩者中包括核心19-聚體核苷酸序列，顯示於下表2中。
表 2 .實例ASGR1 RNAi試劑反義鏈及有義鏈核心伸長段鹼基序列(N=任何核鹼基；I=肌苷(次黃嘌呤)核苷酸)。
包含表2中之核苷酸序列或由其組成之ASGR1 RNAi試劑有義鏈及反義鏈可為經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，包含表2中之核苷酸序列或由其組成、具有有義鏈及反義鏈序列之ASGR1 RNAi試劑為全部或實質上全部經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之反義鏈與表2中之反義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之有義鏈與表2中之有義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。
如本文中所使用，表2中所揭示之序列中所列的各N可獨立地選自任何及所有核鹼基(包括經修飾之核苷酸及未經修飾之核苷酸兩者上之彼等核鹼基)。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一鏈上對應位置處之N核苷酸互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一鏈上對應位置處之N核苷酸不互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一鏈上對應位置處之N核苷酸相同的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一鏈上對應位置處之N核苷酸不同的核鹼基。
某些經修飾之ASGR1 RNAi試劑有義鏈及反義鏈提供於表3及表4中。某些經修飾之ASGR1 RNAi試劑反義鏈以及其基本未經修飾之核鹼基序列提供於表3中。某些經修飾之ASGR1 RNAi試劑有義鏈以及其基本未經修飾之序列提供於表4中。在形成ASGR1 RNAi試劑時，上述表3及4以及表2中列出每一個未經修飾之序列中之每一個核苷酸可為經修飾之核苷酸。
本文所描述之ASGR1 RNAi試劑藉由反義鏈與有義鏈黏接而形成。含有表2或表4中所列序列之有義鏈可與含有表2或表3中所列序列之任何反義鏈雜交，提供兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補的區域。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含表2或表3中之序列中任一者之核苷酸序列。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含以下或由以下組成：具有表2、表3或表4中之序列中任一者之有義鏈及反義鏈之核鹼基序列的雙螺旋體。
含有經修飾之核苷酸之反義鏈之實例提供於表3中。含有經修飾之核苷酸之有義鏈之實例提供於表4中。
如表3及表4中所使用，使用以下記法指示經修飾之核苷酸、靶向基團及連接基團。如一般熟習此項技術者將容易地理解，除非序列另有指示，否則當存在於寡核苷酸中時，單體藉由5'-3'磷酸二酯鍵彼此連接。
A = 腺苷-3'-磷酸酯；
C = 胞苷-3'-磷酸酯；
G = 鳥苷-3'-磷酸酯；
U = 尿苷-3'-磷酸酯
I = 肌苷-3'-磷酸酯
n = 任何經2'-O-甲基修飾之核苷酸
a = 2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯
as = 2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯
c = 2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯
cs = 2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯
g = 2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯
gs = 2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯
t = 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
ts = 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
u = 2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯
us = 2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
i = 2'-O-甲基肌苷-3'-磷酸酯
is = 2'-O-甲基肌苷-3'-硫代磷酸酯
Nf = 任何經2'-氟修飾之核苷酸
Af = 2'-氟腺苷-3'-磷酸酯
Afs = 2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯
Cf = 2'-氟胞苷-3'-磷酸酯
Cfs = 2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯
Gf = 2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯
Gfs = 2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯
Tf = 2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-磷酸酯
Tfs = 2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
Uf = 2'-氟尿苷-3'-磷酸酯
Ufs = 2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯
dN = 任何2'-去氧核糖核苷酸
dA = 2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯
dAs = 2'-去氧腺苷-3'-硫代磷酸酯
dC = 2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯
dCs = 2'-去氧胞苷-3'-硫代磷酸酯
dG = 2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯
dGs = 2'-去氧鳥苷-3'-硫代磷酸酯
dT = 2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯
dTs = 2'-去氧胸苷-3'-硫代磷酸酯
dU = 2'-去氧尿苷-3'-磷酸酯
dUs = 2'-去氧尿苷-3'-硫代磷酸酯
NUNA = 2',3'-開環核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物)-3'-磷酸酯
NUNA s = 2',3'-開環核苷酸模擬物(解鎖核鹼基類似物)-3'-硫代磷酸酯
AUNA = 2',3'-開環-腺苷-3'-磷酸酯
AUNA s= 2',3'-開環-腺苷-3'-硫代磷酸酯
CUNA = 2',3'-開環-胞苷-3'-磷酸酯
CUNA s= 2',3'-開環-胞苷-3'-硫代磷酸酯
GUNA = 2',3'-開環-鳥苷-3'-磷酸酯
GUNA s= 2',3'-開環-鳥苷-3'-硫代磷酸酯
UUNA = 2',3'-開環-尿苷-3'-磷酸酯
UUNA s= 2',3'-開環-尿苷-3'-硫代磷酸酯
a_2N = 參見表6
a_2Ns = 參見表6
pu_2N = 參見表6
pu_2Ns = 參見表6
NLNA = 鎖定核苷酸
NfANA = 2'-F-阿糖核苷酸
NM = 2'-O-甲氧基乙基核苷酸
AM = 2'-O-甲氧基乙基腺苷-3'-磷酸酯
AMs = 2'-O-甲氧基乙基腺苷-3'-硫代磷酸酯
TM = 2'-O-甲氧基乙基胸苷-3'-磷酸酯
TMs = 2'-O-甲氧基乙基胸苷-3'-硫代磷酸酯
R = 核糖醇
(invdN) = 任何反向去氧核糖核苷酸(3'-3'連接型核苷酸)
(invAb) = 反向(3'-3'連接)無鹼基去氧核糖核苷酸，參見表6
(invAb)s = 反向(3'-3'連接)無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-硫代磷酸酯，參見表6
(invn) = 任何反向2'-OMe核苷酸(3'-3'連接型核苷酸)
s = 硫代磷酸酯鍵
sp = 參見表6
vpdN = 膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸
(5Me-Nf) = 5'-Me,2'-氟核苷酸
cPrp = 膦酸環丙酯，參見表6
epTcPr = 參見表6
epTM = 參見表6
如一般熟習此項技術者將容易地理解，除非藉由序列(諸如藉由硫代磷酸酯鍵「s」)另外指明，否則當存在於寡核苷酸中時，核苷酸單體藉由5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接。如一般熟習此項技術者將清楚理解，如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示，包括硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中典型地所存在的磷酸二酯鍵(參見例如展示所有核苷間鍵的圖1A至圖1M)。此外，一般熟習此項技術者將容易理解，離體給定寡核苷酸序列之3'端的末端核苷酸通常將在給定單體之相應3'位置處具有羥基(-OH)而非磷酸酯部分。此外，如一般技術者將容易理解及瞭解，雖然本文所描繪的硫代磷酸酯化學結構通常展示陰離子位於硫原子上，但本文所揭示之發明涵蓋所有硫代磷酸酯互變異構體及/或非對映異構體(例如，其中硫原子具有雙鍵及陰離子位於氧原子上)。本文中除非另外明確指示，否則在描述本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑及ASGR1 RNAi試劑之組合物時使用一般熟習此項技術者之此類理解。
與本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑一起使用的靶向基團及連接基團之某些實例提供於以下表6中。更具體言之，靶向基團及連接基團包括以下，其化學結構提供於以下表6中：(NAG13)、(NAG13)s、(NAG18)、(NAG18)s、(NAG24)、(NAG24)s、(NAG25)、(NAG25)s、(NAG26)、(NAG26)s、(NAG27)、(NAG27)s、(NAG28)、(NAG28)s、(NAG29)、(NAG29)s、(NAG30)、(NAG30)s、(NAG31)、(NAG31)s、(NAG32)、(NAG32)s、(NAG33)、(NAG33)s、(NAG34)、(NAG34)s、(NAG35)、(NAG35)s、(NAG36)、(NAG36)s、(NAG37)、(NAG37)s、(NAG38)、(NAG38)s、(NAG39)、(NAG39)s。各有義鏈及/或反義鏈可具有與序列之5'端及/或3'端結合的本文所列出之任何靶向基團或連接基團，以及其他靶向基團或連接基團。
表 3 . ASGR1 RNAi試劑反義鏈序列.
表 4 .ASGR1 RNAi試劑有義鏈序列.
(A2N ) = 2-胺基腺嘌呤核苷酸
(pu2N ) = 2-胺基嘌呤核苷酸
本文所描述之ASGR1 RNAi試劑藉由反義鏈與有義鏈黏接而形成。含有表2或表4中所列序列之有義鏈可與含有表2或表3中所列序列之任何反義鏈雜交，提供兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補的區域。
在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之反義鏈與表3中之反義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑之有義鏈與表4中之有義鏈序列中任一者之差異為0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含表2或表3中之序列中任一者之核苷酸序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含表2或表3中之序列中任一者之核苷酸(5'端à3'端) 1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24、2-24、1-25、2-25、1-26或2-26之序列。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含以下或由以下組成：表3中之經修飾之序列中任一者之經修飾之序列。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包含表2或表4中之序列中任一者之核苷酸序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包含表2或表4中之序列中任一者之核苷酸(5'端à3'端) 1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21、4-21、1-22、2-22、3-22、4-22、1-23、2-23、3-23、4-23、1-24、2-24、3-24、4-24、1-25、2-25、3-25、4-25、1-26、2-26、3-26或4-26之序列。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑有義鏈包含以下或由以下組成：表4中之經修飾之序列中任一者之經修飾之序列。
對於本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑，反義鏈之位置1處之核苷酸(5'端→3'端)可與ASGR1 基因完美互補，或可與ASGR1 基因非互補。在一些實施例中，反義鏈之位置1 (5'端à3'端)處之核苷酸為U、A或dT (或其經修飾之型式)。在一些實施例中，反義鏈之位置1 (5'端à3'端)處之核苷酸與有義鏈形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈包含表2或表3中之反義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19的序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi有義鏈包含表2或表4中之有義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端→3'端) 1-17或1-18之序列。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包括：(i)包含表2或表3中之反義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端à3'端) 2-18或2-19之序列的反義鏈；及(ii)包含表2或表4中之有義鏈序列中任一者之核苷酸(5'端à3'端) 1-17或1-18之序列的有義鏈。
含有表2或表4中所列序列之有義鏈可與含有表2或表3中所列序列之任何反義鏈雜交，提供兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補的區域。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑具有由表4中之經修飾之序列中任一者的經修飾之序列組成之有義鏈及由表3中之經修飾之序列中任一者的經修飾之序列組成之反義鏈。代表性序列對由表5中展示之雙螺旋ID編號例示。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中任一者表示之雙螺旋體中之任一者。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者所表示之雙螺旋體中之任一者組成。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示之雙螺旋體中之任一者的有義鏈及反義鏈核苷酸序列。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示之雙螺旋體中之任一者的有義鏈及反義鏈核苷酸序列及靶向基團及/或連接基團，其中靶向基團及/或連接基團共價連接(亦即，結合)至有義鏈或反義鏈。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示之雙螺旋體中之任一者之經修飾之核苷酸序列的有義鏈及反義鏈。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有由本文中呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示之雙螺旋體中之任一者的經修飾之核苷酸序列的有義鏈及反義鏈及靶向基團及/或連接基團，其中靶向基團及/或連接基團共價連接至有義鏈或反義鏈。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有表2或表5之反義鏈/有義鏈雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義鏈及有義鏈，且進一步包含靶向基團。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有表2或表5之反義鏈/有義鏈雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義鏈及有義鏈，且進一步包含去唾液酸醣蛋白受體配位體靶向基團。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含具有表2或表5之反義鏈/有義鏈雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列之反義鏈及有義鏈，且進一步包含選自由以下組成之群的靶向基團：(PAZ)、(NAG13)、(NAG13)s、(NAG18)、(NAG18)s、(NAG24)、(NAG24)s、(NAG25)、(NAG25)s、(NAG26)、(NAG26)s、(NAG27)、(NAG27)s、(NAG28)、(NAG28)s、(NAG29)、(NAG29)s、(NAG30)、(NAG30)s、(NAG31)、(NAG31)s、(NAG32)、(NAG32)s、(NAG33)、(NAG33)s、(NAG34)、(NAG34)s、(NAG35)、(NAG35)s、(NAG36)、(NAG36)s、(NAG37)、(NAG37)s、(NAG38)、(NAG38)s、(NAG39)、(NAG39)s，各自如表6中所定義。在一些實施例中，靶向基團為(NAG25)或(NAG25)s，如表6中所定義。在其他實施例中，靶向基團為(NAG37)或(NAG37)s，如表6中所定義。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含反義鏈及有義鏈，其具有表5之雙螺旋體中之任一者之反義鏈及/或有義鏈核苷酸序列中之任一者的經修飾之核苷酸序列。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑反義鏈及有義鏈，其具有表5之雙螺旋體中之任一者之反義鏈及/或有義鏈核苷酸序列中之任一者的經修飾之核苷酸序列，且包括去唾液酸醣蛋白受體配位體靶向基團。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含表2或表5之雙螺旋體中之任一者。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑包含選自由以下組成之群的雙螺旋體：AD05126、AD05150、AD05183、AD05186、AD05193、AD05195、AD05196、AD05206、AD05209、AD05256、AD05374、AD05609及AD05692或其鹽。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑由表2或表5之雙螺旋體中之任一者組成。在某些實施例中，ASGR1 RNAi試劑由選自由以下組成之群的雙螺旋體組成：AD05126、AD05150、AD05183、AD05186、AD05193、AD05195、AD05196、AD05206、AD05209、AD05256、AD05374、AD05609及AD05692或其鹽。
表 5. 藉由具有對應有義鏈及反義鏈之雙螺旋體ID編號鑑別之ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體

在一些實施例中，製備ASGR1 RNAi試劑或以鹽、混合鹽或游離酸形式提供。本文所描述之RNAi試劑在遞送至表現ASGR1 基因之細胞後活體內抑制或阻斷一或多個ASGR1 基因之表現。
靶向基團、連接基團及遞送媒劑
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑與一或多個包括(但不限於)以下的非核苷酸基團結合：靶向基團、連接基團、遞送聚合物或遞送媒劑。非核苷酸基團可促進RNAi試劑之靶向、遞送或附接。靶向基團及連接基團之實例提供於表6中。非核苷酸基團可共價連接至有義鏈及/或反義鏈之3'端及/或5'端。在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑含有連接至有義鏈之3'及/或5'端之非核苷酸基團。在一些實施例中，非核苷酸基團連接至ASGR1 RNAi試劑有義鏈之5'端。非核苷酸基團可經由連接子/連接基團直接地或間接地連接至RNAi試劑。在一些實施例中，非核苷酸基團經由不穩定、可裂解或可逆的鍵或連接子連接至RNAi試劑。
在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi試劑或附接至其之結合物之藥代動力學特性或生物分佈特性，以改良RNAi試劑或結合物之細胞特異性或組織特異性分佈及細胞特異性攝取。在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi試劑之內飲作用。
靶向基團或靶向部分增強結合物或其所附接之RNAi試劑的藥物動力學或生物分佈特性，以改良結合物或RNAi試劑之細胞特異性(在一些情況下包括器官特異性)分佈及細胞特異性(或器官特異性)吸收。靶向基團可為單價、二價、三價、四價或具有更高價數，以適合其所針對之目標。代表性靶向基團包括(但不限於)對細胞表面分子具有親和力之化合物、細胞受體配體、半抗原、抗體、單株抗體、抗體片段及對細胞表面分子具有親和力之抗體模擬物。在一些實施例中，靶向基團使用連接子連接至RNAi試劑，該連接子諸如PEG連接子或一個、兩個或三個無鹼基及/或核糖醇(無鹼基核糖)殘基，該等殘基在一些情況下可充當連接子。在一些實施例中，靶向基團包含半乳糖衍生物簇。
本文所描述之ASGR1 RNAi試劑可在5'-末端及/或3'-末端處合成有反應性基團，諸如胺基(在本文中亦稱為胺)。反應性基團可用於隨後使用此項技術中典型的方法附接靶向基團。
在一些實施例中，靶向基團包含去唾液酸醣蛋白受體配位體。如本文所使用，去唾液酸醣蛋白受體配位體為含有對去唾液酸醣蛋白受體具有親和力之化合物的配位體。如本文提及，去唾液酸醣蛋白受體在肝細胞上高度表現。在一些實施例中，去唾液酸醣蛋白受體配位體包括一或多種半乳糖衍生物或由其組成。如本文所使用，術語半乳糖衍生物包括半乳糖及對去唾液酸醣蛋白受體之親和力等於或大於半乳糖的半乳糖衍生物。半乳糖衍生物包括(但不限於)：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基半乳胺糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖(參見例如：S.T. Iobst及K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686)。適用於將寡核苷酸及其他分子活體內靶向肝臟之半乳糖衍生物及半乳糖衍生物簇為此項技術中已知的(參見例如Baenziger及Fiete，1980，Cell, 22, 611-620；Connolly等人，1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945)。
半乳糖衍生物已經由其結合於肝細胞表面上所表現之去唾液酸醣蛋白受體而用於將分子活體內靶向肝細胞。去唾液酸醣蛋白受體配位體至去唾液酸醣蛋白受體之結合促進細胞特異性靶向肝細胞及分子至肝細胞中之內飲作用。去唾液酸醣蛋白受體配位體可為單體(例如具有單個半乳糖衍生物)或多聚體(例如具有多個半乳糖衍生物)。半乳糖衍生物或半乳糖衍生物簇可使用此項技術中已知之方法附接至RNAi試劑之有義鏈或反義鏈之3'或5'端。諸如半乳糖衍生物簇之靶向基團的製備描述於例如Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2018/044350號及Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.之國際專利申請公開案第WO 2017/156012號中，該等國際專利申請公開案之內容以全文引用的方式併入本文中。
如本文所使用，半乳糖衍生物簇包含具有兩至四個末端半乳糖衍生物的分子。末端半乳糖衍生物經由其C-1碳附接至分子。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇為半乳糖衍生物三聚體(亦稱為三觸角型半乳糖衍生物或三價半乳糖衍生物)。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含N-乙醯基-半乳胺糖。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含三個N-乙醯基-半乳胺糖。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇為半乳糖衍生物四聚體(亦稱為四觸角型半乳糖衍生物或四價半乳糖衍生物)。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含四個N-乙醯基-半乳胺糖。
如本文所使用，半乳糖衍生物三聚體含有三種半乳糖衍生物，其各自連接至中央分支點。如本文所使用，半乳糖衍生物四聚體含有四種半乳糖衍生物，其各自連接至中央分支點。半乳糖衍生物可經由醣中之C-1碳附接至中央分支點。在一些實施例中，半乳糖衍生物經由連接子或間隔子連接至分支點。在一些實施例中，連接子或間隔子為可撓性親水性間隔子，諸如PEG基團(參見例如美國專利案第5,885,968號；Biessen等人，J. Med. Chem. 1995.第39卷.第1538-1546頁)。在一些實施例中，PEG間隔子為PEG3 間隔子。分支點可為允許三種半乳糖衍生物附接且進一步允許分支點附接至RNAi試劑的任何小分子。分支點基團之實例為二-離胺酸或二-麩胺酸。分支點附接至RNAi試劑可經由連接子或間隔子發生。在一些實施例中，連接子或間隔子包含可撓性親水性間隔子，諸如(但不限於) PEG間隔子。在一些實施例中，連接子包含剛性連接子，諸如環狀基團。在一些實施例中，半乳糖衍生物包含N-乙醯基-半乳胺糖或由其組成。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含半乳糖衍生物四聚體，其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖四聚體。
本發明之實施例包括用於將ASGR1 RNAi試劑活體內遞送至肝細胞之醫藥組合物。此類醫藥組合物可包括例如與半乳糖衍生物簇結合之ASGR1 RNAi試劑。在一些實施例中，半乳糖衍生物簇包含半乳糖衍生物三聚體，其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖三聚體，或半乳糖衍生物四聚體，其可為例如N-乙醯基-半乳胺糖四聚體。
靶向基團包括(但不限於) (PAZ)、(NAG13)、(NAG13)s、(NAG18)、(NAG18)s、(NAG24)、(NAG24)s、(NAG25)、(NAG25)s、(NAG26)、(NAG26)s、(NAG27)、(NAG27)s、(NAG28)、(NAG28)s、(NAG29)、(NAG29)s、(NAG30)、(NAG30)s、(NAG31)、(NAG31)s、(NAG32)、(NAG32)s、(NAG33)、(NAG33)s、(NAG34)、(NAG34)s、(NAG35)、(NAG35)s、(NAG36)、(NAG36)s、(NAG37)、(NAG37)s、(NAG38)、(NAG38)s、(NAG39)及(NAG39)s，如表6中所定義。此項技術中已知其他靶向基團，包括半乳糖簇靶向配位體。
在一些實施例中，連接基團與RNAi試劑結合。連接基團有助於試劑共價連接至靶向基團或遞送聚合物或遞送媒劑。連接基團可連接至RNAi試劑有義鏈或反義鏈之3'或5'端。在一些實施例中，連接基團連接至RNAi試劑有義鏈。在一些實施例中，連接基團與RNAi試劑有義鏈之5'端或3'端結合。在一些實施例中，連接基團與RNAi試劑有義鏈之5'端結合。連接基團之實例包括(但不限於)：反應性基團(諸如一級胺)及炔烴、烷基、無鹼基核苷酸、核糖醇(無鹼基核糖)及/或PEG基團。
連接子或連接基團為兩個原子之間的連接，其使所關注之一個化學基團(諸如RNAi試劑)或區段經由一或多個共價鍵連接至所關注之另一個化學基團(諸如靶向基團或遞送聚合物)或區段。不穩定鍵聯含有不穩定鍵。鍵聯可視情況包括使兩個所連接原子之間距離增加的間隔子。間隔子可進一步增加鍵聯之柔性及/或長度。間隔子可包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基；其中之每一者可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣類。間隔基團在此項技術中已熟知且前述清單不意欲限制本發明之範疇。
表2、3或4中列出之ASGR1 RNAi試劑核苷酸序列中之任一者(無論經修飾或未經修飾)可含有3'或5'靶向基團或連接基團。表3或4中所列之含有3'或5'靶向基團或連接基團的ASGR1 RNAi試劑中之任一者可替代地不含有3'或5'靶向基團或連接基團，或可含有不同的3'或5'靶向基團或連接基團，包括(但不限於)表6中描繪之彼等者。表2或表5中所列之ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體中之任一者(無論經修飾或未經修飾)可進一步包含靶向基團或連接基團，包括(但不限於)表6中描繪之彼等者，且靶向基團或連接基團可附接至ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體之有義鏈或反義鏈之3'或5'末端。
靶向基團及連接基團之實例提供於表6中。表4提供具有連接至5'或3'端之靶向基團或連接基團之ASGR1 RNAi試劑有義鏈的若干實施例。
表 6. 代表各種經修飾之核苷酸、靶向基團及連接基團的結構.
在表6中的上述結構之每一者中，NAG包含N-乙醯基-半乳胺糖或如熟習此項技術者鑒於上述結構及本文提供之描述將理解打算附接的另一去唾液酸醣蛋白受體配體。舉例而言，在一些實施例中，表6中提供之結構中之NAG由以下結構表示：

(N-乙醯基-半乳胺糖)
各(NAGx)可經由磷酸酯基(如(NAG25)、(NAG30)及(NAG31)中)或硫代磷酸酯基(如(NAG25)s、(NAG29)s、(NAG30)s、(NAG31)s或(NAG37)s)或另一連接基團連接至ASGR1 RNAi試劑。

磷酸酯基 硫代磷酸酯基
可使用此項技術中已知的其他連接基團。
在一些實施例中，遞送媒劑可用於將RNAi試劑遞送至細胞或組織中。遞送媒劑為使RNAi試劑遞送至細胞或組織改良之化合物。遞送媒劑可包括(但不限於)以下或由其組成：聚合物，諸如兩性聚合物、膜活性聚合物、胜肽、蜂毒素胜肽、蜂毒素樣胜肽(MLP)、脂質、經可逆修飾之聚合物或胜肽或經可逆修飾之膜活性多元胺。
在一些實施例中，RNAi試劑可與脂質、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC或此項技術中可利用之其他遞送系統組合。RNAi試劑亦可以化學方式結合於靶向基團、脂質(包括(但不限於)膽固醇及膽固醇基衍生物)、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC (參見例如WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其中每一者以引用之方式併入本文中)或此項技術中可用之其他遞送系統。
醫藥組合物及調配物
本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑可製備為醫藥組合物或調配物(在本文中亦稱為「藥物」)。在一些實施例中，醫藥組合物包括至少一種ASGR1 RNAi試劑。此等醫藥組合物尤其適用於抑制靶細胞、細胞群、組織或生物體中之靶mRNA之表現。該等醫藥組合物可用於治療患有將得益於靶mRNA之含量降低或靶基因表現之抑制的疾病或病症的個體。該等醫藥組合物可用於治療處於罹患將得益於靶mRNA之含量降低或靶基因表現之抑制的疾病或病症的個體。在一個實施例中，該方法包括向待治療之個體投與連接至如本文所描述之靶向配位體之ASGR1 RNAi試劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(包括媒劑、載劑、稀釋劑及/或遞送聚合物)添加至包括ASGR1 RNAi試劑之醫藥組合物中，由此形成適用於活體內遞送給包括人類之個體的醫藥調配物。
包括本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑及方法的醫藥組合物降低細胞、細胞群、細胞群、組織或個體中之靶mRNA的含量，包括藉由向個體投與治療有效量之本文所描述之ASGR1 RNAi試劑，由此抑制個體之ASGR1 mRNA之表現。在一些實施例中，個體此前已鑑別為靶細胞或組織中之靶基因病原性上調。
在一些實施例中，包括ASGR1 RNAi試劑之所描述之醫藥組合物用於治療或處理與非HDL-C水準提高及/或LDL-C水準提高及/或總膽固醇含量提高及/或TG含量提高及/或ASGR1 mRNA之過度表現相關的臨床表現。在一些實施例中，向需要此類治療、預防或管理之個體投與治療或預防有效量之一或多種醫藥組合物。在一些實施例中，投與所揭示之ASGR1 RNAi試劑中之任一者可用於個體之疾病症狀之發生次數、嚴重程度及/或發生頻率減少。在一些實施例中，個體此前已鑑別或診斷為膽固醇含量提高、三酸甘油酯含量提高及/或一些其他血脂異常。
包括ASGR1 RNAi試劑之所描述之醫藥組合物可用於治療患有將得益於ASGR1 mRNA表現降低或抑制之疾病或病症的個體。在一些實施例中，向該個體投與治療有效量之一或多種包括ASGR1 RNAi試劑之醫藥組合物，由此治療該症狀。在其他實施例中，向該個體投與預防有效量之一或多種ASGR1 RNAi試劑，由此預防至少一種症狀。
投與途徑為使ASGR1 RNAi試劑與身體接觸的路徑。一般而言，投與藥物、寡核苷酸及核酸以用於治療哺乳動物之方法為此項技術中所熟知的，且可應用於投與本文所描述之組合物。本文中所揭示之ASGR1 RNAi試劑可以根據特定途徑適當定製的製劑形式經由任何適合的途徑投與。因此，本文所描述之醫藥組合物可藉由注射(例如靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、關節內或腹膜內)來投與。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物經由皮下注射投與。
包括本文所描述之ASGR1 RNAi試劑之醫藥組合物可使用此項技術中已知之寡核苷酸遞送技術遞送至細胞、細胞群、組織或個體。一般而言，此項技術中公認用於遞送核酸分子(活體外或活體內)之任何適合方法均適合與本文所描述之組合物一起使用。舉例而言，可藉由以下方式進行遞送：局部投與(例如直接注射、植入或表面投與)、全身性投與、或皮下、靜脈內、腹膜內或非經腸途徑，包括顱內(例如室內、實質內及鞘內)、肌肉內、經皮、呼吸道(氣霧劑)、經鼻、經口、經直腸或表面(包括經頰及舌下)投與。在某些實施例中，組合物藉由皮下或靜脈內輸注或注射投與。
因此，在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可經調配以用於投與個體。
如本文所使用，醫藥組合物或藥物包括藥理學有效量之所描述之ASGR1 RNAi試劑中之至少一者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為有意地包括於藥物遞送系統中之除活性藥物成分(API，治療劑產物，例如ASGR1 RNAi試劑)外之物質。賦形劑在預定劑量下不發揮或不意欲發揮治療作用。賦形劑可用於a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支持或增強API之穩定性、生物可用性或患者接受性，c)有助於產品鑑別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括(但不限於)：吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、葡聚糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油狀物、聚合物、防腐劑、生理食鹽水、鹽、溶劑、糖類、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、驅水劑及濕潤劑。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。其應在製造及儲存條件下穩定，且應保護其免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液態聚乙二醇)之溶劑或分散介質及其適合混合物。恰當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)及氯化鈉。可藉由將延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)包括在組合物中而實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下方法來製備：將適當溶劑中之所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一種或組合合併，且視需要繼而進行過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒介中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何其他所需成分的散劑。
適用於關節內投與之調配物可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質調配物或可生物降解聚合物系統亦可用於使藥物用於關節內及經眼投與。
活性化合物可用將防止化合物自體內快速排除的載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法將為一般熟習此項技術者顯而易見的。亦可使用脂質體懸浮液作為醫藥學上可接受之載劑。此等物質可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如美國專利案第4,522,811號中所描述。
ASGR1 RNAi試劑可調配於單位劑型之組合物中以便易於投與及劑量均一性。單位劑型係指適合作為單位劑量用於所治療之個體的實體上離散單元；各單元含有經計算以產生所需治療效果的預定量之活性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格由以下因素規定且直接取決於以下因素：活性化合物之獨特特徵及欲實現之治療效果，以及混配此類用於治療個體之活性化合物之領域中固有之限制。
醫藥組合物可含有通常見於醫藥組合物中之其他額外組分。此類額外組分包括(但不限於)：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑(例如抗組胺劑、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設想表現或包含本文所定義之RNAi試劑的細胞、組織或經分離之器官可用作「醫藥組合物」。如本文所使用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡稱「有效量」係指可產生藥理學、治療性或預防性結果之RNAi試劑之量。
一般而言，有效量之活性化合物將在約0.1至約100 mg/kg體重/天，例如約1.0至約50 mg/kg體重/天範圍內。在一些實施例中，活性化合物之有效量將在每劑量約0.25至約5 mg/kg體重範圍內。在一些實施例中，有效量之活性成分將在每劑量約0.5至約4 mg/kg體重範圍內。投與量亦將可能視諸如患者之整體健康狀況、所遞送之化合物之相關生物學功效、藥物之調配物、調配物中賦形劑之存在及類型及投與途徑等變數而定。此外，應理解，可提高所投與之初始劑量使其超出以上上限含量以快速獲得所需血液含量或組織含量，或初始劑量可小於最佳值。
為了治療疾病或形成用於治療疾病的藥物或組合物，本文所描述之包括ASGR1 RNAi試劑的醫藥組合物可與賦形劑或第二治療劑或治療組合，包括(但不限於)：第二或其他RNAi試劑、小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。
當添加至醫藥學上可接受之賦形劑或佐劑中時，所描述之ASGR1 RNAi試劑可封裝於套組、容器、藥包或分配器中。本文所描述之醫藥組合物可封裝於預填充針筒或小瓶中。
治療方法及表現抑制
本文所揭示之ASGR1 RNAi試劑可用於治療患有將得益於化合物投與的疾病或病症的個體(例如人類或其他哺乳動物)。
在一些實施例中，本文所揭示之RNAi試劑可用於治療患有將得益於ASGR1 mRNA表現降低或抑制之疾病或病症的個體(例如人類)。向個體投與治療有效量之本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之任何一或多者。個體可為人類、患者或人類患者。個體可為成年人、青年、兒童或嬰兒。包括ASGR1 RNAi試劑之所描述之醫藥組合物可用於提供用於疾病之治療性治療之方法。此類方法包括向人類或動物投與本文所描述之醫藥組合物。
在一些實施例中，本文所描述之ASGR1 RNAi試劑用於治療患有ASGR1 相關疾病或病症之個體。「ASGR1相關疾病或病症」係指ASGR1表現水準改變或其中ASGR1之表現水準提高與罹患病況、疾病或病症之風險提高相關的病況、疾病或病症。ASGR1相關疾病或病症包括(但不限於)肥胖症、代謝症候群、高脂質血症、高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、異常脂質及/或膽固醇代謝、動脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、外周血管疾病、腦血管疾病及其他代謝相關病症及疾病。在一些實施例中，所描述之ASGR1 RNAi試劑用於治療患有ASGR1 相關疾病或病症之個體之至少一種症狀。向個體投與治療有效量之所描述之RNAi試劑中之任一或多者。在一些實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑用於製備供治療有需要之患者之ASGR1 相關疾病或病症用之藥物的用途。在其他實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑，其用於治療有需要之患者之ASGR1 相關疾病之方法中。
在某些實施例中，本發明提供一種用於降低有需要之患者之心肌梗塞之風險的方法，其包含向該患者投與本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之任一者。處於患有心肌梗塞之風險下之患者可為具有心肌梗塞病史(例如已患有陳舊性心肌梗塞)之患者。處於患有心肌梗塞之風險下之患者亦可為具有心肌梗塞家族病史或具有一或多種心肌梗塞風險因素之患者。此類風險因素包括(但不限於)高血壓、非HDL膽固醇含量提高、三酸甘油酯含量提高、糖尿病、肥胖症或自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、狼瘡)之病史。在一個實施例中，處於患有心肌梗塞之風險下之患者為患有或診斷患有冠狀動脈疾病之患者。此等及其他患者之心肌梗塞之風險可藉由向該等患者投與本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之任一者降低。在一些實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑用於製備供降低有需要之患者之心肌梗塞風險用之藥物的用途。在其他實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑，其用於降低有需要之患者之心肌梗塞風險之方法中。
在一些實施例中，本發明提供一種用於藉由向患者投與本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之任一者來降低有需要之患者之非HDL膽固醇之方法。非HDL膽固醇為含有促進動脈粥樣硬化脂蛋白之全部膽固醇之量度，包括LDL膽固醇、極低密度脂蛋白、中間密度脂蛋白、脂蛋白(a)、乳糜微粒及乳糜微粒殘餘物。非HDL膽固醇已報導為心血管風險之良好預測因子(Rana等人, Curr. Atheroscler. Rep.,第14卷:130-134, 2012)。可藉由總膽固醇含量減去HDL膽固醇含量來計算非HDL膽固醇含量。在一個實施例中，患者之LDL膽固醇含量在投與ASGR1 RNAi試劑後降低。在另一實施例中，患者之脂蛋白(a)含量在投與ASGR1 RNAi試劑後降低。在一些實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑用於製備供降低有需要之患者之非HDL膽固醇用之藥物的用途。在其他實施例中，本發明提供本文所描述之ASGR1 RNAi試劑，其用於降低有需要之患者之非HDL膽固醇之方法中。
在一些實施例中，根據本發明之方法治療之患者為非HDL膽固醇含量提高(例如非HDL膽固醇之血清含量提高)之患者。理想地，非HDL膽固醇之含量應比任何給定患者之LDL膽固醇含量之目標高約30 mg/dL。在特定實施例中，若患者具有約130 mg/dL或大於130 mg/dL之非HDL膽固醇含量，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在一個實施例中，若患者具有約160 mg/dL或大於160 mg/dL之非HDL膽固醇含量，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在另一實施例中，若患者具有約190 mg/dL或大於190 mg/dL之非HDL膽固醇含量，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在再一實施例中，若患者具有約220 mg/dL或大於220 mg/dL之非HDL膽固醇含量，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在某些實施例中，若根據2013 ACC/AHA心血管風險評定指南(Goff等人, ACC/AHA心血管風險評定指南：美國心臟病學會/美國心臟協會工作組實踐指南(ACC/AHA guideline on the assessment of cardiovascular risk: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines). Circulation. 2013;00:000-000)，患者處於心血管疾病之較高或極高風險下且具有約100 mg/dL或大於100 mg/dL之非HDL膽固醇含量，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。
在本發明之方法之一些實施例中，若根據2013 ACC/AHA心血管風險評定指南(在本文中稱為「2013指南」)，患者處於中等風險或更高心血管疾病風險下，則向患者投與本文所描述之ASGR1 RNAi試劑。在某些實施例中，若患者之LDL膽固醇含量大於約160 mg/dL，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在其他實施例中，若患者之LDL膽固醇含量大於約130 mg/dL且根據2013指南，患者具有中等心血管疾病風險，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。在另其他實施例中，若患者之LDL膽固醇含量大於100 mg/dL且根據2013指南，患者具有較高或極高心血管疾病風險，則向患者投與本發明之ASGR1 RNAi試劑。
在一些實施例中，ASGR1 RNAi試劑用於治療或處理患有ASGR1 相關疾病或病症之個體之臨床表現。向該個體投與治療有效量之ASGR1 RNAi試劑或含有ASGR1 RNAi試劑之本文所描述之組合物中之一或多者在一些實施例中，該方法包含向待治療之個體投與包含本文所描述之ASGR1 RNAi試劑之組合物。
在一些實施例中，相對於在投與ASGR1 RNAi試劑之前的個體或不接受ASGR1 RNAi試劑之個體，投與所描述之ASGR1 RNAi試劑之個體之ASGR1 基因的基因表現含量及/或mRNA含量降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在個體之細胞、細胞群及/或組織中，個體之基因表現水準及/或mRNA含量可降低。在一些實施例中，相對於在投與ASGR1 RNAi試劑之前的個體或不接受ASGR1 RNAi試劑的個體，已投與所描述之ASGR1 RNAi試劑之個體之ASGR1 之蛋白質含量降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。在個體之細胞、細胞群、組織、血液及/或其他體液中，個體之蛋白含量可降低。基因表現、mRNA或蛋白質含量之減少可藉由此項技術中已知之任何方法來評定。ASGR1 mRNA含量及/或蛋白質含量之降低或減少在本文中統稱為ASGR1 降低或減少或ASGR1 表現抑制或降低。
細胞、組織、器官及非人類生物體
涵蓋包括本文所描述之ASGR1 RNAi試劑中之至少一者的細胞、組織、器官及非人類生物體。該細胞、組織、器官或非人類生物體係藉由將該RNAi試劑遞送至該細胞、組織、器官或非人類生物體而製得。
上文所提供之實施例及各項現利用以下非限制性實例加以說明。
實例
實例 1. 合成 ASGR1 RNAi 試劑 .
根據以下合成上述表5中顯示之ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體(具有表3及4中鑑別出之對應有義鏈及反義鏈序列)：
A.合成 . 根據寡核苷酸合成中使用之固相亞胺基磷酸酯技術合成ASGR1 RNAi試劑之有義鏈及反義鏈。視規模而定，使用MerMade96E® (Bioautomation)、MerMade12® (Bioautomation)或OP Pilot 100 (GE Healthcare)。在由受控微孔玻璃(CPG，500 Å或600 Å，自Prime Synthesis, Aston, PA, USA獲得)製成之固體載體上進行合成。所有RNA及2'-經修飾之RNA亞胺基磷酸酯均購自Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA)。2'-O-甲基亞胺基磷酸酯包括以下：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6 -(苯甲醯基)-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)亞胺基磷酸酯、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N4 -(乙醯基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基-胺基)亞胺基磷酸酯、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N2 -(異丁醯基)-2'-O-甲基-鳥苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)亞胺基磷酸酯及5'O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)亞胺基磷酸酯。2'-去氧-2'-氟-亞胺基磷酸酯帶有與2'-O-甲基亞胺基酸酯相同之保護基。5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-開環-尿苷-2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞胺基磷酸酯亦購自Thermo Fisher Scientific。5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-肌苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)亞胺基磷酸酯購自Glen Research (Virginia)。反向無鹼基(3'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-去氧核糖-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)亞胺基磷酸酯係購自ChemGenes (Wilmington, MA, USA)。
使含有亞胺基磷酸酯之靶向配位體溶解於無水二氯甲烷或無水乙腈(50 mM)中，同時使所有其他亞胺基酸酯溶解於無水乙腈(50 mM或100 mM，視規模而定)中且添加分子篩(3Å)。使用5-苯甲基硫-1H-四唑(BTT，250 mM乙腈溶液)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT，250 mM乙腈溶液)作為活化劑溶液。偶合時間為12分鐘(RNA)、15分鐘(靶向配位體)、90秒(2'OMe)及60秒(2'F)。使用100 mM 3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，獲自PolyOrg, Inc., Leominster, MA, 美國)之無水乙腈溶液，引入硫代磷酸酯鍵。除非被特別鑑定為不存在靶向配位體之「裸」RNAi試劑，否則以下實例中所合成及測試之ASGR1 RNAi試劑雙螺旋體中之每一者均採用N-乙醯基-半乳胺糖作為表6中所呈現之靶向配位體化學結構中之「NAG」。
B. 載體結合之寡聚物之裂解及脫除保護基 . 在完成固相合成之後，在30℃下用40重量%甲胺水溶液與28%氫氧化銨溶液(Aldrich)之1:1體積溶液處理經乾燥之固體載體1.5小時。將溶液蒸發且固體殘餘物於水中復原(參見下文)。
C. 純化 . 藉由陰離子交換HPLC，使用TSKgel SuperQ-5PW 13 µm管柱及Shimadzu LC-20AP系統純化粗製寡聚物。緩衝液A為20 mM Tris，pH 9.0且含有20%乙腈，且緩衝液B在添加1.5 M氯化鈉的情況下與緩衝液A相同。在260 nm下記錄UV監測。收集適當溶離份，接著用經過濾之去離子水或100 mM碳酸氫銨，pH 6.7及20%乙腈之操作緩衝液，使用由Sephadex G-25細粒封裝之GE Healthcare XK 26/40管柱，進行尺寸排阻HPLC。
D. 黏接 . 藉由在1×磷酸鹽緩衝鹽水(Corning, Cellgro)中組合等莫耳濃度RNA溶液(有義及反義)來混合互補鏈，以形成RNAi試劑。凍乾一些RNAi試劑且儲存於-15至-25℃下。藉由在1×磷酸鹽緩衝生理食鹽水中，在UV-VIS光譜儀上量測溶液吸光度來測定雙螺旋體濃度。隨後將260 nm溶液吸光度乘以換算因數及稀釋因數以測定雙螺旋體濃度。所用換算因數為0.037 mg/(mL∙cm)或自以實驗方式測定的消光係數計算。
實例 2.ASGR1-SEAP 小鼠模型 .
為了評定RNAi試劑之效能，使用ASGR1- SEAP小鼠模型。藉由流體動力尾部靜脈注射，用質體對六至八週齡雌性C57BL/6白化病小鼠進行活體內瞬時轉染，在投與ASGR1 RNAi試劑或對照物之前投與質體至少15天。該質體含有插入SEAP (分泌型人類胎盤鹼性磷酸酶)報導基因之3'UTR中之ASGR1 cDNA序列(GenBank NM_001671.4 (SEQ ID NO: 1))。經由尾部靜脈將含50 µg含有ASGR1 cDNA序列之質體之林格氏溶液(Ringer's Solution) (總體積為動物體重的10%)注射至小鼠中，以產生ASGR1 -SEAP模型小鼠。溶液如先前所描述經由27規格的針頭在5-7秒內注射(Zhang G等人 「High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA.」 Human Gene Therapy 1999 第10卷, 第1735-1737頁)。藉由ASGR1 RNAi試劑抑制ASGR1 表現導致SEAP表現之伴隨抑制，其藉由Phospha-Light™ SEAP報導基因分析系統(Invitrogen)量測。在治療之前，量測血清中之SEAP表現水準且根據平均SEAP水準將小鼠分組。
分析 ：可在投與ASGR1 RNAi試劑之前及之後的各時間量測SEAP水準。
i) 血清採集 ：用2-3%異氟醚麻醉小鼠且將血液樣品自頜下區域採集至血清分離管(Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany)中。使血液在環境溫度下凝固20分鐘。管在8,000 ×g下離心3分鐘以分離血清且儲存在4℃下。
ii) 血清 SEAP 水準 ：採集血清且根據製造商的說明書藉由Phospha-Light™ SEAP報導基因分析系統(Invitrogen)進行量測。相對於注入生理食鹽水之小鼠對照組使各動物之血清SEAP水準標準化，以考慮此模型之ASGR1 表現之非治療相關降低。首先，各動物在一時間點之SEAP水準除以該動物之預處理表現水準(「預處理」)，以確定「相對於預處理標準化」之表現比率。隨後藉由將個別動物「相對於預處理標準化」之比率除以標準生理食鹽水對照組中所有小鼠「相對於預處理標準化」之平均比率而使在一特定時間點之表現相對於對照組標準化。替代地，在本文所闡述之一些實例中，藉由僅相對於預處理水準標準化來評估各動物之血清SEAP水準。
實例 3.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表7，向各小鼠給與200 μl含有3.0 mg/kg (mpk)ASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 7 .實例3之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第3天、第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表8中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 8. 實例3之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
在所有量測時間點內，相比於生理食鹽水對照(第1組)，給藥組(亦即，第2組至第9組)中之每一者中之ASGR1 RNAi試劑中之每一者顯示SEAP降低，其如本文所描述，指示ASGR1- SEAP小鼠模型中之ASGR1 抑制。舉例而言，第3組顯示在第15天0.010 (±0.011)之標準化SEAP水準，其指示在單次投與3.0 mg/kg雙螺旋體AD04698之後該時間點表現抑制99%。
實例 4.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1- SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表9，向各小鼠給與200 μl含有3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 9. 實例4之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第4天、第8天、第15天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表10中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 10. 實例4之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 5.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表11，向各小鼠給與200 μl含有0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 11. 實例5之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表12中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 12. 實例5之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 6.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表13，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 13. 實例6之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試四(4)隻小鼠(n=4)。在第8天、第13天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表14中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 14. 實例6之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 7.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表15，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 15. 實例7之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試四(4)隻小鼠(n=4)。在第8天、第15天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表16中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 16. 實例7之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 8.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表17，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 17. 實例8之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表18中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 18. 實例8之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 9.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表19，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 19. 實例9之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第13天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表20中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 20. 實例9之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 10.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表21，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kg或3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 21. 實例10之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表22中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 22. 實例10之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 11.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表23，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 23. 實例11之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表24中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 24. 實例11之ASGR1-SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 12.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表25，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 25. 實例12之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第23天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表26中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 26. 實例12之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 13.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表27，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 27. 實例13之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第16天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表28中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 28. 實例13之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 14.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表29，向各小鼠給與200 μl含有0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或3.0 mg/kg ASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 29. 實例14之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表30中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 30. 實例14之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
如上述表30中所示，觀測到所測試之ASGR1 RNAi試劑中之每一者的劑量反應。舉例而言，在第22天，ASGR1 RNAi試劑AD05209顯示0.5 mg/kg投與劑量下約73% (0.268)；1.0 mg/kg投與劑量下約89% (0.113)；及3.0 mg/kg投與劑量下約98% (0.024)之基因表現阻斷。
實例 15. 食蟹獼猴 (Cynomolgus Monkeys) 中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物(「食蟹獼猴」)給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)調配於生理食鹽水中、含有5.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑AD05126或AD05150之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴(n=2)。抽取血液樣品且在第1天(給藥前)、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天及第50天分析血清樣品之鹼性磷酸酶(稱為「ALP」、「ALKP」或「Alk-Phos」)及標準臨床化學圖。因為ALP為ASGR1之受質，預期減少ASGR1以提高ALP水準，如人類群體中之ASGR1 del12載體中所觀測到。總體而言，ASGR1 del12載體之ASGR1水準降低50%顯示ALP水準提高約50.1%。因此，ALP已顯示充當用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。(Nioi等人,2016)。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表31及32中，其報導原始ALP值(單元/L)以及相對於平均化個別預處理水準標準化之ALP。
表 31. 來自Cobas®之實例15 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 32. 相對於Cobas®之實例15之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
在所有量測時間點內，相比於給藥前量測值，用AD05126或AD05150給藥之食蟹獼猴中之每一者顯示ALP提高，指示ASGR1蛋白質水準降低及ASGR1 抑制。
實例 16. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物(「食蟹獼猴」)給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)調配於生理食鹽水中、含有5.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑AD05186或AD05196之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴(n=2)。抽取血液樣品且在第1天(給藥前)、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天及第43天分析血清樣品之ALP及標準臨床化學圖。如實例15中所指出，ALP用作用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表33及34中，其報導原始ALP值(單位/L)以及相對於平均化個別預處理水準標準化之ALP。
表 33. 來自Cobas®之實例16 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 34. 相對於Cobas®之實例16之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
實例 17. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)調配於生理食鹽水中、含有3.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑AD05183或AD05193之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴(n=2)。抽取血液樣品且在第8天、第15天、第22天、第29天、第36天及第43天分析血清樣品之ALP及標準臨床化學圖。如實例15中所指出，ALP用作用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表35及36中，其報導原始ALP值(單位/L)以及相對於平均化個別預處理水準標準化之ALP。
表 35. 來自Cobas®之實例17 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 36. 相對於Cobas®之實例17之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
實例 18. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)調配於生理食鹽水中、含有16.7 mg/kg (對於5.0 mg/kg之總劑量)ASGR1 RNAi試劑AD05209、AD05195或AD05256之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴，不同之處在於僅1隻猴給與AD05195。抽取血液樣品且在第8天、第15天、第22天及第29天分析血清樣品之ALP及標準臨床化學圖。如實例15中所指出，ALP用作用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表37及38中，其報導原始ALP值(單位/L)以及相對於平均化個別預處理水準標準化之ALP。
表 37. 來自Cobas®之實例18 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 38. 相對於Cobas®之實例18之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
實例 19. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)調配於生理食鹽水中、含有10.0 mg/mL、16.7 mg/mL或26.7 mg/mL (分別對於3.0 mg/kg、5.0 mg/kg或8.0 mg/kg之總劑量)ASGR1 RNAi試劑AD05183之單次皮下注射。額外組用0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)給藥，其中生理食鹽水用作對照。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴，不同之處在於用生理食鹽水對照物給藥之猴中之一者在第15天之前死亡。抽取血液樣品且在第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天及第57天分析血清樣品之ALP及標準臨床化學圖。如實例15中所指出，ALP用作用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表39及40中，其報導原始ALP值(單位/L)以及相對於平均化個別預處理水準標準化之ALP。
表 39. 來自Cobas®之實例19 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 40. 相對於Cobas®之實例19之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
實例 20.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表41，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 41. 實例20之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表42中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 42. 實例20之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 21.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表43，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 43. 實例21之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表44中，其中平均SEAP反映SEAP之標準化平均值：
表 44. 實例21之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
實例 22. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估食蟹獼猴中之ASGR1 RNAi試劑。在第1天，向食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)各自調配於生理食鹽水中、含有10.0 mg/kg (對於3.0 mg/kg之總劑量)ASGR1 RNAi試劑AD05209、AD05374、AD05609或AD05692之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。
每組中測試兩隻(2)猴。抽取血液樣品且在第8天、第15天、第22天、第29天及第36天分析血清樣品之ALP及標準臨床化學圖。如實例15中所指出，ALP用作用於監測ASGR1降低及ASGR1 基因抑制之替代生物標記物。根據製造商的建議，在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上量測血清中之ALP水準。
實驗數據顯示於以下表45及46中，其報導原始ALP值(單元/L)以及相對於個別預處理水準平均值標準化之ALP。
表 45. 來自Cobas®之實例22 (以單元/L報導之ALP水準)之食蟹獼猴的ALP水準.
表 46. 相對於Cobas®之實例22之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
如上述表45及46中呈現之資料中所示，RNAi試劑中之每一者顯示在投與食蟹獼猴之後所報導之ALP水準提高。舉例而言，相比於在第22天、第29天及第36天之基線，用3.0 mg/kg AD05209給藥之食蟹獼猴之對應ALP水準加倍(參見例如顯示相比於基線之比率之表46)。
實例 23.ASGR1-SEAP 小鼠中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
使用上述實例2中所描述之ASGR1 -SEAP小鼠模型。在第1天，根據下表47，向各小鼠給與200 μl含有1.0 mg/kgASGR1 RNAi試劑或200 μl不具有ASGR1 RNAi試劑之生理食鹽水(用作對照)的單次皮下注射。
表 47. 實例23之ASGR1 -SEAP小鼠之給藥組.
ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4及5中所示。在皮膚與肌肉之間進行注射(亦即，皮下注射)，注射至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚中。每組中測試三隻(3)小鼠(n=3)。在第8天、第15天、第22天及第29天採集血清，且根據上文實例2中所闡述之程序測定SEAP表現水準。實驗資料顯示於下表48中，顯示反映相對於預處理及對照標準化之SEAP之標準化平均值的平均SEAP，且在下表49中，僅顯示反映相對於預處理水準標準化之SEAP之標準化平均值的平均SEAP：
表 48. 實例23之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理及生理食鹽水對照標準化之平均SEAP.
表 49. 僅於實例23之ASGR1 -SEAP小鼠中相對於預處理標準化之平均SEAP.
實例 24. 食蟹獼猴中之 ASGR1 RNAi 試劑 之活體內測試 .
評估ASGR1 RNAi試劑之食蟹獼猴中之ASGR1 mRNA水準降低。在第1天，向雌性食蟹猴(長尾獼猴)靈長類動物(「食蟹獼猴」)給與0.3 mL/kg (約2-3 mL體積，視動物質量而定)各自調配於生理食鹽水中、含有10.0 mg/kg (對於3.0 mg/kg之總劑量)ASGR1 RNAi試劑AD05193或AD05209之單次皮下注射。ASGR1 RNAi試劑中之每一者包括與具有(NAG37)s之結構之有義鏈之5'-末端結合的N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體，如表4、5及6中所示。
每組中測試四隻(4)猴。在第-7天(給藥前)、第15天、第29天、第43天及第57天，進行肝臟活組織檢查。在每次活組織檢查採集當天，將食蟹獼猴麻醉且進行超音波引導之肝臟活組織檢查以提取肝臟組織樣品。自中葉採集約100 mg肝臟樣品且急凍於液氮中以便RNA分離。隨後將活組織檢查樣品均質化，且藉由RT-qPCR來量測食蟹獼猴肝臟中之ASGR1 mRNA含量。隨後使用ΔΔCT 方法，相對於給藥前(在此情況下，在第-7天)ASGR1 mRNA量測值標準化所得值，其反映於以下表50中。
另外，根據製造商的建議，在第-14天、第-1天、第1天(給藥前)、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第57天、第71天及第85天獲取血清樣品，且在Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics)上每天量測血清中之ALP水準，其報導於以下表51及52中。
表 50. 實例24相對於給藥前(第-7天)之ASGR1 mRNA表現水準.
表 51. 相對於Cobas®之實例24之食蟹獼猴標準化的每組ALP水準.
表 52. 相對於Cobas®之實例24 (相對於給藥前標準化)之食蟹獼猴標準化的ALP水準.
相比於所有量測時間點之預處理量測值，兩個組中之食蟹獼猴均顯示肝臟特異性ASGR1 mRNA明顯降低。在第43天，舉例而言，相比於給藥前水準，第1組(AD05193)之食蟹獼猴的ASGR1 mRNA降低約75.2% (0.248)，而第2組(AD05209)之食蟹獼猴降低約76.3% (0.237)。
其他實施例
應理解，儘管本發明已結合其實施方式加以描述，但前述描述意欲說明且不限制由所附申請專利範圍之範疇定義的本發明之範疇。其他態樣、優點及修改屬於以下申請專利範圍之範疇內。
圖 1A .ASGR1 RNAi試劑AD05126 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1A揭示SEQ ID NO:10及631。
以下縮寫用於圖1A至1M中：a、c、g、i及u為2'-O-甲基修飾核苷酸；Af、Cf、Gf及Uf為2'-氟修飾核苷酸；p為磷酸二酯鍵；s為硫代磷酸酯鍵；invAb為反向無鹼基殘基(參見例如表6)；C為胞苷核糖核苷酸；UUNA 為2',3'-開環-尿苷(參見例如表6)；且(NAG37)s及(NAG37)p為具有表6中描繪之結構之對應的三牙N-乙醯基-半乳胺糖靶向配位體。
圖 1B .ASGR1 RNAi試劑AD05150 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1B揭示SEQ ID NO:10及632。
圖 1C .ASGR1 RNAi試劑AD05183 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1C揭示SEQ ID NO:2及636。
圖 1D .ASGR1 RNAi試劑AD05186 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1D揭示SEQ ID NO:2及639。
圖 1E .ASGR1 RNAi試劑AD05193 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1E揭示SEQ ID NO:5及645。
圖 1F .ASGR1 RNAi試劑AD05195 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1F揭示SEQ ID NO:5及647。
圖 1G .ASGR1 RNAi試劑AD05196 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1G揭示SEQ ID NO:5及648。
圖 1H .ASGR1 RNAi試劑AD05206 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1H揭示SEQ ID NO:28及658。
圖 1I .ASGR1 RNAi試劑AD05209 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1I揭示SEQ ID NO:4及602。
圖 1J .ASGR1 RNAi試劑AD05256 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1J揭示SEQ ID NO:2及674。
圖 1K .ASGR1 RNAi試劑AD05374 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1K揭示SEQ ID NO:2及700。
圖 1L .ASGR1 RNAi試劑AD05609 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1L揭示SEQ ID NO:7及708。
圖 1M .ASGR1 RNAi試劑AD05692 (參見表3-5)之經修飾之有義鏈及反義鏈之示意圖，該RNAi試劑與具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合。圖1M揭示SEQ ID NO:9及721。
圖 2A 至 2D .與在有義鏈之5'末端處具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合之ASGR1 RNAi試劑AD05193之化學結構圖示，以鈉鹽形式展示。
圖 3A 至 3D .與在有義鏈之5'末端處具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合之ASGR1 RNAi試劑AD05193之化學結構圖示，以游離酸形式展示。
圖 4A 至 4D .與在有義鏈之5'末端處具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合之ASGR1 RNAi試劑AD05209之化學結構圖示，以鈉鹽形式展示。
圖 5A 至 5D .與在有義鏈之5'末端處具有(NAG37)s之結構(參見表6)之N-乙醯基-半乳胺糖三牙配位體結合之ASGR1 RNAi試劑AD05209之化學結構圖示，以游離酸形式展示。

Claims (44)

  1. 一種用於抑制ASGR1 基因表現之RNAi試劑，其包含： 包含至少16個與表2或表3中所提供之反義鏈序列中之任一者之差異為0或1個核苷酸之連續核苷酸的反義鏈；及 包含與該反義鏈至少部分互補之核苷酸序列的有義鏈。
  2. 如請求項1之RNAi試劑，其中該反義鏈包含表2或表3中所提供之序列中之任一者的核苷酸2-18。
  3. 如請求項1或2之RNAi試劑，其中該有義鏈包含具有至少16個與該反義鏈至少85%互補之連續核苷酸的核苷酸序列。
  4. 如請求項3之RNAi試劑，其中該有義鏈包含至少16個表2或表4中所提供之有義鏈序列中之任一者的連續核苷酸。
  5. 如請求項1之RNAi試劑，其中該有義鏈及反義鏈各自為約16至約30個核苷酸長度。
  6. 如請求項5之RNAi試劑，其中該有義鏈及反義鏈各自為約17至約26個核苷酸長度。
  7. 如請求項1之RNAi試劑，其中該有義鏈及/或該反義鏈之至少一個核苷酸為經修飾之核苷酸或包括經修飾之核苷間鍵。
  8. 如請求項1之RNAi試劑，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  9. 如請求項7之RNAi試劑，其中該經修飾之核苷酸為去氧核糖核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-經修飾之核苷酸、反向核苷酸、2',3'開環核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2'-F-阿糖核苷酸、5’-Me, 2’-氟核苷酸、含有肌苷之核苷酸或其組合。
  10. 如請求項7之RNAi試劑，其中該有義鏈包含至少一個含有肌苷之核苷酸。
  11. 如請求項7之RNAi試劑，其中該反義鏈包含至少一個2',3'-開環-核苷酸。
  12. 如請求項1之RNAi試劑，其中該反義鏈包含表2中所提供之反義序列中之任一者的核苷酸序列。
  13. 如請求項12之RNAi試劑，其中該有義鏈包含表2中所提供之有義序列中之任一者的核苷酸序列。
  14. 如請求項1之RNAi試劑，其中該反義鏈包含表3中所提供之經修飾之反義序列中之任一者的經修飾之序列。
  15. 如請求項14之RNAi試劑，其中該有義鏈包含表4中所提供之經修飾之有義序列中之任一者的經修飾之序列。
  16. 如請求項1之RNAi試劑，其中該RNAi試劑與靶向配位體結合。
  17. 如請求項16之RNAi試劑，其中該靶向配位體包含N-乙醯基-半乳胺糖。
  18. 如請求項16之RNAi試劑，其中該靶向配位體選自表6中之靶向配位體。
  19. 如請求項16之RNAi試劑，其中該靶向配位體為(NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)或(NAG37)s。
  20. 如請求項16之RNAi試劑，其中該靶向配位體與該有義鏈之5'端結合。
  21. 如請求項16之RNAi試劑，其中該靶向配位體與該有義鏈之3'端結合。
  22. 如請求項1之RNAi試劑，其中該有義鏈包含一或兩個反向無鹼基殘基。
  23. 如請求項1之RNAi試劑，其中該RNAi試劑為表5中所提供之雙螺旋體中之任一者。
  24. 如請求項1之RNAi試劑，其中該RNAi試劑為選自以下之雙螺旋體：AD05126 (SEQ ID NO:10及631)、AD05150 (SEQ ID NO:10及632)、AD05183 (SEQ ID NO:2及636)、AD05186 (SEQ ID NO:2及639)、AD05193 (SEQ ID NO:5及645)、AD05195 (SEQ ID NO:5及647)、AD05196 (SEQ ID NO:5及648)、AD05206 (SEQ ID NO:28及658)、AD05209 (SEQ ID NO:4及602)、AD05256 (SEQ ID NO:2及674)、AD05374 (SEQ ID NO:2及700)、AD05609 (SEQ ID NO:7及708)或AD05692 (SEQ ID NO:9及721)。
  25. 如請求項1之RNAi試劑，其中該反義鏈由以下組成、主要由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'→3')中之一者之差異為0或1個核苷酸的核苷酸序列： UACUCCUUGGUCAUGAUAGGU (SEQ ID NO:3)； AGCGACUUCAUCUUUCUUCCG (SEQ ID NO:6)； AGCGACUUCAUCUUUCUUCGU (SEQ ID NO:8)； ACUUCAUCUUUCUUCCCACGC (SEQ ID NO:11)；或 UGAAAUAAAUUAAAGGAGAGG (SEQ ID NO:27)。
  26. 如請求項25之RNAi試劑，其中該有義鏈由以下組成、主要由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'→3')中之一者之差異為0或1個核苷酸的核苷酸序列： ACCUAUCAUGACCAAGGAIUA (SEQ ID NO:12)， ACCUAUCAUGACCAAGGAGUA (SEQ ID NO:13)； ACCUAUCAUGACCAAIGAIUA (SEQ ID NO:14)； CGGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:15)； ACGAAGAAAGAUGAAGUCICU (SEQ ID NO:16)； ACGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:17)； GCGUGGGAAGAAAGAUGAAGU (SEQ ID NO:18)； CGGAAGAAAGAUGAAIUCICU (SEQ ID NO:31)； CGGAAGAAAGAUGAAGUCGCU (SEQ ID NO:33)；或 CCUCUCCUUUAAUUUAUUUCA (SEQ ID NO:35)； 其中I表示肌苷核苷酸。
  27. 如請求項25或26之RNAi試劑，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  28. 如請求項27之RNAi試劑，其中該有義鏈在該核苷酸序列之3'末端處、在該核苷酸序列之5'端處或在3'及5'兩個末端處進一步包括反向無鹼基殘基。
  29. 如請求項1之RNAi試劑，其中該反義鏈包含以下、由以下組成或主要由以下組成：與以下核苷酸序列(5'→3')中之一者之差異為0或1個核苷酸的經修飾之核苷酸序列： usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)； usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)； asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)； asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)；或 usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷；UUNA 表示2',3'-開環-尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中該有義鏈上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  30. 如請求項1之RNAi試劑，其中該有義鏈包含以下、由以下組成或主要由以下組成：與以下核苷酸序列(5'→3')中之一者之差異為0或1個核苷酸的經修飾之核苷酸序列： accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO:19)； accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)； accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)； accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO:22)； cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)； acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:24)； acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)； gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)； gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)； accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)； cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)； cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)；或 ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)； 其中a、c、g、i及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷、肌苷或尿苷；且Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷或尿苷。
  31. 如請求項1之RNAi試劑，其中雙螺旋體對之有義鏈及反義鏈包含以下、由以下組成或主要由以下組成：與以下成對核苷酸序列(5'→3')中之一者之差異為0或1個核苷酸的經修飾之核苷酸序列： usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及 accuaucaUfGfAfccaaggaiua (SEQ ID NO:19)； usAfscUfcCfUUNA UfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:4)及 accuaucaUfGfAfccaaggagua (SEQ ID NO:20)； usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及 accuaucaUfGfAfcCaaggagua (SEQ ID NO:21)； usAfscUfcCfuUfgGfuCfaUfgAfuAfgsGfsu (SEQ ID NO:2)及 accuaucaUfGfAfcCaaigaiua (SEQ ID NO:22)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及 cggaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:23)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsGfsu (SEQ ID NO:7)及 acgaagaaAfGfAfugaagucicu (SEQ ID NO:24)； asGfscsgacuucauCfuUfuCfuUfcGfsu (SEQ ID NO:9)及 acgaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:25)； asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及 gcgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:26)； asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及 gscgugggaAfGfAfaagaugaagu (SEQ ID NO:29)； asCfsusUfcAfuCfuUfuCfuUfcCfcAfcGfsc (SEQ ID NO:10)及 accuaucaUfGfAfccaaigaiua (SEQ ID NO:30)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及 cggaagaaAfGfAfugaaiucicu (SEQ ID NO:32)； asGfscGfaCfuucauCfuUfuCfuUfcsCfsg (SEQ ID NO:5)及 cggaagaaAfGfAfugaagucgcu (SEQ ID NO:34)；或 usGfsaAfaUfaAfaUfuAfaAfgGfaGfasGfsg (SEQ ID NO:28)及 ccucuccuUfUfAfauuuauuuca (SEQ ID NO:36)。
  32. 如請求項29至31中任一項之RNAi試劑，其中該RNAi試劑在該有義鏈之5'端處與靶向配位體結合。
  33. 如請求項32之RNAi試劑，其中該靶向配位體選自由以下組成之群： (NAG25)、(NAG25)s、(NAG37)或(NAG37)s。
  34. 如請求項33之RNAi試劑，其中該靶向配位體為三牙配位體，其包括N-乙醯基-半乳胺糖且具有選自由以下組成之群的結構： (NAG25)； (NAG25)s； (NAG37)；及 (NAG37)s。
  35. 一種包含如請求項1至31中任一項之RNAi試劑及醫藥學上可接受之賦形劑的組合物。
  36. 如請求項34之組合物，其進一步包含第二ASGR1 RNAi試劑，該RNAi試劑包含反義鏈及有義鏈，其中該反義鏈包含表2或表3中所提供之序列中之任一者的核苷酸2-18。
  37. 如請求項35或36之組合物，其進一步包含一或多種額外治療劑。
  38. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi試劑或如請求項35至37中任一項之組合物的用途，其用於製備供抑制細胞中之ASGR1 基因表現之醫藥組合物。
  39. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi試劑或如請求項35至37中任一項之組合物的用途，其用於製備供治療ASGR1 相關疾病或病症之醫藥組合物。
  40. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi試劑或如請求項35至37中任一項之組合物的用途，其用於製備供治療至少部分地由ASGR1 基因表現介導之疾病、病症或症狀之醫藥組合物。
  41. 如請求項39或40之用途，其中該疾病為心血管代謝疾病。
  42. 如請求項40之用途，其中該疾病或病症為肥胖症、代謝症候群、高脂質血症、高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、異常脂質及/或膽固醇代謝、動脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、外周血管疾病或腦血管疾病。
  43. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi試劑或如請求項35至37中任一項之組合物的用途，其用於製備供為有此需要之個體減少非HDL膽固醇之醫藥組合物。
  44. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi試劑或如請求項35至37中任一項之組合物的用途，其用於製備供為有此需要之個體降低心肌梗塞風險之醫藥組合物。
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