CN116617390A

CN116617390A - Asgr1抑制剂在促进胆固醇外排和治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用

Info

Publication number: CN116617390A
Application number: CN202210130395.1A
Authority: CN
Inventors: 宋保亮; 王菊琼
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2023-08-22
Also published as: WO2023151624A1

Abstract

本发明公开ASGR1抑制剂在治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的应用。本发明还公开ASGR1抑制剂在促进胆固醇外排中的应用。本发明还公开ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合在治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的应用。本发明进一步公开了抗ASGR1单克隆抗体及其用途。

Description

ASGR1抑制剂在促进胆固醇外排和治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用

技术领域

本发明涉及ASGR1抑制剂在促进胆固醇外排和在治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用。本发明还涉及抗ASGR1的单克隆抗体以及ASGR1抑制剂与另一降脂药的联合使用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一类慢性肝脏疾病，排除酒精、药物、遗传等明确的肝损伤因素所致的肝脏脂肪变性 (定义为存在>5％的脂肪变性)，在西方国家中最为常见。据报道，NAFLD在全球范围内的患病率为25％，并且呈现出逐步上升的趋势。在肥胖和糖尿病人中的 NAFLD发病率明显高于普通人。NAFLD作为代谢综合征的重要组成部分，是代谢综合征在肝脏中的表现，可分为单纯非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)和非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)。NAFL及 NASH被认为是主要的脂肪肝疾病，因为它们在患有升高的肝脂质的个体中占最大比例。NAFL/NASH的严重性评价指标包括脂质的存在、炎细胞浸润、肝细胞空泡样变性及纤维化程度。

NAFLD在早期主要表现为过量的甘油三酯(Triglyceride,TG)、胆固醇和胆固醇酯以脂滴的形式大量堆积在肝脏中，肝脏没有或仅有少量的炎症或肝细胞损伤。大量的脂滴堆积在肝脏导致线粒体产生氧化应激反应，从而诱发产生如肿瘤坏死因子(TNFα)以及白介素6(IL-6)在内的大量细胞因子，使NAFLD 发展为肝脏纤维化，最终发展成为肝硬化和肝癌。

II型糖尿病、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、心脑血管疾病等与NAFLD 的发展密切相关，这些因素之间相互协作，共同促进了NAFLD的发生发展。由于NAFLD的发病及其症状极难察觉，因而，纵然有越来越多的研究者试图揭示 NAFLD背后发生的机制，也仍然是阻碍重重。

目前，国内外没有批准上市用于特异性治疗NAFLD的药物。控制体重和改善胰岛素抵抗仍然是治疗NAFLD的主流方案。需要指出的是，传统的降脂药如他汀不能有效治疗脂肪肝，一方面降脂药会损伤肝脏，促使转氨酶升高，另一方面部分降脂药会将血液中的脂肪转移至肝脏，加重脂肪肝，再者脂肪肝的发生并非都由血脂高引起。如能够主动促使肝脏细胞中胆固醇外排，通过减少肝脏中过量脂质的堆积，则能在早期遏制NAFLD的发生，并防止NAFL向NASH转化。

发明内容

发明人发现，Asgr1全身缺陷型小鼠的肝脏中脂质堆积得到显著缓解，进一步研究发现肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中的量显著增加。随后鉴定出 Asgr1缺陷小鼠通过调控胆固醇外排的转录因子LXRα的蛋白水平显著上调，促使ABCG5/8和ABCA1胆固醇外排转运蛋白增多；同时激活AMPK抑制肝脏中脂质合成的转录因子SREBP-1c入核下调下游的脂质合成的靶基因，从而抑制肝脏中脂质的合成。

在第一方面，本发明提供ASGR1抑制剂在制备用于促进胆固醇外排的药物中的应用。

在第二方面，本发明提供ASGR1抑制剂在制备用于治疗NAFLD药物中的应用。

在第三方面，本发明提供用于促进胆固醇外排用途的ASGR1抑制剂。

在第四方面，本发明提供用于治疗NAFLD用途的ASGR1抑制剂。

在第五方面，本发明提供一种促进胆固醇外排的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的ASGR1抑制剂。

在第六方面，本发明提供一种治疗NAFLD的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的ASGR1抑制剂。

在第七方面，本发明提供一种用于治疗NAFLD或促进胆固醇外排的药物组合物，其包含治疗有效量ASGR1抑制剂以及药学上可接受的载体。

发明人还发现，ASGR1抑制剂与另一降脂药物的联合施用产生显著的协同降脂效果，血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平均显著降低。

在第八方面，本发明提供ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合在制备用于促进胆固醇外排、治疗NAFLD、降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平、降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平、或预防心血管疾病的药物中的应用。

在第九方面，本发明提供用于促进胆固醇外排、治疗NAFLD、降低血液中总胆固醇水平、降低血液中甘油三酯水平、或预防心血管疾病用途的ASGR1 抑制剂与第二降脂药的组合。

在第十方面，本发明提供一种促进胆固醇外排、治疗NAFLD、降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平、降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平、或预防心血管疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在第十一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的 ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在第十二方面，本发明提供一种药盒，其包括第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包括治疗有效量的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包括治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在上述任一方面，所述NAFLD是NAFL、NASH、伴随肝纤维化的NAFLD、伴随肝硬化的NAFLD或伴随肝细胞癌的NAFLD。

在上述任一方面，所述ASGR1抑制剂可以包括：(1)与ASGR1结合的抑制剂；(2)与ASGR1的配体(例如去唾液酸糖蛋白)结合的抑制剂；(3)降低或阻断ASGR1与其配体结合的抑制剂；(4)降低或阻断ASGR1内吞的抑制剂；(5)降低ASGR1的蛋白质水平的抑制剂；(6)降低或阻断ASGR1的蛋白质活性的抑制剂；以及(7)降低或阻断ASGR1的编码基因的表达的抑制剂。

在上述任一方面，所述ASGR1抑制剂可以是小分子化合物、反义寡核苷酸(ASO)、干扰核酸(例如shRNA、siRNA、gRNA)、靶向ASGR1的核酸适配体、抗ASGR1抗体或它们的组合。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是ASGR1抗体。在一些实施方案中，所述ASGR1抗体是ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至包含SEQ ID NO:1所示序列的人 ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至ASGR1 的碳水化合物结合区域并抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ IDNO:2的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:3的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、 N209、H257、T259和Y273中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1 单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265 和D266中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向ASGR1的DNA或 mRNA并抑制ASGR1的表达的核酸。在一些实施方式中，所述核酸选自反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、shRNA和gRNA。在一些实施方式中，所述核酸是ASO，所述ASO可以在骨架、糖基或碱基上被修饰，以抵抗体内降解。合适的修饰方式包括，但不限于硫代磷酸化(PSP)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、2’-O- 甲氧基乙基修饰(2’-MOE)、5-甲基胞嘧啶(5mC)。在一些实施方式中，所述核酸是siRNA或shRNA，所述siRNA可通过合适的载体被递送。所述合适的载体例如是GalNAc、LNP(脂质纳米粒)或AAV。在一些实施方式中，所述核酸靶向SEQ ID NO:36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。在一些实施方式中，所述核酸是gRNA，所述gRNA与Crispr/Cas酶(例如Crispr/Cas9)构成基因编辑系统，抑制或阻断ASGR1的编码基因的表达。在一些实施方式中，所述核酸靶向SEQ ID NO:36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向ASGR1的核酸适配体(aptamer)。在一些实施方式中，所述核酸适配体结合至人ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。

在上述任一方面，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。在一些实施方案中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和帕伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是抗PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的干扰核酸(如siRNA或shRNA)。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是 Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。

在第十三方面，本发明提供抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制人ASGR1与其天然配体的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQID NO:4-6所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:7-9所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、 LCDR3，分别包含SEQID NO:22-24所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、 HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:25-27所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含 SEQ ID NO:28所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的序列。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35所示的序列。

本发明的其他方面和优点可从以下关于本发明的详细描述中明显得出。

附图说明

图1.ASGR1缺失增加LXR的蛋白水平，促进胆固醇外排，降低脂质水平。(a)GSEA分析显示LXR通路的靶基因被显著富集。通过小干扰RNA(siRNA) 在人的肝癌细胞Huh7中敲低ASGR1，抽提总RNA用于转录组测序并进行GSEA 分析；(b)Huh7细胞中转染指定小干扰RNA，72小时后，裂解细胞提取总RNA，实时定量PCR分析检测LXR靶基因的表达；(c)Huh7细胞中转染指定小干扰 RNA，72小时后，裂解，提取细胞内总蛋白，检测LXRα、LXRβ和ASGR1蛋白表达水平，Actin作为内参；(d)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在Huh7细胞中构建ASGR1敲除细胞系，免疫蛋白质印记检测在野生型(WT)细胞和 ASGR1敲除细胞系(ASGR1 KO-A,-B)中LXRα、LXRβ和ASGR1蛋白表达变化，Actin作为内参；(e)将Huh7细胞转染表达ASGR1蛋白的质粒用于构建稳定表达ASGR1的细胞株。免疫蛋白质印记检测在野生型(WT)细胞和ASGR1 稳定表达细胞系(ASGR1 OE-A,-B)中LXRα、LXRβ和ASGR1蛋白表达变化， Actin作为内参；(f)实时定量PCR检测ASGR1稳定表达细胞株中LXR下游靶基因的变化。将8周大的ASGR1杂合小鼠、纯合小鼠和同窝生的雄性野生型小鼠随机分组(每组6只)，自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食 (60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养4周。杀小鼠取样前均饥饿 4个小时，所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(g)血清中总胆固醇；(h)血清中甘油三酯；(i)肝脏中总胆固醇；(j)肝脏中甘油三酯；(k)肝脏中苏木精-伊红染色 (左)和油红O染色(右)；(l)胆囊体积；(m)胆汁中胆固醇浓度；(n)胆汁中总胆汁酸的浓度；(o)胆汁中总胆固醇的总量；(p)胆汁中总胆汁酸的总量； (q)胆汁代表性图片；(r)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(s)实时定量PCR 分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂肪酸合成基因、胆汁酸代谢相关的基因和其他通路的基因，亲环素(Cyclophilin)作为内参。

图2.ASGR1敲除策略以及ASGR1对LDLR的影响。(a)小鼠ASGR1 蛋白在各个组织中的分布；(b)Asgr1敲除小鼠的构建策略；(c)脱氧核苷酸琼脂糖凝胶电泳鉴定Asgr1^+/+、Asgr1^+/-、Asgr1^-/-，野生型条带为369bp，纯合小鼠为600bp，若两条带同时出现，则为杂合；(d)对Asgr1^+/+、Asgr1^+/-、Asgr1^-/-三种基因型小鼠取肝组织进行蛋白质免疫印迹分析，甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)作为内参；小鼠与图1中g-s中为同批小鼠；(e)体重；(f)日进食；(g)肝脏与体重的比值；(h)血糖；(i)血清中谷草转氨酶；(j)血清中谷丙转氨酶；(k)胆汁中磷脂；(l)胆汁中胆固醇与磷脂的比值；(m)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA，56小时后，用1×PBS润洗细胞，如图中所示更换新鲜的完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)或者胆固醇缺陷培养基(DMEM+5％去脂蛋白血清+1μM洛伐他汀+10μM甲羟戊酸盐)。16小时后，裂解细胞，蛋白质免疫印迹分析；(n)Huh7细胞转染指定的质粒，32小时后，用1×PBS润洗细胞，如图中所示更换新鲜的完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)或者胆固醇缺陷培养基(DMEM+5％去脂蛋白血清+1μM洛伐他汀+10μM甲羟戊酸盐)。16小时后，裂解细胞，蛋白质免疫印迹分析；(o)Huh7细胞在第0天以2.5×10⁴细胞/ 孔接种在12孔板中，用完全培养基进行培养。第一天转染指定的小干扰RNA。 72小时后，细胞用1×PBS润洗，更换为胆固醇缺陷培养基置于4℃条件下培养 30分钟。随后更换为添加了10μg/ml DiI-LDL的新鲜胆固醇缺陷培养基，置于 4℃培养1小时。接着，用1×PBS润洗细胞2次，细胞置于37℃培养箱中起始内吞，按照指定的时间固定，拍片；(p)内吞的DiI-LDL定量统计，将野生型 Huh7细胞在第0小时内吞的LDL定义为0(每组45个细胞)；(q)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA，细胞培养在完全培养基或者胆固醇曲线培养基中12个小时。随后，细胞在原培养基中添加指定浓度的PCSK9蛋白处理4小时。裂解细胞，进行蛋白质免疫印迹分析。

图3.Asgr1^+/-杂合小鼠的表型，胆固醇外排基因在Asgr1敲除杂合子中高表达。将8周大的Asgr1^+/-小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的2组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食 (60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养4周。杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t 检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本； (b)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成基因、胆汁酸代谢相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参。

图4.ASGR1缺失对代谢综合征的改变依赖于LXRα。所有小鼠均由 Asgr1^+/-Lxrα^+/-小鼠交配而来。将8周大的小鼠随机分成如图所示的4组，每组6 只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养6周。杀小鼠取样前均饥饿4个小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；(c)肝脏与体重的比值；(d)肝脏中苏木精-伊红染色(上) 和油红O染色(下)；(e)血清中总胆固醇；(f)血清中甘油三酯；(g)肝脏中总胆固醇；(h)肝脏中甘油三酯；(i)快速液相色谱(FPLC)分析在野生型和Asgr1 敲除小鼠血清中各脂蛋白组分的分布情况：VLDL：极低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；(j)快速液相色谱分析小鼠血清各中脂蛋白的分布情况；(k)胆汁中总胆固醇的总量；(l)粪便中总胆固醇的总量，每只小鼠连续收集3天的粪便；(m)体重；(n)日进食量；(o)血糖；(p)血清中谷丙转氨酶；(q)血清中谷草转氨酶。

图5.雌性Asgr1^-/-小鼠的表型。将8周大的Asgr1^-/-雌性小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的2组，每组6只。自由饮水和高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐) 喂养4周。杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；(c)体重；(d)肝脏与体重的比值；(e)血清中总胆固醇；(f)血清中甘油三酯；(g)肝脏中总胆固醇；(h)肝脏中甘油三酯；(i)血清中谷丙转氨酶；(j)血清中谷草转氨酶；(k)胆囊的体积；(l)胆汁中总胆固醇的浓度； (m)胆汁中总胆固醇的总量；(n)胆汁中总胆汁酸的浓度；(o)胆汁中总胆汁酸的总量。

图6.ASGR1调控LXRα的降解。(a)Huh7细胞转染指定的质粒，43小时后，将培养基更换为添加或不添加10μM MG132处理5小时。裂解细胞，蛋白质免疫印迹检测；(b)野生型的Huh7和稳定表达ASGR1的细胞(ASGR1 OE- A和-B)置于培养箱中培养43小时。接着更换为添加了10μM MG132的完全培养基处理5个小时。细胞裂解液用LXRα抗体特异性的免疫共沉淀裂解液中的LXRα蛋白。上清和沉淀中分别检测泛素(ubiquitin)、LXRα以及ASGR1；(c) 野生型的Huh7和ASGR1敲除的细胞(ASGR1 KO-A和-B)置于培养箱中培养 43小时。接着更换为添加了10μM MG132的完全培养基处理5个小时。细胞裂解液用LXRα的抗体特异性的免疫共沉淀裂解液中的LXRα蛋白。上清和沉淀中分别检测泛素、LXRα以及ASGR1；(d)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA。 72小时后，收细胞，裂解细胞用于蛋白质免疫共沉淀分析；(e)小鼠的ASGR1 与配体结合复合体的简单示意图。小鼠ASGR1是单次跨膜蛋白，第1-39位的氨基酸位于细胞内，第40-60位氨基酸是跨膜区段，第61-140位氨基酸位茎段，第 141-284位氨基酸是碳水化合物识别区段。其中Q239、D241、W243、E252、N264 与D265这6个氨基酸对于配体结合非常必要；(f)Huh7细胞转染指定的质粒，转染8小时后，用1×PBS润洗细胞，再更换成有10％胎牛血清或者无胎牛血清的新鲜培养基处理40小时，裂解细胞，进行蛋白质免疫印迹分析；(g)Huh7细胞转染指定的质粒，35小时后，细胞用1×磷酸盐缓冲液(PBS)润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加了不同浓度的去唾液酸化酸性蛋白处理8小时。最后收集细胞，裂解用于蛋白质免疫印迹分析；(h)Huh7细胞转染指定的质粒，其中6A突变为Q239、D241、W243、E252、N264和D265全部突变为丙氨酸。转染48小时后，收集、裂解细胞，蛋白质免疫印迹分析；(i)Huh7 细胞转染指定的质粒，35小时后，细胞用1×磷酸盐缓冲液(PBS)润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加了不同浓度的去唾液酸化酸性蛋白处理8小时。最后收集细胞，裂解用于蛋白质免疫印迹分析；(j)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA特异性地敲低网格蛋白重链(CHC)。12小时后，细胞再转染指定的质粒，经过48小时，收集细胞，裂解细胞用于蛋白质免疫共沉淀分析； (k)Huh7细胞转染指定的质粒，46小时以后，更换为添加或者不添加20nM巴弗洛霉素(Bafilomycin)A1的新鲜完全培养基处理2小时，接着收集、裂解细胞，进行蛋白质免疫分析；(l)Huh7细胞转染指定的质粒，43小时以后，更换为添加或者不添加100μM A769662的新鲜完全培养基处理5小时，接着收集、裂解细胞，进行蛋白质免疫分析。

图7.ASGR1-AMPK轴调控LXRα和SREBP蛋白。(a)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA从而特异性地敲低BRCA1和BARD1，12小时后，细胞转染如图中所示的质粒，43小时后，细胞更换为包含有10μM MG132的完全培养基孵育5小时。最后细胞收集、裂解，用抗Myc的磁珠免疫共沉淀。蛋白质免疫印迹进行分析；(b)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA从而特异性地敲低BRCA1和BARD1，12小时后，细胞转染如图中所示的质粒。48小时后，裂解细胞，利用蛋白质免疫印迹进行分析；(c)ASGR1敲除细胞株与野生型细胞株在培养箱中培养48小时，最后裂解细胞用于蛋白质免疫印迹分析；(d)Huh7细胞转染指定的质粒，48小时后，细胞收集，裂解进行免疫印迹分析；(e)Huh7 细胞转染指定的质粒，35小时后，细胞用1×磷酸盐缓冲液(PBS)润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加了不同浓度的去唾液酸化胎球蛋白A处理8小时。最后收集细胞，裂解用于蛋白质免疫印迹分析；(f)Huh7细胞转染指定的质粒，35小时后，细胞用1×PBS润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加或不添加去唾液酸化的胎球蛋白A(1μg/ml)处理3 小时，最后在此基础上添加10μM MG132处理5小时。细胞裂解，蛋白质免疫印迹进行分析；(g)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA从而特异性地敲低BRCA1 和BARD1。60小时后，细胞用1×PBS润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加或不添加去唾液酸化的胎球蛋白A(1μg/ml)处理8小时。收集细胞，裂解用于蛋白质免疫印迹分析；(h)Huh7细胞转染指定的小干扰RNA 从而特异性地敲低CHC。60小时后，细胞用1×PBS润洗一次，更换成MEM培养基孵育6小时。再更换为添加或不添加去唾液酸化的胎球蛋白A(1μg/ml)处理8小时。收集细胞，裂解用于蛋白质免疫印迹分析；(i)野生型Huh7细胞与 ASGR1敲除细胞(ASGR1 KO-A,-B)在培养箱中培养46小时，然后培基中添加20nM巴弗洛霉素A1孵育2小时。收集细胞，裂解进行蛋白质免疫印迹分析；(j)野生型Huh7细胞在培养箱中培养48小时后，用AMPK的激动剂A- 769662按照0、30和100μM的浓度处理5个小时。接着裂解细胞，对蛋白质进行免疫印迹分析；(k)野生型Huh7细胞在培养箱中培养48小时后，用1× PBS润洗一次，更换成无糖的DMEM培养4小时，接着用AMPK的抑制剂 Dorsomophin按照0、3和10μM的浓度处理5个小时。接着裂解细胞，对蛋白质进行免疫印迹分析；(l)ASGR1敲除细胞株(ASGR1 KO-A,-B)和野生型Huh7 细胞和在培养箱中培养48小时后，用1×PBS润洗一次，更换成无糖的DMEM 培养4小时，接着用添加或不添加AMPK的抑制剂Dorsomophin(10μM)处理 5个小时。接着裂解细胞，对蛋白质进行免疫印迹分析；(m)简化的模式图。 ASGR1与去唾液酸糖蛋白结合后，起始内吞，进入到溶酶体中降解。溶酶体释放营养物质激活mTORC1并抑制AMPK的磷酸化。而Asgr1缺失后，则抑制了 mTORC1并激活AMPK。AMPK磷酸化减少了BRCA1/BARD1的蛋白稳定性，进一步增加了LXR的蛋白水平，进而转录激活ABCG5/8以及ABCA1的表达。 ABCA1将胆固醇转运至高密度脂蛋白，而ABCG5/8则帮助胆固醇分泌到胆汁和粪便中。与此同时，AMPK激活还能通过抑制SREBP1的剪切入核从而抑制脂质合成。

图8.AAV shRNA介导的Asgr1沉默增加了胆固醇的外排和改善代谢综合征。将8周大的Balb/c品系的雄性小鼠注射滴度为1×10¹¹个病毒基因组(viral genome,v.g.)的AAV2/8-shAsgr1或者对照AAV2/8-shControl。用高脂/高胆固醇 /胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养 4周，自由饮水喂养4周。杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；(c)血清中总胆固醇；(d)血清中甘油三酯； (e)肝脏中总胆固醇；(f)肝脏中甘油三酯；(g)肝脏切片的苏木精-伊红染色； (h)肝脏切片的油红O染色；(i)胆汁中总胆固醇的总量；(j)胆汁中总胆汁酸的总量；(k)体重；(l)肝脏与体重的比值；(m)血清中谷丙转氨酶；(n)血清中谷草转氨酶。

图9.制备ASGR1中和抗体。(a)制备ASGR1单克隆中和的步骤。纯化的ASGR1蛋白作为抗原免疫兔子，经过第一轮筛选以后，拿到4株B细胞单克隆作为候选。接着对抗体的可变区域的编码区进行测序，并将其构建到抗体表达载体上，转染到哺乳动物细胞中。通过蛋白质免疫印迹和实时定量PCR确认其效果。最后将兔源的Fc片段替换成鼠源的Fc片段。最终选择中和抗体4B9进行大规模生产，并用于后续实验。(b)HEK293T细胞中纯化出的ASGR1蛋白的考马斯亮蓝染色；(c)Huh7细胞与纯化的中和抗体孵育72h，蛋白质免疫印迹分析LXRα的蛋白表达；(d)从8周大的野生型C57B/L6小鼠中分离肝原代细胞。用不同的单克隆中和抗体按照不同的浓度与原代肝细胞孵育72小时，收集细胞，裂解并进行蛋白质免疫印迹分析；(e)从8周大的野生型C57B/L6小鼠中分离肝原代细胞。用ASGR1中和抗体4B9与原代肝细胞孵育72小时，收集细胞，提取细胞内总RNA，利用实时定量PCR分析检测LXR的靶基因；(f)Huh7 细胞转染指定的质粒。转染48小时后，收集细胞，裂解，用蛋白质免疫印迹分析各蛋白的表达。

图10.ASGR1中和抗体增加胆固醇外排，降低血脂和肝脂。将8周大的 Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的4组，每组 6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9。14天后，杀小鼠之前统一饥饿 4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b) 实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸代谢相关的基因，亲环素作为内参；(c)血清中总胆固醇；(d)血清中甘油三酯；(e)肝脏中总胆固醇；(f)肝脏中甘油三酯；(g)胆囊的体积；(h)胆汁中胆固醇的浓度；(i)胆汁中总胆固醇的量；(j)胆囊体积的代表性图片；(k) 粪便中总胆固醇的量；(l)胆汁中总胆汁酸的浓度；(m)胆汁中总胆汁酸的总量； (n)体重；(o)日进食；(p)肝脏与体重的比值；(q)血糖；(r)血清中谷丙转氨酶；(s)血清中谷草转氨酶。

图11.ASGR1中和抗体与阿托伐他汀联用显示出协同降脂的效果。将8 周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的8 组，每组6只。自由饮水，高脂、高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9，每天按照30毫克/千克/天的量灌胃阿托伐他汀。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b)血清中总胆固醇；(c)血清中甘油三酯；(d)肝脏中总胆固醇；(e)肝脏中甘油三酯；(f)胆汁中总胆固醇的量；(g)胆汁中总胆汁酸的总量；(h)粪便中胆固醇的总量；(i)体重；(j)日进食量；(k)肝脏与体重的比值；(l)血糖；(m)血清中谷丙转氨酶； (n)血清中谷草转氨酶；(o-p)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；(q)肝脏切片的苏木精-伊红染色；(r)肝脏切片的油红O染色。

图12.中和抗体4B9与依折麦布协同作用。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的8组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9，每天按照10毫克/千克/天的量灌胃依折麦布。8 天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(a)蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；(b)血清中总胆固醇；(c)血清中甘油三酯；(d)肝脏中总胆固醇；(e)肝脏中甘油三酯；(f)胆汁中总胆固醇的量；(g)胆汁中总胆汁酸的总量；(h)体重；(i)日进食量；(j)肝重/体重；(k)血糖；(l)血清中谷丙转氨酶；(m)血清中谷草转氨酶；(n-o)实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂肪酸合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；(p)肝脏切片的苏木精-伊红染色；(q)肝脏切片的油红O染色。

图13.AAV shRNA介导的Asgr1沉默缓解动脉粥样硬化的形成。将10 周大的Ldlr敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的8组，每组8-16只。自由饮水，饲喂高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)或正常饮食喂养。按照图中所示分组注射滴度为1×10¹¹个病毒基因组(v.g.)的AAV2/8-shAsgr1或者对照AAV2/8- shControl。8周后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。 (a)血清中总胆固醇；(b)血清中总甘油三酯；(c)小鼠血液离心后上清；(d) 体重；(e)肝脏/体重；(f)血糖；(g)主动脉染色；(h)主动脉动脉粥样硬化斑块定量；(i)肝脏切片的苏木精-伊红染色。

具体实施方式

定义

在本发明中，术语“治疗”是指疗法上的以及预防性的措施，其阻止或减缓对象发生不期望的生理学改变或病症，例如脂肪肝的发生或进展。有利或期望的临床效果包括但不限于，症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及疾病的部分或全部治愈，而不论上述效果是否可检测到。“治疗”也可指与不治疗相比生存期延长。需要治疗的对象包括已患有该疾病或病症的对象，以及有可能患有该疾病或病症的对象，或要预防该疾病或病症的对象。

“对象”或“患者”、“个体”是指任何期望进行诊断、预后或治疗的对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物包括人、家畜、农畜、动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文所称的对象优选是人。

在本文中，“抗原结合片段”是指包含相应抗体的特异性识别并结合其抗原的部分的片段，包括但不限于Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv和scFv。在本文中，当描述单克隆抗体时，无论是否明确指出，本发明均意在包括其抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明的药物或药物组合物单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述药物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括当与组合物的活性成分组合时允许该成分保持生物活性并且不会引起与对象的免疫系统的破坏性反应的材料。这些载体可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖配合物或晶体等。“药学上可接受的”是指当施用至人体时不会产生过敏反应或类似的不期望的反应的分子和成分。

ASGR1抑制剂

去唾液酸糖蛋白受体1(Asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)，主要定位肝脏细胞中。ASGR1是单次跨膜蛋白，包括胞质端、跨膜区段、铰链区和碳水化合物结合区。位于血清中的糖蛋白经神经氨酸酶的加工处理后，形成去唾液酸化的糖蛋白，紧接着与位于细胞膜上的ASGR1结合，起始内吞，进入到内体途径，在内体的酸性环境中，受体与配体解离，这些蛋白质被运送至溶酶体中进行降解，而ASGR1则循环至细胞表面再利用。

人源的ASGR1包含291个氨基酸,分子量为33,186Da，氨基酸序列如 SEQ ID NO:1所示(UniProtKB/Swiss-Prot:P07306.2)。ASGR1可与血液中的配体即去唾液酸糖蛋白结合后，通过网格蛋白(Clathrin)介导的内吞，最终进入到溶酶体中进行降解。人ASGR1的胞质端较短(1-40aa)，跨膜区域为40-60aa，胞外区域又分为茎区(62-141aa)和碳水化合物结合区域(142-291，SEQ ID NO: 2)。人源ASGR1基因在NCBI的gene ID为432，编码区序列如SEQID NO:36 所示(NCBI Reference Sequence:NM_001671.5)。

在本文中，“ASGR1抑制剂”是指能降低或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1内吞的物质，以及能降低或阻断ASGR1的编码基因的表达的物质。

在一些实施方案中，本文的ASGR1抑制剂可以包括：(1)与ASGR1结合的抑制剂；(2)与ASGR1的配体(例如去唾液酸糖蛋白)结合的抑制剂；(3) 降低或阻断ASGR1与其配体结合的抑制剂；(4)降低或阻断ASGR1内吞的抑制剂；(5)降低ASGR1的蛋白质水平的抑制剂；(6)降低或阻断ASGR1的蛋白质活性的抑制剂；以及(7)降低或阻断ASGR1的编码基因的表达的抑制剂。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂可以是小分子化合物、靶向 ASGR1的编码基因的核酸、靶向ASGR1的核酸适配体、抗ASGR1抗体或它们的组合。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是ASGR1抗体。在一些实施方案中，所述ASGR1抗体是ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至包含SEQ ID NO:1 所示序列的人ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至ASGR1的碳水化合物结合区域并抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:2的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，ASGR1 的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:3的序列，或实质上由其构成，或由其构成。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、N209、H257、 T259和Y273中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是全人抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是嵌合抗体。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是IgG型，例如IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4型。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是IgG1型。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:4- 6所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:7-9所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10- 12所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:13-15所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16- 18所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22- 24所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:25-27所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35所示的序列。

其他示例性ASGR1单克隆抗体包括在WO 2017058944 A1、WO 2022006327A1或US20210130473 A1中描述的那些抗体，通过引用将其全部公开内容合并至本文中。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向ASGR1的DNA或 mRNA并抑制ASGR1的表达的核酸。

在一些实施方式中，所述核酸选自反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、shRNA 和gRNA。

在一些实施方式中，所述核酸是ASO，所述ASO可以在骨架、糖基或碱基上被修饰，以抵抗体内降解。合适的修饰方式包括，但不限于硫代磷酸化 (PSP)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、2’-O-甲氧基乙基修饰(2’-MOE)、 5-甲基胞嘧啶(5mC)。

在一些实施方式中，所述核酸是siRNA或shRNA，所述siRNA可通过合适的载体被递送。所述合适的载体例如是GalNAc、LNP或AAV。

在一些实施方式中，所述核酸靶向SEQ ID NO:36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

在一些实施方式中，所述核酸是gRNA，所述gRNA与CRISPR/Cas酶 (例如CRISPR/Cas9)构成基因编辑系统，抑制或阻断ASGR1的编码基因的表达。

在ASGR1的编码基因已知的前提下，本领域技术人员可通过常规技术获得并筛选上述核酸的序列。

在一些实施方式中，所述核酸(如ASO、siRNA、shRNA或gRNA)靶向SEQ ID NO:36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

在一些实施方式中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向人ASGR1的核酸适配体(aptamer)。在一些实施方式中，所述核酸适配体结合至人ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体(例如去唾液酸糖蛋白)的结合和/或人ASGR1的内吞。

治疗方法及应用

本发明一方面提供一种促进胆固醇外排的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

本发明另一方面提供一种降低肝脏中总胆固醇水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂。

本发明另一方面提供一种降低肝脏中甘油三酯水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂。

相应地，本发明另一方面提供本文所述的ASGR1抑制剂在制备促进胆固醇外排的药物中的应用。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

相应地，本发明另一方面提供本文所述的ASGR1抑制剂在制备用于降低肝脏中总胆固醇水平的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供本文所述的ASGR1抑制剂在制备用于降低肝脏中甘油三酯水平的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供用于促进胆固醇外排的用途的本文所述的 ASGR1抑制剂。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

相应地，本发明另一方面提供用于降低肝脏中总胆固醇水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂。

相应地，本发明另一方面提供用于降低肝脏中甘油三酯水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂。

本发明另一方面提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂。

相应地，本发明另一方面提供本文所述的ASGR1抑制剂在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 的用途的本文所述的ASGR1抑制剂。

另一个方面，发明人发现，ASGR1抑制剂与降脂药物的联合施用产生显著的协同降脂效果，血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平均显著降低。

因此，在一些实施方式中，本发明提供一种促进胆固醇外排的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低肝脏中总胆固醇水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低肝脏中甘油三酯水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备促进胆固醇外排的药物中的应用。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于降低肝脏中总胆固醇水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于降低肝脏中甘油三酯水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于促进胆固醇外排的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低肝脏中总胆固醇水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低肝脏中甘油三酯水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在一些实施方式中，本发明提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在一些实施方式中，所述对象患有NAFL、NASH、伴随肝纤维化的 NAFLD、伴随肝硬化的NAFLD或伴随肝细胞癌的NAFLD。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低血液中总胆固醇水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备降低血液中总胆固醇水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低血液中总胆固醇水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低血液中甘油三酯水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备降低血液中甘油三酯水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低血液中甘油三酯水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在一些实施方式中，本发明提供预防心血管病例如动脉粥样硬化、心肌梗塞或冠状动脉疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的 ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备预防心血管病的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于预防心血管病的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在上述任一实施方式中，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、 NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。

在上述任一实施方式中，所述第二降脂药可以与所述ASGR1抑制剂同时施用或间隔施用。例如，所述第二降脂药可以在施用所述ASGR1抑制剂之前施用至对象，或者所述第二降脂药可以在施用所述ASGR1抑制剂之后施用至对象。

在一些实施方案中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和帕伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。

在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。

在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的核酸(如siRNA或shRNA)。在一些实施方案中，所述PCSK9抗体是 Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。其他示例性PCSK9抑制剂包括在 WO2017220701A1、WO2012088313A1、WO2009026558A1、WO2009102427A2 或WO2017035340A1中描述的PCSK9抑制剂，通过引用将其全部公开内容合并至本文中。

合适的给药途径包括胃肠外给药(例如肌内、静脉内或皮下给药)及口服给药。其他常规的给药方式包括经气管插管给予、经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、动脉内注射。

由临床医生根据本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的监测指标包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

药物组合物

本发明的一个方面提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂、治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在上述任一方面，所述药物组合物用于促进胆固醇外排。在一些实施方式中，所述促进胆固醇外排包括促进肝脏中总胆固醇外排至胆汁和粪便中。

在上述任一方面，所述药物组合物用于治疗NAFLD。在一些实施方式中，所述NAFLD是NAFL、NASH、伴随肝纤维化的NAFLD、伴随肝硬化的NAFLD 或伴随肝细胞癌的NAFLD。

在上述任一方面，所述药物组合物用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平。在一些实施方式中，所述药物组合物用于降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平。在一些实施方式中，所述药物组合物用于预防心血管病，例如动脉粥样硬化、心肌梗塞或冠状动脉疾病。

本发明的另一个方面提供一种药盒，其包括第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包括治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包括治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在上述任一方面，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。在一些实施方式中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和帕伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是抗PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的核酸(如siRNA或shRNA)。在一些实施方案中，所述PCSK9抗体是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。

为了制备药物组合物或无菌组合物，让药物与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液或混悬剂形式的制剂。药学上可接受的载体是本领域熟知的。本领域已知如何制备包含作为活性组分的水性组合物。通常，这些组合物被制备成注射剂或喷雾剂，例如液态溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射或喷雾之前配制成溶液或悬浮液的固体形式。

序列表

实施例

材料与方法

小鼠

CRISPR/Cas9介导的Asgr1全身敲除小鼠是由成都集萃药康公司构建， sgRNA介导的cas9内切核酸酶在第2与第3个内含子以及第8与第9个内含子之间进行切割。通过同源重组将第3到第8个外显子之间的部分缺失，进而获得全身Asgr1敲除的小鼠。

在实验中，野生型的同窝幼仔作为对照。所有小鼠饲养在SPF(specific pathogenfree)级别的动物房，并保持光照12小时/黑暗12小时，8周大的雄性或者雌性小鼠按照实验中所需的时间喂食高脂高胆固醇胆酸盐饲料(Research Diets,D12109C)进行处理，在抗体中和或者抗体与他汀类药物或依折麦布中，小鼠按照指定的量进行抗体的腹腔注射或者灌胃药物。在杀死之前所有动物都饥饿4个小时。所有动物实验严格遵守国家和武汉大学实验动物福利伦理和保护相关规定。

材料与质粒

Lovastatin(纯度≥98％，HPLC)购自上海Pharm Vally。Sodium mevalonate (#4667)、anti-FLAG M2 beads(#A2220)、anti-MYC beads(E6654)、Fetuin A(SRP6217)、D-Galactose(G5388)、N-acetyl-D-galactosamine(A-2795)、 Phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF,#P7626)、Protease inhibitor cocktail (#P8340)和β-mercaptoethanol(#M3148)均购自Sigma。Dil(1,1-dioctadecyl- 3,3,3,3-tetramethyl-indocarbocyanineperchlorate)-LDL(#20614ES76)购自上海翊圣。Lipofectamine RNAiMAX(#13778150)购自Theromo Fisher。MG132(#I- 130)购自Boston Biochem。Puromycin(#BS111)购自Biosharp。G418(#345810)、 Pepstatin A(#516481)和ALLN(N-acetyl-leu-leu-norleucinal,#208719)购自 Calbiochem。Ni-NTA Agarose(#30230)购自Qiagen。LPEI(Linear polyethylenimine,#23966-1)购自Polysciences。FuGENE HD(#E2311)和M- MLVRTase(#M1701)购自Promega。Leupeptin(#11034626001)购自Roche。 DTT(DL-Dithiothreitol,#A100281)和NP-40(A100109)购自上海生工。磷酸酶抑制剂(P1082)购自碧云天。培养细胞所用的培养基，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自lifeTechnology。Taq酶购自天根。KOD Hot Start DNA polymerase (#KOD-401；TOYOBO)购自Takara；RNA duplex由广州锐博公司合成，Q-PCR 2×MIX购自Mona。总胆固醇(TC)试剂盒、总甘油三酯(TG)试剂盒、胆汁酸试剂盒均购自南京科华生物公司。NEFA kit(294-63601)、Phospholipid kit (292-63901)均购自WAKO。ALT、AST、AKP试剂盒均购自南京建成生物公司。血糖试纸、血糖仪均购自稳豪。Lipoprotein-deficient serum(d>1.215g/mL)，即LPPS均是通过超速离心从新生小牛血清中制备。

通过标准的分子克隆技术构建了以下质粒:

人源和鼠源的Asgr1、Asgr2、Lxrα、Lxrβ基因片段分别来源于Huh7和小鼠肝脏组织的RNA逆转录形成的cDNA，人源的BARD1基因片从Huh7中扩增所得，分别克隆进p3×Flag-CMV14、pEGFP-C1和pcDNA3-C-5×Myc载体。 pDEST-FRT/T0-GFP-BRCA1(#71116)购自Addgene。通过点突变的方法构建 ASGR1的各种截短体和点突变。

Huh7和HEK293T细胞在37℃和5％CO₂的环境中单层生长。细胞都维持在培养基A(含有100units/mL青霉素和100mg/mL硫酸链霉素的DMEM) 中，并补充10％胎牛血清(FBS)，胆固醇缺陷培养基B由培养基A补充了5％的去脂蛋白血清(LPPS)、1μM洛伐他汀和10μM甲羟戊酸得到。原代小鼠肝细胞培养用培养基D(M199)补充5％FBS、100units/mL青霉素和100mg/mL 硫酸链霉素。

免疫印迹

将收集的细胞或者组织用添加了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液中进行裂解。RIPA裂解缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH＝8.0)、150 mM NaCl、2mM MgCl₂、1.5％NP-40,0.1％SDS和0.5％脱氧胆酸钠。蛋白酶抑制剂包含10μM MG-132、10μg/ml亮肽素(Leupeptin)、1mM PMSF、5μg/ml 的胃酶抑素(pepstatin)、25μg/ml ALLN、1mM DTT。使用BCA方法(Thermo Fisher Scientific)确定裂解物的蛋白质浓度。将蛋白样品与膜溶解缓冲液(62.5 mM Tris-HCl(pH＝6.8)，15％SDS，8M尿素，10％甘油和100mM DTT)和4×上样缓冲液(150mM Tris-HCl(pH＝6.8)，12％SDS，30％甘油，6％2-巯基乙醇和0.02％溴酚蓝)在37℃孵育30分钟。将蛋白样品用SDS-PAGE凝胶分离后再转移到PVDF膜上，用含有0.075％Tween 20及5％脱脂牛奶(针对磷酸化实验用3％BSA)的TBS，即TBST封闭1小时。并在4℃下用指定的一抗孵育过夜，随后用TBST清洗3次。最后用Pierce ECL Plus蛋白质印迹底物(Thermo Fisher Scientific)进行检测。

实验中使用的一抗

Anti-β-actin(#A5441)和anti-FLAG(#F3165)均购自Sigma。anti-AMPK (10929-2-AP)、anti-ACC(67373-I-Ig)、anti-FASN(10624-2-AP)、anti-GAPDH (60004-1-Ig)、anti-ASGR1(11739-1-AP)购自ProteinTech。Anti-CYP7A1(sc- 518007)、anti-SREBP1(sc-13551)和anti-BRCA1(sc-6954)购自Santa Cruz。 anti-c-Myc和anti-HMGCR分别从杂交瘤细胞株(ATCC)9E10以及A9制备纯化。anti-LDLR、anti-H2(HMGCR)通过选取可溶性区段，免疫兔获得抗血清和亲和纯化后的抗体。anti-EGFP是通过大肠杆菌表达纯化EGFP蛋白，免疫兔获得。anti-LXRα(ab41902)购自Abcam。anti-LXRβ(NB100-74457)、anti- ABCG8(NBP1-71706F)、anti-ABCA1(NB400-105)购自Novus。anti-BARD1 (A300-263A)购自Bethy。Anti-phos ACC(118187)和anti phos-AMPK(#2535) 购自Cell signaling Tech。二抗购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

泛素化实验

细胞用预先预冷的1xPBS缓冲液洗两次，接着用预冷的裂解缓冲液(添加0.5％毛地黄皂苷(digitonin)、5mM EGTA、5mM EDTA、蛋白酶抑制剂(除 DTT和PMSF)和磷酸酶抑制剂于1xPBS中)裂解细胞，4℃离心机13400rpm 离心10分钟后，弃去沉淀，取60μl上清作为全细胞裂解液对照(Input组分)，将剩余上清与30μl anti-Myc的磁珠混匀，4℃旋转孵育4小时，1000g 3分钟离心后取60μl上清作为上清对照(Supernatant组分)，然后弃去上清，使用裂解缓冲液重复洗3次，每次10分钟并不断旋转混匀。最后收集沉淀，加入100μl 膜溶解缓冲液于37℃金属浴孵育30分钟，接着13400rpm离心2分钟，吸取90 μl离心后上清，与2×上样缓冲液(4×上样缓冲液组分中去除2-巯基乙醇后与SDS 裂解缓冲液按照1:1混匀)1:1混匀。标记为pellet组分。然后各组分经过Western blot检测。

血液与肝脏化学分析

眼球采血获得血清检测总胆固醇和甘油三酯。将肝脏匀浆，收集上清用于脂质提取以获得肝脏总胆固醇，并根据说明书确定肝脏甘油三酯、总胆固醇 (Kehua,China)水平。用试剂盒(Phospholipid,WAKO,Japan)测定磷脂水平。检测血清中ALT、AST水平用的是南京建成的试剂盒(China)。

结果与分析

实施例1：ASGR1缺失后增加LXRα，促进胆固醇外排，减少肝脏和血液的脂质水平。

为了探讨ASGR1缺失是如何影响脂质代谢的，我们在人的肝癌细胞 Huh7中利用小干扰RNA特异性地介导ASGR1敲低，抽提RNA进行真核生物转录组测序，接着用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)进行分析。结果显示LXR通路被显著激活(图1a)，实时定量PCR也证实了这一点 (图1b)。而无论是用siRNA介导的ASGR1敲低细胞(图1c)还是ASGR1敲除细胞中(图1d)中。LXR蛋白水平都显著性上调。而在ASGR1稳定表达的细胞中，LXR的蛋白水平以及LXR下游的靶基因都显著性降低(图1e,f)。此外，我们还发现在Huh7细胞中，无论是利用小干扰RNA特异性地介导ASGR1敲低，还是共同表达ASGR1和LDLR的质粒，均不影响LDLR的蛋白稳定性(图 2m-n)，并且也不影响DiL标记的低密度脂蛋白的内吞(图2o-p)，也不能拮抗 PCSK9诱导的LDLR降解(图2q)。

为更深层次地了解ASGR1对血脂是否存在调控作用，首先我们通过摘取小鼠的各个组织，检测ASGR1在小鼠中的各个组织中的表达水平(图2a)，发现ASGR1主要在小鼠的肝脏中表达。基于此组织表达谱，我们通过 CRISPR/Cas9技术构建了ASGR1全身敲除的小鼠(图2b-d)。选取8周大的同窝生小鼠，按基因型随机分配为3组，用高脂高胆固醇胆酸盐饲料喂养了4周，检测小鼠的代谢表型。结果显示：无论是在雄性还是雌性Asgr1敲除小鼠中，都不影响小鼠体重、日进食、肝脏与体重的比值、血糖和谷草转氨酶以及谷丙转氨酶(图2e-j，图5c-d和图5i-j)，而显著性地降低血液中的总胆固醇和甘油三脂 (图1g-h，图5e-f)；肝脏中的总胆固醇和甘油三酯也显著下降(图1i-j，图5g- h)，肝脏切片的苏木精-伊红染色(左)和油红O染色(右)也显示肝脏中的脂质堆积得到了极大的缓解(图1k)。另外，我们还发现在Asgr1敲除小鼠中，胆囊的体积显著性增加(图1l，图5k)，胆汁中总胆固醇的浓度与总量显著上升(图 1m,1o，图5l-5m)，胆汁中总胆汁酸的浓度和总量同样显著增加(图1n,1p，图 5n-5o)，胆汁中的磷脂上升(图2k)，胆汁胆固醇与磷脂的比值无变化(图2l)。而将肝脏组织匀浆后进行蛋白质免疫印迹分析，发现与前期结果显示一致：LXR 的蛋白水平显著增加，与胆固醇外排相关的蛋白如ABCG8、ABCA1、CYP7A1 显著上升，而包括SREBP1、FASN等与脂质合成相关的蛋白质显著减少，而与胆固醇吸收相关的蛋白质LDLR无变化(图1r，图3a，图5a)，实时定量PCR 也显示与蛋白水平变化一致的结果(图1s，图3b，图5b)。综上所述，ASGR1 缺失对高脂高胆固醇胆酸盐饲料条件下诱导的小鼠的代谢紊乱起到了保护作用。

实施例2：ASGR1敲除改善高脂高胆固醇饮食诱导的代谢综合征依赖于 LXR。

在前期的实验结果中，我们检测到在ASGR1敲除情况下，LXR的蛋白水平显著上升，其下游的靶基因显著性上调，且能够显著性地改善高脂高胆固醇诱导出的代谢表型。但ASGR1对代谢综合征的改善效果是否是通过LXR实现的？为了解决这一疑问，我们通过交配Asgr1^-/-与Lxrα^-/-构建Asgr1^-/-Lxrα^-/-小鼠。选取8W大的Asgr1^-/-(Asgr1 KO)小鼠与同窝生的野生型Asgr1^+/+(WT)、Lxrα^-/-小鼠(LxrαKO)以及Asgr1^-/-Lxrα^-/-(DKO)每组6只，高脂高胆固醇胆酸盐饲料(60％脂肪+1.25％胆固醇+0.5％胆酸盐，HF/HC/BS饮食)饲喂4周后，取小鼠组织检测各个指标。实验结果显示：在Lxrα缺失的背景下，Asgr1缺失对下游的ABCG8、ABCA1、CYP7A1的增加效果以及对SREBP1c和FASN的减少效果都不复存在(图4a)，而实时定量PCR也与蛋白质免疫印迹分析的结果一致，LxrαKO组和DKO组之间差异消失(图4b)。

而对生化指标进行分析，结果显示：小鼠的体重、日进食量、血糖、ALT、 AST、肝脏与体重的比值无显著性区别(图4c,m-q)。与对照组(LxrαKO)相比，DKO小鼠的血液中的总胆固醇和甘油三酯(图4e,f)并未显示出类似于Asgr1 KO组vs WT组中出现血脂降低的效果；而且通过FPLC显示的脂蛋白的分布发现：Asgr1 KO组与WT组比较，显示出VLDL和LDL明显较少，而HDL显著上上升。但在此基础上缺失Lxrα，即比较DKO组与LxrαKO组，发现Lxrα缺失虽然会导致血液中胆固醇处于极高的水平，但ASGR1缺失对血液中脂蛋白分布的影响已经几乎没有了(图4i-j)；Asgr1单独KO对肝脏脂质堆积的缓解效果也不存在了，肝脏的组织切片H&E染色和油红O染色都印证了这一结论(图 4d)。另一方面，胆汁总胆固醇总量在Asgr1 KO组中呈现出显著性上升，而在此基础上若再敲除Lxrα则上升的效果则消失了(图4k)。此外，我们同时检测了粪便中的胆固醇，单看WT组与Asgr1 KO组，发现粪便中的总胆固醇出现了明显增加，提示减少的胆固醇一部分外排到了粪便中。而在LxrαKO的背景下再敲除Asgr1，即DKO小鼠，这些效果都不复存在(图4l)。

综上所述，ASGR1缺失确实是通过LXRα从而实现对改善高脂高胆固醇诱导的代谢综合征，因而一旦LXR缺失了，ASGR1对血脂的调控作用完全消失。

实施例3：去唾液酸糖蛋白-ASGR1-AMPK轴调控LXRα和SREBP。

前期结果证实了ASGR1可以通过泛素化调控LXRα的蛋白水平(图6a- c)，那么是否存在E3泛素连接酶介导了ASGR1对LXRα蛋白降解的？据报道，目前发现BARD1/BRCA1是介导LXRα降解的唯一E3泛素连接酶。BRCA1 (Breast and ovarian cancer susceptibility1)，是一个已知的抑癌基因，与DNA损伤修复有关，与BARD1(BRCA1-associated RINGdomain 1)组成稳定的异源二聚体调控细胞对DNA损伤的响应，也有研究报道该二聚体在转录调控、细胞周期和抑制性染色体的减数分裂中发挥重要作用。BRCA1和BARD1包含一个RING结构域(可用于介导DNA-蛋白结合或者蛋白-蛋白结合),在N端包含核输出信号(NES)和两个串联的BRCA1羧基末端(BRCT，也与蛋白-蛋白结合有关)区域。BRCA1和BARD1 N末端特有的RING区域，使得它们各自都可以作为E3发挥较弱的作用，而一旦两者通过RING结构域形成异源二聚体，两者得蛋白稳定性增加，响应的其E3活性显著增强，这可能是由于它们单独存在是不稳定的，而增强的E3活性在BRCA1第61位和第64位半胱氨酸(C61G， C64G)突变后会减弱，癌症抑制功能也变弱，但不影响两者的结合。

那么，BRCA1/BARD1是否作为E3复合体在ASGR1调控LXRα蛋白降解中发挥作用呢？因此，在图7a中，我们设计了特异性靶向BRCA1和BARD1 的siRNA，观察在该复合体敲低的条件下，ASGR1是否仍然对LXRα存在泛素化作用。如图7a所示，在正常情况下，ASGR1能显著增加LXR的泛素化(泳道1-3)，而当BRCA1和BARD1被敲低时，LXRα的泛素化明显降低(泳道4-6)。一致地，与对照组相比，BRCA1和BARD1缺失后，ASGR1则对LXR的降解作用也几乎消失(图7b)。下一步，我们想知道，ASGR1与BRCA1和BARD1 之间存在着何种联系？我们首先检测ASGR1缺失是否影响BRCA1和BARD1 的转录水平和蛋白水平。实验结果显示，无论是siRNA介导的ASGR1敲低(图6d)还是CRISPR/Cas9介导的ASGR1 KO(图7c)，与对照组相比，BRCA1和BARD1的蛋白水平都明显减少。而相反地，在Huh7细胞中共表达ASGR1、BRCA1和BARD1，也发现ASGR1可稳定BRCA1和BARD1蛋白(图7d)。

鼠源ASGR1结构如图6e所示。其中，第241位、第265位的Asp、第 264位Asn、第252位Glu、第239位Gln和第243位Trp参与形成配体结合的活性位点。

为进一步了解ASGR1与配体结合的功能是否参与ASGR1对LXRα的调控。我们通过分析发现，胎牛血清(FBS)中存在大量ASGR1的配体，因此设计如图6f所示的实验，结果显示：在有配体存在的情况下，与对照组即完全培养基相比，ASGR1都可促进LXRα的降解，而一旦配体消失后，ASGR1对LXRα的降解消失。而ASGR1的配体，无论是去唾液酸化胎球蛋白A(Asialofetuin A, AF)还是去唾液酸化酸性蛋白(Asialoorosomocoid,ASOR)，都能介导ASGR1对 LXRα的降解(图7e,图6g)。更进一步，研究报道ASGR1第241位、第265位的Asp、第264位Asn、第252位Glu、第239位Gln和第243位Trp参与形成配体结合的活性位点。因此，我们将这6个氨基酸突变为丙氨酸(Alanine,A) 后，即文中提到的ASGR1(6A)，再检测其是否还能响应配体诱导的LXRα的降解。如图6h所示：在ASGR1的配体结合位点突变(ASGR1(6A))后，与野生型 ASGR1相比，其对LXRα的降解作用几乎消失。同样的，在图6i中，当仅有配体，没有ASGR1时，LXRα几乎不存在降解作用，而在野生型ASGR1和配体同时存在时，ASGR1对LXRα的降解呈现出剂量依赖效果，而即使有配体存在，而ASGR1的配体结合位点突变后，ASGR1也不能发挥降解功能。且去唾液酸化的胎球蛋白A可显著性地促进ASGR1对LXRα的泛素化(图7f)。

前期实验结果中我们证实了BRCA1和BARD1介导ASGR1对LXRα的降解(图7a,b)，进一步我们探索BRCA1和BARD1是否在配体诱导的ASGR1 对LXRα的降解中是否发挥着关键作用。如图7g所示，配体与ASGR1结合后，可稳定BRCA1和BARD1的蛋白水平，从而诱导LXRα的降解，而与对照组(泳道1-2)相比，无论是单独将ASGR1敲低或将BRCA1和BARD1敲低，即使在有配体存在的条件下，LXRα都不再降解。说明BRCA1和BARD1在配体诱导的ASGR1对LXRα的降解过程中至关重要。

ASGR1与配体即去唾液酸糖蛋白结合后，通过网格蛋白介导的内吞，最终进入到溶酶体中进行降解。因而，我们猜测阻断内吞是否影响ASGR1对LXRα的降解。利用指定的小干扰RNA与质粒转染Huh7细胞，我们发现在特异性地敲低CHC后，ASGR1对LXRα的降解效果几乎消失了(图6j)。且CHC敲低后，ASGR1与配体结合后的引起下游的蛋白变化几乎消失(图7h)。

据已有的文献报道，溶酶体降解蛋白所释放的营养物质包括糖和氨基酸激活mTORC1，抑制AMPK。mTORC1激活SREBP增加脂质合成，相反AMPK 能直接磷酸化SREBP1，抑制其剪切入核。且AMPK激活后能显著降低BRCA1 的表达。那么AMPK是否参与了ASGR1对LXRα的降解？为验证这一猜想，我们首先用巴弗洛霉素A1抑制溶酶体中蛋白质的降解，发现巴弗洛霉素A1处理后，与对照组相比，ASGR1对LXRα的降解效果几乎消失了，而ASGR1缺失对LXRα的稳定效果也消失了(图6k,图7i)。进一步用AMPK的激动剂A- 769662处理后，与对照组相比，ASGR1对LXRα的降解效果消失了(图6l)。并且，实验结果显示：用A-769662剂量依赖性地处理野生型的Huh7细胞，发现 LXRα、p-ACC的蛋白水平显著上升，而p-S6K、BRCA1、BARD1、SREBP1/2 显著性地减少(图7j)。反之，用Dorsomophin(AMPK抑制剂)处理野生型的 Huh7细胞后，结果则与激动剂相反(图7k)。在ASGR1特异性敲除的细胞(ASGR1 KO-A,B)中，ASGR1缺失引起的LXRα、p-ACC的蛋白水平上升，p-S6K、 BRCA1、BARD1、SREBP1/2显著减少这些效果在使用Dorsomophin处理后则消失了(图7l)。

综上所述，以上的结果显示：ASGR1与去唾液酸糖蛋白结合后，通过CHC 介导的内吞进入到溶酶体中，在溶酶体中酸性酶的作用下释放出营养物质，激活 mTORC1，抑制AMPK；一方面激活了SREBP1从而增加了脂质合成，而另一方面，BRCA1/BARD1的蛋白表达增加促进了LXRα的降解，从而减少了胆固醇的外排。相反，ASGR1突变或者被抑制后，配体的内吞和降解被阻断，抑制了 mTORC1，激活了AMPK，AMPK磷酸化抑制了SREBP1c的剪切入核，减少了BRCA1/BARD1的蛋白稳定性，由此增加了LXRα的蛋白水平，通过激活ABCA1、 ABCG5/8、CYP7A1从而促进胆固醇外排，而不增加脂质合成(图7m)。

实施例4：AAV-shRNA介导的ASGR1敲低促进了胆固醇的外排、降低了肝脏和血液中的脂质水平。

RNAi是一种有效的治疗手段。由于ASGR1选择性地表达在肝脏中，因此我们使用腺相关病毒(AAV)血清型2/8特异性地敲低肝脏中的Asgr1。实验结果显示，AAV-shAsgr1特异性地敲低Asgr1后，结果与Asgr1敲除小鼠一致，与胆固醇外排相关的蛋白显著增加，如LXRα、LXRβ、ABCG8、ABCA1、CYP7A1，而脂质合成的蛋白FASN显著下降，而胆固醇合成或吸收的蛋白HMGCR和 LDLR无明显变化(图8a)。实时定量PCR也与蛋白表达结果一致(图8b)。生化指标显示：血清中的总胆固醇、甘油三酯、肝脏中的总胆固醇、甘油三酯显著下降(图8c-f)，且无论是肝脏的苏木精-伊红染色还是油红O染色都显示肝脏中脂质堆积极大程度的得到缓解(图8g-h)。而胆汁中总胆固醇的总量和胆汁中总胆汁酸的总量同样显著增加(图8i-j)，而体重、肝脏与体重的比值、谷丙转氨酶和谷草转氨酶几乎无变化(图8k-n)。

实施例5：ASGR1中和抗体4B9促使胆固醇外排至胆汁和粪便，显示出降脂治疗效果。

ASGR1可与大量的去唾液酸化的糖蛋白结合，为了更好地模拟Asgr1敲除对高脂高胆固醇诱导的代谢综合征的改善作用，我们从HEK293T细胞中纯化出ASGR1蛋白免疫兔子，以取得阻断ASGR1功能的中和抗体。具体流程如图 9a所示：制备ASGR1单克隆中和的步骤。纯化的ASGR1蛋白作为抗原免疫兔子，经过第一轮筛选以后，拿到4株B细胞单克隆作为候选。接着对抗体的可变区域的编码区进行测序，并将其构建到抗体表达载体上，转染到哺乳动物细胞中纯化蛋白。通过蛋白质免疫印迹和实时定量PCR确认其效果，最后将兔源的Fc片段替换成鼠源的Fc片段。最终选择效果最好的中和抗体4B9进行大规模生产，并用于后续实验。实验结果验证了4B9具有潜在的降血脂效果。4B9以及其他3株ASGR1单克隆中和抗体都能显著性增加ASGR1的蛋白稳定性(图9c, 9d)，且胆固醇外排的基因也显著上调(图9e)。更细一步，我们将ASGR1不同截短体质粒转染，检测4B9识别的区段，发现4B9主要识别第182-274aa之间的序列(图9f)。

进一步，我们检测了4B9是否能完全模拟Asgr1缺失对高脂高胆固醇的改善。选取8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图10所示的4组，每组6只。自由饮水、高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS) 饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐)喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。实验结果，在注射4B9抗体后的野生型小鼠显示出与Asgr1缺失一致的结果，即胆固醇外排相关的蛋白，如LXR、ABCG8、ABCA1、 CYP7A1显著上升,而p-ACC同样显著上调，而脂质合成相关的蛋白SREBP1 以及FASN显著减少，LDLR不受影响。BARD1显著下降；且在Asgr1敲除的小鼠中注射或不注射4B9都无影响，说明4B9是特异性地靶向ASGR1(图10a)。实时定量PCR也显示出与蛋白水平变化一致的结果(图10b)。生化指标显示：注射4B9抗体后的小鼠与对照组相比，血清中的总胆固醇与甘油三酯显著性下降(图10c,d)，肝脏中的总胆固醇与甘油三酯显著下降(图10e,f)，胆囊的体积显著增加(图10g,j),胆汁总胆固醇的浓度以及总量显著增加(图10h,i,j)，粪便中的总胆固醇显著增加(图10k),胆汁中总胆汁酸的浓度以及总量显著性增加(图10l,m)。而体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖、谷丙转氨酶与谷草转氨酶无显著性的变化(图10n-s)。综合以上的结果，ASGR1中和抗体4B9 显示出非常显著的降脂效果，能极大地缓解高脂高胆固醇饲料诱导的代谢综合征。

实施例6：抗体4B9与阿托伐他汀联用显示出协同降脂效果。

他汀类药物，通常用于减少LDL-c，是用来降低胆固醇的一线药物。目前由FDA批准上市的他汀类药物主要包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和帕伐他汀，而其中又以阿托伐他汀和瑞舒伐他汀使用最为广泛。然而也有相关研究发现，长期使用他汀类药物会使患者出现他汀抵抗，产生肝脏毒害作用，另外一部分患者他汀不耐受，产生副作用：如肌无力、横纹肌溶解、糖尿病等；另外他汀在水中的溶解性差，机体的利用率不高也在一定程度上限制了其使用。4B9在前期的实验结果中被证明能显著地改善高脂高胆固醇饲料诱导的代谢综合征表型(图10)。进一步，我们想检测4B9与阿托伐他汀联用是否存在协同降脂效果。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图11所示的8组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐(HF/HC/BS)饮食(60％脂肪、1.25％的胆固醇和0.5％的胆酸盐) 喂养。

同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或 ASGR1中和抗体4B9，每天按照30毫克/千克/天的量灌胃阿托伐他汀。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。实验结果显示，4B9单独使用时仍然表现出增加胆固醇外排相关的基因及其蛋白水平，抑制脂质合成相关的基因及其蛋白水平，不影响胆固醇合成或者吸收的相关基因或及其蛋白水平，而阿托伐他汀与4B9联用不影响4B9促进胆固醇外排相关基因及蛋白如LXRs、ABCG8、ABCA1、 CYP7A1的表达效果，而能够更显著地抑制脂质合成相关基因及其蛋白的表达，如SREBP1、FASN(图11a,11o-p)。在单独使用4B9或者阿托伐他汀时，都能有效地降低血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平，而当联合使用4B9和阿托伐他汀后，呈现出更显著的降脂效果(图11b-e,图11q-r)，4B9单独使用可增加胆汁中总胆固醇和总胆汁酸的总量，而阿托伐他汀使用几乎不影响胆汁中的总胆固醇和总胆汁酸(图11f,g)。4B9单独使用时可显著增加粪便中总胆固醇的外排，而阿托伐他汀对粪便中胆固醇无影响(图11h)。而无论是4B9还是阿托伐他汀单独使用还是联合使用，8组之间小鼠的体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶都无显著性影响(图11i-n)。综上所述， 4B9与阿托伐他汀联用可比单独使用两者时取得更好的降脂效果。

实施例7：抗体4B9与依折麦布联用显示出协同降脂效果。

依折麦布(EZ)是一种降脂药，其主要功能是抑制NPC1L1介导的小肠刷状缘从饮食和胆汁中吸收胆固醇，但不影响其他脂溶性营养物质的吸收，主要用于治疗家族性高胆固醇血症。EZ处理后减少肝脏中脂质的堆积，减少血液中总胆固醇，甘油三酯和LDL-c，同时增加HDL-c。对于脂溶性的维生素如维生素 A、维生素D和维生素E无显著影响。4B9在小鼠上已被证实具有一定降脂作用 (图10)，因此，4B9与EZ的联用是否会更大程度上增加降脂作用呢？于是，我们设计了如图12的实验来验证该猜想。小鼠按照基因型随机分成8组(n＝6)，饲喂HF/HC/BS饲料，EZ每天按照10mg/kg灌胃，4B9(10mg/kg)隔天腹腔注射一次，第7天收小鼠，取小鼠组织。结果显示：4B9单独使用时仍然表现出增加胆固醇外排相关的基因及其蛋白水平如LXRs、ABCG8、ABCA1、CYP7A1，抑制脂质合成相关的基因及其蛋白水平，如SREBP1、FASN，不影响胆固醇合成或者吸收的相关基因或及其蛋白水平，而单独使用依折麦布或与4B9连用时，胆固醇外排相关的基因及其蛋白质，脂质合成相关的基因及其蛋白质欧显著下降 (图12a,12n,o)。在单独使用4B9或者依折麦布时，都能有效地降低血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平，而当联合使用4B9和依折麦布后，呈现出更显著的降脂效果(图12b-e，图12p-q)，4B9单独使用可增加胆汁中总胆固醇和总胆汁酸的总量，而无论是依折麦布单独使用还是与4B9联用都显著抑制了胆汁总胆固醇和总胆汁酸的总量(图12f,g)。而无论是4B9还是依折麦布单独使用还是联合使用，8组之间小鼠的体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶都无显著性影响(图12h-m)。综上所述，4B9与依折麦布联用可比单独使用两者时取得更好的降脂效果。

实施例8：Asgr1敲低改善动脉粥样硬化。

冠状动脉疾病(CAD)是最主要的心血管疾病(CVD)之一。CAD的发生主要是由于动脉粥样硬化导致的冠状动脉的闭合，当动脉壁的内皮细胞功能损坏时，脂蛋白颗粒大量积累在动脉血管的内膜处。高浓度的LDL能渗透被损坏的内皮细胞，形成氧化性的低密度脂蛋白(ox-LDL)，而ox-LDL会吸引大量的白细胞至冠状动脉的内膜处，巨噬细胞紧接着发挥清除作用，形成泡沫细胞，大量的泡沫细胞复制，最终形成损伤，导致了脂纹的出现,最早期的损伤则被视为动脉粥样硬化。大量损伤的出现释放出“求救”信号，招募平滑肌细胞(SMCs)到脂纹出现的区域进行“救援”，SMCs开始迅速增殖，产生胞外基质(主要是胶原和蛋白多糖)，动脉粥样硬化斑块开始形成并且积累大量由SMCs产生的胞外基质，使损伤最终转化为纤维化的斑块。纤维化的斑块不断累积在冠状血管内，使血管逐渐变窄，最终斑块钙化。

当利用腺相关病毒(AAV)血清型2/8介导的Asgr1的敲低，能够显著性地降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量以及肝脏中脂质的堆积(图13a-c,13i)，体重以及肝重与体重的比值、血糖无显著性变化(图13d-f)，而主动脉显色结果证明Asgr1缺失后能显著减少动脉粥样硬化斑块的形成(图13g-h)。综上所述，抑制Asgr1的表达可显著减少动脉粥样硬化斑块的堆积。

机体维持胆固醇的动态平衡主要通过协调胆固醇的合成、吸收以及外排三个过程。我们通过小干扰RNA特异性地靶向ASGR1，进行真核生物的转录组测序，经过GSEA分析发现LXR通路相关的基因被显著富集，并通过一系列生化实验，动物实验分析验证得出ASGR1对脂质水平的影响主要是通过对LXR 的蛋白水平的调控来实现，而BRCA1/BARD1作为泛素化连接酶参与了ASGR1 对LXR的降解。

mTORC1是营养传感器和能量存储的中枢。我们的研究表明，ASGR1与血液中的配体去唾液酸糖蛋白结合，通过网格蛋白介导的进入到溶酶体内进行降解，从而激活mTORC1-AMPK信号通路，以稳定BRCA1/BARD1的蛋白水平，从而降解LXR，从而抑制胆固醇的外排。而ASGR1敲除或者中和抗体抑制其功能后，则可阻断该信号通路，从而促进胆固醇的外排。可在肝脏中特异性地激活 AMPK。首先，由于LXR蛋白的稳定性增加，可显著促进胆固醇外排进入胆囊和粪便中；其次，由于AMPK的激活，抑制了SREBP1c的剪切入核，从而抑制了脂质合成相关基因的激活，从而极大的缓解了肝脏中脂质的堆积，减轻了脂肪肝。

综上，本发明通过研究去唾液酸糖蛋白与ASGR1结合，从而激活 mTORC1-AMPK-BRCA1/BARD1通路，最终调节LXR的蛋白稳定性，从而在脂质代谢中发挥重要作用，进而提供了ASGR1缺失在改善代谢综合征如缓解 NAFLD及降低血脂与肝脂的治疗靶点的新用途。

应该理解的是，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方式的代表和示例性的，并且不旨在作为对本发明范围的限制。

序列表

<110> 武汉大学

<120> ASGR1抑制剂在促进胆固醇外排和治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用

<130> 192580-21D-CNP

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 1

Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser

1 5 10 15

Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu

20 25 30

Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser

50 55 60

Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe

65 70 75 80

Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly

85 90 95

Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln

100 105 110

Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys

115 120 125

Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu

130 135 140

Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu

145 150 155 160

His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala

165 170 175

Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val

180 185 190

Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val

195 200 205

Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val

210 215 220

Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln

225 230 235 240

Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala

245 250 255

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260 265 270

Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro

275 280 285

Pro Leu Leu

290

<210> 2

<211> 150

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 2

Ala Ala Leu Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn

1 5 10 15

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 3

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1 5 10 15

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<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-LCDR1

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1 5

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<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

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<400> 5

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1

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<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

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<400> 6

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1

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<220>

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1 5 10 15

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<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-HCDR1

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<220>

<223> 3E8-HCDR2

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<210> 15

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<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-HCDR3

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Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Tyr Tyr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-HCDR2

<400> 20

Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-HCDR3

<400> 21

Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gly Tyr Val Tyr Tyr Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Leu

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR1

<400> 22

Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR2

<400> 23

Asp Ala Ser

1

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR3

<400> 24

Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Asn Asn Leu Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR1

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR2

<400> 26

Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR3

<400> 27

Ala Arg Gly Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Leu

1 5 10

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-VL

<400> 28

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys

20 25 30

Asn Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Lys Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser

85 90 95

Ser Ala Asp Cys Cys Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 127

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-VH

<400> 29

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Thr

1 5 10 15

Met Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser Leu

20 25 30

Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Tyr Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Tyr Pro Ala Gly Ser Phe

100 105 110

Val Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8¬-VL

<400> 30

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Lys Ile Ser Asn Glu

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Gly Ser Ser Asn

85 90 95

Ile Val Asn Tyr Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8¬-VH

<400> 31

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Val Ser Ser Gly Ala Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ser Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Asn

85 90 95

Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-VL

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ile Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Gly Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 127

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-VH

<400> 33

Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

50 55 60

Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Ser Thr Thr Val

65 70 75 80

Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gly Tyr Val Tyr Tyr Gly Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-VL

<400> 34

Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Asn Asn

85 90 95

Leu Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 115

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-VH

<400> 35

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp

85 90 95

Asp Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 1310

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1-mRNA

<400> 36

acacagacac gcagacacag agacaccggg gcccagggcc ctcctatgga ccctgcccgc 60

tcccctccca ttgtccacgg ctgtccgccc acccccattc tccaagcttc agccccctcc 120

ttagttcggc atctgcacag cactgaagaa cctgggaatc agaccctgag accctgagca 180

atcccaggtc cagcgccagc cctatcatga ccaaggagta tcaagacctt cagcatctgg 240

acaatgagga gagtgaccac catcagctca gaaaagggcc acctcctccc cagcccctcc 300

tgcagcgtct ctgctccgga cctcgcctcc tcctgctctc cctgggcctc agcctcctgc 360

tgcttgtggt tgtctgtgtg atcggatccc aaaactccca gctgcaggag gagctgcggg 420

gcctgagaga gacgttcagc aacttcacag cgagcacgga ggcccaggtc aagggcttga 480

gcacccaggg aggcaatgtg ggaagaaaga tgaagtcgct agagtcccag ctggagaaac 540

agcagaagga cctgagtgaa gatcactcca gcctgctgct ccacgtgaag cagttcgtgt 600

ctgacctgcg gagcctgagc tgtcagatgg cggcgctcca gggcaatggc tcagaaagga 660

cctgctgccc ggtcaactgg gtggagcacg agcgcagctg ctactggttc tctcgctccg 720

ggaaggcctg ggctgacgcc gacaactact gccggctgga ggacgcgcac ctggtggtgg 780

tcacgtcctg ggaggagcag aaatttgtcc agcaccacat aggccctgtg aacacctgga 840

tgggcctcca cgaccaaaac gggccctgga agtgggtgga cgggacggac tacgagacgg 900

gcttcaagaa ctggaggccg gagcagccgg acgactggta cggccacggg ctcggaggag 960

gcgaggactg tgcccacttc accgacgacg gccgctggaa cgacgacgtc tgccagaggc 1020

cctaccgctg ggtctgcgag acagagctgg acaaggccag ccaggagcca cctctccttt 1080

aatttatttc ttcaatgcct cgacctgccg caggggtccg ggattgggaa tccgcccatc 1140

tgggggcctc ttctgctttc tcgggaattt tcatctagga ttttaaggga aggggaagga 1200

tagggtgatg ttccgaaggt gaggagcttg aaacccgtgg cgctttctgc agtttgcagg 1260

ttatcattgt gaactttttt tttttaagag taaaaagaaa tatacctaaa 1310

Claims

1.去唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1）抑制剂在制备用于促进胆固醇外排的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述用于促进胆固醇外排的药物用于降低肝脏中总胆固醇、降低肝脏中甘油三酯或治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述ASGR1抑制剂选自抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段、靶向ASGR1的编码核酸的核酸、靶向ASGR1的核酸适配体以及它们的组合。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述抗ASGR1单克隆抗体结合至SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列并抑制或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1的内吞。

5.根据权利要求3所述的应用，其中所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、N209、H257、T259和Y273中的一个或多个。

6.根据权利要求3所述的应用，其中所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO:1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266。

7.根据权利要求3所述的应用，其中所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区并且选自以下任一抗体：

（a）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列；

（b）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列；

（c）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 19-21所示的序列；

（d）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 25-27所示的序列；

（e）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的序列；

（f）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的序列；

（g）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的序列；以及

（h）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35所示的序列。

8.根据权利要求3所述的应用，其中所述核酸是反义寡核苷酸（ASO）、siRNA、shRNA或gRNA。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述gRNA与CRISPR/Cas9系统构成基因编辑系统。

10.根据权利要求8所述的应用，其中所述siRNA通过GalNAc、LNP或AAV递送。

11.根据权利要求8所述的应用，其中所述核酸靶向SEQ ID NO: 36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

12.根据权利要求2所述的应用，其中所述NAFLD是非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、伴随肝纤维化的NAFLD、伴随肝硬化的NAFLD或伴随肝细胞癌的NAFLD。

13.根据权利要求1所述的应用，其中所述ASGR1抑制剂与第二降脂剂组合使用。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述第二降脂剂为HMGCR抑制剂、NPC1L1抑制剂或PCSK9抑制剂。

15.根据权利要求14所述的应用，其中所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。

16.根据权利要求15所述的应用，其中所述他汀类药物是阿托伐他汀。

17.根据权利要求14所述的应用，其中所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。

18.根据权利要求14所述的应用，其中所述PCSK9抑制剂是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。