CN116948030A - 抗asgr1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开抗ASGR1单克隆抗体及其用途。本发明进一步公开了包括抗ASGR1单克隆抗体在内的ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合在降低血液和/肝脏中总胆固醇和/或甘油三酯的水平或治疗和/或预防心血管病中的应用。本发明证实ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合具有协同的降低血清和肝脏中的总胆固醇和甘油三酯的作用。

Description

抗ASGR1单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗ASGR1单克隆抗体。本发明还涉及ASGR1抑制剂（例如抗ASGR1单克隆抗体）与另一降脂药的联合使用。

背景技术

他汀类药物，通常用于减少低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），是用来降低胆固醇的一线药物。目前由FDA批准上市的他汀类药物主要包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀，而其中又以阿托伐他汀和瑞舒伐他汀使用最为广泛。然而，也有相关研究发现，长期使用他汀类药物会使患者出现他汀抵抗，产生肝脏毒害作用。一部分患者他汀不耐受，产生副作用：如肌无力、横纹肌溶解、糖尿病等。中等强度他汀并不能满足强化降脂的临床需求；而大剂量他汀剂量加倍后疗效仅增加6%，不良反应却增加了一倍，临床应用有着很大的局限性。

依折麦布（EZ）是第一个胆固醇吸收抑制剂，其主要功能是抑制NPC1L1介导的小肠刷状缘从饮食和胆汁中吸收胆固醇，但不影响其他脂溶性营养物质的吸收，主要用于高胆固醇血症。EZ处理后减少肝脏中脂质的堆积，减少血液中胆固醇、甘油三酯和LDL-c，同时增加高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c），对于脂溶性的维生素如维生素A、维生素D和维生素E无显著影响。但是，单独应用依折麦布时，LDL-c血浆浓度降低程度较弱（约20%），因此临床上多将其与他汀类联合应用。在4项多中心、双盲、安慰剂对照、为期12周的研究中，1187名原发性高胆固醇血症患者接受了每天单独应用依折麦布10 mg治疗或联合应用阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀的治疗。联合用药的患者LDL-c降低程度与他汀类药物的种类和剂量无关。依折麦布与最小剂量他汀类药物联合应用降低LDL-c的作用优于大剂量单独应用他汀类药物。依折麦布辛伐他汀片（葆至能®）是目前国内唯一一款降脂药物复方制剂，片剂中含有临床应用广泛的两种降脂药物——辛伐他汀和依折麦布，适用于高胆固醇血症患者。依折麦布辛伐他汀片具有双重作用机制，在抑制胆固醇在肝脏合成的同时，抑制胆固醇在小肠的吸收，可强效降低LDL-c达50%以上。

虽然依折麦布与他汀类降脂药物联合给药一定程度上降低了他汀类药物的用量，从而降低其毒副作用，但联合给药仍具有常见的副作用，例如肝功能检查异常，如谷丙转氨酶（ALT）和/或谷草转氨酶（AST）升高；血液肌酸激酶（CK）升高，以及不常见的血液胆红素升高；血液尿酸升高；γ-谷氨酰转肽酶升高；国际标准化比值升高；出现蛋白尿；体重下降等。

WO 2017058944 A1、WO 2022006327 A1以及US 20210163601 A1公开了通过施用ASGR-1抗原结合蛋白来治疗和预防心血管疾病的方法，其中揭示了抗ASGR1抗体能够降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）和/或非高密度脂蛋白胆固醇（Non-HDL-C）的水平。然而，目前没有ASGR1抗体批准上市用于治疗单纯高胆固醇血症或其他心血管疾病。

发明内容

在第一方面，本发明提供结合至ASGR1的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体抑制或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1的内吞，所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区并且选自以下任一抗体：

（a）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:7-9所示的序列或其每一个的等效物；

（b）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:13-15所示的序列或其每一个的等效物；

（c）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21所示的序列或其每一个的等效物；

（d）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:25-27所示的序列或其每一个的等效物；

（e）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列或其等效物；

（f）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列或其等效物；

（g）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列或其等效物；以及

（h）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列或其等效物。

在第二方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种，以及药学上可接受的载体。

在第三方面，本发明提供一种降低血液中胆固醇和/或甘油三酯的水平或治疗和/或预防心血管病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种，或包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种的药物组合物。

在第四方面，本发明提供上述单克隆抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物在制备用于降低血液中胆固醇和/或甘油三酯的水平或用于治疗和/或预防心血管病的药物中的应用。

在第五方面，本发明提供用于降低血液中胆固醇和/或甘油三酯的水平或用于治疗和/或预防心血管病用途的上述单克隆抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物。

在第六方面，本发明提供一种编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。另一方面，本发明还提供一种包含前述核苷酸序列的载体。另一方面，本发明还提供一种包含前述载体的宿主细胞。此外，本发明还提供生成本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的细胞系，包含本发明的核苷酸的重组表达载体，以及通过培养抗体生产细胞系来制备抗体的方法。

在上述任一方面，所述单克隆抗体优选是人源化抗体或嵌合抗体。

发明人还发现，ASGR1抑制剂与另一降脂药物的联合施用产生显著的协同降脂效果，血液和/或肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平均显著降低。

在第七方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的ASGR1抑制剂、治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在第八方面，本发明提供一种药盒，其包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包括治疗有效量的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包括治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在第九方面，本发明提供ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合在制备用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇和/或甘油三酯的水平或用于治疗和/或预防心血管病的药物中的应用。

在第十方面，本发明提供用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇和/或甘油三酯的水平或用于治疗和/或预防心血管病用途的ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合。

在第十一方面，本发明提供一种降低血液和/或肝脏中总胆固醇和/或甘油三酯的水平或治疗和/或预防心血管病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在上述任一方面，所述ASGR1抑制剂优选选自抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段、靶向ASGR1的编码核酸的核酸、靶向ASGR1的核酸适配体以及它们的组合。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至包含SEQ ID NO: 1所示序列的人ASGR1，并且抑制或阻断人ASGR1与其天然配体（例如去唾液酸糖蛋白）的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至ASGR1的碳水化合物结合区域并抑制或阻断人ASGR1与其天然配体（例如去唾液酸糖蛋白）的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:2的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:3的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、N209、H257、T259和Y273中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ IDNO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266。

在一些实施方案中，所述抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段为第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在上述任一方面，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase；ACL）抑制剂、NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。在一些实施方案中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。在一些实施方案中，所述ACL抑制剂为贝派地酸（Bempedoic acid）。在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是抗PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的干扰核酸（如siRNA或shRNA）。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。

本发明的其他方面和优点可从以下关于本发明的详细描述中明显得出。

附图说明

图1. 制备ASGR1中和抗体。（a）制备ASGR1单克隆中和的步骤。纯化的ASGR1蛋白作为抗原免疫兔子，经过第一轮筛选以后，拿到4株B细胞单克隆作为候选。接着对抗体的可变区域的编码区进行测序，并将其构建到抗体表达载体上，转染到哺乳动物细胞中。通过蛋白质免疫印迹和实时定量PCR确认其效果。最后将兔源的Fc片段替换成鼠源的Fc片段。最终选择中和抗体4B9进行大规模生产，并用于后续实验。（b）HEK293T细胞中纯化出的ASGR1蛋白的考马斯亮蓝染色；（c）Huh7细胞与纯化的中和抗体孵育72 h，蛋白质免疫印迹分析LXRα的蛋白表达；（d）从8周大的野生型C57B/L6小鼠中分离肝原代细胞。用不同的单克隆中和抗体按照不同的浓度与原代肝细胞孵育72 小时，收集细胞，裂解并进行蛋白质免疫印迹分析；（e）从8周大的野生型C57B/L6小鼠中分离肝原代细胞。用ASGR1中和抗体4B9与原代肝细胞孵育72 小时，收集细胞，提取细胞内总RNA，利用实时定量PCR分析检测LXR的靶基因；（f）Huh7细胞转染指定的质粒。转染48小时后，收集细胞，裂解，用蛋白质免疫印迹分析各蛋白的表达。

图2. ASGR1中和抗体增加胆固醇外排，降低血脂和肝脂。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的4组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐（HF/HC/BS）饮食（60% 脂肪、1.25%的胆固醇和0.5%的胆酸盐）喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。（a）蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；（b）实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸代谢相关的基因，亲环素作为内参；（c）血清中总胆固醇；（d）血清中甘油三酯；（e）肝脏中总胆固醇；（f）肝脏中甘油三酯；（g）胆囊的体积；（h）胆汁中胆固醇的浓度；（i）胆汁中胆固醇的总量；（j）胆囊体积的代表性图片；（k）粪便中总胆固醇的量；（l）胆汁中胆汁酸的浓度；（m）胆汁中胆汁酸的总量；（n）体重；（o）日进食；（p）肝脏与体重的比值；（q）血糖；（r）血清中谷丙转氨酶；（s）血清中谷草转氨酶。

图3. ASGR1中和抗体与阿托伐他汀联用显示出协同降脂的效果。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的8组，每组6只。自由饮水，高脂、高胆固醇和胆酸盐（HF/HC/BS）饮食（60%脂肪、1.25%的胆固醇和0.5%的胆酸盐）喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9，每天按照30 毫克/千克/天的量灌胃阿托伐他汀。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。（a）蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；（b）血清中总胆固醇；（c）血清中甘油三酯；（d）肝脏中总胆固醇；（e）肝脏中甘油三酯；（f）胆汁中胆固醇的浓度；（g）胆汁中胆固醇的量；（h）胆汁中胆汁酸的浓度；（i）胆汁中胆汁酸的总量；（j）粪便中胆固醇的总量；（k）体重；（l）日进食量；（m）肝脏与体重的比值；（n）血糖；（o）血清中谷丙转氨酶；（p）血清中谷草转氨酶；（q-r）实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；（s）肝脏切片的苏木精-伊红染色；（t）肝脏切片的油红O染色。

图4. 中和抗体4B9与依折麦布协同作用。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图所示的8组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐（HF/HC/BS）饮食（60%脂肪、1.25%的胆固醇和0.5%的胆酸盐）喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9，每天按照10 毫克/千克/天的量灌胃依折麦布。8天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。所有数据均以平均值±SEM表示。统计显著性用未配对的双尾学生t检验计算.*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。（a）蛋白质免疫印迹分析肝脏样本；（b）血清中总胆固醇；（c）血清中甘油三酯；（d）肝脏中总胆固醇；（e）肝脏中甘油三酯；（f）胆汁中胆固醇的浓度；（g）胆汁中胆固醇的总量; （h）胆汁中胆汁酸的浓度；（i）胆汁中胆汁酸的总量；（j）体重；（k）日进食量；（l）肝重/体重；（m）血糖；（n）血清中谷丙转氨酶；（o）血清中谷草转氨酶；（p-q）实时定量PCR分析小鼠肝脏中与胆固醇外排、胆固醇合成与吸收、脂质合成、胆汁酸合成相关的基因和其他通路的基因，亲环素作为内参；（r）肝脏切片的苏木精-伊红染色；（s）肝脏切片的油红O染色。

具体实施方式

定义

在本发明中，“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定（即测量体系的限度）。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

本文中被描述为“包含”一个或多个所述元件或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着所述元件或步骤是必需的，但是可以在所述组合物或方法的范围内添加其它元件或步骤。还应理解，被描述为“包含”一个或多个所述元件或步骤的任何组合物或方法也描述“基本上由所述元件或步骤组成”的相应、更有限的组合物或方法，意味着所述组合物或方法包括所述必需元件或步骤，并且还可以包括不会实质上影响所述组合物或方法的基本和新颖特征的额外元件或步骤。

如本文中使用的，术语“抗体”是指表现所需生物学活性（例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导）的抗体的任何形式。“抗体片段”和“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母抗体的抗原结合区或可变区（例如一个或多个CDR）。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在另一些实施方式中，抗体是多克隆抗体。

本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇（表位）的多种不同抗体的常规（多克隆）抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤或重组DNA方法制备。

单克隆抗体可以包括“嵌合”抗体、人源化抗体或全人源抗体。在一些实施方式中，抗体构成更大的生物分子的一部分，例如融合蛋白或抗体药物偶联物。抗体片段保留亲本抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的亲本结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的亲本抗体对靶标的结合亲和力。

因此，如本文使用的，抗体片段的例子包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；纳米抗体；结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体（如双特异性抗体）、CAR-T和BiTE等。“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)₂分子。“F(ab′)₂片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)₂片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。“单链Fv抗体”（或“scFv抗体”）是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH和VL结构域之间包含额外的多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。

“Fc”或“Fc段”或“Fc区”是指多肽，其包含抗体的恒定区，排除第一恒定区免疫球蛋白域，并且在一些状况下，排除铰链的部分。因此，Fc是指IgA、IgD及IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域，以及这些结构域的柔性铰链N-末端。在一些实施方案中，对Fc区进行氨基酸修饰例如来改变与一个或多个FcγR受体或FcRn受体的结合。

如本文所使用，术语“表位”是指抗体或抗原结合片段所结合的抗原的一部分。在一些实施方案中，表位可能是构象表位，即包含在抗原中虽未共价相邻但当该抗原呈相关构象时在三维空间中彼此接近的该抗原中的部分。例如，对于ASGR1，构象表位是包含在ASGR1胞外域中的、由不相邻的多个氨基酸残基构成的表位。在一些实施方案中，表位可能是线性表位，即包含ASGR1胞外域中在一级结构上相邻的一段氨基酸残基序列的表位。用于测定ASGR1的表位的确切序列和/或特别是氨基酸残基的方式是文献中已知的，包括与来自抗原序列的肽竞争结合至来自不同物种的ASGR1序列、截短和/或诱变（例如通过丙氨酸扫描或其它定点诱变）、基于噬菌体展示的筛选或（共）晶体学技术。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含衍生自除人以外的哺乳动物的抗体的CDR、以及人抗体的框架区（FR）和恒定区的抗体。

如本文所用，术语“嵌合抗体”将被认为是指这样的任何抗体，其中免疫反应区或位点是从第一物种获得或衍生并且恒定区（其可以是完整的、部分的或根据本公开修饰的）是从第二个物种获得的。在某些实施方案中，目标结合区或位点将来自非人类来源（例如小鼠或灵长类动物）并且恒定区是人类的。

抗体或多肽的“等效物”是指与该抗体或多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的抗体或多肽。在一些方面，序列同一性为至少约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99%。在一些方面，与参考抗体或多肽相比，其等效物具有一个、两个、三个、四个或五个添加、缺失、取代及它们的组合。在一些方面，抗体或多肽的等效物保留了参考序列的活性（例如，表位结合）或结构（例如，盐桥）。

如本文中使用的，序列的“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。

本文所用的两个序列之间的“％同一性”是指所述序列共有的等同位置的数目的函数（即％同源性＝等同位置数/总位置数x 100），其中会考虑到空位数目及各空位长度，所述空位需要在进行两个序列最佳比对时引入。序列比较和两个序列之间％同一性的确定可用数学算法来完成。

“保守性取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变或不实质性改变生物学活性。“不改变或不实质性改变”是指当以相同或相似方法测定时，与所比较的对象相比，一个或多个方面具有不超过约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%的差异。

通常，HCDR3和LCDR3被认为在抗原识别中占据比其他CDR更重要的作用，因此，在取代的情况下，本发明优选对HCDR3和LCDR3以外的CDR进行保守性取代。在一些实施方式中，HCDR1、HCDR3和LCDR3不被取代。优选的氨基酸取代包括但不限于：（1）降低蛋白质水解敏感度，（2）降低氧化敏感度，（3）改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，（4）提供或修饰这些类似物的其他物理化学或功能性能的取代。类似物可以包括除了天然存在的肽序列之外的各种序列的突变。例如，可以在天然存在的序列中（优选在形成分子间接触的区域之外的多肽部分中）进行单个或多个氨基酸取代（优选保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代不应该实质上改变亲代序列的结构特征（例如氨基酸替代不应该倾向破坏在亲代序列中存在的螺旋，或者表征破坏亲代序列的其他二级结构类型）。

可以预期的是，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的结合结构域可以带有信号肽，其通常位于分泌蛋白的N端，一般由15～30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒（SRP）所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。如终止转运序列存在于新生肽链的C端，也可以不被信号肽酶切除，如卵清蛋白含有内部信号肽。它的前体与成熟形式都没有被信号肽酶切除的过程。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。“特异性结合”是指本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性地与各人靶标分子的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸相互作用。抗体的“特异性结合”主要由两个参数来表征：定性参数（结合表位或抗体结合位置）和定量参数（结合亲和力或结合强度）。抗体结合表位可通过FACS法、肽点表位作图法、质谱法或肽ELISA法测定。Biacore法和/或ELISA法可测定抗体与特定表位的结合强度。通常将信噪比作为结合特异性的代表性测定计算方法。在这样的信噪比中，信号代表抗体结合至目标表位的强度，而噪声代表抗体与其他非目标表位结合的强度。优选地，对于目标表位的信噪比为约50时可以认为所评估的抗体以特异性方式结合至目标表位，即“特异性结合”。如果抗原结合蛋白（包括抗体）以如通过亲和力常数（KD）值确定的高结合亲和力与抗原结合，则抗原结合蛋白（包括抗体）与抗原“特异性地结合”。在一些实施方式中，所述亲和力常数KD低于10^-9 M。如本文使用的术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的亲和力常数。

如本文所使用，术语“患者”或“对象”是指被施用或可被施用所提供的抗体、其抗原结合片段或药物组合物的任何生物体，以用于实验、诊断、预防、化妆和/或治疗目的。典型的对象包括动物（例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人）。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象患有或易患一种或多种病症或病况。患者可表现出病症或病况的一种或多种症状，或可能已被诊断患有一种或多种病症或病况。在一些实施方案中，患者正在接受或已接受用于诊断和/或治疗此类疾病、病症或病况的某种疗法。

在本发明中，术语“治疗”是指疗法上的以及预防性的措施，其阻止或减缓对象发生不期望的生理学改变或病症的发生或进展。有利或期望的临床效果包括但不限于，症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化（即不恶化）、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及疾病的部分或全部治愈，而不论上述效果是否可检测到。“治疗”也可指与不治疗相比生存期延长。需要治疗的对象包括已患有该疾病或病症的对象，以及有可能患有该疾病或病症的对象，或要预防该疾病或病症的对象。

当用“施用”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“施用”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“施用”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明的结合至ASGR1的单克隆抗体或其抗原结合片段单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括当与组合物的活性成分组合时允许该成分保持生物活性并且不会引起与对象的免疫系统的破坏性反应的材料。这些载体可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖配合物或晶体等。“药学上可接受的”是指当施用至人体时不会产生过敏反应或类似的不期望的反应的分子和成分。

ASGR1单克隆抗体

在本发明的一个方面，本发明提供结合至ASGR1的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体抑制或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1的内吞。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列或其每一个的等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列或其每一个的等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 19-21所示的序列或其每一个的等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 25-27所示的序列或其每一个的等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列或其等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列或其等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列或其等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列或其等效物。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 19-21所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 25-27所示的序列或其每一个的变体，该变体具有单个取代、缺失或插入。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 28具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 29具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 30具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 31具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 32具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 33具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 34具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列或其变体，该变体与SEQ ID NO: 35具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 序列同一性。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 19-21所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 25-27所示的序列。

在上述任一实施方式中，所述LCDR1至LCDR3以及HCDR1至HCDR3是基于IMGT、Kabat、Chothia、Contact或Martin中的任一种定义方案定义的。在一些实施方式中，所述LCDR1至LCDR3以及HCDR1至HCDR3是基于IMGT定义方案定义的。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是IgG型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是IgG1型。

在一些实施方案中，本文所述的取代是保守性取代。

“保守性（氨基酸）取代”是指用具有相似侧链的氨基酸取代氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-支链侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，氨基酸串可以用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构相似的串取代。

本领域技术人员还将理解，本文公开的抗体可以被修饰，使得它们的氨基酸序列与它们所源自的天然存在的结合多肽不同。例如，源自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以与起始序列相似，例如具有一定百分比的同一性，例如，它可以是60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或这些值中任意两个之间的范围与起始序列相同。

在一些实施方案中，抗体包含氨基酸序列或一个或多个通常不与抗体相关的部分。在此更详细地描述了示例性修饰。例如，本文公开的抗体可包含柔性接头序列，或可被修饰以添加功能部分（例如，聚乙二醇（PEG）、药物、毒素或标记）。

本发明的抗体、其变体或衍生物包括被修饰的衍生物，即，通过任何类型的分子与抗体的共价连接，使得共价连接不会阻止抗体与表位结合。例如，但不作为限制，抗体可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等等。多种化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，抗体可以包含一个或多个非经典氨基酸。

在一些实施方案中，抗体可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。

抗体可以与治疗剂缀合或融合，治疗剂可以包括可检测的标记（例如放射性标记）、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒剂（它们可以是药物或毒素）、超声增强剂、非放射性标记、其组合和本领域已知的其他此类试剂。

抗体可以通过将其与化学发光化合物偶联来进行可检测标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）、热稳定性（theromatic）吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

还可以使用荧光发射金属（例如 ¹⁵²Eu或镧系元素系列的其他金属）对抗体进行可检测标记。这些金属可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二胺四乙酸（EDTA）之类的金属螯合基团连接到抗体上。将各种部分缀合到抗体的技术是众所周知的。

人源化抗体和嵌合抗体

在本发明的任一方面，所述单克隆抗体优选是人源化抗体或嵌合抗体。

人源化抗体是源自非人物种抗体的抗体分子，其结合具有一个或多个来自非人物种的互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基以鉴定在特定位置的不寻常的框架残基。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，这些技术包括例如CDR-移植、饰面或表面重修和链改组等。

完全人类抗体对于人类患者的治疗性治疗是特别理想的。人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。。

也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以在通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分别或同时失去功能。特别是，JH 区的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。扩增修饰的胚胎干细胞并显微注射到囊胚中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合子后代。对转基因小鼠以正常方式用选定的抗原进行免疫，所述抗原例如是所需靶多肽的全部或部分。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在 B 细胞分化过程中重新排列，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生治疗上有用的 IgG、IgA、IgM 和 IgE 抗体。

识别选定表位的完全人类抗体也可以使用称为“引导选择”的技术生成。在该方法中，选择非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来引导识别相同表位的完全人抗体的选择。

可以使用常规程序（例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）轻松分离和测序编码所需单克隆抗体的DNA。分离和亚克隆的杂交瘤细胞用作此类 DNA 的优选来源。分离后，可以将 DNA 置于表达载体中，然后将其转染到原核或真核宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿猴 COS 细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。更具体地，分离的DNA可用于克隆恒定区和可变区序列以用于制造抗体。从本质上讲，这需要从选定的细胞中提取 RNA，转化为 cDNA，并使用 Ig 特异性引物通过 PCR 进行扩增。如本文所述，表达所需抗体的转化细胞可以以相对大量生长以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。

另外，使用常规重组DNA技术，可以将本公开的抗原结合多肽的一个或多个CDR插入框架区内，例如插入人框架区以将非人抗体人源化。框架区可以是天然存在的或共有框架区，并且优选人框架区。优选地，由框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码特异性结合所需多肽（例如LIGHT）的至少一个表位的抗体。优选地，可以在构架区内进行一个或多个氨基酸取代，并且优选地，氨基酸取代提高抗体与其抗原的结合。此外，此类方法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其他改变包括在本公开中并且在本领域技术范围内。

此外，可以使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术，其通过剪接来自小鼠抗体分子的具有适当抗原特异性的基因，以及来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因。如本文所用，嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。

另一种产生重组抗体的高效方法是导致产生包含猴可变域和人类恒定序列的灵长类抗体。

相应地，本发明提供一种人源化的ASGR1单克隆抗体，所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区并且选自以下任一抗体：

（a）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:7-9所示的序列或其每一个的等效物；

（b）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:13-15所示的序列或其每一个的等效物；

（c）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21所示的序列或其每一个的等效物；以及

（d）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:25-27所示的序列或其每一个的等效物。

在一些实施方式中，所述人源化ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列或其每一个的等效物。

相应地，本发明提供一种嵌合ASGR1单克隆抗体，所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区以及人恒定区，并且选自以下任一抗体：

（e）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列或其等效物；

（f）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列或其等效物；

（g）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列或其等效物；以及

（h）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列或其等效物。

在一些实施方式中，所述嵌合ASGR1单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的序列或其等效物。

上述任一嵌合ASGR1单克隆抗体或人源化ASGR1单克隆抗体可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区例如是SEQ ID NO: 37所示的人IgG1重链恒定区，所述轻链恒定区例如是SEQ ID NO: 38所示的人Igκ轻链恒定区。

ASGR1抑制剂

去唾液酸糖蛋白受体1（Asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1），主要定位肝脏细胞中。ASGR1是单次跨膜蛋白，包括胞质端、跨膜区段、铰链区和碳水化合物结合区。位于血清中的糖蛋白经神经氨酸酶的加工处理后，形成去唾液酸化的糖蛋白，紧接着与位于细胞膜上的ASGR1结合，起始内吞，进入到内体途径，在内体的酸性环境中，受体与配体解离，这些蛋白质被运送至溶酶体中进行降解，而ASGR1则循环至细胞表面再利用。

人源的ASGR1包含291个氨基酸, 分子量为33,186 Da，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示（UniProtKB/Swiss-Prot: P07306.2）。ASGR1可与血液中的配体即去唾液酸糖蛋白结合后，通过网格蛋白（Clathrin）介导的内吞，最终进入到溶酶体中进行降解。人ASGR1的胞质端较短（1-40 aa），跨膜区域为40-60 aa，胞外区域又分为茎区（62-141 aa）和碳水化合物结合区域（142-291，SEQ ID NO: 2）。人源ASGR1基因在NCBI的gene ID为432，编码区序列如SEQ ID NO:36所示（NCBI Reference Sequence: NM_001671.5）。

在本文中，“ASGR1抑制剂”是指能降低或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1内吞的物质，以及能降低或阻断ASGR1的编码基因的表达的物质。

在一些实施方案中，本文的ASGR1抑制剂可以包括：（1）与ASGR1结合的抑制剂；（2）与ASGR1的配体（例如去唾液酸糖蛋白）结合的抑制剂；（3）降低或阻断ASGR1与其配体结合的抑制剂；（4）降低或阻断ASGR1内吞的抑制剂；（5）降低ASGR1的蛋白质水平的抑制剂；（6）降低或阻断ASGR1的蛋白质活性的抑制剂；以及（7）降低或阻断ASGR1的编码基因的表达的抑制剂。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂可以是小分子化合物、靶向ASGR1的编码基因的核酸、靶向ASGR1的核酸适配体、抗ASGR1抗体或它们的组合。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是ASGR1抗体。在一些实施方案中，所述ASGR1抗体是ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至包含SEQ ID NO: 1所示序列的人ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体（例如去唾液酸糖蛋白）的结合和/或人ASGR1的内吞。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合至ASGR1的碳水化合物结合区域并抑制人ASGR1与其天然配体（例如去唾液酸糖蛋白）的结合和/或人ASGR1的内吞。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:2的序列，或实质上由其构成，或由其构成。在一些实施方式中，ASGR1的碳水化合物结合区域包含SEQ ID NO:3的序列，或实质上由其构成，或由其构成。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265、D266、D267、R237、N209、H257、T259和Y273中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266中的一个或多个。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体结合的表位包含SEQ ID NO: 1中的Q240、D242、W244、E253、N265和D266。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是全人抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是嵌合抗体。

在一些实施方式中，所述ASGR1单克隆抗体是上文“ASGR1单克隆抗体”部分所述的抗体，例如，所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区并且选自以下任一抗体：

（a）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:7-9所示的序列或其每一个的等效物；

（b）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:13-15所示的序列或其每一个的等效物；

（c）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:19-21所示的序列或其每一个的等效物；

（d）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列或其每一个的等效物，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO:25-27所示的序列或其每一个的等效物；

（e）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 29所示的序列或其等效物；

（f）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 31所示的序列或其等效物；

（g）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 33所示的序列或其等效物；以及

（h）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列或其等效物，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 35所示的序列或其等效物。

其他示例性ASGR1单克隆抗体包括在WO 2017058944 A1、WO 2022006327 A1或US20210130473 A1中描述的那些抗体，通过引用将其全部公开内容合并至本文中。

在一些实施方案中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向ASGR1的DNA或mRNA并抑制ASGR1的表达的核酸。

在一些实施方式中，所述核酸选自反义寡核苷酸（ASO）、siRNA、shRNA和gRNA。

在一些实施方式中，所述核酸是ASO，所述ASO可以在骨架、糖基或碱基上被修饰，以抵抗体内降解。合适的修饰方式包括，但不限于硫代磷酸化（PSP）、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）、2’-O-甲氧基乙基修饰（2’-MOE）、5-甲基胞嘧啶（5mC）。

在一些实施方式中，所述核酸是siRNA或shRNA，所述siRNA可通过合适的载体被递送。所述合适的载体例如是GalNAc、LNP或AAV。

在一些实施方式中，所述核酸靶向SEQ ID NO: 36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

在一些实施方式中，所述核酸是gRNA，所述gRNA与CRISPR/Cas酶（例如CRISPR/Cas9）构成基因编辑系统，抑制或阻断ASGR1的编码基因的表达。

在ASGR1的编码基因已知的前提下，本领域技术人员可通过常规技术获得并筛选上述核酸的序列。

在一些实施方式中，所述核酸（如ASO、siRNA、shRNA或gRNA）靶向SEQ ID NO: 36所示的序列并抑制ASGR1的编码基因的表达。

在一些实施方式中，本发明的ASGR1抑制剂是靶向人ASGR1的核酸适配体（aptamer）。在一些实施方式中，所述核酸适配体结合至人ASGR1，并且抑制人ASGR1与其天然配体（例如去唾液酸糖蛋白）的结合和/或人ASGR1的内吞。

治疗方法及应用

本发明一方面提供一种降低血液中胆固醇水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

本发明另一方面提供一种降低血液中甘油三酯水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

本发明再一方面提供一种治疗和/或预防心血管病例如动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞或冠状动脉疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

相应地，本发明另一方面提供上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种在制备用于降低血液中胆固醇水平的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种在制备用于降低血液中甘油三酯水平的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种在制备用于治疗和/或预防心血管病的药物中的应用。

相应地，本发明另一方面提供用于降低血液中胆固醇水平的用途的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

相应地，本发明另一方面提供用于降低血液中甘油三酯水平的用途的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

相应地，本发明另一方面提供用于治疗和/或预防心血管病的用途的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种。

另一个方面，发明人发现，ASGR1抑制剂与降脂药物的联合施用产生显著的协同降脂效果，血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平均显著降低。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在一些实施方式中，本发明提供一种降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

在一些实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防心血管病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和治疗有效量的第二降脂药。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合在制备用于治疗和/或预防心血管病的药物中的应用。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

相应地，在一些实施方式中，本发明提供用于治疗和/或预防心血管病的用途的本文所述的ASGR1抑制剂和第二降脂药的组合。

在上述任一实施方式中，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、ACL抑制剂、NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。

在上述任一实施方式中，所述第二降脂药可以与所述ASGR1抑制剂同时施用或间隔施用。例如，所述第二降脂药可以在施用所述ASGR1抑制剂之前施用至对象，或者所述第二降脂药可以在施用所述ASGR1抑制剂之后施用至对象。

在一些实施方案中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。

在一些实施方案中，所述ACL抑制剂为贝派地酸。在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。

在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的核酸（如siRNA或shRNA）。在一些实施方案中，所述PCSK9抗体是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。其他示例性PCSK9抑制剂包括在WO2017220701A1、WO2012088313A1、WO2009026558A1、WO2009102427A2或WO2017035340A1中描述的PCSK9抑制剂，通过引用将其全部公开内容合并至本文中。

合适的给药途径包括胃肠外给药（例如肌内、静脉内或皮下给药）及口服给药。其他常规的给药方式包括经气管插管给予、经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、动脉内注射。

由临床医生根据本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的监测指标包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

药物组合物

本发明的一个方面提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的上述单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一种，以及药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂、治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在上述任一方面，所述药物组合物用于降低血液和/或肝脏中总胆固醇水平。在一些实施方式中，所述药物组合物用于降低血液和/或肝脏中甘油三酯水平。在一些实施方式中，所述药物组合物用于治疗和/或预防心血管病，例如动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞或冠状动脉疾病。

本发明的另一个方面提供一种药盒，其包括第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包括治疗有效量的本文所述的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包括治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

在上述任一方面，所述第二降脂药优选是HMGCR抑制剂、ACL抑制剂、NPC1L1抑制剂和/或PCSK9抑制剂。在一些实施方式中，所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。在一些实施方案中，所述他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和帕伐他汀。在一些实施方案中，所述他汀类药物为阿托伐他汀。在一些实施方案中，所述ACL抑制剂为贝派地酸（Bempedoic acid）。在一些实施方案中，所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。在一些实施方案中，所述PCSK9抑制剂是抗PCSK9抗体或靶向PCSK9编码基因的核酸（如siRNA或shRNA）。在一些实施方案中，所述PCSK9抗体是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。

为了制备药物组合物或无菌组合物，让药物与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液或混悬剂形式的制剂。药学上可接受的载体是本领域熟知的。本领域已知如何制备包含作为活性组分的水性组合物。通常，这些组合物被制备成注射剂或喷雾剂，例如液态溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射或喷雾之前配制成溶液或悬浮液的固体形式。

序列表

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实施例

材料与方法

小鼠

CRISPR/Cas9介导的Asgr1全身敲除小鼠是由成都集萃药康公司构建，sgRNA介导的cas9内切核酸酶在第2与第3个内含子以及第8与第9个内含子之间进行切割。通过同源重组将第3到第8个外显子之间的部分缺失，进而获得全身Asgr1敲除的小鼠。

在实验中，野生型的同窝幼仔作为对照。所有小鼠饲养在SPF（specific pathogenfree）级别的动物房，并保持光照12小时/黑暗12小时，8周大的雄性或者雌性小鼠按照实验中所需的时间喂食高脂高胆固醇胆酸盐饲料（Research Diets, D12109C）进行处理，在抗体中和或者抗体与他汀类药物或依折麦布中，小鼠按照指定的量进行抗体的腹腔注射或者灌胃药物。在杀死之前所有动物都饥饿4个小时。所有动物实验严格遵守国家和武汉大学实验动物福利伦理和保护相关规定。

材料与质粒

Lovastatin（纯度≥98%，HPLC）购自上海Pharm Vally。Sodium mevalonate （#4667）、anti-FLAG M2 beads （#A2220）、anti-MYC beads （E6654）、Fetuin A （SRP6217）、D-Galactose （G5388）、N-acetyl-D-galactosamine （A-2795）、Phenylmethanesulfonylfluoride （PMSF, #P7626）、Protease inhibitor cocktail （#P8340） 和β-mercaptoethanol （#M3148） 均购自Sigma。Dil （1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate）-LDL （#20614ES76）购自上海翊圣。Lipofectamine RNAiMAX （#13778150）购自Theromo Fisher。MG132 （#I-130）购自BostonBiochem。Puromycin （#BS111）购自Biosharp。G418（#345810）、Pepstatin A （#516481） 和ALLN （N-acetyl-leu-leu-norleucinal, #208719）购自Calbiochem。Ni-NTA Agarose （#30230） 购自Qiagen。LPEI （Linear polyethylenimine, #23966-1） 购自Polysciences。FuGENE HD （#E2311）和M-MLV RTase （#M1701）购自Promega。Leupeptin （#11034626001）购自Roche。DTT （DL-Dithiothreitol, #A100281）和NP-40 （A100109） 购自上海生工。磷酸酶抑制剂（P1082）购自碧云天。培养细胞所用的培养基，胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）购自life Technology。Taq酶购自天根。KOD Hot Start DNA polymerase （#KOD-401;TOYOBO）购自Takara；RNA duplex由广州锐博公司合成，Q-PCR 2×MIX 购自Mona。总胆固醇（TC）试剂盒、总甘油三酯（TG）试剂盒、胆汁酸试剂盒均购自南京科华生物公司。NEFA kit（294-63601）、Phospholipid kit （292-63901）均购自WAKO。ALT、AST、AKP试剂盒均购自南京建成生物公司。血糖试纸、血糖仪均购自稳豪。Lipoprotein-deficient serum （d>1.215g/mL），即LPPS均是通过超速离心从新生小牛血清中制备。

通过标准的分子克隆技术构建了以下质粒:

人源和鼠源的Asgr1、Asgr2、Lxrα、Lxrβ基因片段来源于Huh7和小鼠肝脏组织的RNA逆转录形成的cDNA，人源的BARD1基因片从Huh7中扩增所得，分别克隆进p3×Flag-CMV14、pEGFP-C1和pcDNA3-C-5×Myc载体。pDEST-FRT/T0-GFP-BRCA1（#71116）购自Addgene。通过点突变的方法构建ASGR1的各种截短体和点突变。

Huh7和HEK293T细胞在37°C和5% CO₂的环境中单层生长。细胞都维持在培养基A（含有100 units/mL青霉素和100 mg/mL硫酸链霉素的DMEM）中，并补充10%胎牛血清（FBS），胆固醇缺陷培养基B由培养基A补充了5%的去脂蛋白血清（LPPS）、1 µM 洛伐他汀和10 µM甲羟戊酸得到。原代小鼠肝细胞培养用培养基D （M199）补充5% FBS、100 units/mL青霉素和100 mg/mL硫酸链霉素。

免疫印迹

将收集的细胞或者组织用添加了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中进行裂解。RIPA裂解缓冲液包含50 mM Tris-HCl （pH=8.0）、150 mM NaCl、2 mMMgCl₂、1.5% NP-40, 0.1% SDS和0.5%脱氧胆酸钠。蛋白酶抑制剂包含10 µM MG-132、10 µg/ml亮肽素（Leupeptin）、1 mM PMSF、5 µg/ml 的胃酶抑素（Pepstatin）、25 µg/ml ALLN、1mM DTT。使用BCA方法（Thermo Fisher Scientific）确定裂解物的蛋白质浓度。将蛋白样品与膜溶解缓冲液（62.5 mM Tris-HCl （pH=6.8），15% SDS，8M 尿素，10%甘油和100 mMDTT）和4×上样缓冲液（150 mM Tris-HCl （pH=6.8），12% SDS，30%甘油，6% 2-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝）在37 °C孵育30分钟。将蛋白样品用SDS-PAGE凝胶分离后再转移到PVDF膜上，用含有0.075% Tween 20及5%脱脂牛奶（针对磷酸化实验用3% BSA）的TBS，即TBST封闭1小时。并在4 °C下用指定的一抗孵育过夜，随后用TBST清洗3次。最后用Pierce ECL Plus蛋白质印迹底物（Thermo Fisher Scientific）进行检测。

实验中使用的一抗

Anti-β-actin （#A5441）和anti-FLAG （#F3165）均购自Sigma。anti-AMPK（10929-2-AP）、anti-ACC （67373-I-Ig）、anti-FASN （10624-2-AP）、anti-GAPDH（60004-1-Ig）、anti-ASGR1（11739-1-AP）购自ProteinTech。Anti-CYP7A1 （sc-518007）、anti-SREBP1（sc-13551）和anti-BRCA1 （sc-6954）购自Santa Cruz。anti-c-Myc和anti-HMGCR分别从杂交瘤细胞株（ATCC） 9E10以及A9制备纯化。anti-LDLR、anti-H2 （HMGCR）通过选取可溶性区段，免疫兔获得抗血清和亲和纯化后的抗体。anti-EGFP是通过大肠杆菌表达纯化EGFP蛋白，免疫兔获得。anti-LXRα （ab41902）购自Abcam。anti-LXRβ （NB100-74457）、anti-ABCG8（NBP1-71706F）、anti-ABCA1 （NB400-105）购自Novus。anti-BARD1 （A300-263A）购自Bethy。Anti-phos ACC （118187）和anti phos-AMPK （#2535）购自Cell signaling Tech。二抗购自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

血液与肝脏化学分析

眼球采血获得血清检测总胆固醇和甘油三酯。将肝脏匀浆，收集上清用于脂质提取以获得肝脏总胆固醇，并使用检测试剂盒（Kehua, China）确定肝脏甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平。用试剂盒（Phospholipid, WAKO, Japan）测定磷脂水平。检测血清中ALT、AST水平用的是南京建成的试剂盒（China）。

结果与分析

实施例1：ASGR1中和抗体4B9促使胆固醇外排至胆汁和粪便，显示出降脂治疗效果。

ASGR1可与大量的去唾液酸化的糖蛋白结合。为了更好地模拟Asgr1敲除对高脂高胆固醇诱导的代谢综合征的改善作用，我们从HEK293T细胞中纯化出ASGR1蛋白免疫兔子，以取得阻断ASGR1功能的中和抗体。具体流程如图1a所示：制备ASGR1单克隆中和的步骤。纯化的ASGR1蛋白作为抗原免疫兔子，经过第一轮筛选以后，拿到4株B细胞单克隆作为候选。接着对抗体的可变区域的编码区进行测序，并将其构建到抗体表达载体上，转染到哺乳动物细胞中纯化蛋白。通过蛋白质免疫印迹和实时定量PCR确认其效果，最后将兔源的Fc片段替换成鼠源的Fc片段。最终选择效果最好的中和抗体4B9 进行大规模生产，并用于后续实验。实验结果验证了4B9具有潜在的降血脂效果。4B9以及其他3株ASGR1单克隆中和抗体都能显著性增加LXRα的蛋白稳定性（图1c, 1d），且胆固醇外排的基因也显著上调（图1e）。更细一步，我们将ASGR1不同截短体质粒转染，检测4B9识别的区段，发现4B9主要识别第182-274aa之间的序列（图1f）。

进一步，我们检测了4B9是否能完全模拟Asgr1缺失对高脂高胆固醇的改善。选取8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图2所示的4组，每组6只。自由饮水、高脂高胆固醇和胆酸盐饮食（60%脂肪、1.25%的胆固醇和0.5%的胆酸盐，HF/HC/BS）喂养。同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。实验结果，在注射4B9抗体后的野生型小鼠显示出与Asgr1缺失一致的结果，即胆固醇外排相关的蛋白，如LXR、ABCG8、ABCA1、CYP7A1显著上升, 而p-ACC同样显著上调，而脂质合成相关的蛋白SREBP1 以及FASN显著减少，LDLR不受影响。BARD1显著下降；且在Asgr1敲除的小鼠中注射或不注射4B9都无影响，说明4B9是特异性地靶向ASGR1（图2a）。实时定量PCR也显示出与蛋白水平变化一致的结果（图2b）。生化指标显示：注射4B9抗体后的小鼠与对照组相比，血清中的总胆固醇与甘油三酯显著性下降（图2c, d），肝脏中的总胆固醇与甘油三酯显著下降（图2 e, f），胆囊的体积显著增加（图2g, j）, 胆汁总胆固醇的浓度以及总量显著增加（图2h, i），粪便中的总胆固醇显著增加（图2k）, 胆汁中总胆汁酸的浓度以及总量显著性增加（图2l, m）。而体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖、谷丙转氨酶与谷草转氨酶无显著性的变化（图2n-s）。综合以上的结果，ASGR1中和抗体4B9显示出非常显著的降脂效果，能极大地缓解高脂高胆固醇饲料诱导的代谢综合征。

实施例 2：抗体4B9与阿托伐他汀联用显示出协同降脂效果。

4B9在前期的实验结果中被证明能显著地改善高脂高胆固醇饲料诱导的代谢综合征表型（图2）。进一步，我们想检测4B9与阿托伐他汀联用是否存在协同降脂效果。将8周大的Asgr1敲除小鼠和同窝生的野生型小鼠按基因型随机分成如图3所示的8组，每组6只。自由饮水，高脂高胆固醇和胆酸盐饮食（60%脂肪、1.25%的胆固醇和0.5%的胆酸盐，HF/HC/BS）喂养。

同时，小鼠按照10毫克/千克/天的剂量每隔一天腹腔注射对照抗体或ASGR1中和抗体4B9，每天按照30 毫克/千克/天的量灌胃阿托伐他汀。14天后，杀小鼠之前统一饥饿4小时。实验结果显示，4B9单独使用时仍然表现出增加胆固醇外排相关的基因及其蛋白水平，抑制脂质合成相关的基因及其蛋白水平，不影响胆固醇合成或者吸收的相关基因或及其蛋白水平，而阿托伐他汀与4B9联用不影响4B9促进胆固醇外排相关基因及蛋白如LXRs、ABCG8、ABCA1、CYP7A1的表达效果，而能够更显著地抑制脂质合成相关基因及其蛋白的表达，如SREBP1、FASN（图3a, 3q-r）。在单独使用4B9或者阿托伐他汀时，都能有效地降低血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平，而当联合使用4B9和阿托伐他汀后，呈现出更显著的降脂效果（图3b-e, 图3s-t），4B9单独使用可增加胆汁中总胆固醇和总胆汁酸的总量，而阿托伐他汀使用几乎不影响胆汁中的总胆固醇和总胆汁酸（图3g, i）。4B9单独使用时可显著增加粪便中总胆固醇的外排，而阿托伐他汀对粪便中胆固醇无影响（图3j）。而无论是4B9还是阿托伐他汀单独使用还是联合使用，8组之间小鼠的体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶都无显著性影响（图3k-p）。综上所述，4B9与阿托伐他汀联用可比单独使用两者时取得更好的降脂效果。

实施例3：抗体4B9与依折麦布联用显示出协同降脂效果。

4B9在小鼠上已被证实具有一定降脂作用（图2），因此，4B9与EZ的联用是否会更大程度上增加降脂作用呢于是，我们设计了如图4的实验来验证该猜想。小鼠按照基因型随机分成8组（n=6），饲喂HF/HC/BS饲料，EZ每天按照10 mg/kg灌胃，4B9（10 mg/kg）隔天腹腔注射一次，第7天收小鼠，取小鼠组织。结果显示：4B9单独使用时仍然表现出增加胆固醇外排相关的基因及其蛋白水平如LXRs、ABCG8、ABCA1、CYP7A1，抑制脂质合成相关的基因及其蛋白水平，如SREBP1、FASN，不影响胆固醇合成或者吸收的相关基因及其蛋白水平，而单独使用依折麦布或与4B9连用时，胆固醇外排相关的基因及其蛋白质，脂质合成相关的基因及其蛋白质都显著下降（图4a, 4p-q）。在单独使用4B9或者依折麦布时，都能有效地降低血清和肝脏中总胆固醇水平和甘油三酯水平，而当联合使用4B9和依折麦布后，呈现出更显著的降脂效果（图4b-e，图4r-s），4B9单独使用可增加胆汁中胆固醇和总胆汁酸的总量，而无论是依折麦布单独使用还是与4B9联用都显著抑制了胆汁总胆固醇和总胆汁酸的总量（图4g,i）。而无论是4B9还是依折麦布单独使用还是联合使用，8组之间小鼠的体重、日进食量、肝脏与体重的比值、血糖以及谷丙转氨酶和谷草转氨酶都无显著性影响（图4j-o）。综上所述，4B9与依折麦布联用可比单独使用两者时取得更好的降脂效果。

应该理解的是，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方式的代表和示例性的，并且不旨在作为对本发明范围的限制。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 抗ASGR1单克隆抗体及其应用

<130> 192590-21D-CNP

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 1

Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser

1 5 10 15

Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu

20 25 30

Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser

50 55 60

Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe

65 70 75 80

Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly

85 90 95

Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln

100 105 110

Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys

115 120 125

Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu

130 135 140

Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu

145 150 155 160

His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala

165 170 175

Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val

180 185 190

Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val

195 200 205

Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val

210 215 220

Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln

225 230 235 240

Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala

245 250 255

His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro

260 265 270

Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro

275 280 285

Pro Leu Leu

290

<210> 2

<211> 150

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 2

Ala Ala Leu Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn

1 5 10 15

Trp Val Glu His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys

20 25 30

Ala Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu

35 40 45

Val Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile

50 55 60

Gly Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp

65 70 75 80

Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg

85 90 95

Pro Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu

100 105 110

Asp Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys

115 120 125

Gln Arg Pro Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser

130 135 140

Gln Glu Pro Pro Leu Leu

145 150

<210> 3

<211> 93

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1的片段

<400> 3

Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln

1 5 10 15

Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu

20 25 30

His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu

35 40 45

Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly

50 55 60

His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly

65 70 75 80

Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr Arg Trp

85 90

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-LCDR1

<400> 4

Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys Asn

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-LCDR2

<400> 5

Tyr Ala Ser

1

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-LCDR3

<400> 6

Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Cys Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-HCDR1

<400> 7

Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser Leu Trp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-HCDR2

<400> 8

Ile Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-HCDR3

<400> 9

Ala Arg Arg Tyr Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Tyr Pro Ala Gly Ser Phe

1 5 10 15

Val Phe Lys Leu

20

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-LCDR1

<400> 10

Gln Lys Ile Ser Asn Glu

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-LCDR2

<400> 11

Arg Ala Ser

1

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-LCDR3

<400> 12

Gln Cys Thr Tyr Gly Ser Ser Asn Ile Val Asn Tyr Gly Gly Ala

1 5 10 15

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-HCDR1

<400> 13

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-HCDR2

<400> 14

Ile Val Ser Ser Gly Ala Ala

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8-HCDR3

<400> 15

Val Arg Gly Asn Leu

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-LCDR1

<400> 16

Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-LCDR2

<400> 17

Gln Ala Ser

1

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-LCDR3

<400> 18

Gln Ser Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Asp Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-HCDR1

<400> 19

Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Tyr Tyr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-HCDR2

<400> 20

Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-HCDR3

<400> 21

Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gly Tyr Val Tyr Tyr Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Leu

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR1

<400> 22

Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR2

<400> 23

Asp Ala Ser

1

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-LCDR3

<400> 24

Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Asn Asn Leu Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR1

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR2

<400> 26

Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-HCDR3

<400> 27

Ala Arg Gly Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Leu

1 5 10

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-VL

<400> 28

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys

20 25 30

Asn Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Lys Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser

85 90 95

Ser Ala Asp Cys Cys Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 127

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 4B9-VH

<400> 29

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Thr

1 5 10 15

Met Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser Leu

20 25 30

Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Tyr Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Tyr Pro Ala Gly Ser Phe

100 105 110

Val Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8?-VL

<400> 30

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Lys Ile Ser Asn Glu

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Gly Ser Ser Asn

85 90 95

Ile Val Asn Tyr Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E8?-VH

<400> 31

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Val Ser Ser Gly Ala Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ser Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Asn

85 90 95

Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-VL

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ile Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Gly Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 127

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 3E12-VH

<400> 33

Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

50 55 60

Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Ser Thr Thr Val

65 70 75 80

Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gly Tyr Val Tyr Tyr Gly Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-VL

<400> 34

Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Asn Asn

85 90 95

Leu Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 115

<212> PRT

<213> 兔(Rabbit)

<220>

<223> 5E5-VH

<400> 35

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp

85 90 95

Asp Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 1310

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> ASGR1-mRNA

<400> 36

acacagacac gcagacacag agacaccggg gcccagggcc ctcctatgga ccctgcccgc 60

tcccctccca ttgtccacgg ctgtccgccc acccccattc tccaagcttc agccccctcc 120

ttagttcggc atctgcacag cactgaagaa cctgggaatc agaccctgag accctgagca 180

atcccaggtc cagcgccagc cctatcatga ccaaggagta tcaagacctt cagcatctgg 240

acaatgagga gagtgaccac catcagctca gaaaagggcc acctcctccc cagcccctcc 300

tgcagcgtct ctgctccgga cctcgcctcc tcctgctctc cctgggcctc agcctcctgc 360

tgcttgtggt tgtctgtgtg atcggatccc aaaactccca gctgcaggag gagctgcggg 420

gcctgagaga gacgttcagc aacttcacag cgagcacgga ggcccaggtc aagggcttga 480

gcacccaggg aggcaatgtg ggaagaaaga tgaagtcgct agagtcccag ctggagaaac 540

agcagaagga cctgagtgaa gatcactcca gcctgctgct ccacgtgaag cagttcgtgt 600

ctgacctgcg gagcctgagc tgtcagatgg cggcgctcca gggcaatggc tcagaaagga 660

cctgctgccc ggtcaactgg gtggagcacg agcgcagctg ctactggttc tctcgctccg 720

ggaaggcctg ggctgacgcc gacaactact gccggctgga ggacgcgcac ctggtggtgg 780

tcacgtcctg ggaggagcag aaatttgtcc agcaccacat aggccctgtg aacacctgga 840

tgggcctcca cgaccaaaac gggccctgga agtgggtgga cgggacggac tacgagacgg 900

gcttcaagaa ctggaggccg gagcagccgg acgactggta cggccacggg ctcggaggag 960

gcgaggactg tgcccacttc accgacgacg gccgctggaa cgacgacgtc tgccagaggc 1020

cctaccgctg ggtctgcgag acagagctgg acaaggccag ccaggagcca cctctccttt 1080

aatttatttc ttcaatgcct cgacctgccg caggggtccg ggattgggaa tccgcccatc 1140

tgggggcctc ttctgctttc tcgggaattt tcatctagga ttttaaggga aggggaagga 1200

tagggtgatg ttccgaaggt gaggagcttg aaacccgtgg cgctttctgc agtttgcagg 1260

ttatcattgt gaactttttt tttttaagag taaaaagaaa tatacctaaa 1310

<210> 37

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG1重链恒定区

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人Ig κ轻链恒定区

<400> 38

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

Claims (15)

1.结合至ASGR1的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体抑制或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1的内吞，所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区并且选自以下任一抗体：

（a）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO: 4-6所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 7-9所示的序列；

（b）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:10-12所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 13-15所示的序列；

（c） 所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:16-18所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 19-21所示的序列；

（d）所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，分别包含SEQ ID NO:22-24所示的序列，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，分别包含SEQ ID NO: 25-27所示的序列；

（e）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的序列；

（f）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的序列；

（g）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:32所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的序列；以及

（h）所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35所示的序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化抗体或嵌合抗体。

3.一种药物组合物，其包含治疗有效量的ASGR1抑制剂、治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

4.一种药盒，其包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包括治疗有效量的ASGR1抑制剂和药学上可接受的载体，所述第二药物组合物包括治疗有效量的第二降脂药以及药学上可接受的载体。

5.ASGR1抑制剂与第二降脂药的组合在制备用于降低血液中胆固醇和/或甘油三酯的水平或用于治疗和/或预防心血管病的药物中的应用。

6.根据权利要求3至5任一项所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述ASGR1抑制剂选自抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段、靶向ASGR1的编码核酸的核酸、靶向ASGR1的核酸适配体以及它们的组合。

7.根据权利要求6所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述抗ASGR1单克隆抗体结合至SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列并抑制或阻断ASGR1与其天然配体的结合和/或ASGR1的内吞。

8.根据权利要求6所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述抗ASGR1单克隆抗体或其抗原结合片段为权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求3至5任一项所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述第二降脂剂为HMGCR抑制剂、ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂、NPC1L1抑制剂或PCSK9抑制剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述HMGCR抑制剂为他汀类药物。

11.根据权利要求10所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述他汀类药物是阿托伐他汀。

12.根据权利要求9所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂为贝派地酸。

13.根据权利要求9所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述NPC1L1抑制剂为依折麦布。

14.根据权利要求9所述的药物组合物、药盒或应用，其中所述PCSK9抑制剂是Evolocumab、Alirocumab或Inclisiran。

15.根据权利要求5所述的应用，其中所述心血管病选自动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞和冠状动脉疾病。