JP2024516096A - 終末糖化産物受容体の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、その組成物、及び使用方法 - Google Patents

終末糖化産物受容体の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤、その組成物、及び使用方法 Download PDF

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Abstract

終末糖化産物受容体（ＡＧＥＲ又はＲＡＧＥ）遺伝子を阻害するためのＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤を含む組成物、及び方法が記載される。本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤及びＲＮＡｉ剤コンジュゲートは、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害する。１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、任意選択で１つ以上の更なる治療薬と共に含む医薬組成物も記載される。記載されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤をインビボで肺細胞に送達することにより、ＡＧＥＲ遺伝子発現の阻害及び膜型ＲＡＧＥ活性の低減がもたらされ、これは重症喘息などの肺炎症疾患を含む様々な疾患の処置に関して、対象、例えばヒト対象に治療上の利益を提供することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月０８日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，３０１号及び２０２２年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／３２２，６０３号の優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーはＳＥＱＬＩＳＴ＿３０６９１．ｔｘｔという名称であり、サイズは２２３ｋｂである。
本開示は、終末糖化産物受容体（「ＲＡＧＥ」又は「ＡＧＥＲ」）遺伝子発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物、及びその使用方法に関する。
終末糖化産物受容体（「ＲＡＧＥ」又は「ＡＧＥＲ」）は、炎症性パターン認識受容体として機能する免疫グロブリンスーパーファミリーの３５キロダルトンの膜貫通タンパク質である。その全長の膜結合形態において、受容体は、３つの機能的ドメイン：細胞外リガンド結合ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及びリガンド依存性シグナル伝達を媒介する細胞質ドメインを有する。第２の非膜結合可溶形態の受容体（ｓＲＡＧＥ）は、細胞外リガンド結合ドメインのみを含有し、これは全長膜結合型ＲＡＧＥのタンパク質分解性切断によって（又は選択的スプライシングによって）形成され、ｓＲＡＧＥは、リガンドに結合するが細胞質シグナル伝達ドメインを欠くため、ＲＡＧＥ機能に拮抗する。
ＲＡＧＥは、肺内で、構成的に高レベルで発現され、主に１型肺胞上皮細胞に局在する。体内の他の組織は、通常、低レベルでＲＡＧＥを発現するが、ＲＡＧＥリガンド及び慢性炎症の存在下で発現は上方制御される。パターン認識受容体として、ＲＡＧＥは、終末糖化産物（糖修飾タンパク質又は脂質）、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、及びＳ１００タンパク質を含む多種多様な内因性リガンドに結合する。異なる中間シグナル伝達経路は、異なるＲＡＧＥリガンド（例えば、ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ）によって活性化され得、反応性酸素種の産生、ＮＦ－κＢの持続的活性化、及び炎症性遺伝子（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦα）の転写をもたらす。ＲＡＧＥ自体をコードする遺伝子の転写は、ＮＦ－κＢによって促進され、慢性炎症を持続させる正のフィードバックループを作り出す。
ＲＡＧＥは、肺疾患（喘息、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、肺炎、肺癌、気管支肺異形成症）、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患）、がん、糖尿病、慢性腎疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む特定のウイルス感染によって引き起こされる損傷、特定の眼炎症状態、及び骨格筋消耗を含む多くの疾患の一因となる慢性的な病的炎症に関係している。
肺疾患の領域において、ＲＡＧＥノックアウト（ＫＯ）マウスは、ハウスダストのダニアレルゲン又はオボアルブミンによるチャレンジによって生じるアレルギー性喘息から、生理学的及び組織学的に完全に保護される。同様に、ＲＡＧＥノックアウトマウスは、過酸素症又はリポ多糖誘導性急性肺損傷及び炎症から保護される。（例えば、Ｏｃｚｙｐｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｖ．，２３：４０－４９ （２０１７）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ，５０：４７２－４８２ （２０１８）を参照のこと）。ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、バリアント機能獲得型ＲＡＧＥ対立遺伝子（Ｇ８２Ｓ）を、炎症の増加、肺機能の低下、及び喘息のリスクに関連付けた（例えば、Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．，４２：４５－５２ （２０１０）；Ｒｅｐａｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．，４２：３６－４４ （２０１０）を参照のこと）。
ＲＡＧＥは創薬ターゲットとして潜在的に魅力的であるにもかかわらず、強力かつ選択的なＲＡＧＥ阻害剤の開発は非常に困難であることが示されている。多種多様なＲＡＧＥリガンドは、別個のドメインに結合するのではなく、抗体様細胞外ドメイン内の複数の結合部位と相互作用する（例えば、Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０：３４０－３４６ （２０１９））を参照のこと）。ＲＡＧＥの発現をインビトロで阻害することができる特定のＲＮＡｉ剤は、以前に同定されており、様々な研究において報告されており、又はそうでなくても市販されているが、既知のＲＮＡｉ剤構築物は、治療薬候補として実現性のあるほど十分に強力でもなく、十分に特異的でもない。したがって、ＲＡＧＥ関連疾患及び障害の処置における治療薬としての使用に適したＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤が必要とされている。
治療薬又は医薬としての使用を含む、ＲＡＧＥ（ＡＧＥＲ）遺伝子の発現を選択的かつ効率的に阻害することができる新規なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉトリガー、又はトリガーと称される）、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が継続して必要とされている。更に、ＡＧＥＲ遺伝子発現及び／又はＲＡＧＥ受容体レベルの低減によって少なくとも部分的に媒介され得る病的炎症及び／又は障害に関連する疾患又は障害を処置するための新規なＲＡＧＥ特異的ＲＮＡｉ剤の組成物が必要とされている。
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のヌクレオチド配列及び化学修飾、並びに該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤をインビボで選択的かつ効率的に送達するのに適した特定の特異的標的化リガンドとの該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の組み合わせは、以前に開示されたもの又は当該技術分野で公知のものとは異なる。例えば、本明細書の様々な実施例に示されるように、開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現の非常に強力的かつ効率的な阻害を提供する。
概して、本開示は、ＲＡＧＥ遺伝子特異的ＲＮＡｉ剤、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物、並びに本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤及びＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物を使用してＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現をインビトロで及び／又はインビボで阻害する方法を特徴とする。本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を選択的かつ効率的に低下又は阻害することができ、それによって、ＲＡＧＥ受容体の発現を低減し、ＮＦ－κＢを含むＲＡＧＥ受容体シグナル伝達の活性化を低下させ、最終的に炎症の低減をもたらす。
記載されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、様々な肺疾患（喘息、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、肺炎、肺癌、気管支肺異形成症）、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患）、がん、糖尿病、慢性腎疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む特定のウイルス感染によって引き起こされる炎症性損傷、特定の眼炎症状態、及び骨格筋消耗を含むが、これらに限定されない症状及び疾患の治療的処置（防止的又は予防的処置を含む）のための方法において使用することができる。
一態様において、本開示は、ＲＡＧＥ（ＡＧＥＲ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、センス鎖（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を含む、ＲＮＡｉ剤を特徴とする。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに部分的に、実質的に、又は完全に相補的であり得る。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤センス鎖の長さは、各々１５～４９ヌクレオチド長であり得る。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖の長さは、各々１８～４９ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１８～２６ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さ又は異なる長さのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、独立して、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖は、独立して、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチド長である。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤は、肺細胞などのＲＡＧＥを発現する細胞（より具体的には、１型肺胞上皮細胞を含む）に送達されると、１つ以上のＡＧＥＲ遺伝子バリアントの発現をインビボで及び／又はインビトロで阻害する。
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヒトＡＧＥＲ遺伝子（例えば、配列番号１を参照）を標的化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表１に開示される配列のいずれかの配列を有するＡＧＥＲ遺伝子の一部分を標的化する。
別の態様において、本開示は、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を選択的かつ効率的に低下させることができる開示されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の１つ以上を含む、医薬組成物を含む組成物を特徴とする。本明細書に記載される１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、ＲＡＧＥ受容体活性に関連する症状及び疾患の処置（予防的処置又は阻害を含む）のために、対象、例えばヒト又は動物対象に投与することができる。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤において使用することができるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖の例は、表３、表４、表５、及び表６に提供される。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤二本鎖の例は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０に提供される。本明細書に開示される特定のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなり得るか、又はそれらに含まれ得る１９ヌクレオチドのコアストレッチ配列の例は、表２に提供される。
別の態様において、本開示は、対象、例えば哺乳動物における肺上皮細胞にＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤をインビボで送達するための方法を特徴とする。そのような方法において使用するための組成物も本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を対象にインビボで肺細胞（上皮細胞、マクロファージ、平滑筋、内皮細胞、及び好ましくは１型肺胞上皮細胞を含む）に送達するための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、対象はヒト対象である。
本明細書に開示される方法は、当該技術分野で公知の任意の好適な手段による、対象、例えばヒト又は動物対象への１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投与を含む。１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む本明細書に開示される医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかに応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、真皮下（例えば、埋め込み型装置を介して）、及び実質内投与であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、吸入（乾燥粉末吸入又はエアロゾル吸入など）、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔咽頭吸引投与によって投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、肺上皮におけるＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害することが望まれ、そのために、投与は吸入によって行われる（例えば、定量吸入器などの吸入デバイス、又はジェット式若しくは振動メッシュ式ネブライザーなどのネブライザー、又はソフトミスト吸入器による）。
１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、当該技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して標的細胞又は組織に送達することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を標的化基に共有結合させることによって細胞又は組織に送達される。いくつかの実施形態において、標的化基は、インテグリン標的化リガンドなどの細胞受容体リガンドを含むことができる。インテグリンは、細胞－細胞外マトリックス（ＥＣＭ）接着を促進する膜貫通受容体のファミリーである。特に、インテグリンアルファ－ｖ－ベータ－６（αｖβ６）は、ＥＣＭタンパク質及びＴＧＦ－ベータ潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）の受容体であることが知られている上皮特異的インテグリンであり、様々な細胞及び組織において発現される。インテグリンαｖβ６は、損傷した肺上皮において高度に上方制御されることが知られている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、インテグリンαｖβ６に対する親和性を有するインテグリン標的化リガンドに連結されている。本明細書で言及される場合、「αｖβ６インテグリン標的化リガンド」は、インテグリンαｖβ６に対する親和性を有する化合物であり、これは、所望の細胞及び／又は組織（すなわち、インテグリンαｖβ６を発現する細胞）に結合されるＲＮＡｉ剤の標的化及び送達を容易にするためのリガンドとして利用され得る。いくつかの実施形態において、複数のαｖβ６インテグリン標的化リガンド又はαｖβ６インテグリン標的化リガンドのクラスターは、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤に連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤－αｖβ６インテグリン標的化リガンドコンジュゲートは、受容体媒介エンドサイトーシスを介して、又は他の手段によって、肺上皮細胞により選択的に内在化される。
αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含むＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を送達するのに有用な標的化基の例は、例えば、国際公開第２０１８／０８５４１５号及び国際公開第２０１９／０８９７６５号に開示されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
標的化基は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’又は５’末端に連結され得る。いくつかの実施形態において、標的化基は、センス鎖の３’又は５’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、標的化基は、センス鎖の５’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、標的化基は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖上のヌクレオチドに内部的に連結されている。いくつかの実施形態において、標的化基は、リンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結されている。
別の態様において、本開示は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０に開示される二本鎖構造を有する１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物を特徴とする。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の使用は、ＲＡＧＥ受容体活性の低減により治療上の利益を提供することができる、疾患又は障害の治療的（予防的を含む）処置のための方法を提供する。本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、様々な呼吸器疾患、例えば肺疾患（喘息、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、肺炎、肺癌、気管支肺異形成症）、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患）、がん、糖尿病、慢性腎疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む特定のウイルス感染によって引き起こされる損傷、特定の眼炎症状態、及び骨格筋消耗を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、肺の炎症性疾患又は状態を処置するために使用され得る。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は更に、例えば、様々な眼の炎症性疾患及び障害を処置するために使用され得る。このような処置方法は、ＲＡＧＥ受容体レベル又はＲＡＧＥ受容体活性が望ましいレベルを超えて上昇又は増強したヒト又は動物へのＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投与を含む。
本明細書に記載される一態様は、終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
（ｉ）表３に提供される配列のいずれか１つと０又は１ヌクレオチド異なる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、
（ｉｉ）該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｉｉｉ）１つ以上の標的化リガンドと、
を含む、ＲＮＡｉ剤である。
別の態様において、終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤であって、
（ｉ）終末糖化産物受容体遺伝子（配列番号１）に少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖と、
（ｉｉ）該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖と、
（ｉｉｉ）該センス鎖に連結された標的化リガンドと、
を含む、ＲＮＡｉ剤について記載される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）と１ヌクレオチド以下異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号７は該アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）と１ヌクレオチド以下異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。当業者であれば明確に理解するように、本明細書に開示される修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合を含むことは、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合の代わりとなる（例えば、全てのヌクレオシド間結合を示す図１１Ａ～図１１Ｊを参照のこと）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）と１ヌクレオチド以下異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）と１ヌクレオチド以下異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号８は該アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）と１ヌクレオチド以下異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。当業者であれば明確に理解するように、本明細書に開示される修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合を含むことは、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合の代わりとなる（例えば、全てのヌクレオシド間結合を示す図１１Ａ～図１１Ｊを参照のこと）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）と１ヌクレオチド以下異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号７は該アンチセンス鎖の１～２１位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）と１ヌクレオチド以下異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。当業者であれば明確に理解するように、本明細書に開示される修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合を含むことは、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合の代わりとなる（例えば、全てのヌクレオシド間結合を示す図１１Ａ～図１１Ｊを参照のこと）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）と１ヌクレオチド以下異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し、センス鎖は、アンチセンス鎖に少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を更に含み；該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を更に含み；該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；該センス鎖はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆位脱塩基残基を更に含み、該センス鎖はまた、５’末端に共有結合している標的化リガンドであって、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含む、標的化リガンドも含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を更に含み；該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；該センス鎖はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆位脱塩基残基を更に含み、該センス鎖はまた、５’末端に共有結合している標的化リガンドであって、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含む、標的化リガンドも含み；対応するアンチセンス鎖配列はアンチセンス鎖の１～２１位に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）ペア：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）及び
ＣＧＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号１９）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）及び
ＡＧＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号２１）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）及び
ＧＡＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号２０）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）ペア：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）及び
ＣＧＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号１９）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）及び
ＡＧＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号２１）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）及び
ＧＡＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号２０）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；該センス鎖はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆位脱塩基残基を更に含み、該センス鎖はまた、５’末端に共有結合している標的化リガンドであって、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含む、標的化リガンドも含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）；
ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）；
ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）；
ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）；
ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し；該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を更に含み；該センス鎖のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）；
ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）；
ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）；
ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）；
ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含み、該ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖を更に含み；該センス鎖のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；該アンチセンス鎖及び該センス鎖の両方のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり；該センス鎖はヌクレオチド配列の３’末端及び５’末端に逆位脱塩基残基を更に含み、該センス鎖はまた、５’末端に共有結合している標的化リガンドであって、インテグリン受容体に対して親和性を有する化合物を含む、標的化リガンドも含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列ペア（５’→３’）：
ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）及び
ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａ（配列番号１３）；
ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）及び
ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａ（配列番号１３）；
ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）及び
ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａ（配列番号１４）；
ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）及び
ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａ（配列番号１４）；並びに
ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）及び
ａｓｇｇｃａａｕｇＡｆＡｆＣｆａｇｇａａｕｉｇａａ（配列番号１５）；
のうちの１つからなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ、ｉ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、イノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し；ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）は、図１に示される化学構造を有する三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し；センス鎖はまた、インテグリン受容体に対する親和性を有する標的化リガンドも含み、該標的化リガンドは任意選択でセンス鎖の５’末端に連結される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下の配列ペア（５’→３’）：
ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）及び
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番
号１０）；
ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）及び
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号１０）；
ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）及び
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号１１）；
ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）及び
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号１１）；並びに
ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）及び
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ａｓｇｇｃａａｕｇＡｆＡｆＣｆａｇｇａａｕｉｇａａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号１２）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ、ｉ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、イノシン及びウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンを表し、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）は、図１に示される化学構造を有する三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドを表し；（ｉｎｖＡｂ）は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドを表し（表１１も参照のこと）、ｓは、ホスホロチオエート結合を表す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号６９）；及び
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号６９）；及び
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号６９）；及び
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列と０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり、配列番号５５、配列番号６９、及び配列番号６５は、それぞれアンチセンス鎖のヌクレオチド１～１９位（５’→３’）に位置する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）及びＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号２９８）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号６９）；及びＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号３１６）；又は
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）及びＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号３０８）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列ペアと０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列を各々が含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）及びＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号２９８）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号６９）；及びＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号３１６）；又はＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）及びＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号３０８）；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列ペアと０又は１核酸塩基異なる核酸塩基配列を各々が含むアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、該ヌクレオチドの全て又は実質的に全ては修飾ヌクレオチドである。
定義
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、その各々は、独立して修飾されていても修飾されていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」（「ＲＮＡｉトリガー」とも呼ばれる）は、配列特異的様式で標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の翻訳を分解又は阻害する（例えば、適切な条件下で分解又は阻害する）ことができるＲＮＡ又はＲＮＡ様（例えば、化学修飾ＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含有する組成物を意味する。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉機構（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又はＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）を介して、又は任意の代替機構若しくは経路によって作用し得る。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用される場合、主にＲＮＡ干渉機構を介して作用すると考えられるが、本開示のＲＮＡｉ剤は、任意の特定の経路又は作用機構に束縛されることもそれらに限定されることもない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖から構成され、短鎖（又は小分子）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的化されるｍＲＮＡ（すなわち、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ）に対して少なくとも部分的に相補的である。ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／又は１つ以上の非ホスホジエステル結合を含むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「サイレンシング」、「低減」、「阻害」、「ダウンレギュレート」、又は「ノックダウン」は、所与の遺伝子の発現を指す場合、遺伝子から転写されるＲＮＡのレベル、又は遺伝子が転写される細胞、細胞群、組織、器官、若しくは対象におけるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、タンパク質、若しくはタンパク質サブユニットのレベルによって測定される遺伝子の発現が、細胞、細胞群、組織、器官、若しくは対象が本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤で処置された場合、そのように処置されていない第２の細胞、細胞群、組織、器官、若しくは対象と比較して低減されることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「配列」及び「ヌクレオチド配列」は、標準的な命名法を使用して文字の連続で記載される核酸塩基又はヌクレオチドの連続又は順序を意味する。
本明細書で使用される場合、「塩基」、「ヌクレオチド塩基」又は「核酸塩基」は、ヌクレオチドの成分である複素環式ピリミジン又はプリン化合物であり、一級プリン塩基アデニン及びグアニン、並びに一級ピリミジン塩基シトシン、チミン、及びウラシルが挙げられる。核酸塩基は更に修飾され得、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基が挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８を参照のこと）。そのような修飾核酸塩基（修飾核酸塩基を含むホスホラミダイト化合物を含む）の合成は、当該技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、及び別途示されない限り、用語「相補的」は、第１の核酸塩基又はヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤センス鎖又は標的ｍＲＮＡ）を第２の核酸塩基又はヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖又は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）に関連して記載するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがハイブリダイズする（哺乳動物の生理学的条件（又は他の適切なインビボ又はインビトロ条件）下で塩基対水素結合を形成する）能力、及び特定の標準的な条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと二本鎖又は二重らせん構造を形成する能力を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション試験に最も適切な条件のセットを選択することができるであろう。相補的配列は、ワトソン－クリック塩基対又は非ワトソン－クリック塩基対を含み、少なくとも上記のハイブリダイゼーション要件が満たされる程度まで、天然又は修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物を含む。配列同一性又は相補性は、修飾とは無関係である。例えば、本明細書で定義されるａ及びＡｆは、同一性又は相補性を決定する目的で、Ｕ（又はＴ）に相補的であり、Ａに同一である。
本明細書で使用される場合、「完全に相補的」又は「十分に相補的」とは、核酸塩基又はヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続配列中の塩基の全て（１００％）が、第２のオリゴヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全て又は一部を含み得る。
本明細書で使用される場合、「部分的に相補的」とは、核酸塩基又はヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続配列中の塩基の少なくとも７０％（全てではない）が、第２のオリゴヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全て又は一部を含み得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、核酸塩基又はヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続配列中の塩基の少なくとも８５％（全てではない）が、第２のオリゴヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続配列は、第１又は第２のヌクレオチド配列の全て又は一部を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」、「十分に相補的」、「部分的に相補的」、及び「実質的に相補的」は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖との間、又はＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖とＡＧＥＲ ｍＲＮＡの配列との間でマッチする核酸塩基又はヌクレオチドに関して使用される。
本明細書で使用される場合、核酸配列に適用される「実質的に同一」又は「実質的な同一性」という用語は、ヌクレオチド配列（又はヌクレオチド配列の一部分）が、参照配列と比較して、少なくとも約８５％以上の配列同一性、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有することを意味する。配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される。パーセンテージは、同じタイプの核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書に開示される発明は、本明細書に開示されるものと実質的に同一のヌクレオチド配列を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」などは、対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は頻度の軽減又は緩和を提供するために取られる方法又はステップを意味する。本明細書で使用される場合、「処置する」及び「処置」は、予防、管理、予防的処置、並びに／又は対象における疾患の１つ以上の症状の数、重症度、及び／若しくは頻度の阻害若しくは低減を含み得る。
本明細書で使用される場合、語句「細胞に導入すること」は、ＲＮＡｉ剤に言及する場合、ＲＮＡｉ剤を細胞に機能的に送達することを意味する。「機能的送達」という語句は、ＲＮＡｉ剤が予想される生物学的活性、例えば、遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを可能にする様式でＲＮＡｉ剤を細胞に送達することを意味する。
別段の記載がない限り、本明細書で使用される記号
の使用は、本明細書に記載される本発明の範囲に従う任意の基がそれに連結され得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「異性体」は、同一の分子式を有するが、それらの原子の結合の性質若しくは順序、又は空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物を指す。空間におけるそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。互いに鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は、「鏡像異性体」又は場合により光学異性体と呼ばれる。４つの同一でない置換基に結合した炭素原子は、「キラル中心」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、不斉中心が存在し、したがって鏡像異性体、ジアステレオマー、又は他の立体異性配置を生じる各構造について、構造において特定の立体配座を有すると具体的に特定されない限り、本明細書に開示される各構造は、それらの光学的に純粋な形態及びラセミ形態を含む、全てのそのような可能な異性体を表すことが意図される。例えば、本明細書に開示される構造は、ジアステレオマーの混合物及び単一の立体異性体を包含することが意図される。
本明細書の特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」という句は、特許請求の範囲に明記されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書の特許請求の範囲において使用される場合、「から本質的になる」という句は、特許請求の範囲を、特定の材料又はステップ、並びに特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
当業者であれば、本明細書に開示される化合物及び組成物は、化合物又は組成物が置かれる環境に応じて、プロトン化又は脱プロトン化状態の特定の原子（例えば、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子）を有し得ることを容易に理解及び認識するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、本明細書に開示される構造は、例えば、ＯＨ、ＳＨ、又はＮＨなどの特定の官能基がプロトン化又は脱プロトン化され得ることを想定する。本明細書における開示は、当業者によって容易に理解されるように、環境（ｐＨなど）に基づくプロトン化の状態に関係なく、開示された化合物及び組成物を包含することが意図される。対応して、不安定なプロトン又は塩基性原子を有する本明細書に記載される化合物はまた、対応する化合物の塩形態も表すと理解されたい。本明細書に記載される化合物は、遊離酸であっても、遊離塩基であっても、塩形態であってもよい。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内であると理解されたい。
本明細書で使用される場合、２つの化合物又は分子間の接続に関して言及する際の用語「連結された」又は「コンジュゲートされた」とは、２つの化合物又は分子が共有結合によって結合されることを意味する。記載されない限り、本明細書で使用される用語「連結された」及び「コンジュゲートされた」は、任意の介在原子又は原子団を伴うか又は伴わない第１の化合物と第２の化合物との間の接続を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「含む（including）」は、句「含むが、これに限定されない」を意味するために本明細書で使用され、句「含むが、これに限定されない」と互換的に使用される。文脈が明確に別様に示さない限り、用語「又は」は、用語「及び／又は」を意味するために本明細書で使用され、用語「及び／又は」と互換的に使用される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するものとする。更に、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本発明の他の目的、特徴、態様、及び利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本明細書においてＴｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）と呼ばれる三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造を表す。
本明細書においてαｖβ６－ｐｅｐ１と呼ばれるペプチドαｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造を表す。
遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。
ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ０００２９２の化学構造を表す。
遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。
ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６６の化学構造を表す。
遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６７の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６７の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６７の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６７の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６７の化学構造を表す。
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遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 遊離酸として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。
ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。 ナトリウム塩として示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートＡＣ００１２６８の化学構造を表す。
センス鎖の５’末端に三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドが連結された、ＡＣ０００２８６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。 以下の略語が図１１Ａ～１１Ｊにおいて使用される：ａ、ｃ、ｇ、ｉ及びｕは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｏは、ホスホジエステル結合であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ｉｎｖＡｂは、逆位脱塩基残基であり（例えば表１１を参照のこと）、ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジン修飾ヌクレオチドであり（例えば表１１を参照のこと）、Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）は、図１に示される構造を有する三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドであり、（ＴｒｉＡｌｋ１４）は、標的化リガンドへのその後のカップリングに好適な表１１に示される連結基である（本明細書の実施例１も参照のこと）。
センス鎖の５’末端に三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドが連結された、ＡＣ０００２９２の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドが連結された、ＡＣ００１２６６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドが連結された、ＡＣ００１２６７の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドが連結された、ＡＣ００１２６８の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）リンカーを有する、ＡＤ０７４７４の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤二本鎖の修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）リンカーを有する、ＡＣ０００２８６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）リンカーを有する、ＡＣ０００２８６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）リンカーを有する、ＡＣ０００２８６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
センス鎖の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）リンカーを有する、ＡＣ０００２８６の構造を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの修飾センス鎖及びアンチセンス鎖（例えば、表８及び表１０を参照のこと）の概略図である。
ＲＮＡｉ剤
ＡＧＥＲ（又はＲＡＧＥ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤（本明細書においてＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉトリガーと呼ばれる）が、本明細書に記載される。本明細書に開示される各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤センス鎖の長さは、各々１５～４９ヌクレオチド長であり得る。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖の長さは、各々１８～４９ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１８～２６ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さ又は異なる長さのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して２１～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、独立して、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス鎖は、独立して、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、又は４９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチドの二本鎖長を有する。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の形成に使用されるヌクレオチド配列の例は、表２、表３、表４、表５、表６、及び表１０に提供される。表２、３、４、５、６のセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列を含むＲＮＡｉ剤二本鎖の例は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０に示される。
いくつかの実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖との間の完全に、実質的に、又は部分的に相補性の領域は、１５～２６（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６）ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の５’末端又はその近くで生じる（例えば、この領域は、完全に、実質的に、又は部分的に相補的ではない０、１、２、３、又は４個のヌクレオチドによって、アンチセンス鎖の５’末端から分離し得る）。
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ中の同じ数のヌクレオチドのコアストレッチ配列（本明細書において「コアストレッチ」又は「コア配列」とも呼ばれる）に対して少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンス鎖中のコアストレッチ配列に対して１００％（完全に）相補的又は少なくとも約８５％（実質的に）相補的であり、したがって、センス鎖コアストレッチ配列は、典型的には、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ標的中に存在する同じ長さのヌクレオチド配列（例えば、標的配列と呼ばれることがある）に完全に同一又は少なくとも約８５％同一である。いくつかの実施形態において、このセンス鎖コアストレッチは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、このセンス鎖コアストレッチは、１７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、このセンス鎖コアストレッチは、１９ヌクレオチド長である。
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ中の同じ数のヌクレオチドのコアストレッチに対して、及び対応するセンス鎖中の同じ数のヌクレオチドのコアストレッチに対して少なくとも８５％の相補性を有する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖コアストレッチは、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ標的に存在する同じ長さのヌクレオチド配列（例えば、標的配列）に対して１００％（完全に）相補的又は少なくとも約８５％（実質的に）相補的である。いくつかの実施形態において、このアンチセンス鎖コアストレッチは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、このアンチセンス鎖コアストレッチは、１９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、このアンチセンス鎖コアストレッチは、１７ヌクレオチド長である。センス鎖コアストレッチ配列は、対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであり得るか、又は異なる長さであり得る。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、アニーリングして二本鎖を形成する。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに部分的に、実質的に、又は完全に相補的であり得る。相補的二本鎖領域内で、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンスコアストレッチ配列に対して少なくとも８５％相補的又は１００％相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の対応する１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％又は１００％相補的である、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３ヌクレオチドの配列を含有する（すなわち、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス及びアンチセンスコアストレッチ配列は、少なくとも８５％塩基対形成する又は１００％塩基対形成する少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３ヌクレオチドの領域を有する）。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２又は表３のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２、表４、表５、表６、又は表１０のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。
いくつかの実施形態において、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、任意選択でかつ独立して、コアストレッチ配列の３’末端、５’末端、又は３’末端と５’末端の両方に、追加の１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド（伸長部）を含むことができる。アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ中の対応する配列に対して相補的であってもなくてもよい。センス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ中の対応する配列と同一であってもなくてもよい。アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合、対応するセンス鎖の追加のヌクレオチド（存在する場合）に対して相補的であってもなくてもよい。
本明細書で使用される場合、伸長部は、センス鎖コアストレッチ配列及び／又はアンチセンス鎖コアストレッチ配列の５’及び／又は３’末端に１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。センス鎖上の伸長部ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中のヌクレオチド（コアストレッチ配列ヌクレオチド又は伸長部ヌクレオチドのいずれか）に対して相補的であってもなくてもよい。逆に言うと、アンチセンス鎖上の伸長部ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のヌクレオチド（コアストレッチヌクレオチド又は伸長部ヌクレオチドのいずれか）に対して相補的であってもなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、３’伸長部及び５’伸長部を含む。いくつかの実施形態において、一方の鎖の３’伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、他方の鎖の５’伸長部ヌクレオチドの１つ以上と塩基対を形成する。他の実施形態において、一方の鎖の３’伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、他方の鎖の５’伸長部ヌクレオチドの１つ以上と塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、３’伸長部を有するアンチセンス鎖と、５’伸長部を有するセンス鎖とを有する。いくつかの実施形態において、伸長部ヌクレオチドは、不対であり、オーバーハングを形成する。本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤のハイブリダイズされた部分又は二本鎖部分の一部を形成しないセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端に位置する１つ以上の不対ヌクレオチドのストレッチを指す。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド長の３’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１、２、又は３ヌクレオチド長の３’伸長部を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、対応するＡＧＥＲ ｍＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、対応するＡＧＥＲ ｍＲＮＡ配列に対して相補的でないヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、又は５ヌクレオチド長の３’伸長部を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、アデノシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド、若しくはチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、又はＡＧＥＲ ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するか若しくは同一であるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、３’センス鎖伸長部は、以下の配列：Ｔ、ＵＴ、ＴＴ、ＵＵ、ＵＵＴ、ＴＴＴ、又はＴＴＴＴ（各々５’から３’で記載）のうちの１つを含むか又はそれからなるが、これらに限定されない。
センス鎖は、３’伸長部及び／又は５’伸長部を有し得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド長の５’伸長部を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖伸長部ヌクレオチドの１つ以上は、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するか又は同一であるヌクレオチドを含む。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を形成する際に使用される配列の例は、表２、表３、表４、表５、表６、及び表１０に提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２、表３、又は表１０の配列のいずれかの配列を含む。特定の実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表３の修飾配列のいずれか１つを含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７、２～１５、２～１７、１～１８、２～１８、１～１９、２～１９、１～２０、２～２０、１～２１、又は２～２１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２、表４、表５、又は表６の配列のいずれかの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２、表４、表５、又は表６の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１８、１～１９、１～２０、１～２１、２～１９、２～２０、２～２１、３～２０、３～２１、又は４～２１の配列を含む。特定の実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表４、表５、表６、又は表１０の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖３’末端及びアンチセンス鎖５’末端は、平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両末端は平滑末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端も平滑末端ではない。本明細書で使用される場合、「平滑末端」は、２本のアニーリングされた鎖の末端ヌクレオチドが相補的である（相補的塩基対を形成する）二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、ほつれた（frayed）末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖３’末端及びアンチセンス鎖５’末端は、ほつれた末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の両末端は、ほつれた末端を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端もほつれた末端ではない。本明細書で使用される場合、ほつれた末端は、２本のアニーリングされた鎖の末端ヌクレオチドが対を形成する（すなわち、オーバーハングを形成しない）が、相補的ではない（すなわち、非相補的対を形成する）二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の末端における１つ以上の不対ヌクレオチドは、オーバーハングを形成する。不対ヌクレオチドはセンス鎖上にあってもアンチセンス鎖上にあってもよく、３’オーバーハング又は５’オーバーハングのいずれかを形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、平滑末端及びほつれた末端、平滑末端及び５’オーバーハング末端、平滑末端及び３’オーバーハング末端、ほつれた末端及び５’オーバーハング末端、ほつれた末端及び３’オーバーハング末端、２つの５’オーバーハング末端、２つの３’オーバーハング末端、５’オーバーハング末端及び３’オーバーハング末端、２つのほつれた末端、又は２つの平滑末端を含む。典型的には、存在する場合、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置する。
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤はまた、１つ以上の修飾ヌクレオチドから構成され得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、及びＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾ヌクレオチドである。本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合、例えば１つ以上のホスホロチオエート結合から更に構成されてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含有する。いくつかの実施形態において、２’－修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合と組み合わされる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、又は遊離酸として調製又は提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、薬学的に許容される塩として調製される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、薬学的に許容されるナトリウム塩として調製される。当該技術分野において周知であるこのような形態は、本明細書に開示される本発明の範囲内である。
修飾ヌクレオチド
修飾ヌクレオチドは、種々のオリゴヌクレオチド構築物において使用される場合、細胞における化合物の活性を維持し、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることができ、またオリゴヌクレオチド構築物の投与後にヒトにおいてインターフェロン活性が活性化される可能性を最小限にすることもできる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有する。本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’－ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）は、修飾ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド模倣物、脱塩基ヌクレオチド、２’－修飾ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド、修飾核酸塩基を含むヌクレオチド、架橋ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’，３’－セコヌクレオチド模倣物（アンロックド核酸塩基類似体）、ロックドヌクレオチド、３’－Ｏ－メトキシ（２’ヌクレオシド間連結）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、５’－Ｍｅ，２’－フルオロヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド、ビニルホスホネート含有ヌクレオチド、及びシクロプロピルホスホネート含有ヌクレオチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。２’－修飾ヌクレオチド（すなわち、５員糖環の２’位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）としては、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（２’－メトキシヌクレオチドとも呼ばれる）、２’－フルオロヌクレオチド（本明細書及び当該技術分野では２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドとも呼ばれる）、２’－デオキシヌクレオチド、２’－メトキシエチル（２’－Ｏ－２－メトキシルエチル）ヌクレオチド（２’－ＭＯＥとも呼ばれる）、２’－アミノヌクレオチド、及び２’－アルキルヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。所与の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はない。逆に言うと、２つ以上の修飾を、単一のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤に、又は更にはその単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、当該技術分野で公知の方法によって合成及び／又は修飾することができる。１つのヌクレオチドにおける修飾は、別のヌクレオチドにおける修飾とは無関係である。
修飾核酸塩基としては、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（例えば、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル又は５－プロピニルシトシン）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－アルキル（例えば、６－メチル、６－エチル、６－イソプロピル又は６－ｎ－ブチル）誘導体、アデニン及びグアニンの２－アルキル（例えば、２－メチル、２－エチル、２－イソプロピル又は２－ｎ－ブチル）及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、５－ハロウラシル、シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－スルフヒドリル、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ（例えば、５－ブロモ）、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの合成及び天然核酸塩基が挙げられる。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端は、脱塩基残基（Ａｂ）を含むことができ、これは「脱塩基部位」又は「脱塩基ヌクレオチド」とも呼ばれ得る。脱塩基残基（Ａｂ）は、糖部分の１’位で核酸塩基を欠くヌクレオチド又はヌクレオシドである。（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、脱塩基残基は、ヌクレオチド配列の内部に配置することができる。いくつかの実施形態において、Ａｂ又はＡｂＡｂは、アンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。いくつかの実施形態において、センス鎖の５’末端は、１つ以上の追加の脱塩基残基（例えば、（Ａｂ）又は（ＡｂＡｂ））を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＵＵＡｂ、ＵＡｂ、又はＡｂは、センス鎖の３’末端に付加される。いくつかの実施形態において、脱塩基（デオキシリボース）残基は、リビトール（脱塩基リボース）残基で置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの全て又は実質的に全ては、修飾ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中にリボヌクレオチド（未修飾）である４つ以下（すなわち、０、１、２、３、又は４）のヌクレオチドを有するＲＮＡｉ剤である。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであるセンス鎖は、センス鎖中に未修飾リボヌクレオチドである２つ以下（すなわち、０、１、又は２）のヌクレオチドを有するセンス鎖である。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであるアンチセンスセンス鎖は、センス鎖中に未修飾リボヌクレオチドである２つ以下（すなわち、０、１、又は２）のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤の１つ以上のヌクレオチドは、未修飾リボヌクレオチドである。特定の修飾ヌクレオチドの化学構造を本明細書の表１１に記載する。
修飾ヌクレオシド間結合
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の１つ以上のヌクレオチドは、非標準結合又は骨格（すなわち、修飾ヌクレオシド間結合又は修飾骨格）によって連結される。修飾ヌクレオシド間結合又は骨格としては、ホスホロチオエート基（本明細書では小文字「ｓ」として表される）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート又は３’－アルキレンホスホネート）、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート（例えば、３’－アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、又はチオノホスホルアミデート）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノ結合、通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、ボラノホスフェートの２’－５’結合類似体、又はヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’若しくは２’－５’から５’－２’に連結している逆極性を有するボラノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合又は骨格は、リン原子を欠いている。リン原子を欠く修飾ヌクレオシド間結合としては、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間骨格としては、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素を有する他の骨格が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１、２、３、４、５、若しくは６つのホスホロチオエート結合を含有することができるか、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、若しくは６つのホスホロチオエート結合を含有することができるか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方が独立して、１、２、３、４、５、若しくは６つのホスホロチオエート結合を含有することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１、２、３、若しくは４つのホスホロチオエート結合を含有することができるか、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、若しくは４つのホスホロチオエート結合を含有することができるか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方が独立して、１、２、３、若しくは４つのホスホロチオエート結合を含有することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する。いくつかの実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、センス鎖の３’末端から１～３位のヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態において、１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、センス鎖ヌクレオチド配列の５’末端にあり、別のホスホロチオエート結合は、センス鎖ヌクレオチド配列の３’末端にある。いくつかの実施形態において、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、センス鎖の５’末端に位置し、別のホスホロチオエート結合は、センス鎖の３’末端にある。いくつかの実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド間にいかなるホスホロチオエートヌクレオシド間結合も含まないが、５’末端及び３’末端の両方の末端ヌクレオチドと、任意選択で存在する逆位脱塩基残基末端キャップとの間に１つ、２つ、又は３つのホスホロチオエート結合を含有する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、ホスホロチオエート結合を介してセンス鎖に連結される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する。いくつかの実施形態において、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から１～３位のヌクレオチド間、及び５’末端から１９～２１位、２０～２２位、２１～２３位、２２～２４位、２３～２５位、又は２４～２６位のヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態において、３つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から１～４位の間に位置し、第４のホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、アンチセンス鎖の５’末端から２０～２１位の間に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に少なくとも３つ又は４つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する。
キャッピング残基又は部分
いくつかの実施形態において、センス鎖は、当該技術分野で「キャップ」、「末端キャップ」、又は「キャッピング残基」と呼ばれることもある、１つ以上のキャッピング残基又は部分を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「キャッピング残基」は、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤のヌクレオチド配列の１つ以上の末端に組み込むことができる非ヌクレオチド化合物又は他の部分である。キャッピング残基は、場合によっては、例えばエキソヌクレアーゼ分解に対する保護などの特定の有益な特性を有するＲＮＡｉ剤を提供することができる。いくつかの実施形態において、逆位脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）（当該技術分野では「逆位脱塩基部位」とも呼ばれる）が、キャッピング残基として付加される（表１１を参照のこと）。（例えば、Ｆ．Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００３，３１（１１），２７０５－１６を参照のこと）。キャッピング残基は、概ね当該技術分野で公知であり、例えば、逆位脱塩基残基及び炭素鎖、例えば末端Ｃ３Ｈ７（プロピル）、Ｃ６Ｈ１３（ヘキシル）、又はＣ１２Ｈ２５（ドデシル）基を含む。いくつかの実施形態において、キャッピング残基は、センス鎖の５’末端、３’末端のいずれか、又は５’及び３’末端の両方に存在する。いくつかの実施形態において、センス鎖の５’末端及び／又は３’末端は、キャッピング残基として２つ以上の逆位脱塩基デオキシリボース部分を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の３’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の５’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位脱塩基残基又は逆位脱塩基部位は、標的化リガンドとＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の１つ若しくは複数の末端に又はそれらの近くに１つ以上の逆位脱塩基残基又は逆位脱塩基部位を含めることにより、ＲＮＡｉ剤の活性又は他の所望の特性の増強が可能になる。
いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）がセンス鎖の５’末端に付加される。いくつかの実施形態において、１つ以上の逆位脱塩基残基は、標的化リガンドとＲＮＡｉ剤のセンス鎖のヌクレオチド配列との間に挿入することができる。逆位脱塩基残基は、ホスフェート、ホスホロチオエート（例えば、本明細書において（ｉｎｖＡｂ）ｓとして示される）、又は他のヌクレオシド間結合を介して連結され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の１つ若しくは複数の末端に又はそれらの近くに１つ以上の逆位脱塩基残基を含めることにより、ＲＮＡｉ剤の活性又は他の所望の特性の増強が可能になり得る。いくつかの実施形態において、逆位脱塩基（デオキシリボース）残基は、逆位リビトール（脱塩基リボース）残基で置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の３’末端又はアンチセンス鎖配列の３’末端は、逆位脱塩基残基を含んでもよい。逆位脱塩基デオキシリボース残基の化学構造を以下の表１１に示す。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子（例えば、配列番号１（ＮＭ＿００１１３６．５））上の特定の位置を標的化するように設計されている。本明細書で定義されるように、アンチセンス鎖配列は、ＡＧＥＲ遺伝子を該遺伝子上の所与の位置で標的化するように設計され、遺伝子に塩基対合する場合、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基が該遺伝子上のその位置から２１ヌクレオチド下流（３’末端に向かって）にある位置と整列される。例えば、本明細書の表１及び表２に例示されるように、ＡＧＥＲ遺伝子を１７７位で標的化するように設計されたアンチセンス鎖配列は、遺伝子に塩基対合する場合、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基がＡＧＥＲ遺伝子の１９７位と整列されることを必要とする。
本明細書で提供されるように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子との少なくとも８５％の相補性（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の相補性）が存在する限り、アンチセンス鎖の１位（５’→３’）の核酸塩基が遺伝子と相補的であることを必要としない。例えば、ＡＧＥＲ遺伝子の１７７位を標的化するように設計された本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤について、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、遺伝子の１９７位と整列されるべきである。しかしながら、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子との少なくとも８５％の相補性（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の相補性）が存在する限り、ＡＧＥＲ遺伝子の１９７位に相補的であり得るが、そうである必要はない。とりわけ、本明細書に開示される種々の実施例によって示されるように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖による遺伝子の特異的な結合部位（例えば、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤が、ＡＧＥＲ遺伝子を１７７位、９０位、３３０位、又は他のいくつかの位置で標的化するように設計されているかどうか）は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤によって達成される阻害のレベルに対する重要な因子である。（例えば、Ｋａｍｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｎｏｎ－ｓｅｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｒｅ Ａｕｘｉｌｉａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｅｆｆｅｃｔｓ，ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１（１２），Ｆｉｇｕｒｅ １ （２０１５）を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表１に示されるＡＧＥＲ配列の位置の又はその付近のＡＧＥＲ遺伝子を標的化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表１に開示される標的ＲＡＧＥ １９－ｍｅｒ配列に完全に、実質的に、又は少なくとも部分的に相補的であるコアストレッチ配列を含む。
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ終末糖化産物特異的受容体（ＡＧＥＲ）、転写バリアント１、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００１１３６．５（配列番号１）、遺伝子転写物（１４２０塩基）：
１ ａｇａｃａｇａｇｃｃ ａｇｇａｃｃｃｔｇｇ ａａｇｇａａｇｃａｇ ｇａｔｇｇｃｔｇｃｃ ｇｇａａｃａｇｃａｇ ｔｔｇｇａｇｃｃｔｇ
６１ ｇｇｔｇｃｔｇｇｔｃ ｃｔｃａｇｔｃｔｇｔ ｇｇｇｇｇｇｃａｇｔ ａｇｔａｇｇｔｇｃｔ ｃａａａａｃａｔｃａ ｃａｇｃｃｃｇｇａｔ
１２１ ｔｇｇｃｇａｇｃｃａ ｃｔｇｇｔｇｃｔｇａ ａｇｔｇｔａａｇｇｇ ｇｇｃｃｃｃｃａａｇ ａａａｃｃａｃｃｃｃ ａｇｃｇｇｃｔｇｇａ
１８１ ａｔｇｇａａａｃｔｇ ａａｃａｃａｇｇｃｃ ｇｇａｃａｇａａｇｃ ｔｔｇｇａａｇｇｔｃ ｃｔｇｔｃｔｃｃｃｃ ａｇｇｇａｇｇａｇｇ
２４１ ｃｃｃｃｔｇｇｇａｃ ａｇｔｇｔｇｇｃｔｃ ｇｔｇｔｃｃｔｔｃｃ ｃａａｃｇｇｃｔｃｃ ｃｔｃｔｔｃｃｔｔｃ ｃｇｇｃｔｇｔｃｇｇ
３０１ ｇａｔｃｃａｇｇａｔ ｇａｇｇｇｇａｔｔｔ ｔｃｃｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｃａａｔｇａａｃ ａｇｇａａｔｇｇａａ ａｇｇａｇａｃｃａａ
３６１ ｇｔｃｃａａｃｔａｃ ｃｇａｇｔｃｃｇｔｇ ｔｃｔａｃｃａｇａｔ ｔｃｃｔｇｇｇａａｇ ｃｃａｇａａａｔｔｇ ｔａｇａｔｔｃｔｇｃ
４２１ ｃｔｃｔｇａａｃｔｃ ａｃｇｇｃｔｇｇｔｇ ｔｔｃｃｃａａｔａａ ｇｇｔｇｇｇｇａｃａ ｔｇｔｇｔｇｔｃａｇ ａｇｇｇａａｇｃｔａ
４８１ ｃｃｃｔｇｃａｇｇｇ ａｃｔｃｔｔａｇｃｔ ｇｇｃａｃｔｔｇｇａ ｔｇｇｇａａｇｃｃｃ ｃｔｇｇｔｇｃｃｔａ ａｔｇａｇａａｇｇｇ
５４１ ａｇｔａｔｃｔｇｔｇ ａａｇｇａａｃａｇａ ｃｃａｇｇａｇａｃａ ｃｃｃｔｇａｇａｃａ ｇｇｇｃｔｃｔｔｃａ ｃａｃｔｇｃａｇｔｃ
６０１ ｇｇａｇｃｔａａｔｇ ｇｔｇａｃｃｃｃａｇ ｃｃｃｇｇｇｇａｇｇ ａｇａｔｃｃｃｃｇｔ ｃｃｃａｃｃｔｔｃｔ ｃｃｔｇｔａｇｃｔｔ
６６１ ｃａｇｃｃｃａｇｇｃ ｃｔｔｃｃｃｃｇａｃ ａｃｃｇｇｇｃｃｔｔ ｇｃｇｃａｃａｇｃｃ ｃｃｃａｔｃｃａｇｃ ｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇ
７２１ ｇｇａｇｃｃｔｇｔｇ ｃｃｔｃｔｇｇａｇｇ ａｇｇｔｃｃａａｔｔ ｇｇｔｇｇｔｇｇａｇ ｃｃａｇａａｇｇｔｇ ｇａｇｃａｇｔａｇｃ
７８１ ｔｃｃｔｇｇｔｇｇａ ａｃｃｇｔａａｃｃｃ ｔｇａｃｃｔｇｔｇａ ａｇｔｃｃｃｔｇｃｃ ｃａｇｃｃｃｔｃｔｃ ｃｔｃａａａｔｃｃａ
８４１ ｃｔｇｇａｔｇａａｇ ｇａｔｇｇｔｇｔｇｃ ｃｃｔｔｇｃｃｃｃｔ ｔｃｃｃｃｃｃａｇｃ ｃｃｔｇｔｇｃｔｇａ ｔｃｃｔｃｃｃｔｇａ
９０１ ｇａｔａｇｇｇｃｃｔ ｃａｇｇａｃｃａｇｇ ｇａａｃｃｔａｃａｇ ｃｔｇｔｇｔｇｇｃｃ ａｃｃｃａｔｔｃｃａ ｇｃｃａｃｇｇｇｃｃ
９６１ ｃｃａｇｇａａａｇｃ ｃｇｔｇｃｔｇｔｃａ ｇｃａｔｃａｇｃａｔ ｃａｔｃｇａａｃｃａ ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ ｇｇｃｃａａｃｔｇｃ
１０２１ ａｇｇｃｔｃｔｇｔｇ ｇｇａｇｇａｔｃａｇ ｇｇｃｔｇｇｇａａｃ ｔｃｔａｇｃｃｃｔｇ ｇｃｃｃｔｇｇｇｇａ ｔｃｃｔｇｇｇａｇｇ
１０８１ ｃｃｔｇｇｇｇａｃａ ｇｃｃｇｃｃｃｔｇｃ ｔｃａｔｔｇｇｇｇｔ ｃａｔｃｔｔｇｔｇｇ ｃａａａｇｇｃｇｇｃ ａａｃｇｃｃｇａｇｇ
１１４１ ａｇａｇｇａｇａｇｇ ａａｇｇｃｃｃｃａｇ ａａａａｃｃａｇｇａ ｇｇａａｇａｇｇａｇ ｇａｇｃｇｔｇｃａｇ ａａｃｔｇａａｔｃａ
１２０１ ｇｔｃｇｇａｇｇａａ ｃｃｔｇａｇｇｃａｇ ｇｃｇａｇａｇｔａｇ ｔａｃｔｇｇａｇｇｇ ｃｃｔｔｇａｇｇｇｇ ｃｃｃａｃａｇａｃａ
１２６１ ｇａｔｃｃｃａｔｃｃ ａｔｃａｇｃｔｃｃｃ ｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔ ｃｃｃｔｔｇａａｃｔ ｇｔｔｃｔｇｇｃｃｔ ｃａｇａｃｃａａｃｔ
１３２１ ｃｔｃｔｃｃｔｇｔａ ｔａａｔｃｔｃｔｃｔ ｃｃｔｇｔａｔａａｃ ｃｃｃａｃｃｔｔｇｃ ｃａａｇｃｔｔｔｃｔ ｔｃｔａｃａａｃｃａ
１３８１ ｇａｇｃｃｃｃｃｃａ ｃａａｔｇａｔｇａｔ ｔａａａｃａｃｃｔｇ ａｃａｃａｔｃｔｔｇ
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖の１９位（５’→３’）は表１に開示される１９－ｍｅｒ標的配列の１位と塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖の１位（５’→３’）は表１に開示される１９－ｍｅｒ標的配列の１９位と塩基対を形成することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖の２位（５’→３’）は表１に開示される１９－ｍｅｒ標的配列の１８位と塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖の２位から１８位（５’→３’）は表１に開示される１９－ｍｅｒ標的配列の１８位から２位に位置するそれぞれの相補的塩基の各々と塩基対を形成することができる。
本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、ＡＧＥＲ遺伝子と完全に相補的であり得るか、又はＡＧＥＲ遺伝子と非相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、又はｄＴである。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、センス鎖とＡ：Ｕ又はＵ：Ａ塩基対を形成する。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）２～１８又は２～１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉセンス鎖は、表２、表４、表５、又は表６のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７、１～１８、又は２～１８の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２又は表３のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）２～１８又は２～１９の配列を含むアンチセンス鎖と、（ｉ）表２、表４、表５、又は表６のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７又は１～１８の配列を含むセンス鎖とから構成される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、以下の表２に示されるコア１９－ｍｅｒヌクレオチド配列を含む。
表２のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、修飾ヌクレオチド又は非修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、表２のヌクレオチド配列のいずれかを含むか又はそれからなるセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列を有するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、全て又は実質的に全て修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。
いくつかの実施形態において、開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、表２に開示される配列に列挙される各Ｎは、あらゆる核酸塩基（修飾ヌクレオチド及び非修飾ヌクレオチドの両方に見出される核酸塩基を含む）から独立して選択され得る。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドに相補的である核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドに相補的でない核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドと同じである核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、表２に開示される配列に列挙されるＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドとは異なる核酸塩基を有する。
特定の修飾ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、表３、表４、表５、表６及び表１０に提供される。特定の修飾ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖、及びその基礎の非修飾核酸塩基配列は、表３に提供される。特定の修飾ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖、及びその基礎の非修飾核酸塩基配列は、表４、表５、及び表６に提供される。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の形成において、表３、表４、表５、及び表６、並びに上記表２に列挙された基礎塩基配列の各々におけるヌクレオチドの各々は、修飾ヌクレオチドであり得る。
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニーリングすることによって形成される。表２、表４、表５、又は表６に列挙される配列を含むセンス鎖は、２つの配列、センス鎖とアンチセンス鎖とが、連続する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列にわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する限り、表２又は表３に列挙される配列を含む任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズされ得る。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表２、表３、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の核酸塩基配列を有する二本鎖を含むか又はそれからなる。
修飾ヌクレオチドを含有するアンチセンス鎖の例は、表３に提供される。修飾ヌクレオチドを含有するセンス鎖の例は、表４、表５、及び表６に提供される。
表３、表４、表５、表６及び表１０で使用される場合、以下の表記が修飾ヌクレオチド、標的化基、及び連結基を示すために使用される。
Ａ ＝ アデノシン－３’－ホスフェート
Ｃ ＝ シチジン－３’－ホスフェート
Ｇ ＝ グアノシン－３’－ホスフェート
Ｕ ＝ ウリジン－３’－ホスフェート
Ｉ ＝ イノシン－３’－ホスフェート
ａ ＝ ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート
ａｓ ＝ ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスホロチオエート
ｃ ＝ ２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート
ｃｓ ＝ ２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスホロチオエート
ｇ ＝ ２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェート
ｇｓ ＝ ２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスホロチオエート
ｉ ＝ ２’－Ｏ－メチルイノシン－３’－ホスフェート
ｉｓ ＝ ２’－Ｏ－メチルイノシン－３’－ホスホロチオエート
ｔ ＝ ２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン－３’－ホスフェート
ｔｓ ＝ ２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
ｕ ＝ ２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェート
ｕｓ ＝ ２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
Ａｆ ＝ ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート
Ａｆｓ ＝ ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスホロチオエート
Ｃｆ ＝ ２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート
Ｃｆｓ ＝ ２’－フルオロシチジン－３’－ホスホロチオエート
Ｇｆ ＝ ２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェート
Ｇｆｓ ＝ ２’－フルオログアノシン－３’－ホスホロチオエート
Ｔｆ ＝ ２’－フルオロ－５’－メチルウリジン－３’－ホスフェート
Ｔｆｓ ＝ ２’－フルオロ－５’－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート
Ｕｆ ＝ ２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェート
Ｕｆｓ ＝ ２’－フルオロウリジン－３’－ホスホロチオエート
ｄＴ ＝ ２’－デオキシチミジン－３’－ホスフェート
ＡＵＮＡ ＝ ２’，３’－セコ－アデノシン－３’－ホスフェート
ＡＵＮＡｓ ＝ ２’，３’－セコ－アデノシン－３’－ホスホロチオエート
ＣＵＮＡ ＝ ２’，３’－セコ－シチジン－３’－ホスフェート
ＣＵＮＡｓ ＝ ２’，３’－セコ－シチジン－３’－ホスホロチオエート
ＧＵＮＡ ＝ ２’，３’－セコ－グアノシン－３’－ホスフェート
ＧＵＮＡｓ ＝ ２’，３’－セコ－グアノシン－３’－ホスホロチオエート
ＵＵＮＡ ＝ ２’，３’－セコ－ウリジン－３’－ホスフェート
ＵＵＮＡｓ ＝ ２’，３’－セコ－ウリジン－３’－ホスホロチオエート
ａ＿２Ｎ ＝ 表１１を参照のこと
ａ＿２Ｎｓ ＝ 表１１を参照のこと
（ｉｎｖＡｂ） ＝ 逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド－５’－
ホスフェート、表１１を参照のこと
（ｉｎｖＡｂ）ｓ ＝ 逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド－５’－
ホスホロチオエート、表１１を参照のこと
ｓ ＝ ホスホロチオエート結合
ｐ ＝ 末端ホスフェート（合成されたまま）
ｖｐｄＮ ＝ ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド
ｃＰｒｐａ ＝ ５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート（表１１を参照のこと）
ｃＰｒｐａｓ ＝ ５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスホロチオエート（表１１を参照のこと）
ＣＰｒｐｕ ＝ ５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェート（表１１を参照のこと）
ＣＰｒｐｕｓ ＝ ５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエート（表１１を参照のこと）
（Ａｌｋ－ＳＳ－Ｃ６） ＝ 表１１を参照のこと
（Ｃ６－ＳＳ－Ａｌｋ） ＝ 表１１を参照のこと
（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６） ＝ 表１１を参照のこと
（６－ＳＳ－６） ＝ 表１１を参照のこと
（Ｃ６－ＳＳ－Ａｌｋ－Ｍｅ） ＝ 表１１を参照のこと
（ＮＨ２－Ｃ６） ＝ 表１１を参照のこと
（ＴｒｉＡｌｋ１４） ＝ 表１１を参照のこと
（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓ ＝ 表１１を参照のこと
－Ｃ６－ ＝ 表１１を参照のこと
－Ｃ６ｓ－ ＝ 表１１を参照のこと
－Ｌ６－Ｃ６－ ＝ 表１１を参照のこと
－Ｌ６－Ｃ６ｓ－ ＝ 表１１を参照のこと
－Ａｌｋ－ｃｙＨｅｘ－ ＝ 表１１を参照のこと
－Ａｌｋ－ｃｙＨｅｘｓ－ ＝ 表１１を参照のこと
（ＴＡ１４） ＝ 表１１（コンジュゲーション後の（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓの構造）を参照のこと
（ＴＡ１４）ｓ ＝ 表１１（コンジュゲーション後の（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓの構造）を参照のこと
当業者であれば容易に理解するように、配列によって（例えば、ホスホロチオエート結合「ｓ」によってなど）別途示されない限り、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ヌクレオチドモノマーは、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に連結される。当業者であれば明確に理解するように、本明細書に開示される修飾ヌクレオチド配列に示されるようなホスホロチオエート結合を含むことは、オリゴヌクレオチドに典型的に存在するホスホジエステル結合の代わりとなる。更に、当業者であれば、所与のオリゴヌクレオチド配列の３’末端の末端ヌクレオチドが、典型的には、エクスビボにおいて所与のモノマーのそれぞれの３’位にホスフェート部分の代わりにヒドロキシル（－ＯＨ）基を有することを容易に理解するであろう。加えて、本明細書に開示される実施形態について、それぞれの鎖を５’→３’に見ると、逆位脱塩基残基が、デオキシリボースの３’位がそれぞれの鎖上の先行するモノマーの３’末端で連結されるように挿入される（例えば、表１１を参照のこと）。更に、当業者であれば容易に理解及び認識するように、本明細書に描写されるホスホロチオエート化学構造は、典型的には硫黄原子上にアニオンを示すが、本明細書に開示される本発明は、全てのホスホロチオエート互変異性体（例えば、硫黄原子が二重結合を有し、アニオンが酸素原子上にある場合）を包含する。本明細書において別途明示的に示されない限り、当業者のこのような理解は、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤及びＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の組成物を記載する場合に使用される。
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤で使用される標的化基及び連結基の特定の例は、以下の表１１に提供される化学構造に含まれる。各センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、配列の５’末端及び／又は３’末端にコンジュゲートされた、本明細書に列挙される任意の標的化基又は連結基、及び他の標的化基又は連結基を有し得る。
（Ａ２Ｎ）＝２－アミノアデニン含有ヌクレオチド；Ｉ＝ヒポキサンチン（イノシン）ヌクレオチド
（Ａ２Ｎ）＝２－アミノアデニン含有ヌクレオチド；Ｉ＝ヒポキサンチン（イノシン）ヌクレオチド
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニーリングすることによって形成される。表２、表４、表５、又は表６に列挙される配列を含むセンス鎖は、２つの配列、センス鎖とアンチセンス鎖とが、連続する１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列にわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する限り、表２又は表３に列挙される配列を含む任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズされ得る。
上記表５に示すように、特定の例示的なＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ヌクレオチド配列は、センス鎖の５’末端及び３’末端の一方又は両方に反応性連結基を更に含むことが示されている。例えば、上記の表５に示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖配列の多くは、ヌクレオチド配列の５’末端に（ＴｒｉＡｌｋ１４）連結基を有する。（ＮＨ２－Ｃ６）連結基又は（６－ＳＳ－６）若しくは（Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）連結基などの他の連結基が、特定の実施形態において、同様に又は代わりに存在してもよい。このような反応性連結基は、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤への標的化リガンド、標的化基、及び／又はＰＫ／ＰＤモジュレーターの連結を容易にするように配置される。連結又はコンジュゲーション反応は当該技術分野において周知であり、２つの分子又は反応物間の共有結合の形成をもたらす。本明細書における本発明の範囲での使用に適したコンジュゲーション反応としては、アミドカップリング反応、マイケル付加反応、ヒドラゾン形成反応、逆要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環化付加反応、オキシムライゲーション、及び銅（Ｉ）触媒型又は歪み促進型アジド－アルキン環化付加反応が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される実施例及び図に示されるインテグリン標的化リガンドなどの標的化リガンドは、活性化エステル、例えばテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルとして合成することができ、これは、反応性アミノ基（例えば、ＮＨ２－Ｃ６）によって置換されて、標的化リガンドを本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤に結合させることができる。いくつかの実施形態において、標的化リガンドはアジドとして合成され、これは、例えば、銅（Ｉ）触媒型又は歪み促進型アジド－アルキン環化付加反応を介して、プロパルギル（例えばＴｒｉＡｌｋ１４）又はＤＢＣＯ基にコンジュゲートすることができる。
加えて、特定のヌクレオチド配列は、センス鎖の３’末端にｄＴヌクレオチドを有し、続いて（３’→５’）リンカー（例えば、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６）を有するように合成することができる。リンカーは、いくつかの実施形態において、例えば、ＰＫ／ＰＤモジュレーター又は１つ以上の標的化リガンドなどの更なる構成要素への連結を容易にすることができる。本明細書に記載されるように、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６のジスルフィド結合がまず還元され、分子からｄＴが除去され、次いでこれが所望のＰＫ／ＰＤモジュレーターのコンジュゲーションを容易にすることができる。したがって、末端ｄＴヌクレオチドは、完全にコンジュゲートされた構築物の一部ではない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表３又は表１０のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表４、表５、表６、又は表１０のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２又は表３の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２、表３、又は表１０の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７、２～１７、１～１８、２～１８、１～１９、２～１９、１～２０、２～２０、１～２１、２～２１、１～２２、２～２２、１～２３、２～２３、１～２４、又は２～２４の配列を含む。特定の実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表３又は表１０の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表２又は表４の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７、２～１７、３～１７、４～１７、１～１８、２～１８、３～１８、４～１８、１～１９、２～１９、３～１９、４～１９、１～２０、２～２０、３～２０、４～２０、１～２１、２～２１、３～２１、４～２１、１～２２、２～２２、３～２２、４～２２、１～２３、２～２３、３～２３、４～２３、１～２４、２～２４、３～２４、又は４～２４の配列を含む。特定の実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖は、表３又は表１０の修飾配列のいずれか１つの修飾配列を含むか又はそれからなる。
本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、ＡＧＥＲ遺伝子と完全に相補的であり得るか、又はＡＧＥＲ遺伝子と非相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、又はｄＴ（又はＵ、Ａ、若しくはｄＴの修飾バージョン）である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（５’末端→３’末端）のヌクレオチドは、センス鎖とＡ：Ｕ又はＵ：Ａ塩基対を形成する。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖は、表２、表３、又は表１０のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）２～１８又は２～１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉのセンス鎖は、表２、表４、表５、表６、又は表１０のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７又は１～１８の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２、表３、又は表１０のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）２～１８又は２～１９の配列を含むアンチセンス鎖と、（ｉｉ）表２、表４、表５、表６、又は表１０のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端）１～１７又は１～１８の配列を含むセンス鎖とを含む。
表２又は表４に列挙される配列を含むセンス鎖は、２つの配列、センス鎖とアンチセンス鎖とが、連続する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列にわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する限り、表２又は表３に列挙される配列を含む任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表４、表５、表６、又は表１０の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるセンス鎖と、表３又は表１０の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるアンチセンス鎖とを有する。特定の代表的な配列ペアは、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ及び表９Ｂに示される二本鎖ＩＤ番号によって例示される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれか１つによって表される二本鎖を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかからなる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、並びに標的化基、連結基、及び／又は他の非ヌクレオチド基を含み、該標的化基、連結基、及び／又は他の非ヌクレオチド基は、センス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合されている（すなわち、コンジュゲートされている）。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖修飾ヌクレオチド配列、並びに標的化基、連結基、及び／又は他の非ヌクレオチド基を含み、該標的化基、連結基、及び／又は他の非ヌクレオチド基は、センス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合されている。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表２、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、かつ標的化基を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表２、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、かつ１つ以上のαｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表２、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、かつインテグリン標的化リガンドである標的化基を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表２、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、かつ１つ以上のαｖβ６インテグリン標的化リガンド又はαｖβ６インテグリン標的化リガンドのクラスター（例えば、三座αｖβ６インテグリン標的化リガンド）を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの修飾ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、かつインテグリン標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０の二本鎖のいずれかを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、又は遊離酸として調製又は提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、薬学的に許容される塩として調製又は提供される。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、薬学的に許容されるナトリウム又はカリウム塩として調製又は提供される。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤は、ＡＧＥＲ遺伝子を発現する細胞に送達されると、１つ以上のＡＧＥＲ遺伝子の発現をインビボで及び／又はインビトロで阻害又はノックダウンする。
標的化基、連結基、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モジュレーター、及び送達ビヒクル
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、標的化基、連結基、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モジュレーター、送達ポリマー、又は送達ビヒクルを含むがこれらに限定されない１つ以上の非ヌクレオチド基を含有するか、又はそれらにコンジュゲートされる。非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤の標的化、送達、又は結合を増強することができる。非ヌクレオチド基は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの３’及び／又は５’末端に共有結合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’及び／又は５’末端に連結された非ヌクレオチド基を含有する。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’末端に連結されている。非ヌクレオチド基は、直接、又はリンカー／連結基を介して間接的にＲＮＡｉ剤に連結することができる。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、不安定な、切断可能な、又は可逆的な結合又はリンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結される。
いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、それが結合しているＲＮＡｉ剤又はコンジュゲートの薬物動態特性又は生体内分布特性を増強して、コンジュゲートの細胞組織特異的分布及び細胞特異的取り込みを改善する。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤のエンドサイトーシスを増強する。
標的化基又は標的化部分は、それらが結合しているコンジュゲート又はＲＮＡｉ剤の薬物動態特性又は生体内分布特性を増強して、コンジュゲート又はＲＮＡｉ剤の細胞特異的（場合によっては臓器特異的を含む）分布及び細胞特異的（又は臓器特異的）取り込みを改善する。標的化基は、一価、二価、三価、四価であり得るか、又はそれが向けられる標的に対してより高い価数を有し得る。代表的な標的化基としては、細胞表面分子に対する親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、及び細胞表面分子に対する親和性を有する抗体模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標的化基は、ＰＥＧリンカー又は１つ、２つ、若しくは３つの脱塩基及び／若しくはリビトール（脱塩基リボース）残基などのリンカーを使用してＲＮＡｉ剤に連結され、これはいくつかの例においてリンカーとして機能することができる。
標的化基は、リンカーの有無にかかわらず、表２、表３、表４、表５、表６、及び表１０に開示されるセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの５’又は３’末端に結合され得る。リンカーは、標的化基の有無にかかわらず、表２、表３、表４、表５、表６、及び表１０に開示されるセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの５’又は３’末端に結合され得る。
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、５’末端及び／又は３’末端にアミノ基（本明細書ではアミンとも呼ばれる）などの反応性基を有して合成され得る。反応性基は、その後、当該技術分野において典型的な方法を使用して標的化部分を結合するために使用することができる。
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にＮＨ２－Ｃ６基を有して合成される。末端アミノ基は、その後、例えば、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む基とコンジュゲートを形成するために反応させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に１つ以上のアルキン基を有して合成される。末端アルキン基は、その後、例えば、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む基とコンジュゲートを形成するために反応させることができる。
いくつかの実施形態において、標的化基は、インテグリン標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態において、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである。αｖβ６インテグリン標的化リガンドの使用は、そのそれぞれの表面上にαｖβ６を有する細胞への細胞特異的標的化を容易にし、インテグリン標的化リガンドの結合は、それが連結されているＲＮＡｉ剤などの治療剤が、細胞、例えば肺上皮細胞及び腎上皮細胞などの上皮細胞に侵入するのを容易にすることができる。インテグリン標的化リガンドは、モノマー若しくは一価（例えば、単一のインテグリン標的化部分を有する）、又はマルチマー若しくは多価（例えば、複数のインテグリン標的化部分を有する）であり得る。標的化基は、当該技術分野で公知の方法を使用して、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端に結合され得る。αｖβ６インテグリン標的化リガンドなどの標的化基の調製は、例えば、国際公開第２０１８／０８５４１５号及び国際公開第２０１９／０８９７６５号に記載されており、これらの各々の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、標的化基は、更なるリンカーを使用することなくＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤に連結されている。いくつかの実施形態において、標的化基は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤への連結を容易にするために存在するリンカーを容易に有するように設計される。いくつかの実施形態において、２つ以上のＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２つ以上のＲＮＡｉ剤は、同じリンカーを使用してそれらのそれぞれの標的化基に連結され得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２つ以上のＲＮＡｉ剤は、異なるリンカーを使用してそれらのそれぞれの標的化基に連結される。
いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。連結基は、標的化基、薬物動態モジュレーター、送達ポリマー、又は送達ビヒクルへの薬剤の共有結合を容易にする。連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖又はアンチセンス鎖の３’及び／又は５’末端に連結することができる。いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖に連結されている。いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’又は３’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、連結基は、ＲＮＡｉ剤センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる。連結基の例としては、Ｃ６－ＳＳ－Ｃ６、６－ＳＳ－６、反応性基、例えば第一級アミン（例えば、ＮＨ２－Ｃ６）及びアルキン、アルキル基、脱塩基残基／ヌクレオチド、アミノ酸、トリ－アルキン官能化基、リビトール、及び／又はＰＥＧ基が挙げられるが、これらに限定されない。特定の連結基の例は、表１１に提供される。
リンカー又は連結基は、１つ以上の共有結合を介して、１つの化学基（ＲＮＡｉ剤など）又は目的のセグメントを別の化学基（標的化基、薬物動態モジュレーター、又は送達ポリマーなど）又は目的のセグメントに連結する２つの原子間の接続部である。不安定な連結は、不安定な結合を含む。連結は、２つの結合した原子間の距離を増加させるスペーサーを任意選択で含むことができる。スペーサーは、連結に可撓性及び／又は長さを更に加え得る。スペーサーとしては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、１つ以上のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、及び糖類を含み得る。スペーサー基は当該技術分野で周知であり、先のリストは説明の範囲を限定することを意味しない。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に、又は１２個以上の炭素原子を有する疎水性基、例えばコレステロール若しくはパルミトイル基にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モジュレータ－に連結される。ＰＫ／ＰＤモジュレーターは、改善された細胞受容体結合、改善された細胞取り込み、及び／又は他の手段を通じて、コンジュゲートされた薬物の循環時間を延長させ、かつ／又はＲＮＡｉ剤の活性を増加させることができる。ＲＮＡｉ剤での使用に適した様々なＰＫ／ＰＤモジュレーターが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、ＰＫ／ＰＤモジュレーターは、コレステロール又はコレステリル誘導体であり得るか、又はいくつかの状況において、ＰＫ／ＰＤモジュレーターは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、又はアラルキニル基から構成され得、これらの各々は、直鎖状、分岐状、環状、及び／又は置換若しくは非置換であり得る。いくつかの実施形態において、これらの部分の結合位置は、センス鎖の５’若しくは３’末端、センス鎖の任意の所与のヌクレオチドのリボース環の２’位であり、かつ／又はセンス鎖の任意の位置でホスフェート若しくはホスホロチオエート骨格に結合している。
表２、表３、表４、表５、表６、及び表１０に列挙されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ヌクレオチド配列のいずれかは、修飾されていてもいなくても、３’及び／又は５’標的化基、連結基、及び／又はＰＫ／ＰＤモジュレーターを含むことができる。３’若しくは５’標的化基、連結基、及び／又はＰＫ／ＰＤモジュレーターを含有する、表３、表４、表５、表６及び表１０に列挙されるか、又は本明細書に別様に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤配列のいずれかは、代替的に、３’若しくは５’標的化基、連結基、又はＰＫ／ＰＤモジュレーターを含有しなくてもよく、あるいは表１１に描写されるものを含むがこれらに限定されない異なる３’若しくは５’標的化基、連結基、又は薬物動態モジュレーターを含有してもよい。表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０に列挙されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤二本鎖のいずれかは、修飾されていてもいなくても、表１１に描写されるものを含むがこれらに限定されない標的化基又は連結基を更に含むことができ、標的化基又は連結基は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤二本鎖のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合することができる。
特定の修飾ヌクレオチド、キャッピング部分、及び連結基の例は、表１１に提供される。
あるいは、当該技術分野で公知の他の連結基が使用され得る。多くの場合、連結基は商業的に入手することができるか、あるいは、市販のヌクレオチドホスホラミダイトに組み込まれる。（例えば、国際公開第２０１９／１６１２１３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、標的化リガンド又は薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モジュレーターにコンジュゲートされることなく送達される（「ネイキッド」又は「ネイキッドＲＮＡｉ剤」と呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、標的化基、連結基、ＰＫモジュレーター、及び／又は別の非ヌクレオチド基にコンジュゲートされて、インビボで選択された細胞又は組織への、例えば上皮細胞へのＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の送達を容易にする。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、インテグリン標的化リガンドを含む標的化基にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである。いくつかの実施形態において、標的化基は、１つ以上のαｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、ＲＮＡｉ剤を細胞又は組織に送達するために使用され得る。送達ビヒクルは、細胞又は組織へのＲＮＡｉ剤の送達を改善する化合物である。送達ビヒクルは、ポリマー、例えば両親媒性ポリマー、膜活性ポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）、脂質、可逆的に修飾されたポリマー若しくはペプチド、又は可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含み得るか、又はそれらからなり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ、又は当該技術分野において核酸送達のために利用可能な他の送達系と組み合わせることができる。ＲＮＡｉ剤はまた、標的化基、脂質（コレステリル及びコレステリル誘導体を含むが、これらに限定されない）に化学的にコンジュゲートされ得、ナノ粒子、リポソーム、ミセルに封入され得、ポリマー若しくはＤＰＣ（例えば、国際公開第２０００／０５３７２２号、同第２００８／０２２３０９号、同第２０１１／１０４１６９号、及び同第２０１２／０８３１８５号、同第２０１３／０３２８２９号、同第２０１３／１５８１４１号を参照のこと。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）にコンジュゲートされ得、これらのことは、イオン導入によるか、又は当該技術分野で利用可能な他の送達ビヒクル若しくは送達系、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質性ベクターへの組み込みによる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、肺上皮細胞に対する親和性を有する抗体にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、肺上皮細胞又は肺上皮細胞上に存在する受容体に対して親和性を有する標的化リガンドに連結され得る。
医薬組成物及び製剤
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物又は製剤（本明細書において「医薬」とも呼ばれる）として調製され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つのＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む。これらの医薬組成物は、標的細胞、細胞群、組織、又は生物におけるＡＧＥＲ ｍＲＮＡの発現の阻害において特に有用である。医薬組成物は、標的ｍＲＮＡのレベルの低減又は標的遺伝子の発現の阻害から恩恵を受ける疾患、障害、又は状態を有する対象を処置するために使用することができる。医薬組成物は、標的ｍＲＮＡのレベルの低減又は標的遺伝子の発現の阻害から恩恵を受ける疾患又は障害を発症するリスクのある対象を処置するために使用することができる。一実施形態において、本方法は、本明細書に記載される標的化リガンドに連結されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、処置される対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（ビヒクル、担体、希釈剤、及び／又は送達ポリマーを含む）が、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物に添加され、それによって、対象、例えばヒトへのインビボ送達に適した医薬製剤又は医薬が形成される。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物及び本明細書に開示される方法は、例えば本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるＡＧＥＲ ｍＲＮＡの発現を阻害することによって、細胞、細胞群、細胞群、組織、器官、又は対象における標的ｍＲＮＡのレベルを減少させる。いくつかの実施形態において、対象は、ＲＡＧＥ発現の低減によって少なくとも部分的に媒介され得る疾患又は障害を有すると以前に同定又は診断されている。いくつかの実施形態において、対象は、１つ以上の肺疾患、例えば喘息（重症喘息を含む）、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺炎、肺癌、又は気管支肺異形成症を有すると以前に診断されている。いくつかの実施形態において、肺疾患は重症喘息である。
いくつかの実施形態において、対象は、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患）、がん、糖尿病、慢性腎疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む特定のウイルス感染によって引き起こされる損傷、特定の眼炎症状態、又は骨格筋消耗を有すると以前に診断されている。
いくつかの実施形態において、対象は、眼炎症に関連する１つ以上の眼疾患を有すると以前に診断されている。
本開示の実施形態は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を肺上皮細胞にインビボで送達するための医薬組成物を含む。そのような医薬組成物は、例えば、インテグリン標的化リガンドを含む標的化基にコンジュゲートされたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリンリガンドから構成される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む記載された医薬組成物は、ＲＡＧＥの発現の阻害から恩恵を受ける対象における臨床症状を処置又は管理するために使用される。いくつかの実施形態において、治療有効量又は予防有効量の１つ以上の医薬組成物が、このような処置を必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のいずれかの投与は、対象における疾患の症状の数、重症度、及び／又は頻度を低下させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の更なる（すなわち、第２、第３などの）治療薬と任意選択で組み合わされる。第２の治療薬は、別のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（例えば、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子内の異なる配列を標的化するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤）であってもよい。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は、ＡＧＥＲ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤であり得る。更なる治療薬はまた、小分子薬物、抗体、抗体断片、及び／又はアプタマーであり得る。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の更なる治療薬の有無にかかわらず、１つ以上の賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成することができる。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む記載された医薬組成物は、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡの発現の低減又は阻害から恩恵を受ける疾患又は障害を有する対象における少なくとも１つの症状を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、対象は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む治療有効量の１つ以上の医薬組成物を投与され、それによって症状が処置される。他の実施形態において、対象は、１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の予防有効量を投与され、それによって少なくとも１つの症状が予防又は阻害される。
いくつかの実施形態において、記載されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の１つ以上は、薬学的に許容される担体又は希釈剤中で哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
投与経路は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を身体と接触させる経路である。概して、哺乳動物の処置のために薬物、オリゴヌクレオチド、及び核酸を投与する方法は当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物の投与に適用され得る。本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、特定の経路にあうように適切に調整された調製物において、任意の適切な経路を介して投与され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、吸入、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔咽頭吸引投与を介して投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、注射によって、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節内、眼内、若しくは腹腔内、又は局所的に投与することができる。
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して、細胞、細胞群、組織、又は対象に送達することができる。概して、核酸分子を送達（インビトロで又はインビボで）するための当該技術分野で認識されている任意の適切な方法は、本明細書に記載される組成物で使用するために適合させることができる。例えば、送達は、局所投与（例えば、直接注射、埋め込み、又は局所投与）、全身投与、又は皮下、静脈内、腹腔内、又は非経口経路、例えば頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、経口、直腸、又は局所（頬側及び舌下を含む）投与によるものであり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、吸入、鼻腔内投与、口腔咽頭吸引投与、又は気管内投与を介して投与される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、肺上皮におけるＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害することが望まれ、そのためには、吸入による投与（例えば、定量吸入器などの吸入デバイス、又はジェット式若しくは振動メッシュ式ネブライザーなどのネブライザー、又はソフトミスト吸入器による）が特に好適かつ有利である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書に記載される医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。
本明細書で使用される場合、医薬組成物又は医薬は、薬理学的有効量の少なくとも１つの記載された治療化合物及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤は、薬物送達系に意図的に含まれる医薬品有効成分（ＡＰＩ、治療生成物、例えばＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤）以外の物質である。賦形剤は、意図される用量で治療効果を発揮しないか、又は発揮することを意図するものではない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達系の操作を補助する、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティ、若しくは患者による受容性を保護し、支援し、若しくは強化する、ｃ）製品の識別を補助する、かつ／又はｄ）保管若しくは使用の際にＡＰＩの送達の全体的な安全性、有効性の他の任意の属性を高めるように作用し得る。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。
賦形剤としては、吸収促進剤、抗粘着剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、送達ポリマー、洗浄剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味料、流動促進剤、保湿剤、滑沢剤、油、ポリマー、防腐剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖、界面活性剤、懸濁化剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤、及び湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の夾雑作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、塩基性分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、予め滅菌濾過された溶液から、活性成分及び任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。
関節内投与に適した製剤は、微結晶形態、例えば水性微結晶懸濁液の形態であり得る、薬物の滅菌水性調製物の形態であり得る。リポソーム製剤又は生分解性ポリマー系もまた、関節内投与及び眼投与の両方のために薬物を提供するために使用され得る。
吸入投与に適した製剤は、適切な溶媒中に所望の量の活性化合物を組み込んだ後、滅菌濾過することによって調製することができる。概して、吸入投与用の製剤は、生理的ｐＨの滅菌溶液であり、低粘度（＜５ｃＰ）を有する。塩を製剤に添加して張度を平衡化してもよい。場合によっては、界面活性剤又は共溶媒を添加して、活性化合物の溶解度を高め、エアロゾル特性を改善することができる。場合によっては、賦形剤を添加して粘度を調節し、噴霧される液滴の大きさ及び分布を確保してもよい。
いくつかの実施形態において、吸入投与に適した本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む医薬製剤は、注射用水（滅菌水）、又はリン酸ナトリウム緩衝水溶液中で調製することができる（例えば、水中の０．５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム中で製剤化したＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤）。
活性化合物は、埋め込み及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、単位剤形で組成物に製剤化することができる。単位剤形は、処置される対象のための単一の用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴及び達成される処置効果、並びに個体の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術分野に固有の制限によって規定され、直接左右される。
薬学的組成物は、薬学的組成物中に一般的に見出される他の更なる成分を含有することができる。そのような更なる成分としては、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で定義されるＲＮＡｉ剤を発現するか又は含む細胞、組織、又は単離された器官が、「医薬組成物」として使用され得ることも想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」又は単に「有効量」は、薬理学的、治療的又は予防的結果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤を投与することに加えて、第２の治療薬又は処置を投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は、別のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（例えば、ＲＡＧＥ標的内の異なる配列を標的化するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤）である。他の実施形態において、第２の治療薬は、小分子薬物、抗体、抗体断片、及び／又はアプタマーであり得る。
いくつかの実施形態において、異なる配列を有する少なくとも２つのＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の組み合わせ又はカクテルを含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、２つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、各々別々にかつ独立して標的化基に連結されている。いくつかの実施形態において、２つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、インテグリン標的化リガンドを含むか、又はそれからなる標的化基に各々連結されている。いくつかの実施形態において、２つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含むか、又はそれからなる標的化基に各々連結されている。
肺上皮細胞へのＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の送達のための組成物を本明細書に記載する。更に、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、細胞、例えば腎上皮細胞及び／又は消化管若しくは生殖管における上皮細胞及び／又は眼における眼表面上皮細胞にインビボで送達するための組成物を、概して本明細書に記載する。
概して、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．０００１～約２０ｍｇ／ｋｇの体重／沈着用量（of body weight／deposited dose）、例えば、約０．００１～約５ｍｇ／ｋｇの体重／沈着用量の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの体重／沈着用量の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの体重／沈着用量の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．０１～約１．０ｍｇ／ｋｇの沈着用量／体重の範囲にある。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．５０～約１．０ｍｇ／ｋｇの沈着用量／体重の範囲にある。投与される量はまた、患者の全体的な健康状態、送達される化合物の相対的な生物学的効能、薬物の製剤、製剤中の賦形剤の存在及び種類、並びに投与経路などの可変要素に依存する可能性が高い。また、投与される初期投薬量は、所望の血中レベル又は組織レベルを迅速に達成するために上記の上限レベルを超えて増加させてもよく、又は初期投薬量は、最適量より少なくてもよいことが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、用量は毎日投与される。いくつかの実施形態において、用量は毎週投与される。更なる実施形態において、用量は、隔週、３週間に１回、月に１回、又は四半期に１回（すなわち、３ヶ月毎に１回）投与される。
疾患の処置のため、又は疾患を処置するための医薬若しくは組成物の形成のため、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む本明細書に記載される医薬組成物は、賦形剤と、又は第２の治療剤若しくは処置、例えば、限定されないが第２の若しくは他のＲＮＡｉ剤、小分子薬物、抗体、抗体断片、ペプチド、及び／若しくはアプタマーと組み合わせてもよい。
記載されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、薬学的に許容される賦形剤又はアジュバントに添加される場合、キット、容器、パック、又はディスペンサーにパッケージングしてもよい。本明細書に記載される医薬組成物は、乾燥粉末又はエアロゾル吸入器、他の定量吸入器、ネブライザー、プレフィルドシリンジ、又はバイアルにパッケージングしてもよい。
処置及びＲＡＧＥ発現の阻害の方法
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の投与から恩恵を受ける疾患又は障害を有する対象（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、ＡＧＥＲ ｍＲＮＡの発現の低減及び／若しくは阻害並びに／又はＲＡＧＥ受容体レベルの低減から恩恵を受ける対象（例えば、ヒト）を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、対象（例えば、ヒト）がＲＡＧＥ受容体の低減から恩恵を受ける疾患又は障害を有する対象を処置するために使用することができ、そのような疾患又は障害としては、肺疾患、例えば喘息（重症喘息を含む）、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺癌、気管支肺異形成症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、又は嚢胞性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、肺疾患は重症喘息である。いくつかの実施形態において、対象は、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患）、がん、糖尿病、慢性腎疾患、神経変性疾患、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む特定のウイルス感染によって引き起こされる損傷、特定の眼炎症状態、又は骨格筋消耗を有すると以前に診断されている。対象の処置は、治療的及び／又は予防的処置を含むことができる。対象は、治療有効量の本明細書に記載される任意の１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与される。対象は、ヒト、患者、又はヒト患者であり得る。対象は、成人、青年、小児、又は乳児であり得る。本明細書に記載される薬学的組成物の投与は、ヒト又は動物に対するものであり得る。
膜型ＲＡＧＥ活性の増加は、組織における炎症を促進することが知られている。いくつかの実施形態において、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、対象におけるＲＡＧＥレベルの低減によって少なくとも部分的に媒介される少なくとも１つの症状を処置するために使用される。対象は、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の任意の１つ以上の治療有効量を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、記載されるＲＮＡｉ剤の任意の１つ以上の予防有効量を投与され、それによって、少なくとも１つの症状を予防又は阻害することによって対象を処置する。
特定の実施形態において、本開示は、ＡＧＥＲ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、状態、又は病的状態の処置を、それを必要とする患者において行うための方法であって、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のいずれかを患者に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、対象における臨床症状又は病的状態を処置又は管理するために使用され、臨床症状又は病的状態は、ＲＡＧＥ発現の低減によって少なくとも部分的に媒介される。対象は、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤含有組成物のうちの１つ以上の治療有効量を投与される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物を、処置される対象に投与することを含む。
更なる態様において、本開示は、ＲＡＧＥ受容体レベルの低減によって対処され得る疾患又は症状を処置する（予防的又は防止的処置を含む）方法であって、処置を必要とする対象に、表２、表３、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与することを含む、方法を特徴とする。そのような方法において使用するための組成物も本明細書に記載される。
記載されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤及び／又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、増強又は上昇したＲＡＧＥ受容体活性レベルによって引き起こされる疾患又は状態の治療的処置のための方法において使用することができる。そのような方法は、本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を対象、例えばヒト又は動物対象に投与することを含む。
別の態様において、本開示は、ＲＡＧＥ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態（病態又は疾患など）を処置する（予防的処置を含む）ための方法であって、表２、表３、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、表２、表３、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を細胞に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態を処置する（予防的処置を含む）ための方法であって、表２、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、表２、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を細胞に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態を処置する（予防的処置を含む）ための方法であって、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖と、表３又は表１０の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖とを含むＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子の発現を阻害するための方法であって、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖と、表３又は表１０の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖とを含むＲＮＡｉ剤を細胞に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害する方法であって、表４、表５、表６、又は表１０の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるセンス鎖と、表３又は表１０の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。他の実施形態において、ＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害する方法であって、表４、表５、表６、又は表１０の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるセンス鎖と、表３又は表１０の修飾配列のいずれかの修飾配列からなるアンチセンス鎖とを含むＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、細胞におけるＡＧＥＲ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、及び表１０に記載される二本鎖のうちの１つの二本鎖構造を含む１つ以上のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態において、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤が投与される対象の特定の上皮細胞におけるＡＧＥＲ遺伝子の遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与される前の対象又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与されていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超低減される。いくつかの実施形態において、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤が投与される対象の特定の上皮細胞におけるＲＡＧＥ受容体又はＲＡＧＥタンパク質レベルは、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与される前の対象又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与されていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超低減される。対象における遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、及び／又はｍＲＮＡレベルは、対象の細胞、細胞群、及び／又は組織において低減され得る。いくつかの実施形態において、記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤が投与された対象の特定の上皮細胞におけるＡＧＥＲ ｍＲＮＡレベルは、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与される前の対象又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与されていない対象と比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％低減される。
遺伝子発現、ｍＲＮＡ、及びタンパク質レベルの低減は、当該技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。ＲＡＧＥ受容体活性レベル及び／又はＲＡＧＥタンパク質レベルの低減又は低下は、本明細書において、ＲＡＧＥ発現の低下、低減、又は阻害と総称される。本明細書に記載される実施例は、ＲＡＧＥ発現及びＡＧＥＲ遺伝子発現の阻害を評価するための公知の方法を例示する。
細胞、組織、器官、及び非ヒト生物
本明細書に記載されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つを含む細胞、組織、器官、及び非ヒト生物が企図される。該細胞、組織、器官、又は非ヒト生物は、ＲＮＡｉ剤を細胞、組織、器官、又は非ヒト生物に送達することによって作製される。
更なる例示的な実施形態
本明細書では、開示された技術の特定の更なる例示的な実施形態が提供される。これらの実施形態は例示にすぎず、本開示の範囲又は本明細書に添付の特許請求の範囲を限定するものではない。
実施形態１．終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
表２又は表３に開示されるアンチセンス鎖のいずれか１つと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態２．終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
配列番号１の同じ長さのヌクレオチドのストレッチと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むセンス鎖と、該センス鎖に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、
を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態３．ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥ）遺伝子の阻害剤であって、表１の標的ヌクレオチド配列のいずれかに相補的である０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む、阻害剤。
実施形態４．（ｉ）表２、表３、又は表１０のヌクレオチド配列のいずれかと０、１、２、又は３ヌクレオチド異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、（ｉｉ）該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖と、を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態５．（ｉ）表２、表３、又は表１０のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれかに由来するヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるアンチセンス鎖と、（ｉｉ）表２、表４、表５、表６、又は表１０のセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれかに由来するヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるセンス鎖と、を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態６．アニーリングして二本鎖を形成するアンチセンス鎖及びセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤であって、該二本鎖が、表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９、又は表１０に記載される二本鎖のいずれかの構造を有する、ＲＮＡｉ剤。
実施形態７．終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤であって、
（ｉ）終末糖化産物受容体遺伝子（配列番号１）に少なくとも部分的に相補的である１８～４９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖と、
（ｉｉ）該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖と、
（ｉｉｉ）該センス鎖に連結された標的化リガンドと、
を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態８．終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
表２又は表３に提供される配列のいずれか１つと０又は１ヌクレオチド異なる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、
該アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
を含む、ＲＮＡｉ剤。
実施形態９．アンチセンス鎖が、表２又は表３に提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド２～１８を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１０．センス鎖が、表２又は表４に提供される配列のいずれか１つと０又は１ヌクレオチド異なる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖に対して１７個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１１．ＲＮＡｉ剤の少なくとも１個のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであるか、又は修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１２．ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１３．修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－セコヌクレオチド模倣物、ロックドヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、２’－メトキシエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、リビトール、逆位ヌクレオチド、逆位２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、逆位２’－デオキシヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネート含有ヌクレオチド、シクロプロピルホスホネート含有ヌクレオチド、及び３’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態１１～１２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１４．ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、又はそれらの組み合わせで修飾されている、実施形態１２に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１５．アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１６．センス鎖が、表４に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１７．アンチセンス鎖が表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖が表４に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１８．センス鎖が１８～３０ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が１８～３０ヌクレオチド長である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態１９．センス鎖及びアンチセンス鎖が、各々１８～２７ヌクレオチド長である、実施形態１８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２０．センス鎖及びアンチセンス鎖が、各々１８～２４ヌクレオチド長である、実施形態１９に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２１．センス鎖及びアンチセンス鎖が、各々２１ヌクレオチド長である、実施形態２０に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２２．２つの平滑末端を有する、実施形態２１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２３．センス鎖が、１つ又は２つの末端キャップを含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２４．センス鎖が、１つ又は２つの逆位脱塩基残基を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２５．表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０の二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成される、実施形態８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２６．ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、実施形態２５に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２７．以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）；
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）；
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号７３）；
ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）；
ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）；又は
ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む、実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２８．センス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号２９８）；
ＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号３０８）；
ＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号３１６）；
ＣＧＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号１９）；
ＧＡＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号２０）；又は
ＡＧＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号２１）
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含む、実施形態２７に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態２９．ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、実施形態２７又は２８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３０．以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）；
ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）；
ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）；
ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）；
ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるアンチセンス鎖を含み、式中、ａ、ｃ、ｇ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン及び２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、２’－フルオロシチジン、２’－フルオログアノシン及び２’－フルオロウリジンを表し；ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し；センス鎖上のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、
実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３１．センス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａ（配列番号１４）；
ａｓｇｇｃａａｕｇＡｆＡｆＣｆａｇｇａａｕｉｇａａ（配列番号１５）；
ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａ（配列番号１３）；
のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になり、式中、ａ、ｃ、ｇ、ｉ及びｕは、それぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン及び２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ及びＵｆは、それぞれ、２’－フルオロアデノシン、２’－フルオロシチジン、２’－フルオログアノシン及び２’－フルオロウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し；アンチセンス鎖上のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、
実施形態１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３２．センス鎖が、ヌクレオチド配列の３’末端に、ヌクレオチド配列の５’末端に、又はその両方に逆位脱塩基残基を更に含む、実施形態２７～３１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３３．標的化リガンドに連結されている、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３４．標的化リガンドが、上皮細胞上に発現される細胞受容体に対する親和性を有する、実施形態３３に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３５．標的化リガンドが、インテグリン標的化リガンドを含む、実施形態３４に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３６．インテグリン標的化リガンドが、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである、実施形態３５に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３７．標的化リガンドが、以下の構造：
若しくはその薬学的に許容される塩、又は
若しくはその薬学的に許容される塩を含み、
が、ＲＮＡｉ剤への接続点を示す、
実施形態３６に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３８．標的化リガンドが、以下：
からなる群から選択される構造を有し、
が、ＲＮＡｉ剤への接続点を示す、
実施形態３３～３６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態３９．以下の構造：
を有する標的化リガンドにコンジュゲートされている、実施形態３８に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４０．標的化リガンドが以下の構造：
を有する、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４１．標的化リガンドがセンス鎖にコンジュゲートされている、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４２．標的化リガンドが、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされている、実施形態４１に記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４３．標的化リガンドにコンジュゲートされており、ＡＣ０００２９２、ＡＣ００１２６６、ＡＣ００１２６７、又はＡＣ００１２６８の二本鎖構造を有する、実施形態１～４２のいずれかに記載のＲＮＡｉ剤。
実施形態４４．薬学的に許容される賦形剤を更に含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤を含む組成物。
実施形態４５．終末糖化産物受容体遺伝子発現の発現を阻害することができる第２のＲＮＡｉ剤を更に含む、実施形態４４に記載の組成物。
実施形態４６．１つ以上の更なる治療薬を更に含む、実施形態４４又は４５に記載の組成物。
実施形態４７．吸入による投与のために製剤化される、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４８．定量吸入器、ジェット式ネブライザー、振動メッシュ式ネブライザー、又はソフトミスト吸入器によって送達される、実施形態４７に記載の組成物。
実施形態４９．ＲＮＡｉ剤がナトリウム塩である、実施形態４４～４８のいずれかに記載の組成物。
実施形態５０．薬学的に許容される賦形剤が注射用水である、実施形態４４～４９のいずれかに記載の組成物。
実施形態５１．薬学的に許容される賦形剤が緩衝生理食塩水である、実施形態４４～４９のいずれかに記載の組成物。
実施形態５２．細胞における終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害する方法であって、有効量の実施形態１～４３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤又は実施形態４４～５１のいずれか１つに記載の組成物を細胞に導入することを含む、方法。
実施形態５３．細胞が対象内に存在する、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．対象がヒト対象である、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５．ＲＮＡｉ剤の投与後に、終末糖化産物受容体遺伝子の発現が少なくとも約３０％阻害される、実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．膜型ＲＡＧＥ活性レベルの増強又は上昇に関連する１つ以上の症状又は疾患を処置する方法であって、その処置を必要とするヒト対象に、治療有効量の実施形態４４～５１のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む、方法。
実施形態５７．疾患が呼吸器疾患である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８．呼吸器疾患が、嚢胞性線維症、肺炎、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全症、又は肺癌嚢胞性線維症である、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．疾患が眼疾患である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態６１．眼疾患がドライアイ症候群である、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．ＲＮＡｉ剤が、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約５．０ｍｇの沈着用量で投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．ＲＮＡｉ剤が、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０３ｍｇ～約２．０ｍｇの沈着用量で投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４．ＲＮＡｉ剤が２回以上の用量で投与される、実施形態５２～６１のいずれかに記載の方法。
実施形態６５．膜型ＲＡＧＥ活性及び／又はＡＧＥＲ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤の使用。
実施形態６６．終末糖化産物受容体の受容体活性及び／又は終末糖化産物受容体遺伝子の発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための、実施形態４４～５１のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態６７．終末糖化産物受容体の受容体活性及び／又は終末糖化産物受容体遺伝子の発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための医薬の製造のための、実施形態４４～５１のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態６８．疾患が肺炎症である、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載の使用。
実施形態６９．センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングして二本鎖リボ核酸分子を形成することを含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉ剤を作製する方法。
実施形態７０．センス鎖が標的化リガンドを含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．該センス鎖に標的化リガンドをコンジュゲートすることを含む、実施形態７０に記載の方法。
次に、上記で提供された実施形態及び項目を、以下の非限定的な実施例を用いて説明する。
実施例１．ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の合成。
本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤二本鎖は、以下に従って合成された。
Ａ．合成。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖を、オリゴヌクレオチド合成において使用される固相上でのホスホラミダイト技術に従って合成した。規模に応じて、ＭｅｒＭａｄｅ９６Ｅ（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＭｅｒＭａｄｅ１２（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、又はＯＰ Ｐｉｌｏｔ １００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。合成を、制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Å又は６００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡから入手）から作製された固体支持体上で実施した。それぞれの鎖の３’末端に位置するモノマーを、合成の出発点として固体支持体に結合させた。全てのＲＮＡ及び２’－修飾ＲＮＡホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した。具体的には、使用された２’－Ｏ－メチルホスホラミダイトとしては、以下の：（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ６－（ベンゾイル）－２’－Ｏ－メチル－アデノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシ－トリチル－Ｎ４－（アセチル）－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－アミノ）ホスホラミダイト、（５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ２－（イソブチリル）－２’－Ｏ－メチル－グアノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイト、及び５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイトが挙げられた。２’－デオキシ－２’－フルオロ－ホスホラミダイトは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を有していた。５’－ジメトキシトリチル－２’－Ｏ－メチル－イノシン－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。逆位脱塩基（３’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－デオキシリボース－５’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。以下のＵＮＡホスホラミダイト：５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ６－（ベンゾイル）－２’，３’－セコ－アデノシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト、５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ－アセチル－２’，３’－セコ－シトシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソ－プロピル）］－ホスホラミダイト、５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ－イソブチリル－２’，３’－セコ－グアノシン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト、及び５’－（４，４’－ジメトキシ－トリチル）－２’，３’－セコ－ウリジン、２’－ベンゾイル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソ－プロピル）］－ホスホラミダイトを使用した。ＴＦＡアミノリンクホスホラミダイトも市販品を購入した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。リンカーＬ６はＢｒｏａｄＰｈａｒｍからプロパルギル－ＰＥＧ ５－ＮＨＳとして購入し（カタログ番号ＢＰ－２０９０７）、標準的なカップリング条件を使用して、アミノリンクホスホラミダイトからのＮＨ２－Ｃ６基にカップリングさせて、－Ｌ６－Ｃ６－を形成した。リンカーＡｌｋ－ｃｙＨｅｘは、同様に、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（アルキンホスホラミダイト、５’－末端）からプロパルギル含有化合物ホスホラミダイト化合物として市販品を購入し、リンカー－Ａｌｋ－ｃｙＨｅｘ－を形成した。各々の場合において、ホスホロチオエート結合を、本明細書に記載される条件を使用して指定された通りに導入した。シクロプロピルホスホネートホスホラミダイトは、国際公開第２０１７／２１４１１２号に従って合成した。
トリ－アルキン含有ホスホラミダイトを無水ジクロロメタン又は無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、他の全てのアミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を添加した。５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）又は５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ－Ｍｅ）、及び６０秒（２’Ｆ）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３－フェニル１，２，４－ジチアゾリン－５－オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡから入手）の１００ｍＭ溶液を使用した。
あるいは、トリ－アルキン部分を合成後に導入した（以下のセクションＥを参照のこと）。この経路のために、センス鎖を、第一級アミンを含有する５’及び／又は３’末端ヌクレオチドで官能化した。ＴＦＡアミノリンクホスホラミダイトを無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を添加した。５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）又は５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ－Ｍｅ）、及び６０秒（２’Ｆ）であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル中の３－フェニル１，２，４－ジチアゾリン－５－オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡから入手）の１００ｍＭ溶液を使用した。
Ｂ．支持体結合オリゴマーの切断及び脱保護。固相合成の終了後、乾燥した固体支持体を、４０重量％のメチルアミン水溶液と２８％～３１％水酸化アンモニウム溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）との１：１体積溶液で、３０℃で１．５時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残留物を水中で再構成した（下記参照）。
Ｃ．精製。粗オリゴマーを、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ １３μｍカラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８システムを使用して陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０であり、２０％アセトニトリルを含有し、緩衝液Ｂは１．５ Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ａと同じであった。２６０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。適切な画分をプールし、次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ ｆｉｎｅを充填したＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＸＫ １６／４０カラムを使用して、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ６．７及び２０％アセトニトリル又は濾過水の泳動緩衝液を用いてサイズ排除ＨＰＬＣにかけた。あるいは、プールした画分を脱塩し、接線流濾過を介して適切な緩衝液又は溶媒系に交換した。
Ｄ．アニーリング。１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、１×、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の等モルＲＮＡ溶液（センス及びアンチセンス）を組み合わせることによって相補鎖を混合して、ＲＮＡｉ剤を形成した。いくつかのＲＮＡｉ剤を凍結乾燥し、－１５～－２５℃で保存した。二本鎖濃度は、１×ＰＢＳ中、ＵＶ－Ｖｉｓ分光計で溶液吸光度を測定することによって決定した。次いで、２６０ｎｍでの溶液吸光度に変換係数（０．０５０ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ））及び希釈係数を掛けて、二本鎖濃度を決定した。
Ｅ．トリ－アルキンリンカーのコンジュゲーション。いくつかの実施形態において、トリ－アルキンリンカーは、ホスホラミダイトとして樹脂上のＲＮＡｉ剤のセンス鎖にコンジュゲートされる（例示的なトリ－アルキンリンカーホスホラミダイトの合成については実施例１Ｇを、ホスホラミダイトのコンジュゲーションについては実施例１Ａを参照のこと。）。他の実施形態において、トリ－アルキンリンカーは、樹脂からの切断後に、以下に記載のようにセンス鎖にコンジュゲートされ得る：アニーリングの前又は後に、いくつかの実施形態において、５’又は３’アミン官能化センス鎖は、トリ－アルキンリンカーにコンジュゲートされる。本明細書に開示される構築物の形成に使用することができる例示的なトリ－アルキンリンカー構造は、以下の通りである。
トリ－アルキンリンカーをアニーリングされた二本鎖にコンジュゲートするために、アミン官能化二本鎖を９０％ＤＭＳＯ／１０％Ｈ２Ｏ中に約５０～７０ｍｇ／ｍＬで溶解した。４０当量のトリエチルアミンを添加し、続いて３当量のトリ－アルキン－ＰＮＰを添加した。完了してから、コンジュゲートを１×リン酸緩衝生理食塩水／アセトニトリル（１：１４比）の溶媒系中で２回沈殿させ、乾燥させた。
Ｆ．標的化リガンドＳＭ６．１の合成
（（Ｓ）－３－（４－（４－（（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）オキシ）ナフタレン－１－イル）フェニル）－３－（２－（４－（（４－メチルピリジン－２－イル）アミノ）ブタンアミド）アセトアミド）プロパン酸）
化合物５（ｔｅｒｔ－ブチル（４－メチルピリジン－２－イル）カルバメート）（０．５０１ｇ、２．４０６ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（１７ｍＬ）に溶解した。混合物にＮａＨ（０．１１６ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ、１．２５当量、油中６０％分散液）を添加した。混合物を１０分間撹拌した後、化合物２０（エチル４－ブロモブチレート（０．７４５ｇ、３．８２ｍｍｏｌ、０．５４７ｍＬ））（Ｓｉｇｍａ１６７１１８）を添加した。３時間後、反応物をエタノール（１８ｍＬ）でクエンチし、濃縮した。濃縮物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ水溶液（１×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をシリカカラム、ＤＣＭ中０～５％メタノールの勾配で精製した。
化合物２１（０．８０ｇ、２．３７８ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのアセトン：０．１Ｍ ＮａＯＨ［１：１］に溶解した。反応物をＴＬＣ（ヘキサン中５％酢酸エチル）によってモニターした。有機物を濃縮除去し、残留物を０．３Ｍクエン酸（４０ｍＬ）でｐＨ３～４に酸性化した。生成物をＤＣＭ（３×７５ｍＬ）で抽出した。有機物をプールし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物を更に精製することなく使用した。
化合物２２（１．１ｇ、３．９５ｍｍｏｌ、１当量）、化合物４５（５９５ｍｇ、４．７４ｍｍｏｌ、１．２当量）、及びＴＢＴＵ（１．５２ｇ、４．７４ｍｍｏｌ、１．２当量）の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２．０６ｍＬ、１１．８５ｍｍｏｌ、３当量）を０℃で添加した。反応混合物を室温に加温し、３時間撹拌した。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）によってクエンチした。水相を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルを固定相として使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって生成物を分離した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋３６６．２０、実測値３６７。
化合物６１（２ｇ、８．９６ｍｍｏｌ、１当量）及び化合物６２（２．１３ｍＬ、１７．９３ｍｍｏｌ、２当量）の無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２．４８ｇ、１７．９３ｍｍｏｌ、２当量）を０℃で添加した。反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。反応物を水（１０ｍＬ）によってクエンチした。水相を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルを固定相として使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって生成物を分離した。
化合物６０（１．７７ｇ、４．８４ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液に、水酸化リチウム一水和物（０．６１ｇ、１４．５３ｍｍｏｌ、３当量）を０℃で少しずつ添加した。反応混合物を室温に加温した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物をＨＣｌ（６Ｎ）によってｐＨ３．０に酸性化した。水相を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋３５２．１８、実測値３５２。
化合物６３（１．８８ｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、ヘキサン中のｎ－ＢｕＬｉ（３．６ｍＬ、９．０ｍｍｏｌ、１．５当量）を－７８℃で滴下した。反応物を－７８℃で更に１時間維持した。次いで、ホウ酸トリイソプロピル（２．０８ｍＬ、９．０ｍｍｏｌ、１．５当量）を混合物に－７８℃で添加した。次いで、反応物を室温まで加温し、更に１時間撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２０ｍＬ）によってクエンチし、ｐＨを３に調整した。水相をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。
化合物１２（３００ｍｇ、０．８３７ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物６５（３４９ｍｇ、１．２５６ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（１３ｍｇ、０．０１６７ｍｍｏｌ、０．０２当量）、及びＫ３ＰＯ４（３５５ｍｇ、１．６７５ｍｍｏｌ、２．０当量）を丸底フラスコ中で混合した。フラスコをスクリューキャップセプタムで密封し、次いで排気し、窒素で再充填した（このプロセスを合計３回繰り返した）。次いで、ＴＨＦ（８ｍＬ）及び水（２ｍＬ）を、シリンジを介して添加した。混合物を窒素で２０分間バブリングし、反応物を室温で一晩維持した。反応物を水（１０ｍＬ）でクエンチし、水相を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルを固定相として使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって精製し、１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋５１２．２４、実測値５１２．５６。
化合物６６（８５８ｍｇ、１．６７７ｍｍｏｌ、１．０当量）を氷浴で冷却した。ジオキサン中のＨＣｌ（８．４ｍＬ、３３．５４ｍｍｏｌ、２０当量）をフラスコに添加した。反応物を室温に加温し、更に１時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物を更に精製することなく直接使用した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋４１２．１８、実測値４１２．４６。
化合物６４（５００ｍｇ、１．４２３ｍｍｏｌ、１当量）、化合物６７（６６９ｍｇ、１．４９４ｍｍｏｌ、１．０５当量）、及びＴＢＴＵ（５４８ｍｇ、０．４９２ｍｍｏｌ、１．２当量）の無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．７４４ｍＬ、４．２６８ｍｍｏｌ、３当量）を０℃で添加した。反応混合物を室温に加温し、更に１時間撹拌した。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）によってクエンチし、生成物を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルを固定相として使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）によって生成物を精製し、ＤＣＭ中３～４％メタノールで溶出した。収率は９６．２３％であった。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋７４５．３５、実測値７４６．０８。
化合物６８（１．０２ｇ、１．３６９ｍｍｏｌ、１当量）の酢酸エチル（１０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１５ｇ、５０％Ｈ２Ｏ）を室温で添加した。反応混合物を室温に加温し、反応物をＬＣ－ＭＳによってモニターした。反応物を室温で一晩維持した。固体をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した。生成物を更に精製することなく直接使用した。ＬＣ－ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋６５５．３１、実測値６５５．８７。
化合物６９（１００ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ、１当量）及びアジド－ＰＥＧ５－ＯＴｓ（１２８ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ、２当量）の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（４２ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ、２当量）を０℃で添加した。反応混合物を８０℃で６時間撹拌した。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液によってクエンチし、水層を酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋９００．４０、実測値９０１．４６。
化合物７２（５９ｍｇ、０．０６５６ｍｍｏｌ、１．０当量）のＴＨＦ（２ｍＬ）及び水（２ｍＬ）溶液に、水酸化リチウム（５ｍｇ、０．１９７ｍｍｏｌ、３．０当量）を室温で添加した。混合物を室温で更に１時間撹拌した。ＨＣｌ（６Ｎ）によってｐＨを３．０に調整し、水相をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ＴＦＡ（０．５ｍＬ）及びＤＣＭ（０．５ｍＬ）を残留物に添加し、混合物を室温で更に３時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。ＬＣ－ＭＳ：計算値［Ｍ＋Ｈ］＋７８６．３７、実測値７８６．９５。
Ｇ．ＴｒｉＡｌｋ １４の合成
上記表１１に示されるようなＴｒｉＡｌｋ１４及び（ＴｒｉＡｌｋ１４）ｓは、以下に示される合成経路を使用して合成され得る。化合物１４は標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を使用してホスホラミダイトとしてセンス鎖に付加され得、又は化合物２２はアミドカップリング反応においてアミンを含むセンス鎖にコンジュゲートされ得る。
３Ｌのジャケット付き反応器に、５００ｍｌのＤＣＭ及び４（７５．０ｇ、０．１６ｍｏｌ）を添加した。反応物の内部温度を０℃に冷却し、ＴＢＴＵ（１７０．０ｇ、０．５３ｍｏｌ）を添加した。次いで、懸濁液を、内部温度を５℃未満に維持しながら、アミン５（７５．５ｇ、０．５３ｍｏｌ）を滴下して処理した。次いで、反応物を、内部温度を５℃未満に維持しながら、ＤＩＰＥＡ（７２．３ｇ、０．５６ｍｏｌ）でゆっくり処理した。加え終えた後、反応物を１時間かけて２３℃まで加温し、３時間撹拌した。全３種の試薬の１０％キッカーチャージを添加し、更に３時間撹拌した。４の残りが１％未満になったときに反応を完了と見なした。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液（２×５００ｍＬ）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（５００ｍＬ）で１回洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。粗油状物の質量は１８８ｇであり、ＱＮＭＲで７２％の６を含有していた。粗油状物を次の工程に移した。Ｃ４６Ｈ６０Ｎ４Ｏ１１の質量の計算値８４５．０ｍ／ｚ。実測値［Ｍ＋Ｈ］＝８４６．０。
７２重量％の化合物６（８６．０ｇ、０．１０ｍｏｌ）を含有する１２１．２ｇの粗油状物をＤＭＦ（３４４ｍＬ）に溶解し、内部温度を２３℃未満に維持しながらＴＥＡ（８６ｍＬ、２０ｖ／ｖ％）で処理した。Ｆｍｏｃ－アミン６の消費量に対するジベンゾフルベン（ＤＢＦ）の形成をＨＰＬＣ方法１によってモニターし（図２）、反応は１０時間以内に完了した。この溶液にグルタル酸無水物（１２．８ｇ、０．１１ｍｏｌ）を添加し、２時間以内に中間体アミン７が化合物８に変換された。完了後、ＤＭＦ及びＴＥＡを減圧下３０℃で除去し、１００ｇの粗油状物を得た。化合物７の水への溶解度が高いため、水系後処理を使用することができず、クロマトグラフィーがＤＢＦ、ＴＭＵ、及びグルタル酸無水物を除去する唯一の方法である。粗油状物（７５ｇ）をＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで３回に分けて精製した。粗油状物（２５ｇ）を３３０ｇシリカカラムに充填し、０～２０％メタノール／ＤＣＭから３０分かけて溶出し、４２ｇの化合物８を得た（３工程で収率５４％）。Ｃ３６Ｈ５５Ｎ４Ｏ１２の質量の計算値７３６．４ｍ／ｚ。実測値［Ｍ＋Ｈ］＝７３７．０。
化合物８（４２．０ｇ、０．０５７ｍｏｌ）を、使用前に１０倍量のアセトニトリルと共ストリッピングしてクロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを全て除去した。油状物をＤＭＦ（２１０ｍＬ）に再溶解し、０℃に冷却した。この溶液を４－ニトロフェノール（８．７ｇ、０．０６３ｍｏｌ）、続いてＥＤＣ－塩酸塩（１２．０ｇ、０．０６３ｍｏｌ）で処理し、１０時間以内に完了したことを確認した。溶液を０℃に冷却し、１０倍量の酢酸エチルに続いて１０倍量の飽和塩化アンモニウム溶液を、内部温度を１５℃未満に維持しながら添加した。層を分離させ、酢酸エチル層をブラインで洗浄した。合わせた水層を５倍量の酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。粗油状物（５５ｇ）をＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで３回に分けて精製した。粗油状物（２５ｇ）を３３０ｇシリカカラムに充填し、０～１０％メタノール／ＤＣＭから３０分かけて溶出し、２２ｇの純粋な９（化合物２２）を得た（収率５０％）。Ｃ４２Ｈ５９Ｎ５Ｏ１４の質量の計算値８５７．４ｍ／ｚ。実測値［Ｍ＋Ｈ］＝８５８．０。
エステル９（４９．０ｇ、５７．１ｍｍｏｌ）及び６－アミノ－１－ヘキサノール（７．３６ｇ、６．２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３倍量）溶液を、トリエチルアミン（１１．５６ｇ、１１１．４ｍｍｏｌ）を滴下して処理した。ＨＰＬＣ方法１で化合物９の消失を観察することにより反応をモニターし、１０分で完了したことを確認した。粗反応混合物を５倍量のジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウム（５倍量）及びブライン（５倍量）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。粗油状物を、３３０ｇシリカカラムを用いてＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）精製システムで精製した。４－ニトロフェノールを１００％酢酸エチルで溶出し、２０％メタノール／ＤＣＭを用いてカラムから１０を洗い流し、無色の油状物を得た（３９ｇ、収率８１％）。Ｃ４２Ｈ６９Ｎ５Ｏ１２の質量の計算値８３６．０ｍ／ｚ。実測値［Ｍ＋Ｈ］＝８３７．０。
アルコール１０を１０倍量のアセトニトリルと２回共ストリッピングしてクロマトグラフィー溶媒から残留メタノールを全て除去し、乾燥ジクロロメタン（ＫＦ＜６０ｐｐｍ）と再度共ストリッピングして微量の水を除去した。アルコール１０（２．３０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を５倍量の乾燥ジクロロメタン（ＫＦ＜５０ｐｐｍ）に溶解し、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１８８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）で処理した。溶液を０℃に冷却し、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホラミダイト（１．００ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を滴下して処理した。溶液を氷浴から取り出し、２０℃で撹拌した。反応が３～６時間以内に完了したことを確認した。反応混合物を０℃に冷却し、１０倍量の飽和重炭酸アンモニウム／ブラインの１：１溶液で処理し、次いで１分間かけて周囲温度に加温し、２０℃で更に３分間撹拌した。二相混合物を分液漏斗に移し、１０倍量のジクロロメタンを添加した。有機層を分離し、１０倍量の飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄して未反応のビスリン試薬を加水分解した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得、３．０８ｇの９４重量％の化合物１４を得た。Ｃ５１Ｈ８６Ｎ７Ｏ１３Ｐの質量の計算値１０３５．６ｍ／ｚ。実測値［Ｍ＋Ｈ］＝１０３６。
Ｈ．標的化リガンドのコンジュゲーション。アニーリングの前又は後のいずれかに、５’又は３’三座アルキン官能化センス鎖を、標的化リガンドにコンジュゲートさせる。以下の実施例は、アニーリングされた二本鎖への標的化リガンドのコンジュゲーションについて記載する：０．５Ｍのトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、０．５Ｍの硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）及び２Ｍのアスコルビン酸ナトリウム溶液の原液を脱イオン水中で調製した。標的化リガンドのＤＭＳＯ溶液７５ｍｇ／ｍＬを作製した。トリ－アルキン官能化二本鎖（３ｍｇ、７５μＬ、脱イオン水中４０ｍｇ／ｍＬ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を収容する１．５ｍＬ遠心管に、２５μＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．５緩衝液を添加する。ボルテックスした後、３５μＬのＤＭＳＯを添加し、溶液をボルテックスする。標的化リガンドを反応物に添加し（６当量／二本鎖、２当量／アルキン、約１５μＬ）、溶液をボルテックスする。ｐＨ紙を使用してｐＨをチェックし、ｐＨが約８であることを確認した。別個の１．５ｍＬ遠心管中で、５０μＬの０．５ＭのＴＨＰＴＡを１０μＬの０．５Ｍ Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏと混合し、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。５分後、ＴＨＰＴＡ／Ｃｕ溶液（７．２μＬ、６当量５：１ ＴＨＰＴＡ：Ｃｕ）を反応バイアルに添加し、ボルテックスした。その直後に、２Ｍアスコルベート（５μＬ、二本鎖当たり５０当量、アルキン当たり１６．７当量）を反応バイアルに添加し、ボルテックスした。反応が完了してから（典型的には０．５～１時間で完了）、反応物を直ちに非変性陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
実施例２．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ気管内投与。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を介して２００マイクロリットルの等張生理食塩水又は１．０ｍｇ／ｋｇの以下のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のうちの１つを投与した。
表１２に示すように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７４、ＡＤ０７４７５、ＡＤ０７４７６、及びＡＤ０７４７７の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（対応するアンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない対応するセンス鎖を示す）に示されている。
ＡＤ０６９４９及びＡＤ０７２５６は、ヒトＡＧＥＲ遺伝子と相同性を有していないラット及びマウス特異的配列であり、以下のように化学修飾された。
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０６９４９
修飾センス鎖（５’→３’）：
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｃｓｃａｃａｕｇａＵｆＣｆＣｆａｕｇｃｕｉａｇｕａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号８８８）
修飾アンチセンス鎖（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｃｓＵｆｃＡｆｇＣｆａＵｆｇＧｆａＵｆｃＡｆｕＧｆｕＧｆｓｇ（配列番号８８９）
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０７２５６
修飾センス鎖（５’→３’）：
Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－（ＴＡ１４）ｃｓｃａｃａｕｇａＵｆＣｆＣｆａｕｇｃｕｉａｇｕａｓ（ｉｎｖＡｂ）（配列番号８９０）
修飾アンチセンス鎖（５’→３’）：
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｃｓＵｆｃＡｆｇＣｆａＵｆｇＧｆａＵｆｃＡｆｕＧｆｕＧｆｓｇ（配列番号８９１）
１群当たり５匹のラットに投薬した。試験８日目にラットを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表１３のデータに示されるように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々は有意なＡＧＥＲ遺伝子阻害を示し、１７７位での発現を阻害するように標的化されたＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（群４（８０．５％阻害）及び群５（８７．５％阻害））は、ＡＧＥＲ遺伝子の１７８位を標的化するＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（群６（７０．６％阻害）及び群７（７７％阻害））と比較してわずかに良好な阻害を提供した。
実施例３．マウスにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ気管内投与。
試験１日目に、雄のｃ５７ｂｌ／６マウスに、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を介して５０マイクロリットルの等張生理食塩水又は３．０ｍｇ／ｋｇの以下のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のうちの１つを投与した。
表１４に示すように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７８、ＡＤ０７４７９、ＡＤ０７４８０、及びＡＤ０７４８１の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０６９４９及びＡＤ０７２５６の化学修飾配列は、上記実施例２に示されている。
１群当たり５匹のマウスに投薬した。試験８日目にマウスを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。マウスＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表１５のデータに示されるように、群４及び５のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（３８４位を標的化）は、阻害を示さず、インビボで完全に不活性であった。群６及び７のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤（３９１位を標的化）は、比較的限定されたインビボでの阻害を示し、ヒトを処置するための実現性のある治療薬候補とみなされるには活性が不十分と思われる。
実施例４．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ気管内投与。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を介して２００マイクロリットルの等張生理食塩水又は０．５ｍｇ／ｋｇの以下のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のうちの１つを投与した。
表１６に示すように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７４、ＡＤ０７４７５、ＡＤ０７７００、ＡＤ０７７０１、ＡＤ０７７０２、ＡＤ０７７０３、ＡＤ０７７０４、ＡＤ０７７０５、ＡＤ０７７０６、ＡＤ０７７０７、及びＡＤ０７７０８の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。
１群当たり５匹のラットに投薬した。試験８日目にラットを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表１７のデータに示されるように、各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、わずか０．５ｍｇ／ｋｇの用量で有意なＡＧＥＲ遺伝子阻害を示した。試験した各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、異なる化学修飾を含むが、全てがＡＧＥＲ遺伝子の１７７位を標的化する基礎ヌクレオチド配列を含んでいた。
実施例５．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ吸入エアロゾル投与。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０７４７５の単回肺沈着用量（ＰＤＤ）０．５ｍｇ／ｋｇを投与した。ジェット式ネブライザー（Ｍｉｓｔｙ Ｍａｘ １０）を使用して、エアロゾルを、げっ歯動物の一段式フローパスト型鼻部吸入曝露チャンバー（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に送達した。ＲＮＡｉ剤エアロゾル濃度を評価することができるように、ポートの１つにフィルターハウジングを取り付けた。げっ歯類の体重に対してアロメトリックスケーリングされた推定毎分呼吸量を、フィルター収集及びＲＮＡｉ剤定量から決定されたエアロゾル濃度と共に使用して、曝露時間を、報告されたＰＤＤの０．５ｍｇ／ｋｇを標的とするように調整した。示されるように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７５の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。
１群当たり５匹のラットに投薬した。ラットを、以下のスケジュールに従って投与後の様々な試験日に屠殺した。
それぞれの日に屠殺した後、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表１９のデータに示されるように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７５は、わずか０．５ｍｇ／ｋｇの用量で有意なＡＧＥＲ遺伝子阻害を示し、ノックダウンの期間は少なくとも２２日目まで維持され、その後ベースラインレベルにゆっくりと戻り始めた。このことから、月１回の投薬（例えば、２８日毎の投与）が実現可能であり得ることが示唆された。
実施例６．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ吸入エアロゾル投与及び標的化リガンド作用。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、様々な濃度のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０７４７５、又はαｖβ６上皮細胞標的化リガンドが結合していないＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ７４７５を単回投与した。ジェット式ネブライザー（Ｍｉｓｔｙ Ｍａｘ １０）を使用して、エアロゾルを、げっ歯動物の一段式フローパスト型鼻部吸入曝露チャンバー（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に送達した。ＲＮＡｉ剤エアロゾル濃度を評価することができるように、ポートの１つにフィルターハウジングを取り付けた。げっ歯類の体重に対してアロメトリックスケーリングされた推定毎分呼吸量を、フィルター収集及びＲＮＡｉ剤定量から決定されたエアロゾル濃度と共に使用して、曝露時間を、表２０に列挙される報告されたＰＤＤを標的とするように調整した。標的化リガンドを含む群については、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７５の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。投薬群は以下の通りであった。
１群当たり５匹のラットに投薬した。試験８日目にラットを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表２１のデータに示されるように、測定された各時点において、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７５は、標的化リガンドあり及びなしの両方で、対照と比較して実質的な阻害を示した。実際、試験した最も低用量の０．０１５ｍｇ／ｋｇの沈着用量であっても、阻害レベルは５０％に近かった（群６（標的化リガンドＴｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６あり；５６．４％の遺伝子阻害）及び群１１（標的化リガンドなし；４６．３％の遺伝子阻害）を参照のこと）。更に、測定されたそれぞれの用量レベルの各々において、標的化リガンドにコンジュゲートされたＲＮＡｉ剤は、標的化リガンドを有していないＲＮＡｉ剤よりも数値的に優れており（その差は概して用量レベルが低くなると顕著になる）、このことはインビボでの阻害活性を増加させることができるリガンド作用の存在を示している。
実施例７．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ気管内投与。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を介して２００マイクロリットルの等張生理食塩水又は０．２５ｍｇ／ｋｇの以下のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のうちの１つを投与した。
表２２に示すように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤ＡＤ０７４７４、ＡＤ０７４７５、ＡＤ０７９７２、ＡＤ０７９７３、ＡＤ０７９７４、ＡＤ０７９７５、及びＡＤ０７９７６の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。
１群当たり５匹のラットに投薬した。試験８日目にラットを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表２３のデータに示されるように、各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、わずか０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で有意なＡＧＥＲ遺伝子阻害を示した。試験した各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、異なる化学修飾を含むが、全てがＡＧＥＲ遺伝子の１７７位を標的化する基礎ヌクレオチド配列を含んでいた。
実施例８．ラットにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ気管内投与。
試験１日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を介して２００マイクロリットルの等張生理食塩水又は０．２５ｍｇ／ｋｇの以下のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のうちの１つを投与した。
表２４に示すように、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の各々を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。
実施例８におけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。
１群当たり５匹のラットに投薬した。試験８日目にラットを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に両肺から全ＲＮＡを単離した。ラットＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、ラットＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表２５のデータに示されるように、各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、わずか０．１ｍｇ／ｋｇの用量で有意なＡＧＥＲ遺伝子阻害を示した。試験した各ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤は、異なる化学修飾を含むが、全てがＡＧＥＲ遺伝子の１７７位を標的化する基礎ヌクレオチド配列を含んでいた。
実施例９．カニクイザルにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ吸入エアロゾル投与。
試験１日目に、雌のカニクイザルに、ＰＤＤ１ｍｇ／ｋｇでＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０９１５０、Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０９１５１、又はＴｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０９１５２の単回用量を投与した。振動メッシュ式ネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）Ｓｏｌｏ）を使用して、エアロゾルを、霊長類用吸入ヘルメットを装着した拘束麻酔サルに送達した。ＲＮＡｉ剤エアロゾル濃度を評価することができるように、ヘルメットの１つにフィルターハウジングを取り付けた。げっ歯類の体重に対してアロメトリックスケーリングされた推定毎分呼吸量を、フィルター収集及びＲＮＡｉ剤定量から決定されたエアロゾル濃度と共に使用して、曝露時間を、表２６に列挙される報告されたＰＤＤを標的とするように調整した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６インテグリン受容体標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（各アンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６インテグリン受容体標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない各センス鎖を示す）に示されている。投薬群は以下の通りであった。
１群当たり３匹のサルに投薬した。試験１５日目にサルを屠殺し、収集及びホモジナイゼーション後に肺試料から全ＲＮＡを単離した。以下の表２７のデータは、遠位左後葉（distal left caudal lobe）からサンプリングされたｍＲＮＡ発現を示す。以下の表２８のデータは、遠位右後葉からサンプリングされたｍＲＮＡ発現を示す。カニクイザルＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、カニクイザルベータアクチン発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表２８のデータに示されるように、ＲＮＡｉ剤ＡＤ０９１５０及びＡＤ０９１５１は、対照と比較して実質的な阻害（９３％）を示し、このことは非ヒト霊長類におけるＡＧＥＲ発現を強固（ロバスト）にサイレンシングする能力を実証する。
別個のｑＰＣＲアッセイにおいて、カニクイザルＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を定量した。以下の表２９～４２のデータは、カニクイザル肺試料からサンプリングしたｍＲＮＡ発現を示す。カニクイザルＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、カニクイザルベータアクチン発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。一部の肺組織については、入手可能な場合は異なる組織試料、例えば、遠位左後葉及び遠位左前葉で繰り返した。
上記表２９～４２のデータに示されるように、ＲＮＡｉ剤ＡＤ０９１５０及びＡＤ０９１５１は、対照と比較して実質的な阻害（最大９２％）を示し、このことは非ヒト霊長類におけるＡＧＥＲ発現を強固にサイレンシングする能力を実証する。
実施例１０．気道炎症のラットモデルにおけるＲＡＧＥノックダウンのインビボでの抗炎症効果（エアロゾルにより送達）。
試験１日目及び試験１５日目に再び、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、以下の表４３に従って、０．５ｍｇ／ｋｇの沈着用量のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０７４７５、又はＲＮＡｉ剤を含まないビヒクル対照を投与した。ジェット式ネブライザー（Ｍｉｓｔｙ Ｍａｘ １０）を使用して、エアロゾルを、げっ歯動物の一段式フローパスト型鼻部吸入曝露チャンバー（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に送達した。ＲＮＡｉ剤エアロゾル濃度を評価することができるように、ポートの１つにフィルターハウジングを取り付けた。げっ歯類の体重に対してアロメトリックスケーリングされた推定毎分呼吸量を、フィルター収集及びＲＮＡｉ剤定量から決定されたエアロゾル濃度と共に使用した。
４０日目に、群４及び群５のラットを、生理食塩水中で調製したＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ（Ａｌｔ）の単回気管内用量４００ｕｇ／ラットでチャレンジし、群２及び３のラットには、４００ｕｇ／ラットの用量の生理食塩水対照を投与した。群Ｎ－１のラットは未処置（ナイーブ）であり、処置を施さなかった。
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａの投与の４８時間後（すなわち、４２日目）に、ラットをイソフルラン／Ｏ２で麻酔し、採血し、放血により安楽死させた。気管にカニューレを挿入し、２×１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を回収した。ＢＡＬ試料をスピンダウンし、細胞を１ｍＬの氷冷ＰＢＳで再懸濁し、アリコートをチュルク液と混合し（比率１：１）、総細胞数を血球計算盤によって計数した。サイトスピンを準備し、染色し、細胞種別計数を行った。上清を使用して、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）及びサイトカイン測定を行った。１つの葉を用いてＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を測定し、組織試料を分析してＲＡＧＥタンパク質の濃度を評価した。
顆粒球（好酸球及び好中球の両方）は、細胞性炎症についての周知のマーカーである。ＢＡＬ試料について、総細胞及び細胞種別計数を行い、炎症細胞数を導出した。群５（ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与し、組織をＡｌｔｅｒｎａｒｉａによってチャレンジした）は、群４（ＲＮＡｉ剤を投与せず）と比較して、炎症細胞の減少を示した。
更に、ＶＥＧＦは血管リモデリングを引き起こすことが知られており、炎症によって誘導される。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を投与された群（群３及び５）は、試験されたＢＡＬ試料中のＶＥＧＦレベルの減少を示した。
実施例１１．気道炎症のラットモデルにおけるＲＡＧＥノックダウンのインビボでの抗炎症効果（気管内マイクロスプレーにより送達）。
試験１日目、８日目、及び２９日目に、雄のＢｒｏｗｎ－Ｎｏｒｗａｙラットに、３ｍｇ／ｋｇ（１．５ｍＬ／ｋｇ）の用量のＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０７４７５又はビヒクルを投与した。１．５ｍＬ／ｋｇで計算された量を、マイクロスプレー装置（Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に接続されたシリンジに充填した。
４３日目に、群３及び群４のラットを、生理食塩水中で調製したＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａの単回気管内用量４００ｕｇ／ラットでチャレンジし、群１及び２のラットには、４００ｕｇ／ラットの用量の生理食塩水対照を投与した。群Ｎ－１のラットは未処置であり、処置を施さなかった。
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａの投与の４８時間後（すなわち、４５日目）に、ラットをイソフルラン／Ｏ２で麻酔し、採血し、放血により安楽死させた。気管にカニューレを挿入し、２×１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を回収した。ＢＡＬ試料をスピンダウンし、細胞を１ｍＬの氷冷ＰＢＳで再懸濁し、アリコートをチュルク液と混合し（比率１：１）、総細胞数を血球計算盤によって計数した。サイトスピンを準備し、染色し、細胞種別計数を行った。上清を使用して、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）及びサイトカイン測定を行った。１つの葉を用いてＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を測定し、組織の一部を用いてＲＡＧＥタンパク質の組織濃度を測定した。
血清及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）試料中の可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）をＥＬＩＳＡによって測定した。ｓＲＡＧＥは、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投与によってほぼ完全に減少した（群２及び４を参照のこと）。
更に、先の実施例で述べたように、顆粒球（好酸球及び好中球の両方）は、細胞性炎症についての周知のマーカーである。ＢＡＬ試料について、総細胞及び細胞種別計数を行い、炎症細胞数を導出した。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ抽出物によって誘導される好酸球性炎症に対する、本明細書に開示されるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤によるＲＡＧＥ阻害の影響を評価した。群４（ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤で処置した）は、群３（ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤未投与）と比較して、総顆粒球の減少を示した。
ＭＩＰ１ａ、ＩＬ－１３、ＩＰ－１０及びＶＥＧＦなどの他のバイオマーカーもまた、細胞性炎症を示す。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａチャレンジ群について、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投与（群４）は、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤未投与群（群３）と比較して、これらの炎症性バイオマーカーの各々の減少をもたらした。
実施例１２．カニクイザルにおけるＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ吸入エアロゾル投与の用量応答。
１５匹の雌のカニクイザルを無作為に５つの処置群に割り当てた。動物に、以下の表４５に要約したように投薬した。麻酔を必要とする試験日の前夜に動物を絶食させたが、水は自由に与えた。動物をケタミン塩酸塩（５～１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で麻酔し、続いてイソフルラン吸入を行った。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行うための小児用光ファイバー気管支鏡の挿入を可能にし、気管内チューブを通じた曝露を可能にするため、適切な大きさのカフ付き気管内チューブが気管分岐部のすぐ近位に挿入されるまで、動物にまずマスクを用いてイソフルラン（４～５％）で麻酔した。麻酔した動物を曝露システムに移し、人工呼吸器に接続した。麻酔し、換気を施した動物に、等張生理食塩水又はＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤Ｔｒｉ－ＳＭ６．１－αｖβ６－ＡＤ０９１５１（ＡＣ００１２６７）のいずれかによる単回吸入曝露を行った。曝露期間中、Ｈａｒｖａｒｄポンプを１０～１５ｍＬ／ｋｇの一回換気量、３０呼吸／分、及び３５：６５の吸気量に設定して使用して、動物に換気を施した。曝露終了後、麻酔を解除し、動物を回復ステーションで、毛布又はＢａｉｒ Ｈｕｇｇｅｒで覆い、心拍数及びＯ２飽和度を連続的に取得するためにモニターデバイスに接続した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤を、センス鎖の５’末端で三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１、図１を参照のこと）にコンジュゲートさせ、等張生理食塩水中で製剤化した。ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の化学修飾配列は、表７Ｂ（二本鎖を示す）、表３（対応するアンチセンス鎖を示す）及び表５（リンカーを有するが、三座小分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンド（Ｔｒｉ－ＳＭ６．１）を有していない対応するセンス鎖を示す）に示されている。
[表４６]
曝露の７日前及び吸入曝露の２～４週間後（－７日目、１５日目、２９日目）の時点で、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び採血（血清）を行った。２９日目の試料採取の直前に全ての動物を安楽死させて、肺組織を回収した。
各動物の左肺を組織学的検査のために採取した。右肺を取得し、肺葉を分離して個々に秤量し、瞬間凍結した。分離した肺葉を、気道に対して垂直な縦断面でスライスされた３つのほぼ等しい断片に切り分けた。すなわち、分離した肺葉を、気道に対して垂直な縦断面で３つのほぼ等しい断片に、すなわち近位、中間、及び遠位に切り分けた。前葉及び中葉については、近位切片から２～３個、他の２つの切片から３個の等分した試料を回収した。目に見える気道の有無にかかわらず、ほぼ等しいサイズの組織立方体が得られた。
以下の表４７～７１のデータは、カニクイザル肺試料からサンプリングしたｍＲＮＡ発現を示す。カニクイザルＡＧＥＲ ｍＲＮＡ発現を、プローブベースの定量的ＰＣＲによって定量化し、カニクイザルＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群に対する割合として表した（幾何平均、＋／－９５％信頼区間）。
上記表４７～７１のデータに示されるように、ＲＮＡｉ剤ＡＤ０９１５１は、対照と比較して実質的な阻害（０．３１ｍｇ／ｋｇ及び０．４７ｍｇ／ｋｇの単回吸入用量で７０％超の阻害を観察）を示し、このことは非ヒト霊長類におけるＡＧＥＲ発現を強固にサイレンシングする能力を実証する。
組織ＲＡＧＥタンパク質をウェスタンブロットによって分析した。組織の入手可能性に基づいて、後葉遠位肺組織及び中葉組織を含む、粉砕した肺組織アリコートを、Ｑｉａｇｅｎビーズベースホモジナイザーを使用して放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ）中でホモジナイズした。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）によって決定した。試料をＬａｅｍｅｌｌｉ緩衝液中で調製し、煮沸した。ゲルに１０μｇの総タンパク質を充填し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にセミドライ転写した。ブロットをＰｉｅｒｃｅ Ｆａｓｔ－ｗｅｓｔｅｒｎキットによりアッセイした（一次抗体（ａｂ２１６３２９）を所有のブロッキング緩衝液中に１：１０００で３０分間、ＨＲＰ１５分間、洗浄３×５分。検出基質Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ５分間）。得られたブロットを、総タンパク質ノーマライズ試薬で処理した膜を用いて、ＲＡＧＥ及び総タンパク質染色のためにｉＢｒｉｇｈｔ上で画像化した。目的のバンドと、総タンパク質のバンドとの両方からバックグラウンドシグナルを差し引いた濃度測定を、ｉＢｒｉｇｈｔソフトウェアを使用して定量化した。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投与後のカニクイザルの用量応答では、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の用量濃度が高くなると、ＲＡＧＥタンパク質阻害が着実に高くなることを示す。これは、中葉及び後葉の両方において見られ、０．４７ｍｇ／ｋｇで最大約８０～８８％のＲＡＧＥタンパク質阻害があった。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投薬後１５日目及び２９日目にカニクイザルから血清試料を回収し、血清ｓＲＡＧＥレベルをＧｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアッセイによって定量した。以下の表７２は、ベースラインに対して正規化した１５日目の血清ｓＲＡＧＥレベルを標準偏差と共に示す。以下の表７３は、ベースラインに対して正規化した２９日目の血清ｓＲＡＧＥレベルを標準偏差と共に示す。
ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投薬後、カニクイザルは、ベースラインレベルと比較して、血清ｓＲＡＧＥレベルの有意な低下を示した。表７２及び表７３に示されるように、用量応答では、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤の投薬濃度が高くなると、ｓＲＡＧＥレベルが着実に低下し（より高いｓＲＡＧＥ阻害）を示し、ＲＡＧＥ ＲＮＡｉ剤への曝露後１５日目及び２９日目に最大約３９～４３％の血清ｓＲＡＧＥレベル（約５７～６１％阻害）を示した。
他の実施形態
本発明は発明を実施するための形態と併せて記載されているが、前述の記載は例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (64)

  1. 終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
    表２又は表３に提供される配列のいずれか１つと０又は１ヌクレオチド異なる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖と、
    前記アンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
    を含む、ＲＮＡｉ剤。
  2. 前記アンチセンス鎖が、表２又は表３に提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド２～１８を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  3. 前記センス鎖が、表２又は表４に提供される配列のいずれか１つと０又は１ヌクレオチド異なる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖に対して前記１７個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する、請求項１又は請求項２に記載のＲＮＡｉ剤。
  4. 前記ＲＮＡｉ剤の少なくとも１個のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであるか、又は修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  5. 前記ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  6. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－セコヌクレオチド模倣物、ロックドヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノヌクレオチド、２’－メトキシエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、リビトール、逆位ヌクレオチド、逆位２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、逆位２’－デオキシヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネート含有ヌクレオチド、シクロプロピルホスホネート含有ヌクレオチド、及び３’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４又は５に記載のＲＮＡｉ剤。
  7. 前記ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチド、又はそれらの組み合わせで修飾されている、請求項５に記載のＲＮＡｉ剤。
  8. 前記アンチセンス鎖が、表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  9. 前記センス鎖が、表４に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  10. 前記アンチセンス鎖が表３に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が表４に提供される修飾配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  11. 前記センス鎖が１８～３０ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が１８～３０ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  12. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々１８～２７ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
  13. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々１８～２４ヌクレオチド長である、請求項１２に記載のＲＮＡｉ剤。
  14. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、各々２１ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のＲＮＡｉ剤。
  15. ２つの平滑末端を有する、請求項１４に記載のＲＮＡｉ剤。
  16. 前記センス鎖が、１つ又は２つの末端キャップを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  17. 前記センス鎖が、１つ又は２つの逆位脱塩基残基を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  18. 表７Ａ、表７Ｂ、表８、表９Ａ、表９Ｂ、又は表１０の二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成される、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  19. 前記ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載のＲＮＡｉ剤。
  20. 以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
    ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣ（配列番号５５）；
    ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣ（配列番号６５）；
    ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣ（配列番号７３）；
    ＵＵＧＵＧＵＵＣＡＧＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣＧ（配列番号７）；
    ＵＧＡＵＧＵＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＡＣＵＣ（配列番号９）；又は
    ＵＵＣＣＡＵＵＣＣＵＧＵＵＣＡＵＵＧＣＣＵ（配列番号８）
    のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含むアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  21. 前記センス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
    ＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号２９８）；
    ＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号３０８）；
    ＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号３１６）；
    ＣＧＧＡＡＵＧＧＡＡＡＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡ（配列番号１９）；
    ＧＡＧＵＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡ（配列番号２０）；又は
    ＡＧＧＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＧＡＡＵＩＧＡＡ（配列番号２１）
    のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれを含む、請求項２０に記載のＲＮＡｉ剤。
  22. 前記ヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項２０又は２１に記載のＲＮＡｉ剤。
  23. 以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
    ｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号２）；
    ｃＰｒｐｕｓＵｆｓｇｓＵｆｇＵｆｕＣｆａＧｆｕＵｆｕＣｆｃＡｆｕＵｆｃＣｆｓｇ（配列番号３）；
    ｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号５）；
    ｃＰｒｐｕｓＧｆｓａｓｕｇｕｕｕｕｇａＧｆｃＡｆｃＣｆｕａｃｕｓｃ（配列番号６）；
    ｕｓＵｆｓｃｓＣｆａＵｆｕＣｆｃＵｆｇＵｆｕＣｆａＵｆｕＧｆｃＣｆｓｕ（配列番号４）；
    のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるアンチセンス鎖を含み；
    式中、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシンを表し、ｃは２’－Ｏ－メチルシチジンを表し、ｇは２’－Ｏ－メチルグアノシンを表し、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ａｆは２’－フルオロアデノシンを表し、Ｃｆは２’－フルオロシチジンを表し、Ｇｆは２’－フルオログアノシンを表し、Ｕｆは２’－フルオロウリジンを表し；ｃＰｒｐｕは、５’－シクロプロピルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート結合を表し；前記センス鎖上のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、
    請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  24. 前記センス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
    ｇｓａｇｕａｇＧｆｕＧｆｃＵｆｃａａａａｃａｕｃａ（配列番号１４）；
    ａｓｇｇｃａａｕｇＡｆＡｆＣｆａｇｇａａｕｉｇａａ（配列番号１５）；
    ｃｓｇｇａａｕｇｇＡｆＡｆＡｆｃｕｇａａｃａｃａａ（配列番号１３）；
    のうちの１つと０又は１ヌクレオチド異なる修飾ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になり；
    式中、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシンを表し、ｃは２’－Ｏ－メチルシチジンを表し、ｇは２’－Ｏ－メチルグアノシンを表し、ｉは２’－Ｏ－メチルイノシンを表し、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジンを表し；Ａｆは２’－フルオロアデノシンを表し、Ｃｆは２’－フルオロシチジンを表し、Ｇｆは２’－フルオログアノシンを表し、Ｕｆは２’－フルオロウリジンを表し；ｓはホスホロチオエート結合を表し；前記アンチセンス鎖上のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、
    請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
  25. 前記センス鎖が、前記ヌクレオチド配列の３’末端に、前記ヌクレオチド配列の５’末端に、又はその両方に逆位脱塩基残基を更に含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  26. 標的化リガンドに連結されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  27. 前記標的化リガンドが、上皮細胞上に発現される細胞受容体に対する親和性を有する、請求項２６に記載のＲＮＡｉ剤。
  28. 前記標的化リガンドが、インテグリン標的化リガンドを含む、請求項２７に記載のＲＮＡｉ剤。
  29. 前記インテグリン標的化リガンドが、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである、請求項２８に記載のＲＮＡｉ剤。
  30. 前記標的化リガンドが、以下の構造：
    若しくはその薬学的に許容される塩、又は
    若しくはその薬学的に許容される塩を含み、
    が、前記ＲＮＡｉ剤への接続点を示す、
    請求項２９に記載のＲＮＡｉ剤。
  31. 前記標的化リガンドが、以下：
    からなる群から選択される構造を有し、
    が、前記ＲＮＡｉ剤への接続点を示す、
    請求項２６～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  32. 以下の構造を有する標的化リガンドにコンジュゲートされている、請求項３１に記載のＲＮＡｉ剤。
  33. 前記標的化リガンドが以下の構造を有する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  34. 前記標的化リガンドが前記センス鎖にコンジュゲートされている、請求項２６～３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  35. 前記標的化リガンドが、前記センス鎖の５’末端にコンジュゲートされている、請求項３４に記載のＲＮＡｉ剤。
  36. 標的化リガンドにコンジュゲートされており、ＡＣ０００２９２、ＡＣ００１２６６、ＡＣ００１２６７、又はＡＣ００１２６８の二本鎖構造を有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
  37. 薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤を含む組成物。
  38. 終末糖化産物受容体遺伝子発現の発現を阻害することができる第２のＲＮＡｉ剤を更に含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. １つ以上の更なる治療薬を更に含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 吸入による投与のために製剤化される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 定量吸入器、ジェット式ネブライザー、振動メッシュ式ネブライザー、又はソフトミスト吸入器によって送達される、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記ＲＮＡｉ剤がナトリウム塩である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記薬学的に許容される賦形剤が注射用水である、請求項３７～４２のいずれかに記載の組成物。
  44. 前記薬学的に許容される賦形剤が緩衝生理食塩水である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 細胞における終末糖化産物受容体遺伝子の発現を阻害する方法であって、有効量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤又は請求項３７～４４のいずれか一項に記載の組成物を細胞に導入することを含む、方法。
  46. 前記細胞が対象内に存在する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記対象がヒト対象である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ＲＮＡｉ剤の投与後に、前記終末糖化産物受容体遺伝子の発現が少なくとも約３０％阻害される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 膜型ＲＡＧＥ活性レベルの増強又は上昇に関連する１つ以上の症状又は疾患を処置する方法であって、その処置を必要とするヒト対象に、治療有効量の請求項３７～４４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  50. 前記疾患が呼吸器疾患である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記呼吸器疾患が、嚢胞性線維症、肺炎、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛機能不全症、又は肺癌嚢胞性線維症である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記疾患が眼疾患である、請求項４９に記載の方法。
  54. 前記眼疾患がドライアイ症候群である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＲＮＡｉ剤が、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約５．０ｍｇの沈着用量で投与される、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ＲＮＡｉ剤が、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０３ｍｇ～約２．０ｍｇの沈着用量で投与される、請求項４４～５４のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ＲＮＡｉ剤が２回以上の用量で投与される、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 膜型ＲＡＧＥ活性及び／又はＡＧＥＲ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤の使用。
  59. 終末糖化産物受容体の受容体活性及び／又は終末糖化産物受容体遺伝子の発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  60. 終末糖化産物受容体の受容体活性及び／又は終末糖化産物受容体遺伝子の発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、又は症状を処置するための医薬の製造のための、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  61. 前記疾患が肺炎症である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の使用。
  62. センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングして二本鎖リボ核酸分子を形成することを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤を作製する方法。
  63. 前記センス鎖が標的化リガンドを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記センス鎖に標的化リガンドをコンジュゲートすることを含む、請求項６３に記載の方法。
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