TW202227627A - 用於抑制DUX4表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明描述RNAi藥劑、包括RNAi藥劑之組合物及用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因之方法。本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑及RNAi藥劑結合物抑制 DUX4基因之表現。本發明亦描述包括一或多種DUX4 RNAi藥劑，視情況具有一或多種額外治療劑之醫藥組合物。將所描述之DUX4 RNAi藥劑遞送至活體內骨骼肌細胞中提供 DUX4基因表現之抑制及DUX4含量之降低，此可向患有某些骨骼肌相關疾病或病症，包括臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)之個體，包括人類個體提供治療益處。

Description

用於抑制DUX4表現之RNAi藥劑、其組合物及使用方法
本發明係關於用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因表現之RNA干擾(RNAi)藥劑(例如，雙股RNAi藥劑)、包括DUX4 RNAi藥劑之組合物及其使用方法。
DUX4為通常在胚胎發生期間表現之轉錄因子，含有兩個同源匣域，其部分基因係位於染色體4上之D4Z4大形附隨體重複陣列內。其通常在除睪丸以外的所有組織中經由甲基化而受到嚴重的表觀遺傳抑制且在成年骨骼肌中不具有已知生理功能。在 DUX4在骨骼肌中係低甲基化且未抑制之條件下，DUX4可經表現且可活化生殖系基因、免疫介體、反轉錄轉位子、內源性反轉錄病毒元件及中心體周圍衛星HSATII序列之轉錄，此可促進非生理學轉錄物、長非編碼RNA或反義轉錄物之錯誤表現，最終引起胞內及胞外信號傳導級聯，從而導致肌肉退化。DUX4之表現引起肌肉病理及無力，造成臉肩胛肱骨肌肉失養症( Facio scapulo humeral Muscular Dystrophy，FSHD)之常見症狀，臉肩胛肱骨肌肉失養症係最常見成人肌病，影響1/15,000至1/20,000的成人。
FSHD發作相對較晚，其中典型診斷發生在20歲至30歲，且進展緩慢，其中肌肉無力嚴重程度在數年至數十年間增加。FSHD患者通常經歷面部、背部、上臂、腹部核心、髖帶及腿部肌肉中之不對稱肌無力及質量損失，導致生活品質顯著降低。稱為FSHD1及FSHD2之兩個主要形式的FSHD由容許表現DUX4所引起。當D4Z4大形附隨體重複陣列之長度少於11個複本時，發生FSHD1。陣列之較短長度引起不充分的甲基化及表觀遺傳抑制，且允許DUX4偶發地表現於肌核中，由此引起前述肌毒性信號傳導級聯。FSHD2係由染色體鉸鏈域結構維持1 (SMCHD1)基因中之功能喪失型突變引起，該基因部分負責對D4Z4大形附隨體重複陣列進行甲基化及抑制。SMCHD1之活性降低導致DUX4之表觀遺傳去抑制及表現。
因為DUX4通常不表現於成年骨骼肌中，在骨骼肌中不具有已知正常生理功能，且當表現時，導致功能獲得型肌毒性，所以此係大部分模態(諸如小分子化合物或抗體)的困難目標。當前，沒有有效治療來逆轉或預防骨骼肌中DUX4表現之肌毒性作用。需要能夠抑制DUX4表現且預防、停止及/或逆轉與DUX4表現相關之肌肉退化、肌肉質量損失及與FSHD相關之肌無力的治療劑。
需要能夠尤其活體內選擇性且有效抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因之表現的新穎RNA干擾(RNAi)藥劑(在本文中亦稱為RNAi藥劑、RNAi觸發劑或觸發劑)，例如雙股RNAi藥劑。此外，需要用於治療疾病或病症之新穎DUX4特異性RNAi藥劑之組合物，該疾病或病症諸如臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)，其可至少部分藉由DUX4蛋白質含量之減少來改善。
一般而言，本發明之特徵在於DUX4 RNAi藥劑、包括此類RNAi藥劑之組合物，以及使用本文所描述之RNAi藥劑及包括RNAi藥劑之組合物來抑制活體外及/或活體內 DUX4基因表現之方法。本文所描述之DUX4 RNAi藥劑能夠選擇性且有效地減少、抑制或靜默 DUX4基因之表現。
所描述之DUX4 RNAi藥劑可用於治療性治療(包括預防性、干預或防治性治療)諸如FSHD之症狀及疾病的方法中，該等症狀及疾病包括最常見形式之FSHD1及FSHD2，兩者均由容許表現DUX4而引起。本文所揭示之方法包括使用此項技術中已知之任何適合方法，諸如皮下(SQ)注射、肌肉內注射或靜脈內(IV)投與向個體，例如人類或動物個體投與一或多種DUX4 RNAi藥劑。
在一個態樣中，本發明之特徵在於用於抑制 DUX4基因表現之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑包括有義股(亦稱為隨從股)及反義股(亦稱為引導股)。有義股及反義股可彼此部分、實質上或完全互補。本文所描述之RNAi藥劑有義股之長度各自可為15至49個核苷酸。本文所描述之RNAi藥劑反義股之長度各自可為17至49個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為17至26個核苷酸。有義股及反義股可為相同長度或不同長度。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為21至26個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度獨立地為21至24個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度皆為21個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度獨立地為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度獨立地為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。本文所描述之RNAi藥劑在遞送至表現DUX4之細胞(諸如骨骼肌細胞(骨骼肌纖維))後抑制一或多種 DUX4基因轉錄物活體內及/或活體外表現。
本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑靶向雙重同源匣4 ( DUX4)基因(參見例如SEQ ID NO:1 & SEQ ID NO:2，智人轉錄變異體2)。在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑靶向具有表1中所揭示序列中之任一者之序列的 DUX4基因之一部分。
在另一態樣中，本發明之特徵在於醫藥組合物，該醫藥組合物包括能夠選擇性地且有效地降低 DUX4基因表現之所揭示之DUX4 RNAi藥劑中之一或多者。包括一或多種本文所描述之DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物可投與至個體，諸如人類或動物個體，以用於治療(包括干預或防治性治療或抑制)可至少部分藉由DUX4蛋白質含量降低來改善之症狀及疾病。本文所描述之醫藥組合物包括能夠抑制 DUX4基因之表現的RNAi藥劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
DUX4 RNAi藥劑中可使用之DUX4 RNAi藥劑有義股及反義股之實例提供於表3及表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及表5.4中。DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體之實例提供於表5.1、5.2、5.3及5.4中。可由本文所揭示之某些DUX4 RNAi藥劑之有義股及反義股組成或可包括於其中的19個核苷酸核心伸長序列之實例提供於表2中。
本文所描述之一個態樣為一種用於抑制 DUX4基因表現之RNAi藥劑，其包含： (i)        反義股，其包含與表3或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸；以及 (ii)      有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
本文所描述之另一態樣為一種用於抑制 DUX4基因表現之RNAi藥劑，其包含： (i)        反義股，其包含與表3或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸； (ii)      有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列； (iii)    連接於該有義股之靶向配位體，其對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力；以及 (iv)     連接於該有義股之PK/PD調節劑。
本文所描述之又一態樣為一種用於抑制 DUX4基因表現之RNAi藥劑，其包含： (i)        反義股，其包含與表3或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸； (ii)      有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列； (iii)    連接於該有義股之靶向配位體，其對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，其中該靶向配位體連接於該有義股之5'末端；及 (iv)     PK/PD調節劑，其連接於該有義股之3'末端。
本文所描述之另一態樣為一種用於抑制 DUX4基因表現之RNAi藥劑，其包含： (i)        反義股，其包含與表3或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸； (ii)      有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列； (iii)    靶向配位體，其包含本文中之表6.2或6.3中表示之化學結構，其中該靶向配位體連接於該有義股之5'末端；以及 (iv)     PK/PD調節劑，其包含本文中之表6.5或6.7中表示之化學結構，其中該PK/PD調節劑連接於該有義股之3'末端。
在另一態樣中，本發明之特徵在於用於將DUX4 RNAi藥劑活體內遞送至個體(諸如哺乳動物，例如人類個體)中之骨骼肌細胞的方法。本文亦描述用於此類方法中之組合物。
可使用此項技術中已知之任何寡核苷酸遞送技術將一或多種DUX4 RNAi藥劑遞送至靶細胞或組織。在一些實施例中，藉由將RNAi藥劑共價連接至靶向基團來將DUX4 RNAi藥劑遞送至細胞或組織。在一些實施例中，靶向基團可包括細胞受體配位體。靶向基團可連接於DUX4 RNAi藥劑之有義股或反義股的3'或5'端。在一些實施例中，靶向基團連接於有義股之3'或5'端。在一些實施例中，靶向基團連接於有義股之5'端。在一些實施例中，靶向基團內部連接於RNAi藥劑之有義股及/或反義股上之核苷酸。在一些實施例中，靶向基團經由連接子連接於RNAi藥劑。對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力的靶向配位體之實例(例如整合素α-v-β-6 (αvβ6))展示於本文中之表6.2及6.3中。適用於本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之某些靶向配位體之合成及結合展示於實例1中。
在一些實施例中，與將RNAi藥劑引導至骨骼肌細胞之靶向基團或靶向配位體結合的本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑，從而RNAi藥劑可經由受體介導之內飲作用或藉由其他方式選擇性內化。
在另一態樣中，本發明之特徵在於用於抑制個體中之 DUX4基因表現的方法，其中該等方法包括向個體投與一定量的能夠抑制 DUX4基因表現之DUX4 RNAi藥劑，其中該DUX4 RNAi藥劑包含有義股及反義股，且其中該反義股包括表2、表3或表5.4中之反義股核苷酸序列中之任一者之序列。在另一態樣中，本發明之特徵在於治療(包括防治性、干預或預防性治療)可至少部分藉由DUX4蛋白質含量減少來改善之疾病或症狀的方法，該等方法包含向有需要之個體投與DUX4 RNAi藥劑，該DUX4 RNAi藥劑包括反義股，該反義股包含表2、表3或表5.4中之序列中之任一者的序列。亦描述用於此類方法之醫藥組合物。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑連接於一或多種連接基團或其他非核苷酸基團或化合物，諸如藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑。PK/PD調節劑可經由改良細胞受體結合、改良細胞攝取及/或其他方法來增加結合藥物之循環時間及/或增加RNAi藥劑之活性。適用於本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之PK/PD調節劑的實例可見於本文中之表6.5及6.7中。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑與靶向基團、連接基團、PK/PD調節劑及/或另一非核苷酸基團結合。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑與靶向基團及PK/PD調節劑結合。
DUX4 RNAi藥劑之用途提供用於治療性(包括防治性或干預)治療可至少部分藉由減少DUX4蛋白質含量而改善之疾病或病症的方法。本文描述用於將DUX4 RNAi藥劑遞送至個體之骨骼肌細胞的組合物。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑能夠減少個體之脊柱旁、面部、軀幹、腹部及四肢肌肉組織中，例如個體之三頭肌、二頭肌、四頭肌、胸肌、腓腸肌、比目魚肌、嚼肌、EDL (伸趾長肌)、TA (脛前肌)、斜方肌及/或隔膜中的 DUX4基因表現。
在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或干預治療)至少部分由DUX4表現介導之病理狀態(諸如FSHD)的方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之RNAi藥劑，該RNAi藥劑包括有義股，該有義股包含表2、表4.1、表4.2、表4.3、表4.4、表4.5、表4.6或表5.4中之序列中之任一者的序列。
在一些實施例中，本文揭示治療(包括防治性或干預治療)至少部分由DUX4表現介導之病理狀態的方法，其中該等方法包括向個體投與治療有效量之DUX4 RNAi藥劑，該DUX4 RNAi藥劑包括有義股及反義股，該有義股包含本文中之表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的序列，該反義股包含表3中之序列中之任一者的序列。
在一些實施例中，本文揭示抑制 DUX4基因表現之方法，其中該等方法包括向個體投與DUX4 RNAi藥劑，其包括由本文中之表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的核鹼基序列組成之有義股，及由表3或表5.4中之序列中之任一者的核鹼基序列組成之反義股。在其他實施例中，本文揭示抑制 DUX4基因表現之方法，其中該等方法包括向個體投與DUX4 RNAi藥劑，其包括由本文中之表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或表5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成之有義股，及由表3或表5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成之反義股。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差不超過1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)； 其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)； 其中上文各別序列位於反義股之位置1-21 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差不超過1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)； cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中有義股至少與反義股實質上互補。如一般熟習此項技術者將清楚地理解，包括如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示之硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中通常存在之磷酸二酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括： (i)        由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (ii)      由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (iii)    由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (iv)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (v)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (vi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (vii)   由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (viii)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (ix)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； (x)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)；或 (xi)     由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括： (xii)   由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (xiii)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (xiv)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (xv)    由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (xvi)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (xvii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (xviii)       由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (xix)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (xx)    由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； (xxi)  由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)；或 (xxii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中各別有義股在核苷酸序列之3'末端處及在核苷酸序列之5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基；且有義股亦包括共價連接至有義股之5'末端處的反向無鹼基殘基的靶向配位體，其中靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且其中有義股進一步包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至有義股之3'末端處的反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)； 其中該DUX4 RNAi藥劑進一步包括與該反義股至少部分互補之有義股；且其中反義股及有義股上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)； 其中DUX4 RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；其中反義股及有義股上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'末端處及在核苷酸序列之5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基，且有義股亦包括有義股之5'末端處之靶向配位體，該有義股共價連接至反向無鹼基殘基，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO: 164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)； 其中DUX4 RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；其中反義股及有義股上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'末端處及在核苷酸序列之5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'末端處之靶向配位體，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且該有義股進一步包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至3'末端處的反向無鹼基殘基；且其中各別反義股序列係位於反義股之位置1-21處。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括反義股及有義股，其中反義股及有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'à3')對中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO:164)及CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA (SEQ ID NO:183)；或 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)及CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA (SEQ ID NO:181)；或 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)及AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (SEQ ID NO:182)；或 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)及GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (SEQ ID NO:189)； 其中反義股及有義股上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括反義股及有義股，其中反義股及有義股由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：與以下核苷酸序列(5'à3')對中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO:164)及CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA (SEQ ID NO:183)；或 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)及CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA (SEQ ID NO:181)；或 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)及AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (SEQ ID NO:182)；或 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)及GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA (SEQ ID NO:189)； 其中反義股及有義股上之全部或實質上全部核苷酸均為經修飾之核苷酸；且其中有義股在各別核苷酸序列之3'末端處及5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基，且其中有義股亦包括共價連接至5'末端處之反向無鹼基殘基之靶向配位體，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且其中有義股亦包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至3'末端處之反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)； cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中DUX4 RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；且其中有義股上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)； cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵；且其中DUX4 RNAi藥劑進一步包括與反義股至少部分互補之有義股；且其中有義股上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；且其中有義股在核苷酸序列之3'末端處及在核苷酸序列之5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基，且有義股亦包括共價連接至5'末端處的反向無鹼基殘基的靶向配位體，其中靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且其中有義股亦包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至3'末端處的反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股及有義股：與以下核苷酸序列對(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)；及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)；或 cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)及 aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)及 gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)及 gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；且s表示硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股及有義股：以下核苷酸序列對(5'à3')中之一者： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)；及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)及 cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)；或 cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)及 caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)及 aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)及 gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)及 gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中有義股在核苷酸序列之3'末端處及在核苷酸序列之5'末端處進一步包括反向無鹼基殘基；且有義股亦包括共價連接至5'末端處的反向無鹼基殘基的靶向配位體，其中靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且其中有義股進一步包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至3'末端處的反向無鹼基殘基。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UAGAAUUUCACGGAAGAAC (SEQ ID NO:22)； UGAAACCAGAUCUGAAUCC (SEQ ID NO:10)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUC (SEQ ID NO:14)； 其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列(5'à3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UAGAAUUUCACGGAAGAAC (SEQ ID NO:22)； UGAAACCAGAUCUGAAUCC (SEQ ID NO:10)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUC (SEQ ID NO:14)； 其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中各別序列係位於反義股之核苷酸位置1-19 (5'à3')處。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包括反義股及有義股，其各自包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列對(5'à3')相差0或1個核鹼基之核鹼基序列： UAGAAUUUCACGGAAGAAC (SEQ ID NO:22)及GUUCUUCCGUGAAAUUCUA (SEQ ID NO:50)； UGAAACCAGAUCUGAAUCC (SEQ ID NO:10)及GGAUUCAGAUCUGGUUUCA (SEQ ID NO:38)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUC (SEQ ID NO:14)及GAUUCAGAUCUGGUUUCAA (SEQ ID NO:42)；及 其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
如本文所使用，術語「寡核苷酸」及「多核苷酸」意謂所連接之核苷的聚合物，其中之每一者可獨立地經修飾或未經修飾。
如本文所使用，「RNAi藥劑」(亦稱為「RNAi觸發劑」)意謂含有RNA或類RNA (例如經化學修飾之RNA)寡核苷酸分子之組合物，其能夠以序列特異性方式降低或抑制(例如在適當條件下降低或抑制)靶mRNA之信使RNA (mRNA)轉錄物的轉譯。如本文所使用，RNAi藥劑可經RNA干擾機制(亦即，經與哺乳動物細胞之RNA干擾路徑機制(RNA誘導之沉默複合物或RISC)之相互相用誘導RNA干擾)或藉由任何替代性機制或路徑來起作用。儘管咸信RNAi藥劑(如該術語在本文中所使用)主要經由RNA干擾機制起作用，但所揭示之RNAi藥劑不藉由任何特定路徑或作用機制結合或受限於任何特定路徑或作用機制。本文所揭示之RNAi藥劑包含有義股及反義股，且包括(但不限於)：短(或小)干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)及切丁酶受質(dicer substrate)。本文所描述之RNAi藥劑之反義股與所靶向之mRNA (亦即DUX4 mRNA)至少部分互補。RNAi藥劑可包括一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個非磷酸二酯鍵。
如本文所使用，當參考給定基因之表現時，術語「沉默」、「降低」、「抑制」、「下調」或「阻斷基因表現」意謂當用本文所描述之RNAi藥劑治療細胞、細胞群、組織、器官或個體時，與未經歷該治療之第二細胞、細胞群、組織、器官或個體相比，基因之表現降低，如藉由其中基因經轉錄之細胞、細胞群、組織、器官或個體中自基因轉錄之RNA含量或自mRNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質次單元之含量所量測。
如本文所使用，術語「序列」及「核苷酸序列」意謂使用標準命名法用一系列字母描述的一系列或某種次序的核鹼基或核苷酸。
如本文所使用，「鹼基」、「核苷酸鹼基」或「核鹼基」係作為核苷酸組分之雜環嘧啶或嘌呤化合物，且包括主要嘌呤鹼基腺嘌呤及鳥嘌呤以及主要嘧啶鹼基胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。核鹼基可進一步經修飾以包括(但不限於)通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴展鹼基及氟化鹼基。(參見例如Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P.編Wiley-VCH, 2008)。此類經修飾之核鹼基(包括包含經修飾之核鹼基之胺基亞磷酸酯化合物)之合成係此項技術中已知的。
如本文所使用，術語「核苷酸」具有與此項技術中通常所理解相同的含義，且因此係指包含糖部分、鹼基部分及共價連接基團(鍵聯基團) (諸如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷間鍵基團)之醣苷，且涵蓋天然存在之核苷酸(諸如DNA或RNA)及非天然存在之包含經修飾之糖及/或鹼基部分的核苷酸，其在本文中亦稱為核苷酸類似物或經修飾之核苷酸。本文中，單核苷酸可稱為單體或單元。
如本文所使用且除非另外指示，否則術語「互補」在用於相對於第二核鹼基或核苷酸序列(例如，RNAi藥劑反義股或單股反義寡核苷酸)描述第一核鹼基或核苷酸序列(例如，RNAi藥劑有義股或靶向mRNA)時，意謂包括第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些標準條件下與包括第二核苷酸序列之寡核苷酸雜交(在哺乳動物生理條件(或其他適合之活體內或活體外條件)下形成鹼基對氫鍵)及形成雙螺旋體或雙螺旋結構之能力。一般熟習此項技術者將能夠選擇最適合於雜交測試之條件組。至少在滿足以上雜交要求之範圍內，互補序列包括沃森-克里克鹼基對(Watson-Crick base pairs)或非沃森-克里克鹼基對且包括天然或經修飾之核苷酸或核苷酸模擬物。序列一致性或互補性與修飾無關。舉例而言，出於判定一致性或互補性之目的，如本文所定義之a及Af與U (或T)互補，且與A一致。
如本文所使用，「完全互補」或「完全互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的所有(100%)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，「部分互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少70% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，「實質上互補」意謂在核鹼基或核苷酸序列分子之雜交對中，第一寡核苷酸之連續序列中的至少85% (但並非所有)鹼基將與第二寡核苷酸之連續序列中的相同數目個鹼基雜交。連續序列可包含第一或第二核苷酸序列之全部或一部分。
如本文所使用，術語「互補」、「完全互補」、「部分互補」及「實質上互補」係關於RNAi藥劑之有義股與反義股之間或RNAi藥劑之反義股與DUX4 mRNA之序列之間的核鹼基或核苷酸匹配而使用。
如本文所使用，適用於核酸序列之術語「實質上一致」或「實質一致性」意謂核苷酸序列(或核苷酸序列之一部分)相比於參考序列具有至少約85%序列一致性或更高，例如至少90%、至少95%或至少99%一致性。序列一致性之百分比係藉由在比較窗口內比較兩個最佳比對序列來測定。藉由如下步驟計算百分比：測定兩個序列中存在之相同類型的核酸鹼基的位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。本文中所揭示之發明涵蓋與本文中所揭示之彼等實質上相同的核苷酸序列。
如本文所使用，術語「個人」、「患者」及「個體」可互換使用以指任何動物物種之成員，包括(但不限於)鳥類、人類及其他靈長類動物，及包括商業上相關之哺乳動物或動物模型(諸如小鼠、大鼠、猴、牛、豬、馬、綿羊、貓及狗)的其他哺乳動物。個體較佳為人類。
如本文所使用，術語「治療(treat/treatment)」及其類似術語意謂用於提供個體疾病之一或多個症狀之發生次數、嚴重程度及/或發生頻率的減輕或緩解之方法或步驟。如本文所使用，「治療(treat/treatment)」可包括個體中之疾病之一或多種症狀的發生次數、嚴重程度及/或發生頻率之預防、管理、防治性或干預治療及/或抑制或減少。
如本文所使用，當提及RNAi藥劑時，片語「向細胞中引入」意謂將RNAi藥劑功能性遞送至細胞中。片語「功能性遞送」意謂以使RNAi藥劑能夠具有預期生物活性(例如，基因表現之序列特異性抑制)的方式將RNAi藥劑遞送至細胞中。
除非另外說明，否則使用如本文所使用之符號
Figure 02_image001
意謂根據本文所描述之發明之範疇任何基團可與其連接。
如本文所使用，術語「異構體」係指具有相同分子式，但在性質或其原子之結合序列或其原子在空間中之排列方面不同的化合物。在原子空間排列中存在不同之異構體稱為「立體異構體」。彼此不為鏡像之立體異構體稱為「非鏡像異構物」且為不可重疊之鏡像的異構體稱為「鏡像異構物」或有時稱為光學異構體。結合於四個不相同的取代基之碳原子稱為「對掌性中心」。
如本文所使用，除非在結構中特定鑑別為具有特定構形，否則對於其中存在不對稱中心且因此產生鏡像異構物、非鏡像異構物或其他立體異構構型之各結構，本文所揭示之各結構意欲表示所有此類可能的異構體，包括其光學純及外消旋形式。舉例而言，本文中所揭示之結構意欲涵蓋非鏡像異構物之混合物以及單一立體異構體。
如在本文申請專利範圍中所使用，片語「由…組成」不包括申請專利範圍中未指定之任何元件、步驟或成分。如本文所使用，片語「基本上由…組成」將申請專利範圍之範疇限制於所規定材料或步驟及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的彼等材料或步驟。
一般熟習此項技術者將容易理解及瞭解，本文所揭示之化合物及組合物可具有呈質子化或去質子化狀態之某些原子(例如，N、O或S原子)，其取決於化合物或組合物所置放的環境。因此，如本文所使用，本文所揭示之結構涵蓋可經質子化或去質子化之某些官能基，諸如OH、SH或NH。本文中之揭示內容意欲涵蓋本發明化合物及組合物而與其基於環境(諸如pH值)之質子化狀態無關，如一般熟習此項技術者可容易地理解。對應地，具有不穩定質子或鹼性原子之本文所描述之化合物亦應理解為表示對應化合物之鹽形式。本文所描述之化合物可呈游離酸、游離鹼或鹽形式。本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽應理解為在本發明之範疇內。所揭示之DUX4 RNAi藥劑之典型的醫藥學上可接受之鹽呈鈉鹽形式。
如本文所使用，當參考兩種化合物或分子之間的連接時，術語「連接」或「結合」意謂兩種化合物或分子藉由共價鍵接合。除非加以陳述，否則如本文所使用之術語「連接」及「結合」可指第一化合物與第二化合物之間在存在或不存在任何插入原子或原子基團的情況下的連接。
如本文所使用，術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與該片語互換使用。術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與術語「及/或」互換使用，除非上下文另外明確說明。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習此項技術者中之一者通常理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料可用於實踐或測試本發明，但合適的方法及材料描述如下。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。
在明確列舉值之情況下，應理解，與所列舉值大約相同數量或量之值亦在本發明之範疇內。在揭示組合之情況下，彼組合之元件的每一子組合亦經具體地揭示且在本發明之範疇內。相反，在個別地揭示不同元件或元件之群組的情況下，亦揭示其組合。在將本發明之任何元件揭示為具有複數個替代物之情況下，特此亦揭示其中每一替代物單獨排除或與其他替代物以任何組合排除的本發明之實例；本發明之多於一個元件可具有此等排除，且特此揭示具有此等排除之元件的所有組合。
本發明之其他目標、特徵、態樣及優勢將自以下實施方式、附圖及申請專利範圍而變得顯而易見。
相關申請之交叉引用
本申請案主張提交於2020年9月11日之美國臨時專利申請案第63/077,272號及提交於2021年6月24日之美國臨時專利申請案第63/214,742號之優先權，該等申請案中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式提交且在此以全文引用之方式併入。ASCII複本命名為30679_SEQLIST.txt且大小為58 kb。
本文描述用於抑制 DUX4基因(在本文中稱為DUX4 RNAi藥劑或DUX4 RNAi觸發劑)表現之RNAi藥劑。各DUX4 RNAi藥劑包含有義股及反義股。有義股之長度可為15至49個核苷酸。反義股之長度各自可為17至49個核苷酸。有義股及反義股可為相同長度或其可為不同長度。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自獨立地為17至27個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自獨立地為19-21個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股兩者之長度各自為21-26個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之長度各自為21-24個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約19個核苷酸，而反義股之長度為約21個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為約21個核苷酸，而反義股之長度為約23個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為23個核苷酸且反義股之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股兩者之長度各自為21個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑有義股之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、36、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑反義股之長度為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑具有約15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸之雙螺旋體長度。
用於形成DUX4 RNAi藥劑之核苷酸序列之實例提供於表2、3、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中。RNAi藥劑雙螺旋體之實例展示於表5.1、5.2、5.3及5.4中，該等RNAi藥劑雙螺旋體包括表2、3、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6中之有義股及反義股序列。
在一些實施例中，有義股與反義股之間完全互補、實質上互補或部分互補的區域(有時稱為「雙螺旋體區」)之長度為12-26(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)個核苷酸，且存在於反義股之5'端或其附近(例如，此區域可與反義股之5'端間隔0、1、2、3或4個不係完全互補、實質上互補或部分互補的核苷酸)。
本文所描述之DUX4 RNAi藥劑之有義股包括至少12個連續核苷酸，該等核苷酸與DUX4 mRNA中相同數目核苷酸的核心伸長序列(在本文中亦稱為「核心伸長段」或「核心序列」)具有至少85%一致性。在一些實施例中，有義股核心伸長序列與反義股中之核心伸長序列100% (完全)互補或至少約85% (實質上)互補，且因此有義股核心伸長序列通常與DUX4 mRNA目標中存在之具有相同長度之核苷酸序列(有時稱為例如目標序列)完全一致或至少約85%一致。在一些實施例中，此有義股核心伸長段之長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心伸長段之長度為17個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心伸長段之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，此有義股核心伸長段之長度為21個核苷酸。
本文所描述之DUX4 RNAi藥劑之反義股包括至少17個與DUX4 mRNA中具有相同數目個核苷酸的核心伸長段及在一些實施例中與對應有義股中具有相同數目個核苷酸的核心伸長段具有至少85%互補性之連續核苷酸。在一些實施例中，反義股核心伸長段與DUX4 mRNA目標中存在之具有相同長度之核苷酸序列(例如目標序列) 100% (完全)互補或至少約85% (實質上)互補。在一些實施例中，此反義股核心伸長段之長度為17、18、19、20、21、22或23個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長段之長度為19個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長段之長度為17個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長段之長度為21個核苷酸。在一些實施例中，此反義股核心伸長段之長度為23個核苷酸。有義股核心伸長序列可具有與對應反義核心序列相同的長度或其可為不同長度。
DUX4 RNAi藥劑有義股及反義股黏接形成雙螺旋體。DUX4 RNAi藥劑之有義股及反義股可彼此部分、實質上或完全互補。在互補雙螺旋體區內，有義股核心伸長序列與反義核心伸長序列至少85%互補或100%互補。在一些實施例中，有義股核心伸長序列含有至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸之序列，該序列與反義股核心伸長序列之對應16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸序列至少85%或100%互補(亦即，DUX4 RNAi藥劑之有義及反義核心伸長序列具有至少85%鹼基配對或100%鹼基配對的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22或至少23個核苷酸之區域)。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑的反義股與表2、表3或表5.4中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之有義股與表2或表4.1或表4.2或表4.3或表4.4或表4.5、表4.6或表5.4中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，有義股及/或反義股可視情況且獨立地在核心伸長序列之3'端、5'端或3'及5'端兩者處含有額外1、2、3、4、5或6個核苷酸(延伸部分)。反義股之額外核苷酸(若存在)可或可不與DUX4 mRNA中之相應序列互補。有義股之額外核苷酸(若存在)可或可不與DUX4 mRNA中之相應序列一致。反義股額外核苷酸(若存在)可與或可不與對應有義股之額外核苷酸(若存在)互補。
如本文所使用，延伸部分在有義股核心伸長序列及/或反義股核心伸長序列之5'及/或3'端處包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。有義股上之延伸部分核苷酸可或可不與對應反義股中之核苷酸(核心伸長序列核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。相反，反義股上之延伸部分核苷酸可與或可不與對應有義股中之核苷酸(核心伸長段核苷酸或延伸部分核苷酸)互補。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股與反義股兩者含有3'及5'延伸部分。在一些實施例中，一個股之一或多個3'延伸部分核苷酸與另一股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在其他實施例中，一個股之一或多個3'延伸部分核苷酸不與另一股之一或多個5'延伸部分核苷酸鹼基配對。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑具有含有3'延伸部分之反義股及含有5'延伸部分之有義股。在一些實施例中，延伸部分核苷酸不配對且形成突出物(overhang)。如本文所使用，「突出物」係指位於有義股或反義股之末端處的一或多個不成對的核苷酸延伸段，其不形成本文所揭示之RNAi藥劑之雜交部分或雙螺旋部分的部分。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含反義股，其具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之3'延伸部分。在其他實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含反義股，其具有長度為1、2或3個核苷酸之3'延伸部分。在一些實施例中，反義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含與對應DUX4 mRNA序列互補之核苷酸。在一些實施例中，反義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含不與對應DUX4 mRNA序列互補之核苷酸。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4或5個核苷酸之3'延伸部分的有義股。在一些實施例中，有義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸或與DUX4 mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。在一些實施例中，3'有義股延伸部分包括或由以下序列中之一者組成，但不限於：T、UT、TT、UU、UUT、TTT、或TTTT (各自5'至3'列出)。
有義股可具有3'延伸部分及/或5'延伸部分。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含具有長度為1、2、3、4、5或6個核苷酸之5'延伸部分的有義股。在一些實施例中，有義股延伸部分核苷酸中之一或多者包含與DUX4 mRNA序列中之核苷酸對應或一致的核苷酸。在一些實施例中，有義股5'延伸部分為以下序列中之一者，但不限於：CA、AUAGGC、AUAGG、AUAG、AUA、A、AA、AC、GCA、GGCA、GGC、UAUCA、UAUC、UCA、UAU、U、UU (各自5'至3'列出)。
用於形成DUX4 RNAi藥劑之序列之實例提供於表2、3及4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包括表2或表3中之序列中之任一者的序列。在某些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表3或表5.4中之經修飾之序列中之任一者或由其組成。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包括表2、3或5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列(5'端à3'端) 1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1­19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包括表2或表4中之序列中之任一者的序列。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包括表2、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列(5'端à3'端) 1-18、1-19、1-20、1­21、2-19、2-20、2-21、3-20、3-21或4-21。在某些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包含或由以下組成：表4.1、表4.2、表4.3、表4.4、表4.5、表4.6或表5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列。
在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有相同數目個核苷酸。在一些實施例中，本文所描述之RNAi藥劑之有義股及反義股含有不同數目個核苷酸。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成鈍端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均非鈍端。如本文所使用，「鈍端」係指雙股RNAi藥劑之一端，其中兩個所黏接股之末端核苷酸互補(形成互補鹼基對)。
在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股5'端及反義股3'端形成磨損端。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股3'端及反義股5'端形成磨損端。在一些實施例中，RNAi藥劑之兩端均形成磨損端。在一些實施例中，RNAi藥劑之末端均非磨損端。如本文所使用，磨損端係指雙股RNAi藥劑之一端，其中兩個黏接股之末端核苷酸形成對(亦即，不形成突出物)，但並不互補(亦即，形成非互補對)。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑之一個股之末端處的一或多個不成對的核苷酸形成突出物。不成對核苷酸可位於有義股或反義股上，從而產生3'或5'突出物。在一些實施例中，RNAi藥劑含有:鈍端及磨損端、鈍端及5'突出端、鈍端及3'突出端、磨損端及5'突出端、磨損端及3'突出端、兩個5'突出端、兩個3'突出端、5'突出端及3'突出端、兩個磨損端或兩個鈍端。通常，突出物(若存在)位於有義股、反義股或有義股及反義股兩者之3'末端處。
本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑亦可包含一或多個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑之有義股的實質上全部核苷酸及反義股的實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑可進一步包含一或多個經修飾之核苷間鍵，例如一或多個硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑含有一或多個經修飾之核苷酸及一或多個經修飾之核苷間鍵。在一些實施例中，2'-經修飾之核苷酸與經修飾之核苷間鍵組合。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離酸形式製備或提供。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑以鈉鹽形式製備。此項技術中所熟知之該等形式在本文中所揭示之發明之範疇內。 經修飾之核苷酸
當用於各種寡核苷酸構築體中時，經修飾之核苷酸可保存細胞中化合物之活性，同時增加此等化合物之血清穩定性，且亦可最小化在投與寡核苷酸構築體時人類中活化干擾素活性之可能性。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑含有一或多個經修飾之核苷酸。如本文中所使用，「經修飾之核苷酸」為除核糖核苷酸(2'-羥基核苷酸)以外的核苷酸。在一些實施例中，至少50% (例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，經修飾之核苷酸可包括(但不限於)去氧核糖核苷酸、核苷酸模擬物、無鹼基核苷酸、經2'-修飾之核苷酸、反向核苷酸、包含經修飾之核鹼基之核苷酸、橋接核苷酸、肽核酸(PNA)、2',3'-開環核苷酸模擬物(未鎖定核鹼基類似物)、鎖定核苷酸、3'-O-甲氧基(2'核苷間連接之)核苷酸、2'-F-阿拉伯糖基核苷酸、5'-甲基、2'-氟核苷酸、N-𠰌啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸及含膦酸環丙酯之核苷酸。2'-經修飾之核苷酸(亦即，在五員糖環之2'位置處具有除羥基以外之基團的核苷酸)包括(但不限於) 2'-O-甲基核苷酸(亦稱為2'-甲氧基核苷酸)、2'-氟核苷酸(在本文中亦稱為2'-去氧-2'-氟核苷酸)、2'-去氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-O-(2-甲氧基乙基))核苷酸(亦稱為2'-MOE)、2'-胺基核苷酸及2'-烷基核苷酸。並非給定化合物之所有位置需經均一修飾。相反，多於一種修飾可併入單一DUX4 RNAi藥劑中或甚至其單一核苷酸中。DUX4 RNAi藥劑有義股及反義股可藉由此項技術中已知之方法合成及/或修飾。一個核苷酸處之修飾獨立於另一核苷酸處之修飾。各種經修飾之核苷酸為此項技術中所熟知及描述。
經修飾之核鹼基包括合成及天然核鹼基，諸如5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及經N-2、N-6及O-6取代之嘌呤(例如2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、肌苷(次黃嘌呤)、黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-異丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-異丙基或2-正丁基)及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8胺基、8-硫氫基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(例如5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一些實施例中，反義股之5'及/或3'端可包括無鹼基殘基(Ab)，其亦可稱為「無鹼基位點」或「無鹼基核苷酸」。無鹼基殘基(Ab)為在糖部分之1'位置處不具有核鹼基之核苷酸或核苷。在一些實施例中，無鹼基殘基可置放於核苷酸序列內部。在一些實施例中，Ab或AbAb可添加至反義股之3'端。在一些實施例中，有義股之5'端可包括一或多個額外無鹼基殘基(例如(Ab)或(AbAb))。在一些實施例中，將UUAb、UAb或Ab添加至有義股之3'端。在一些實施例中，可用核糖醇(無鹼基核糖)殘基替代無鹼基(去氧核糖)殘基。
在一些實施例中，RNAi藥劑之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。如本文所使用，其中所存在之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸之RNAi藥劑為有義股及反義股兩者中之四個或更少(亦即0、1、2、3或4個)核苷酸為核糖核苷酸(亦即未經修飾)的RNAi藥劑。如本文所使用，其中所存在之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸之有義股係有義股中之兩個或更少(亦即，0、1或2)個核苷酸為未經修飾之核糖核苷酸的有義股。如本文所使用，其中所存在的實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸之反義有義股係有義股中之兩個或更少(亦即，0、1或2)個核苷酸為未經修飾之核糖核苷酸的反義股。在一些實施例中，RNAi藥劑之一或多個核苷酸為未經修飾之核糖核苷酸。某些經修飾之核苷酸之化學結構闡述於本文表6.1中。 經修飾之核苷間鍵
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑之一或多個核苷酸藉由非標準鍵或主鏈(亦即，經修飾之核苷間鍵或經修飾之主鏈)連接。經修飾之核苷間鍵或主鏈包括(但不限於)硫代磷酸酯基(本文中表示為小寫字母「s」)、對掌性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、二硫代磷酸酯、膦酸烷基酯(例如，膦酸甲酯或3'-伸烷基膦酸酯)、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基亞磷酸酯(例如，3'-胺基胺基亞磷酸酯、胺基烷基胺基亞磷酸酯或硫羰基胺基亞磷酸酯)、硫羰基烷基-膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、𠰌啉基鍵、具有正常3'-5'鍵之硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物或具有反向極性之硼烷磷酸酯，其中相鄰核苷單元對使3'-5'連接於5'-3'或使2'-5'連接於5'-2'。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵或主鏈不具有磷原子。不具有磷原子之經修飾之核苷間鍵包括(但不限於)短鏈烷基或環烷基糖間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基糖間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環糖間鍵。在一些實施例中，經修飾之核苷間主鏈包括(但不限於)矽氧烷主鏈、硫醚主鏈、亞碸主鏈、碸主鏈、甲醯基及硫甲醯基主鏈、亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈、含有烯烴之主鏈、胺基磺酸酯主鏈、亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈、磺酸酯及磺醯胺主鏈、醯胺主鏈及其他具有混合N、O、S及CH 2組分之主鏈。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，DUX4 RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3、4、5或6個硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑之有義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，DUX4 RNAi藥劑之反義股可含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵，或有義股及反義股兩者可獨立地含有1、2、3或4個硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股含有至少兩個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵在自有義股之3'端之位置1-3處的核苷酸之間。在一些實施例中，一個硫代磷酸酯核苷間鍵在有義股核苷酸序列之5'端處，且另一硫代磷酸酯鍵在有義股核苷酸序列之3'端處。在一些實施例中，兩個硫代磷酸酯核苷間鍵位於有義股之5'端，且另一硫代磷酸酯鍵位於有義股之3'端。在一些實施例中，有義股不包括核苷酸之間的任何硫代磷酸酯核苷間鍵，但含有5'及3'端上之末端核苷酸之間的一個、兩個或三個硫代磷酸酯鍵且視情況存在反向無鹼基殘基端帽。在一些實施例中，靶向配位體經由硫代磷酸酯鍵連接於有義股。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股含有四個硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，四個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義股之5'端起之位置1-3處的核苷酸之間以及自5'端起之位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26處的核苷酸之間。在一些實施例中，三個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義股之5'端起之位置1-4之間，且第四個硫代磷酸酯核苷間鍵位於自反義股之5'端起之位置20-21之間。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑在反義股中含有至少三個或四個硫代磷酸酯核苷間鍵。 封端殘基或部分
在一些實施例中，有義股可包括一或多個封端殘基或部分，在此項技術中有時稱為「帽」、「端帽」或「封端殘基」。如本文所使用，「封端殘基」為非核苷酸化合物或可在本文所揭示之RNAi藥劑之核苷酸序列的一或多個端處併入之其他部分。在一些情況下，封端殘基可為RNAi藥劑提供某些有益特性，諸如(例如)防止核酸外切酶降解。在一些實施例中，添加反向無鹼基殘基(invAb) (在此項技術中亦稱為「反向無鹼基位點」)作為封端殘基(參見表6.1)。(參見例如F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705-16；美國專利第5,998,203號)。封端殘基為此項技術中通常已知的，且包括例如反向無鹼基殘基以及碳鏈，諸如末端C 3H 7(丙基)、C 6H 13(己基)或C 12H 25(十二烷基)基團。在一些實施例中，在有義股之5'末端、3'末端或5'及3'末端兩者處存在封端殘基。在一些實施例中，有義股之5'端及/或3'端可包括超過一個反向無鹼基去氧核糖部分作為封端殘基。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之3'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點插入靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點插入PK/PD調製劑與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。在一些實施例中，在RNAi藥劑之有義股之一或多個末端或其附近包括一或多個反向無鹼基殘基或反向無鹼基位點允許增強RNAi藥劑之活性或其他所需特性。
在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基(invAb)添加至有義股之5'端。在一些實施例中，將一或多個反向無鹼基殘基插入靶向配位體與RNAi藥劑之有義股的核苷酸序列之間。反向無鹼基殘基可經由磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵(例如，本文中展示為(invAb)s))或其他核苷間鍵連接。在一些實施例中，在RNAi藥劑之有義股之一或多個末端或其附近包括一或多個反向無鹼基殘基可允許增強RNAi藥劑之活性或其他所需特性。在一些實施例中，反向無鹼基(去氧核糖)殘基可經反向核糖醇(無鹼基核糖)殘基置換。在一些實施例中，反義股核心伸長序列之3'端或反義股序列之3'端可包括反向無鹼基殘基。反向無鹼基去氧核糖殘基之化學結構展示於下表6.1中。 DUX4 RNAi藥劑
本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑實施例經設計以靶向 DUX4基因上之特定位置(亦即 DUX4基因轉錄物上之特定位置)。如本文所定義，反義股序列經設計以當反義股之5'末端核鹼基在與基因鹼基配對時與基因上位置下游(朝向3'端) 21個核苷酸的位置對準時，靶向基因上特定位置處之 DUX4基因。舉例而言，如本文中表1及表2中所說明，設計成在位置408處靶向 DUX4基因之反義股序列需要在與該基因鹼基配對時，該反義股之5'末端核鹼基與 DUX4基因之位置428對準。
如本文中所提供，對於本文所揭示之具體實施例，DUX4 RNAi藥劑不需要反義股之位置1 (5'→3')處之核鹼基與基因互補，其限制條件為在至少16個連續核苷酸之核心伸長序列內反義股與基因具有至少85%互補性(例如，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補性)。舉例而言，對於本文所揭示之設計成靶向 DUX4基因之位置408的 DUX4RNAi藥劑，DUX4 RNAi藥劑之反義股之5'末端核鹼基必須與基因之位置428對準；然而，反義股之5'末端核鹼基可以但非必需與 DUX4基因之位置428互補，其限制條件為在至少16個連續核苷酸之核心伸長序列內反義股及基因具有至少85%互補性(例如，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補性)。如尤其本文所揭示之各種實例所示，基因藉由DUX4 RNAi藥劑之反義股的特異性結合位點(例如不管DUX4 RNAi藥劑係設計成靶向位置408處、位置1437處或一些其他位置處的 DUX4基因)對DUX4 RNAi藥劑實現的抑制程度至關重要。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑靶向表1中所展示之DUX4序列之位置或其附近的 DUX4基因。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之反義股包括與表1中所揭示之靶向DUX4 19-m聚體序列完全、實質上或至少部分互補的核心伸長序列。 表 1.DUX4 19聚體mRNA目標序列(獲自 智人雙重同源匣4、轉錄變異體2、GenBank NM_001293798.2)
SEQ ID No. DUX4 19 聚體 目標序列 (5 ' → 3 ') SEQ ID NO: 1 上序列之對應位置 靶向基因位置( 如本文中所提及)
3 GGAUUCAGAUCUGGUUUCA 408-428 408
4 GAUUCAGAUCUGGUUUCAA 409-429 409
5 CCUUGUUCUUCCGUGAAAU 1433-1453 1433
6 GUUCUUCCGUGAAAUUCUA 1437-1457 1437
7 ACCUGGAUUAGAGUUACAU 1496-1516 1496
8 CUGGAUGAUUAGUUCAGAA 1518-1538 1518
9 AUGAUUAGUUCAGAGAUAU 1522-1542 1522
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置19 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19聚體目標序列之位置1形成鹼基對。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置1 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19聚體目標序列之位置19形成鹼基對。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置2 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19聚體目標序列之位置18形成鹼基對。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括反義股，其中反義股之位置2至18 (5'→3')能夠與表1中所揭示之19聚體目標序列之位置18至2處的各別互補鹼基中之每一者形成鹼基對。
對於本文所揭示之RNAi藥劑，反義股之位置1處之核苷酸(5'→3'端)可與 DUX4基因完美互補，或可與 DUX4基因不互補。在一些實施例中，反義股之位置1處的核苷酸(5'端→3'端)為U、A或dT。在一些實施例中，反義股之位置1處的核苷酸(5'端→3'端)與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表2、表3或表5.4中之反義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 2-18或2-19。在一些實施例中，DUX4 RNAi有義股包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之有義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 1-17、1-18或2-18。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含：(i)反義股，其包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 2-18或2-19；及(ii)有義股，其包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之有義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 1-17或1-18。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括下表2中所示之核心19聚體核苷酸序列。 表 2.DUX4 RNAi藥劑反義股及有義股核心伸長鹼基序列(N=任何核鹼基)
SEQ ID NO:. 反義股鹼基序列 (5 ' → 3 ') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:. 有義股鹼基序列 (5 ' → 3 ') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO: 1 所鑑別之序列之對應位置 靶向基因位置
10 UGAAACCAGAUCUGAAUCC 38 GGAUUCAGAUCUGGUUUCA 410-428 408
11 AGAAACCAGAUCUGAAUCC 39 GGAUUCAGAUCUGGUUUCU 410-428 408
12 NGAAACCAGAUCUGAAUCC 40 GGAUUCAGAUCUGGUUUCN 410-428 408
13 NGAAACCAGAUCUGAAUCN 41 NGAUUCAGAUCUGGUUUCN 410-428 408
14 UUGAAACCAGAUCUGAAUC 42 GAUUCAGAUCUGGUUUCAA 411-429 409
15 AUGAAACCAGAUCUGAAUC 43 GAUUCAGAUCUGGUUUCAU 411-429 409
16 NUGAAACCAGAUCUGAAUC 44 GAUUCAGAUCUGGUUUCAN 411-429 409
17 NUGAAACCAGAUCUGAAUN 45 NAUUCAGAUCUGGUUUCAN 411-429 409
18 AUUUCACGGAAGAACAAGG 46 CCUUGUUCUUCCGUGAAAU 1435-1453 1433
19 UUUUCACGGAAGAACAAGG 47 CCUUGUUCUUCCGUGAAAA 1435-1453 1433
20 NUUUCACGGAAGAACAAGG 48 CCUUGUUCUUCCGUGAAAN 1435-1453 1433
21 NUUUCACGGAAGAACAAGN 49 NCUUGUUCUUCCGUGAAAN 1435-1453 1433
22 UAGAAUUUCACGGAAGAAC 50 GUUCUUCCGUGAAAUUCUA 1439-1457 1437
23 AAGAAUUUCACGGAAGAAC 51 GUUCUUCCGUGAAAUUCUU 1439-1457 1437
24 NAGAAUUUCACGGAAGAAC 52 GUUCUUCCGUGAAAUUCUN 1439-1457 1437
25 NAGAAUUUCACGGAAGAAN 53 NUUCUUCCGUGAAAUUCUN 1439-1457 1437
26 AUGUAACUCUAAUCCAGGU 54 ACCUGGAUUAGAGUUACAU 1498-1516 1496
27 UUGUAACUCUAAUCCAGGU 55 ACCUGGAUUAGAGUUACAA 1498-1516 1496
28 NUGUAACUCUAAUCCAGGU 56 ACCUGGAUUAGAGUUACAN 1498-1516 1496
29 NUGUAACUCUAAUCCAGGN 57 NCCUGGAUUAGAGUUACAN 1498-1516 1496
30 UUCUGAACUAAUCAUCCAG 58 CUGGAUGAUUAGUUCAGAA 1520-1538 1518
31 AUCUGAACUAAUCAUCCAG 59 CUGGAUGAUUAGUUCAGAU 1520-1538 1518
32 NUCUGAACUAAUCAUCCAG 60 CUGGAUGAUUAGUUCAGAN 1520-1538 1518
33 NUCUGAACUAAUCAUCCAN 61 NUGGAUGAUUAGUUCAGAN 1520-1538 1518
34 AUAUCUCUGAACUAAUCAU 62 AUGAUUAGUUCAGAGAUAU 1524-1542 1522
35 UUAUCUCUGAACUAAUCAU 63 AUGAUUAGUUCAGAGAUAA 1524-1542 1522
36 NUAUCUCUGAACUAAUCAU 64 AUGAUUAGUUCAGAGAUAN 1524-1542 1522
37 NUAUCUCUGAACUAAUCAN 65 NUGAUUAGUUCAGAGAUAN 1524-1542 1522
包含表2中之核苷酸序列或由其組成之DUX4 RNAi藥劑有義股及反義股可為經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，具有包含表2中之核苷酸序列中之任一者或由其組成之有義股及反義股序列的DUX4 RNAi藥劑全部或實質上全部為經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之反義股與表2中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之有義股與表2中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
如本文所使用，表2中所揭示之序列中所列的各N可獨立地選自任何及全部核鹼基(包括經修飾之核苷酸及未經修飾之核苷酸兩者上之彼等核鹼基)。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置的N核苷酸不互補的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置的N核苷酸相同的核鹼基。在一些實施例中，表2中所揭示之序列中所列的N核苷酸具有與另一股上對應位置處之N核苷酸不同的核鹼基。
某些經修飾之DUX4 RNAi藥劑有義股及反義股提供於表3及表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中。經修飾之DUX4 RNAi藥劑反義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表3中。經修飾之DUX4 RNAi藥劑有義股以及其基礎未經修飾之核鹼基序列提供於表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中。在形成DUX4 RNAi藥劑時，表3及表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4以及上文表2中所列之基礎鹼基序列中之每一者中的各核苷酸可為經修飾之核苷酸。
本文所描述之DUX4 RNAi藥劑藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中所列序列之有義股可與含有表2、表3或表5.4中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補性之區域。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表2、表3或表5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含以下或由以下組成：具有表2、表3或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的有義股及反義股之核鹼基序列的雙螺旋體。
含有經修飾之核苷酸之反義股的實例提供於表3中。含有經修飾之核苷酸之有義股的實例提供於表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中。
如在表3及表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中所使用，以下標記用於指示經修飾之核苷酸、靶向基團及連接基團： A             = 腺苷-3'-磷酸酯 C             = 胞苷-3'-磷酸酯 G             = 鳥苷-3'-磷酸酯 U             =  尿苷-3'-磷酸酯 I              =  肌苷-3'-磷酸酯 a              =  2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯 as             =  2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯 c              =  2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯 cs             =  2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯 g              = 2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯 gs            =  2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯 i              = 2'-O-甲基肌苷-3'-磷酸酯 is             =  2'-O-甲基肌苷-3'-硫代磷酸酯 t              =  2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯 ts             =  2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 u              =  2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯 us            =  2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 Af            =  2'-氟腺苷-3'-磷酸酯 Afs          =  2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯 Cf            =  2'-氟胞苷-3'-磷酸酯 Cfs           =  2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯 Gf            =  2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯 Gfs          =  2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯 Tf            =  2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-磷酸酯 Tfs           =  2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯 Uf            =  2'-氟尿苷-3'-磷酸酯 Ufs          =  2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯 dT            =  2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯 A UNA=  2',3'-開環-腺苷-3'-磷酸酯 A UNAs =  2',3'-開環-腺苷-3'-硫代磷酸酯 C UNA=  2',3'-開環-胞苷-3'-磷酸酯 C UNAs =  2',3'-開環-胞苷-3'-硫代磷酸酯 G UNA=  2',3'-開環-鳥苷-3'-磷酸酯 G UNAs =  2',3'-開環-鳥苷-3'-硫代磷酸酯 U UNA=  2',3'-開環-尿苷-3'-磷酸酯 U UNAs =  2',3'-開環-尿苷-3'-硫代磷酸酯 a_2N        =  參見表6.1 a_2Ns       =  參見表6.1 (invAb)    =  反向無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-磷酸酯，參見表6.1 (invAb)s   =  反向無鹼基去氧核糖核苷酸-5'-硫代磷酸酯，參見表6.1 s              =  硫代磷酸酯鍵 p              =  末端磷酸酯(如所合成) vpdN        =  膦酸乙烯酯去氧核糖核苷酸 cPrpa        =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯(參見表6.1) cPrpas      =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯(參見表6.1) cPrpu       =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯(參見表6.1) cPrpus      =  5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯(參見表6.1) aAlk         =  2'-O-炔丙基腺苷-3'-磷酸酯，參見表6.1 aAlks       =  2'-O-炔丙基腺苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6.1 cAlk         =  2'-O-炔丙基胞苷-3'-磷酸酯，參見表6.1 cAlks       =  2'-O-炔丙基胞苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6.1 gAlk         = 2'-O-炔丙基鳥苷-3'-磷酸酯，參見表6.1 gAlks       =  2'-O-炔丙基鳥苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6.1 tAlk         =  2'-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯，參見表6.1 tAlks        =  2'-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6.1 uAlk         =  2'-O-炔丙基尿苷-3'-磷酸酯，參見表6.1 uAlks       =  2'-O-炔丙基尿苷-3'-硫代磷酸酯，參見表6.1 (Alk-SS-C6)  =  參見表6.1 (C6-SS-Alk)  =  參見表6.1 (C6-SS-C6)   =  參見表6.1 (6-SS-6)       =  參見表6.1 (C6-SS-Alk-Me) =   參見表6.1 (NH2-C6)    =   參見表6.1 (Alk-cyHex) =   參見表6.1 (Alk-cyHex)s    =   參見表6.1
如一般熟習此項技術者將容易地理解，除非藉由序列(諸如藉由硫代磷酸酯鍵「s」)另外指明，否則當存在於寡核苷酸中時，核苷酸單體藉由5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接。如一般熟習此項技術者將清楚地理解，包括如本文所揭示之經修飾之核苷酸序列中所展示之硫代磷酸酯鍵替代寡核苷酸中通常存在之磷酸二酯鍵。此外，一般熟習此項技術者將容易理解，離體給定寡核苷酸序列之3'端的末端核苷酸通常將在給定單體之相應3'位置處具有羥基(-OH)而非磷酸酯部分。此外，如一般技術者將容易地理解及瞭解，雖然本文中所描繪之硫代磷酸酯化學結構通常展示陰離子位於硫原子上，但本文所揭示之發明涵蓋所有硫代磷酸酯互變異構體(例如，其中硫原子具有雙鍵且陰離子位於氧原子上)。本文中除非另外明確指示，否則在描述本文中所揭示之DUX4 RNAi藥劑及DUX4 RNAi藥劑之組合物時使用一般熟習此項技術者之此類理解。
與本文中所揭示之DUX4 RNAi藥劑一起使用的靶向基團及連接基團之某些實例包括在下表6.1中所提供之化學結構中。各有義股及/或反義股可具有與序列之5'端及/或3'端結合的本文中所列之任何靶向基團或連接基團，以及其他靶向基團或連接基團。 表 3.DUX4 RNAi藥劑反義股序列
反義股 ID 經修飾之反義股 (5 ' → 3') SEQ ID NO: 基礎鹼基序列 (5 ' → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:
AM09247-AS usGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg 66 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM09250-AS usUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu 67 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU 163
AM09252-AS usAfsgsAfaUfuUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfsg 68 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM09260-AS usUfscsUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfcAfgGfsa 69 UUCUGAACUAAUCAUCCAGGA 165
AM10009-AS asUfsusUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfaGfgGfsc 70 AUUUCACGGAAGAACAAGGGC 166
AM10019-AS asUfsgsUfaAfcUfcUfaAfuCfcAfgGfuUfsu 71 AUGUAACUCUAAUCCAGGUUU 167
AM10023-AS asUfsasUfcUfcUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfsc 72 AUAUCUCUGAACUAAUCAUCC 168
AM10026-AS cPrpusAfsgsAfaUfuUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfsg 73 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10028-AS cPrpusUfscsUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfcAfgGfsa 74 UUCUGAACUAAUCAUCCAGGA 165
AM10029-AS cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg 75 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM10030-AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu 76 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU 163
AM10159-AS usUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc 77 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10195-AS cPrpasUfsusUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfaGfgGfsc 78 AUUUCACGGAAGAACAAGGGC 166
AM10197-AS cPrpasUfsgsUfaAfcUfcUfaAfuCfcAfgGfuUfsu 79 AUGUAACUCUAAUCCAGGUUU 167
AM10199-AS cPrpasUfsasUfcUfcUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfsc 80 AUAUCUCUGAACUAAUCAUCC 168
AM10251-AS usAfsgsaauuucacGfgAfaGfaacasg 81 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10252-AS usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg 82 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10260-AS usUfscsugaacuaaUfcAfuCfcaggsa 83 UUCUGAACUAAUCAUCCAGGA 165
AM10378-AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg 84 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10380-AS usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc 85 UAGAAUUUCACGGAAGAACAC 170
AM10381-AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc 86 UAGAAUUUCACGGAAGAACAC 170
AM10464-AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc 87 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10564-AS usUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc 88 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10565-AS cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc 89 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10566-AS usUfsgsaaacCfaGfaUfcUfgAfauccsc 90 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10567-AS cPrpusUfsgsaaacCfaGfaUfcUfgAfauccsc 91 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC 169
AM10645-AS cPrpusUfscsugaacuaaUfcAfuCfcaggsa 92 UUCUGAACUAAUCAUCCAGGA 165
AM10646-AS cPrpusAfsgsaauuucacGfgAfaGfaacasg 93 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10647-AS usAfsgsaauuucacGfgAfaGfaacasc 94 UAGAAUUUCACGGAAGAACAC 170
AM10648-AS cPrpusAfsgsaauuucacGfgAfaGfaacasc 95 UAGAAUUUCACGGAAGAACAC 170
AM10850-AS usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg 96 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM10851-AS cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg 97 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM10852-AS usGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg 98 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM10853-AS cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg 99 UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG 162
AM10948-AS cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg 100 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
AM10949-AS cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg 101 UAGAAUUUCACGGAAGAACAG 164
表 4.1.DUX4 RNAi藥劑有義股序列
有義股 ID 經修飾之有義股 (5 ' → 3') SEQ ID NO: 基礎鹼基序列 (5 ' → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:
AM09965-SS (NH2-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-SS-C6)dT 102 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCAT 171
AM09966-SS (NH2-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 103 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAAT 172
AM09967-SS (NH2-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6)dT 104 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUAT 173
AM09968-SS (NH2-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 105 UCCUGGAUGAUUAGUUCAGAAT 174
AM10194-SS (NH2-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-SS-C6)dT 106 GCCCUUGUUCUUCCGUGAAAUT 175
AM10196-SS (NH2-C6)s(invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb)(C6-SS-C6)dT 107 (A 2N)AACCUGGAUUAGAGUUACAUT 176
AM10198-SS (NH2-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-SS-C6)dT 108 GGAUGAUUAGUUCAGAGAUAUT 177
AM10379-SS (NH2-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6)dT 109 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUAT 178
AM10382-SS (NH2-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6)dT 110 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUAT 178
AM10463-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 111 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAAT 179
AM10465-SS (NH2-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 112 (A 2N)GGAUUCAGAUCUGGUUUCAAT 238
AM10568-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 113 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAAT 179
AM10569-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6)dT 114 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAAT 179
AM10854-SS (NH2-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugiuuucas(invAb)(C6-SS-C6)dT 115 CAGGAUUCAGAUCUGIUUUCAT 180
AM10950-SS (NH2-C6)s(invAb)scuguucuuCfcGfuGfaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6)dT 116 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUAT 173
(A 2N)表示2-胺基腺嘌呤核苷酸；I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸
如上表4.1中所示，實例DUX4 RNAi藥劑有義股核苷酸序列經展示在有義股之5'末端與3'末端處進一步包括反應性連接基團。舉例而言，上表4.1中所示之DUX4 RNAi藥劑有義股序列在核苷酸序列之5'端處具有(NH2-C6)連接基團。類似地，上表4.1中所示之DUX4 RNAi藥劑核苷酸序列在核苷酸序列之3'端附近具有(C6-SS-C6)連接基團。此類反應性連接基團定位成促進靶向配位體、靶向基團及/或PK/PD調節劑與本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之連接。連接或結合反應為此項技術中所熟知且使得在兩種分子或反應物之間形成共價鍵。本文中適用於本發明範疇之結合反應包括(但不限於)醯胺偶合反應、邁克爾加成反應(Michael addition reaction)、腙形成反應及點擊化學環加成反應。
在一些實施例中，靶向配位體可合成為四氟苯基(TFP)酯，其與胺基(例如NH2-C6)反應以使靶向配位體附接至本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向配位體合成為疊氮化物，其可結合於炔丙基或DBCO基團，例如經由點擊化學環加成反應。
此外，表4.1中所示之核苷酸序列用有義股之3'末端處的dT核苷酸合成，接著用(3' →5')連接子(例如C6-SS-C6)合成。適合且市售之裝載dT之樹脂可用於引發寡核苷酸股之合成。在一些實施例中，(C6-SS-C6)連接子可促進與額外組分，諸如(例如) PK/PD調節劑或一或多個靶向配位體之連接。如本文所描述，C6-SS-C6首先除其他以外減少將dT殘基自分子裁切出，由此可隨後有助於所需PK/PD調節劑結合。下表4.2展示上表4.1中所鑑別之核苷酸序列，但不包括3'末端dT核苷酸，因為當活體內遞送時，此等核苷酸序列恰當反映本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之序列。
此外，下表4.3展示上表4.1中所鑑別之核苷酸序列，但不存在末端連接基團(亦即僅具有封端基團之核苷酸序列)。 表 4.2.DUX4 RNAi藥劑有義股序列展示3'末端dT
有義股ID: 經修飾之有義股(5 ' → 3 ') SEQ ID NO. 基礎鹼基序列 (5 ' → 3 ') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO.
AM09965-SS (NH2-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-SS-C6) 117 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA 181
AM09966-SS (NH2-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6) 118 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 182
AM09967-SS (NH2-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6) 119 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
AM09968-SS (NH2-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-SS-C6) 120 UCCUGGAUGAUUAGUUCAGAA 184
AM10194-SS (NH2-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-SS-C6) 121 GCCCUUGUUCUUCCGUGAAAU 185
AM10196-SS (NH2-C6)s(invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb)(C6-SS-C6) 122 (A 2N)AACCUGGAUUAGAGUUACAU 186
AM10198-SS (NH2-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-SS-C6) 123 GGAUGAUUAGUUCAGAGAUAU 187
AM10379-SS (NH2-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6) 124 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10382-SS (NH2-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6) 125 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10463-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6) 126 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10465-SS (NH2-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6) 127 (A 2N)GGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 239
AM10568-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6) 128 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10569-SS (NH2-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb)(C6-SS-C6) 129 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10854-SS (NH2-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugiuuucas(invAb)(C6-SS-C6) 130 CAGGAUUCAGAUCUGIUUUCA 190
AM10950-SS (NH2-C6)s(invAb)scuguucuuCfcGfuGfaaauucuas(invAb)(C6-SS-C6) 131 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
(A 2N)表示2-胺基腺嘌呤核苷酸；I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸 表 4.3.DUX4 RNAi藥劑有義股序列展示無末端連接基團
有義股 ID 經修飾之有義股 (5 ' → 3') SEQ ID NO: 基礎鹼基序列 (5 ' → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:
AM09965-SS (invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb) 132 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA 181
AM09966-SS (invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb) 133 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 182
AM09967-SS (invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb) 134 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
AM09968-SS (invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb) 135 UCCUGGAUGAUUAGUUCAGAA 184
AM10194-SS (invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb) 136 GCCCUUGUUCUUCCGUGAAAU 185
AM10196-SS (invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb) 137 (A 2N)AACCUGGAUUAGAGUUACAU 186
AM10198-SS (invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb) 138 GGAUGAUUAGUUCAGAGAUAU 187
AM10379-SS (invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb) 139 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10382-SS (invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb) 140 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10463-SS (invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb) 141 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10465-SS (invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb) 142 (A 2N)GGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 239
AM10568-SS (invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb) 143 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10569-SS (invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb) 144 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10854-SS (invAb)scaggauucAfGfAfucugiuuucas(invAb) 145 CAGGAUUCAGAUCUGIUUUCA 190
AM10950-SS (invAb)scuguucuuCfcGfuGfaaauucuas(invAb) 146 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
(A 2N)表示2-胺基腺嘌呤核苷酸；I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸 表 4.4.DUX4 RNAi藥劑有義股序列展示為僅經修飾之核苷酸序列(無末端連接基團或反向無鹼基封端部分)
有義股 ID 經修飾之有義股 (5 ' → 3') SEQ ID NO: 基礎鹼基序列 (5 ' → 3') ( 展示為未經修飾之核苷酸序列) SEQ ID NO:
AM09965-SS caggauucAfGfAfucugguuuca 147 CAGGAUUCAGAUCUGGUUUCA 181
AM09966-SS aggauucaGfAfUfcugguuucaa 148 AGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 182
AM09967-SS cuguucuuCfCfGfugaaauucua 149 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
AM09968-SS uccuggauGfAfUfuaguucagaa 150 UCCUGGAUGAUUAGUUCAGAA 184
AM10194-SS gcccuuguUfCfUfuccgugaaau 151 GCCCUUGUUCUUCCGUGAAAU 185
AM10196-SS a_2NaaccuggAfUfUfagaguuacau 152 (A 2N)AACCUGGAUUAGAGUUACAU 186
AM10198-SS ggaugauuAfGfUfucagagauau 153 GGAUGAUUAGUUCAGAGAUAU 187
AM10379-SS guguucuuCfCfGfugaaauucua 154 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10382-SS guguucUfuCfcGfugaaauucua 155 GUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 188
AM10463-SS gggauucaGfAfUfcugguuucaa 156 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10465-SS a_2NggauucaGfAfUfcugguuucaa 157 (A 2N)GGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 239
AM10568-SS gggauucaGfaUfcugguuucaa 158 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10569-SS gggauucaGfaUfCfugguuucaa 159 GGGAUUCAGAUCUGGUUUCAA 189
AM10854-SS caggauucAfGfAfucugiuuuca 160 CAGGAUUCAGAUCUGIUUUCA 190
AM10950-SS cuguucuuCfcGfuGfaaauucua 161 CUGUUCUUCCGUGAAAUUCUA 183
(A 2N)表示2-胺基腺嘌呤核苷酸；I表示肌苷(次黃嘌呤)核苷酸
如本文所論述，在一些實施例中，一或多種靶向配位體及/或PK調節劑連接或結合於RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向配位體(或靶向基團)及/或PK調節劑連接於有義股之5'端、有義股之3'端及/或一或多個內部核苷酸。有義股及/或反義股之合成可經設計以使得反應性基團可容易地用於促進與額外組分，諸如靶向配位體或PK/PD調節劑連接。下表4.5描繪下表4.1中以上所揭示之DUX4 RNAi藥劑在連接於一或多種靶向配位體及/或PK/PD調節劑(下文展示統稱為Z)之後的有義股。使用下文實例1中所描述之反應將藥理學部分連接於DUX4 RNAi藥劑。在與靶向配位體結合之後，連接基團可具有結構(NH-C6)、(NH-C6)或(C6-S)，其中之每一者之結構展示於下表6.1中。 表 4.5.DUX4 RNAi藥劑有義股序列展示靶向配位體及/或PK/PD調節劑位置(Z=藥理學部分(例如靶向配位體、靶向基團及/或PK/PD調節劑))
有義股ID: 經修飾之有義股(5 ' → 3 ') SEQ ID NO.
AM09965-SS Z-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)- Z 191
AM09966-SS Z-(NH-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- Z 192
AM09967-SS Z-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- Z 193
AM09968-SS Z-(NH-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-S)- Z 194
AM10194-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-S)- Z 195
AM10196-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb)(C6-S)- Z 196
AM10198-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-S)- Z 197
AM10379-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- Z 198
AM10382-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- Z 199
AM10463-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- Z 200
AM10465-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- Z 201
AM10568-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- Z 202
AM10569-SS Z-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb)(C6-S)- Z 203
AM10854-SS Z-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugiuuucas(invAb)(C6-S)- Z 204
AM10950-SS Z-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfcGfuGfaaauucuas(invAb)(C6-S)- Z 205
表 4.6.DUX4 RNAi藥劑有義股序列展示連接在有義股之5'末端之靶向配位體及連接在有義股之3'末端之PK/PD調節劑。( TL=靶向配位體； PK=PK/PD調節劑))
有義股ID: 經修飾之有義股 (5 ' → 3 ') SEQ ID NO.
AM09965-SS TL-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)- PK 206
AM09966-SS TL-(NH-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- PK 207
AM09967-SS TL-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- PK 208
AM09968-SS TL-(NH-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-S)- PK 209
AM10194-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-S)- PK 210
AM10196-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb)(C6-S)- PK 211
AM10198-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-S)- PK 212
AM10379-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- PK 213
AM10382-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)- PK 214
AM10463-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- PK 215
AM10465-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- PK 216
AM10568-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)- PK 217
AM10569-SS TL-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb)(C6-S)- PK 218
AM10854-SS TL-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugiuuucas(invAb)(C6-S)- PK 219
AM10950-SS TL-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfcGfuGfaaauucuas(invAb)(C6-S)- PK 220
本文所描述之DUX4 RNAi藥劑藉由反義股與有義股黏接而形成。含有表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中所列序列之有義股可與含有表2、表3或表5.4中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補性之區域。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之反義股與表3中之反義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之有義股與表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之有義股序列中之任一者相差0、1、2或3個核苷酸。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之序列中之任一者的核苷酸序列。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表2、表3或表5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列(5'端 →3'端) 1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24或2-24。在某些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表3中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列或由其組成。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21、4-21、1-22、2-22、3-22、4-22、1-23、2-23、3-23、4-23、1-24、2-24、3-24或4-24。在某些實施例中，DUX4 RNAi藥劑有義股包含以下或由以下組成：表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列。
對於本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑，反義股之位置1處的核苷酸(5'端→3'端)可與 DUX4基因完美互補，或可與 DUX4基因不互補。在一些實施例中，反義股(5'端→3'端)之位置1處的核苷酸為U、A或dT (或其經修飾之型式)。在一些實施例中，反義股之位置1處的核苷酸(5'端→3'端)與有義股形成A:U或U:A鹼基對。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑反義股包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 2-18或2-19。在一些實施例中，DUX4 RNAi有義股包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之有義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 1-17或1-18。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括(i)反義股，其包含表2或表3中之反義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 2-18或2-19；及(ii)有義股，其包含表2或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之有義股序列中之任一者的核苷酸序列(5'端→3'端) 1-17或1-18。
含有表2或表4中所列序列之有義股可與含有表2或表3中所列序列之任何反義股雜交，其限制條件為兩個序列在連續16、17、18、19、20或21個核苷酸序列內具有至少85%互補性的區域。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑具有由表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成的有義股，及由表3或表5.4中之經修飾之序列中之任一者的經修飾之序列組成的反義股。某些代表性序列配對由表5.1、5.2、5.3及5.4中所示之雙螺旋體ID編號例示。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：由本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者表示的雙螺旋體。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含由本文所呈現之任何雙螺旋體ID編號表示的任何雙螺旋體之有義股及反義股核苷酸序列。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含由本文所呈現之任何雙螺旋體ID編號表示的任何雙螺旋體之有義股及反義股核苷酸序列，及靶向配位體、靶向基團及/或連接基團，其中靶向配位體、靶向基團及/或連接基團共價連接(結合)至有義股或反義股。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包括本文所呈現之雙螺旋體ID編號中之任一者的有義股及反義股經修飾之核苷酸序列。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含本文所呈現之任何雙螺旋體ID編號之有義股及反義股經修飾之核苷酸序列，及靶向配位體、靶向基團及/或連接基團，其中靶向配位體、靶向基團及/或連接基團共價連接至有義股或反義股。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含具有表2或表5.1 (或表5.2、表5.3或表5.4)之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列的反義股及有義股，且進一步包含靶向基團。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含具有表5.1 (或表5.2或5.3，或表5.4)之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列的反義股及有義股，且進一步包含整合素受體配位體靶向基團。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含反義股及有義股，其具有表5.1、5.2、5.3或5.4之反義股/有義股雙螺旋體中之任一者的核苷酸序列，且包含一或多個選自由(NH2-C6)、(C6-NH2)、(C6-SS-C6)或(6-SS-6)組成之群的連接基團，其各自如表6.1中所定義。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含具有表3或表4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6或5.4中之任何反義股及/或有義股核苷酸序列之經修飾之核苷酸序列的反義股及有義股。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含反義股及有義股，其具有表5.1 (或表5.2、5.3或5.4)之任何雙螺旋體之任何反義股及/或有義股核苷酸序列之經修飾之核苷酸序列，且進一步包含整合素靶向基團。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：表5.1 (或表5.2、5.3或5.4)之任何雙螺旋體。 表 5.1.具有對應有義股及反義股ID編號之DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體
雙螺旋體ID 反義股ID 有義股ID
AD07218 AM09247-AS AM09965-SS
AD07219 AM09250-AS AM09966-SS
AD07220 AM09252-AS AM09967-SS
AD07221 AM09260-AS AM09968-SS
AD07274 AM10029-AS AM09965-SS
AD07275 AM10030-AS AM09966-SS
AD07276 AM10026-AS AM09967-SS
AD07277 AM10028-AS AM09968-SS
AD07394 AM10009-AS AM10194-SS
AD07395 AM10195-AS AM10194-SS
AD07396 AM10019-AS AM10196-SS
AD07397 AM10197-AS AM10196-SS
AD07398 AM10023-AS AM10198-SS
AD07399 AM10199-AS AM10198-SS
AD07510 AM10252-AS AM09967-SS
AD07511 AM10378-AS AM09967-SS
AD07512 AM10380-AS AM10379-SS
AD07513 AM10381-AS AM10379-SS
AD07514 AM10380-AS AM10382-SS
AD07515 AM10381-AS AM10382-SS
AD07555 AM10159-AS AM10463-SS
AD07556 AM10464-AS AM10463-SS
AD07557 AM09250-AS AM10465-SS
AD07558 AM10030-AS AM10465-SS
AD07615 AM10564-AS AM10463-SS
AD07616 AM10565-AS AM10463-SS
AD07617 AM10566-AS AM10463-SS
AD07618 AM10567-AS AM10463-SS
AD07619 AM10464-AS AM10568-SS
AD07620 AM10464-AS AM10569-SS
AD07662 AM10260-AS AM09968-SS
AD07663 AM10645-AS AM09968-SS
AD07664 AM10251-AS AM09967-SS
AD07665 AM10646-AS AM09967-SS
AD07666 AM10647-AS AM10379-SS
AD07667 AM10648-AS AM10379-SS
AD07775 AM10850-AS AM09965-SS
AD07776 AM10851-AS AM09965-SS
AD07777 AM10852-AS AM09965-SS
AD07778 AM10853-AS AM09965-SS
AD07779 AM09247-AS AM10854-SS
AD07780 AM10029-AS AM10854-SS
AD07843 AM10948-AS AM09967-SS
AD07844 AM10949-AS AM09967-SS
AD07845 AM10949-AS AM10950-SS
表 5.2.具有對應有義股及反義股ID編號及經修飾及未經修飾之核苷酸序列之序列ID編號之DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體。
雙螺旋體 AS ID AS 經修飾之 SEQ ID NO: AS 未經修飾之 SEQ ID NO: SS ID SS 經修飾之 SEQ ID NO*: SS 未經修飾之 SEQ ID NO:
AD07218 AM09247-AS 66 162 AM09965-SS 117 181
AD07219 AM09250-AS 67 163 AM09966-SS 118 182
AD07220 AM09252-AS 68 164 AM09967-SS 119 183
AD07221 AM09260-AS 69 165 AM09968-SS 120 184
AD07274 AM10029-AS 75 162 AM09965-SS 117 181
AD07275 AM10030-AS 76 163 AM09966-SS 118 182
AD07276 AM10026-AS 73 164 AM09967-SS 119 183
AD07277 AM10028-AS 74 165 AM09968-SS 120 184
AD07394 AM10009-AS 70 166 AM10194-SS 121 185
AD07395 AM10195-AS 78 166 AM10194-SS 121 185
AD07396 AM10019-AS 71 167 AM10196-SS 122 186
AD07397 AM10197-AS 79 167 AM10196-SS 122 186
AD07398 AM10023-AS 72 168 AM10198-SS 123 187
AD07399 AM10199-AS 80 168 AM10198-SS 123 187
AD07510 AM10252-AS 82 164 AM09967-SS 119 183
AD07511 AM10378-AS 84 164 AM09967-SS 119 183
AD07512 AM10380-AS 85 170 AM10379-SS 124 188
AD07513 AM10381-AS 86 170 AM10379-SS 124 188
AD07514 AM10380-AS 85 170 AM10382-SS 125 188
AD07515 AM10381-AS 86 170 AM10382-SS 125 188
AD07555 AM10159-AS 77 169 AM10463-SS 126 189
AD07556 AM10464-AS 87 169 AM10463-SS 126 189
AD07557 AM09250-AS 67 163 AM10465-SS 127 239
AD07558 AM10030-AS 76 163 AM10465-SS 127 239
AD07615 AM10564-AS 88 169 AM10463-SS 126 189
AD07616 AM10565-AS 89 169 AM10463-SS 126 189
AD07617 AM10566-AS 90 169 AM10463-SS 126 189
AD07618 AM10567-AS 91 169 AM10463-SS 126 189
AD07619 AM10464-AS 87 169 AM10568-SS 128 189
AD07620 AM10464-AS 87 169 AM10569-SS 129 189
AD07662 AM10260-AS 83 165 AM09968-SS 120 184
AD07663 AM10645-AS 92 165 AM09968-SS 120 184
AD07664 AM10251-AS 81 164 AM09967-SS 119 183
AD07665 AM10646-AS 93 164 AM09967-SS 119 183
AD07666 AM10647-AS 94 170 AM10379-SS 124 188
AD07667 AM10648-AS 95 170 AM10379-SS 124 188
AD07775 AM10850-AS 96 162 AM09965-SS 117 181
AD07776 AM10851-AS 97 162 AM09965-SS 117 181
AD07777 AM10852-AS 98 162 AM09965-SS 117 181
AD07778 AM10853-AS 99 162 AM09965-SS 117 181
AD07779 AM09247-AS 66 162 AM10854-SS 130 190
AD07780 AM10029-AS 75 162 AM10854-SS 130 190
AD07843 AM10948-AS 100 164 AM09967-SS 119 183
AD07844 AM10949-AS 101 164 AM09967-SS 119 183
AD07845 AM10949-AS 101 164 AM10950-SS 131 183
* 經修飾之SS序列取自表4.2(展示為可製造性不添加末端dT)。 表 5.3.具有靶向於 DUX4基因上之對應有義股及反義股ID編號參考位置之DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體
雙螺旋體ID 反義股ID 有義股ID 靶向XHD 基因位置 ( 屬於 SEQ ID NO:1)
AD07218 AM09247-AS AM09965-SS 408
AD07219 AM09250-AS AM09966-SS 409
AD07220 AM09252-AS AM09967-SS 1437
AD07221 AM09260-AS AM09968-SS 1518
AD07274 AM10029-AS AM09965-SS 408
AD07275 AM10030-AS AM09966-SS 409
AD07276 AM10026-AS AM09967-SS 1437
AD07277 AM10028-AS AM09968-SS 1518
AD07394 AM10009-AS AM10194-SS 1433
AD07395 AM10195-AS AM10194-SS 1433
AD07396 AM10019-AS AM10196-SS 1496
AD07397 AM10197-AS AM10196-SS 1496
AD07398 AM10023-AS AM10198-SS 1522
AD07399 AM10199-AS AM10198-SS 1522
AD07510 AM10252-AS AM09967-SS 1437
AD07511 AM10378-AS AM09967-SS 1437
AD07512 AM10380-AS AM10379-SS 1437
AD07513 AM10381-AS AM10379-SS 1437
AD07514 AM10380-AS AM10382-SS 1437
AD07515 AM10381-AS AM10382-SS 1437
AD07555 AM10159-AS AM10463-SS 409
AD07556 AM10464-AS AM10463-SS 409
AD07557 AM09250-AS AM10465-SS 409
AD07558 AM10030-AS AM10465-SS 409
AD07615 AM10564-AS AM10463-SS 409
AD07616 AM10565-AS AM10463-SS 409
AD07617 AM10566-AS AM10463-SS 409
AD07618 AM10567-AS AM10463-SS 409
AD07619 AM10464-AS AM10568-SS 409
AD07620 AM10464-AS AM10569-SS 409
AD07662 AM10260-AS AM09968-SS 1518
AD07663 AM10645-AS AM09968-SS 1518
AD07664 AM10251-AS AM09967-SS 1437
AD07665 AM10646-AS AM09967-SS 1437
AD07666 AM10647-AS AM10379-SS 1437
AD07667 AM10648-AS AM10379-SS 1437
AD07775 AM10850-AS AM09965-SS 408
AD07776 AM10851-AS AM09965-SS 408
AD07777 AM10852-AS AM09965-SS 408
AD07778 AM10853-AS AM09965-SS 408
AD07779 AM09247-AS AM10854-SS 408
AD07780 AM10029-AS AM10854-SS 408
AD07843 AM10948-AS AM09967-SS 1437
AD07844 AM10949-AS AM09967-SS 1437
AD07845 AM10949-AS AM10950-SS 1437
如本文所描述，在一些實施例中，雙螺旋有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列可連接於某些靶向配位體及/或PK/PD調節劑。吾等連接之某些例示性靶向配位體及/或PK/PD調節劑如下表5.4中所示，其展示充分結合之雙螺旋體且具有「AC」鑑別首碼。
表 5.4.具有經化學修飾之反義股及有義股的結合物ID編號(包括連接子及結合物)
AC ID 編號 股 (SS= 有義股 AS= 反義股 ) 股 ( 經結合靶向配位體充分修飾 ) (5 ' à 3 ' ) 充分結合之 AD ID 編號之型式
AC000232 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07511
   AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)   
AC000237 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07776
   AS cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)   
AC000246 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP38b (SEQ ID NO:223) AD07511
   AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)   
AC000247 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP38b (SEQ ID NO:224) AD07776
   AS cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)   
AC000250 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07220
   AS usAfsgsAfaUfuUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfsg (SEQ ID NO:68)   
AC000251 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07218
   AS usGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:66)   
AC000252 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:225) AD07219
   AS usUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:67)   
AC000253 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)saggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:225) AD07275
   AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)   
AC000254 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07276
   AS cPrpusAfsgsAfaUfuUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfsg (SEQ ID NO:73)   
AC000255 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:226) AD07221
   AS usUfscsUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfcAfgGfsa (SEQ ID NO:69)   
AC000256 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)succuggauGfAfUfuaguucagaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:226) AD07277
   AS cPrpusUfscsUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfcAfgGfsa (SEQ ID NO:74)   
AC000257 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sa_2NaaccuggAfUfUfagaguuacaus(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:227) AD07396
   AS asUfsgsUfaAfcUfcUfaAfuCfcAfgGfuUfsu (SEQ ID NO:71)   
AC000258 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07276
   AS cPrpusAfsgsAfaUfuUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfsg (SEQ ID NO:73)   
AC000259 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07510
   AS usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)   
AC000260 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:228) AD07512
   AS usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc (SEQ ID NO:85)   
AC000261 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sguguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:228) AD07513
   AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc (SEQ ID NO:86)   
AC000262 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:229) AD07514
   AS usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc (SEQ ID NO:85)   
AC000263 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sguguucUfuCfcGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:229) AD07515
   AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasc (SEQ ID NO:86)   
AC000264 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:230) AD07394
   AS asUfsusUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfaGfgGfsc (SEQ ID NO:70)   
AC000265 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgcccuuguUfCfUfuccgugaaaus(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:230) AD07395
   AS cPrpasUfsusUfcAfcGfgAfaGfaAfcAfaGfgGfsc (SEQ ID NO:78)   
AC000266 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:231) AD07398
   AS asUfsasUfcUfcUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfsc (SEQ ID NO:72)   
AC000267 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sggaugauuAfGfUfucagagauaus(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:231) AD07399
   AS cPrpasUfsasUfcUfcUfgAfaCfuAfaUfcAfuCfsc (SEQ ID NO:80)   
AC000268 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07555
   AS usUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:77)   
AC000269 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07556
   AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)   
AC000270 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:244) AD07557
   AS usUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:67)   
AC000271 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sa_2NggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb) (C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:245) AD07558
   AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)   
AC000272 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07615
   AS usUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:88)   
AC000273 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07616
   AS cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)   
AC000274 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07617
   AS usUfsgsaaacCfaGfaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:90)   
AC000275 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfAfUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:232) AD07618
   AS cPrpusUfsgsaaacCfaGfaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:91)   
AC000276 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfcugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:233) AD07619
   AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)   
AC000277 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)sgggauucaGfaUfCfugguuucaas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:234) AD07620
   AS cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)   
AC000278 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07274
   AS cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)   
AC000279 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07775
   AS usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)   
AC000280 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07777
   AS usGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:98)   
AC000281 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:222) AD07778
   AS cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)   
AC000282 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07843
   AS cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)   
AC000283 SS αvβ6-SM45-L4-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP1b (SEQ ID NO:221) AD07844
   AS cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)   
AC000446 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scuguucuuCfCfGfugaaauucuas(invAb)(C6-S)-LP29b (SEQ ID NO:235) AD07511
   AS cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)   
AC000447 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP29b (SEQ ID NO:236) AD07776
   AS cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)   
AC000448 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP29b (SEQ ID NO:236) AD07778
   AS cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)   
AC000449 SS αvβ6-肽1-(NH-C6)s(invAb)scaggauucAfGfAfucugguuucas(invAb)(C6-S)-LP38b (SEQ ID NO:237) AD07778
   AS cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)   
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑以鹽、混合鹽或游離鹼形式製備或提供。在一些實施例中，將XDH RNAi藥劑製備為醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，將XDH RNAi藥劑製備為醫藥學上可接受之鈉鹽。此項技術中所熟知之該等形式在本文中所揭示之發明之範疇內。本文所描述之RNAi藥劑在遞送至表現 DUX4基因之細胞之後可在活體內及/或活體外抑制或阻斷一或多個 DUX4基因之表現。
在一些實施例中，本文描述包括至少兩種具有不同序列之DUX4 RNAi藥劑之組合或混合物的組合物。在一些實施例中，兩種或兩種以上DUX4 RNAi藥劑各自分別且獨立地連接於靶向基團。在一些實施例中，兩種或兩種以上DUX4 RNAi藥劑各自連接於包括靶向配位體或由靶向配體組成之靶向基團。在一些實施例中，兩種或兩種以上DUX4 RNAi藥劑各自連接於靶向基團。 靶向基團、連接基團及遞送媒劑
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑含有一或多種非核苷酸基團或與一或多種非核苷酸基團結合，該一或多種非核苷酸基團包括(但不限於)靶向基團、連接基團、藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑、遞送聚合物或遞送媒劑。非核苷酸基團可增強RNAi藥劑之靶向、遞送或附接。連接基團之實例提供於表6.1中，且靶向基團或靶向配位體之實例提供於表6.2及表6.3中。非核苷酸基團可共價連接至有義股及/或反義股之3'端及/或5'端。在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑含有連接於有義股之3'及/或5'端之非核苷酸基團。在一些實施例中，非核苷酸基團連接於DUX4 RNAi藥劑有義股之5'端。非核苷酸基團可經由連接子/連接基團而直接或間接連接於RNAi藥劑。在一些實施例中，非核苷酸基團經不穩定、可裂解或可逆鍵或連接子連接於RNAi藥劑。
在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi藥劑或附接至其之結合物之藥物動力學或生物分佈特性，以改良細胞特異性或組織特異性分佈及結合物之細胞特異性吸收。在一些實施例中，非核苷酸基團增強RNAi藥劑之內飲作用。
靶向基團或靶向配位體增強結合物或其所附接之RNAi藥劑之藥物動力學或生物分佈特性，以改良結合物或RNAi藥劑之細胞特異性(在一些情況下包括器官特異性)分佈及細胞特異性(或器官特異性)吸收。靶向基團可為單價、二價、三價、四價或具有更高價數，以用於其所針對之目標。代表性靶向基團包括(但不限於)對細胞表面分子具有親和力之化合物、對細胞表面分子具有親和力之細胞受體配位體、半抗原、抗體、單株抗體、抗體片段及抗體模擬物。在一些實施例中，靶向基團使用連接子連接於RNAi藥劑，該連接子諸如PEG連接子或一個、兩個或三個無鹼基及/或核糖醇(無鹼基核糖)殘基，該等殘基在一些情況下可充當連接子。
本文所描述之DUX4 RNAi藥劑可合成為在5'末端及/或3'端處具有反應性基團，諸如胺基(在本文中亦稱為胺)。反應性基團隨後可用於使用此項技術中典型之方法附接靶向部分。
舉例而言，在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑合成為在RNAi藥劑之有義股之5'端處具有NH 2-C 6基團(在本文中之經修飾之序列中表示為(NH2-C6))。末端胺基隨後可反應以與例如包括靶向配位體之基團形成結合物。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑合成為在RNAi藥劑之有義股的5'端處具有一或多個炔烴基團。末端炔基可隨後經反應以與例如包括靶向配位體之基團形成結合物。
在一些實施例中，RNAi藥劑包含靶向基團，其包括2個或2個以上靶向配位體。在一些實施例中，靶向基團可結合於RNAi藥劑之有義股之5'或3'端。在一些實施例中，靶向基團可結合於RNAi藥劑上之內部核苷酸。在一些實施例中，靶向基團可由連接在一起之兩個靶向配位體組成，稱為「雙齒」靶向基團。在一些實施例中，靶向基團可由連接在一起之三個靶向配位體組成，稱為「三齒」靶向基團。在一些實施例中，靶向基團可由連接在一起之四個靶向配位體組成，稱為「四齒」靶向基團。
在一些實施例中，使用靶向配位體促進細胞特異性靶向在其對應表面上具有所需受體之細胞，且靶向配位體之結合可促進治療劑(諸如RNAi藥劑)進入其所連接之細胞(諸如骨骼肌細胞)中。靶向配位體可為單體或單價的(例如，具有單一靶向部分)或多聚或多價的(例如，具有多個靶向部分)。靶向基團可使用此項技術中已知之方法附接至RNAi寡核苷酸之3'端及/或5'端。
本發明之實施例包括用於在活體內將DUX4 RNAi藥劑遞送至骨骼肌細胞之醫藥組合物。此類醫藥組合物可包括例如結合於包含靶向配位體之靶向基團之DUX4 RNAi藥劑。
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑可減少以下組織中之一或多者中的 DUX4基因表現：旁脊髓、面部、軀幹、腹部及四肢肌肉組織，包括例如三頭肌、二頭肌、四頭肌、胸肌、腓腸肌、比目魚肌、嚼肌、EDL (伸趾長肌)、TA (脛前肌)、斜方肌及/或隔膜。
在一些實施例中，連接基團與RNAi藥劑結合。連接基團促進藥劑與靶向基團、藥物動力學調節劑、遞送聚合物或遞送媒劑之共價連接。連接基團可連接於RNAi藥劑有義股或反義股之3'及/或5'端。在一些實施例中，連接基團連接於RNAi藥劑有義股。在一些實施例中，連接基團結合於RNAi藥劑有義股之5'端或3'端。在一些實施例中，連接基團結合於RNAi藥劑有義股的5'端。連接基團之實例包括(但不限於)：C6-SS-C6；6-SS-6；反應性基團，諸如一級胺(例如，NH2-C6)及炔烴；烷基；無鹼基殘基/核苷酸；胺基酸；三炔烴官能化基團；核糖醇；及/或PEG基團。
連接子或連接基團為兩個原子之間的連接部分，其經由一或多個共價鍵將一個相關化學基團(諸如RNAi藥劑)或片段連接於另一相關化學基團(諸如靶向基團、藥物動力學調節劑或遞送聚合物)或片段。不穩定連接含有不穩定鍵。連接可視情況包括使兩個接合之原子之間的距離增加的間隔基。間隔基可進一步增加連接之可撓性及/或長度。間隔基包括但不限於烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基；其各自可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣類。間隔基團在此項技術中已熟知且前述清單不意欲限制本說明書之範疇。
在一些實施例中，靶向基團在不使用額外連接子之情況下連接於DUX4 RNAi藥劑。在一些實施例中，靶向基團經設計成具有容易存在的連接子以促進與DUX4 RNAi藥劑之連接。在一些實施例中，當組合物中包括兩種或兩種以上RNAi藥劑時，該兩種或兩種以上RNAi藥劑可使用相同連接子連接於其各別靶向基團。在一些實施例中，當組合物中包括兩種或兩種以上RNAi藥劑時，該兩種或兩種以上RNAi藥劑使用不同連接子連接於其各別靶向基團。
表2、3及4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中所列之DUX4 RNAi藥劑核苷酸序列中之任一者(無論經修飾或未經修飾)可含有3'及/或5'靶向基團、連接基團及/或藥物動力學調節劑。表3及4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6及5.4中所列之DUX4 RNAi藥劑序列中之任一者或本文中以其他方式描述，其含有3'或5'靶向基團、連接基團或藥物動力學調節劑可替代地不含有3'或5'靶向基團、連接基團或PK/PD調節劑，或可含有不同的3'或5'靶向基團、連接基團或PK/PD調節劑，包括(但不限於)表6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6或6.7中所描繪之彼等。表5.1中所列之DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體中之任一者(或表5.2、5.3或5.4) (無論經修飾或未經修飾)可進一步包含靶向基團、連接基團或PK/PD調節劑，包括(但不限於)表6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6或6.7中所描繪之彼等，且在一些實施例中，靶向基團、連接基團及/或PK/PD調節劑可附接至DUX4 RNAi藥劑雙螺旋體之有義股的3'或5'末端，或反義股之3'或5'末端。
某些經修飾之核苷酸及連接基團之實例提供於表6.1中。 表 6.1.表示各種經修飾之核苷酸及連接基團的結構
Figure 02_image003
a_2N                                                                                   a_2Ns
Figure 02_image005
aAlk                                                                                     aAlks
Figure 02_image007
cAlk                                                                                         cAlks
Figure 02_image009
gAlk                                                                                     gAlks
Figure 02_image011
uAlk                                                                                     uAlks
Figure 02_image013
cPrpas                                                                                   cPrpa
Figure 02_image015
cPrpus                                                                                   cPrpu
當位於內部時：
Figure 02_image017
(invAb)
當位於內部時：
Figure 02_image019
(invAb)s
當位於3'末端時：
Figure 02_image021
(invAb)
當位於寡核苷酸之3'末端時：   
Figure 02_image023
(C6-SS-C6)
當位於內部時：
Figure 02_image025
(C6-SS-C6)
Figure 02_image027
(C6-S)
當位於3'末端時：
Figure 02_image029
(6-SS-6)
當位於寡核苷酸內部時：
Figure 02_image031
(6-SS-6)
Figure 02_image033
(C6-SS-Alk)或(Alk-SS-C6)
Figure 02_image035
(C6-SS-Alk-Me)
Figure 02_image037
(PEG-C3-SS)
Figure 02_image039
(NH2-C6)
Figure 02_image041
(NH-C6)
Figure 02_image043
(NH2-C6)s
Figure 02_image045
(NH-C6)s
Figure 02_image047
DBCO-NHS (BroadPharm® BP-22231)
Figure 02_image049
連接子-1
Figure 02_image051
連接子-2
Figure 02_image053
連接子-3
Figure 02_image055
連接子-4
Figure 02_image057
連接子-5 (Activate Scientific® AS28942)
Figure 02_image059
連接子-6 (BroadPharm® BP-20907)
Figure 02_image061
連接子-7
Figure 02_image063
連接子-8
Figure 02_image065
連接子-9
Figure 02_image067
連接子-10
或者，可使用此項技術中已知的其他連接基團。在許多情況下，連接基團可商業地獲得或替代地併入至商業上可獲得之核苷酸胺基亞磷酸酯中。
在一些實施例中，靶向配位體連接於本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑。某些靶向配位體之實例提供於表6.2中： 表 6.2.表示靶向配位體之結構
Figure 02_image069
Figure 02_image071
Figure 02_image073
Figure 02_image075
Figure 02_image077
Figure 02_image079
或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image081
指示與DUX4 RNAi藥劑之連接點。在一些實施例中，PEG或其他連接基團併入RNAi藥劑與靶向配位體之間。
在一些實施例中，表6.2中之靶向基團與允許將包括一或多個靶向基團之靶向配位體有效偶合至本文所揭示之RNAi藥劑的反應性基團一起合成。在一些實施例中，表6.2中所鑑別之靶向基團係以疊氮化合物形式合成以促進連接於RNAi藥劑。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑連接於具有表6.3中所揭示之結構的靶向配位體： 表 6.3.與DUX4 RNAi藥劑組合之實例靶向配位體。
Figure 02_image083
Figure 02_image085
Figure 02_image087
Figure 02_image089
Figure 02_image091
Figure 02_image093
或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image095
指示與DUX4 RNAi藥劑之連接點。
在一些實施例中，遞送媒劑可用於將RNAi藥劑遞送至細胞或組織中。遞送媒劑為使RNAi藥劑遞送至細胞或組織改良之化合物。遞送媒劑可包括(但不限於)以下或由以下組成：聚合物，諸如兩性聚合物、膜活性聚合物、肽、蜂毒素肽、蜂毒素類肽(MLP)、脂質、經可逆修飾之聚合物或肽或經可逆修飾之膜活性多元胺。
在一些實施例中，RNAi藥劑可與脂質、奈米粒子、聚合物、脂質體、微胞、DPC或核酸遞送之此項技術中可利用之其他遞送系統組合。RNAi藥劑亦可以化學方式結合於靶向基團、脂質(包括(但不限於)膽固醇基及膽固醇基衍生物)，藉由離子導入療法或藉由併入至此項技術中可利用之其他遞送媒劑或系統(諸如水凝膠、環糊精、生物可降解奈米膠囊、生物黏附微球體或蛋白質載體)中來囊封於奈米粒子、脂質體、微胞中，結合於聚合物或DPC (參見例如WO 2000/053722、WO 2008/022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其中之每一者以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，RNAi藥劑可結合於對骨骼肌細胞具有親和力之抗體。在一些實施例中，RNAi藥劑可連接於對骨骼肌細胞或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力的靶向配位體。 藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑
在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑進一步或替代地連接於一或多種PK/PD調節劑。適用於與本文所揭示之RNAi藥劑一起使用的某些藥力學/藥物動力學(PK/PD)調節劑之實例提供於表6.4中。在表6.4中，PK/PD調節劑自商業供應商獲得，其中指示且以其他方式使用市售材料合成： 表 6.4例示性PK/PD調節劑化合物。
Figure 02_image097
PEG40K (2x2-臂)， 其中n及m為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓 NOF，Sunbright ® GL4-400MA
Figure 02_image099
PEG40K (4-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓 NOF，Sunbright® XY4-400MA
Figure 02_image101
PEG40K (2-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓 NOF，Sunbright® GL2-400MA
Figure 02_image103
PEG40K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓 NOF，Sunbright® ME-400MA
Figure 02_image105
PEG10K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約10千道爾頓 NOF，Sunbright® ME-100MA
Figure 02_image107
PEG5K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓 NOF，Sunbright® ME-050MA
Figure 02_image109
DSPE-PEG5K-NHS (Naonsoft Polymers TM#SKU 1544) (1,2-二硬脂醯基- sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[丁二醯亞胺基(聚乙二醇)])，其中n為整數且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image111
DSPE-PEG5K-MAL (Naonsoft Polymers TMSKU #2049) 1,2-二硬脂醯基- sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[順丁烯二醯亞胺(聚乙二醇)]， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image113
DSPE-PEG5K-N3 (Naonsoft Polymers TMSKU #2274) (1,2-二硬脂醯基- sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[疊氮基(聚乙二醇)])，其中n為整數且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image115
PEG47+C22
Figure 02_image117
PEG47+CLS (膽固醇)
Figure 02_image119
PEG23+C22
Figure 02_image121
雙(PEG23+C14)
Figure 02_image123
雙(PEG23+C22)
Figure 02_image125
雙(PEG47+C22)
Figure 02_image127
PEG48+C22
Figure 02_image129
PEG71+C22
Figure 02_image131
PEG95+C22
Figure 02_image133
PEG71+CLS
Figure 02_image135
PEG95+CLS
Figure 02_image137
雙(PEG23+C18)
Figure 02_image139
參(PEG23+C22)
Figure 02_image141
參(PEG23+CLS)
Figure 02_image143
雙(PEG23+CLS)
Figure 02_image145
PEG5K+C22 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image147
C18
Figure 02_image149
(NHS)-PEG1K+C18 (Nanosoft Polymers TMSKU #10668-1000) 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約1千道爾頓
Figure 02_image151
(NHS)-PEG2K+C18 (Nanosoft Polymers TMSKU #10668-2000) 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約2千道爾頓
Figure 02_image153
(NHS)-PEG5K+C18 (Nanosoft Polymers TMSKU #10668-5000) 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image155
(MAL)-PEG5K+C18 (Nanosoft Polymers TMSKU #10647) 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image157
PEG48+C18
在一些實施例中，表6.4之PK/PD調節劑在與如表6.5中所示之DUX4 RNAi藥劑結合之後具有以下結構： 表 6.5.實例PK/PD調節劑與DUX4 RNAi藥劑結合。
Figure 02_image159
PEG40K (2x2-臂)， 其中n及m為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
Figure 02_image161
PEG40K (4-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
Figure 02_image163
PEG40K (2-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
Figure 02_image165
PEG40K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
Figure 02_image167
PEG10K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約10千道爾頓
Figure 02_image169
PEG5K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image171
DSPE-PEG5K-NHS 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image173
DSPE-PEG5K-MAL 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image175
DSPE-PEG5K-N3 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image177
PEG47+C22
Figure 02_image179
PEG47+CLS (膽固醇)
Figure 02_image181
PEG23+C22
Figure 02_image183
雙(PEG23+C14)
Figure 02_image185
雙(PEG23+C22)
Figure 02_image187
雙(PEG47+C22)
Figure 02_image189
PEG48+C22
Figure 02_image191
PEG71+C22
Figure 02_image193
PEG95+C22
Figure 02_image195
PEG71+CLS
Figure 02_image197
PEG95+CLS
Figure 02_image199
雙(PEG23+C18)
Figure 02_image201
參(PEG23+C22)
Figure 02_image203
參(PEG23+CLS)
Figure 02_image205
雙(PEG23+CLS)
Figure 02_image207
PEG5K+C22 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image209
C18
Figure 02_image211
(NHS)-PEG1K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約1千道爾頓
Figure 02_image213
(NHS)-PEG2K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約2千道爾頓
Figure 02_image215
(NHS)-PEG5K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image217
(MAL)-PEG5K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
Figure 02_image219
PEG48+C18
或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image221
指示與DUX4 RNAi藥劑之連接點。
在其他實施例中，可與本文所描述之DUX4 RNAi藥劑結合之PK/PD調節劑可選自由表6.6中之PK/PD調節劑組成之群： 表6.6：用於與DUX4 RNAi藥劑結合之實例PK/PD調節劑(化合物編號出現在結構之前)。
Figure 02_image223
Figure 02_image225
Figure 02_image227
Figure 02_image229
Figure 02_image231
Figure 02_image233
Figure 02_image235
Figure 02_image237
Figure 02_image239
Figure 02_image241
Figure 02_image243
在一些實施例中，表6.6之PK/PD調節劑在與如表6.7中所示之DUX4 RNAi藥劑結合後具有以下結構： 表 6.7.供DUX4 RNAi藥劑使用之實例PK/PD調節劑
Figure 02_image245
Figure 02_image247
Figure 02_image249
Figure 02_image251
Figure 02_image253
Figure 02_image255
Figure 02_image257
Figure 02_image259
Figure 02_image261
Figure 02_image263
Figure 02_image265
Figure 02_image267
其中R Z包含DUX4 RNAi藥劑。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑可包含一或多種PK/PD調節劑。在一些實施例中，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種或更多種PK/PD調節劑。
PK/PD調節劑可使用此項技術中任何已知方法與DUX4 RNAi藥劑結合。許多PK/PD調節劑，包括上述彼等調節劑中之若干者係可商購的。在一些實施例中，諸如表6.4中所示之若干化合物，PK/PD調節劑可包括順丁烯二醯亞胺部分且與包含二硫鍵之RNAi藥劑反應以形成包含PK/PD調節劑之RNAi藥劑。二硫鍵可經還原，且藉助於邁克爾加成反應加成至順丁烯二醯亞胺。例示性反應流程展示如下：
Figure 02_image269
其中R ZZ包含RNAi藥劑，且
Figure 02_image271
指示與此項技術中已知之任何適合基團之連接點。在上文反應流程之一些情況下，
Figure 02_image273
附接至烷基，諸如己基(C 6H 13)。
在一些實施例中，PK/PD調節劑前驅物可包含碸部分且可與二硫化物反應。例示性反應流程展示如下：
Figure 02_image275
其中R ZZ包含RNAi藥劑，且
Figure 02_image277
指示與此項技術中已知之任何適合基團之連接點。在上文反應流程之一些情況下，
Figure 02_image279
附接至烷基，諸如己基(C 6H 13)。
在一些實施例中，根據以下通用反應流程，PK/PD調節劑前驅物可包含疊氮化合物部分且與包含炔烴之RNAi藥劑反應以形成包含與RNAi藥劑結合之PK/PD調節劑的化合物：
Figure 02_image281
其中R ZZ包含RNAi藥劑。
在一些實施例中，根據以下通用反應流程，PK/PD調節劑前驅物可包含炔烴部分且與包含二硫化物之RNAi藥劑反應以形成包含與RNAi藥劑結合之PK/PD調節劑的化合物：
Figure 02_image283
其中R ZZ包含RNAi藥劑，且
Figure 02_image285
指示與此項技術中已知之任何適合基團之連接點。在上文反應流程之一些情況下，
Figure 02_image287
附接至烷基，諸如己基(C 6H 13)。
在一些實施例中，PK/PD調節劑可結合於有義股或反義股之5'端、有義股或反義股之3'端或DUX4 RNAi藥劑之內部核苷酸。在一些實施例中，使用以上通用合成流程合成在有義股之3'端具有含二硫鍵之部分的DUX4 RNAi藥劑，且PK/PD調節劑可結合於有義股之3'端。 醫藥組合物及調配物
本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑可以醫藥組合物或調配物(在本文中亦稱為「藥劑」)之形式製備。在一些實施例中，醫藥組合物包括至少一種DUX4 RNAi藥劑。此等醫藥組合物特別適用於抑制靶細胞、細胞群、組織或生物體中之DUX4 mRNA表現。醫藥組合物可用於治療患有疾病、病症或病況之個體，該疾病、病症或病況將得益於靶mRNA之含量降低或靶基因表現之抑制。在一些實施例中，待治療之疾病為FSHD，包括FSHD1及FSHD2。醫藥組合物可用於治療處於發生疾病或病症之風險之個體，該疾病或病症將得益於靶mRNA之含量降低或靶基因表現之抑制。在一個實施例中，該方法包括向待治療之個體投與連接於如本文所描述之靶向配位體的DUX4 RNAi藥劑。在一些實施例中，將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑(包括媒劑、載劑、稀釋劑及/或遞送聚合物)添加至包括DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物中，藉此形成適合於活體內遞送至個體(包括人類)之醫藥調配物或藥劑。
在一些實施例中，所描述之DUX4 RNAi藥劑中之一或多者係在醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑中投與至哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。取決於需要局部還是全身治療，可以多種方式投與包括一或多種DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物。投與可為(但不限於)例如靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、真皮下(例如，經由植入裝置)及腦實質內投與。
包括DUX4 RNAi藥劑及本文所揭示之方法之醫藥組合物降低細胞、細胞群、細胞群、組織、器官或個體中之靶mRNA之含量，包括藉由向個體投與治療有效量之本文所描述之DUX4 RNAi藥劑，由此抑制個體中DUX4 mRNA之表現。在一些實施例中，該個體事先已鑑定或診斷為患有至少部分地由DUX4表現介導之疾病或病症。在一些實施例中，個體事先已鑑定或診斷為患有將得益於一或多種細胞或組織中DUX4蛋白質含量降低的病況、疾病或病症。在一些實施例中，個體事先已診斷為患有一或多種骨骼肌疾病，諸如FSHD，諸如FSHD1或FSHD2。在一些實施例中，個體患有與一或多種骨骼肌疾病相關之症狀。
在一些實施例中，包括DUX4 RNAi藥劑之所描述之醫藥組合物用於治療或管理將得益於抑制DUX4表現之個體中的臨床表現。在一些實施例中，向需要此類治療之個體投與治療或預防有效量的醫藥組合物中之一或多者。在一些實施例中，所揭示之DUX4 RNAi藥劑中之任一者之投與可用於降低個體中疾病之症狀之數目、嚴重程度及/或頻率。
所描述之包括DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物可用於治療患有疾病或病症之個體中之至少一種症狀，該疾病或病症將得益於DUX4 mRNA表現之減少或抑制。在一些實施例中，向個體投與治療有效量之一或多種包括DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物，藉此治療該症狀。
投與途徑為藉以使DUX4 RNAi藥劑與身體實現接觸的路徑。一般而言，投與藥物、寡核苷酸及核酸以用於治療哺乳動物之方法為此項技術中所熟知且可應用於投與本文所描述之組合物。本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑可以根據特定途徑適當定製的製劑形式經由任何適合途徑投與。在一些實施例中，醫藥組合物可藉由注射(例如靜脈內、肌內、皮內、皮下、關節內或腹膜內或局部)投與。
包括本文所描述之DUX4 RNAi藥劑之醫藥組合物可使用此項技術中已知的寡核苷酸遞送技術遞送至細胞、細胞群、組織或個體。一般而言，此項技術中公認用於遞送核酸分子(活體外或活體內)之任何適合方法均適合與本文中所描述之組合物一起使用。舉例而言，遞送可藉由以下實現：局部投與(例如直接注射、植入或表面投與)、全身性投與或皮下、靜脈內、腹膜內或非經腸途徑，包括顱內(例如室內、腦實質內及鞘內)、肌內、經皮、氣道(氣溶膠)、經鼻、經口、經直腸或表面(包括經頰及舌下)投與。在一些實施例中，組合物經由皮下注射、肌內注射或靜脈內投與來投與。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。本文所描述之醫藥組合物經調配以用於向個體投與。
在一些實施例中，包括適用於SQ或IV投與之本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑的醫藥調配物可在水性磷酸鈉緩衝液(例如，在含0.5 mM磷酸二氫鈉、0.5 mM磷酸氫二鈉之水中調配之DUX4 RNAi藥劑)中製備。
如本文所使用，醫藥組合物或藥劑包括藥理學有效量之所描述治療性化合物中之至少一者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為有意包括於藥物遞送系統中之除活性醫藥成分(API、治療性產品，例如DUX4 RNAi藥劑)以外之物質。賦形劑在預期劑量下不發揮或不打算發揮治療作用。賦形劑可用於a)在製造期間輔助加工藥物遞送系統，b)保護、支撐或增強API之穩定性、生物可用性或患者接受性，c)有助於產物鑑別，及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
賦形劑包括(但不限於)：吸收增強劑、抗黏劑、抗起泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、遞送聚合物、清潔劑、聚葡萄糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油狀物、聚合物、防腐劑、鹽水、鹽、溶劑、糖類、界面活性劑、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、媒劑、驅水劑及潤濕劑。
適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合之載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, NJ.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。其在製造及儲存條件下應為穩定的，且應經保存以免受微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液態聚乙二醇)之溶劑或分散介質及其適合混合物。適當流動性可以例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)及氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)實現可注射組合物之延長吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下方法來製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合併入適當溶劑中，並視需要隨後進行過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有基本分散介質及來自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的粉末。
適用於關節內投與之調配物可呈藥物之無菌水性製劑形式，其可呈微晶形式，例如呈水性微晶懸浮液形式。脂質調配物或可生物降解聚合物系統亦可用於使藥物用於關節內及經眼投與。
活性化合物可用將防止化合物自體內快速排除之載劑製備，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。其可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。
就投與之容易性及劑量之均勻性而言，DUX4 RNAi藥劑可在組合物中以單位劑型形式調配。單位劑型係指適合作為單位劑量用於待治療之個體的物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，其經計算以與所需醫藥載劑一起產生所需治療效果。本說明書之單位劑型之規格由以下因素規定且直接取決於以下因素：活性化合物之獨特特徵及欲實現之治療效果，以及混配此類用於治療個體之活性化合物之領域中固有之限制。
醫藥組合物可含有常見於醫藥組合物中之其他額外組分。該等額外組分包括(但不限於)：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑、鎮痛劑、抗組織胺或抗炎劑(例如乙醯胺苯酚、NSAID、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設想表現或包含本文所定義之RNAi藥劑的細胞、組織或經分離之器官可用作「醫藥組合物」。如本文所使用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡稱「有效量」係指產生藥理學、治療性或預防性結果之RNAi藥劑之量。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法除了投與本文中所揭示之RNAi藥劑以外，進一步包含投與第二治療劑或第二治療之步驟。在一些實施例中，第二治療劑為另一DUX4 RNAi藥劑(例如靶向DUX4目標內之不同序列的DUX4 RNAi藥劑)。在其他實施例中，第二治療劑可為小分子藥物、抗體、抗體片段及/或適體。
一般而言，本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑之有效量將在每公斤體重/劑量約0.0001至約20 mg範圍內，例如每公斤體重/劑量約0.5至約10 mg。所投與之量及給藥頻率(例如每天、每兩週、每週、每月、每季度或每年)將可能視諸如以下各者之變數而定：患者之整體健康狀況、所遞送化合物之相對生物功效、藥物之調配物、調配物中賦形劑之存在及類型及投與途徑。此外，應理解可提高所投與之初始劑量以超出以上上限含量而快速獲得所需血液含量或組織含量，或初始劑量可小於最佳值。
為了治療疾病或形成用於治療疾病之藥劑或組合物，本文所描述之包括DUX4 RNAi藥劑的醫藥組合物可與賦形劑或第二治療劑或治療組合，包括(但不限於)：第二或其他RNAi藥劑、小分子藥物、抗體、抗體片段、肽及/或適體。
當添加至醫藥學上可接受之賦形劑或佐劑中時，所描述之DUX4 RNAi藥劑可封裝於套組、容器、封裝物或分配器中。本文中所描述之醫藥組合物可封裝於例如預填充注射器或小瓶中。 治療方法及表現抑制
本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑可用於治療患有將得益於RNAi藥劑投與之疾病或病症的個體(例如人類或其他哺乳動物)。在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑可用於治療將得益於DUX4 mRNA表現之降低及/或抑制的個體(例如人類)。
在一些實施例中，本文所揭示之RNAi藥劑可用於治療患有疾病或病症之個體(例如人類)，該疾病或病症將得益於DUX4蛋白質含量之降低，包括(但不限於)例如FSHD，包括FSHD1及FSHD2。個體之治療可包括治療性及/或防治性治療。向個體投與治療有效量之本文所描述之任何一或多種DUX4 RNAi藥劑。個體可為人類、患者或人類患者。個體可為成年人、青年、兒童或嬰兒。本文中所描述之醫藥組合物之投與可針對人類或動物。
在一些實施例中，所描述之DUX4 RNAi藥劑用於治療個體中至少部分地由DUX4蛋白質含量介導之至少一種症狀。向個體投與治療有效量之所描述之DUX4 RNAi藥劑中之任一或多者。在一些實施例中，向個體投與防治有效量之所描述之RNAi藥劑中之任一或多者，藉此藉由預防或抑制至少一種症狀來治療個體。
在某些實施例中，本發明提供用於治療有需要之患者之至少部分由 DUX4基因表現介導之疾病、病症、病況或病理狀態的方法，其中該等方法包括向患者投與本文所描述之DUX4 RNAi藥劑中之任一者。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑用於治療或管理個體中之臨床表現或病理狀態，其中臨床表現或病理狀態至少部分由DUX4表現介導。向個體投與治療有效量之本文所描述之DUX4 RNAi藥劑或含有DUX4 RNAi藥劑之組合物中之一或多者。在一些實施例中，該方法包含向待治療之個體投與本文所描述之包含DUX4 RNAi藥劑之組合物。
在一些實施例中，在投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體之某些骨骼肌細胞中DUX4基因之基因表現量或mRNA含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。在一些實施例中，投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體的DUX4蛋白質含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。在個體之細胞、細胞群、組織及/或其他體液中，個體中之基因表現量、蛋白質含量及/或mRNA含量可降低。在一些實施例中，已投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體中之某些骨骼肌細胞或骨骼肌組織中的DUX4 mRNA含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在一些實施例中，已投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體之骨骼肌細胞及/或骨骼肌組織中之DUX4蛋白質含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。
如本文所指出，個體中之DUX4蛋白質含量及/或DUX4 mRNA含量在個體之細胞、細胞群、組織、血液及/或其他體液(例如血清)中可降低，如一般熟習此項技術者將理解。舉例而言，在一些實施例中，已投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體之一或多個骨骼肌細胞或骨骼肌組織中之DUX4 mRNA含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。在一些實施例中，在已投與所描述之DUX4 RNAi藥劑之個體之骨骼肌細胞亞組中之DUX4 mRNA及/或DUX4蛋白質之含量相對於投與DUX4 RNAi藥劑之前之該個體或相對於未接受DUX4 RNAi藥劑之該個體減少至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。
在一些實施例中，DUX4 RNAi藥劑可減少以下肌肉組織中之一或多者中的 DUX4基因表現：三頭肌、二頭肌、四頭肌、腓腸肌、比目魚肌、嚼肌、EDL (伸趾長肌)、TA (脛前肌)、斜方肌及/或隔膜。
基因表現、mRNA及蛋白質含量之降低可藉由此項技術中已知之任何方法來評估。舉例而言，本文所闡述之實例提供用於量測個體中之DUX4蛋白質含量及DUX4 mRNA含量之適當方法。DUX4 mRNA含量及/或DUX4蛋白質含量之減少或降低在本文中統稱為DUX4之減少或降低或抑制或減少 DUX4基因之表現。本文所闡述之實例說明用於評估 DUX4基因表現之抑制的已知方法。 細胞、組織、器官及非人類生物體
涵蓋包括本文所描述之DUX4 RNAi藥劑中之至少一者的細胞、組織、器官及非人類生物體。藉由將RNAi藥劑遞送至細胞、組織、器官或非人類生物體來製得細胞、組織、器官或非人類生物體。
上文所提供之實施例及項目現藉由以下非限制性實例說明。 實例 實例 1. 合成 DUX4 RNAi 藥劑 。
根據以下合成本文所揭示之DUX4 RNAi藥劑：
A. 合成. 根據寡核苷酸合成中使用之固相胺基亞磷酸酯技術合成DUX4 RNAi藥劑之有義股及反義股。視規模而定，使用MerMade96E® (Bioautomation)、MerMade12® (Bioautomation)或OP Pilot 100 (GE Healthcare)。在由受控微孔玻璃(CPG，500 Å或600 Å，獲自Prime Synthesis, Aston, PA, USA)製成之固體載體上進行合成。所有RNA及2'-經修飾之RNA胺基亞磷酸酯係購自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific) (Milwaukee, WI, USA)。特定言之，所使用之2'-O-甲基胺基亞磷酸酯包括以下：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N 6-(苯甲醯基)-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基亞磷酸酯、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N 4-(乙醯基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基-胺基)胺基亞磷酸酯、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N 2-(異丁醯基)-2'-O-甲基-鳥苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基亞磷酸酯及5'­O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基亞磷酸酯。2'-去氧-2'-氟-胺基亞磷酸酯帶有與2'-O-甲基RNA胺基酸酯相同之保護基。5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-肌苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基亞磷酸酯係購自Glen Research (Virginia)。反向無鹼基(3'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-去氧核糖-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙胺基)胺基亞磷酸酯係購自ChemGenes (Wilmington, MA, USA)。UNA胺基亞磷酸酯包括5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲醯基)-2',3'-開環-腺苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯、5'­(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-乙醯基-2',3'-開環-胞嘧啶、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異-丙基)]-胺基亞磷酸酯、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-異丁醯基-2',3'-開環-鳥苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基亞磷酸酯，及5'-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基)-2',3'-開環-尿苷、2'-苯甲醯基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異-丙基)]胺基亞磷酸酯。膦酸環丙酯胺基亞磷酸酯係根據國際專利申請公開案第WO 2017/214112號，及Erich F. Altenhafer等人., Synthesis of a novel cyclopropyl phosphonate nucleotide as a phosphate mimic, Chemical Communications (2021年6月) (DOI:10.1039/d1cc02328d)合成。TFA胺基連接臂胺基亞磷酸酯亦係可商購的(賽默飛世爾)。
B. 載體結合寡聚物之裂解及去除保護基。完成固相合成之後，經乾燥的固體載體在30℃用40 wt.%甲胺水溶液與28%至31%氫氧化銨溶液(Aldrich)之1:1體積溶液處理1.5小時。將溶液蒸發且固體殘餘物於水中復原(參見下文)。
C. 純化。使用TSKgel SuperQ-5PW 13 µm管柱及Shimadzu LC-8系統，藉由陰離子交換HPLC純化粗寡聚物。緩衝液A為20 mM Tris、5 mM EDTA pH 9.0且含有20%乙腈，且緩衝液B在添加1.5 M氯化鈉的情況下與緩衝液A相同。記錄260 nm下之UV跡線。收集適當溶離份，接著用100 mM碳酸氫銨，pH 6.7及20%乙腈或過濾水之操作緩衝液，使用封裝有Sephadex G-25細粒之GE Healthcare XK 16/40管柱藉由尺寸排阻HPLC來操作。替代地，將合併之溶離份去鹽且經由切向流過濾將其交換至適當緩衝液或溶劑系統中。
D. 黏接 。藉由將等莫耳RNA溶液(有義股及反義股)合併於1×PBS (磷酸鹽緩衝鹽水，1×, Corning, Cellgro)中來使互補股混合以形成RNAi藥劑。將一些RNAi藥劑凍乾且儲存於-15℃至-25℃下。藉由經UV-Vis光譜儀量測1×PBS中之溶液吸光度來測定雙螺旋體濃度。隨後將260 nm溶液吸光度乘以換算因數及稀釋因數以測定雙螺旋體濃度。所使用之換算因數為0.050 mg/(mL∙cm)或以實驗方式測定。
E. 合成用於與 RNAi 藥劑結合之 SM45-p ； (S)-3-(4-(4-((14- 疊氮基 -3,6,9,12- 四氧雜十四烷基 ) 氧基 ) 萘 -1- 基 ) 苯基 )-3-(2-(5-((4- 甲基吡啶 -2- 基 ) 胺基 ) 戊醯胺基 ) 乙醯胺基 ) 丙酸
Figure 02_image289
在室溫下在N 2(g)下，向化合物1 (0.50 g)於DMF中之溶液中添加Cs 2CO 3(0.94 g)。隨後緩慢逐滴添加化合物2 (0.49 g)。將反應物攪拌隔夜。隨後藉由LC-MS證實大約50%轉化為所需產物。將反應混合物用NaHCO 3(10 mL)淬滅。將產物用EtOAc (3×15 mL)萃取且隨後用水(3×10 mL)及鹽水(10 mL)洗滌。合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾，且濃縮。藉由CombiFlash使用矽膠作為固定相使用hex至EtOAc (0-70%)之梯度純化殘餘物，其中產物以16% B溶離。在真空下濃縮產物，得到透明油狀物(0.35 g，產率45.0%)。LC-MS：經計算[M+H]+ 323.19 m/z，經觀測328.38 m/z。
Figure 02_image291
在室溫下在正常氛圍下，向化合物1 (0.35 g)於1:1 THF/水中之溶液中添加LiOH (0.078 g)。在室溫下攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。在1 h之後，反應混合物用6 N HCl酸化至pH約為3。用EtOAc (3×15 mL)萃取產物。合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，得到澄清無色油狀物(0.32 g，94.9%產率)。不需要分離。LC-MS：經計算[M+H]+309.17 m/z，經觀測309.24 m/z。
Figure 02_image293
在環境條件下，向化合物1 (0.10 g)及2 (0.049 g)於DMF中之溶液中添加TBTU (0.058 g)且隨後添加DIPEA (0.079 mL)。攪拌反應物1 h，直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。隨後將反應混合物用NaHCO 3(10 mL)淬滅。將產物用EtOAc (3×15 mL)萃取且隨後用水(3×10 mL)及鹽水(10 mL)洗滌。合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾，且濃縮。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相，使用DCM至20% MeOH/DCM (0-70%)之梯度純化殘餘物，其中產物以23% B溶離。在真空下濃縮產物，得到澄清無色油狀物(0.088 g，產率63.6%)。
Figure 02_image295
在室溫下，向化合物1 (0.088 g)於DCM中之溶液中添加TFA (0.22 mL)。在環境條件下攪拌反應物。攪拌反應物5 h直至經由LC-MS證實完全轉化。使反應混合物與PhMe共沸且在真空下濃縮。不需要分離。濃縮得到澄清無色油狀物(0.10 g，產率113%)。LC-MS：經計算[M+H]+ 814.41 m/z，經觀測814.63 m/z。
Figure 02_image297
在室溫下在正常氛圍下，向化合物1 (0.10 g)於1:1 THF/水中之溶液中添加LiOH (0.0078 g)。在室溫下攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。在4 h之後，反應混合物用6 N HCl酸化至pH約為3。用20% CF 3CH 2OH/DCM (3×15 mL)萃取產物。合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，得到淡黃色固體(0.104 g，產率119%)。LC-MS：經計算[M+H]+ 800.39 m/z，經觀測800.76 m/z。
F. 合成用於與 RNAi 藥劑結合之活化酯骨骼肌細胞受體肽 (αvβ6 肽 1)
Figure 02_image299
肽1藉由修飾Arg-Gly-Asp(tBu)-Leu-Ala-Abu-Leu-Cit-Aib-Leu-Peg 5-CO 2-2-Cl-Trt樹脂1製備，該樹脂1係如上文所描述使用通用Fmoc肽化學在CS Bio肽合成儀上利用Fmoc-Peg 5-CO 2H預負載之2-Cl-Trt樹脂(0.79 mmol/g)以4.1 mmol規模獲得。在自樹脂裂解之後，肽6-2轉化為四氟苯基酯6-3，且粗產物不經純化即用於下一步驟中。
最終去保護藉由用去保護混合物TFA/TIS/H 2O=90:5:5 (80 mL)處理粗肽 6-31.5 h進行。將反應混合物逐滴添加至甲基三級丁基醚(700 mL)中，且藉由離心收集所得沈澱。用額外甲基三級丁基醚(500 mL)洗滌集結粒。殘餘物藉由RP-HPLC (Phenomenex Gemini C18 250×50 mm，10微米，60 mL/min，含有0.1%TFA之水中30-45% ACN梯度，每次操作大約1公克粗物質)純化，得到4.25 g純肽 6-4。
G. 靶向配位體之結合 。在黏接之前或之後，5'或3'胺官能化有義股直接或經由使用連接子(諸如炔烴官能化連接子(例如如表6.1中所示之DBCO或連接子1-10))與靶向配位體結合，其隨後可用於促進與靶向配位體之結合。
以下大體上描述活化酯官能化連接子(包括DBCO及連接子1-10)與單股或黏接之雙螺旋體的結合：將胺官能化雙螺旋體以約50-70 mg/mL溶解於90% DMSO/10% H 2O中。添加40當量三乙胺，接著添加3當量(L4)。藉由RP-HPLC監測反應。一旦完成，則將結合物在1×磷酸鹽緩衝鹽水/乙腈(1:14比率)之溶劑系統中沈澱兩次，且乾燥。
i. 靶向配位體與炔丙基連接子之結合
在黏接之前或之後，5'或3'三齒炔烴官能化有義股與αvβ6整合素配位體結合。以下實例描述αvβ6整合素配位體與黏接之雙螺旋體之結合：於去離子水中製備0.5 M參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA)、0.5 M五水合硫酸Cu(II) (Cu(II)SO 4·5H 2O)及2 M抗壞血酸鈉溶液之儲備溶液。製備75 mg/mL αvβ6整合素配位體之DMSO溶液。在含有三炔烴官能化雙螺旋體(3 mg，75 µL，40 mg/mL於去離子水中，約15,000 g/mol)之1.5 mL離心管中，添加25 µL之1 M Hepes pH 8.5緩衝劑。渦旋後，添加35 µL DMSO，且將溶液渦旋。將αvβ6整合素配位體添加至反應(6當量/雙螺旋體，2當量/炔烴，約15 µL)中且使溶液渦旋。使用pH紙檢測pH，且證實pH為約8。在單獨1.5 mL離心管中，將50 µL之0.5 M THPTA與10 uL之0.5 M Cu(II) Cu(II)SO 4·5H 2O混合，渦旋且在室溫下培育5 min。在5分鐘之後，將THPTA/Cu溶液(7.2 µL，6當量，5:1 THPTA:Cu)添加至反應小瓶中，且渦旋。緊接著，將2 M抗壞血酸酯(5 µL，每雙螺旋體50當量，每炔烴16.7)添加至反應小瓶中，且渦旋。一旦反應完成(通常在0.5-1 h內完成)，即刻藉由非變性陰離子交換層析純化反應物。
ii. 靶向配位體與胺官能化有義股之結合
可使用以下程序將活化酯官能化靶向配位體，諸如αvβ6肽1結合於包含胺，諸如如上文表6.1中所示之C6-NH2、NH2-C6或(NH2-C6)s的胺官能化RNAi藥劑。
將經黏接之凍乾RNAi藥劑以25 mg/mL溶解於DMSO及10%水(v/v%)中。隨後將50-100當量TEA及三當量活化酯靶向配位體添加至混合物中。將反應物攪拌1-2小時，同時藉由RP-HPLC-MS (移動相A：100 mM HFIP、14 mM TEA；移動相B：乙腈；管柱：XBridge C18)監測。在反應完成之後，添加12 mL乙腈，接著添加0.4 mL PBS，且隨後將混合物離心。收集固體集結粒且溶解於0.4 mL 1×PBS中且隨後添加12 mL乙腈。收集所得集結粒且在高真空下乾燥1小時。
H. 合成 PK/PD 調節劑
PEG48+C22
Figure 02_image301
在室溫下，向化合物1 (350 mg，1.027 mmol，1.0當量)、化合物2 (181 mg，1.130 mmol，1.1當量)及二異丙基乙胺(0.537 mL，3.082 mmol，3.0當量)於無水DMF (3 mL)中之溶液中添加TBTU (396 mg，1.233 mmol，1.2當量)。將反應物保持在室溫下2小時。用飽和NaHCO 3水溶液(20 mL)淬滅反應物，且用二氯甲烷(3×10 mL)萃取水溶液。將有機相合併，經無水Na 2SO 4乾燥，且濃縮。藉由CombiFlash®純化產物且用含4-5%甲醇之二氯甲烷溶離。LC-MS：經計算[M+H]+ 483.44，實驗值483.67。
Figure 02_image303
在室溫下，向化合物1 (290 mg，0.600 mmol，1.0當量)於無水1,4-二㗁烷(1 mL)中之溶液中添加HCl於二㗁烷(0.751 mL，3.003 mmol，5.0當量)中之溶液。將反應物保持在室溫下3小時且濃縮溶劑。產物未經進一步純化即可直接使用。LC-MS：經計算[M+H]+ 383.39，實驗值383.57。
Figure 02_image305
在室溫下，向化合物1 (83 mg，0.0322 mmol，1.0當量)及化合物2 (13.5 mg，0.322 mmol，1.0當量)於無水DMF (2 mL)中之溶液中添加三乙胺(0.014 mL，0.0967 mmol，3.0當量)。將反應物保持在室溫下3小時且濃縮溶劑。藉由CombiFlash分離產物且用10-15%甲醇/二氯甲烷溶離。LC-MS：經計算[M+4H]+/4 698.18，實驗值698.49，經計算[M+3H]+/3 930.58，實驗值930.61。
合成 LP29-p
Figure 02_image307
在環境條件下，向化合物 1(40 mg)及 2(334 mg)於DMF中之溶液中添加TBTU (50.1 mg)，且隨後添加DIPEA (0.082 mL)。攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。隨後直接濃縮反應混合物以便分離。藉由CombiFlash使用矽膠作為固定相，使用DCM至20% MeOH/DCM (0-80%)之梯度在20-30 min內純化殘餘物，其中產物以71% B溶離。在真空下濃縮產物以提供白色油性殘餘物。LC-MS：經計算[M+H]+2539.62 m/z，經觀測1288.21 (+2/2，+H 2O) m/z。
Figure 02_image309
在室溫下，向化合物 1(147 mg)中添加4 M HCl/二㗁烷(21.2 mg)。在環境條件下攪拌反應物。攪拌反應物隔夜直至經由LC-MS確認完全轉化。使反應混合物與PhMe共沸且在真空下濃縮隔夜，得到油狀物。LC-MS：經計算[M+H]+2439.57 m/z，經觀測611.16 (+4/4) m/z。
Figure 02_image311
製備化合物 1(143 mg)及NEt3 (0.024 mL)於無水DCM中之溶液且在鼓泡氮氣氛圍下攪拌。隨後向反應混合物中添加化合物 2(23.4 mg)。在室溫下攪拌反應混合物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。
直接濃縮反應混合物以便分離。藉由CombiFlash使用矽膠作為固定相純化殘餘物且用DCM至20% MeOH/DCM (0-100% B)梯度溶離。產物以54% B溶離。LC-MS：經計算[M+H]+5506.42 m/z，經觀測1854.41 (+3/3，+H 2O) m/z。
合成 LP38-p
Figure 02_image313
在環境條件下，向化合物 1(35 mg)及 2(299 mg)於DMF中之溶液中添加TBTU (43.8 mg)且隨後添加DIPEA (0.071 mL)。攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。隨後直接濃縮反應混合物以便分離。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相，使用DCM至20% MeOH/DCM (0-100%)之梯度純化殘餘物20-30 min，其中產物以56% B溶離。在真空下濃縮產物以提供白色油性殘餘物。LC-MS：經計算[M+H]+ 2539.62 m/z，觀測到1288.07 (+2/2，+H 2O) m/z。
Figure 02_image315
在室溫下，向化合物 1(186 mg)中添加4 M HCl/二㗁烷(26.7 mg)。在環境條件下攪拌反應物。攪拌反應物隔夜直至經由LC-MS確認完全轉化。使反應混合物與PhMe共沸且在真空下濃縮隔夜，得到油狀物。LC-MS：經計算[M+H]+2439.57 m/z，經觀測1220.97 (+2/2) m/z。
Figure 02_image317
在環境條件下，向化合物 1(181 mg)、TBTU (24 mg)及DIEA (0.033 mL)於DMF中之溶液中添加 2(8.7 mg)。攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。隨後直接濃縮反應混合物以便分離。藉由CombiFlash使用矽膠作為固定相，使用DCM至20% MeOH/DCM (0-100%)之梯度純化殘餘物20-30 min，其中產物以65% B溶離。在真空下濃縮產物以提供白色油性殘餘物。LC-MS：經計算[M+H]+5089.22 m/z，經觀測1036.24 (+5/5，+H2O) m/z。
Figure 02_image319
在室溫下，向化合物 1(130 mg)中添加4 M HCl/二㗁烷(9.3 mg)。在環境條件下攪拌反應物。攪拌反應物隔夜直至經由LC-MS確認完全轉化。使反應混合物與PhMe共沸且在真空下濃縮隔夜，得到油狀物。LC-MS：經計算[M+H]+4989.17m/z，經觀測1248.58 (+4/4) m/z。
Figure 02_image321
在室溫下在鼓泡N 2(g)下製備化合物 1(128 mg)及NEt 3(0.018 mL)於無水DCM中之溶液。隨後緩慢添加化合物 2(10.3 mg)。使反應混合物攪拌直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。使反應混合物攪拌直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。隨後直接濃縮反應混合物。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相，使用DCM至20% MeOH/DCM (0-100%)之梯度純化殘餘物30 min，其中產物以100% B溶離。濃縮產物，得到白色固體。LC-MS：經計算[M+H]+5299.28 m/z，經觀測1786.62 (+3/3，+H 2O) m/z。
合成 LP238-p
Figure 02_image323
在室溫下，向化合物 1(5.00 g，22.50 mmol)及Cs 2CO 3(25.66 g，78.75 mmol)於無水DMF (80 mL)中之懸浮液中添加碘甲烷(4.20 mL，67.50 mmol)。所得反應混合物在室溫下攪拌48小時。用水(200 mL)淬滅反應物，且用EtOAc (3×100 Ml)萃取混合物。合併有機相且用水及鹽水洗滌。有機層經無水Na 2SO 4乾燥且濃縮。獲得5.41 g，96%呈淡黃色固體狀之化合物 2。化合物 2未經進一步純化即直接使用。LC-MS：[M+H]經計算251.05，實驗值251.18。
Figure 02_image325
在室溫下，向化合物 2(5.41 g，21.62 mmol)於THF/H2O (50 mL/50 mL)中之溶液中添加LiOH (2.59 g，108.08 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物1小時。在真空下移除THF之後，藉由[C] HCl將pH調節至約2。隨後使用EtOAc  (3×60 mL)萃取。合併之有機層用鹽水洗滌，隨後經無水Na 2SO 4乾燥且濃縮。獲得5 g，98%呈灰白色固體之化合物 3。化合物 3未經進一步純化即直接使用。LC-MS：經計算[M+H]237.03，實驗值237.26。
Figure 02_image327
在室溫下，向化合物 3(5.81 g，24.60 mmol)於THF/DMF (80 mL/20 mL)中之溶液中添加EDC (7.07 g，36.90 mmol)、DMAP (0.30 g，2.46 mmol)及化合物 4(6.13 g，36.90 mmol)。在室溫下將反應混合物攪拌隔夜。在真空下移除溶劑之後，將殘餘物裝載於120 g管柱上且用含0-50% EtOAc之己烷溶離化合物 5。獲得9.36 g，99%呈白色固體狀之化合物 5。LC-MS：經計算[M+H]385.03，實驗值385.46。
Figure 02_image329
在0℃下，向化合物 5(2.29 g，5.96 mmol)於DCM (110 mL)中之溶液中添加70% m-CPBA (5.14 g，27.79 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌6小時。在室溫下添加另一1.8 g m-CPBA。在室溫下將反應混合物攪拌隔夜。在過濾之後，真空移除溶劑。使殘餘物自DCM/EtOAc (50 mL/50 mL)再結晶兩次。獲得1.93 g，78%呈白色針晶體狀之化合物 6。LC-MS：經計算[M+H] 417，實驗值417。
Figure 02_image331
Figure 02_image333
在0℃下，向化合物 7(10.00 g，4.34 mmol)於DCM (100 mL)中之溶液中添加軟脂醯氯(1.31 g，4.78 mmol)及TEA。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜且隨後在真空下移除溶劑。藉由矽膠層析，使用0-20% MeOH/DCM純化殘餘物。獲得10.0 g，90%呈白色固體狀之化合物 8。
Figure 02_image335
將化合物 8(9.56 g，3.76 mmol)溶解於25 mL 4 N HCl/二㗁烷中且在室溫下攪拌1小時。移除所有溶劑且在真空下乾燥殘餘物2小時。將殘餘物再溶解於150 mL DCM中且添加TEA，接著添加化合物9 (1.10 g，1.79 mmol)及COMU (1.69 g，3.94 mmol)。在室溫下將反應混合物攪拌隔夜。在標準處理(1 N HCl，飽和碳酸氫鈉，鹽水洗滌)之後，移除DCM。化合物 10藉由120 g管柱使用0-20% MeOH/DCM純化以獲得5.90 g，60%。
Figure 02_image337
將化合物 10(4.50 g，0.82 mmol)溶解於20 mL 4 N HCl/二㗁烷中且在室溫下攪拌1小時。移除所有溶劑且在真空下乾燥殘餘物2小時。將殘餘物再溶解於100 mL DCM中且添加TEA，接著添加化合物 6(0.69 g，1.65 mmol)。在室溫下將反應混合物攪拌隔夜。TEA藉由1N HCl洗滌移除且濃縮有機層。粗 LP238-p藉由矽膠層析，使用0-20% MeOH/DCM純化。獲得2.80 g (60%)呈淡黃色固體狀之 LP238-p。
I. PK/PD 調節劑與 RNAi 藥劑之結合
在黏接之前或之後以及在結合一或多種靶向配位體之前或之後，一或多種PK/PD調節劑前驅物可連接於本文所揭示之RNAi藥劑。下文描述用於將脂質PK/PD調節劑前驅物連接於本文所描繪之實例中所闡述之構築體的通用結合方法。
A. 含順丁烯二醯亞胺之脂質 PK/PD 調節劑前驅物之結合
下文描述用於將含順丁烯二醯亞胺之脂質PK/PD調節劑前驅物連接於RNAi藥劑之(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有義股的通用方法，其藉由採用二硫蘇糖醇還原二硫化物，接著用各別含順丁烯二醯亞胺之脂質PK/PD調節劑前驅物之硫醇-邁克爾加成進行：在小瓶中，將官能化有義股以50 mg/mL溶解於滅菌水中。隨後添加各20當量的0.1 M Hepes pH 8.5緩衝液及二硫蘇糖醇。使混合物反應一小時，隨後使結合物在乙腈及PBS中沈澱，且將固體離心成集結粒。
以30 mg/mL之固體濃度使集結粒溶於DMSO/水之70/30混合物中。隨後，以1.5當量添加含順丁烯二醯亞胺之脂質PK/PD調節劑前驅物。使混合物反應30分鐘。在AEX-HPLC (移動相A：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、50%乙腈；移動相B：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、500 mM NaBr、50%乙腈；固相TSKgel-30；1.5 cm×10 cm)上純化產物。藉由旋轉式蒸發器移除溶劑，且使用2×10 mL與滅菌水之交換用3K旋轉管柱去鹽。固體產物使用凍乾進行乾燥且儲存以便後續使用。
B. 含碸脂質 PK/PD 調節劑前驅物之結合
在小瓶中，官能化有義股以50 mg/mL溶解於滅菌水中。隨後添加各20當量0.1 M Hepes pH 8.5緩衝液及二硫蘇糖醇。使混合物反應一小時，隨後使結合物在乙腈及PBS中沈澱，且將固體離心成集結粒。
以30 mg/mL之固體濃度使集結粒溶於DMSO/水之70/30混合物中。隨後，以1.5當量添加含碸脂質PK/PD調節劑前驅物。用N 2吹掃小瓶，且在攪拌的同時加熱至40℃。使混合物反應一小時。在AEX-HPLC (移動相A：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、50%乙腈；移動相B：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、500 mM NaBr、50%乙腈；固相TSKgel-30；1.5 cm×10 cm)上純化產物。藉由旋轉式蒸發器移除溶劑，且使用2×10 mL與滅菌水之交換用3K旋轉管柱去鹽。固體產物使用凍乾進行乾燥且儲存以便後續使用。
C. 含疊氮化物之脂質 PK/PD 調節劑前驅物之結合
將裝載有Cu(I)之一莫耳當量之TG-TBTA樹脂秤量至玻璃小瓶中。用N 2吹掃小瓶15分鐘。隨後，將官能化有義股溶解於滅菌水中之另一獨立小瓶中，濃度為100 mg/mL。隨後向小瓶中添加兩當量含疊氮化物之脂質PK/PD調節劑前驅物(50 mg/mL於DMF中)。接著添加TEA、DMF及水直至最終反應條件為33 mM TEA、60% DMF及20 mg/mL結合產物。隨後經由注射器將溶液轉移至具有樹脂之小瓶中。移除N 2吹掃，且將小瓶密封且在40℃下移動至攪拌盤。使混合物反應16小時。使用0.45 μm過濾器濾出樹脂。
使用AEX純化(移動相A：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、50%乙腈；移動相B：25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、500 mM NaBr、50%乙腈；固相TSKgel-30；1.5 cm×10 cm)來純化產物。使用旋轉式蒸發器移除乙腈，且使用2×10 mL與滅菌水之交換用3K旋轉管柱去鹽。固體產物使用凍乾進行乾燥且儲存以便後續使用。
D. 含炔烴之脂質 PK/PD 調節劑前驅物之結合
下文描述用於將含活化炔烴之脂質PK/PD調節劑前驅物連接於RNAi藥劑之(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有義股的通用方法，其藉由採用二硫蘇糖醇還原二硫化物，接著加成至含炔烴之PK/PD調節劑前驅物：在小瓶中，將包含(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有義股之10 mg siRNA以50 mg/mL溶解於滅菌水中。添加各20當量0.1 M Hepes pH 8.5緩衝液及二硫蘇糖醇(1 M於滅菌水中)。使混合物反應一小時，隨後在XBridge BEH C4管柱上使用100 mM HFIP、14 mM及TEA之移動相A及乙腈之移動相B使用下式來純化，其中% B指示移動相B之量，而剩餘部分為移動相A。
時間 %B
0 3
8 70
10 90
11 90
11.1 3
13 3
藉由添加12 mL乙腈及0.4 mL 1×PBS使產物沈澱一次，且將所得固體離心成集結粒。將集結粒再溶解於0.4 mL 1×PBS及12 mL乙腈中。在高真空下乾燥集結粒一小時。
在小瓶中以30 mg/mL之固體濃度使集結粒溶於DMSO/水之70/30混合物中。隨後，以相對於siRNA 2當量添加含炔之脂質PK/PD調節劑前驅物。隨後添加10當量TEA。使用N2吹掃小瓶，且在攪拌的同時將反應混合物加熱至40℃。使混合物反應一小時。使用陰離子交換HPLC使用TSKgel-30填充管柱，1.5 cm×10 cm，使用25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、50%乙腈之移動相A及25 mM TRIS pH=7.2、1 mM EDTA、500 mM NaBr、50%乙腈之移動相B使用下式來純化產物，其中% B指示移動相B之量，而剩餘部分為移動相A。
時間 %B
4 10
7 80
10.5 80
11 10
14 10
收集含有產物之溶離份，且使用旋轉式蒸發器移除乙腈。使用2×10 mL與滅菌水之交換用3K旋轉管柱將產物去鹽。隨後產物使用凍乾進行乾燥且儲存以便後續使用。
J. 合成連接子 4
Figure 02_image339
在室溫下，向化合物 1(3.00 g)於DMF中之溶液中添加Cs 2CO 3(7.71 g)。隨後緩慢添加化合物 2(1.85 mL)。在N 2(g)下攪拌反應物隔夜。隨後藉由LC-MS證實大約完全轉化為所需產物。將反應混合物用NaHCO 3(10 mL)淬滅。將產物用EtOAc (5×10 mL)萃取且隨後用水(3×8 mL)及鹽水(8 mL)洗滌。合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾，且濃縮。藉由CombiFlash使用矽膠作為固定相使用hex至EtOAc (0-30%)之梯度純化殘餘物，其中產物以14% B溶離。在真空下濃縮產物以提供白色固體。LC-MS：經計算[M+H]+191.06 m/z，經觀測191.23 m/z。
Figure 02_image341
在室溫下在正常氛圍下，向化合物1 (2.87 g)於1:1 THF/水中之溶液中添加LiOH (1.08 g)。攪拌反應物直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。殘餘起始物質經由EtOAc萃取，且隨後水相用6 N HCl酸化至pH約為3。產物作為白色固體狀析出且經由真空過濾且用水洗滌。由於其濕/黏性性質，需要溶劑以將固體轉移至圓底燒瓶；物質經由MeOH及DCM轉移。由於任一者中之不良溶合及組合，材料不能夠經Na 2SO 4乾燥且對應地僅在真空下濃縮以提供白色蓬鬆結晶固體。不需要分離。LC-MS：經計算[M+H]+177.05 m/z，經觀測177.19 m/z。
Figure 02_image343
在室溫下，在N 2(g)下向化合物 1(1.00 g)及 2(1.04 g)於DMF (10.0 mL)中之溶液中添加EDC (1.20 g)。使反應混合物攪拌直至藉由LC-MS觀測到完全轉化。由於在隔夜攪拌之後無法成功觀測到產物，因此用NaHCO 3淬滅反應混合物，隨後析出。沈澱物經由LC-MS確認含有起始物質且經真空過濾，試圖再懸浮於MeOH/DCM中，且隨後在真空下濃縮。隨後將混合物再溶解於DMF中，經Na 2SO 4乾燥，且經真空過濾，用DMF沖洗。將EDC再添加至濾液(反應混合物)中，且使混合物在室溫下攪拌隔夜。直接濃縮反應混合物且使其與MeOH及PhMe共沸以供分離。藉由CombiFlash®使用矽膠作為固定相純化殘餘物且用DCM至20% MeOH/DCM (0-15% B)之梯度溶離。產物在0% B溶離，得到白色固體。LC-MS：經計算[M+H]+325.04 m/z，經觀測325.35 m/z。 實例 2. F S HD 樣基因轉殖小鼠模型 ( FLExDUX4/HSA-MCM )
為了在活體內評估DUX4 RNAi藥劑，使用FSHD之轉殖基因模型。FLExDUX4小鼠(B6(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm1.1(DUX4*)Plj/J)係市售獲得，且由Jackson Laboratories (JAX)與HSA-MCM小鼠(Tg(ACTA1-cre/Esr1*)2Kesr/J)雜交，以產生在投與他莫昔芬(tamoxifen)後在骨骼肌中表現人類DUX4之同型接合後代。
FLExDUX4 小鼠背景 ：使用cre依賴性單向遺傳開關(FLEx)系統產生FLExDUX4小鼠。攜帶此DUX4條件性對偶基因之同型接合小鼠係活的且係可生育的。兩組不相容的外向重組位點(loxP及lox511)側接反向人類DUX4序列，包括外顯子1-3及兩個內含子。 DUX4基因編碼若干替代性mRNA剪接變異體。遺傳性肌肉病症，臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)係由 DUX4-全長(DUX4-fl) mRNA同功型編碼之DUX4之表現引起。如本文中先前所指出，編碼配對同源匣域轉錄因子之 DUX4-fl mRNA通常不表現於健康肌肉中。然而，在FSHD中，DUX4-fl (在小於1%肌纖維中)之罕見表現引發事件之病原性級聯，該等事件包括細胞凋亡、分化缺陷、肌肉萎縮及對氧化應激之易感性。總體而言，FSHD之特徵為緩慢進行性肌肉萎縮症，其主要影響面部、肩胛骨及上臂之骨骼肌，但可影響腹部肌肉、髖帶及小腿之肌肉，其中約20%之患者最終失去行走能力。
DUX4啟動子驅動短非致病性同功型( DUX4-s)及較長細胞毒性同功型( DUX4-fl)之表現。此品系在兩個 DUX4-s mRNA之5'剪接供體位點中含有4點突變，消除短同功型之表現且僅產生致病性 DUX4-fl mRNA同功型。
因為此構築體之目標係插入Gt(ROSA)26Sor基因座，所以 DUX4-fl表現藉由何種組織表現Cre重組酶來確定。當與表現Cre重組酶之小鼠交配時，所得後代將有loxP或lox511位點重組，導致人類 DUX4-fl序列之反轉，以有義取向結束。
半合子及同型接合小鼠在無Cre重組酶存在下具有較低 DUX4-fl表現量。此等小鼠展現出脫毛，且隨著年齡增長，展現出軟便、炎症及肌無力。如男性相比於女性一般，同型接合更受影響。
HSA-MCM 小鼠背景 ：HSA-MCM小鼠在人類 ACTA1(肌動蛋白、α 1、骨骼肌)啟動子的控制下表現MerCreMer雙融合蛋白。異型接合小鼠係活的且係可生育的。同型接合亦係活的，但展現顯著降低的生育力。值得注意的是，與CreMer單一融合蛋白相比，MerCreMer雙融合蛋白之Cre重組酶活性實質上更大，且雜交性更小。當HSA-MCM小鼠與含有 loxP側接序列之小鼠交配時，他莫昔芬誘導型Cre介導之重組導致後代之四肢、面部/舌頭及隔膜之骨骼肌中之floxed序列缺失。
MerCreMer雙融合蛋白由在各端上側接突變鼠類雌激素受體(聚體)配位體域(胺基酸281-599，G525R)之Cre重組酶組成；其在生理學濃度下不結合其天然配位體(17β-雌二醇)，但將結合合成雌激素受體配位體4-羥基他莫昔芬(OHT或他莫昔芬)以及以較低的敏感性結合ICI 182780。受限於細胞質，MerCreMer僅可在暴露於他莫昔芬之後進入核區室。
他莫昔芬誘導 DUX4 表現：溶解於玉米油中之他莫昔芬(1 mg/mL)經由經口管飼每週投與2或3次，以在研究期間(通常18至31天)誘導骨骼肌中之 DUX4表現增加。
體重評估：由於已知 DUX4表現增加會導致此FSHD動物模型中之肌肉萎縮及體重損失，因此對於本文所揭示之實例，在各種研究之整個持續時間中記錄體重，包括在投與他莫昔芬或RNAi藥劑當天及在組織收集當天。體重相對於投與他莫昔芬之第一天及投與玉米油(不含他莫昔芬)及鹽水(不含RNAi藥劑)之「基線」對照組之平均體重歸一化。
總體運動協調評估：在投與他莫昔芬或RNAi藥劑之前的一週期間，使小鼠適應商業上獲取之滾棒(Rotarod)裝置至少5次。一旦投與他莫昔芬及/或RNAi藥劑，每週至少兩次使用滾棒裝置藉由取評估的每一天五次嘗試的平均值來評估總體運動協調。
組織收集：用3-4%異氟醚麻醉小鼠且經由放血實施安樂死。收集意欲用於基因表現分析之相關組織且將其快速冷凍在液氮中，且隨後在-80℃下儲存。意欲將用於組織學之相關組織固定在福馬林中，隨後包埋於石蠟中且經由組織化學或免疫組織化學方案染色。
基因表現分析：使用Precellys組織均質化系統(Bertin)將整個冷凍組織均質化，且經由酸性硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取來分離RNA。使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo)，將提取的RNA用於合成互補DNA，且使用QX200微滴式數位PCR (Bio-Rad)量測 DUX4表現。使用QuantFlex7 qRT-PCR (Applied Biosystems)系統，採用經設計以偵測相關基因之Taqman引子/探針集(Applied Biosystems)來量測 Wfdc3及 Myo1g表現。基因表現相對於參考基因(例如 Arl1)及投與玉米油(不含他莫昔芬)及鹽水(不含RNAi藥劑)之「基線」對照組之平均值歸一化。
WAP 型四二硫鍵核心域 3 (Wfdc3) 表現為小鼠肌肉中 DUX4 活性之生物標記：WAP型四二硫鍵核心域3為已得到充分證明之過度表現DUX4-fl蛋白質之直接鼠類目標。量測 Wfdc3之基因表現(使用如上文所描述之qRT-PCR)，且將其用作收集的肌肉組織中DUX4活性之生物標記。
肌凝蛋白 1G (Myo1g) 表現作為小鼠肌肉中 DUX4 活性之生物標記： Myo1g為已得到充分證明之過度表現DUX4-fl蛋白質之直接鼠類目標。量測 Myo1g之基因表現(使用如上文所描述之qRT-PCR)，且將其用作收集的肌肉組織中DUX4活性之生物標記。
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。 實例 3. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中活體內投與 DUX4 RNAi 藥劑
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑向小鼠的頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中的皮膚與肌肉之間進行注射(亦即皮下注射)。在第4天開始，每週三次(第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 7.實例3之給藥組。
組 RNAi 藥劑及給藥 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 SM45b-L4-AD07218-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 SM45b-L4-AD07219-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 SM45b-L4-AD07275-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 SM45b-L4-AD07220-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
7 SM45b-L4-AD07276-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
8 SM45b-L4-AD07221-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
9 SM45b-L4-AD07277-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
10 SM45b-L4-AD07396-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例2中之RNAi藥劑(第3-10組)，其具有針對靶向 DUX4基因(亦即mRNA轉錄物)之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與連接子L4之結合，該連接子L4可與靶向配位體結合，該靶向配位體為對存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力的小分子(在本文中稱為「骨骼肌細胞受體小分子」)。用於將連接子與有義股結合及將靶向配位體與連接子結合之程序提供於以上實例1中。
DUX4 RNAi藥劑連接於對骨骼肌細胞具有親和力之小分子靶向配位體SM45b。DUX4 RNAi藥劑連接於具有以下化學結構之化合物：
Figure 02_image345
。 靶向配位體SM45-p經合成為疊氮化合物，其允許方便地與連接子L4偶合。連接子L4最初以具有以下結構之四氟苯基(TFP)酯官能化之化合物形式合成：
Figure 02_image347
。 TFP酯反應性基團首先連接於有義股之5'端上之末端胺(NH 2-C 6)。隨後使SM45之疊氮化合物與連接子(L4)之炔烴偶合。
實例2中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑結合。雙(PEG47+C22)部分附接至有義股之3'末端以充當具有以下結構之藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑：
Figure 02_image349
雙(PEG47+C22)。 順丁烯二醯亞胺藉由還原末端3'二硫鍵且對末端3'硫醇進行邁克爾加成反應而連接於有義股之3'端。如本文所描述，PK/PD調節劑可經由改良細胞受體結合、改良細胞攝取及/或其他方法來增加結合藥物之循環時間及/或增加RNAi藥劑之活性。在結合於靶向配位體及PK/PD調節劑後，DUX4 RNAi藥劑有義股具有如表4.5中所示之通式結構。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
在各組(n=5)中對五隻小鼠進行給藥，其中第1組中僅對3隻小鼠進行給藥(n=3)。在第21天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。
所收集組織中之平均相對 DUX4表現針對各種肌肉類型展示於下表中： 表 8.1.實例3之小鼠相對於基線(第1組)歸一化的二頭肌之平均相對 DUX4表現。
   第 21 天之二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/- )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.259
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.323 0.327
第3 組(AD07218) 0.628 0.141
第4 組(AD07219) 0.941 0.340
第5 組(AD07275) 0.578 0.140
第6 組(AD07220) 0.922 0.589
第7 組(AD07276) 0.544 0.143
第8 組(AD07221) 0.878 0.170
第9 組(AD07277) 0.551 0.154
第10 組(AD07396) 1.096 0.406
表 8.2.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 DUX4表現。
   第21 天之隔膜
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第1 組( 基線) 1.000 0.385
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.739 0.686
第3 組(AD07218) 1.227 0.422
第4 組(AD07219) 1.497 0.694
第5 組(AD07275) 0.806 0.340
第6 組(AD07220) 1.063 0.241
第7 組(AD07276) 0.636 0.196
第8 組(AD07221) 0.909 0.404
第9 組(AD07277) 0.891 0.059
第10 組(AD07396) 1.047 0.545
表 8.3.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之EDL (伸趾長肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第21 天之EDL
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.231
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.076 0.172
第3 組(AD07218) 0.748 0.140
第4 組(AD07219) 0.759 0.268
第5 組(AD07275) 0.530 0.165
第6 組(AD07220) 0.664 0.064
第7 組(AD07276) 0.569 0.164
第8 組(AD07221) 0.662 0.249
第9 組(AD07277) 0.463 0.154
第10 組(AD07396) 0.874 0.166
表 8.4.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 21 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.375
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.663 0.509
第3 組(AD07218) 1.021 0.465
第4 組(AD07219) 1.159 0.756
第5 組(AD07275) 0.585 0.214
第6 組(AD07220) 0.998 0.395
第7 組(AD07276) 0.553 0.140
第8 組(AD07221) 0.647 0.191
第9 組(AD07277) 0.556 0.119
第10 組(AD07396) 0.819 0.483
表 8.5.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 21 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.206
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.585 0.659
第3 組(AD07218) 1.191 0.375
第4 組(AD07219) 1.325 0.353
第5 組(AD07275) 0.774 0.357
第6 組(AD07220) 1.161 0.515
第7 組(AD07276) 0.826 0.153
第8 組(AD07221) 1.219 1.077
第9 組(AD07277) 1.007 0.217
第10 組(AD07396) 0.976 0.277
表 8.6.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之比目魚肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 21 天之比目魚肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.101
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 0.884 0.130
第3 組(AD07218) 0.916 0.283
第4 組(AD07219) 0.884 0.209
第5 組(AD07275) 0.711 0.243
第6 組(AD07220) 1.034 0.101
第7 組(AD07276) 0.800 0.168
第8 組(AD07221) 0.646 0.095
第9 組(AD07277) 0.799 0.061
第10 組(AD07396) 0.822 0.260
表 8.7.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第21 天之TA
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.675
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.121 0.353
第3 組(AD07218) 0.741 0.122
第4 組(AD07219) 0.874 0.367
第5 組(AD07275) 0.550 0.304
第6 組(AD07220) 0.819 0.122
第7 組(AD07276) 0.375 0.196
第8 組(AD07221) 0.636 0.285
第9 組(AD07277) 0.498 0.083
第10 組(AD07396) 0.805 0.327
表 8.8.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 DUX4表現。
   第21 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.624
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.372 0.969
第3 組(AD07218) 1.298 0.688
第4 組(AD07219) 1.424 0.399
第5 組(AD07275) 0.711 0.126
第6 組(AD07220) 1.252 0.282
第7 組(AD07276) 0.688 0.334
第8 組(AD07221) 1.189 0.331
第9 組(AD07277) 0.765 0.321
第10 組(AD07396) 1.410 0.373
表 8.9.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 21 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.380
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.812 0.542
第3 組(AD07218) 1.189 0.445
第4 組(AD07219) 1.240 0.426
第5 組(AD07275) 0.691 0.133
第6 組(AD07220) 1.302 0.522
第7 組(AD07276) 0.503 0.101
第8 組(AD07221) 1.150 0.160
第9 組(AD07277) 0.785 0.271
第10 組(AD07396) 1.322 0.502
如本文所論述， Wfdc3轉錄物含量充當DUX4蛋白質活性程度之生物標記物。針對各種肌肉類型，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3轉錄物含量： 表 9.1.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 21 天之二頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.813 4.339
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 13.361 1.868 2.172
第3 組(AD07218) 9.383 4.112 7.319
第4 組(AD07219) 7.677 2.713 4.195
第5 組(AD07275) 1.678 0.732 1.298
第6 組(AD07220) 8.267 1.842 2.370
第7 組(AD07276) 2.320 0.964 1.650
第8 組(AD07221) 11.011 2.190 2.733
第9 組(AD07277) 8.878 1.748 2.177
第10 組(AD07396) 11.367 1.687 1.980
表 9.2.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 Wfdc3表現。
第21 天之隔膜
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.664 1.975
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 18.199 3.336 4.085
第3 組(AD07218) 9.174 2.429 3.304
第4 組(AD07219) 6.604 3.138 5.978
第5 組(AD07275) 0.495 0.237 0.457
第6 組(AD07220) 10.531 2.171 2.734
第7 組(AD07276) 1.563 0.215 0.249
第8 組(AD07221) 15.696 3.022 3.743
第9 組(AD07277) 12.060 3.654 5.243
第10 組(AD07396) 18.914 3.786 4.733
表 9.3.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之EDL (伸趾長肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第21 天之EDL
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.852 5.777
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 12.724 1.272 1.413
第3 組(AD07218) 6.344 1.658 2.244
第4 組(AD07219) 6.694 0.893 1.031
第5 組(AD07275) 1.080 0.358 0.535
第6 組(AD07220) 6.976 1.300 1.597
第7 組(AD07276) 2.512 0.508 0.638
第8 組(AD07221) 8.875 1.493 1.795
第9 組(AD07277) 5.914 1.141 1.414
第10 組(AD07396) 10.992 1.059 1.172
表 9.4.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 21 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.820 4.547
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 8.719 2.368 3.251
第3 組(AD07218) 4.624 0.429 0.473
第4 組(AD07219) 5.130 0.952 1.169
第5 組(AD07275) 0.897 0.290 0.430
第6 組(AD07220) 6.630 0.606 0.668
第7 組(AD07276) 2.119 0.424 0.530
第8 組(AD07221) 8.283 0.689 0.751
第9 組(AD07277) 5.471 0.892 1.065
第10 組(AD07396) 8.881 1.075 1.223
表 9.5.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 21 天之嚼肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.865 6.401
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 14.978 3.110 3.926
第3 組(AD07218) 5.741 0.618 0.693
第4 組(AD07219) 5.675 1.998 3.083
第5 組(AD07275) 1.333 0.506 0.815
第6 組(AD07220) 6.550 2.586 4.274
第7 組(AD07276) 1.952 0.492 0.659
第8 組(AD07221) 11.286 3.380 4.824
第9 組(AD07277) 5.732 1.860 2.754
第10 組(AD07396) 10.845 2.718 3.627
表 9.6.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之比目魚肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 21 天之比目魚肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.692 2.243
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 13.759 3.999 5.637
第3 組(AD07218) 11.716 1.296 1.457
第4 組(AD07219) 14.551 2.494 3.009
第5 組(AD07275) 7.020 1.053 1.239
第6 組(AD07220) 13.022 2.046 2.427
第7 組(AD07276) 8.457 1.391 1.665
第8 組(AD07221) 12.482 2.060 2.467
第9 組(AD07277) 11.943 1.119 1.235
第10 組(AD07396) 14.068 1.580 1.780
表 9.7.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第21 天之TA
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 低 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.910 10.072
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 15.728 1.743 1.961
第3 組(AD07218) 6.427 0.572 0.628
第4 組(AD07219) 6.384 1.762 2.433
第5 組(AD07275) 0.983 0.425 0.749
第6 組(AD07220) 8.774 1.905 2.433
第7 組(AD07276) 2.507 0.466 0.572
第8 組(AD07221) 11.377 1.958 2.366
第9 組(AD07277) 7.636 1.613 2.045
第10 組(AD07396) 11.927 0.841 0.905
表 9.8.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第21 天之斜方肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.846 5.489
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 13.554 2.388 2.899
第3 組(AD07218) 4.817 1.669 2.554
第4 組(AD07219) 3.640 1.035 1.446
第5 組(AD07275) 0.349 0.180 0.373
第6 組(AD07220) 5.388 0.974 1.189
第7 組(AD07276) 0.819 0.292 0.453
第8 組(AD07221) 9.104 1.209 1.394
第9 組(AD07277) 5.020 1.571 2.288
第10 組(AD07396) 10.919 1.398 1.603
表 9.9.實例3之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 21 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.846 5.475
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 15.243 1.053 1.131
第3 組(AD07218) 3.624 1.143 1.671
第4 組(AD07219) 3.323 1.488 2.694
第5 組(AD07275) 0.334 0.114 0.173
第6 組(AD07220) 5.235 0.634 0.721
第7 組(AD07276) 0.965 0.123 0.141
第8 組(AD07221) 10.811 2.080 2.575
第9 組(AD07277) 5.284 1.677 2.456
第10 組(AD07396) 11.046 2.195 2.740
此外，在第4、6、8、10、12、14、18、20及21天進行體重量測。體重之預定可指示預防效應。如針對第4天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化之體重展示於圖1中。
對於上文所展示之DUX4 RNAi藥劑，AD07218 (第3組)包括經設計成在基因之位置408處抑制 DUX4基因(即， DUX4mRNA轉錄物)之核苷酸序列；AD07219及AD07275 (第4組及第5組)包括經設計成在基因之位置409處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；AD07220及AD07276 (第6組及第7組)包括經設計成在基因之位置1437處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；AD07221及AD07277 (第8組及第9組)包括經設計成在基因之位置1518處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；且AD07396 (第10組)包括經設計成在基因之位置1496處抑制 DUX4基因之核苷酸序列。
由於上表中之資料所示，DUX4 RNAi藥劑在FSHD樣小鼠模型中引起 DUX4基因表現之降低，其中DUX4 RNAi藥劑靶向位置408、409及1437，特定言之證明 DUX4基因表現顯著抑制。舉例而言，如表8.1-8.9中所示，投與DUX4 RNAi藥劑之第3組、第5組及第7組中 DUX4之相對表現保持遠低於他莫昔芬組且處於或低於所有肌肉中指示預防性作用之基線組。此作用藉由如表9.1-9.9中所示在第5組及第7組中預防 Wfdc3表現顯著增加且在第5組及第7組中預防體重損失來證實(圖1)。 實例 4. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑，將小鼠在皮膚與肌肉之間注射(亦即皮下注射)至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中。在第4天開始，每週三次(亦即第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導 DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 10.實例4之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 SM45b-L4-AD07276-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 SM45b-L4-AD07510-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 SM45b-L4-AD07511-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 SM45b-L4-AD07512-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
7 SM45b-L4-AD07513-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
8 SM45b-L4-AD07514-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
9 SM45b-L4-AD07515-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
10 SM45b-L4-AD07394-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
11 SM45b-L4-AD07395-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
12 SM45b-L4-AD07398-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
13 SM45b-L4-AD07399-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例4中之RNAi藥劑(第3-13組)，其具有針對靶向 DUX4基因(亦即 DUX4mRNA轉錄物)之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與骨骼肌細胞受體小分子靶向配位體SM45之結合。靶向配位體SM45經合成為疊氮化合物，其允許方便地與連接子L4偶合。(關於SM45及L4之結構及相關資訊，參見例如上文實例3)。
實例2中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑雙(PEG47+C22)結合。(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例3)。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
在各組(n=5)中對五隻小鼠進行給藥，其中第1組中僅對4隻小鼠進行給藥(n=4)。在第22天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。
在第1天、第4天、第7天、第8天、第10天、第12天、第14天、第18天、第21天及第22天進行體重量測，且如上所指出，體重的保持可以指示對肌肉萎縮之預防作用。第10組(AD07394)、第11組(AD07395)、第12組(AD07398)及第13組(AD07399)之RNAi藥劑與陽性對照(僅投與他莫昔芬)相比未展示可接受的體重保持，且因此未對此等組進行進一步評估。此外，雖然第8組(AD07514)及第13組(AD07399)均展示維持體重之一些預防性作用，但體重下降超過若干靶向 DUX4基因之相同位置之其他RNAi藥劑，且因此亦不對此等組進行進一步評估。如針對第4天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化之體重展示於圖2及圖3中。
所收集組織中之平均相對 DUX4表現針對各種肌肉類型展示於下表中之第1-7組及第9組： 表 11.1.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.498
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.678 0.299
第3 組(AD07276) 1.016 0.167
第4 組(AD07510) 0.861 0.345
第5 組(AD07511) 0.819 0.161
第6 組(AD07512) 1.045 0.509
第7 組(AD07513) 0.716 0.157
第9 組(AD07515) 0.834 0.430
表 11.2.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之隔膜
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.226
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.273 0.830
第3 組(AD07276) 1.535 0.519
第4 組(AD07510) 1.096 0.361
第5 組(AD07511) 0.755 0.158
第6 組(AD07512) 2.129 0.429
第7 組(AD07513) 1.230 0.440
第9 組(AD07515) 0.757 0.252
表 11.3.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.272
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.156 0.212
第3 組(AD07276) 1.264 0.107
第4 組(AD07510) 0.872 0.376
第5 組(AD07511) 0.534 0.101
第6 組(AD07512) 0.987 0.248
第7 組(AD07513) 1.318 0.994
第9 組(AD07515) 1.756 0.744
表 11.4.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.267
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 0.867 0.165
第3 組(AD07276) 0.500 0.153
第4 組(AD07510) 0.603 0.215
第5 組(AD07511) 0.449 0.142
第6 組(AD07512) 0.915 0.236
第7 組(AD07513) 0.438 0.105
第9 組(AD07515) 0.447 0.094
表 11.5.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之TA
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.177
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.429 0.484
第3 組(AD07276) 0.767 0.117
第4 組(AD07510) 0.643 0.105
第5 組(AD07511) 0.516 0.161
第6 組(AD07512) 0.775 0.189
第7 組(AD07513) 0.634 0.207
第9 組(AD07515) 0.618 0.171
表 11.6.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.306
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.669 0.280
第3 組(AD07276) 0.707 0.210
第4 組(AD07510) 0.710 0.233
第5 組(AD07511) 0.543 0.161
第6 組(AD07512) 0.833 0.290
第7 組(AD07513) 0.541 0.193
第9 組(AD07515) 0.549 0.248
表 11.7.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.410
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.679 0.885
第3 組(AD07276) 0.487 0.081
第4 組(AD07510) 0.480 0.096
第5 組(AD07511) 0.391 0.118
第6 組(AD07512) 0.550 0.179
第7 組(AD07513) 0.327 0.120
第9 組(AD07515) 0.287 0.074
針對各種肌肉類型，如以下表中第1-7組及第9組所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量： 表 12.1.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之二頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.900 9.018
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 16.231 4.505 6.236
第3 組(AD07276) 4.928 1.787 2.802
第4 組(AD07510) 9.048 3.580 5.925
第5 組(AD07511) 1.478 0.415 0.577
第6 組(AD07512) 13.042 2.577 3.212
第7 組(AD07513) 1.922 0.834 1.475
第9 組(AD07515) 2.589 1.172 2.141
表 12.2.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之隔膜
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.780 3.554
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 17.540 6.624 10.642
第3 組(AD07276) 1.834 0.986 2.132
第4 組(AD07510) 7.582 3.337 5.960
第5 組(AD07511) 0.531 0.164 0.236
第6 組(AD07512) 10.993 2.761 3.687
第7 組(AD07513) 0.621 0.297 0.570
第9 組(AD07515) 1.024 0.319 0.463
表 12.3.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.799 3.981
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 5.449 1.871 2.849
第3 組(AD07276) 1.455 0.533 0.842
第4 組(AD07510) 3.452 0.735 0.934
第5 組(AD07511) 0.461 0.104 0.135
第6 組(AD07512) 3.895 0.420 0.470
第7 組(AD07513) 0.590 0.228 0.371
第9 組(AD07515) 0.712 0.284 0.472
表 12.4.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之嚼肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.794 3.862
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 7.246 2.966 5.021
第3 組(AD07276) 1.353 0.595 1.062
第4 組(AD07510) 3.051 0.834 1.148
第5 組(AD07511) 0.299 0.093 0.135
第6 組(AD07512) 3.994 1.011 1.354
第7 組(AD07513) 0.337 0.152 0.275
第9 組(AD07515) 0.569 0.154 0.212
表 12.5.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之TA
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.925 12.306
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 18.324 8.692 16.536
第3 組(AD07276) 2.436 1.027 1.775
第4 組(AD07510) 5.873 1.830 2.658
第5 組(AD07511) 0.539 0.235 0.417
第6 組(AD07512) 7.128 1.095 1.293
第7 組(AD07513) 0.694 0.314 0.574
第9 組(AD07515) 1.148 0.481 0.827
表 12.6.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之斜方肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.840 5.248
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 8.145 3.444 5.969
第3 組(AD07276) 0.966 0.529 1.168
第4 組(AD07510) 3.212 1.085 1.638
第5 組(AD07511) 0.154 0.052 0.079
第6 組(AD07512) 4.472 1.194 1.629
第7 組(AD07513) 0.206 0.101 0.197
第9 組(AD07515) 0.379 0.157 0.267
表 12.7.實例4之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.853 5.811
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 8.594 3.757 6.675
第3 組(AD07276) 1.115 0.472 0.820
第4 組(AD07510) 3.253 0.926 1.295
第5 組(AD07511) 0.326 0.108 0.161
第6 組(AD07512) 3.948 0.932 1.219
第7 組(AD07513) 0.451 0.168 0.268
第9 組(AD07515) 0.590 0.176 0.251
對於上文所展示之DUX4 RNAi藥劑，AD07276、AD07510、AD07511、AD07512、AD07513、AD07514、AD07515 (第3-9組)包括經設計成在基因之位置1437處抑制 DUX4基因(即， DUX4mRNA轉錄物)之核苷酸序列；AD07394及AD07395 (第10組及第11組)包括經設計成在基因之位置1433處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；AD07398及AD07399 (第12組及第13組)包括經設計成在基因之位置1522處抑制DUX4基因之核苷酸序列。
由於上表中之資料所示，靶向基因之位置1437之DUX4 RNAi藥劑在FSHD樣小鼠模型中引起 DUX4基因表現之降低。特別注意的是，觀測到 DUX4基因表現量低於基線且觀測到由投與AD07511之小鼠所分析之7個肌肉中之7個中 Wfdc3基因表現量遠低於基線(參見表11.1-11.7及12.1-12.7)。 實例 5. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑，將小鼠在皮膚與肌肉之間注射(亦即皮下注射)至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中。在第4天開始，每週三次(第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 13.實例5之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥 方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 SM45b-L4-AD07218-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 SM45b-L4-AD07274-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 SM45b-L4-AD07775-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 SM45b-L4-AD07776-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
7 SM45b-L4-AD07777-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
8 SM45b-L4-AD07778-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例5中之RNAi藥劑(第3-8組)，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與骨骼肌細胞受體小分子靶向配位體SM45之結合。靶向配位體SM45經合成為疊氮化合物，其允許方便地與連接子L4偶合。(關於SM45及L4之結構及相關資訊，參見例如上文實例3)。
實例2中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑雙(PEG47+C22)結合。(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例3)。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
在各組(n=5)中對五隻小鼠進行給藥。在第22天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。
在第1天、第4天、第7天、第9天、第11天、第14天、第16天、第18天及第21天進行體重量測，且如上所指出，體重之保持可指示對肌肉萎縮之預防性作用。第3組(AD07218)、第5組(AD07775)及第7組(AD07777)之RNAi藥劑展示維持體重之一些預防性作用。然而，AD07274、AD07776及AD07778之DUX4 RNAi藥劑在投與他莫昔芬之後保持動物體重方面表現出最佳所測試之RNAi藥劑，且進行額外評估。如針對第4天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化之體重展示於圖4中。
所收集組織中之平均相對 DUX4表現針對各種肌肉類型展示於下表中之第1組、第2組、第4組、第6組及第8組： 表 14.1.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.634
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.414 0.840
第4 組(AD07274) 0.725 0.353
第6 組(AD07776) 1.092 0.394
第8 組(AD07778) 1.534 0.738
表 14.2.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之隔膜
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.504
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.024 0.872
第4 組(AD07274) 0.488 0.062
第6 組(AD07776) 0.745 0.198
第8 組(AD07778) 0.734 0.466
表 14.3.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.308
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.343 1.059
第4 組(AD07274) 0.643 0.397
第6 組(AD07776) 0.676 0.310
第8 組(AD07778) 0.634 0.353
表 14.4.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.388
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.974 0.761
第4 組(AD07274) 0.685 0.236
第6 組(AD07776) 0.639 0.190
第8 組(AD07778) 0.798 0.127
表 14.5.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之TA
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.180
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.471 0.503
第4 組(AD07274) 0.623 0.176
第6 組(AD07776) 0.616 0.123
第8 組(AD07778) 0.768 0.258
表 14.6.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.216
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 4.907 2.097
第4 組(AD07274) 0.930 0.487
第6 組(AD07776) 1.180 0.273
第8 組(AD07778) 1.106 0.965
表 14.7.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.421
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.284 0.888
第4 組(AD07274) 1.004 0.697
第6 組(AD07776) 0.666 0.346
第8 組(AD07778) 0.768 0.529
針對各種肌肉類型，如以下表中第1組、第2組、第4組、第6組及第8組所示，類似地測定所收集組織中的平均相對Wfdc3 mRNA轉錄物含量： 表 15.1.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之二頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.848 5.574
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 37.917 4.969 5.718
第4 組(AD07274) 3.269 1.221 1.948
第6 組(AD07776) 1.017 0.316 0.459
第8 組(AD07778) 0.940 0.580 1.518
表 15.2.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之隔膜
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.814 4.371
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 69.613 13.167 16.238
第4 組(AD07274) 0.766 0.260 0.393
第6 組(AD07776) 0.307 0.139 0.256
第8 組(AD07778) 0.323 0.166 0.342
表 15.3.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.807 4.179
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 17.428 2.830 3.378
第4 組(AD07274) 1.136 0.303 0.414
第6 組(AD07776) 0.339 0.091 0.124
第8 組(AD07778) 0.458 0.166 0.260
表 15.4.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之嚼肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.825 4.715
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 16.944 2.072 2.361
第4 組(AD07274) 0.646 0.191 0.272
第6 組(AD07776) 0.061 0.009 0.011
第8 組(AD07778) 0.089 0.052 0.126
表 15.5.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之TA
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.867 6.517
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 41.110 5.691 6.605
第4 組(AD07274) 1.034 0.265 0.356
第6 組(AD07776) 0.198 0.122 0.314
第8 組(AD07778) 0.294 0.204 0.670
表 15.6.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之斜方肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.851 5.697
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 31.526 3.384 3.791
第4 組(AD07274) 0.424 0.255 0.640
第6 組(AD07776) 0.073 0.027 0.043
第8 組(AD07778) 0.099 0.053 0.113
表 15.7.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.774 3.428
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 23.499 3.361 3.922
第4 組(AD07274) 0.385 0.124 0.182
第6 組(AD07776) 0.060 0.032 0.067
第8 組(AD07778) 0.100 0.053 0.113
對於上文所示之所有DUX4 RNAi藥劑，RNAi藥劑包括經設計以在基因之位置408處抑制DUX4基因的核苷酸序列。如本文所示，DUX4 RNAi藥劑展示相關參數之實質性降低，其中AD07776及AD07778在降低DUX4及 Wfdc3基因表現方面具有特定效力。 實例 6. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑，將小鼠在皮膚與肌肉之間注射(亦即皮下注射)至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中。在第4天開始，每週三次(第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 16.實例6之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 SM45b-L4-AD07511-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 SM45b-L4-AD07511-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 SM45b-L4-AD07843-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 SM45b-L4-AD07843-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
7 SM45b-L4-AD07844-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
8 SM45b-L4-AD07844-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
9 SM45b-L4-AD07776-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
10 SM45b-L4-AD07776-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
11 SM45b-L4-AD07778-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
12 SM45b-L4-AD07778-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
13 αvβ6肽1-AD07511-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
14 αvβ6肽1-AD07511-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例6 (組3-14)中之RNAi藥劑，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與各別靶向配位體之結合。
對於第3-12組，靶向配位體SM45經合成為疊氮化合物，其允許方便地與連接子L4偶合。(關於SM45及L4之結構及相關資訊，參見例如上文實例3)。
對於第13-14組，對骨骼肌細胞上存在之受體具有親和力之肽與DUX4 RNAi藥劑之有義股結合。骨骼肌細胞受體肽(肽1)經由如上述實例1中所描述之醯胺偶合反應在有義股之5'端連接於RNAi藥劑。αvβ6肽1由以下結構表示：
Figure 02_image351
其中
Figure 02_image353
指示與RNAi藥劑(經由反應性胺(NH 2-C 6)連接子)之連接點。
實例6中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑結合。
對於第3-12組，雙(PEG47+C22)部分附接至有義股之3'末端以充當藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例3)。
對於第13-14組，LP38b部分附接至有義股之3'末端以充當具有以下結構之藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑：
Figure 02_image355
其中R為RNAi藥劑之剩餘部分。順丁烯二醯亞胺藉由還原末端3'二硫鍵且對末端3'硫醇進行邁克爾加成反應而連接於有義股之3'端。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
在各組(n=6)中對六隻小鼠進行給藥。在第22天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。
在第1天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天及第22天進行體重量測，且針對第4天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化，如圖5 (1 mg/kg)及圖6 (5 mg/kg)中所示。在用1或5 mg/kg RNAi藥劑處理之所有組中，體重保持高於陽性對照量。值得注意的是，用AD07511、AD07776及AD07778處理之動物在1及5 mg/kg下將體重量維持等於基線。
對於某些組，檢測所收集組織中之平均相對 DUX4表現，如以下表中針對各種肌肉類型所示： 表 17.1.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.502
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.574 0.380
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.801 0.243
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.674 0.253
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.991 0.184
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.422 0.188
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.880 0.250
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.622 0.222
表 17.2.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之隔膜
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.270
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.025 0.716
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 1.045 0.317
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.857 0.652
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.090 0.478
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.067 0.455
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.087 0.349
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.709 0.257
表 17.3.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.202
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.778 1.042
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.967 0.464
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.505 0.313
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.799 0.204
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.796 0.481
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.531 0.261
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.547 0.248
表 17.4.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.326
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.376 0.398
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 1.124 0.456
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.842 0.563
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.962 0.289
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.039 0.545
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.829 0.339
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.578 0.224
表 17.5.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之TA
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.434
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.664 0.653
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.627 0.192
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.609 0.537
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.786 0.119
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.724 0.348
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.642 0.208
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.539 0.170
表 17.6.實例5之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.307
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.968 0.377
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 1.331 0.190
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.961 0.803
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.050 0.306
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.159 0.382
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.942 0.387
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.244 0.337
表 17.7.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.207
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.774 0.214
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.640 0.292
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.500 0.490
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.705 0.132
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.642 0.274
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.629 0.301
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.523 0.215
為了進一步說明抑制程度，僅將上表17.1至表17.7中之資料與陽性對照(僅他莫昔芬)組進行比較，以展示各組之 DUX4阻斷基因表現%或減少%(非相對表現)： 表 18.1.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之二頭肌中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第 22 天之二頭肌 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.491
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.572
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.370
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.732
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.441
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.605
表 18.2.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之隔膜中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第22 天之隔膜 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.484
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.577
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.462
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.473
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.463
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.650
表 18.3.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之腓腸肌中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第 22 天之腓腸肌 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.456
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.716
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.551
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.553
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.701
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.692
表 18.4.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之嚼肌中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第 22 天之嚼肌 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.183
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.388
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.301
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.245
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.398
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.580
表 18.5.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之TA (脛前肌)中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第22 天之TA DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.623
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.634
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.527
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.565
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.614
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.676
表 18.6.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之斜方肌中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第22 天之斜方肌 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.552
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.676
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.646
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.610
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.683
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.581
表 18.7.相比於陽性對照(僅他莫昔芬)(第2組)，實例6之小鼠之三頭肌中之 DUX4阻斷基因表現百分比。
第 22 天之三頭肌 DUX4 阻斷基因表現 %
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.639
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.718
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.602
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.638
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.645
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.705
針對各種肌肉類型，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量： 表 19.1.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之二頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.868 6.549
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 21.742 2.185 2.429
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 10.061 2.600 3.506
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 3.302 1.613 3.154
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 4.360 2.022 3.769
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.778 0.318 0.538
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 9.153 3.716 6.257
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 5.444 2.062 3.319
表 19.2.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之隔膜
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.747 2.954
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 19.044 3.445 4.206
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 6.596 2.343 3.634
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.640 0.393 1.016
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.688 0.839 1.668
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.108 0.049 0.088
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 5.007 2.475 4.895
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.127 0.542 1.044
表 19.3.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.773 3.403
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 8.502 1.568 1.923
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 3.528 0.689 0.857
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.787 0.415 0.877
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.238 0.472 0.763
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.213 0.100 0.189
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 2.801 0.666 0.873
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.707 0.455 0.620
表 19.4.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之嚼肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.766 3.276
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 10.813 4.217 6.913
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 4.561 1.194 1.618
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.854 0.563 1.653
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.391 0.400 0.561
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.141 0.065 0.122
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 2.251 0.824 1.299
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 0.778 0.450 1.065
表 19.5.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之TA
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.866 6.475
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 23.367 3.417 4.002
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 5.417 1.188 1.521
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 1.153 0.647 1.474
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.800 0.639 0.990
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.263 0.122 0.229
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 4.666 1.699 2.672
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 2.429 0.512 0.650
表 19.6.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之斜方肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.820 4.552
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 20.944 3.702 4.497
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 4.452 1.705 2.763
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.586 0.386 1.128
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.072 0.503 0.949
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.122 0.060 0.119
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 3.512 1.804 3.709
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.000 0.538 1.162
表 19.7.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.810 4.255
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 23.534 5.125 6.552
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 4.148 1.492 2.330
第4 組(5 mg/kg SM45b-AD07511-PK/PD) 0.796 0.449 1.028
第11 組(1 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 1.006 0.550 1.212
第12 組(5 mg/kg SM45b-AD07778-PK/PD) 0.136 0.053 0.087
第13 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 3.284 1.485 2.712
第14 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-PK/PD) 1.241 0.633 1.290
對於上文資料表中所示之DUX4 RNAi藥劑，AD07511包括經設計以在基因之位置1437處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；且AD077778包括經設計以在基因之位置408處抑制 DUX4基因之核苷酸序列。
如上文所示，此等DUX4 RNAi藥劑兩者均保持體重且展示 DUX4基因表現有意義的減少。 實例 7. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑，將小鼠在皮膚與肌肉之間注射(亦即皮下注射)至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中。在第4天開始，每週三次(第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 20.實例7之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥 方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 αvβ6肽1-AD07511-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 αvβ6肽1-AD07511-LP38b 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 αvβ6肽1-AD07776-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 αvβ6肽1-AD07776-LP38b 在第1天及第7天投與5 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例7(第3-6組)中之RNAi藥劑，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以有助於與稱為肽1之骨骼肌細胞受體肽結合(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例6)。
實例7中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑(LP38b)結合。(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例6)。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
對於上文所示之DUX4 RNAi藥劑，AD07511 (第3組及第4組)包括經設計以在基因之位置1437處抑制DUX4基因之核苷酸序列；且AD07776 (第5組及第6組)包括經設計以在基因之位置408處抑制DUX4基因之核苷酸序列。
在第1、3、4、5、8、10、11、12、15、17、18及19天進行體重量測，且針對第1天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化，如圖7中所示。在用1或5 mg/kg RNAi藥劑處理之所有組中，體重保持高於陽性對照量。
在各組(n=6)中對六隻小鼠進行給藥。在第19天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。所收集組織中之平均相對DUX4表現展示於以下有關腓腸肌及三頭肌之表中： 表 21.1.實例7之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 19 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.215
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.486 0.325
第3 組(AD07511, 1 mg/kg) 0.919 0.200
第4 組(AD07511, 5 mg/kg) 0.879 0.241
第5 組(AD07776, 1 mg/kg) 1.474 0.615
第6 組(AD07776, 5 mg/kg) 1.136 0.540
表 21.2.實例7之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 19 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.217
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.654 0.675
第3 組(AD07511, 1 mg/kg) 0.777 0.091
第4 組(AD07511, 5 mg/kg) 0.968 0.620
第5 組(AD07776, 1 mg/kg) 1.145 0.285
第6 組(AD07776, 5 mg/kg) 0.968 0.620
針對各種腓腸肌及三頭肌，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量： 表 22.1.實例7之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 19 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.810 4.259
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 7.684 3.764 7.376
第3 組(AD07511 ，1 mg/kg) 5.999 1.891 2.762
第4 組(AD07511 ，5 mg/kg) 2.742 0.649 0.851
第5 組(AD07776 ，1 mg/kg) 3.628 0.735 0.922
第6 組(AD07776 ，5 mg/kg) 1.537 0.467 0.672
表 22.2.實例7之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 19 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.899 8.915
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 16.942 4.319 5.797
第3 組(AD07511 ，1 mg/kg) 5.014 1.291 1.738
第4 組(AD07511 ，5 mg/kg) 0.958 0.396 0.676
第5 組(AD07776 ，1 mg/kg) 1.334 0.668 1.339
第6 組(AD07776 ，5 mg/kg) 0.131 0.071 0.156
為進一步說明抑制程度，僅將上表22.1及22.2中之資料與陽性對照(僅他莫昔芬)組進行比較，其展示各種組之以下相對抑制程度： 表 23.1.實例7之相對於陽性對照(第2組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之相對平均 Wfdc3表現。
第 22 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.000
第3 組(AD07511 ，1 mg/kg) 0.781
第4 組(AD07511 ，5 mg/kg) 0.357
第5 組(AD07776 ，1 mg/kg) 0.472
第6 組(AD07776 ，5 mg/kg) 0.200
表 23.2.實例7之相對於陽性對照(第2組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.000
第3 組(AD07511 ，1 mg/kg) 0.296
第4 組(AD07511 ，5 mg/kg) 0.057
第5 組(AD07776 ，1 mg/kg) 0.079
第6 組(AD07776 ，5 mg/kg) 0.008
如上文實例2中所描述，實例7中之小鼠進一步經歷滾棒裝置以進行總體運動協調評估。如圖8中所示，在整個研究持續時間中，給與DUX4 RNAi藥劑之動物(第3-6組)能夠在與未投與他莫昔芬之陰性對照鹽水組類似的滾棒裝置上維持其平衡及總體運動功能。反之，用他莫昔芬給藥但無DUX4 RNAi藥劑之動物自約第11天開始更快地自滾棒裝置脫落，表明肌肉功能喪失。
如以上所示資料所證明，DUX4 RNAi藥劑兩者在用DUX4 RNAi藥劑給藥之模型小鼠中展示DUX4基因表現之實質性抑制及總體運動功能及體重之保持。 實例 8 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型用於評估DUX4 RNAi藥劑。根據固相上之胺基亞磷酸酯技術，根據此項技術中已知及寡核苷酸合成中常用之通用程序，如本文之實例1中所闡述，合成包括有義股及反義股之DUX4 RNAi藥劑。
在研究第1天，使用等張鹽水(媒劑對照)或調配於等張鹽水中之DUX4 RNAi藥劑，將小鼠在皮膚與肌肉之間注射(亦即皮下注射)至頸部及肩部區域上之鬆弛皮膚區域中。在第4天開始，每週三次(第4、6、8、10、12、15、17及19天)投與每20 g小鼠100 µL玉米油(陰性對照)或溶解於玉米油(1 mg/mL)中之他莫昔芬的經口管飼，以誘導DUX4之表現增加。給藥方案及細節闡述於下表中： 表 24.實例8之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 在第4天開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
3 SM45b-L4-AD07511-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
4 SM45b-L4-AD07778-雙(PEG47+C22) 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
5 αvβ6肽1-AD07511-LP29b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
6 αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
7 αvβ6肽1-AD07511-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
8 αvβ6肽1-AD07578-LP38b 在第1天及第7天投與1 mg/kg 他莫昔芬 在第4天開始每週3次
合成實例8(第3-8組)中之RNAi藥劑，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與各別靶向配位體或連接子結合。
對於第3-4組，所選靶向配位體為小分子骨骼肌受體SM45b，其係以疊氮化合物形式合成，其允許方便地與連接子L4偶合。(關於SM45-p及L4之結構及相關資訊，參見例如上文實例3)。
對於第5-8組，肽1結合於DUX4 RNAi藥劑之有義股。肽1經由有義股之5'末端處之醯胺偶合反應連接於((NH2-C6)官能化RNAi藥劑(結構資訊參見實例6。)
實例6中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑結合。
對於第3-4組，雙(PEG47+C22)部分附接至有義股之3'末端以充當藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例3)。
對於第5-6組，LP29b部分附接至有義股之3'末端以充當具有以下結構之藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑：
Figure 02_image357
其中R包含DUX4 RNAi藥劑。
LP29-p藉由還原(C6-SS-C6)官能基之末端3'二硫鍵且經由邁克爾加成反應使LP29-p之順丁烯二醯亞胺偶合至末端3'硫醇而連接於有義股之3'端。對於第7-8組，將LP38b部分附接至有義股之3'末端以充當藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑。(關於結構資訊及相關資訊，參見例如上文實例6)。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
除陽性對照(他莫昔芬及鹽水，未投與DUX4 RNAi藥劑)以外，對各組中之九隻小鼠(n=9)進行給藥，該陽性對照具有12隻小鼠(n=12)。在第22天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。
在第1天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天及第22天進行體重量測，且針對第4天(投與他莫昔芬前)及基線歸一化，如圖9中所示。
檢測所收集組織中之平均相對 DUX4表現，如以下表中針對各種肌肉類型所示： 表 25.1.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.831
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.311 0.478
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.705 0.313
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.788 0.254
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.399 0.172
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.405 0.262
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.580 0.275
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.374 0.228
表 25.2.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 DUX4表現。
   第22 天之隔膜
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.373
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.628 0.681
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.926 0.353
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 1.098 0.366
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.990 0.360
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.866 0.372
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 1.053 0.333
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.787 0.382
表 25.3.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.328
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.274 0.757
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.585 0.207
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.764 0.162
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.615 0.218
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.631 0.212
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.705 0.239
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.727 0.330
表 25.4.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.300
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.330 0.318
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.852 0.243
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.876 0.221
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.533 0.111
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.534 0.068
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.613 0.248
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.610 0.156
表 25.5.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   TA Day 22
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.211
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.516 0.297
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.616 0.195
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.654 0.159
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.484 0.167
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.573 0.303
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.495 0.218
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.556 0.184
表 25.6.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對DUX4表現。
   第22 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.340
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.181 0.466
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.508 0.233
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.622 0.277
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.562 0.179
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.567 0.214
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.603 0.322
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.633 0.218
表 25.7.實例8之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 22 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.387
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.331 1.000
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 0.508 0.243
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 0.649 0.109
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 0.569 0.189
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.601 0.265
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 0.679 0.300
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.848 0.359
針對各種肌肉類型，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量： 表 26.1.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之二頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.821 4.586
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 16.434 2.039 2.327
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 4.778 2.175 3.994
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 3.760 1.353 2.114
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 6.146 1.610 2.181
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 2.722 1.090 1.819
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 6.513 2.463 3.962
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 3.041 1.072 1.655
表 26.2.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之隔膜中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之隔膜
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.769 3.338
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 21.913 2.959 3.421
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 4.848 2.284 4.320
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 2.795 1.346 2.598
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 5.240 1.774 2.682
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 1.306 0.621 1.185
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 5.245 2.932 6.646
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 1.618 1.003 2.642
表 26.3.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.674 2.064
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 8.357 1.679 2.102
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 2.326 0.537 0.698
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 1.455 0.464 0.681
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 2.382 0.597 0.797
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 1.130 0.420 0.669
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 2.440 0.814 1.221
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38) 1.126 0.468 0.800
表 26.4.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之嚼肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.724 2.625
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 9.662 1.776 2.175
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 2.818 0.911 1.347
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 1.574 0.598 0.965
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 1.716 0.602 0.928
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.700 0.294 0.507
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 1.836 0.884 1.704
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.570 0.271 0.516
表 26.5.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之TA
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.825 4.714
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 16.122 2.924 3.571
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 3.474 1.193 1.817
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 1.697 0.618 0.971
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 4.008 0.925 1.202
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 1.539 0.793 1.634
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 4.097 1.537 2.459
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 1.553 0.560 0.876
表 26.6.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第22 天之斜方肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.757 3.112
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 13.635 2.965 3.790
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 1.929 1.009 2.115
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22)) 1.222 0.553 1.010
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 1.834 0.609 0.911
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.552 0.272 0.534
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 2.258 1.166 2.410
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.632 0.321 0.651
表 26.7.實例6之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 22 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.648 1.842
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 13.188 2.581 3.209
第3 組(1 mg/kg SM45b-AD07511- 雙(PEG47+C22)) 1.742 0.614 0.948
第4 組(1 mg/kg SM45b-AD07778- 雙(PEG47+C22) ) 0.792 0.427 0.926
第5 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP29b) 1.702 0.573 0.865
第6 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29b) 0.517 0.229 0.411
第7 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07511-LP38b) 1.606 0.962 2.399
第8 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP38b) 0.590 0.322 0.707
對於上文資料表中所示之DUX4 RNAi藥劑，AD07511包括經設計以在基因之位置1437處抑制 DUX4基因之核苷酸序列；且AD077778包括經設計以在基因之位置408處抑制 DUX4基因之核苷酸序列。 如上文所示，此等DUX4 RNAi藥劑兩者均展示所檢測之三種型式中之每一者中 DUX4基因表現有意義的降低。 實例 9. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
使用如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型。所評估DUX4 RNAi藥劑為連接於肽1之靶向配位體及PK/PD調節劑LP29b之DUX4 RNAi藥劑AD07778 (關於完全經修飾及結合之有義股及反義股結構，參見表5.4中之AC000448)，其係根據固相胺基亞磷酸酯技術根據此項技術中已知且通常用於寡核苷酸合成中之通用程序合成，如本文中實例1中所闡述。
此研究之目標為評估此DUX4 RNAi藥劑對DUX4 mRNA表現之阻斷基因表現的劑量反應及時序作用、DUX4蛋白質活性之生物標記的減少及在每週兩次皮下給藥繼之以FLExDUX4/HSA-MCM小鼠中之每週皮下給藥之後的藥力學作用。
在研究下使用兩種投與策略：預防及干預。
在預防策略(下文C組及D組)期間，DUX4 RNAi藥劑在開始投與他莫昔芬2天內投與。以此方式，咸信DUX4 RNAi藥劑遞送至骨骼肌細胞(肌纖維)中，因為 DUX4表現經誘導且增加。
在干預策略(下文E組)期間，在FSHD樣表型表現之後(在開始投與他莫昔芬之後第10天)投與DUX4 RNAi藥劑。以此方式，在 DUX4表現已開始發揮肌毒性作用之後，將DUX4 RNAi藥劑遞送至肌纖維中。
給藥方案及細節闡述於下表27中： 表 27.實例9之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
A 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
B 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
C (預防研究)    αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第3、5、10、17及25天投與1 mg/kg 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
D (預防研究)    αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第3、5、10、17及25天投與5 mg/kg 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
E (干預研究)    前兩次劑量之鹽水(無RNAi藥劑)，接著投與肽1-AD07778-LP29b 在第3天及第5天投與鹽水(無RNAi藥劑)。    在第10、17及25天投與5 mg/kg RNAi藥劑 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
在第1週期間每週兩次及在第2週至第4週期間每週三次經由經口管飼向各小鼠投與玉米油對照物或1 mg/mL他莫昔芬溶液，劑量體積為100 µL/20 g體重(5 mg/kg)。
合成實例9 (C、D及E組)中之RNAi藥劑，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以有助於與各別靶向配位體或連接子結合。肽1結合於DUX4 RNAi藥劑之有義股。肽1經由有義股之5'末端處之醯胺偶合反應連接於((NH2-C6)官能化RNAi藥劑(結構資訊參見實例6。)
實例6中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑結合。LP29b部分附接至有義股之3'末端以充當具有以下結構之藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑：
Figure 02_image359
其中R包含DUX4 RNAi藥劑。
藉由還原末端3'二硫鍵且對末端3'硫醇進行邁克爾加成反應以合成RNAi藥劑，將順丁烯二醯亞胺LP29-p連接於有義股之3'端。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
對不涉及他莫昔芬之A組(n=6)中之六隻小鼠進行給藥。對B、C、D及E組中之十隻小鼠(n=10)進行給藥。
在他莫昔芬及RNAi藥劑投與當天(第1、3、4、5、8、10、12、15、17、19、22、24、26、29及31天)進行體重量測。為控制個別差異，各個別動物之體重相對於第1天歸一化且隨後相對於基線組之體重在各時間點之平均值歸一化。使用雙因子變異數分析，接著鄧尼特氏多重比較測試(Dunnett's multiple comparison test)確定各時間點各組體重之間的顯著差異。
體重在各組之間無顯著差異，直至第10天。在第10天，投與他莫昔芬之動物僅傾向於具有與基線相比更低的體重且具有與在第3天開始之1或5 mg/kg RNAi藥劑投與之體重顯著更低的體重(分別為C及D組；p=0.0294、p=0.0010及p=0.0012)。截至第12天，與基線動物(A組)及在第3天投與1或5 mg/kg之彼等動物(C及D組)相比，僅投與他莫昔芬之動物(B組)及在第10天首次投與他莫昔芬及5 mg/kg RNAi藥劑之組(E組)之體重顯著較低。在第17天，對於在E組中投與之動物，體重損失停止，而對於僅投與他莫昔芬之動物，體重損失持續(B組)。儘管E組平均體重顯著低於基線及第3天開始投與1或5 mg/kg DUX4 RNAi藥劑之動物(A、C及D組；對於所有各別比較組，p＜0.05)，但其亦顯著高於僅投與他莫昔芬之動物之平均體重(B組，p=0.0003)。在第22天之後，在第10天開始投與DUX4 RNAi藥劑之E組動物的體重在統計學上等效於C組及D組至第31天。
在第31天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。檢測所收集組織中之平均相對 DUX4表現，如以下表中針對各種肌肉類型所示： 表 28.1.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之二頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 31 天二頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.306
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.929 0.794
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.868 0.255
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 1.050 0.327
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.715 0.223
表 28.2.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 31 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.283
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.912 1.101
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.888 0.455
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.716 0.288
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.789 0.419
表 28.3.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之嚼肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 31 天之嚼肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.246
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.444 0.467
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽 1-AD07778-LP29) 0.843 0.410
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽 1-AD07778-LP29) 0.666 0.168
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.841 0.176
表 28.4.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之TA (脛前肌)中之平均相對 DUX4表現。
   第31 天之TA
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.338
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.907 0.808
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.953 0.312
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.834 0.281
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.808 0.311
表 28.5.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之斜方肌中之平均相對 DUX4表現。
   第31 天之斜方肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.258
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.679 2.189
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽 1-AD07778-LP29) 0.931 0.564
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽 1-AD07778-LP29) 0.890 0.241
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.857 0.199
表 28.6.實例9之相對於基線(A組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 DUX4表現。
   第 31 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
A 組( 基線) 1.000 0.227
B 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.565 2.000
C 組(1 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.972 0.358
D 組(5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.633 0.222
E 組( 在第3 天及第5 天兩次鹽水給藥之後開始在第10 天給藥5 mg/kg αvβ6 肽1-AD07778-LP29) 0.793 0.259
針對各種肌肉類型，類似地測定所收集組織中之平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量及 Myo1gmRNA轉錄物含量。所有個體及組 Wfdc3及 Myo1g相對表現值相對於來自基線組(A組)之對應平均相對表現量歸一化。他莫昔芬投與(B組)使得所有評估之肌肉中 Wfdc3(4.891-11.772倍)及 Myo1g(2.139-12.744倍)表現急劇且顯著增加(對於所有各別比較組，p＜0.001)。在他莫昔芬誘導之動物中，第3天開始(C組及D組)且第10天開始(E組)投與之1或5 mg/kg DUX4 RNAi藥劑肽1-AD07778-LP29避免 Wfdc3及 Myo1g表現增加或相對 Wfdc3及 Myo1g表現減少至基線或低於基線。投與DUX4 RNAi藥劑使得 Wfdc3及 Myo1g意謂與僅他莫昔芬(B組)相比顯著較低之相對表現量，與劑量含量或投與時序無關(C、D及E組；對於所有各別比較組，p＜0.0001)。
此外，分析組織樣品之組織學。自採集當天收集的福馬林固定的腓腸肌、TA及三頭肌切下肌肉切片，並用H&E及PSR染色。在腓腸肌、TA及三頭肌中，他莫昔芬之投與誘導居中定位核急劇增加，表明FLExDUX4/HSA-MCM動物(B組)中之活性肌肉修復及纖維化。一般而言，當與僅投與他莫昔芬之彼等動物(B組)相比時，在來自投與他莫昔芬之動物及DUX4 RNAi藥劑治療之動物(C、D及E組)之肌肉切片中觀測到較少集中核及較少纖維化。實際上，來自C、D及E組之動物的肌肉切片具有與基線組(A組)類似之形態。E組動物(在第1天開始投與他莫昔芬，隨後在第10天開始投與DUX4 RNAi藥劑)傾向於展現比C組及D組稍微更多的纖維化。
如本文所示，使用預防或干預策略投與之DUX4 RNAi藥劑足以使 DUX4表現量恢復至基線，防止或減少 DUX4靶基因及DUX4活性之標記( Wfdc3及 Myo1g)表現增加，防止體重損失及體重恢復至基線量，且減少肌毒性之跡象(纖維化、中心核增加、血清肌酐激酶升高、肌肉重量損失-9種肌肉中之4種)，由此當經由經口管飼投與他莫昔芬時，緩解FLExDUX4/HSA-MCM基因轉殖小鼠模型中所觀測到之FSHD樣表型。 實例 10. 在 FSHD 樣基因轉殖小鼠中之活體內投與靶向 DUX4 之 RNAi 藥劑
使用如實例2中所描述之FSHD樣基因轉殖小鼠模型。所評估DUX4 RNAi藥劑為連接於肽1之靶向配位體及PK/PD調節劑LP29b之DUX4 RNAi藥劑AD07778 (關於完全經修飾及結合之有義股及反義股結構，參見表5.4中之AC000448)，其係根據固相胺基亞磷酸酯技術根據此項技術中已知且通常用於寡核苷酸合成中之通用程序合成，如本文中實例1中所闡述。
給藥方案及細節闡述於下表29中： 表 29.實例10之小鼠之給藥組。
組 RNAi 藥劑 及劑量 RNAi 藥劑給藥方案 誘導藥劑投與 誘導藥劑給藥方案
1 基線(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 玉米油 (陰性對照) 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
2 陽性對照(無RNAi藥劑，鹽水注射) N/A 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
3 (預防研究)    αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第1天及第4天投與1 mg/kg 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
4 (預防研究)    αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第1天及第4天投與5 mg/kg 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
5 (干預研究)    前兩次劑量之鹽水(無RNAi藥劑)，接著投與αvβ6肽1-AD07778-LP29b 在第3天及第5天投與鹽水(無RNAi藥劑)。    在第10天及第12天投與5 mg/kg RNAi藥劑 他莫昔芬 第1天，且隨後在第一週每週2次，且第2週開始每週3次
在第1週期間每週兩次及在第2週至第4週期間每週三次經由經口管飼向各小鼠投與玉米油對照物或1 mg/mL他莫昔芬溶液，劑量體積為100 µL/20 g體重(5 mg/kg)。
合成實例10(第2組及第4-6組)中之RNAi藥劑，其具有針對靶向DUX4基因之核苷酸序列，且在有義股之5'末端處包括官能化胺反應性基團(NH 2-C 6)以促進與各別靶向配位體或連接子結合。肽1結合於DUX4 RNAi藥劑之有義股。肽1經由有義股之5'末端處之醯胺偶合反應連接於((NH2-C6)官能化RNAi藥劑(結構資訊參見實例6。)
實例6中之DUX4 RNAi藥劑與二硫鍵官能基(C6-SS-C6)一起在有義股之3'末端進一步合成以促進與PK/PD調節劑結合。LP29b部分附接至有義股之3'末端以充當具有以下結構之藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑：
Figure 02_image361
其中R包含DUX4 RNAi藥劑。
藉由還原末端3'二硫鍵且對末端3'硫醇進行邁克爾加成反應以合成RNAi藥劑，將順丁烯二醯亞胺LP29-p連接於有義股之3'端。
經修飾之RNAi藥劑核苷酸序列如本文中表3、表4.1、表4.6及表5.1、表5.2、表5.3及表5.4中所示經合成(展示完全經修飾之結合物)。
對第1組中之六隻小鼠(n=6)進行給藥，對第2組中之十隻小鼠(n=10)進行給藥，且對第3-5組中之每一者中之八隻小鼠(n=8)進行給藥。
在第26天，處死動物且收集肌肉，處理且根據實例2中所描述之程序分析。所收集組織中之平均相對DUX4表現展示於以下有關腓腸肌及三頭肌之表中： 表 30.1.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對DUX4表現。
   第 26 天之腓腸肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.213
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.520 0.268
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.868 0.223
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.909 0.224
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 1.059 0.201
表 30.2.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對DUX4表現。
   第 26 天之三頭肌
   相對 DUX4 表現 標準差 (+/-)
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.419
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.216 0.353
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.755 0.198
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.583 0.126
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 1.009 0.217
針對各種腓腸肌及三頭肌，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Wfdc3mRNA轉錄物含量： 表 31.1.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 26 天之腓腸肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.238 0.312
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 3.562 0.399 0.450
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 1.187 0.399 0.600
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.320 0.103 0.151
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 0.459 0.281 0.725
表 31.2.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對 Wfdc3表現。
第 26 天之三頭肌
相對 Wfdc3 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.453 0.828
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 2.726 0.938 1.429
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.699 0.281 0.469
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.075 0.027 0.043
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 0.147 0.110 0.430
針對各種腓腸肌及三頭肌，如以下表中所示，類似地測定所收集組織中的平均相對 Myo1gmRNA轉錄物含量： 表 32.1.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之腓腸肌中之平均相對 Myo1g表現。
第 26 天之腓腸肌
相對 Myo1g 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.079 0.086
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.685 0.163 0.180
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.977 0.337 0.515
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.284 0.117 0.198
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 0.392 0.166 0.288
表 32.2.實例10之相對於基線(第1組)歸一化的小鼠之三頭肌中之平均相對Myo1g表現。
第 26 天之三頭肌
相對 Myo1g 表現 低 ( 誤差 ) 高 ( 誤差 )
第 1 組 ( 基線 ) 1.000 0.249 0.332
第 2 組 ( 陽性對照 ( 僅他莫昔芬 )) 1.375 0.275 0.343
第3 組(1 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.701 0.293 0.504
第4 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第1 天及第4 天給藥 0.160 0.079 0.156
第5 組(5 mg/kg αv β6 肽1-AD07778-LP29) ， 在第10 天及第12 天給藥 0.293 0.175 0.432
如上文實例2中所描述，實例10中之小鼠進一步經歷滾棒裝置以進行總體運動協調評估。如圖12中所示，在研究期間，給與DUX4 RNAi藥劑之動物(第3-5組)能夠維持其在滾棒裝置上之平衡及總體運動功能與未投與他莫昔芬之陰性對照鹽水組(第1組)更類似。反之，用他莫昔芬給藥但無DUX4 RNAi藥劑之動物(第2組)不能長期維持平衡及運動功能且自第11天開始更快地自滾棒裝置脫落(相比於第1、3及4組)，表明第2組動物之肌肉功能喪失。用他莫昔芬給藥但無DUX4 RNAi藥劑之動物直至第10天(第5組)類似地長時間不能維持平衡及運動功能，且自第11天開始更快地自滾棒裝置脫落；然而，在DUX4 RNAi藥劑給藥之後(自第10天開始)，到第15天，此等動物能夠維持平衡及足以在滾棒裝置上停留之運動功能，持續與第1、3及4組的動物相當的時間，表明第5組的動物中肌肉功能的初始損失藉由投與DUX4 RNAi藥劑而逆轉。
如以上所示資料證明，DUX4 RNAi藥劑在模型小鼠中展示DUX4基因表現之實質性抑制及保持總體運動功能或逆轉總體運動功能喪失(如約第15天開始之第5組所示)。 實例 11. 在源於患者之肌管中活體外抑制 DUX4 RNAi 藥劑
冷凍的未轉型源於FSHD患者之肌母細胞係自位於卡瑞爾醫學研究所(Coriell Institute for Medical Research) (Camden, NJ)之NIGMS人類基因細胞庫獲取。在活體外分化成肌管時，此等細胞已展示出表現相對較高量之 DUX4及DUX4蛋白質之靶基因。源於FSHD患者之肌母細胞隨後擴增且活體外分化成肌管。
此研究之目標為評估此 DUX4RNAi藥劑對在轉染之後DUX4 mRNA表現之阻斷基因表現及DUX4蛋白質活性在源於FSHD患者之肌管中之生物標記的減少的劑量反應。
源於FSHD患者之肌母細胞擴增且活體外分化成肌管。DUX4 RNAi藥劑使用市售脂染胺轉染劑(RNAiMAX；Thermo)轉染以分化成肌管。一旦觀測到成熟肌管形態且檢測 DUX4及DUX4靶基因相對表現，即收集肌管培養物。
在源於患者之肌管中所評估之DUX4 RNAi藥劑係連接於肽1之靶向配位體及PK/PD調節劑LP29b的DUX4 RNAi藥劑AD07778 (關於完全修飾及結合之有義股及反義股結構，參見表5.4中之AC000448)，其係根據固相胺基亞磷酸酯技術根據此項技術中已知且通常用於寡核苷酸合成中之通用程序合成，如本文實例1中所闡述。
在1.0、10及100 nM濃度下測試DUX4 RNAi藥劑。亦評價「加擾對照」，其包括與DUX4 RNAi藥劑AD07778相同的靶向配位體及PK/PD調節劑，該DUX4 RNAi藥劑AD07778連接於肽1之靶向配位體及PK/PD調節劑LP29b，但加擾對照係以使得預期其不具有活性且不抑制DUX4基因表現之方式加以修飾。
圖11展示使用DUX4 RNAi藥劑之源於患者之肌管的劑量依賴性抑制，表明DUX4 RNAi藥劑藉由消除人類肌細胞中之 DUX4mRNA而有效減少DUX4蛋白質表現。資料相對於「加擾對照」歸一化。
此外，評估DUX4表現之某些生物標記以確定其如何受DUX4 RNAi藥劑影響。此等包括 CCNA1 、 KHDC1L 、 LEUTX 、 MDB3L2 、 PRAMEF2 、 PRAMEF6 、 SLC2A3 、 SLC34A2 、 TRIM43及 ZSCAN4。此等基因為DUX4轉錄因子之已知基因目標且其表現增加已在FSHD患者肌肉活體組織切片中表徵為DUX4表現增加之標記。如圖12中所示，投與DUX4 RNAi藥劑之細胞亦展示此等FSHD生物標記基因之表現量減少。 其他實施例
應瞭解，雖然本發明已結合其實施方式描述，但前述描述意欲說明且不限制本發明之範疇，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍之範疇界定。其他態樣、優勢及修改在以下申請專利範圍之範疇內。
圖 1.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例3中更充分地描述。
圖 2.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例4中更充分地描述。
圖 3.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例4中更充分地描述。
圖 4.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例5中更充分地描述。
圖 5.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例6中更充分地描述。
圖 6.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例6中更充分地描述。
圖 7.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例7中更充分地描述。
圖 8.描繪FSHD樣模型小鼠在滾棒裝置上之時間之圖，如實例7中更充分地描述。
圖 9.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例8中更充分地描述。
圖 10.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例9中更充分地描述。
圖 11.描繪FSHD樣模型小鼠之平均體重之圖，如實例10中更充分地描述。
圖 12.描繪FSHD樣模型小鼠在滾棒裝置上之時間之圖，如實例10中更充分地描述。
圖 13.描繪源於患者之肌管中之 DUX4表現之圖，如實例11中更充分地描述。
圖 14.描繪源於患者之肌管中已知與FSHD有關之若干生物標記基因之相對基因表現之圖，如實例11中更充分地描述。
圖 15A.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000232之結構(參見例如表5.4)、具有經由L4連接子連接於有義股之5'末端處之(NH 2-C 6)連接基團之avb6-SM45b靶向配位體，且具有PK/PD調節劑，該調節劑具有經由有義股之3'末端處之C6-SS-C6連接子連接的LP1b之結構。(參見例如本文中之實例1及3)。 下列縮寫用於圖15A至15I：a、c、g及u為2'-O-甲基修飾之核苷酸；Af、Cf、Gf及Uf為2'-氟修飾之核苷酸；o為磷酸二酯鍵；s為硫代磷酸酯鍵；invAb為反向無鹼基殘基(參見例如表6.1)；cPrpu為5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷修飾之核苷酸(參見例如表6.1)；avb6-SM45b為SM45b之小分子靶向配位體(參見例如表6.3)；-L4-為具有如實例3中所描述之結構之連接子；avb6-pep1為avb6肽1靶向配位體(參見例如表6.3)；-C6-S-為如表6.1中所展示之連接基團；(NH-C6)為如表6.1中所展示之連接基團；且LP1b、LP29b及LP38b各自分別為具有如本文中表6.7中所描述之結構之PK/PD調節劑。(亦參見本文中之實例1及3)。
圖 15B.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000247之結構(參見例如表5.4)，展示具有連接於有義股之5'末端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-肽1靶向配位體，且其中PK/PD調節劑具有連接於有義股之3'末端處之C6-SS-C6連接子的LP38b之結構(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 15C.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000278之結構(參見例如表5.4)、具有經由L4連接子連接於有義股之5'末端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-SM45b靶向配位體，且具有PK/PD調節劑，該調節劑具有經由有義股之3'末端處之C6-SS-C6連接子連接的LP1b之結構。(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 15D.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000280之結構(參見例如表5.4)、具有經由L4連接子連接於有義股之5'末端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-SM45b靶向配位體，且具有PK/PD調節劑，該調節劑具有經由有義股之3'末端處之C6-SS-C6連接子連接的LP1b之結構。(參見例如本文中之實例1及3)
圖 15E.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000281之結構(參見例如表5.4)、具有經由L4連接子連接於有義股之5'末端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-SM45b靶向配位體，且具有PK/PD調節劑，該調節劑具有經由有義股之3'末端處之C6-SS-C6連接子連接的LP1b之結構。(參見例如本文中之實例1及3)
圖 15F.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000446之結構(參見例如表5.4)、展示具有連接於有義股之5'端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-肽1靶向配位體，且其中PK/PD調節劑具有連接於有義股之3'端處之C6-SS-C6連接子的LP29b之結構(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 15G.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000447之結構(參見例如表5.4)、展示具有連接於有義股之5'端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-肽1靶向配位體，且其中PK/PD調節劑具有連接於有義股之3'端處之C6-SS-C6連接子的LP29b之結構(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 15H.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000448之結構(參見例如表5.4)、展示具有連接於有義股之5'端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-肽1靶向配位體，且其中PK/PD調節劑具有連接於有義股之3'端處之C6-SS-C6連接子的LP29b之結構(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 15I.DUX4 RNAi藥劑結合物之經修飾之有義股及反義股的示意圖，該DUX4 RNAi藥劑結合物具有AC000449之結構(參見例如表5.4)、展示具有連接於有義股之5'端處之(NH 2-C 6)連接基團的avb6-肽1靶向配位體，且其中PK/PD調節劑具有連接於有義股之3'端處之C6-SS-C6連接子的LP28b之結構(參見例如本文中之實例1及3)。
圖 16A 至圖 16E.AC000446之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以游離酸形式展示。
圖 17A 至圖 17E.具有AC000446結構之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以鈉鹽形式展示。
圖 18A 至圖 18E.AC000448之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以游離酸形式展示。
圖 19A 至圖 19E.具有AC000448之結構之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以鈉鹽形式展示。
圖 20A 至圖 20E.AC000449之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以游離酸形式展示。
圖 21A 至圖 21E.具有AC000449結構之DUX4 RNAi藥劑結合物之化學結構圖示(參見例如表5.4)，其以鈉鹽形式展示。 

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          augauuaguu cagagauan                                              19
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  1, 19]]>
          <![CDATA[<223>  n =任何核鹼基]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          nugauuaguu cagagauan                                              19
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
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          <![CDATA[<400>  66]]>
          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          uugaaaccag aucugaaucc u                                           21
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
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          <![CDATA[<400>  68]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
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          <![CDATA[<400>  69]]>
          uucugaacua aucauccagg a                                           21
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  70]]>
          auuucacgga agaacaaggg c                                           21
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          auguaacucu aauccagguu u                                           21
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  72]]>
          auaucucuga acuaaucauc c                                           21
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  73]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          uucugaacua aucauccagg a                                           21
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  76]]>
          uugaaaccag aucugaaucc u                                           21
          <![CDATA[<210>  77]]>
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  77]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          auuucacgga agaacaaggg c                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          auguaacucu aauccagguu u                                           21
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          auaucucuga acuaaucauc c                                           21
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          uucugaacua aucauccagg a                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  85]]>
          uagaauuuca cggaagaaca c                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          uagaauuuca cggaagaaca c                                           21
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
          <![CDATA[<210>  89]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          uugaaaccag aucugaaucc c                                           21
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          uucugaacua aucauccagg a                                           21
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          uagaauuuca cggaagaaca c                                           21
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          uagaauuuca cggaagaaca c                                           21
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑反義股修飾之序列]]>
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          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
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          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
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          <![CDATA[<211>  21]]>
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          ugaaaccaga ucugaauccu g                                           21
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          uagaauuuca cggaagaaca g                                           21
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          caggauucag aucugguuuc at                                          22
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          aggauucaga ucugguuuca at                                          22
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          <![CDATA[<400>  104]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  223]]>
          cuguucuucc gugaaauucu a                                           21
          <![CDATA[<210>  224]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  224]]>
          caggauucag aucugguuuc a                                           21
          <![CDATA[<210>  225]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  225]]>
          aggauucaga ucugguuuca a                                           21
          <![CDATA[<210>  226]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  226]]>
          uccuggauga uuaguucaga a                                           21
          <![CDATA[<210>  227]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  1]]>
          <![CDATA[<223>  n = 2'-O-甲基-2-胺基腺苷-3'-磷酸酯]]>
          <![CDATA[<400>  227]]>
          naaccuggau uagaguuaca u                                           21
          <![CDATA[<210>  228]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  228]]>
          guguucuucc gugaaauucu a                                           21
          <![CDATA[<210>  229]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  229]]>
          guguucuucc gugaaauucu a                                           21
          <![CDATA[<210>  230]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  230]]>
          gcccuuguuc uuccgugaaa u                                           21
          <![CDATA[<210>  231]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  231]]>
          ggaugauuag uucagagaua u                                           21
          <![CDATA[<210>  232]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  232]]>
          gggauucaga ucugguuuca a                                           21
          <![CDATA[<210>  233]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  233]]>
          gggauucaga ucugguuuca a                                           21
          <![CDATA[<210>  234]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  234]]>
          gggauucaga ucugguuuca a                                           21
          <![CDATA[<210>  235]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  235]]>
          cuguucuucc gugaaauucu a                                           21
          <![CDATA[<210>  236]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  236]]>
          caggauucag aucugguuuc a                                           21
          <![CDATA[<210>  237]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股修飾之序列]]>
          <![CDATA[<400>  237]]>
          caggauucag aucugguuuc a                                           21
          <![CDATA[<210>  238]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股基礎鹼基序列 ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  1]]>
          <![CDATA[<223>  n=含2-胺基腺嘌呤之核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  238]]>
          nggauucaga ucugguuuca at                                          22
          <![CDATA[<210>  239]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RNAi藥劑有義股基礎鹼基序列 ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  1]]>
          <![CDATA[<223>  n=含2-胺基腺嘌呤之核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  239]]>
          nggauucaga ucugguuuca a                                           21
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
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Figure 12_A0101_SEQ_0055
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Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065

Claims (56)

  1. 一種用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因表現之RNAi藥劑，其包含： i. 反義股，其包含與表2、表3或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸；以及 ii. 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表2、表3或表5.4中所提供之序列中之任一者的核苷酸2-18。
  3. 如請求項1或2之RNAi藥劑，其中該有義股包含與表2、表4.1、表4.2、表4.3、表4.4、表4.5、表4.6或表5.4中所提供之序列中之任一者相差0或1個核苷酸之至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，且其中該有義股在該連續17個核苷酸內具有與該反義股至少85%互補的區域。
  4. 如請求項1至3中任一項之RNAi藥劑，其中該DUX4 RNAi藥劑之至少一個核苷酸為經修飾之核苷酸或包括經修飾之核苷間鍵。
  5. 如請求項1至3中任一項之RNAi藥劑，其中全部或實質上全部該等核苷酸為經修飾之核苷酸。
  6. 如請求項4至5中任一項之RNAi藥劑，其中該經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2',3'-開環核苷酸模擬物、鎖定核苷酸、2'-F-阿拉伯糖基核苷酸、2'-甲氧基乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向2'-O-甲基核苷酸、反向2'-去氧核苷酸、2'-胺基修飾核苷酸、2'-烷基修飾核苷酸、N-𠰌啉基核苷酸、含膦酸乙烯酯之核苷酸、含膦酸環丙酯之核苷酸及3'-O-甲基核苷酸。
  7. 如請求項5之RNAi藥劑，其中全部或實質上全部該等經修飾之核苷酸為2'-O-甲基核苷酸、2'-氟核苷酸或其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3中所提供之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含表4.1、表4.2、表4.3、表4.4、表4.5、表4.6或表5.4中所提供之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列。
  10. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該反義股包含表3中所提供之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列，且該有義股包含表4.1、表4.2、表4.3、表4.4、表4.5、表4.6或表5.4中所提供之經修飾之序列中之任一者的核苷酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑連接於靶向配位體。
  12. 如請求項11之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接於該有義股。
  13. 如請求項12之RNAi藥劑，其中該靶向配位體連接於該有義股之5'末端。
  14. 如請求項11至13中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞及/或在骨骼肌細胞上表現之細胞受體具有親和力。
  15. 如請求項11至14中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image363
    Figure 03_image365
    Figure 03_image367
    Figure 03_image369
    Figure 03_image371
    Figure 03_image373
    Figure 03_image375
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image377
    指示與該RNAi藥劑之連接點。
  16. 如請求項1至15中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑進一步連接於藥物動力學/藥力學(PK/PD)調節劑。
  17. 如請求項16之RNAi藥劑，其中該PK/PD調節劑連接於該有義股。
  18. 如請求項17之RNAi藥劑，其中該PK/PD調節劑連接於該有義股之3'末端。
  19. 如請求項16至18中任一項之RNAi藥劑，其中該PK/PD調節劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image379
    PEG40K (2x2-臂)， 其中n及m為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
    Figure 03_image381
    PEG40K (4-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
    Figure 03_image383
    PEG40K (2-臂)， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
    Figure 03_image385
    PEG40K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約40千道爾頓
    Figure 03_image387
    PEG10K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約10千道爾頓
    Figure 03_image389
    PEG5K， 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image391
    DSPE-PEG5K-NHS 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image393
    DSPE-PEG5K-MAL 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image395
    DSPE-PEG5K-N3 其中n為整數，且PEG基團之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image397
    PEG47+C22
    Figure 03_image399
    PEG47+CLS (膽固醇)
    Figure 03_image401
    PEG23+C22
    Figure 03_image403
    雙(PEG23+C14)
    Figure 03_image405
    雙(PEG23+C22)
    Figure 03_image407
    雙(PEG47+C22)
    Figure 03_image409
    PEG48+C22
    Figure 03_image411
    PEG71+C22
    Figure 03_image413
    PEG95+C22
    Figure 03_image415
    PEG71+CLS
    Figure 03_image417
    PEG95+CLS
    Figure 03_image419
    雙(PEG23+C18)
    Figure 03_image421
    參(PEG23+C22)
    Figure 03_image423
    參(PEG23+CLS)
    Figure 03_image425
    雙(PEG23+CLS)
    Figure 03_image427
    PEG5K+C22 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image429
    C18
    Figure 03_image431
    (NHS)-PEG1K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約1千道爾頓
    Figure 03_image433
    (NHS)-PEG2K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約2千道爾頓
    Figure 03_image435
    (NHS)-PEG5K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image437
    (MAL)-PEG5K+C18 其中n為整數，且PEG單元之分子量為約5千道爾頓
    Figure 03_image439
    PEG48+C18
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image441
    指示與該RNAi藥劑之連接點。
  20. 如請求項17至19中任一項之RNAi藥劑，其中該PK/PD調節劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image443
    Figure 03_image445
    Figure 03_image447
    Figure 03_image449
    Figure 03_image451
    Figure 03_image453
    其中R Z包含RNAi藥劑。
  21. 如請求項1至20中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股之長度為15至49個核苷酸，且該反義股之長度為17至30個核苷酸。
  22. 如請求項21之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為18至24個核苷酸。
  23. 如請求項22之RNAi藥劑，其中該有義股及該反義股之長度各自為21個核苷酸。
  24. 如請求項23之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑具有兩個鈍端。
  25. 如請求項1至24中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個端帽。
  26. 如請求項1至25中任一項之RNAi藥劑，其中該有義股包含一或兩個反向無鹼基去氧核糖殘基。
  27. 如請求項1至26中任一項之RNAi藥劑，其包含由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之核苷酸序列： UAGAAUUUCACGGAAGAAC (SEQ ID NO:22)； UGAAACCAGAUCUGAAUCC (SEQ ID NO:10)； UUGAAACCAGAUCUGAAUC (SEQ ID NO:14)； UAGAAUUUCACGGAAGAACAG (SEQ ID NO:164)； UGAAACCAGAUCUGAAUCCUG (SEQ ID NO:162)； UUGAAACCAGAUCUGAAUCCU (SEQ ID NO:163)；及 UUGAAACCAGAUCUGAAUCCC (SEQ ID NO:169)。
  28. 如請求項27之RNAi藥劑，其中全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  29. 如請求項1至28中任一項之RNAi藥劑，其包含有包含以下、由以下組成、基本上由以下組成之反義股：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)； cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)； cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)； cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)； cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)； cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)； cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)； usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)； cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)； cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)；及 cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鳥苷及2'-O-甲基尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、2'-氟胞苷、2'-氟鳥苷及2'-氟尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中該有義股上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  30. 如請求項29之RNAi藥劑，其中該有義股包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與以下核苷酸序列(5'à3')中之一者相差0或1個核苷酸之經修飾之核苷酸序列： caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)；及 gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鳥苷及2'-O-甲基尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、2'-氟胞苷、2'-氟鳥苷及2'-氟尿苷；且其中該反義股上之全部或實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  31. 如請求項1至30中任一項之RNAi藥劑，其包含： (i) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:82)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (ii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:84)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (iii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsgsAfauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:100)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (iv) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusAfsGfsaauuucacGfgAfaGfaacasg (SEQ ID NO:101)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cuguucuuCfCfGfugaaauucua (SEQ ID NO:149)； (v) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:97)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (vi) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:99)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (vii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusGfsasAfaCfcAfgAfuCfuGfaAfuCfcUfsg (SEQ ID NO:75)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (viii) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') usGfsasaaccagauCfuGfaAfuccusg (SEQ ID NO:96)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') caggauucAfGfAfucugguuuca (SEQ ID NO:147)； (ix) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsu (SEQ ID NO:76)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') aggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:148)； (x) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsaaaccagaUfcUfgAfauccsc (SEQ ID NO:89)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfAfUfcugguuucaa (SEQ ID NO:156)；或 (xi) 由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之反義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') cPrpusUfsgsAfaAfcCfaGfaUfcUfgAfaUfcCfsc (SEQ ID NO:87)；及由以下組成、基本上由以下組成或包含以下之有義股：經修飾之核苷酸序列(5'à3') gggauucaGfaUfCfugguuucaa (SEQ ID NO:159)； 其中a、c、g及u分別表示2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鳥苷及2'-O-甲基尿苷；Af、Cf、Gf及Uf分別表示2'-氟腺苷、2'-氟胞苷、2'-氟鳥苷及2'-氟尿苷；cPrpu表示5'-膦酸環丙酯-2'-O-甲基尿苷；s表示硫代磷酸酯鍵；且其中各別有義股在該核苷酸序列之3'末端處及在該核苷酸序列之5'末端處進一步視情況包括反向無鹼基殘基；且該有義股亦視情況包括共價連接至該有義股之5'末端處的該反向無鹼基殘基的靶向配位體，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞及/或存在於骨骼肌細胞上之受體具有親和力，且其中該有義股進一步視情況包括PK/PD調節劑，該PK/PD調節劑共價連接至該有義股之3'末端處的該反向無鹼基殘基。
  32. 如請求項1之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑由形成雙螺旋體之有義股及反義股構成，該雙螺旋體具有表5.1、表5.2、表5.3或表5.4中之雙螺旋體中之任一者的結構。
  33. 如請求項32之RNAi藥劑，其中該有義股在該核苷酸序列之3'端處及/或5'端處進一步包括反向無鹼基去氧核糖殘基。
  34. 如請求項33之RNAi藥劑，其中全部或實質上全部該等核苷酸為經修飾之核苷酸。
  35. 如請求項32至34中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑之該有義股連接於靶向配位體。
  36. 如請求項35之RNAi藥劑，其中該靶向配位體對在骨骼肌細胞上表現之細胞受體具有親和力。
  37. 如請求項35至36中任一項之RNAi藥劑，其中該靶向配位體包含具有表6.2或表6.3中所闡述之結構的化合物。
  38. 如請求項1至37中任一項之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑為醫藥學上可接受之鹽。
  39. 如請求項38之RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑呈鈉鹽形式。
  40. 一種包含如請求項1至39中任一項之RNAi藥劑之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  41. 一種用於抑制 DUX4基因在細胞中之表現的方法，該方法包含向細胞中引入有效量之如請求項1至39中任一項之RNAi藥劑或如請求項40之組合物。
  42. 如請求項41之方法，其中該細胞在個體內。
  43. 如請求項42之方法，其中該個體為人類個體。
  44. 如請求項41至43中任一項之方法，其中該DUX4基因表現經抑制至少約40%。
  45. 如請求項41至44中任一項之方法，其中該DUX4蛋白質含量減少至少約40%。
  46. 一種治療一或多種症狀或疾病之方法，該等症狀或疾病可至少部分藉由DUX4蛋白質含量之減少、DUX4 mRNA含量之減少來改善，該方法包含向有需要之人類個體投與治療有效量之如請求項40之醫藥組合物。
  47. 如請求項46之方法，其中該疾病為FSHD。
  48. 如請求項41至47中任一項之方法，其中該DUX4基因表現在該個體之脊柱旁、面部、軀幹、腹部及四肢肌肉組織中之一或多者中減少。
  49. 如請求項41至48中任一項之方法，其中該DUX4基因表現在該個體之三頭肌、二頭肌、四頭肌、腓腸肌、比目魚肌、EDL (伸趾長肌)、TA (脛前肌)或隔膜中之一或多者中減少。
  50. 如請求項41至49中任一項之方法，其中該RNAi藥劑以約0.5 mg/kg至約10.0 mg/kg體重之劑量投與。
  51. 如請求項50之方法，其中該RNAi藥劑係藉由皮下(SQ)注射投與。
  52. 一種如請求項1至39中任一項之RNAi藥劑或如請求項40之組合物之用途，其用於治療至少部分由DUX4蛋白質含量之減少或DUX4 mRNA含量之減少或兩者介導之疾病、病症或症狀。
  53. 一種如請求項40之組合物之用途，其用於製造用以治療至少部分由DUX4蛋白質含量之減少或DUX4 mRNA含量之減少或兩者介導之疾病、病症或症狀的藥劑。
  54. 一種用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因表現之組合物，該組合物包含： i. RNAi藥劑，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之一部分至少部分互補之長度為18至49個核苷酸的反義股； ii. 連接於該RNAi藥劑之靶向配位體，其中該靶向配位體對骨骼肌細胞具有親和力；及 iii. 連接於該RNAi藥劑之PK/PD調節劑。
  55. 一種用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因表現之RNAi藥劑，其包含： i. 有義股，其包含包括與SEQ ID NO: 1之一段15個連續核苷酸相差0、1、2或3個核苷酸之至少15個連續核苷酸的核苷酸序列；及 ii. 反義股，其包含與該有義股至少部分互補之核苷酸序列。
  56. 一種用於抑制雙重同源匣4 ( DUX4)基因表現之RNAi藥劑，其包含： i. 反義股，其包含包括與SEQ ID NO: 1之一段15個連續核苷酸至少部分互補之至少15個連續核苷酸的核苷酸序列；及 ii. 有義股，其包含與該反義股至少部分互補之核苷酸序列。
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