JP2002524501A

JP2002524501A - 合成ポリアミドによるＨＥＲ２／ｎｅｕオンコジーン発現の調節

Info

Publication number: JP2002524501A
Application number: JP2000569793A
Authority: JP
Inventors: ピーターダーバン，; ジョエルエム．ゴッテスフェルド，; ジョンジェイ．ロング，
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2002-08-06
Also published as: EP1162961A2; AU768405B2; CA2344654A1; AU6496599A; WO2000015242A1; JP2002524525A; EP1112080A4; WO2000015209A2; EP1112080A1; WO2000015209A3; AU6034199A; CA2343289A1

Abstract

(57)【要約】二本鎖ＤＮＡの浅いほうの溝を結合し得るポリアミドを含む方法および組成物は、遺伝子転写および遺伝子発現の阻害および減少について記載される。このポリアミドは、標的遺伝子のプロモーター領域において二本鎖ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に特異的に接触するか、および／またはこのヌクレオチド配列に特異的に結合するように選択される、少なくとも４つの芳香族カルボキサミド残基の相補対を含む。この方法、組成物およびポリアミドは、オンコジーン転写および発現の阻害ならびに癌の処置のために開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】米国政府は、国立衛生研究所に与えられる助成金番号ＧＭ２６４５３、２７６
８１およびＡＩ２９１８２に準じて本発明において特定の権利を有する。

【０００２】（関連出願）本出願は、米国仮出願第６０／０９９，９０６号（１９９８年９月１１日出願
）（これは、十分に示されるように本明細書において参考として援用される）か
らの優先権の利益を主張する。

【０００３】（発明の分野）本発明は、一般に、ＤＮＡを結合するポリアミドの使用による、遺伝子発現の
調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）または調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）のための方
法および組成物に関する。この方法および組成物は、ポリアミドと二本鎖ＤＮＡ
（ｄｓＤＮＡ）の浅いほうの溝との間の相互作用によって遺伝子発現もしくは過
剰発現の阻害またはダウンレギュレーションを生じる。これらの方法および組成
物のポリアミドは、ダウンレギュレートまたは阻害されるべき遺伝子のプロモー
ター領域内に配置される、予め決定された標的核酸配列を結合する。望ましくな
いレベルで発現されるかまたは過剰発現される標的オンコジーンの阻害またはダ
ウンレギュレーションは、本発明の１つの適用である。特に、本発明は、標的内
因性細胞性オンコジーンの発現または過剰発現の減少に関する。

【０００４】（発明の背景）チロシンキナーゼ膜増殖因子レセプターＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｐ１８５^HER2とし
ても公知である）は、ヒト乳癌の２０〜３０％に過剰発現され、そして増幅され
る、同名の細胞性オンコジーンによってコードされる。Ｂａｅｒｔ，Ｊ．−Ｌ．
ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７０，５９０〜５９７（１９９７）；Ｂｅｎｚ
，Ｃ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１５，１５１３〜１５２５（１９９７）；Ｃｈａ
ｎｇ，Ｃ．−Ｈ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４，１６１７〜１６２２（１９９７
）；Ｓｃｏｔｔ，Ｇ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９８４８〜
１９８５８（１９９４）；Ｐａｓｌｅａｕ，Ｆ．；ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，
８４９〜８５４（１９９３）；Ｔａｌ，Ｍ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ
ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ７，２５９７〜２６０１（１９８７）を参
照のこと。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕはまた、他の状態（ヒト婦人科学的腺癌（例えば
、卵巣、子宮内膜、乳房、ファローピウス管および子宮頸の癌）を含む）におい
て過剰発現される（Ｃｉｒｉｓａｎｏ，Ｆ．Ｄ．，およびＫａｒｌａｎ，Ｂ．Ｙ
．，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．３９９〜１０５（１９
９６））。

【０００５】ｎｅｕオンコジーン遺伝子産物は、げっ歯類における化学的に誘導された（エ
チルニトロソ尿素（ｅｔｈｙｌｎｉｔｏｓｏｕｒｅａ））腫瘍において元々記載
された。続いて、ヒト対応物（ｃ−ｅｒｂＢ−２またはＨｅｒ−２／ｎｅｕ）は
、ＥＧＦレセプター（タンパク質チロシンキナーゼ活性を有する１８５ｋＤａの
膜貫通タンパク質）に相同であることが見出された。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの過剰発
現はまた、腫瘍が転移する見込みに関連し、患者に対する乏しい予後の結果を伴
う。Ｈｅｒ２／ｎｅｕオンコジーンの変異、増幅、および過剰発現は、胸部腫瘍
進行、早期転移、および乏しい予後に関連することが報告されてきた。Ｈｅｒ２
／ｎｅｕ遺伝子増幅は、リンパ節転移に直接相関付けられる。さらに、動物モデ
ルにおいて、変異を活性化すると、迅速な腫瘍進行を誘導する。Ｈｅｒ−２／ｎ
ｅｕタンパク質は、細胞運動性において役割を果たし、それゆえに転移において
役割を果たすようであると考えられている。従って、ＤＮＡレベルでの直接的な
干渉によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子発現の阻害は、転移性疾患に対する強力な
治療的アプローチであり得る。

【０００６】いくつかの転写因子（例えば、ＥＳＸ、ＡＰ−２、およびＴＡＴＡ結合タンパ
ク質（「ＴＢＰ」））は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ増殖因子レセプターに対する遺伝子
の発現の調節において重要な役割を果たす。Ｂａｅｒｔ，Ｊ．−Ｌ．ら，前出；
Ｂｅｎｚ，Ｃ．ら，前出；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．−Ｈ．ら，前出；Ｂｏｓｈｅｒ，Ｊ
．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２，７４４〜７
４７（１９９５）を参照のこと。これらの転写因子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモ
ーター内の部位への結合に際してｐ１８５^HER2の発現を活性化する。Ｈｅｒ２／
ｎｅｕプロモーターのヌクレオチド配列および概略図は、図１に示される。

【０００７】ＴＢＰは、ほとんどのタンパク質コード遺伝子の活性化に関与する遍在性の転
写因子である。ＴＢＰは、ＤＮＡの浅いほうの溝と相互作用するＤＮＡ結合タン
パク質である。ＥＳＸ、ＡＰ−２およびＴＢＰとは別に、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロ
モーター内の他の可能な転写因子結合部位が存在することに留意すること。

【０００８】かなりの試みが、治療的ストラテジーがこれらの研究から出てくるということ
を期待して、生存細胞における遺伝子発現に干渉するための方法を考案するため
に、当該分野において行われてきた。これらのアプローチは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの細胞への導入（天然のまたはペプチド核酸に基づく）によるか
、または特定のＲＮＡのリボザイム媒介破壊による、メッセンジャーＲＮＡのタ
ンパク質への翻訳の干渉を含む。遺伝子転写の直接的な阻害についてのいくつか
のアプローチもまた、試みられており；これらは、三重へリックス形成オリゴヌ
クレオチド（予め決定された配列を認識する、設計または選択されたジンクフィ
ンガーペプチド）、およびＤＮＡ結合カリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉ
ｃｉｎ）オリゴサッカリドを含む。

【０００９】遺伝子発現の干渉に基づく、成功すべき任意の治療的アプローチについて、い
くつかの基準がその治療剤によって達成されなければならない：第１に、この薬
剤は、任意の一般的な細胞毒性を保有してはならない；第２に、この薬剤は、細
胞浸透性でなければならず、そしてＤＮＡ結合薬剤の場合には、この化合物は、
核に対して一過性であり、そして細胞性染色質の状況において、高親和性および
特異性によってこれらの標的配列を結合しなければならない；および第３に、こ
の薬剤のそのＤＮＡ標的配列への結合は、遺伝子転写を干渉しなければならない
。上記に列挙される可能なアプローチの各々は、それ自体の特有の限定を有する
。例えば、三重へリックス形成オリゴヌクレオチドは、配列選択性について可能
性を有し、そしてインビトロで転写を有効に阻害し得る一方、これらの分子は、
有効な遺伝子阻害のために使用されるために必要な、乏しい細胞浸透性および浸
透化細胞を受ける。同様に、ジンクフィンガーペプチドは、遺伝子治療アプロー
チを介して、適切なウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクターを用い
て導入されなければならない。なぜなら、これらのペプチドは、細胞に直接進入
し得ないからである。対照的に、カリチェアミシンオリゴサッカリドは、細胞膜
を通過するために十分に疎水性であるが、これらの分子は、厳しく制限された配
列特異性（４ｂｐ）を保有し、そして非常に低親和性（タンパク質−ＤＮＡ相互
作用の阻害について必要な１００μＭ以上）でＤＮＡを結合する。従って、より
高い程度のＤＮＡ配列特異性および親和性を保有する、新たなクラスの細胞浸透
性分子が、実現可能な任意のヒト遺伝子治療アプローチに必要である。

【００１０】別のアプローチは、特定のＤＮＡ配列を標的にする細胞浸透性の低分子を利用
する。これらの分子は、遺伝子発現の調節に有用である。ＤＮＡ二重へリックス
において特性の配列を認識する小さな合成ＤＮＡ結合リガンドの設計は、長く存
在する化学の目標である。三重へリックス形成を介して二重へリックスＤＮＡの
深いほうの溝を認識するオリゴデオキシヌクレオチドは、高親和性および特異性
を有する広範囲の配列に結合する。オリゴヌクレオチドおよびこれらのアナログ
は、遺伝子発現を干渉することが示されてきたが、三重へリックスアプローチは
、プリントラック（ｔｒａｃｋ）に限定され、そして乏しい細胞性取り込みを伴
う。

【００１１】他の低分子もまた、ＤＮＡ結合リガンドとして興味深い。Ｗａｄｅらは、二量
体の並行するモチーフによって５’−（Ａ，Ｔ）Ｇ（Ａ，Ｔ）Ｃ（Ａ，Ｔ）−３
’配列でＤＮＡの浅いほうの溝において結合するペプチドの設計を報告した（Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，８７８３〜８７９４（１９９２））。報告
されたＭｒｋｓｉｃｈらは、設計されたペプチド１−メチルイミダゾール−２−
カルボキサミドネトロプシン（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａ
ｒｂｏｘａｍｉｄｅｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）によるＤＮＡの浅いほうの溝における
配列特異的認識について逆平行の並行するモチーフを記載する（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，７５８６〜７５９０（１９９２））。
Ｐｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．およびＷｅｍｍｅｒ，Ｄ．Ｅ．は、二次元ＮＭＲによる
２−１ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）Ａ−ｄ（ＣＧＣＡＡＡＴＴＴＧ
ＧＣ）複合体の構造的特徴付けを報告した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８６，５７２３〜５７２７（１９８９））。

【００１２】Ｄｅｒｖａｎおよび共同研究者らは、合成ピロール−イミダゾールポリアミド
が、良好な特異性および非常に高い親和性（多くの配列特異的転写因子の親和性
をさらに超える）でＤＮＡを結合することを示した（Ｔｒａｕｇｅｒら，Ｎａｔ
ｕｒｅ３８２，５５９〜５６１（１９９６））。彼らはさらに、ｎＭ未満の濃
度における設計されたリガンドによるＤＮＡの認識を記載する。ＤＮＡ認識は、
浅いほうの溝におけるイミダゾール−ピロール対またはピロール−ピロール対の
並行するアミノ酸対合に依存する。Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．ら（１９９６）は、ＤＮＡ
の浅いほうの溝におけるピロール−イミダゾールポリアミド認識のＡ・Ｔ／Ｔ・
Ａ縮重の効果を報告した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５，６１４７〜６１５
２（１９９６））。Ｗｈｉｔｅら（１９９７）は、ピロール−イミダゾールポリ
アミドによるＤＮＡの浅いほうの溝における認識に対する対合の役割を報告し（
Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．４，５６９〜５７８（１９９７））、そして浅いほうの
溝におけるポリアミド結合についての５’−３’ Ｎ−Ｃ配向選択を実証した。
従って、ポリアミド分子は、従って、浅いほうの溝におけるタンパク質−ＤＮＡ
相互作用のインヒビターとして作用する能力を有する。

【００１３】Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）アミノ酸およびＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）
アミノ酸由来の、浅いほうの溝に結合するポリアミドについての対合の役割の開
発は、配列特異性を与えるための別の手段を提供する。Ｉｍ／Ｐｙ対は、Ｇ・Ｃ
とＣ・Ｇとを区別し、そしてこれらの両方とＡ・Ｔ塩基対またはＴ・Ａ塩基対と
を区別するが、一方、Ｐｙ／Ｉｍは、Ｃ−Ｇ塩基対合を標的にする。Ｐｙ／Ｐｙ
対は、Ａ・ＴとＧ・Ｃとを特定するが、Ａ・ＴとＴ・Ａとを区別しない。配列特
異的ＤＮＡリガンドの合理的な設計に対するこのアプローチの一般性は、直接的
なＮＭＲ構造研究（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，６
４６〜６５０（１９９４））および０．０３ｎＭの適切な解離定数を有する６つ
の塩基対配列を標的にする８つの環のヘパリンポリアミドの合成における最近の
成功（Ｔｒａｕｇｅｒら，上記）によって支持されている。さらに、配列中で単
一のアミノ酸残基によって異なる２つの８環ピロール−イミダゾールポリアミド
は、配列中で単一の塩基対によって異なるそれぞれの６つの塩基対標的部位に特
異的に結合する。単一の窒素原子のＣ−Ｈとの置換は、２桁程度、特異性および
親和性を調節し得る。

【００１４】６つの塩基対配列がヒトゲノムにおいて高度に縮重するので（ヒトゲノムにお
いて、４キロベースごとに１回、すなわち、５００，０００倍、ランダムで生じ
る）、ポリアミドは、はるかに長い配列を認識するように合成されている。例え
ば、１２の環の二重ヘパリンポリアミドは、１２ｂｐ部位を標的にするように設
計され、そして結合は、再びｎＭ親和性で観察される。このような配列は、ヒト
ゲノムにおいて、１６００万塩基対ごとに１回のみ、すなわち、ほんの１２５倍
、ランダムで生じることが予測される。従って、このような分子は、インビボに
おいて遺伝子転写のインヒビターとして、および概要を述べた条件が満たされ得
る場合にはヒトの治療剤として作用する能力を有する。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、遺伝子の転写を減少することによる、遺伝子発現または過剰発現の
調節または調節のための方法および組成物に関し、そしてこれらを含む。好まし
くは、特定の個々の標的遺伝子の転写が、減少される。このような減少は、標的
遺伝子のプロモーター領域内の二本鎖（ｄｓＤＮＡ）の浅いほうの溝に結合する
か、または相互作用するポリアミドの適用から生じる。好ましくは、結合または
相互作用は、転写を阻害またはダウンレギュレートするための、プロモーター領
域内に予め決定された標的核酸配列による。

【００１６】本発明は、細胞浸透性であり、そして遺伝子転写を阻害し得る配列特異的ＤＮ
Ａ結合低分子の使用によって遺伝子の発現および過剰発現を減少する。このよう
な分子の適切な適用は、種々の疾患（癌を含む）の処置のための本質的に新たな
治療的ストラテジーを提供するために内因性オンコジーンの過剰発現を阻害し得
る。本発明の低分子は、標的遺伝子のプロモーター領域内で核酸配列に結合する
か、または相互作用するポリアミドである。好ましくは、これらの配列は、１つ
以上の転写因子によって、認識されるか、または認識されるように近接される。

【００１７】好ましくは、このポリアミドは、遺伝子の転写および発現を制御するプロモー
ター領域中の二本鎖ＤＮＡの浅いほうの溝に結合する。好ましくは、この遺伝子
の転写は、タンパク質転写因子のｄｓＤＮＡへの結合を調節することによって阻
害される。好ましい実施態様において、この転写因子は、ＥＳＸ、ＥＴＳおよび
ＴＢＰである。

【００１８】ＨＩＶ−Ｉプロモーターの転写活性の阻害に指向する以前の研究は、ポリアミ
ドがＴＢＰならびにＥｔｓファミリー転写因子の結合をブロックし得ることを実
証してきた（ＰＣＴ公開出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２４４４、現在ＷＯ９８／
３５７０２を参照のこと、これらの教示は、全体が記載されるように参考として
援用される）。原理的に、転写因子の両方のクラスは、ｄｓＤＮＡの浅いほうの
溝と接触するか、または結合するポリアミドによって阻害され得る。理論によっ
て束縛されることなく、浅いほうの溝と接触するタンパク質のＤＮＡ複合体は、
直接的な立体障害、反発または排除によって阻害され得る。あるいは、阻害は、
アロステリック効果によってであり得る。比較において、そしてまた理論によっ
て束縛されることなく、深いほうの溝と接触するタンパク質のＤＮＡ複合体は、
ＤＮＡコンホメーションにおけるポリアミド誘導変化によって抑制され得る。当
然のことながら、阻害はまた、他の手段によって（例えば、所望の部位に標的に
されるポリアミドに対するＤＮＡ切断薬剤を結合体化することによってか、また
は化学的改変ＤＮＡによって）達成され得る。

【００１９】本発明の１つの好ましい局面において、オンコジーンの発現または過剰発現が
、標的にされる。好ましくは、オンコジーンは、癌、好ましくはヒト乳癌に関与
する内因性細胞性オンコジーンである。本発明の１つのオンコジーン標的は、Ｈ
ＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子であり、これは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター領域
内で標的配列に結合するポリアミドの使用によって、ダウンレギュレートされ得
るか、または阻害され得る。好ましくは、これらの配列は、ＨＥＲ２／ｎｅｕプ
ロモーター内にある転写因子結合部位であるか、またはそれに近接する。ポリア
ミドと標的配列との間の相互作用または結合は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の転写
を阻害し得る。ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の阻害の程度は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発
現の阻害に広範にわたり得、そしてそれを含み得る。本発明はさらに、種々の腫
瘍または癌（乳癌を含む）の処置のためのポリアミドの適用を包含する。

【００２０】適切なポリアミドは、少なくとも１０⁹Ｍ^-1のｄｓＤＮＡ標的配列での結合親
和性および少なくとも約２の選択性を有する。選択性は、単一の塩基対ミスマッ
チｄｓＤＮＡ配列についての結合親和性に対する同定されたｄｓＤＮＡ標的配列
についての結合親和性の比として規定される。好ましい実施態様において、少な
くとも９０％の単一塩基ミスマッチ配列に対する選択性は、約１０より大きい。

【００２１】本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤および転写を阻害する量の本発明の
少なくとも１つのポリアミドを含む組成物を提供する。各ポリアミドは、少なく
とも４つの芳香族カルボキサミド残基の相補対を含み、この対は、ｄｓＤＮＡ標
的の同定されたヌクレオチド配列に対応するように選択される。このポリアミド
はさらに、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ−２，４−ジアミノ酪
酸および５−アミノ吉草酸からなる群より選択される少なくとも２つの脂肪族ア
ミノ酸残基、ならびに少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基を含み、このポ
リアミドは、少なくとも１０⁹Ｍ^-1の標的ｄｓＤＮＡ配列での結合親和性および
少なくとも約２の選択性を有する。この選択性は、単一の塩基対ミスマッチｄｓ
ＤＮＡ配列についての結合親和性に対する同定された標的ｄｓＤＮＡについての
結合親和性の比として規定される。

【００２２】本発明はさらに、細胞性オンコジーンの異常な発現に関連する状態を有する被
験体を処置するために適切な方法および組成物を提供する。この被験体は、好ま
しくはヒト被験体であり、特に、この被験体は、乳癌、または異常なＨｅｒ−２
／ｎｅｕオンコジーン発現に関連する他の疾患もしくは状態に罹患している。こ
の方法は、上記のようなポリアミドまたは組成物の投与を包含する。

【００２３】（詳細な説明）本発明は、遺伝子転写を減少させることによって、遺伝子の発現または過剰発
現を調整または調節するための方法および組成物に関する。この方法および組成
物は、好ましくは、オンコジーン（特に、癌（特にヒトの癌）および特に乳癌に
関与するオンコジーン）転写の阻害、に関する。

【００２４】遺伝子転写の減少は、ポリアミドと標的遺伝子のプロモーター領域内のｄｓＤ
ＮＡの浅いほうの溝との間の結合さもなくば他の相互作用から生じる。好ましく
は、このポリアミドは、プロモーター領域内の特異的な、さもなくば所定の標的
核酸配列と結合するか、さもなくば相互作用して、転写を阻害さもなくば下方調
節する。所定の配列とは、ポリアミドによる結合が所望される配列をいう。実際
の配列は、公知であり得るか、または位置または他の特徴によって同定されてい
るのみであり得る。好ましくは、その配列、または認識される配列の近位の配列
は、１つ以上の転写因子によって認識される。

【００２５】このポリアミドは、好ましくは、細胞透過性であり、そしてインビボ、インビ
トロ、または無細胞系での遺伝子転写を阻害し得る。そのようなポリアミド分子
の適切な適用を使用して、種々の疾患（癌を含む）の処置として、内因性オンコ
ジーンの発現または過剰発現を阻害し得る。

【００２６】好ましい実施態様において、このポリアミドは、標的遺伝子の転写および発現
を調節するプロモーター領域における二本鎖ＤＮＡの浅いほうの溝に結合する。
好ましい標的遺伝子は、癌形成または進行に関与する内陰性オンコジーンである
。好ましくは、この遺伝子の転写は、タンパク質（例えば、転写因子）の同じプ
ロモーター領域（これは、ポリアミドが結合または相互作用する）への結合を調
節することによって阻害される。特に好ましい実施態様において、この転写因子
は、以下の１つ以上である：ＥＳＸ、ＥＴＳおよびＴＢＰ。

【００２７】ＨＩＶ−１プロモーターにおける転写活性の阻害は、ポリアミドがＴＢＰおよ
びＥｔｓ転写因子の結合をブロックし得る（ＷＯ９８／３５７０２を参照のこ
と。これは、ポリアミド合成についての考察を包含する）。本発明は、ＴＢＰお
よびＥｔｓ転写因子の両方の活性を阻害もしくは調節するポリアミドの使用を包
含する。本発明は、ｄｓＤＮＡの浅いほうの溝と接触もしくは結合する１つ以上
のポリアミドの使用によって転写因子活性に影響を与え得る。そのような接触も
しくは結合は、妨害効果、反撥効果、アロステリック効果または他の機能によっ
て、その浅いほうの溝においてＤＮＡ転写因子複合体の形成を阻害し得る。これ
は、おそらく、ＤＮＡコンフォメーションにおけるポリアミド誘導性変化によっ
て阻害され得る、ＴＢＰのような深いほうの溝ＤＮＡ結合タンパク質とは対照的
である。

【００２８】本発明の好ましい局面において、オンコジーン、特に内因性細胞性オンコジー
ンの発現または過剰発現が標的化される。好ましくは、このオンコジーンは、ヒ
ト乳癌と関係付けられたものであり、そしてその発現または過剰発現は、そのオ
ンコジーンの領域における浅いほうの溝と接触もしくは結合するポリアミドによ
って阻害される。好ましくは、そのプロモーター領域の、接触され、または結合
された部分が転写因子結合部位であるか、またはその近位である。阻害の程度は
、好ましくは、大きな、そしてより好ましくはそのオンコジーンの過剰発現でさ
え阻害するに充分であり、ここで、その遺伝子のコピー数は、増加してい得る。

【００２９】本発明の１つのオンコジーン標的は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子であり、これ
は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター領域内の標的配列に結合するポリアミドの
使用によって下方調節もしくは阻害され得る。好ましくは、これらの配列は、Ｈ
ＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター内の転写因子結合部位であるか、またはその近位
である。これらの転写因子としては、ＴＢＰ、ＥＳＸおよびＡＰ−２が挙げられ
る。そのポリアミドとその標的配列との相互作用または結合は、ＨＥＲ２／ｎｅ
ｕ遺伝子転写の阻害をもたらす。

【００３０】好ましい実施態様において、ポリアミドは、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ乳癌オン
コジーンプロモーターに見出されるＴＡＴＡエレメントの直ぐ下流に結合するよ
うに設計された。組成物ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−(−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ
−β−ＤｐのこのポリアミドＨｅｒ２−１は、２００ｐＭの見かけ上の解離定数
で、配列５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’（ここで、この配列の５’Ａは、ＴＡＴＡ
エレメントの３’Ａである）を結合する。Ｈｅｒ２−１は、ＴＢＰの結合および
転写の有効なインヒビターである。

【００３１】本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤および転写阻害量の、少なくとも１つの
、遺伝子発現もしくは過剰発現の阻害のためのポリアミドを含む組成物を包含す
る。これらの組成物はまた、乳癌を含む、種々の腫瘍または癌の処置のために使
用され得る。本発明はさらに、そのような組成物を投与して遺伝子発現もしくは
過剰発現の阻害を生じるための方法を提供する。この方法および組成物は、好ま
しくは、細胞性オンコジーンの異常な発現に関連する状態を有する被験体を処置
するための適合される。この被験体は、好ましくは、ヒト患者、特に、癌（特に
乳癌）に罹患したヒト患者である。

【００３２】（本発明のポリアミド）本発明において使用されるポリアミドは、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−
メチルピロールカルボキサミドを含む。これらのポリアミドは一般に、三日月型
構造を有し、これは、二本鎖ＤＮＡの浅いほうの溝の相互作用および複合体化を
可能にする。ＮＭＲ研究によって、これらの化合物がＤＮＡと、２：１の比率で
、２つのポリアミドリガンドが反並行で互いに並んだ様式で整列しているモチー
フによって、結合し得ることが確認された（Ｐｅｌｔｏｎ、Ｊ．、ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、５７２３−５７２７（１９８６
）；Ｍｒｋｓｉｃｈ、Ｍ．、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８９、７５８６−７５９０（１９９２）；Ｗａｄｅ、Ｗ．Ｓ．、ら，．Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、８７８３（１９９２））。

【００３３】２つのポリアミドの結合親和性を上昇させる１つの手段は、γアミノ酪酸のよ
うなターン単位を伴ってそれらと共有結合させることである（Ｍｒｋｓｉｃｈ、
Ｍ．、ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６、７９８３（１９９４）を参照
のこと）。このようなポリアミドは、「ヘアピンポリアミド」と呼ばれる。なぜ
なら、それらは、ヘアピン様のコンフォメーションを、そのＤＮＡ複合体におい
て採るからである。そのポリアミド中のそのイミダゾールおよびピロールカルボ
キサミドの配列は、上記の核酸対を認識するカルボキサミド対のスキームに従っ
て、そのリガンドのＤＮＡ配列特異性を決定する。いくつかの場合において、１
またはいくつかのピロールカルボキサミド単位を、ＤＮＡの曲率に対するそのポ
リアミドの曲率を調整するために、β−アラニン部分で置き換えることが有用で
ある。近年、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチルピロールカルボキサミド
を含むポリアミドが真核生物細胞における遺伝子発現を阻害し得ることが示され
た（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ、Ｊ．Ｍ．、らＮａｔｕｒｅ３８７、２０３−２
０５（１９９７））。

【００３４】新規芳香族アミノ酸である、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルピロール（Ｈｐ）（
対の対向するＰｙ）を含むポリアミドが、ＤＮＡ配列において、Ａ・Ｔヌクレオ
チド対を、Ｔ・Ａヌクレオチド対から識別する能力を有することが見出された。
これらの対合規則は、直接のＮＭＲ構造研究（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ、ら（
１９９４）ＤｅｓｉｇｎｏｆａＧ・Ｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｍｉ
ｎｏｒｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２
６６、６４６−６５０）およびＸ線結晶学（Ｋｉｅｌｋｏｐｆ、ら（１９９８）
ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒＧＣｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
ｉｎｔｈｅＤＮＡｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃ
ｔ．Ｂｉｏｌ．５、１０４−１０９；Ｋｉｅｌｋｏｐｆ、ら（１９９８）Ａｓ
ｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＡ
．ＴａｎｄＴ．Ａｂａｓｅｐａｉｒｓｉｎｔｈｅｍｉｎｏｒｇ
ｒｏｏｖｅｏｆＢ−ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２、１１１−１１５）に
よって支持される。このＰｙ−Ｉｍポリアミドは、天然の真核生物ＤＮＡ結合転
写因子に相当する親和性および特異性を有する。例えば、８環ヘアピンポリアミ
ド（これは、６塩基対配列を標的化する）は、３×１０¹⁰ Ｍ^-1の見かけ上の解
離定数で結合する（Ｔｒａｕｇｅｒ、ら（１９９６）Ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａ
ｒｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎｔ
ｈｅｍｉｎｏｒｇｒｏｏｖｅｏｆＤＮＡｂｙｄｅｓｉｇｎｅｄｌ
ｉｇａｎｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ３８２、５５９−５６１）。さらに、単一のアミ
ノ酸分配列において異なる２つの８環ピロール−イミダゾールポリアミドは、単
一の塩基対分配列において異なるそれぞれの６塩基対標的に特異的に結合する。

【００３５】Ｈｐ／Ｐｙ対合において、ヒドロキシル基でのピロール上の単一の水素原子の
置換は、一桁の程度分、ポリアミドの親和性および特異性に影響を与える。単一
の窒素原子のＣ−Ｈでの置換は、２桁の程度分特異性および親和性を調節し得る
。ＰｙおよびＩｍとともにＨｐを芳香族アミノ酸残基の組合せの４つの対合（Ｉ
ｍ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ、Ｈｐ／ＰｙおよびＰｙ／Ｈｐ）において使用することに
よって、ポリアミドは、二本鎖ＤＮＡの浅いほうの溝における４つすべてのワト
ソンクリック塩基対合を選択的に識別し得る。Ｗｈｉｔｅ、ら、Ｎａｔｕｒｅ
３９１、４６８−４７１（１９９８）。

【００３６】本発明は、遺伝子発現または過剰発現を減少させるための方法および組成物に
おけるＤＮＡの浅いほうの溝に結合させるための改善されたポリアミドの使用を
包含する。ＤＮＡの浅いほうの溝における結合のためのポリアミドの調製および
使用は、当該分野において記載されている。本発明には以下が包含される：３−
ヒドロキシ−Ｎ−メチルピロールを利用してＤＮＡ結合ポリアミドのためのカル
ボキサミド結合対を提供する既存技術の改善。この改善は、Ｈｐ／Ｐｙカルボキ
サミドの結合対をそのポリアミドへ含有させて、ＤＮＡの浅いほうの溝における
Ｔ・Ａ塩基対に結合させること、またはＰｙ／Ｈｐカルボキサミド結合対をその
ポリアミドへと含有させて、ＤＮＡの浅いほうの溝におけるＡ・Ｔ塩基対に結合
させることに関する。本発明において使用されるこのポリアミドは、少なくとも
４つのカルボキサミド結合対を有する。これら結合対は、Ａ・Ｔ、Ｔ・Ａ、Ｃ・
ＧおよびＧ・Ｃの塩基対を、浅いほうの溝中で識別する。このポリアミドはまた
、γ−アミノ酪酸または別のターン単位を有して、その各々の側における多数の
カルボキサミド対合の各々を有してヘアピンループを形成させ得る。

【００３７】本発明はまた、Ｐｙ残基が置換されたβ−アラニンを含むポリアミドを包含す
る。これは、カルボキサミド結合対において通常使用されて、特定のヌクレオチ
ド対を適合させる。このβ−アラニンは、本発明の式においてβと称される。β
−アラニンは、カルボキサミド結合対のメンバーとなり、そしてヌクレオチド塩
基対に対して隣接するアミノ酸部分の水素結合を最適化するように作用する。本
発明はさらに、非Ｈｐ含有結合ついについてのβ・β結合対の置換を包含する。
従って、Ｈｐ／ＰｙおよびＰｙ／Ｈｐの他に、結合対として、Ｐｙ／Ｐｙ、Ｉｍ
／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／β、β／Ｉｍ、Ｐｙ／β、β／Ｐｙ、およびβ／β
が存在する。

【００３８】一般に、本発明のポリアミドは、遺伝子、好ましくはオンコジーンの転写を阻
害するために適切である。このポリアミドは、少なくとも４つの芳香族カルボキ
サミド残基の相補対からなり、この対は、ｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に
対応するように選択される。これらのポリアミドは、少なくとも２つの脂肪族ア
ミノ酸残基を含み、この残基は以下からなる群より選択される：グリシン、β−
アラニン、γ−アミノ酪酸および５−アミノ吉草酸ならびに少なくとも１つの末
端アルキルアミノ残基。同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応す
るように選択された芳香族性カルボキサミド残基の相補対は、以下からなる群よ
り選択される：ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｃ
／Ｇに対応するＰｙ／Ｉｍ、ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｐｙ、ヌク
レオチド対Ｔ／Ａに対応するＰｙ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ
／Ｐｙ、およびヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐ、ここで、Ｉｍは、
Ｎ−メチルイミダゾールであり、Ｐｙは、Ｎ−メチルピロールであり、そしてＨ
ｐは３−ヒドロキシＮ−メチルピロールである。上記の原則の適用によって、遺
伝子の発現または過剰発現を減少させるにおいて使用するための特定の標的核酸
配列と結合または相互作用する特定のポリアミドの設計が可能となった。

【００３９】好ましいポリアミドは、少なくとも１つのβ−アラニンを脂肪族アミノ酸残基
として含有する。好ましい実施態様において、末端のアルキルアミノ残基は、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノプロピル残基である。少なくとも２つのβ−アラニン残基
を含む適切なポリアミドが整列されて、Ａ／ＴおよびＴ／Ａの群から選択された
ヌクレオチド対に対応する相補対合残基を形成する。あるいは、対応する対は、
脂肪族アミノ酸と芳香族カルボキサミドとの間で形成され得る（例えば、Ｉｍ／
β、β／Ｉｍ、Ｐｙ／βおよびβ／Ｐｙ）。好ましいポリアミドにおいて、ヘア
ピン分子が、脂肪族アミノ酸残基（例えば、γ−アミノ酪酸）の含有によって形
成される。さらに、本発明のいくつかのポリアミドにおいて、カルボキサミド対
の少なくとも１つのＰｙがβ−アラニンによって置換される。

【００４０】適切なポリアミドは、ｄｓＤＮＡ標的配列において少なくとも１０⁹Ｍ^-1の結
合親和性、および少なくとも２つの選択性を有する。選択性は、単一塩基対ミス
マッチｄｓＤＮＡ配列についての結合親和性に対する同定されたｄｓＤＮＡ標的
配列についての結合親和性の比率として規定される。好ましい実施態様において
、単一の塩基のミスマッチ配列の少なくとも９０％に対する選択性は、約１０よ
り大きい。

【００４１】本発明の組成物において使用される各ポリアミドは、好ましくは、対がｄｓＤ
ＮＡ標的の同定されたヌクレオチド配列に対応するように選択される、芳香族カ
ルボキサミド残基の少なくとも４つの相補対を含有する。このポリアミドはまた
、好ましくは、少なくとも２つの脂肪族アミノ酸残基（この残基は、以下からな
る群より選択される：グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ−２，４−
ジアミノ酪酸および５−アミノ吉草酸）および少なくとも１つの末端アルキルア
ミノ残基を含む。このポリアミドはまた、好ましくは、少なくとも１０⁹Ｍ^-1の
標的ｄｓＤＮＡ配列での結合親和性および少なくとも約２の選択性を有する。こ
の選択性は、単一塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ配列についての親和性に対する同
定されたｄｓＤＮＡ標的配列についての結合親和性の比率として規定される。

【００４２】ポリアミドＨｅｒ２−１は、ＤＮＡ配列５’−ＡＧＡＡＴＧ−３’に結合する
ように設計され、これは、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのＴＡＴＡボックスに
直ぐ隣接する。ＤＮＡｓｅ１フットプリント分析によって、このポリアミドが
約０．２ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で所望の配列に結合することが確認された。ポ
リアミド７０はまた、ＨＥＲ２／ｎｅｕのＴＡＴＡボックスに隣接しておよび部
分的に重複して結合する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＴＡＴＡエレメントに隣接また
は重複するこれらのＤＮＡ配列に標的化されたこれらのポリアミドは、固相方法
によって合成される。

【００４３】配列組成物ＩｍＩｍ−β−ＰｙＩｍ−γ−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ
（ここで、Ｉｍはイミダゾールを表し、Ｐｙはピロールを表し、γはγ−アミノ
酪酸を表し、βはβアラニンを表し、そしてＤｐはジメチルアミノプロピルアミ
ドを表す）のポリアミドＨｅｒ−２は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＴＡＴＡエレメン
トの５’境界で配列５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’と結合する。一方、配列組成物
ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−γ−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐのポリアミド
Ｈｅｒ２−１は、ＴＡＴＡエレメントの３’境界で配列５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−
３’と結合する（図１を参照のこと）。

【００４４】配列組成物ＩｍＩｍ−β−ＩｍＩｍ−γ−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ
（ＨＩＶ−１と呼ばれる）のミスマッチポリアミドもまた、これらの研究におい
て使用された。配列組成物ＩｍＰｙＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ
のポリアミド７０は、ＴＡＴＡボックスと重複する配列５’−ＡＧＴＡＴＡ−３
’と結合するが、一方配列組成物ＩｍＰｙＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙＰｙ−β
−Ｄｐのポリアミド８６は、ポリアミド７０からの単一原子置換を有するミスマ
ッチポリアミドである。

【００４５】図１は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプロモーター領域の配列およびいくつかの転写因
子の結合部位を示す。ヘアピンポリアミドＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−γ−ＰｙＰ
ｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（Ｈｅｒ２−１）が、ＴＢＰ結合部位のすぐ下流に
結合するように合成された（図２−１、左）。ポリアミド７０およびＨｅｒ２−
Ａは、ＴＡＴＡエレメントから上流のＥＳＸ／Ｅｔｓ部位と重複する部位に結合
し（図３を参照のこと）、そしてＥｔｓ−１のＤＮＡ結合ドメインを含む組換え
ポリペプチドのＤＮＡ結合活性を阻害することが見出された。さらなるポリアミ
ドは、ＥＳＸ（これは、ＴＡＴＡエレメントに隣接するＥｔｓ部位に結合すると
考えられているＥｔｓファミリーの実際のメンバーである）の結合に指向される
（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９７）ＥＳＸ：ａｓｔｒｕｃｔｕａｌｌｙ
ｕｎｉｑｕｅＥｔｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｅａｒｌｙｄｕｒｉｎ
ｇｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ１４，１６１７−１６２２）。

【００４６】ＨＥＲ／ｎｅｕ遺伝子含有プラスミド（Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓら、「Ｔｒｉｐ
ｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓＨＥＲ−２／ｎｅｕｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２
：２４３３−２４３９（１９９３））から単離された³²Ｐ末端標識制限フラグメ
ントで行った定量的ＤＮａｓｅＩフットプリンティング実験（図２Ａ）は、Ｈｅ
ｒ２−１が、その標的配列と、約５×１０⁹Ｍ^-1の平衡結合定数で結合すること
を示した。ミスマッチポリアミドＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−γ−ＰｙＰｙＰｙＰ
ｙＰｙ−β−Ｄｐ（ポリアミド８６）は、同じ配列に約２×１０⁸Ｍ^-1の平衡結
合定数で結合した（図２Ｂ、右）。フットプリンティング実験は、このポリアミ
ドもまた、匹敵する親和性で、ＥＳＸ結合部位に対して近位の５’−ＡＧＧＡＡ
ＧＴ−３’単一塩基対ミスマッチ配列に結合することを示した。

【００４７】ＴＡＴＡボックス領域およびこれらのポリアミドの各々に対する結合モデルは
、図３に示される。この図において、ポリアミドは、それぞれの結合部位におい
て２つのＤＮＡ鎖間で模式的に示される。影を付けた円および影を付けていない
円は、イミダゾール（Ｉｍ）環およびピロール（Ｐｙ）環をそれぞれ表し；曲線
は、γ−アミノ酪酸（γ）を表し；ひし形はβ−アラニン（β）を表し；そして
Ｄｐは、ジメチルアミノプロピルアミドを表す。これらのポリアミドの各々に対
する見かけの結合親和性は、定量的ＤＮａｓｅＩフットプリント滴定によって決
定された。ポリアミドＨｅｒ２−Ａは、その一致部位と１０⁸Ｍ^-1より下のＫａ
で結合するが、一方ポリアミドＨｅｒ２−１は、５×１０⁹Ｍ^-1のＫａで結合す
る。その標的部位に対するＨｅｒ２−１のより高い親和性が与えられる場合、以
下に記載される例の大部分は、この化合物を利用した。ポリアミド７０に対する
結合定数は、以前に報告され（Ｔｒａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３８２、５５
９−５６１、１９９６におけるポリアミド２）、そして３．５×１０⁹Ｍ^-1に対
応する。ミスマッチポリアミドは、より減少した親和性で結合する。

【００４８】ＴＡＴＡエレメントに隣接して結合するさらなるポリアミドが合成された（図
７を参照のこと）。これらの化合物は、上記のような、ポリアミドＨｅｒ２−１
の変異体であり、そして、ポリアミドＨｅｒ２−１において使用される、中性の
、アキラルなγ−アミノ酪酸リンカーの代わりに、荷電したキラルターン（（Ｒ
）−２，４−ジアミノ酪酸＝Ｄ；ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−Ｄ−ＰｙＰｙ−β−
ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ、１ａ）を有するものを含む。結果として、このポリアミド
は、以下の、ポリアミドＨｅｒ２−１の２つのさらなる変異体のように二重に荷
電している：リング／β対を有するもの（ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−Ｄ−ＰｙＰ
ｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ、１ｂ）、および、ＴＡＴＡボックスまで延びる、さ
らに２つのピロールアミノ酸単位を有するもの（ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−Ｄ−
ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ、１ｃ）である。これらの化
合物の各々は、ナノモル濃度以下の親和性でそれらの標的に結合し（図７に提供
される）、そしてＴＢＰＤＮＡ結合活性の有効なインヒビターであり、ポリア
ミド１ｃは、最も強力なインヒビターである（図８）。これらの知見に基づき、
本発明者らは、これらのポリアミドが、基本的な、ＴＡＴＡ依存性転写の強力な
インヒビターであることを予測する。

【００４９】（薬学的および治療的組成物）本発明のポリアミド、およびその薬学的に受容可能な塩は、薬学的または治療
的な、組成物、処方物または調製物に処方され得る。本発明のポリアミド化合物
の薬学的に受容可能な塩は、当該分野で公知の方法によって、強いかまたは中程
度に強い、非毒性の、有機のまたは無機の酸または塩基とともに適切であるよう
に形成される。本発明に含まれる塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩
、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および
硝酸塩が含まれる。

【００５０】上記で言及したように、本発明のポリアミド化合物は、遺伝子発現または遺伝
子過剰発現を阻害する能力、多数の疾患または状態（最も著しくは癌およびとり
わけ乳癌）のいずれかの処置において利用される特性を有する。本発明の組成物
はそれ自体で活性であり得るか、またはインビボで活性型に転換される「プロド
ラッグ」として機能し得る。

【００５１】本発明の化合物、およびその薬学的に受容可能な塩は、便利な用量形態（例え
ば、カプセル、浸透したオブラード、錠剤、または注射可能な調製物）に取り込
まれ得る。固体または液体の薬学的に受容可能なキャリアが利用され得る。時限
放出のために設計された薬学的組成物もまた、処方される。

【００５２】好ましくは、本発明の化合物は、全身的に、例えば、注射によって投与される
。使用される場合、注射は任意の公知の経路、好ましくは静脈内、皮下、筋肉内
、頭蓋内、または腹腔内によってであり得る。注射剤は、溶液または懸濁液のい
ずれかの従来的な形態で、注射の前の、液体中の溶液または懸濁液のために適切
な固体形態で、または乳化物として、調製され得る。

【００５３】固体キャリアには、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、白土、ショ糖
、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムお
よびステアリン酸が含まれる。液体キャリアには、シロップ、ピーナッツ油、オ
リーブ油、生理食塩水、水、デキストロース、グリセロールなどが含まれる。同
様に、キャリアまたは希釈剤には、単独のまたはワックスを伴う、任意の長期放
出物質（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート
）が含まれ得る。液体キャリアが使用される場合、その調製物はシロップ、エリ
キシル、懸濁液、ソフトゼラチンカプセル、液体を含むカプセル、滅菌した注射
可能な液体（例えば、溶液）、例えば、アンプル、または水性もしくは非水性液
体懸濁液の形態であり得る。このような薬学的組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃ
ｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＥａｓｔｏｎＰｅｎｎｓｙｌｖ
ａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ第１８版、１９９０）に見出され得る。

【００５４】薬学的調製物は、薬化学の従来的な技術に従って作製され、その技術は、混合
、顆粒化、および圧縮のような工程を含むか、または錠剤形態について必要であ
る場合、成分の混合、充填、および溶解を含み、適切なように、経口もしくは非
経口投与（局所的投与、経皮投与、膣内投与、鼻内投与、気管支内投与、頭蓋内
投与、眼内投与、耳内投与、および直腸投与を含む）のために所望の産物を与え
る。薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化
剤、ｐＨ緩衝剤など）を含み得る。

【００５５】好ましい投与の経路は全身であるが、薬学的組成物は、局所的または経皮的（
例えば、軟膏、クリーム、またはゲルとして）；経口的に；直腸的に（例えば、
坐剤として）、非経口的に（注射によるかまたは注入によって連続的に）；膣内
に；鼻内に；気管支内に；頭蓋内に；耳内に；または眼内に投与され得る。

【００５６】局所的適用のために、本発明の化合物および組成物は、局所適用ビヒクル（例
えば、軟膏（ｓａｌｖｅまたはｏｉｎｔｍｅｎｔ））中に取り込まれ得る。活性
成分のためのキャリアは、噴霧可能であるか、または噴霧可能でない形態のいず
れかであり得る。噴霧可能でない形態は、局所適用に固有のキャリアを含み、そ
して動的な粘性を有する（好ましくは、水の粘性よりも大きい）、半固体形態ま
たは固体形態であり得る。適切な処方物には、溶液、懸濁液、乳化物、クリーム
、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、塗布剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれ
るがこれらに限定されない。所望される場合、これらは補助剤（例えば、保存剤
、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響を与えるための塩など）を用い
て滅菌または混合され得る。噴霧可能でない局所調製物のための好ましいビヒク
ルは、軟膏基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１００
０）；ＨＥＢクリームのような従来的なクリーム；ゲル；およびワセリンなど）
を含む。

【００５７】噴霧可能なエアロゾル調製物もまた、局所適用のために適切であり、ここで本
発明の化合物は、好ましくは固体または液体の不活性なキャリア物質と組み合わ
せて、圧搾ボトルにパッケージされるか、または加圧した揮発性物質（通常、気
体の噴霧剤）との混合物中でパッケージされる。エアロゾル調製物は、本発明の
化合物に加えて、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、芳香剤、および／または抗酸化剤
を含み得る。

【００５８】とりわけヒトについての好ましい局所適用のために、化合物の有効量を標的領
域（例えば、皮膚表面、粘膜、眼など）に投与することが好ましい。この量は、
一般的に、１適用あたり約０．００１ｍｇ〜約１ｇの範囲であり、これは、処置
される面積、症状または疾患の重篤度、および使用される局所ビヒクルの性質に
依存する。

【００５９】本発明の組成物は、疾患または状態を処置するために使用される１つ以上のさ
らなる化合物と組み合わせて投与され得る。癌の処置のために、ポリアミドおよ
び誘導体が、抗腫瘍剤（例えば、有糸分裂インヒビター（例えば、ビンブラスチ
ン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；葉酸インヒビター（例え
ば、メトトレキサート、プリトレキシム（ｐｒｉｔｒｅｘｉｍ）、またはトリメ
トレキサート）；代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびシトシンア
ラビノシド）；インターカレーティング抗生物質（例えば、アドリアマイシンお
よびブレオマイシン）；酵素または酵素インヒビター（例えば、アスパラギナー
ゼ）；トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エトポシド）；または生体応答
調整物質（例えば、インターフェロン））と組み合わせて与えられる。実際、本
明細書中で開示されるポリアミドアナログおよび誘導体と組み合わせる任意の公
知の癌治療剤を含む薬学的組成物は、本発明の範囲内である。

【００６０】本発明の化合物の代表的な単回用量は、体重１ｋｇあたり約１ｎｇと約１０ｇ
との間である。この用量は、好ましくは、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇと約
１ｇとの間であり、そして最も好ましくは、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと約
１００ｍｇとの間である。局所適用のために、化合物の約０．０１〜２０％濃度
、好ましくは１〜５％濃度の範囲の投薬量が示唆される。経口投与のために、約
１〜５００ｍｇの範囲の１日の全体の投薬量が好ましい。しかし、個々の処置レ
ジメに関する変数の数が大きいので、前述の範囲は示唆的なものであり、そして
これらの推奨される値からの考慮すべき可動域は予想され、そして当業者によっ
て慣用的になされ得る。

【００６１】疾患または状態を処置するための化合物の有効量または用量は、特定の疾患ま
たは状態のために認識されるインビトロ系またはインビボ動物モデルを用いて決
定され得る。癌の場合において、多くの当該分野で認識されるモデルが公知であ
り、そしてヒト腫瘍の広範なスペクトルを表す。本発明の化合物および組成物は
、ヒトまたは非ヒト動物起源の多数の腫瘍細胞株のいずれかを用いる標準的なア
ッセイを使用して培養中の腫瘍細胞増殖の阻害について試験され得る。動物モデ
ルを含むこれらのアプローチの多くは、Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．ら、「Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｆｏｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇＣｈｅｍｉｃａｌＡｇｅｎｔｓａ
ｎｄＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＡｇａｉｎｓｔＡｎｉｍａｌＴ
ｕｍｏｒｓａｎｄＯｔｈｅｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ（第
３版）」Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、第３部、３：１−１
１２に詳細に記載される。

【００６２】（投与方法）上記に示したように、本発明の処置方法は、ポリアミド含有組成物の投与に関
する。本発明のポリアミド含有調製物は、全身的にまたは局所的に投与され得、
そして単独でまたは混合物の成分として使用され得る。投与の経路は、局所的、
静脈内、経口、または移植物の使用によってであり得る。例えば、ポリアミドは
、以下を含む手段によって投与され得るがこれらに限定されない：局所的調製物
、静脈内注射または注入、経口摂取、または皮内注射もしくは移植物の形態にお
ける局所的投与。さらなる投与の経路は、従来的なまたは便利な形態におけるポ
リアミドの皮下注射、筋肉内注射、または腹腔内である。必要な場合、リポソー
ム性処方物または親油性処方物もまた使用され得る。局所的投与のために、ポリ
アミドは、標準的な局所処方物および局所組成物（ローション、懸濁液、または
ペーストを含む）中にあり得る。適切な処方物の経口投与はまた、ポリアミドが
この経路を介して標的細胞または組織に容易に投与され得る、これらの例におい
て適切であり得る。

【００６３】ポリアミドの用量は、例えば、選択されるポリアミド、それが運ばれる物理的
送達系、個々の被験体、および実施者の判断を含むがこれらに限定されない要因
に依存して、当業者によって最適化され得る。

【００６４】例えば、標的特異的リガンド（例えば、抗体またはその免疫学的に活性なフラ
グメント）と結合する場合のような、投与の形態は、当業者によって考慮される
１つの要因である。

【００６５】一般的に、用量は調製物の特異性に依存し、その結果、ポリアミドのより少な
いかまたはより多い用量が、必要とされるように投与され得る。標的組織および
細胞に高度に特異的な組成物について、体重１ｋｇあたり０．００５〜１ｍｇの
範囲の用量が示唆される。標的に対して、より特異性が低い組成物について、１
ｋｇあたり１〜１０ｍｇまでのより多い用量が所望され得る。前述の範囲は、個
々の処置レジメに関する変数の数が多く、これらの値の間の考慮すべき偏差が予
測され得るという点で、単に示唆的である。当業者は、前述の濃度を自由に変化
させ、その結果、取り込みおよび刺激／回復パラメーターは、上記に開示される
治療目的と一致する。

【００６６】ここで本発明を一般的に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照してよ
り容易に理解される。この実施例は、例示の目的のために提供され、明記されな
い限り、本発明を制限することを意図しない。

【００６７】（実施例１）（電気泳動移動度シフトアッセイ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｉｃＭｏｂｉｌ
ｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙｓ（ＥＭＳＡ））を行い、ＨＥＲ２／ｎｅｕプ
ロモーターのＴＡＴＡボックスに隣接する配列に特異的なポリアミドの種々の濃
度の添加が、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）のＤＮＡ結合活性を妨害し得る
か否かを決定した。ＨＥＲ２／ｎｅｕＴＡＴＡボックスおよびその隣接する配
列に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。第１のオリゴヌクレオチド、ＨＥ
ＲＴＡＴＡ１は、以下の配列を有する：

【００６８】

【化１】（ここでＴＡＴＡボックスは太字である）。相補的オリゴヌクレオチドである、
ＨＥＲＴＡＴＡ２は、以下の配列を有する：５’−ＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡ
ＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣ−３’。これらの相補的な３５
塩基オリゴヌクレオチドを、γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで５’末端標識し、次いでアニーリングさせて、二本鎖の３５塩基対オリゴ
ヌクレオチドを得た。次いで、このオリゴヌクレオチドを電気泳動移動度シフト
アッセイにおいて用いた。このアッセイは、４４ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐ
Ｈ８．３、１ｍＭＥＤＴＡとともに、４ｍＭＭｇＣｌ₂および０．０２％（
ｖ／ｖ）ＮＰ−４０非イオン性界面活性剤を含有する、５％の非変性ポリアクリ
ルアミドゲル（２９：１アクリルアミド対ビスアクリルアミド）を使用する。
０．１ｍＭの濃度の標識したオリゴを、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ−ＯＨ、ｐＨ７．９、２５ｍＭＫＣｌ、０．０２５％ＮＰ−
４０（ｖ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０．５ｍＭジチオ
スレイトール、０．８ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭ
ｇＣｌ₂を含有する、２０μｌの反応容積でＴＢＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１ｎＭ
の最終濃度と反応させた。

【００６９】種々の濃度のこの異なるポリアミド（０．１ｎＭ〜３０ｎＭの範囲にわたる）
をこの結合反応物に添加した。反応物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
し、そして乾燥したゲルを、引き続き画像化し、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソ
フトウェアを備えるＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｍａｇｅｒを用いて数量化した。結果を図４に示す。ＨＥＲ２／ｎｅｕ−特異
的ポリアミド（ポリアミドＨＥＲ２−１（図４Ａ）、７０（図４Ｂ、四角）、お
よびＲＰＲ７０（ＩｍＰｙＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−ＲＰＲの構成
である）（図４Ｂ、ｘ’ｓ））は、ＨＥＲ２／ｎｅｕＴＡＴＡボックスへのＴ
ＢＰ結合をインビトロで有意に減少する。コントロールポリアミド８６（図４Ｂ
、丸）（ＨＥＲ２／ｎｅｕＴＡＴＡボックスに特異的でない）は、ＨＥＲ２／
ｎｅｕＴＡＴＡボックスへのＴＢＰの結合にほとんど効果がない。

【００７０】「ＲＰＲ」は、ポリアミド上の荷電したアルギニン−プロリン−アルギニンテ
イルの存在を示す。

【００７１】（実施例ＩＩ）（無細胞系でのインビトロ転写の阻害）転写の鋳型を生成するために、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター（Ｅｂｂｉｎｇ
ｈａｕｓら（１９９３））を含有する、プラスミドｐＧＥＭ／ＨＮＰを、制限エ
ンドヌクレアーゼＤｒａＩを用いて線状化した。この鋳型は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ
プロモーターの２７０塩基対、および下流配列の４００塩基対を含んだ。供給業
者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の推奨のように、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および２μｌ
のＨｅＬａ細胞核抽出物を含有する２０μｌの反応液中で、２５μｌの反応容積
中で、転写反応を実行した。これらの反応物を、３０℃で１時間、０．６ｍＭの
未標識のヌクレオシド三リン酸および２０μＭのＧＴＰとともに１０μＣｉ α
−３２Ｐ−ＧＴＰの存在下で、インキュベートした。標識した転写物を、供給業
者（Ｔｅｌｔｅｓｔ）により推奨されるようにＲＮＡｚｏｌを用いて精製し、そ
して８．３Ｍ尿素および８８ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３、２ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する８％ポリアクリルアミドゲル上で変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供した。

【００７２】乾燥したゲルを画像化し、そしてｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。このＨＥＲ２／ｎｅｕプロモ
ーター鋳型からのインビトロ転写は、漸増する量のポリアミドＨＥＲ２−１の添
加により阻害された（図５）。１０ｎＭＨＥＲ２−１の添加は、ポリアミドの
添加のない反応に比べて、効果を有さなかったが、１００ｎＭの添加は、転写を
１／２に抑制した。転写の鋳型として無関係のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモーターを用いるインビトロ転写をまた、コントロールとして行った。この
鋳型に対する１０ｎＭまたは１００ｎＭのポリアミドＨＥＲ２−１の添加は、
転写のレベルを有意に低下させなかった。

【００７３】（実施例ＩＩＩ）（細胞培養におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の阻害）多数の乳癌細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎから入手し、そして細胞培養中で維持した。これらの細胞株として
は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子が増幅されそして非常に過剰発現されている乳癌細
胞（ＳＫ−ＢＲ−３およびＺＲ７５−１）、ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子
の正常なコピー数を有し、そして正常な低いレベルでＨＥＲ２／ｎｅｕを発現す
る乳癌細胞（Ｈｓ５７８Ｔ）が挙げられる。３７℃での５％ＣＯ₂／空気混合気
中でのこれらの細胞の増殖期に、ウシ胎仔血清を１０％（ｖ／ｖ）補充した適切
な細胞培養培地に、種々の濃度のポリアミドを直接添加した。最初の実験のため
に、ポリアミドＨＥＲ２−１を種々の濃度で培地に添加した。コントロールのポ
リアミド（ＨＩＶ−１）を、異なるフラスコの細胞に種々の濃度で添加した。ポ
リアミドＨＩＶ−１は、ＨＥＲ２−１に類似の構造であるが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ
ＴＡＴＡボックスまたはその隣接配列を特には認識しない。

【００７４】引き続く実験では、細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を、６日間ポリアミドで処理した。
これらの実験では、別々の実験でポリアミドＨＥＲ２−１およびポリアミド７０
を、最終濃度０．５μＭになるよう細胞培養培地に添加した。３日のインキュベ
ーション後、新鮮培地および新鮮なポリアミドを細胞に添加した。これらの細胞
をさらに３日間インキュベートし、次いでＲＮＡ抽出のために収集した。

【００７５】この細胞が、７５ｃｍ²培養フラスコ中で一旦コンフルエンスに増殖すると、
２ｍｌの０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
）を用いて付着した細胞を処理して、培養フラスコからこの細胞を剥離すること
により、ポリアミド処理した乳癌細胞を収集した。これらの細胞を、５０００ｒ
ｐｍ（ＩＥＣ）の臨床的遠心分離により収集し、そしてペレット化した。この細
胞を冷却した１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、そして臨床的
遠心分離でペレット化した。全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ（Ｔｅｌｔｅｓｔ）を用
いて細胞から抽出した。詰めた細胞の容積、約１００μｌに対して、１ｍｌのＲ
ＮＡｚｏｌおよび１００μｌのクロロホルムを添加した。この混合物を１０秒間
ボルテックスし、そして１０分間氷上に置いた。次いでこの混合物を、遠心分離
機中で４℃、１４，０００ｇで１５分間回転させた。上層を取り出し、そして全
ＲＮＡを、１容積のイソプロパノールで沈殿させた。このＲＮＡペレットを７０
％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥し、そして１μｌのＲＮａｓｉｎ（４０単
位）を含有する、５０〜１００μｌの無ＲＮＡｓｅ水（ＤＥＰＣ処理）に再懸濁
した。

【００７６】ポリアミド添加の効果を、ＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡの相対的レベルについ
てのアッセイとして逆転写酵素（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用
いて、引き続き分析した。これらのＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡレベルは、ＨＥ
Ｒ２／ｎｅｕプロモーターからの、転写の量に関連するはずである（これは、ポ
リアミドＨＥＲ２−１がインビボで転写に何らかの効果を有するか否かを決定し
得る）。ＨＥＲ２／ｎｅｕオンコジーンに特異的なＰＣＲプライマーを用いた場
合、ＰＣＲ産物は、ＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡの相対的レベルを反映する、Ｈ
ＥＲ２／ｎｅｕｃＤＮＡに相当する。このＰＣＲプライマーは、以下であった
：（Ｈｅｒ２Ａ）５’−ＧＣＴＧＧＣＣＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴ−３
’および（Ｈｅｒ２Ｂ）５’−ＧＴＴＣＴＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴ
ＴＴ−３’、そしてそれぞれの５０ｎｇを以下に記載の様にＰＣＲ反応に用いた
。

【００７７】種々の細胞由来のＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡの相対的な量は、逆転写酵素（
ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて決定され得る。全ＲＮＡを上
記のようにポリアミド処理乳癌細胞から抽出した後、それぞれの異なる細胞型お
よびポリアミド濃度について、分光光度法（２６０ｎＭでの光学密度を用いて）
により、全ＲＮＡの濃度を決定する。等量の全ＲＮＡ（１０ｎｇ）を、各ＲＴ−
ＰＣＲについて用いる。ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓ
ｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。オリゴｄ
Ｔプライマーを用いて、推奨されるように、酵素リバーストランスクリプターゼ
により、４２℃で２５分間、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する。次いで、こ
れらのｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いる。このキットに提供される緩衝液お
よびＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを以下の２６サイクルで実行した：９
４℃４５秒間の変性、６０℃４５秒間のアニーリング、および７２℃２分間の伸
長。５μＣｉの放射活性ヌクレオチドα−³²Ｐ−ｄＡＴＰをＰＣＲ工程に含み、
アクリルアミドゲル上で分析し得かつオートラジオグラフィーで可視化し得る、
放射線標識したＰＣＲ産物を生成する。ＰＣＲ産物の相対的な量は、Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｉｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量し
得る。ポリアミドで処理していない細胞由来のＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡのレ
ベルが陽性コントロールであり、かつ１．０の値であり、そしてポリアミド処理
サンプルについてのＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡのレベルは、未処理の細胞の値
に対する値である。

【００７８】これらのＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を図６に示す。ポリアミドＨＥＲ２−１
での１〜２日間の細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＨｓ５７８−Ｔの処理の結果、Ｈ
ＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡの相対的レベルの１／２よりわずかに大きいレベルま
での低下が生じた。コントロールポリアミドＨＩＶ−１は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ
ｍＲＮＡの相対的なレベルに対して明白な効果を有さなかった。ＳＫ−ＢＲ−３
細胞をポリアミドＨＥＲ２−１または７０のいずれかで６日間処理した場合、ｍ
ＲＮＡの相対的レベルは、１〜２日間処理した細胞よりも有意に低下した。ＳＫ
−ＢＲ−３細胞は、それぞれ、ポリアミドＨＥＲ２−１または７０で処理した場
合、ＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡの相対的レベルの１／４および１／３までの低
下を示した。これらの結果は、このポリアミドが、この細胞に進入し、そしてそ
の所定の標的ヌクレオチド配列に結合し得、これによりその遺伝子の発現を妨害
することを示唆する。

【００７９】（実施例ＩＶ）（ＲＮアーゼプロテクションアッセイ）培養中で維持された、ポリアミド処理した乳癌細胞、およびコントロールの未
処理の乳癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡのレベルをモニターする
ため、特異的リボプローブを用いるＲＮアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ
）を用いた。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡ特異的放射線標識リボプローブを合
成するため、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡコード配列のセグメントをＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に挿入した。このリボプローブのＨｅｒ
−２／ｎｅｕｍＲＮＡに対する特異性を示すために、そして得られたシグナル
により、乳癌細胞から単離された総ＲＮＡにおけるＨｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮ
Ａの相対的レベルの定量的に信頼のおける評価が得られたことを確認するために
コントロール実験を行った。ＲＰＡ中の試験ＲＮＡの量を変化することで、ホス
ホルイメージ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅ）分析により決定した場合、線形の
応答シグナルを生じた。さらに、一連の市販のＤＮＡ鋳型を用いて、非標的遺伝
子上のポリアミド処理の効果をモニターするためのリボプローブを合成した。こ
れらの遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子（リボソームタンパク質Ｌ３２
、ＧＡＰＤＨ）、アポトーシス関連遺伝子（ｂｃｌ−ｘ，ｂａｘ）、ストレス誘
導性遺伝子（ｍｃｌ１、ＧＡＤＤ４５）、オンコジーン（ｃ−ｆｏｓ）、腫瘍サ
プレッサー遺伝子ｐ５３、および細胞周期調節タンパク質遺伝子ｐ２１が挙げら
れる。

【００８０】これらのプローブを用いて、コントロール遺伝子についてのｍＲＮＡレベルは
、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡ発現を阻害するポリアミドの濃度により影響さ
れないことを見出した。この実験に用いたポリアミド（１ｂ；ＩｍＰｙ−β−Ｐ
ｙＩｍ−Ｄ−ＰｙＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ）を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＴＡ
ＴＡエレメントにすぐ隣接し、そして重複する配列に結合するように、設計し（
上記図７参照のこと）た。そして、これはＤＮａｓｅＩフットプリント分析に
より決定される場合０．２６ｎＭのみかけの解離定数を示す。細胞を７２時間種
々の濃度のポリアミドとともにインキュベートし、次いで、細胞総ＲＮＡを単離
した。次いで、コントロール細胞および処理細胞からの等量のＲＮＡをリボプロ
ーブプロテクションアッセイに用いた。ポリアミド１ｂは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ
遺伝子が、正常な乳癌組織に対して５０倍のオーダーで過剰発現する乳癌細胞株
ＳＫ−ＢＲ−３におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡ合成の効果的なインヒビ
ターであることが見出された。０．３μＭのポリアミド１ｂ濃度で、転写の約７
０％の阻害が観察された。ポリアミドの濃度が高いほど、より高いレベルの阻害
を生じることが観察されている（示さず）。

【００８１】コントロール遺伝子ｍＲＮＡ合成の阻害の欠如は、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の
ポリアミド処理がアポトーシスまたはストレス関連応答を誘導しないことを強く
示す。さらに、ポリアミド処理は、細胞増殖または細胞密度に影響せず、そして
細胞傷害性は観察されていない。コントロール実験において、ポリアミド処理の
存在または非存在における肝細胞の画分は、トリパンブルー染色により検出され
た。培養培地中における、３μＭの最終濃度までのポリアミド１ｂでの乳癌細胞
株ＳＫ−ＢＲ−３の処理は、細胞生存度に影響がないことが見出された。

【００８２】（実施例Ｖ）（ポリアミド安定性）放射線標識したピロール−イミダゾールポリアミドの取り込みおよび安定性を
、培養中で維持した乳癌細胞においてモニターした。この実験で用いたポリアミ
ドは、トリチアトール（ｔｒｉｔｉａｔｏｌ）基がＤｐの代わりに末端で組み込
まれたことを除けば、転写実験で用いたポリアミドと類似の構造である、八環系
化合物（ＩｍＰｙＰｙＰｙ−Ｄ−ＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−ＣＴ₂ＯＨ、ここでＣ
Ｔ₂ＯＨはトリチアトールである）であった。これらの実験を、２つの異なる乳
癌細胞株（ＭＣＦ−７およびＺｒ−７５−１）で実行し、そして質的に類似の結
果を得た。細胞の核および細胞質部分のポリペプチド濃度を、固定した７２時間
のトリチウム化した種々の濃度のポリアミドとのインキュベート後に評価した。
これらのデータは、上記のＲＰＡ実験について用いたのと同じプロトコール下で
得られた。この結果は、濃度依存性様式で、細胞核におけるポリアミドの高濃度
を示す。別の分析で、ＺＲ−７５−１細胞およびＭＣＦ−７細胞へのポリアミド
移入の時間経過を行った。この実験では、細胞質画分をさらに細胞質ゾルおよび
膜に分画し、そして核の画分を、可溶性の核質および不溶性のクロマチンに分画
した。これはポリアミドがクロマチンにおいて非常に富んでいるという予期した
結果を得た。

【００８３】この化合物なしでの、培養培地中でのインキュベーション後、細胞中のトリチ
ウム化したポリアミドの安定性もまた、モニターした。この実験では、０．１μ
Ｍの放射線標識したポリアミドを含有する培養培地中で、細胞を最初に２４時間
インキュベートした。このインキュベーション後、培養培地を取りだし、そして
ポリアミドを欠く新鮮培地を添加した。血清濃度を０．１％まで低下し、ポリア
ミド非存在下での引き続くインキュベーションの間の細胞増殖を阻害した。細胞
を６日間まで２４時間間隔で回収した。本発明者らは、細胞質のポリアミドの量
が２４時間後半分低下し、一方で、クロマチン結合ポリアミドがより安定である
らしいことを見出す。類似の結果がＺＲ−７５−１細胞で得られた。さらなる実
験により、細胞処理の間ポリアミドの化学組成においてなんらかの変化（例えば
、分解、または他の分子への放射性同位体の組み込み）が存在するか否かを決定
する。まとめると、これらの結果は、ピロール−イミダゾールポリアミドが、細
胞透過性であり、そして核に濃縮されており、そしてクロマチンに結合している
ことを示唆する。クロマチンで見出されるポリアミドの高いレベルにより、この
化合物は、短いポリアミド標的配列（ゲノム中に数百万回出現する）と仮定して
期待されるように、ヒトゲノムにおける複数の部位に結合することが示される。
細胞傷害性の非存在は、複数の部位がポリアミドにより占有されるが、全ゲノム
中にわたる転写への有害な非特異的効果は存在しないことを示唆する。それにも
かかわらず、本出願に記載されたように、より複雑なＤＮＡ配列を標的するよう
に設計されたプロモーター特異的であるはずのポリアミドを用いて、将来の研究
を実施する。

【００８４】（実施例ＶＩ）（細胞運動性アッセイ）ＶｉｔｏＱｕａｒａｎｔａ博士（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＴｈｅＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ）の研究室と協働して、ＭＣＦ−７乳癌細胞の運動性に対するポリアミド処
理の効果をインビトロでモニターした。このアッセイは、タンパク質被覆膜への
細胞の付着、およびその膜を通っての細胞の引き続く移動をモニターする。この
膜を通って細胞が移動する能力を、細胞の転移能力の指標ととらえる。コントロ
ール実験において、ポリアミド処理は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−５または
フィブロネクチンのいずれかで被覆した膜への細胞の付着の能力に影響しないこ
とが検出された。ＭＣＦ−７細胞を、別の実験でポリアミドＨｅｒ２−１または
７０で処理した場合、定常状態Ｈｅｒ−２／ｎｅｕｍＲＮＡにおいて約５０％
の低下が培養３日後に観察された。この阻害値は、これらのポリアミドでの他の
乳癌細胞株の３日間の処理についての本発明者らの結果と一致している。すでに
述べたように、コントロールのミスマッチポリアミドは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ
ｍＲＮＡレベルに対して影響を有さなかった。膜を横切るこれらの細胞の移動は
また、ポリアミドＨｅｒ２−１またはＨｅｒ２−Ａでの処理（培養培地中で０．
５μＭ）により５０％阻害されたが、ポリアミド８６は、類似の濃度で細胞移動
に影響しなかった。これらの知見は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−５およびフ
ィブロネクチンで被覆した膜で得られた。これらの予備的実験は、Ｈｅｒ−２／
ｎｅｕｍＲＮＡ（従って、タンパク質）のダウンレギュレーションが、ＭＣＦ
−７の運動性を減少し得ることを示唆する；しかし、運動性の消失とＨｅｒ−２
／ｎｅｕタンパク質レベルとの間の直接の関係は、将来の実験において得なけれ
ばならない。

【００８５】（引用文献）

【００８６】

【表１】本明細書において引用されるすべての引用文献は、以前に詳細に援用されたか
否かにかかわらず、その全体が参考として本明細書において援用される。

【００８７】いまや本発明を完全に記載したが、本発明が、本発明の精神および範囲から逸
脱することなく、そして過度の実験なく、広範な等価のパラメーター、濃度およ
び条件内で実行され得ることは、当業者には明らかである。

【００８８】本発明は、その特定の実施態様と連関して記載されてきたが、さらなる改変が
なされ得ることが理解される。本出願は、本発明の任意の変化、用途または適応
を含むことを意図する。これは、一般に、本発明の原理に従い、そして本発明が
属する当該分野で公知かまたは慣用的実施内であるような本開示からの逸脱およ
び上記の添付の特許請求の範囲のように記載された後の本明細書上記における必
須の特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕプロモーターを示す。これは、Ａにおいてヌクレオ
チド配列（これは、Ｅｔｓ，Ａｐ−２およびＴＢＰ（「ＴＡＴＡ」）転写因子な
らびに「ＣＣＡＡＴボックス」を含む）、ならびにＢにおいて、模式図を示す（
スケーリングはしていない）。

【図２】図２Ａは、ポリアミドＨＥＲ２−１（左）のＤＮａｓｅＩフットプリント力価
決定およびミスマッチポリアミドＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−γ−ＰｙＰｙＰｙＰ
ｙＰｙ−β−Ｄｐ（右）の結果の代表図であり、そして、図２Ｂは、そのポリア
ミドの模式的構造および会合状態であり、ここで、そのポリアミドは、イミダゾ
ール環については黒丸、ピロール環については白丸、γ−アミノ酪酸について曲
線、β−アラニンについてひし形、そしてジメチルアミノプロピルアミドについ
て正電荷を有する半丸で示す。

【図３】図３は、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターの配列ならびにポリアミド構造および
結合部位を比較し；ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）についての結合部位を、
ポリアミドＨＥＲ２−Ａ、ＨＥＲ２−１、７０、およびミスマッチポリアミド８
６の構造とともに示す。

【図４】図４は、ポリアミドＨｅｒ２−１（Ａ）および７０のＴＢＰ結合に対する効果
を示す実験の結果のグラフ図である。

【図５】図５は、無細胞系におけるインビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ転写に対するポリ
アミドＨＥＲ２−１の効果を示す実験の結果のグラフ図である。

【図６】図６は、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−２におけるＨＥＲ２／ｎｅｕｍＲＮＡ
産生に対するポリアミドＨＥＲ２−１および７０のの効果を示す実験の結果のグ
ラフ図である。

【図７】図７は、ポリアミド１ａ〜１ｃについての結合モデルを示す。Ｈｅｒ−２／ｎ
ｅｕＴＡＴＡエレメントおよび隣接配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列が示され、こ
こでは、ＴＡＴＡエレメントがボックスで囲まれている。ポリアミドは、それぞ
れの結合部位において２つのＤＮＡ鎖の間で模式的に表されている。黒丸および
白丸は、それぞれＩｍおよびＰｙの環を表し、菱形はβ−アラニン（β）を表し
、そして曲線は、γ−アミノ酪酸（γ）を表す。荷電キラルターン（（Ｒ）−２
，４−ジアミノ酪酸）を、プラス印で、末端のジメチルアミノプロピルアミドと
同様に示す。各ポリアミドについての平衡会合定数は、定量的なＤＮａｓｅＩフ
ットプリンティングによって決定され、そして示されている。

【図８】図８は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕＴＡＴＡエレメントおよび隣接配列に対応する
３５ｂｐのオリゴヌクレオチドに対するＴＢＰ結合のポリアミド阻害を示す。Ｅ
ＭＳＡの結果を、ホスホルイメージ分析により決定し、そしてポリアミドＨｅｒ
２−１（ポリアミド１として示す）、１ａ、１ｂ、１ｃおよびミスマッチポリア
ミド４（ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−(−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−Ｄｐ）に
ついてのポリアミド濃度の関数としての、残りの結合複合体の割合としてプロッ
トする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＡ (72)発明者ダーバン，ピーターアメリカ合衆国カリフォルニア 91108，サンマリノ，セントアルバンズロード 1235 (72)発明者ゴッテスフェルド，ジョエルエム．アメリカ合衆国カリフォルニア 92037，ラホヤ，ノーストーリーパインズロード 10550 (72)発明者ロング，ジョンジェイ．アメリカ合衆国ニューヨーク 14150，トナワンダ，デクスターストリート 158 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 FA03 MA01 MA04 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オンコジーンの発現または過剰発現に関連する状態を有する
被験体を処置する方法であって、該方法は、薬学的に受容可能な賦形剤および転
写を阻害する量の少なくとも１つのポリアミドを含む組成物を投与する工程を包
含し、該ポリアミドは、以下：ｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するように選択される、少なくとも
４つの芳香族カルボキサミド残基の相補対、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸および５−アミノ吉草酸からなる群
より選択される、少なくとも２つの脂肪族アミノ酸残基、ならびに少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基、を含む、方法。
【請求項２】前記被験体がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記オンコジーンが、細胞性オンコジーンまたは内因性オン
コジーンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記オンコジーン
の前記転写の阻害が、ＥＳＸ、ＥＴＳおよびＴＢＰからなる群より選択されるタ
ンパク質因子のｄｓＤＮＡへの結合を調節することによる、方法。
【請求項５】前記状態が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ポリアミドが、少なくとも１０⁹Ｍ^-1の標的ｄｓＤＮＡ
配列での結合親和性および少なくとも約２の選択性を有する、請求項１に記載の
方法。
【請求項７】請求項１に記載の方法であって、前記ｄｓＤＮＡ標的のヌク
レオチド配列に対応するように選択される芳香族カルボキサミド残基の相補対が
、以下：ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｃ／Ｇに対応するＰｙ／Ｉｍ、ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＰｙ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ／Ｐｙ、およびヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐ、からなる群から選択され、ここで、ＩｍはＮ−メチルイミダゾールであり、ＰｙはＮ−メチルピロールで
あり、そしてＨｐは３−ヒドロキシＮ−メチルピロールである、方法。
【請求項８】少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基がβ−アラニンである
、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記ポリアミドがヌクレオチド対Ａ／Ｔまたはヌクレオチド
対Ｔ／Ａに対応する残基の相補対を形成するβ−アラニン残基を２つ含有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記末端アルキルアミノ残基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノプ
ロピル残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】カルボキサミド対の少なくとも１つのＰｙがβ−アラニン
によって置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記ポリアミドが、ポリアミドＨｅｒ２−１、ポリアミド
７０、およびポリアミドＲＰＲ７０からなる群より選択される、請求項１に記載
の方法。