JP2024506099A - 細胞透過性のペプチド複合体およびその使用方法 - Google Patents

細胞透過性のペプチド複合体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体であって、ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個のカチオン性ドメイン、および少なくとも３個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個の疎水性ドメインを含み、但しペプチドは、合計７～４０個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、オリゴヌクレオチドは、合計１２～４０個の連続した核酸塩基を含み、少なくとも１２個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子の標的配列に相補的である、複合体を開示する。

Description

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのペプチド複合体、それを含む組成物、およびその使用方法に関する。
核酸薬は、ヒトにおける医療を変容させる可能性を秘めたゲノム薬である。研究からは、そのような治療薬が神経筋疾患を含む広範囲の疾患領域にわたり適用され得ることが示唆されている。プレｍＲＮＡスプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの方法が、神経筋疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に適用されるようになり、この単一遺伝子障害はプレシジョン・メディシンの最先端に置かれている。
しかし、これらの有望なアンチセンス治療薬の治療上の開発は、不十分な細胞透過度と不十分な分布特性が原因で妨げられてきた。この課題は、ＤＭＤでは、筋組織基質が大量であることと、その分散特性とによりさらに重要視されている。
ＤＭＤは、３５００人に１人の新生男児が罹患している。この重篤なＸ連鎖劣性疾患は、ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子内の変異によってもたらされる。この障害は、呼吸不全と心臓の合併症の出現を伴った進行性の筋肉変性および萎縮を特徴としており、最終的には早死につながる。ＤＭＤの根底にある変異の大部分は、オープンリーディングフレーム内の早期トランケーションを誘発するゲノムのアウトオブフレーム欠失であり、これがジストロフィンタンパク質を欠乏させる。
エクソンスキッピング療法は、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を利用してＤＭＤ転写物の特定領域を標的とし、個々のエクソンの排除を誘導し、異常リーディングフレームを回復させ、内部的に欠失されているが部分的には機能するジストロフィンタンパク質の生成をもたらす。ＤＭＤに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピング療法の可能性は疑う余地がないにもかかわらず、このアプローチの適用の成功は、現在のところ、骨格筋のターゲッティングが比較的非効率であること、ならびに、心臓などの他の罹患組織への一本鎖オリゴヌクレオチドの標的化が不十分であることによって制限されている。
２０１６年９月に、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、第５１番エクソンのスプライシングのモジュレーターである、「ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ」を早期承認した。これは、スプライシングを調節する、最初に米国ＦＤＡ承認されたオリゴヌクレオチドの先駆けとなったが、ジストロフィンの回復レベルは、正常なジストロフィンレベルの約１％であり、期待外れであった。対立遺伝子障害のベッカー型筋ジストロフィーとの比較と、ｍｄｘマウスにおける実験からは、運動による損傷から筋肉を保護するためには、少なくとも約１５％の野性型の均一な筋線維鞘ジストロフィン発現が必要であることが示唆されている。
そのため、ＤＭＤなどの破壊的な遺伝性疾患に対する新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドをベースとした治療法が必要とされている。
大略的には、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩を提供する。オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番エクソン，第５１番エクソン，または第５３番エクソンの内または近位の標的配列に相補的である。
一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩であって、
前記ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個のカチオン性ドメインと、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個の疎水性ドメインとを含み、ただし前記ペプチドは、合計７～４０個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、
前記オリゴヌクレオチドは、合計１２～４０個の連続した核酸塩基を含み、ただし少なくとも１２個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子中の標的配列に対して相補的であることを特徴とする複合体またはその薬学的に許容される塩を提供する。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第４５番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第４５番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されている。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表１中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか１つ選択される少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表１中のいずれか１つの配列またはそのチミン置換型を含む。
いくつかの実施形態では、表１中の前記配列は、５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）である。
いくつかの実施形態では、表１中の前記配列は、５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）である。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第５１番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第５１番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されている。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表２中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか１つ選択される少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表３中のいずれか１つの配列またはそのチミン置換型を含む。
いくつかの実施形態では、表２中の前記配列は、５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（配列番号１３０）である。
いくつかの実施形態では、表２中の前記配列は、５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）である。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第５３番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第５３番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されている。いくつかの実施形態では、表３中のいずれか１つの配列である少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表３中のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、表３中の前記配列は、５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）である。
いくつかの実施形態では、表３中の前記配列は、５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）である。
いくつかの実施形態では、前記スプライス部位はアクセプタースプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記スプライス部位はドナースプライス部位である。
いくつかの実施形態では、前記配列は、ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０）である。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドはアミノヘキサン酸（Ｘ）残基を含まない。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは６－アミノヘキサン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは天然アミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、４アミノ酸残基から１２アミノ酸残基の間、好ましくは４アミノ酸残基から７アミノ酸残基の間の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、大多数のカチオン性アミノ酸を含み、好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基、および／またはセリン残基を含み、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインが、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および／またはセリン残基からなる。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび／またはヒスチジンリッチであり、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは２つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のうちの１つまたはその任意の組合せを含み、
好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、１つの以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）またはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは３アミノ酸から６アミノ酸の間の長さを有し、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは５アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基およびグルタミン残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基および／またはグルタミン残基からなる。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは１つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはその任意の組合せを含み、前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインおよび１つの疎水性ドメインからなり、好ましくは、前記ペプチドは、２つのカチオン性アームドメインに挟まれた１つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、およびＲ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）から選択される配列をそれぞれ含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、およびＷＷＰＷ（配列番号２６）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）、ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）、ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のうちの１つからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのＮ末端を通して前記複合体の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態では、前記ペプチドのＮ末端は－ＮＨ２である。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのＣ末端を通して前記複合体の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのＮ末端はアシル化されている（例えば、Ｎ末端に、アセチル基、またはＮＨ２－もしくはＡｃＮＨ－を有するアミノ酸残基を有している）。
好ましくは、アミノ酸残基がペプチドのＮ末端に存在する場合には、それ以外の場合に存在する－ＣＯＯＨの代わりに－ＣＯＮＨ２が含まれる。
いくつかの実施形態では、前記複合体は以下の構造：
［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は以下の構造：
Figure 2024506099000001
 または
Figure 2024506099000002


を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は以下の構造：
［ペプチド］－［リンカー］－［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］
を有する。
いくつかの実施形態では、各リンカーは、独立して、下記式（Ｉ）による構造を有する：
Ｔ１－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｔ２ （Ｉ）
｛ここで、
Ｔ１は、前記ペプチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
Ｔ２は、オリゴヌクレオチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
ｎは、１、２又は３であり；
各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、
Ｙ１は、不在か、又は式：
－［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれ、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｎ（ＲＡ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＡ４ＲＡ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＡ４及びＲＡ５は、それぞれ独立して、水素および（１－４Ｃ）アルキルからなる群から選択される）から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］
で示される基であり；
各Ｒ２は、独立して、式：
－Ｙ２－Ｘ２－Ｚ２
［ここで、
Ｙ２は、不在か、又は式：
－［ＣＲＢ１ＲＢ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれる整数であり、ＲＢ１及びＲＢ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
Ｘ２は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（ＮＲＢ３）Ｎ（ＲＢ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＢ３）－、又は－Ｎ（ＲＢ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＢ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
Ｚ２は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＢ４ＲＢ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＢ４及びＲＢ５は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）からなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］
で示される基であり；
ただし、
ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なる場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨとなることはなく；
ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なり、Ｒ１及びＲ２の一方がＨである場合、Ｒ１及びＲ２の他方はメチルではなく；
ｎ＝２で、各Ｒ１及びＲ２がＨである場合、Ｔ１及びＴ２はともに－Ｃ（Ｏ）－であるか、又はともに－ＮＨ－である｝。
いくつかの実施形態では、Ｔ２は－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、
Ｙ１は、不在か、又は式：
－［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｓ－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＡ４ＲＡ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＡ４及びＲＡ５は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）からなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、
Ｙ１は、不在か、又は式：
－［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｓ－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、
Ｙ１は、不在か、又は式：
－［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
Ｘ１は、不在か、又は－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、もしくは－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）であり（ここで、各ＲＡ３は、水素又はメチルである）；
Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、Ｙ１は、不在か、又は－（ＣＨ２）－もしくは－（ＣＨ２ＣＨ２）－であり、
Ｘ１は、不在か、又は－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－もしくは－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
Ｚ１は、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである］で示される基である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、式：
－Ｙ２－Ｚ２
［ここで、Ｙ２は、不在か、又は式：
－［ＣＲＢ１ＲＢ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＢ１及びＲＢ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
Ｚ２は、水素又は（１－６Ｃ）アルキルである］で示される基である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素である。
いくつかの実施形態では、ｎは２又は３である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ－アミノ酪酸からなる群から選ばれた酸残基である。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000003
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000004
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000005
 。
を有する
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000006
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000007
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、以下の構造：
Figure 2024506099000008
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、以下の構造：
Figure 2024506099000009
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、以下の構造：
Figure 2024506099000010
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、以下の構造：
Figure 2024506099000011
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、以下の構造：
Figure 2024506099000012
 を有する。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端において、前記リンカーまたは前記ペプチドに結合している。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
Figure 2024506099000013
 を含む。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
Figure 2024506099000014
 を含む。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、ヒドロキシルを含む。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃ－ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃ－ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体はペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
オリゴヌクレオチドの３’－末端が、グルタミン酸残基を介してペプチドのＣ－末端またはＮ－末端に共有結合している、上記または本明細書の他の箇所に記載の各複合体、またはその薬学的に許容される塩について、前記複合体またはその薬学的に許容される塩は、以下の構造：
Figure 2024506099000015
 、またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
Figure 2024506099000016
 を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の複合体、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する被験体の治療方法であって、治療有効量の本明細書に記載の複合体または本明細書に記載の医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。本発明はさらに、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する被験体の治療における使用のための医薬組成物を含む。
いくつかの実施形態では、前記被験体はＤＭＤを有する。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドはモルフォリノである（より好ましくは、全てのモルフォリノヌクレオシド間結合は－Ｐ（Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｏ－である）。
定義
「Ｘ」への言及は、全体を通して、例えば６－アミノヘキサン酸のようなアミノヘキサン酸等のアミノ酸の任意の形態を示す。
「Ｂ」への言及は、全体を通して、アミノ酸のベータアラニンを示す。
「Ｈｙｐ」への言及は、全体を通して、アミノ酸のヒドロキシプロリンを示す。
「Ａｃ」への言及は、全体を通して、アセチル基（ＣＨ３－Ｃ（Ｏ）－）を示す。
他の大文字への言及は、全体を通して、関連する遺伝的にコードされたアミノ酸残基を、認められているアルファベットのアミノ酸コードに従って示す。
ここで使用される用語「アルキル」は、特記しない限り（例えば、（１－６Ｃ）アルキル，（１－４Ｃ）アルキル，（１－３Ｃ）アルキル，または（１－２Ｃ）アルキル）、合計１～２０個の炭素原子を含む直鎖状または分岐鎖状の炭化水素基を意味する。アルキルの非限定的な例として、メチル，エチル，１－メチルエチル，プロピル，１－メチルブチル，１－エチルブチル等が含まれる。個々のアルキル基に関する表示、例えば、「プロピル」は、特に直鎖状型のみを意味し、個々の分枝状アルキルに関する表示、例えば、「イソプロピル」は、特に分枝鎖型のみを意味する。
ここで使用される用語「アルケニル」は、特記しない限り（例えば、（２－６Ｃ）アルケニル，（２－４Ｃ）アルケニル，または（２－３Ｃ）アルケニル）、１，２，または３個の炭素－炭素二重結合を有し、合計２～２０個の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。アルケニルの非限定的な例として、ビニル，アリル，ホモアリル，イソプレニル等が含まれる。特記しない限り、アルケニルは、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、ヘテロアリール基，オキソ基，ハロゲン基，およびヒドロキシル基からなる群から選ばれた１，２，３，４，または５個の基で任意に置換されていてもよい。
ここで使用される用語「アルキニル」は、特記しない限り（例えば、（２－６Ｃ）アルキニル，（２－４Ｃ）アルキニル，または（２－３Ｃ）アルキニル）、１，２，または３個の炭素－炭素三重結合を有し、合計２～２０個の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。アルキニルの非限定的な例として、エチニル，プロパギル，ホモプロパギル，ブタ－２－イン－１－イル，２－メチル－プロパ－２－イン－１－イル等が含まれる。特記しない限り、アルキニルは、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、ヘテロアリール基，オキソ基，ハロゲン基，およびヒドロキシル基からなる群から選ばれた１，２，３，４，または５個の基で任意に置換されていてもよい。
用語アミノ酸「残基」は、アミノ酸の１つのＮ－Ｈ結合が１価の原子価で置換され、１つのカルボン酸Ｃ－Ｏ結合が１価の原子価で置換された２価の基を意味する。Ｎ－Ｈ結合またはカルボン酸Ｃ－Ｏ結合は、例えば、側鎖上にあることがある。
用語「アルギニンリッチ」は、少なくとも４０％のカチオン性ドメインが、アルギニン残基により形成されていることを意味する。
ここで使用される用語「人工アミノ酸」は、非生物起源アミノ酸（例えば非蛋白質原性のもの）を指す。例えば、人工アミノ酸は、合成アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば糖で修飾したもの）、非天然アミノ酸、人為的アミノ酸、スペーサー、および非ペプチド結合スペーサーを含む。合成アミノ酸は、人間によって化学的に合成されるものであり得る。誤解を避けるために、アミノヘキサン酸（Ｘ）は、本発明の文脈における人工アミノ酸である。誤解を避けるために、ベータアラニン（Ｂ）およびヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）は自然界に存在しており、したがって、本発明の文脈においては人工アミノ酸ではなく、天然アミノ酸である。人工アミノ酸は、例えば、６－アミノヘキサン酸（Ｘ）、テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（ＴＩＣ）、１－（アミノ）シクロヘキサンカルボン酸（Ｃｙ）、および３－アゼチジン－カルボン酸（Ａｚ）、および１１－アミノウンデカン酸を含み得る。
ここで使用される用語「アリール」は、少なくとも１つは芳香族である、１つ、２つ、または３つの環を含む炭素環系を意味する。非置換型のアリールは、合計６から１４個の炭素原子を含む。用語アリールは、１価の種および２価の種の両方を含む。限定的ではないが、アリール基の例として、フェニル、ナフチル、インダニルなどが含まれる。特定の実施形態では、任意に置換されたアリールは任意に置換されたフェニルである。
ここで使用される用語「架橋環系」は、２つの環が２以上の原子を共有する環系を意味する（例えば、Ｊｅｒｒｙ ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ｐ．１３１－１３３，１９９２参照）。架橋複素環系の例としては、アザ－ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２－オキサ－５－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、アザ－ビシクロ［２．２．２］オクタン、アザ－ビシクロ［３．２．１］オクタン、キヌクリジン等が含まれる。
ここで使用される用語「カルボニル」は、以下の構造：－Ｃ（Ｏ）－の基を意味する。カルボニル基の非限定的な例として、例えばアセトン、酢酸エチル、タンパク原性アミノ酸、アセトアミドなどに見られるものがある。
用語「カチオン性」は、生理的ｐＨにおいて全体的に正電荷を持つアミノ酸またはアミノ酸のドメインを意味する。
単独または接頭辞として使用される用語「（ｍ－ｎＣ）」または「（ｍ－ｎＣ）基」は、置換されていない場合に、合計でｍからｎ個の炭素原子を有する基を意味する。
核酸塩基配列に関して本明細書で使用する「相補的」という用語は、その核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、生理的条件下で、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することを可能にする連続した核酸塩基のパターンを有する核酸塩基配列を指す。相補的配列には、天然および／または修飾された核酸塩基から形成されるワトソン－クリック型塩基対が含まれる。相補的配列はまた、非ワトソン－クリック型塩基対、例えばウォブル型塩基対（グアノシン－ウラシル、ヒポキサンチン－ウラシル、ヒポキサンチン－アデニン、ヒポキサンチン－シトシン）およびフーグスティーン型塩基対を含むことができる。
ここで使用される用語「シクロアルキル」は、特に断りのない限り、１つまたは２つの環を含み、合計３から１０個の炭素原子を含む飽和炭素環系を意味する。２環シクロアルキルは、縮合環系（２つの橋頭炭素原子が互いに直接結合している）、架橋環系（２つの橋頭炭素原子が、少なくとも１つの炭素原子を含む共有結合リンカーを介して互いに結合している）、およびスピロ環系（２つの環が同じ炭素原子で縮合している）として配置することができる。シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
特に断らない限り、用語「シクロアルケニル」は、１つまたは２つの環を含み；１つ、２つまたは３つの内環式二重結合を含み；そして合計３～１０個の炭素原子を含む、非芳香族で、不飽和の炭素環系を意味する。２環のシクロアルケニルは、縮合環系（２つの橋頭炭素原子が互いに直接結合している）、架橋環系（２つの橋頭炭素原子が、少なくとも１つの炭素原子を含む共有結合リンカーを介して互いに結合している）、およびスピロ環系（２つの環が同じ炭素原子で縮合している）として配置することができる。シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、３－シクロヘキセン－１－イル、シクロオクテニルなどが挙げられる。
ジストロフィンは、棒状の細胞質タンパク質であり、筋繊維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスにつなぐタンパク質複合体の重要な一部である。ジストロフィンは複数の機能ドメインを含んでいる。例えば、ジストロフィンは、約１４～２４０個のアミノ酸のアクチン結合ドメインを含み、約２５３～３０４０個のアミノ酸の中央ロッドドメインを含む。この大きな中央ドメインは、約１０９個のアミノ酸からなる２４個のスペクトリン様三重らせん要素によって形成されており、α－アクチニンおよびスペクトリンと相同性を有する。反復配列は、典型的には４つのプロリンに富む非反復部分によって中断され、これはヒンジ領域とも呼ばれる。反復配列の１５番および１６番は、ジストロフィンのタンパク質分解切断の主要部位と思われる１８アミノ酸の伸長によって隔てられている。ほとんどの反復配列間の配列同一性は１０～２５％である。１つの反復配列には、１，２，３の３つのα－ヘリックスが含まれる。α－ヘリックス１と３はそれぞれ７本のヘリックスターンによって形成されており、おそらく疎水性界面を介してコイルドコイルとして相互作用している。α－ヘリックス２はより複雑な構造を持ち、グリシン残基またはプロリン残基によって隔てられた４つおよび３つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各反復配列は２つのエクソンによってコードされており、通常、α－ヘリックス２の最初の部分のアミノ酸４７と４８の間でイントロンによって中断されている。もう１つのイントロンは反復配列の異なる位置にあり、通常はヘリックス３上に散在している。ジストロフィンはまた、約３０８０～３３６０個のアミノ酸あたりにシステインに富むドメインを含み、粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のα－アクチニンのＣ末端ドメインと相同性を示すシステインに富むセグメント（すなわち、２８０個のアミノ酸中に１５個のシステイン）を含む。カルボキシ末端ドメインはおよそアミノ酸３３６１～３６８５個中にある。
ジストロフィンのアミノ末端はＦアクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜でジストロフィン関連蛋白質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣには、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン、カベオリンが含まれ、これらの成分のいずれかの変異は常染色体遺伝性筋ジストロフィーを引き起こす。ジストロフィンが欠乏するとＤＡＰＣは不安定化し、その結果構成タンパク質のレベルが低下し、線維の損傷と膜漏出が進行する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）やベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）など、さまざまな筋ジストロフィーでは、筋細胞は、主に誤ったスプライシングを引き起こす遺伝子配列の変異により、変化した機能的欠損型のジストロフィンを産生するか、または全くジストロフィンを産生しない。欠損したジストロフィンタンパク質が優勢に発現しているか、またはジストロフィンやジストロフィン様タンパク質が完全に欠如していると、前述のように筋肉の変性が急速に進行する。この点に関して、「欠陥のある」ジストロフィンタンパク質は、当該分野で知られているように、特定のＤＭＤまたはＢＭＤの被験体で産生されるジストロフィンの形態、または検出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴づけられる場合がある。
用語「エクソン」は、タンパク質をコードする核酸の定義された部分、または前処理（または前駆体）ＲＮＡのいずれかの部分がスプライシングによって除去された後、ＲＮＡ分子の成熟形で表される核酸配列を意味する。成熟ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であることも、ｒＲＮＡやｔＲＮＡのような非コードＲＮＡの機能型であることもある。ヒトのジストロフィン遺伝子には約７５個のエクソンがある。
用語「エクソンスキッピング」は、一般に、それによって、エクソン全体またはその一部が所定の前処理ＲＮＡから除去され、もってタンパク質に翻訳される成熟ｍＲＮＡなどの成熟ＲＮＡに存在しないようにされるプロセスを指す。そのため、通常はスキップされたエクソンによってコードされているタンパク質の部分は、タンパク質の発現された形では存在せず、通常は機能的ではあるが変化した形のタンパク質を生成する。ある種の実施形態では、スキップされるエクソンはヒトジストロフィン遺伝子の異常エクソンであり、異常エクソンには、別のやり方で異常なスプライシングを引き起こす変異やその他の変化がその配列に含まれている場合がある。特定の実施形態では、スキップされるエクソンは、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番エクソン，第５１番エクソン、および／または第５３番エクソンである。
ここで使用される用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を表す。
用語「ヒスチジンリッチ」は、カチオン性ドメインの少なくとも４０％がヒスチジン残基から形成されることを意味する。
ここで互換的に使用される用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、１，２，または３個の環を含む環系化合物であって、それらの環のうち、少なくとも１個は、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選ばれた１～４（例えば、１、２、または３個の）のヘテロ原子を含有する芳香環である環系化合物を意味する。非置換型のヘテロアリール基は、合計１～９個の炭素原子を含む。用語ヘテロアリールは、１価の種及び２価の種の両方を含む。ヘテロアリール基の例としては、５～１２の環メンバー、より一般的には、５～１０の環メンバーを含有する単環基及び二環基が含まれる。ヘテロアリール基は、例えば、５員、又は６員の単環又は９員又は１０員の二環であり、例えば、縮合５及び６員環、又は２つの縮合６員環から形成された二環構造体である。各環は、代表的には窒素、イオウ、及び酸素から選ばれる約４までのヘテロ原子を含有できる。代表的には、ヘテロアリール環は、３以下のヘテロ原子、より一般的には、２以下のヘテロ原子、例えば、１のヘテロ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール環は、少なくとも１の窒素原子を含有する。ヘテロアリール環における窒素原子は、イミダゾール又はピリジンにおけるように塩基性であり、インドール又はピロール窒素の場合のように、本質的に非塩基性である。一般に、ヘテロアリール基に存在する塩基性窒素原子の数は、環の各種のアミノ酸置換基を含めて、少なくとも５以上である。
ヘテロアリールの例としては、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，５－トリアゼニル、ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、インダゾリル、プリニル、ベンゾフラザニル、キノリニル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、ナフチリジニル、カルバゾリル、フェナジニル、ベンズイソキノリニル、ピリドピラジニル、チエノ［２，３－ｂ］フラニル、２Ｈ－フロ［３，２－ｂ］－ピラニル、５Ｈ－ピラジノ［２，３－ｄ］－ｏ－オキサジニル、１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］－オキサゾリル、４Ｈ－イミダゾ［４，５－ｄ］チアゾリル、ピラジノ［２，３－ｄ］ピリダジニル、イミダゾ［２，１－ｂ］チアゾリル、イミダゾ［１，２－ｂ］［１，２，４］トリアジニルが含まれる。「ヘテロアリール」は、少なくとも１の環が、窒素、酸素、又はイオウから選ばれる１以上のヘテロ原子を含有する限り、少なくとも１の環が芳香族環であり、他の環の１以上が非芳香族、飽和又は部分的に飽和の環である部分的に芳香族のジ－又は多環系も含む。部分的に芳香族のヘテロアリール基の例としては、例えば、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロキノリニル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、２，２－ジオキソ－１，３－ジヒドロ－２－ベンゾチエニル、４，５，６，７－テトラヒドロベンゾフラニル、インドリニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－１，８－ナフチリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロピリジド［２，３－ｂ］ピラジニル、及び３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピリド［３，２－ｂ］［１，４］オキサジニルが含まれる。
５員ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、フラザニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、及びテトラゾリル基が含まれるが、これらに限定されない。
６員ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、及びトリアジニルが含まれるが、これらに限定されない。
二環式ヘテロアリール基は、例えば、下記の中から選ばれる基である：
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員環に縮合したベンゼン環；
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員環に縮合したピリジン環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したピリミジン環；
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員環に縮合したピロール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したピラゾール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したピラジン環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したイミダゾール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したオキサゾール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したイソキサゾール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したチアゾール環；
環ヘテロ原子１又は２個を含有する５員又は６員環に縮合したイソチアゾール環；
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員環に縮合したチオフェン環；
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員環に縮合したフラン環；
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員の芳香族複素環に縮合したシクロヘキシル環；及び
環ヘテロ原子１、２、又は３個を含有する５員又は６員の芳香族複素環に縮合したシクロペンチル環。
５員環に縮合した６員環を含有する二環式ヘテロアリール基の特別な例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インドリニル、イソインドリニル、プリニル（例えば、アデニニル、グアニニル）、インダゾリル、ベンゾジオキサリル、及びピラゾロピリジニル基が含まれるが、これらに限定されない。
２つの縮合した６員環を含有する二環式ヘテロアリール基の特別な例としては、キノリニル、イソキノリニル、クロマニル、チオクロマニル、クロメニル、イソクロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ベンゾジオキサニル、キノリジニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾジアジニル、ピリドピリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、及びプテリジニル基が含まれるが、これらに限定されない。
ここで使用される用語「ヘテロシクリル基」は、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１～４個（例えば、１個、２個、または３個）のヘテロ原子を少なくとも１個含む、１個、２個、または３個の環を含む環系を指し、ただし、環系は、内環式ヘテロ原子も含む芳香族環を含まない。無置換のヘテロシクリル基は、合計２～９個の炭素原子を含む。用語ヘテロシクリルは、１価の種と２価の種の両方を含む。ヘテロシクリル基の例としては、５個から１２個の環員を含み、より一般的には５個から１０個の環員を含む単環式基と二環式基がある。ヘテロシクリル基は、例えば、５員環または６員環の単環または９員環または１０員環の二環であることができ、例えば、縮合した５員環と６員環から形成される二環式構造、または２つの縮合した６員環から形成される二環式構造であることができる。各環は、窒素、硫黄、酸素から典型的に選択されるヘテロ原子を４個まで含むことができる。ヘテロシクリル基の非限定的な例としては、例えば、ピロリジン、ピペラジン、ピペリジン、アゼパン、１，４－ジアゼパン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、１，４－ジオキセパン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、インドリン、ベンゾピロリジン、２，３－ジヒドロベンゾフラン、フタラン、イソクロマン、および２，３－ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。
ここで用いられる用語「ヌクレオシド間結合」という用語は、オリゴヌクレオチドにおいて隣接するヌクレオシド間で共有結合を形成する基または結合を表す。ヌクレオシド間結合は、修飾されていないヌクレオシド間結合または修飾されたヌクレオシド間結合である。「非修飾ヌクレオシド間結合」は、リン酸（－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－）ヌクレオシド間結合（「リン酸ホスホジエステル」）である。「修飾ヌクレオシド間結合」は、リン酸ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合である。修飾ヌクレオシド間結合の２つの主要なクラスは、リン原子の有無によって定義される。リン含有ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエートジエステル結合、ホスホロチオエートトリエステル結合、モルフォリノヌクレオシド間結合、メチルホスホナート、ホスホルアミダートなどがある。非限定的な非リン系ヌクレオシド間結合の例としては、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）、シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－）などがある。ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素原子の１つが硫黄原子に置換されたホスホジエステル結合およびホスホトリエステル結合である。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、以下の構造の基：
Figure 2024506099000017
 ，
［ここで、ＺはＯ，Ｓ，またはＳｅであり；
Ｙは式：
－Ｘ－Ｌ－Ｒ１
であり；
各Ｘは、それぞれ独立して、－Ｏ－，－Ｓ－，－Ｎ（－Ｌ－Ｒ１）－，またはＬであり；
各Ｌは、それぞれ独立して、共有結合またはリンカー（例えば、任意に置換されたＣ１－６０ 脂肪族のリンカーまたは任意に置換されたＣ２－６０複素脂肪族のリンカー）であり；
各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素，－Ｓ－Ｓ－Ｒ２，－Ｏ－ＣＯ－Ｒ２，－Ｓ－ＣＯ－Ｒ２，任意に置換されたＣ１－９ヘテロシクリル基，または疎水性部位である（ここで、各Ｒ２は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ１－１０アルキル，任意に置換されたＣ２－１０ヘテロアルキル，任意に置換されたＣ６－１０アリール，任意に置換されたＣ６－１０アリールＣ１－６アルキル，任意に置換されたＣ１－９ヘテロシクリル基，または任意に置換されたＣ１－９ヘテロシクリルＣ１－６アルキルである）］である。
Ｌが共有結合、Ｒ１が水素、Ｚが酸素、すべてのＸ基が－Ｏ－のとき、ヌクレオシド間基はリン酸ホスホジエステルとして知られる。Ｌが共有結合、Ｒ１が水素、Ｚが硫黄、すべてのＸ基が－Ｏ－のとき、ヌクレオシド間基はホスホロチオエートジエステルとして知られる。Ｚが酸素であり、すべてのＸ基が－Ｏ－であり、（１）Ｌがリンカーであるか、または（２）Ｒ１が水素でない場合、ヌクレオシド間基はホスホトリエステルとして知られている。Ｚが硫黄であり、すべてのＸ基が－Ｏ－であり、（１）Ｌがリンカーであるか、または（２）Ｒ１が水素でない場合、インターヌクレオシド基はホスホロチオエートトリエステルとして知られている。ホスホロチオエートトリエステル結合およびホスホトリエステル結合の非限定的な例は、ＵＳ２０１７／００３７３９９に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない（遺伝子内の）核酸領域を意味する。イントロンは、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）に転写され、その後、成熟ＲＮＡの形成中にスプライシングによって除去される非コード領域である。
オリゴヌクレオチドのクラスに関連してここで使用される用語「モルフォリノ」は、モルフォリノヌクレオシド間結合によって相互接続された少なくとも１０個のモルフォリノ単量体単位のオリゴマーを表す。
モルフォリノには５’基と３’基を含む。例えば、モルフォリノは、以下の構造：
Figure 2024506099000018
［ここで、ｎは少なくとも１０（例えば１２から３０）の整数であり、モルフォリノサブユニットと関連する基Ｌの数を示す；
各Ｂは、それぞれ独立に核酸塩基であり；
Ｒ１は５’基であり（本明細書ではＲ１を５’末端と呼ぶことがある）；
Ｒ２は３’基であり（本明細書ではＲ２を３’末端と呼ぶことがある）；
Ｌは、（ｉ）モルフォリノヌクレオシド間結合、または（ｉｉ）ＬがＲ２に結合している場合、共有結合である］であることがある。
モルフォリノの５’基は、例えば、ヒドロキシル基、疎水性部位、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホスホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチドとリンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部分、中性有機ポリマー、または以下の構造：
Figure 2024506099000019
 または
Figure 2024506099000020
 で示される基である。
好ましい５’基は、ヒドロキシル基、および以下の構造：
Figure 2024506099000021
 または
Figure 2024506099000022
 で示される基である。
より好ましい５’基は、以下の構造：
Figure 2024506099000023
 で示される基である。
モルフォリノの３’基は、例えば、水素、疎水性部分、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホスホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチドとリンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部分、中性有機ポリマー、または以下の構造：
Figure 2024506099000024
 または
Figure 2024506099000025
 で示される基である。
モルフォリノであるオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合または連結されたペプチドとの複合体において、好ましい３’基は、ペプチドへの結合またはペプチド／リンカーの組み合わせへの結合である。
ここで使用される用語「モルフォリノヌクレオシド間結合」は、以下の構造：
Figure 2024506099000026
 ，
［ここで、ＺはＯまたはＳであり；
Ｘ１は単結合，－ＣＨ２－，または－Ｏ－であり；
Ｘ２は単結合，－ＣＨ２－Ｏ－，または－Ｏ－であり；
Ｙは－ＮＲ２であり（ここで、各Ｒは、それぞれ独立にＨまたはＣ１－６アルキル（例えばメチル）であるか、あるいは、両Ｒは、それらが結合している窒素原子と一緒になってＣ２－９ヘテロシクリルを形成しており（例えばＮ－ピペラジニル基））；
ただし、Ｘ１およびＸ２が同時に単結合であることはない］で示される２価の基を意味する。
ここで使用される用語「モルフォリノサブユニット」は、以下の構造：
Figure 2024506099000027
 （ここで、Ｂは核酸塩基である）を意味する。
ここで使用される用語「核酸塩基」は、ヌクレオシドのリボフラノース／２’－デオキシリボフラノースの１’位に見られる窒素を含む複素環を表す。核酸塩基は修飾されていないか、または修飾されている。ここで使用されるように、「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基としては、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、およびＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリン、ならびに合成および天然核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－アルキル（例えば、６－メチル）アデニンおよびグアニン、２－アルキル（例えばアデニンおよびグアニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－トリフルオロメチルウラシル、５－トリフルオロメチルシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン等が含まれる。
ある種の核酸塩基は、核酸の結合親和性を高めるのに特に有用である。例えば、５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ２－、Ｎ６－、および／またはＯ６－置換プリンなどである。核酸二重鎖の安定性は、例えば５－メチルシトシンを用いて高めることができる。核酸塩基の非限定的な例としては、以下が挙げられる：２－アミノプロピルアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－Ｎ－メチルグアニン、６－Ｎ－メチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－リボシルウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、８－アザおよび他の８－置換プリン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、６－Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－Ｎ－イソブチリルグアニン、４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルシトシン、５－メチル４－Ｎ－ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、プロミスキャス塩基、サイズ拡大塩基、フッ素化塩基等。
さらなる修飾核酸塩基には、１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン、１，３－ジアザフェノチアジン－２－オン、９－（２－アミノエトキシ）－１，３－ジアザフェノキサジン－２－オン（Ｇ－クランプ）などの三環式ピリミジンがある。修飾核酸塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、２－アミノピリジン、２－ピリドンなどで置換されたものも含まれる。
さらなる核酸塩基として、Ｍｅｒｉｇａｎら、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８－８５９に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３－２８８に開示されているもの；およびＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒｏｏｋｅ Ｓ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００８，１６３－１６６ ａｎｄ ４４２－４４３に開示されているもの等が含まれる。
ここで使用される用語「ヌクレオシド」は、本技術分野で知られている糖－核酸塩基化合物および基、ならびに本技術分野で知られている修飾または非修飾の２’－デオキシリボフラノース－核酸塩基化合物および基を表す。糖はリボフラノースでもよい。糖は修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。非修飾リボフラノース－核酸塩基は、非修飾核酸塩基にアノマー炭素結合を有するリボフラノースである。非修飾リボフラノース核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジンである。非修飾の２’－デオキシリボフラノース－核酸塩基化合物は、２’－デオキシアデノシン、２’－デオキシシチジン、２’－デオキシグアノシン、およびチミジンである。修飾化合物および基は、本明細書に記載の核酸塩基修飾物および糖修飾物からなる群から選択される１つ以上の修飾物を含む。核酸塩基修飾とは、修飾されていない核酸塩基を修飾された核酸塩基に置き換えることである。糖修飾は、例えば、２’－置換、固定化、炭素環化、または非固定化であってよい。２’－置換とは、リボフラノースの２’－ヒドロキシルを、２’－フルオロ、２’－メトキシ、または２’－（２－メトキシ）エトキシで置換することである。
あるいは、２’－置換は２’－（ａｒａ）置換であってもよく、これは以下の構造に相当する：
Figure 2024506099000028
 （Ｂは核酸塩基であり、Ｒは２’－（ａｒａ）置換基（例えばフルオロ）である）。２’－（ａｒａ）置換基は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される他の２’－置換基と同じであり得る。いくつかの実施形態では、２’－（ａｒａ）置換基は２’－（ａｒａ）－Ｆ置換基である（Ｒはフルオロ）。固定修飾は、リボフラノースの４’－炭素原子と２’－炭素原子の間に架橋を組み込むことである。固定修飾を有するヌクレオシドは、当該技術分野では架橋核酸として知られており、例えば、固定核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、およびｃＥｔ核酸である。架橋核酸は、典型的には親和性増強ヌクレオシドとして使用される。「ヌクレオシド」はまた、モルフォリノサブユニットを意味することがある。
ここで使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合に結合したヌクレオシド、または以下の構造：
－Ｘ１－Ｐ（Ｘ２）（Ｒ１）２
［ここで、Ｘ１は、Ｏ，Ｓ，またはＮＨであり、Ｘ２は、存在しないか、＝Ｏ、または＝Ｓであり、各Ｒ１は、それぞれ独立に－ＯＨ，－Ｎ（Ｒ２）２、または－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである（ここで、各Ｒ２は、それぞれ独立に、任意に置換されたアルキルであるか、または両Ｒ２基は、それら結合している窒素原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル基を形成する）］により表される一価基を表す。
ここで使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合によって共有結合した１０個以上の連続したヌクレオシドを含む構造；１０個以上のモルフォリノサブユニットを含むモルフォリノ；または１０個以上のモルフォリノサブユニットを含むペプチド核酸を意味する。好ましくは、オリゴヌクレオチドはモルフォリノである。
用語「任意に置換された」は、前述の各々の基について、置換されていても、置換されていなくてもよい基、構造体、又は分子を意味する。用語「ここで、Ｒ１基内のＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３基又はヘテロ原子（すなわち、ＮＨ）のいずれかが任意に置換されている」は、Ｒ１基の水素原子の（いずれかの）１が、適切に定義された基によって置換されていることを意味する。
本明細書において、用語「作動可能に結合された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列および調節ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドコード配列の発現を調節配列の制御下に置くような方法で共有結合している状況を含み得、そのようなものとして、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列の一部または全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写をもたらすことが可能である。適切な場合には、得られた転写物を所望のペプチドに翻訳することができる。
ここで使用される用語「薬学的に許容される」は、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応および他の問題合併症を伴わずに、個体（例えばヒト）の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、および／または投薬フォームを意味する。
ここで使用される用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書に開示される複合体、オリゴヌクレオチド、またはペプチドの薬学的に許容される塩を意味する。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩には、健全な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合うものが含まれ得る。薬学的に許容される塩は当技術分野でよく知られている。例えば、薬学的に許容される塩は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６：１－１９，１９７７およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，（Ｅｄｓ． Ｐ．Ｈ． Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に記載されている。その塩は、本明細書に記載の化合物の最終的な単離および精製の際にその場で調製することもできるし、遊離塩基基を適切な酸と反応させることによって別途調製することもできる。代表的な酸付加塩として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩 シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、 ２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩 ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、バレレート塩などがある。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む、無毒なアンモニウム、４級アンモニウム、アミンカチオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ここで使用される用語「医薬組成物」は、ここに記載されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を表し、薬学的に許容される賦形剤で調合され、被験体の疾患治療のための治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を得て製造または販売される。
用語「減少させる」または「抑制する」は、一般に、診断技術における日常的な技術に従って測定される、本明細書に記載される疾患または状態の症状のような、関連する生理学的または細胞応答を「減少させる」、本発明の１つ以上の化合物の能力に関連することがある。関連する（生体内または生体外における）生理学的または細胞学的応答は、当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状または病態の軽減、またはＤＭＤもしくはＢＭＤの個体で発現されるジストロフィンの変化形態のような、ジストロフィンの欠損形態の発現の軽減が含まれ得る。反応の「減少」は、アンチセンス化合物または対照組成物を用いない場合に生じる反応と比較して統計的に有意であり、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含み、その間のすべての整数を含む。
ここで使用される用語「被験体」は、被験体からの試料の当技術分野で既知の実験室検査の有無にかかわらず、有資格の専門家（例えば、医師または実地看護師）によって決定される、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはその危険性があるヒトまたはヒト以外の動物（例えば、哺乳動物）を表す。疾患、障害、状態の非限定的な例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）やベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）がある。
用語「糖」または「糖部分」には、フラノース環またはヌクレオシドのフラノース環を置換できる構造を有する、天然に存在する糖が含まれる。本発明のヌクレオシドに含まれる糖は、非フラノース（または４’－置換フラノース）環、環系または開放系であってもよい。このような構造には、天然のフラノース環（例えば、六員環）に対する単純な変化が含まれる。代替の糖としては、フラノース環が、例えばモルフォリノまたはヘキシトール環系のような別の環系に置換された代替糖も含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれ得る有用な糖部位の非限定的な例としては、β－Ｄ－リボース、β－Ｄ－２’－デオキシリボース、置換糖（例えば、２’，５’，およびビス置換された糖）、４’－Ｓ－糖（例えば、４’－Ｓ－リボース、４’－Ｓ－２’－デオキシリボース、および４’－Ｓ－２’－置換リボース）、二環式糖部位（例えば２’－Ｏ－ＣＨ２－４’または２’－Ｏ－（ＣＨ２）２－４’架橋リボース由来の二環式糖）および代替糖（リボース環がモルフォリノまたはヘキシトール環系で置換されている場合）等が挙げられる。
ここで使用される用語「治療」および「処置」は、疾患、障害、または状態（例えば、ＤＭＤまたはＢＭＤ）を改善、緩和、または安定させることを意図した被験体の医学的管理を指す。この用語には、積極的治療（ＤＭＤまたはＢＭＤを改善するための治療）、緩和的治療（ＤＭＤまたはＢＭＤの症状を緩和するための治療）、支持的治療（他の治療を補完するための治療）が含まれる。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む」および「含有する」およびこれらの変形は、「含むがこれらに限定されない」という意味であり、他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図するものではない（また、除外するものではない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の定めがない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、文脈上そうでなければならない場合を除き、本明細書は単数だけでなく複数も想定していると理解される。
用語「複合体」はすべて、その溶媒和物も指す。
用語「オリゴヌクレオチド」はすべて、その塩および溶媒和物も指す。
特記しない限り、本明細書では、すべてのペプチドをＮ末端からＣ末端方向（左から右）に示す。特記しない限り、本明細書では、すべてのオリゴヌクレオチドを５’から３’方向（左から右）に示す。
本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学部位または基は、それと両立しない場合を除き、本明細書に記載された他の態様、実施形態または実施例にも適用可能であると理解される。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示されたすべての特徴、および／またはこのように開示された方法もしくはプロセスのすべての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
Ｈ２Ｋ－ｍｄｘ細胞においてネステッドＲＴ－ＰＣＲのデンシトメトリー分析により測定された、アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化したＤＰＥＰ１系の一部のペプチドの０．２５μＭ、０．５μＭおよび１μＭでの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの第２３番エクソンスキッピングの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ≧３）。 Ｈ２Ｋ－ｍｄｘ細胞においてネステッドＲＴ－ＰＣＲのデンシトメトリー分析により測定された、アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化したＤＰＥＰ３系の一部のペプチドの０．２５μＭ、０．５μＭおよび１μＭでの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの第２３番エクソンスキッピングの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ≧３）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化したＤＰＥＰ１系の一部のペプチドについての、ｍｄｘマウスへの単一１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量の後に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心筋におけるウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝３）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化したＤＰＥＰ３系の一部のペプチドについての、ｍｄｘマウスへの単一１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量の後に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心筋におけるウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝３）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した２日および７日後にＣ６７ＢＬ／６マウスの尿中で測定された、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水との比較での、相対ＫＩＭ－１レベルを示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した２日および７日後にＣ６７ＢＬ／６マウスの尿中で測定された、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水との比較での、相対ＮＧＡＬレベルを示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ６７ＢＬ／６マウスにおいて測定された血清中ＢＵＮレベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ６７ＢＬ／６マウスにおいて測定された血清中クレアチニンレベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの３０ｍｇ／ｋｇの単一用量を投与した７日後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて測定された（Ａ）アラニントランスフェラーゼ、（Ｂ）アルカリホスファターゼおよび（Ｃ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ血清レベルを、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す（エラーバー：標準偏差、ｎ＝６）。 アンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した様々なＤＰＥＰペプチドの単一３０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後にＣ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心臓においてｑＲＴ－ＰＣＲにより評定された第２３番エクソンスキッピングのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体、および食塩水と比較して示す。 ８～１０週齢Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝４～６）への２．５から５０ｍｇ／ｋｇの間の異なる量のペプチド－ＰＭＯの単一用量投与後２日目および７日目の尿ＫＩＭ－１レベルについての、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体との比較での評定。ＫＩＭ－１レベルは、ＥＬＩＳＡにより判定され、尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。データは、食塩水を注射したマウスの対照ＫＩＭ－１レベル（ｎ＝１０）に対する変化倍数として提示されている。 ８～１０週齢Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝３～６）への２．５から５０ｍｇ／ｋｇの間の漸増量の単一用量投与後のペプチド－ＰＭＯのｉｎ ｖｉｖｏでのエクソンスキッピングの有効性についての、同じアンチセンス療法用ＰＭＯに複合化した現在利用可能なペプチド担体と比較での、用量応答比較研究。第２３番エクソンエクスクルージョンのｑＰＣＲ分析は、投与後７日目に（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜および（Ｃ）心臓において評定された。 様々な濃度の、ＤＭＰＫ遺伝子に２６００のリピートを有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者筋芽細胞（ｎ＝１～３）における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭｂｎｌ１転写物のスプライシング欠陥を修正する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体を示す。 様々な濃度の、ＤＭＰＫ遺伝子に２６００のリピートを有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者筋芽細胞における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＭＤ転写物のスプライシング欠陥を修正する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体を示す（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝１～３）。 異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体についての注射後２日目および７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの尿で評定された相対ＫＩＭ－１レベルであって、標準曲線内に当てはまるように希釈された試料を用いてＥＬＩＳＡにより測定されたレベルを示す。値は、尿中タンパク質濃度を説明するために尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。ＫＩＭ－１レベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。 異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体についての注射後２日目および７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの尿で測定された相対ＮＧＡＬレベルであって、標準曲線内に当てはまるように希釈された試料を用いてＥＬＩＳＡにより測定されたレベルを示す。値は、尿中タンパク質濃度を説明するために尿中クレアチニンレベルに対して正規化された。ＮＧＡＬレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。 異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体についての注射後７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの血清において食塩水と比較して評定されたＢＵＮレベルを示す。ＢＵＮレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。 異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体についての注射後７日目にメスＣ５７ＢＬ６マウスの血清において食塩水と比較して評定されたクレアチニンレベルを示す。クレアチニンレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった（エラーバー：平均±ＳＥＭ、ｎ＝４～１０）。 異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体のボーラスＩＶ（尾静脈）注射による投与を受けたメスＣ５７ＢＬ６マウスからの血清において注射後７日目の採取時に食塩水と比較して評定された（Ａ）アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、（Ｂ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および（Ｃ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを示す。ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴレベルは、以前のＰｉｐ系のペプチド担体により誘導された増加倍数と比較して食塩水対照注射と同様であった。 異なるリンカーを介して治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合したＤＰＥＰ３．１ペプチド３０ｍｇ／ｋｇの単一用量の投与後、２日目及び７日目において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尿において測定した尿中クレアチニンに対する、正規化した尿中の腎臓損傷マーカー（ＫＩＭ－１）の相対レベルを、０．９％食塩水コントロール及び同じ治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合した現在利用可能なペプチドキャリヤー（Ｒ６Ｇｌｙ－及びＰｉｐ９ｂ２－）と比較して示すグラフである（エラーバー：平均値の標準誤差、ｎ＝３～１０）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける３０ｍｇ／ｋｇのシングル静脈内ボーラス投与後、それぞれ、（図２１Ａ）前脛骨筋、（図２１Ｂ）横隔膜、及び（図２１Ｃ）心筋における、異なるリンカーを介して治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合されたＤＰＥＰ３．１ペプチドのインビボ有効性を示すグラフである。ジストロフィン（第２３番エクソン）のエクソンスキッピング用ｑＰＣＲによって、有効性を投与後７日間測定した。０．９％食塩水コントロール及び同じ治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合した現在利用可能なペプチドキャリヤー（Ｒ６Ｇｌｙ－及びＰｉｐ９ｂ２－）と比較して、エクソンスキッピング効果を使用した。ＤＰＥＰ３．１ｄ－ＰＭＯＤＭＤについての外れ値は、誤った注入を示唆する（エラーバー：平均値の標準誤差、ｎ＝３～１０）。 異なるリンカーを介して治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合したＤＰＥＰ１．９ペプチド１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇの単一用量の投与後、２日目及び７日目において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尿において測定した尿中クレアチニンに対する、正規化した尿中の腎臓損傷マーカー（ＫＩＭ－１）の相対レベルを、０．９％食塩水コントロール及び同じ治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合した現在利用可能なペプチドキャリヤー（Ｒ６Ｇｌｙ－及びＰｉｐ９ｂ２－）と比較して示すグラフである（エラーバー：平均値の標準誤差、ｎ＝３～１０）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇのシングル静脈内ボーラス投与後、（図２３Ａ）前脛骨筋、（図２３Ｂ）横隔膜、及び（図２３Ｃ）心筋における、異なるリンカーを介して治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合されたＤＰＥＰ１．９ペプチドのインビボ有効性を示すグラフである。ジストロフィン（第２３番エクソン）のエクソンスキッピング用ｑＰＣＲによって、有効性を投与後７日間測定した。０．９％食塩水コントロール及び同じ治療用アンチセンスＰＭＯＤＭＤに結合した現在利用可能なペプチドキャリヤー（Ｒ６Ｇｌｙ－及びＰｉｐ９ｂ２－）と比較して、エクソンスキッピング効果を使用した（エラーバー：平均値の標準誤差、ｎ＝３～１０）。 各種の濃度のリンカーａ、ｂ、及びｄを使用する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７複合体が、ＤＭＰＫ遺伝子において２６００のＣＴＧ反復を有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者の筋芽細胞におけるＭｂｎｌ１－依存性転写のスプライシング欠損を是正したことを示すグラフである。 各種の濃度のリンカーａ、ｂ、及びｄを使用する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７複合体が、ＤＭＰＫ遺伝子において２６００のＣＴＧ反復を有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者の筋芽細胞におけるＭｂｎｌ１－依存性転写のスプライシング欠損を是正したことを示すグラフである。 各種の濃度のリンカーａ、ｂ、及びｄを使用する異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体が、各種の濃度でＤＭＰＫ遺伝子において２６００の反復を有するＤＭ１患者に由来するＤＭ１患者の筋芽細胞におけるインビトロＤＭＤ転写のスプライシング欠損を是正することを示すグラフである。 リンカーａ、ｂ、及びｄを使用する異なったＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７複合体の各種の用量にて４８時間遺伝子導入した２６００のＣＴＧ反復を有するＤＭ１患者の筋芽細胞の筋芽細胞生存率を示すグラフである。複合体の濃度は、細胞死を生ずることなく、治療レベルから数倍増大される。 リンカーａ、ｂ、及びｄを使用する異なったＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７複合体４０μＭにて遺伝子導入した肝細胞の細胞生存率を示すグラフである。複合体の濃度は、Ｐｉｐ６ａ複合体に反して、細胞死を生ずることなく、治療レベルから数倍増大される。 標準曲線に適合するように希釈したサンプルでのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｃａｔ＃ ＭＫＭ１００）によって測定したＣ５７ＢＬ６雌マウスへの異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体の注射後２日目及び７日目からの尿中毒性マーカーを示す。値は、尿中のタンパク質濃度を説明するために、尿中クレアチニンレベルに正規化した（Ｈａｒｗｅｌｌ）。ＫＩＭ－１レベルは、先のＰｉｐシリーズのペプチドキャリヤーによって惹起される数倍の増大と比べて、食塩水コントロール注射と同様であった。 標準曲線に適合するように希釈したサンプルでのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｃａｔ＃ ＭＫＭ１００）によって測定したＣ５７ＢＬ６雌マウスへの異なるＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体の注射後２日目及び７日目からの尿中毒性マーカーを示す。値は、尿中のタンパク質濃度を説明するために、尿中クレアチニンレベルに正規化した（Ｈａｒｗｅｌｌ）。ＶＫＩＭ－１レベルは、先のＰｉｐシリーズのペプチドキャリヤーによって惹起される数倍の増大と比べて、食塩水コントロール注射と同様であった。 異なったリンカーを有する異なったＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯをボーラスＩＶ（尾静脈）注入したＣ５７ＢＬ６雌マウス（年齢：８～１０週、ｎ＝５（１グループ当り））からの血漿において評価した毒性マーカーを示す。注入後７日目において、血漿におけるコレクションを食塩水と比較した。全てのレベルが、注入後７日目において、食塩水コントロール注入と同様であった。 異なったリンカーを有する異なったＤＰＥＰ１／３－［ＣＡＧ］７ＰＭＯをボーラスＩＶ（尾静脈）注入したＣ５７ＢＬ６雌マウス（年齢：８～１０週、ｎ＝５（１グループ当り））からの血漿において評価した毒性マーカーを示す。注入後７日目において、血漿におけるコレクションを食塩水と比較した。全てのレベルが、注入後７日目において、食塩水コントロール注入と同様であった。 複合体で処理した動物の主要な骨格筋、心筋、平滑筋および中枢神経系組織における生体内分布を示すプロットである。主要な筋肉組織には、到達しにくい心臓組織も含まれる。このプロットは、複合体が血液脳関門を通過して送達されることも示している。 骨格筋組織と心筋組織における第５１番エクソンスキッピングの有効性を示すプロットである。ＴＡは前脛骨筋であり、ＤＩＡＰＨは横隔膜である。
概して、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体、またはその薬学的に許容される塩を提供する。オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番エクソン，第５１番エクソン，または第５３番エクソンの内または近位の標的配列に相補的である。ペプチドは少なくとも１つの正電荷ドメインと少なくとも１つの疎水性ドメインを含む。理論に縛られることなく、ペプチドは、例えば、複合体化オリゴヌクレオチドの細胞内送達を改善することによって、複合体化オリゴヌクレオチドの活性を高めるための細胞透過性ペプチドとして作用する可能性がある。有利なことに、以下の例に記載されているように、ここに開示されている複合体は、特定の代替ペプチド構造と比較して毒性が低い。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ＤＭＤの治療に使用するジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングを誘導するためのものである。いくつかの実施形態では、単一エクソンは、ＤＭＤに関与する任意のエクソンから選択され、例えば、第４５番，第５１番または第５３番のエクソンのような、ジストロフィン遺伝子の任意のエクソンであり得る。任意の配列のＰＭＯオリゴヌクレオチドは、購入することができる（例えば、米国のＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ社から）。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、遺伝子標的のｍＲＮＡ前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、遺伝子標的のｍＲＮＡ前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ前駆体を変化させて変化したｍＲＮＡ、ひいては変化した配列のタンパク質をもたらす立体的なブロッキング事象を引き起こす。いくつかの実施形態では、遺伝子標的はジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、立体的な遮断事象は、エクソン封入またはエクソンスキッピングであることがある。いくつかの実施形態では、立体的な遮断事象はエクソンスキッピング、例えばジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングである。
必要に応じて、水溶性を向上させるために、ペプチドに結合させる前に、オリゴヌクレオチド（ＰＭＯやＰＮＡなど）の一端または両端に、リジン残基を付加することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの分子量は５，０００Ｄａ未満、例えば３，０００Ｄａ未満または１，０００Ｄａ未満である。
いくつかの実施形態では、ペプチドはＣ末端でオリゴヌクレオチドと共有結合している。
いくつかの実施形態では、必要に応じて、リンカーを介して、ペプチドをオリゴヌクレオチドに共有結合させる。リンカーは、ペプチド配列をオリゴヌクレオチドから分離するスペーサーとして機能する可能性がある。
リンカーは、任意の適切な配列から選択することができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドとオリゴヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドおよびオリゴヌクレオチドとは別の基である。従って、リンカーは人工アミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、複合体は、オリゴヌクレオチドにリンカーを介して共有結合したペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、以下の構造：
［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］
を含む。
いくつかの実施形態では、複合体は、以下の構造：
［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］
からなる。
いくつかの実施形態では、本発明による複合体には、ここに記載されたペプチドのいずれを用いてもよい。
好ましくは、オリゴヌクレオチドはモルフォリノ（より好ましくは、すべてのモルフォリノヌクレオシド間結合が－Ｐ（Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｏ－であるモルフォリノ）である。通常、モルホリニオヌクレオシド間結合のリン原子は、モルフォリノサブユニットの窒素原子に結合している。
オリゴヌクレオチド
ここに開示された複合体に使用されるオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子内の標的部位に相補的なものであることがある。理論に縛られることなく、ヒトジストロフィン遺伝子内の特定の標的領域にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体スプライシングの際に、第４５番エクソン，第５１番エクソン，または第５３番エクソンのスキップを誘導し、それによってデュシェンヌ型筋ジストロフィーを改善する可能性があると考えられている。本発明のオリゴヌクレオチドで使用することができる核酸塩基配列の非限定的な例は、米国特許第９，０１８，３６８号；米国特許第９，０７９，９３４号；米国特許第９，４４７，４１７号；米国特許第１０，３８５，０９２号；米国特許第１０，７８１，４５０号等に見ることができる。あるいは、配列はＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０）であり、マウスジストロフィン遺伝子の第２３番エクソンを標的とする。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的な核酸塩基配列を含み、例えば、第４５番エクソンスキッピングを誘導することができる。このような配列の非限定的な例を表１に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表１に記載されている配列のいずれかから少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＵＵＣＣＵＧ－３’（配列番号１２２）またはそのチミン置換アナログ，５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）からの少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＵＵＣＣＵＧ－３’（配列番号１２２）またはそのチミン置換アナログ，および５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
Figure 2024506099000029
いくつかの実施形態では、表１に示すオリゴヌクレオチド配列中の１つ以上のウラシル（例えば、全てのウラシル）がチミンに置換されている。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、５’－ＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＵＵＣＣＵＧ－３’（配列番号１２２）であることがある。あるいは、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）であることがある。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的で、例えば、第５１番エクソンスキッピングを誘導することができる核酸塩基配列を含む。このような配列の非限定的な例を表２に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表２に記載されている配列のいずれかから、少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（配列番号１３０）またはそのチミン置換アナログ，あるいは５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）からの少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（配列番号１３０）またはそのチミン置換アナログ，および５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
Figure 2024506099000030
いくつかの実施形態では、表２に示すオリゴヌクレオチド配列中の１つ以上のウラシル（例えば、全てのウラシル）がチミンに置換されている。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（配列番号１３０）であることがある。あるいは、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）であることがある。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的で、例えば、第５３番エクソンスキッピングを誘導することができる核酸塩基配列を含む。このような配列の非限定的な例を表３に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表３に記載されている配列のいずれかから、少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）または５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）からの少なくとも１２個（例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上）の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）および５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
Figure 2024506099000031
いくつかの実施形態では、表３に示すオリゴヌクレオチド配列中の１つ以上のチミン（例えば全てのチミン）をウラシルに置換する。いくつかの実施形態では、表３に示すオリゴヌクレオチド配列中の１つ以上のウラシル（例えば、全てのウラシル）がチミンに置換されている。
ペプチド
ここで述べられる複合体に使用可能なペプチドは、国際公開第２０２０／０３０９２７号および国際公開第２０２０／１１５４９４号に開示されているものを含む。好ましくは、ここで述べられる複合体に含まれるペプチドは、人工アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基のいかなる形態も含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６－アミノヘキサン酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは天然アミノ酸残基のみを含み、したがって、天然アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、天然アミノ酸に置き換えられる。いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンから選択されるアミノ酸に置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、６－アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、６－アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば６－アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンのいずれかの組合せ、例えば、ベータアラニン、ヒスチジン、およびヒドロキシプロリンのいずれかの組合せに置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも４アミノ酸残基をそれぞれ含む２つ以上のカチオン性ドメインと、少なくとも３アミノ酸残基をそれぞれ含む１つまたは複数の疎水性ドメインを含む、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、少なくとも１個のカチオン性ドメインがヒスチジン残基を含むペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のカチオン性ドメインはヒスチジンリッチである。
いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチによって意味されるものは、カチオン性ドメインに関連して本明細書で定義されている。
カチオン性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも２つのカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大４つのカチオン性ドメイン、最大３つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含む。
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも４アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する２つ以上のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、４アミノ酸残基から１２アミノ酸残基の間の長さ、適切には４アミノ酸残基から７アミノ酸残基の間の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、４、５、６、または７アミノ酸残基の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは同様の長さであり、例えば、それぞれのカチオン性ドメインは同じ長さである。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインはカチオン性アミノ酸を含み、極性アミノ酸および／または非極性アミノ酸も含み得る。
非極性アミノ酸は、アラニン、ベータアラニン、プロリン、グリシン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンから選択することができる。適切には、非極性アミノ酸は電荷を有していない。
極性アミノ酸は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。いくつかの実施形態では、選択された極性アミノ酸は、負電荷を有していない。
カチオン性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシンから選択することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性アミノ酸は、生理学的ｐＨで正電荷を有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アニオン性アミノ酸残基または負電荷アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および／またはセリン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および／またはセリン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも７．５、少なくとも８．０、少なくとも８．５、少なくとも９．０、少なくとも９．５、少なくとも１０．０、少なくとも１０．５、少なくとも１１．０、少なくとも１１．５、少なくとも１２．０の等電点（ｐｉ）を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも１０．０の等電点（ｐｉ）を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、１０．０から１３．０の間の等電点（ｐｉ）を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、１０．４から１２．５の間の等電点（ｐｉ）を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインの等電点は、当技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって生理学的ｐＨで算出される。いくつかの実施形態では、ＩＰＣ（ｗｗｗ．ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ．ｏｒｇ）のＬｕｋａｓｚ Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ、Ｂｉｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ． ２０１６；１１：５５．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１３０６２－０１６－０１５９－９によって開発されたｗｅｂベースのアルゴリズムを使用する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも１個のカチオン性アミノ酸、例えば、１カチオン性アミノ酸から５カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも２つのカチオン性アミノ酸、例えば、２カチオン性アミノ酸から５カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび／またはヒスチジンリッチである。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、ヒスチジンおよびアルギニンの両方を含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のヒスチジン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、合計で１ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、１アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、１アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、１ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、合計で２ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、３アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、３アルギニン残基から５アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、２ヒスチジン残基から５ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、１つまたは複数のベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、合計で２ベータアラニン残基から５ベータアラニン残基の間のベータアラニン残基、適切には合計で２ベータアラニン残基または３ベータアラニン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、１つまたは複数のヒドロキシプロリン残基またはセリン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、１ヒドロキシプロリン残基から２ヒドロキシプロリン残基の間のヒドロキシプロリン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、１セリン残基から２セリン残基の間のセリン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はヒスチジンであり得るか、あるいは、例えば、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はアルギニンであり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアルギニンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアルギニンリッチカチオン性ドメインと、少なくとも１個のヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのアルギニンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのアルギニンおよびヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つのアルギニンリッチカチオン性ドメインと１つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、３つ以下の連続するアルギニン残基、例えば、２つ以下の連続するアルギニン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、連続するヒスチジン残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメイン内のアミノ酸残基の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％は、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基である。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および／またはベータアラニン残基からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、および必要に応じてアルギニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第１のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第１のカチオン性ドメインと、アルギニン残基、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも２つのカチオン性ドメインを含み、例えば、これらのカチオン性ドメインはペプチドのアームを形成する。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に位置している。いくつかの実施形態では、したがって、カチオン性ドメインは、カチオン性アームドメインとして公知であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含み、１つはペプチドのＮ末端に位置しており、もう１つはペプチドのＣ末端に位置している。いくつかの実施形態では、ペプチドのいずれかの末端に位置している。いくつかの実施形態では、末端修飾、リンカーおよび／またはオリゴヌクレオチドなどの他の基を除き、さらなるアミノ酸またはドメインは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に存在しない。誤解を避けるために、そのような他の基は、本明細書で記載され、特許請求されている「ペプチド」に加えて存在し得る。いくつかの実施形態では、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、ペプチドの末端を形成する。いくつかの実施形態では、これは、本明細書で記載されているさらなるリンカー基の存在を排除するものではない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大４つのカチオン性ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、両方ともアルギニンリッチである２つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである１つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、両方がアルギニンリッチおよびヒスチジンリッチである２つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである１つのカチオン性ドメインと、ヒスチジンリッチである１つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、以下のＲ、Ｈ、Ｂ、ＲＲ、ＨＨ、ＢＢ、ＲＨ、ＨＲ、ＲＢ、ＢＲ、ＨＢ、ＢＨ、ＲＢＲ、ＲＢＢ、ＢＲＲ、ＢＢＲ、ＢＲＢ、ＲＢＨ、ＲＨＢ、ＨＲＢ、ＢＲＨ、ＨＲＲ、ＲＲＨ、ＨＲＨ、ＨＢＢ、ＢＢＨ、ＲＨＲ、ＢＨＢ、ＨＢＨから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインはまた、セリン残基、プロリン残基および／またはヒドロキシプロリン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、以下のＲＰ、ＰＲ、ＲＰＲ、ＲＲＰ、ＰＲＲ、ＰＲＰ、Ｈｙｐ；Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ、ＲＲ［Ｈｙｐ］、［Ｈｙｐ］ＲＲ、［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］、［Ｈｙｐ］［Ｈｙｐ］Ｒ、Ｒ［Ｈｙｐ］［Ｈｙｐ］、ＳＢ、ＢＳから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せ、または上記で列挙したアミノ酸単位との任意の組合せをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のいずれかまたはその任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のいずれかまたはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）のうちの１つからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは異なる。
疎水性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも１個の疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
「疎水性」への言及は、本明細書では、水をはじく能力を有するか、または水と混じり合わないアミノ酸またはアミノ酸のドメインを示す。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大３つの疎水性ドメイン、最大２つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つの疎水性ドメインを含む。
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも３アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する１つまたは複数の疎水性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、３アミノ酸から６アミノ酸の間の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、５アミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基を含み得る。
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンから選択することができる。
非極性アミノ酸残基は、プロリン、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンから選択することができる。
極性アミノ酸残基は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインは、親水性アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、疎水性アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも０．３、少なくとも０．３５、少なくとも０．４、少なくとも０．４５の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも１．２、少なくとも１．２５、少なくとも１．３、少なくとも１．３５の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、０．４から１．４の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、０．４５から０．４８の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、１．２７から１．３９の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、疎水性は、ＷｈｉｔｅおよびＷｉｍｌｅｙ：Ｗ．Ｃ．Ｗｉｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ｈ． Ｗｈｉｔｅ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ３：８４２（１９９６）によって測定されるものである。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも３疎水性アミノ酸残基、少なくとも４疎水性アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、およびグルタミン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、および／またはグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシンおよび／またはグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、トリプトファンおよび／またはプロリン残基からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、ペプチドの中央に位置する。いくつかの実施形態では、したがって、疎水性ドメインは、コア疎水性ドメインとして公知であり得る。いくつかの実施形態では、上記疎水性コアドメインまたはそれぞれの疎水性コアドメインは、両側がアームドメインによって挟まれている。いくつかの実施形態では、アームドメインは、１つまたは複数のカチオン性ドメインと、１つまたは複数のさらなる疎水性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる２つのアームドメインを含み、それぞれのアームドメインはカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる２つのカチオン性アームドメインからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはそれらの任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）のうちの１つからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチド内のそれぞれの疎水性ドメインは、同じ配列または異なる配列を有し得る。
本発明は、病状の処置における治療用カーゴ分子の輸送で使用するための短い細胞透過性ペプチドに関する。
ペプチドは、連続する単一分子である配列を有し、したがって、ペプチドのドメインは連続している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の間に直線的に配置されたいくつかのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ドメインは、上記で記載したカチオン性ドメインおよび疎水性ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、カチオン性ドメインおよび疎水性ドメインからなり、ドメインは上記で定義した通りである。
それぞれのドメインは、上記の関連セクションで記載した共通の配列特性を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変形形態および修飾が可能である。したがって、それぞれのドメインに対して様々な配列が可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組合せは、様々なペプチド構造をもたらし、それらのそれぞれが本発明の一部を形成する。ペプチド構造の特徴は以下に記載されている。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインは、任意の２つのカチオン性ドメインを分ける。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、その両側でカチオン性ドメインにより挟まれる。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、別のカチオン性ドメインと連続していない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配置で２つのカチオン性ドメインにより挟まれている１つの疎水性ドメインを含む：
［カチオン性ドメイン］－［疎水性ドメイン］－［カチオン性ドメイン］。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインはコアドメインとして公知であり得、それぞれのカチオン性ドメインはアームドメインとして公知であり得る。いくつかの実施形態では、疎水性アームドメインは、カチオン性コアドメインをその両側から挟む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性ドメインおよび１つの疎水性ドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、２つのカチオン性アームドメインに挟まれた１つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、およびＲ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）から選択される配列をそれぞれ含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、およびＷＷＰＷ（配列番号２６）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）から選択される配列を含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、およびＩＬＦＱＹ（配列番号２２）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）から選択される配列を含む２つのカチオンのアームドメインに挟まれた、配列：ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）を含む１つの疎水性コアドメインからなる。
いずれかのそのような実施形態では、さらなる基、例えば、リンカー、末端修飾および／またはオリゴヌクレオチドが存在し得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ－アセチル化、Ｎ－メチル化、Ｎ－トリフルオロアセチル化、Ｎ－トリフルオロメチルスルホニル化、またはＮ－メチルスルホニル化されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ－アセチル化されている。
必要に応じて、ペプチドのＮ末端は修飾されていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ－アセチル化されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カルボキシ基、チオ酸基、アミノオキシ基、ヒドラジノ基、チオエステル基、アジド基、歪みアルキン、歪みアルケン、アルデヒド基、チオール基またはハロアセチル基から選択されるＣ末端修飾を含む。
有利なことには、Ｃ末端修飾は、ペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させるための手段を提供する。
したがって、Ｃ末端修飾はリンカーを含むことができ、その逆も同様である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端修飾はリンカーからなっていてもよく、その逆も同様である。適切なリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端カルボキシル基を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端カルボキシル基は、グリシンまたはベータアラニン残基によって提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端カルボキシル基は、ベータアラニン残基によって提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端のベータアラニン残基は、リンカーである。
いくつかの実施形態では、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、Ｎ末端修飾またはＣ末端修飾をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端のカチオン性ドメインは、Ｃ末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端のカチオン性ドメインは、Ｎ末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端のカチオン性ドメインはリンカー基を含み、いくつかの実施形態では、Ｃ末端のカチオン性ドメインはＣ末端ベータアラニンを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端のカチオン性ドメインは、Ｎ－アセチル化されている。
本発明のペプチドは、４０アミノ酸残基以下の全長を有するものと定義される。ペプチドは、したがって、オリゴペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、３アミノ酸残基から３０アミノ酸残基の間、例えば、５アミノ酸残基から２５アミノ酸残基の間、１０アミノ酸残基から２５アミノ酸残基の間、１３アミノ酸残基から２３アミノ酸残基の間、１５アミノ酸残基から２０アミノ酸残基の間の全長を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基、少なくとも１３アミノ酸残基、少なくとも１４アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも１６アミノ酸残基、少なくとも１７アミノ酸残基の全長を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞に透過することが可能である。ペプチドは、したがって、細胞透過性ペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに付着させるためのものである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に輸送するためのものである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達するためのものである。ペプチドは、したがって、担体ペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞および組織に、適切には細胞の核に透過することが可能である。例えば、筋肉組織に透過することが可能である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列のいずれかから選択することができる：
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲ（配列番号２８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＲＢＲＢＲ（配列番号２９）
ＲＢＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号３０）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３３）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＲＢＲ（配列番号３４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号３６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＲＢＨ（配列番号３９）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＨＢＨ（配列番号４０）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＨＢＨ（配列番号４１）
ＲＢＲＨＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号４２）
ＲＢＲＢＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号４５）
ＲＢＲＲＢＨＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４６）
ＨＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４７）
ＲＢＲＲＢＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号４９）
ＲＢＲＲＢＲＹＱＦＬＩＨＢＨＢＨ（配列番号５０）
ＲＢＲＲＢＲＩＬＦＱＹＨＢＨＢＨ（配列番号５１）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＨ（配列番号５２）
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下のさらなる配列のいずれかから選択することができる：
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＳ（配列番号５３）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢ［Ｈｙｐ］（配列番号５４）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号５５）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５６）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号５７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号５８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号５９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号６０）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＢＲＢＲ（配列番号６１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＲＢＲ（配列番号６４）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＲＢＲ（配列番号６５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号６６）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲ（配列番号６７）
ＢＲＢＲＢＷＷＰＷＷＲＢＲＲＢＲ（配列番号６８）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号６９）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＹＲＢＨＢＨ（配列番号７０）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＨ（配列番号７１）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号７３）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＲ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］Ｈ（配列番号７４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７５）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＲＢＨＢＨ（配列番号７６）
ＲＢＲＲＢＲＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７７）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号７８）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号７９）
ＲＢＲＲＢＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８０）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８１）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８２）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＰＷＷＲＢＨＢＨ（配列番号８３）
ＲＢＲＲＢＲＲＷＷＰＷＲＢＨＢＨ（配列番号８４）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８５）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８６）
ＲＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８７）
ＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＢＨＢＨ（配列番号８８）
ＲＢＲＲＢＨＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号８９）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０１）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号１０２）
Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］ＲＦＱＩＬＹ［Ｈｙｐ］Ｒ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１０３）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０４）
ＲＢＲＲＢＲＷＷＰＷＷＢＲＢＲ（配列番号１０５）
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列のうちの１つから選択することができる：
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）
ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）
ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）
ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）
ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）。
複合体
いくつかの実施形態では、複合体は、以下の配列のうちの１つから選択されるペプチドを含む：ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）およびＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）。いくつかの実施形態では、複合体は、配列番号２７～５２、配列番号５３～８９、配列番号１０１～１０５、並びに配列番号２７，３１，３２，３５，３７，３８，および４４のいずれかから選択されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、表１，表２，または表３に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、いずれの場合においても、ペプチドは、上記で記載したＮ末端修飾をさらに含み得る。
適切なリンカーには、例えば、ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール－マレイミド結合を形成することができるＣ末端システイン残基、ペプチド上の塩基性アミノ酸とオキシム、クリック反応もしくはモルフォリノ結合形成を形成するためのＣ末端アルデヒド、またはアミノ基に共有的に複合体化してカルボキサミド結合を形成するペプチド上のカルボン酸部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、１アミノ酸から５アミノ酸の間の長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、当技術分野で公知の任意のリンカーを含み得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、以下の配列：Ｇ、ＢＣ、ＸＣ、Ｃ、ＧＧＣ、ＢＢＣ、ＢＸＣ、ＸＢＣ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸおよびＸＢのいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、ここで、Ｘは、６－アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリマー、例えばＰＥＧなどであり得る。
いくつかの実施形態では、リンカーはベータアラニンである。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カルボキサミド結合を介してオリゴヌクレオチドに複合体化されている。
複合体のリンカーは、ペプチドが結合されるオリゴヌクレオチドの一部を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドの結合は、ペプチドのＣ末端に直接結合され得る。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、リンカーは必要ではない。
あるいは、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに化学的に複合体化され得る。化学結合は、例えば、ジスルフィド、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、アミド、カルボキサミド、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジン、オキシム、ホスフェート、ホスホルアミデート、チオホスフェート、ボラノホスフェート、イミノホスフェート、またはチオール－マレイミドの結合を介し得る。
必要に応じて、システインをオリゴヌクレオチドのＮ末端に付加してペプチドへのジスルフィド結合の形成させることができるか、またはＮ末端をブロモアセチル化させてペプチドへのチオエーテルコンジュゲーションを行うことができる。
本発明のペプチドは、複合体を提供するために、同様に、イメージング分子に共有結合させることができる。
いくつかの実施形態では、イメージング分子は、複合体の可視化を可能にする任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、イメージング分子は、複合体の位置を示すことができる。いくつかの実施形態では、生体外または生体内での複合体の位置である。いくつかの実施形態では、複合体を被験体に投与することと、被験体をイメージングして複合体の位置を確認することとを含む、イメージング分子を含む複合体の位置をモニターする方法が提供される。
イメージング分子の例には、検出分子、コントラスト分子、または増強分子が含まれる。適切なイメージング分子は、放射性核種；フルオロフォア；ナノ粒子（例えばナノシェル）；ナノケージ；発色剤（例えば酵素）、放射性同位元素、色素、放射線不透性物質、蛍光性化合物、およびその組合せから選択され得る。
いくつかの実施形態では、イメージング分子は、イメージング技術を使用して可視化することができ、これらは細胞イメージング技術または医療用イメージング技術であってもよい。適切な細胞イメージング技術には、例えば、画像サイトメトリー、蛍光顕微鏡法、位相差顕微鏡法、ＳＥＭ、ＴＥＭが含まれる。適切な医療用イメージング技術には、例えば、Ｘ線、透視検査、ＭＲＩ、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＦＮＲＩが含まれる。
ある場合には、イメージング分子は、診断用分子と見なされ得る。いくつかの実施形態では、診断用分子は、複合体を使用して疾患の診断を可能にする。いくつかの実施形態では、疾患の診断は、イメージング分子を使用して、複合体の位置を決定することにより達成することができる。いくつかの実施形態では、イメージング分子を含む複合体の有効量を被験体に投与することと、複合体の位置をモニターすることとを含む、疾患の診断方法が提供される。
いくつかの実施形態では、イメージング分子を含む複合体の結合などのさらなる詳細は、オリゴヌクレオチドを含む複合体に関して上記で説明したものと同じである。
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、複合体を提供するために、オリゴヌクレオチドおよびイメージング分子に共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、複合体は、細胞および組織に、例えば、細胞の核に透過することが可能である。例えば、筋組織に透過することが可能である。
リンカー
本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載のペプチドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結するリンカーを含み得る。本発明に有用なリンカーは、ＷＯ２０２０／１１５４９４に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
リンカーは、下記式（Ｉ）による構造を有する：
Ｔ１－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｔ２ （Ｉ）
｛ここで、
Ｔ１は、ペプチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
Ｔ２は、オリゴヌクレオチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
ｎは、１、２又は３であり；
各Ｒ１は、独立して、式：
－Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
［ここで、
Ｙ１は、不在か、又は式：
－［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれ、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｎ（ＲＡ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＡ４ＲＡ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＡ４及びＲＡ５は、それぞれ独立して、水素および（１－４Ｃ）アルキルからなる群から選択される）から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］
で示される基であり；
各Ｒ２は、独立して、式：
－Ｙ２－Ｘ２－Ｚ２
［ここで、
Ｙ２は、不在か、又は式：
－［ＣＲＢ１ＲＢ２］ｍ－
（ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれる整数であり、ＲＢ１及びＲＢ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
Ｘ２は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（ＮＲＢ３）Ｎ（ＲＢ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＢ３）－、又は－Ｎ（ＲＢ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＢ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
Ｚ２は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＢ４ＲＢ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＢ４及びＲＢ５は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）からなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］
で示される基であり；
ただし、
ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なる場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨとなることはなく；
ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なり、Ｒ１及びＲ２の一方がＨである場合、Ｒ１及びＲ２の他方はメチルではなく；
ｎ＝２で、各Ｒ１及びＲ２がＨである場合、Ｔ１及びＴ２はともに－Ｃ（Ｏ）－であるか、又はともに－ＮＨ－である｝。
いくつかの実施形態では、リンカーは、以下の構造：
Figure 2024506099000032
 ，
Figure 2024506099000033
 ，
Figure 2024506099000034
 ，
Figure 2024506099000035
 ，
または
Figure 2024506099000036
 を有する。
医薬組成物
本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩は、医薬組成物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含み得る。
適切な薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび担体は、当技術分野において周知である。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されている疾患、障害、および状態を医療上の使用の下で緩和、媒介、予防、および処置するために、追加の公知の治療剤、薬物、化合物のプロドラッグへの修飾などをさらに含むことができると理解されたい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬として使用するためのものである。例えば、複合体について本明細書に記載されているのと同じ方法で医薬として使用するためのものである。複合体を使用する医療処置に関して本明細書に記載されている全ての特徴は、本医薬組成物に適用される。
したがって、本発明のさらなる態様では、医薬として使用するための第４の態様に記載の医薬組成物が提供される。さらなる態様では、ここで開示される医薬組成物の有効量を被験体に投与することを含む、疾患状態について被験体を処置する方法が提供される。
医療上の使用
本発明のペプチドを含む複合体は、疾患を処置するための医薬として使用することができる。
医薬は、上記で定義した医薬組成物の剤形であり得る。
疾患状態の処置を必要とする患者または被験体を処置する方法であって、治療有効量の複合体を患者または被験体に投与するステップを含む方法も提供される。いくつかの実施形態では、医療処置は、細胞への、例えば、細胞の核へのオリゴヌクレオチドの送達を必要とする。
処置しようとする疾患には、オリゴヌクレオチドによる細胞および／または核膜の透過の改善が治療効果の改善をもたらし得る任意の疾患が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、複合体は、筋神経系の疾患の処置で使用するためのものである。
本発明のペプチドを含む複合体は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はブッチャー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）の治療に適している。
いくつかの実施形態では、複合体は、スプライシング欠損によって引き起こされる疾患の処置で使用するためのものである。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、スプライシング欠陥を予防もしくは修正することが可能であり、および／または正しくスプライシングされたｍＲＮＡ分子の産生を増加させることが可能なオリゴヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態では、複合体は、ＤＭＤの処置に使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、ＤＭＤの処置において使用するための第２の態様に記載の複合体が提供される。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、機能性ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。
いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィン発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％増加させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンの発現を最大５０％増加させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の発現を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の発現を最大５０％回復させる。
いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の機能を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の機能を最大５０％回復させる。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン転写中に１つまたは複数のエクソンのスキッピングを引き起こすことによってそうするように作動可能である。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％のスキッピングを引き起こす。いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンの最大５０％のスキッピングを引き起こす。
いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、任意の動物またはヒトであり得る。いくつかの実施形態では、患者または被験体は、非ヒト哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、患者または被験体は、男性または女性であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は男性である。
いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、０から４０歳、例えば０から３０歳、例えば０から２５歳、例えば０から２０歳の間の年齢である。
いくつかの実施形態では、複合体は、例えば、髄内、髄腔内、脳室内、硝子体内、経腸、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、口腔内、鼻腔内の経路によって被験体に全身投与される。
いくつかの実施形態では、複合体は、被験体に静脈内投与するためのものである。
いくつかの実施形態では、複合体は、被験体に注射により静脈内投与するためのものである。
いくつかの実施形態では、複合体は、「治療有効量」で被験体に投与するためのものであり、それによって、その量が個体に利益性を示すのに十分であることが意味される。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置しようとする疾患の性質および重症度に依存する。用量についての決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓで確認することができる。例示的な用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間、０．０５ｍｇ／ｋｇと４０ｍｇ／ｋｇの間、０．１ｍｇ／ｋｇと３０ｍｇ／ｋｇの間、０．５ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇの間、１ｍｇ／ｋｇと１６ｍｇ／ｋｇの間、２ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇの間、５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの間、１２ｍｇ／ｋｇと１８ｍｇ／ｋｇの間、１３ｍｇ／ｋｇと１７ｍｇ／ｋｇの間であり得る。
有利なことには、本発明の複合体の用量は、例えば、オリゴヌクレオチド単独からのいずれかの効果を見るために必要とされる用量よりも低いオーダーまたは程度でよい。
いくつかの実施形態では、本発明の複合体を投与した後、毒性の１つまたは複数のマーカーは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較して有意に減少する。
毒性の適切なマーカーは、腎毒性のマーカーであり得る。
毒性の適切なマーカーとしては、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、ＢＵＮ、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、およびＢＵＮのうちの少なくとも１個のレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後に減少する。
いくつかの実施形態では、ＫＩＭ－１、ＮＧＡＬ、およびＢＵＮのそれぞれのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後に減少する。
いくつかの実施形態では、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、有意に減少する。
いくつかの実施形態では、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％減少する。
有利なことには、ペプチドと、それによって得られる複合体の毒性は、以前の細胞透過性ペプチドおよび複合体と比較して有意に減少する。特に、ＫＩＭ－１およびＮＧＡＬ－１は毒性のマーカーであり、これらは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較して最大１２０倍有意に減少する。
ペプチド調製
本発明のペプチドは、任意の標準のタンパク質合成方法、例えば、化学合成、半化学合成によって、または発現系の使用を介して、生成することができる。
したがって、本発明はまた、ペプチドをコードするＤＮＡを含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列、発現系、例えば、発現および発現の制御に必要な配列と一緒に前記配列を含むベクター、ならびに前記発現系によって形質転換された宿主細胞および宿主生物に関する。
したがって、本発明に記載のペプチドをコードする核酸もまた提供される。
いくつかの実施形態では、核酸は、単離または精製された形態で提供することができる。
本発明に記載のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターもまた提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。
いくつかの実施形態では、ベクターは、制御配列、例えば、本発明に記載のペプチドをコードする核酸に作動可能に結合したプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、適切な細胞、例えば哺乳動物、細菌または真菌の細胞にトランスフェクトされた場合にペプチドを発現することが可能である。
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
発現ベクターは、本発明の核酸が挿入され得る宿主細胞に応じて選択することができる。宿主細胞のそのような形質転換は、従来の技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ］で教示されているものを含む。適切なベクターの選択は、本技術分野の当業者の技術範囲内である。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、およびウイルスが含まれる。
生成されたペプチドは、任意の適切な方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィー分離、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、宿主細胞から単離および精製することができる。
適切なベクター、宿主および組換え技術は、当技術分野において周知である。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
［実施例］
実施例１
１．材料および方法
１．１ Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ＾－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＵＳＡ）から購入した。ニワトリ胚抽出物およびウマ血清は、Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ（Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）から入手した。インターフェロンは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
１．２ Ｈ２ｋ ｍｄｘ細胞におけるスクリーニングのためのＰ－ＰＭＯペプチドの合成
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ＾－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０ｐｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を使用して１００ｐｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た。

表４：Ｎ末端アセチル化およびＣ末端ベータ－アラニンリンカーを有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｐｉｐ９ｂ２およびＲ６Ｇｌｙは、比較ペプチドである。Ｒ６Ｇｌｙは、Ｃ末端グリシンをリンカーとして使用する。
Figure 2024506099000037
ｂ）ＰＭＯ－ペプチド複合体のライブラリーの合成
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５量体ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のために２．３当量のＨＢＴＵをＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ，８０ｍＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２ｍＬ）、（１６．７ｍＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０ｐＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１００ｍＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して４ｍＬ・分－１の流速でイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチド複合体を精製した。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチド－ＰＭＯ誘導体を白色固体として得た。ペプチド－ＰＭＯ複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、０．２２ｐｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中の複合体の２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表５を参照されたい）。

表５：細胞培養分析のためのＰ－ＰＭＯ複合体の収率（収率は、凍結乾燥させた精製ｐｐｍｏの乾燥重量に基づく。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）Ｐ－ＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した。
Figure 2024506099000038
１．３ 細胞培養
マウスＨ２ｋ ｍｄｘ筋芽細胞を、ゼラチン（０．０１％）被覆フラスコ内で２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ Ｇｏｌｄ，ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、２％ニワトリ胚抽出物（Ｓｅｒａｌａｂ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－ネオマイシン抗生物質混合物（ＰＳＮ，Ｇｉｂｃｏ）と、３ｐｇ／ｐＬのｇ－インターフェロン（Ｒｏｃｈｅ）とを補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ ＰＰＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において１０％ＣＯ２下、３３℃で培養した。細胞をゼラチン（０．０１％）被覆２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、２日間、３３℃、１０％ＣＯ２で放置した。筋管への分化後、５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ）と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭにおいて３７℃で、５％ＣＯ２下、２日間細胞をさらに増殖させた。
１．４ 細胞トランスフェクション
無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で作製した、上記の通り調製したペプチド－ＰＭＯ複合体とともに、細胞をインキュベートし、３５０ｍＬをそれぞれのウェルに二重反復で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を、５％ウマ血清と１％ＰＳＮとを補充したＤＭＥＭで置換し、細胞をさらに２０時間、３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬのＴＲＩ ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）単離試薬をそれぞれのウェルに添加した。細胞を－８０℃で１時間、凍結させた。
１．５ ＲＮＡ抽出およびネステッドＲＴ－ＰＣＲ分析
全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬を使用して抽出し、エタノールでの追加のさらなる沈殿を行った。精製されたＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲの鋳型として、ＲＮＡ（４００ｎｇ）を使用した。プライマー配列については、表７を参照されたい。最初の逆転写のサイクル条件は、３０分間５０℃および７分間９４℃を１サイクル、その後、２０秒間９４℃、４０秒間５５℃および８０秒間６８℃を３０サイクルであった。１マイクロリットルのＲＴ－ＰＣＲ産物を第２のＰＣＲステップの鋳型として使用した。０．５ＵのＳｕｐｅｒＴＡＱを使用して、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で１分間での２５サイクルで、増幅を行った。１．５％アガロースゲルを使用して電気泳動により産物を分離した。アガロースゲルの画像をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋イメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ，ＵＫ）で撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｖ４．１）を使用して画像を解析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用してエクソンスキッピングアッセイデータを解析してプロットし、少なくとも３回の独立した実験からの第２３番エクソンスキッピングのパーセンテージとして表した。
１．６ Ｈ２ｋ ｍｄｘマウスにおける試験のためのＰＭＯ－ペプチド複合体の合成
ａ）ペプチド変異体の合成
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）マイクロ波Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）およびＦｍｏｃ化学を製造業者の推奨手順に従って使用して、ペプチドを１００ｐｍｏｌ規模で合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、ＤＩＰＥＡの存在下、ＰｙＢＯＰ（５倍過剰）を使用して活性化させた５倍過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用してペプチドを合成した。ピペリジン（ＤＭＦ中２０％ｖ／ｖ）を使用して、Ｎ－Ｆｍｏｃ保護基を除去した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで１回は３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％，１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。切断されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。
ｂ）ＰＭＯ－ペプチド複合体の合成
マウスジストロフィン第２３番エクソンの２５量体ＰＭＯアンチセンス配列（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０））を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して２．３当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．３および２倍当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基の活性化のためにＨＢＴＵ（２．３当量）をＰｙＢＯＰの代わりに使用した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ，１００ｍＬ）中のペプチド（１０ｐｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの７６．６ｍＬ）、（６６．７ｍＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（４．０ｍＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの４００ｍＬ）を添加した。混合物を２時間、４０℃で放置し、０．１％ＴＦＡ（１ｍＬ）の添加により反応を停止させた。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ，ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウム（０～１Ｍ）の線形勾配を使用して６ｍＬ・分－１の流速でカチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍＬ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて反応物を精製した。ペプチド－ＰＭＯ複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、０．２２ｐｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中の複合体の２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。全収率（表６）は、ＰＭＯに基づいて２５～３６％であった。

表６：生体内での分析のためにより大きい規模で合成したＰ－ＰＭＯ複合体の収率（収率は、凍結乾燥させた精製ＰＰＭＯの乾燥重量に基づく。ＰＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。（ａ）ＰＰＭＯは、ＰｙＢＯＰの代わりにＨＢＴＵ活性化を使用して合成した。
Figure 2024506099000039
１．７ Ｐ－ＰＭＯによるジストロフィン修復の生体内での評定
実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＯｘｆｏｒｄのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵｎｉｔにおいてＨｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎのもとで施設内倫理審査に従って行った。マウスを最小疾患施設で飼育し、環境を１２時間の昼夜サイクルで温度制御した。動物は、市販の齧歯動物用固形飼料および水を自由に摂取した。
実験は、メス１０～１２週齢ｍｄｘマウスで行った。ｍｄｘマウスを拘束した後、１０ｍｇ／ｋｇのＰ－ＰＭＯの単回尾静脈注射を行った。注射の１週間後、マウスを屠殺し、ＴＡ、心臓および横隔膜筋を除去し、ドライアイス冷却イソペンタンで急速凍結させ、－８０℃で保管した。
１．８ ウェスタンブロット分析
単回投与後のジストロフィン修復期間を評定するために、筋肉の３分の１（ＴＡおよび横隔膜について）または７ｐｍ厚の横断凍結切片（心臓について）を３００ｍｌの緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＮＰ４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，１０％ＳＤＳおよびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤）に溶解した後、１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ、＃３３２５Ｂ）。上清を回収し、１００℃で３分間、加熱した。ＢＣＡ法によりタンパク質を定量し、４０ｐｇタンパク質／試料をＮｕＰａｇｅ ３～８％Ｔｒｉｓ酢酸塩ゲルで以前に記載された（１９）ように分離した。タンパク質を、孔径０．４５ｐｍのＰＶＤＦ膜に１時間、３０Ｖで、その後、１時間１００Ｖで転写し、モノクローナル抗ジストロフィン（１：２００，ＮＣＬ－ＤＹＳ１，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）および抗ビンキュリン（ローディング対照，１：１０００００，ｈＶＩＮ－１，Ｓｉｇｍａ）抗体で以前に記載された（３７）ようにプローブした。二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスを１：２００００の希釈で使用した（ＬｉＣＯＲ）。
Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘマウスにおけるジストロフィン修復レベルを、１００％と見なしたＣ５７ＢＬ／１０野生型対照マウスのレベルに対する相対レベルとして表した。このために、Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘ試料と並行して５系列のＣ５７ＢＬ／１０タンパク質希釈物を含めることにより、標準曲線を作成した。希釈系列は、次の通りであった：レーンごとにローディングした総タンパク質４０ｐｇのそれぞれ７５％、４０％、１５％、５％または０％は、Ｃ５７ＢＬ／１０タンパク質溶解物からのものであり、残部は、未処置ｍｄｘタンパク質溶解物からのものであった。これらの標準物質を分取し、処置ｍｄｘ試料と並行してそれぞれのウェスタンブロットに使用した。全ての標準物質および処置試料について、ジストロフィン強度の定量をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムにより行い、全ての試料におけるビンキュリン蛍光強度に対する比を算出することにより正規化した。標準正規化値をそれらの既知のジストロフィン濃度に対してプロットして最もよく当てはまる数式を得、この式を使用して、Ｐ－ＰＭＯ処置ｍｄｘマウスのそれぞれの試料の正規化値を補間した。
１．９ 生体内でのＤｍｄ第２３エクソンスキッピングのＲＴ－ｑＰＣＲ分析
ペプチド－ＰＭＯで処理した骨格筋および心臓組織を用いて、マウスＤｍｄ転写物からの第２３番エクソンのエクスクルージョンの定量を行った。手短に述べると、均質化された組織からＴｒｉｚｏｌに基づく抽出法を使用してＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。プライマー／プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、非スキップ産物を表す第２３～２４番エクソンにわたる領域を増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２３－２４、表７を参照されたい）または第２２番エクソンと第２４番エクソンの境界にわたるプローブを使用して第２３番エクソンを欠いている転写物を特異的に増幅するように設計された（ｍＤＭＤ２２－２４）。既知の転写物量を使用して作成した標準曲線に対してそれぞれの転写物レベルを較正し、［スキップ］／［スキップ＋非スキップ］によりスキッピングパーセンテージを導出した。

表７：ネステッドＲＴ－ＰＣＲ法または定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による第２３番エクソンスキッピングの定量のためのプライマーおよびプローブ配列
Figure 2024506099000040
１．１０ ペプチド－ＰＭＯの毒物学的評定
８～１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに０．９％食塩水中のペプチド－ＰＭＯの単一用量３０ｍｇ／ｋｇを尾静脈へのボーラス静脈内注射により投与した。投与後２日目および７日目に、代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ，ＵＫ）に２０時間収容した後、冷却条件下で尿を非侵襲的に採取した。７日目の剖検時に頸静脈から血清を採取し、前脛骨筋、横隔膜および心臓組織も採取した。
尾静脈への静脈内注射による０．９％食塩水中のペプチド－ＰＭＯの２．５ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまでにわたる異なる単一投薬量で同じ手順を踏んだ。
標準曲線に当てはまるように尿を適切に希釈した後、ＥＬＩＳＡによりＫＩＭ－１（腎損傷分子－１）およびＮＧＡＬ（好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン）の尿中レベルを定量した（ＫＩＭ－１ Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＫＭ１００，ＮＧＡＬ Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＬＣＮ２０）。ＭＲＣ Ｈａｒｗｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｒｙ Ｌｙｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫで定量した尿中クレアチニンレベルに対して値を正規化した。血清血中尿素窒素レベルは、ＭＲＣ Ｈａｒｗｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｒｙ Ｌｙｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫで定量した。
全てのレベルをＡＵ６８０ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒで定量した。
エクソンスキッピングの有効性の定量を第２３番エクウソンスキップおよび非スキップ転写物の定量的ＲＴ－ＰＣＲにより判定し、スキップ転写物の全（スキップおよび非スキップ）転写物（配列については表７を参照されたい）に対するパーセンテージとして表した。
２．結果
ここで提供する結果は、細胞内でのエクソンスキッピング活性においてここで生成したペプチド－ＰＭＯ複合体の明らかな用量応答効果を実証する（図１，２および１２）。これらの図は、ＤＰＥＰ１およびＤＰＥＰ３系の全て、すなわち本発明のペプチドが、治療上の使用の考慮に足る細胞内への十分な細胞透過有効性を有することも強調する。
ここで提供する結果は、疾患の適切なマウスモデルにおける生体内でのペプチド－ＰＭＯ複合体の活性をさらに強調する（図３～４）。全体的に見て、これらの結果は、このような複合体の活性が、前脛骨筋で最大であり、次に横隔膜、その次に心臓であることを示唆している。これらの図は、本発明のＤＰＥＰペプチド複合体が、生体内で良好なエクソンスキッピング活性を有すること、および生体内でジストロフィンタンパク質発現の増加をもたらすことを実証する。さらに、本発明のＤＰＥＰ複合体は、同じ複合体を使用したとき、両方の点で、「ＰＩＰ」ペプチドおよびＲ６Ｇｌｙなどの以前の細胞透過性ペプチドと比べて勝るとも劣らない。
ＤＰＥＰペプチド複合体化合物の投与後のＫＩＭ－１およびＮＧＡＬ（これらは腎毒性の指標である）のレベルが、以前の細胞透過性ペプチドとの複合体より有意に低いことも、ここで実証される。ＤＰＥＰ１．９および３．８複合体は、そのようなマーカーの最低レベルを示した（図５，６および１１）。血清血中尿素窒素レベル（腎機能障害のもう１つのマーカー）も、Ｐｉｐ９ｂ２との複合体についてのみ上昇し、本発明のＤＰＥＰペプチドとの複合体については上昇しなかった（図７）。第２の主要な発見は、投与の７日後、ＫＩＭ－１およびＮＧＡＬレベルが全てのＤＰＥＰペプチド複合体についてほぼ食塩水レベルに低下することであり、これは、腎臓関連毒性の何らかの逆転および改善もあることを示唆している。このような効果は、以前の細胞透過性ペプチドを使用する複合体では見られなかった。毒性のこの逆転効果は、本発明のＤＥＤＰペプチドでは５０ｍｇ／ｋｇの高用量で与えたときでさえ見られる（図１１）。以前の細胞透過性ペプチドは、７日後には毒性の減少を示さず、全体を通して毒性マーカーがはるかに高いままであった。
エクソンスキッピング活性が、ＤＰＥＰペプチド複合体の全てについて３０および５０ｍｇ／ｋｇのより高用量でＴＡおよび横隔膜において高いままであり（図１０および１２）、これは、腎障害マーカーのレベル低下で裏付けられ、毒性マーカーが何倍も低いのでこれらの化合物のより広い治療指数を示唆する。ＤＰＥＰペプチド複合体の全てが、複合体中の公知Ｒ６Ｇｌｙコンパレーターより高い活性を有し、その上、同様の毒性マーカーレベルを少なくとも維持すること、および複合体中の公知ＰＩＰペプチドコンパレーターと同様の活性を有し、その上、はるかに低い毒性マーカーレベルを有することも、注目に値する。一部の場合には、本発明のＤＰＥＰペプチド複合体は、公知Ｒ６Ｇｌｙ複合体と比較して活性の増加ばかりでなく、毒性マーカーの低減も示す。
したがって、本発明のＤＰＥＰ１および３ペプチドは、ヒトにおける神経筋障害の処置のための治療用複合体の有効性を改善し、毒性を低下させるために有望な細胞透過性ペプチドを提供する。
３．さらなる実施例
Ｐ－ＰＭＯ合成および調製
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、およびＦｍｏｃ＾－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９または０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジエチルエーテルは、ＶＷＲ（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。ＰＭＯは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーションを使用して行った。水中５０％アセトニトリル中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±０．１％である。
細胞におけるスクリーニングのためのＰ－ＰＭＯペプチドの合成
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ＾－Ａｌａ－ＯＨがプレローディングされているＷａｎｇ樹脂（０．１９もしくは０．４６ｍｍｏｌ・ｇ－１，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、標準的なＦｍｏｃ化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して１０ｐｍｏｌスケールで調製するか、またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を使用して１００ｐｍｏｌスケールで調製した。Ｉｎｔａｖｉｓ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成する場合、ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ２回カップリングしたアルギニン残基を除いて、１回、７５℃で５分間、６０ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、７５℃で２回、１回は３０秒間、次いで３分間、３５ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、固相結合ペプチドのＮ末端をＤＩＰＥＡの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。Ｎ末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５％：２．５％：２．５％：３～１０ｍＬ）からなる切断カクテルでの３時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なＴＦＡを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル（合成規模に依存して１５～４０ｍＬ）の添加および３２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、３回、冷ジエチルエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、４４５－ＬＣ Ｓｃａｌｅ－ｕｐモジュールと４４０－ＬＣフラクションコレクターとを取り付けたＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＣＨ３ＣＮの線形勾配を使用して１５ｍＬ・分－１の流速でＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）を用いて半分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。検出は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た（収率について表８を参照されたい）。

表８：Ｎ末端アセチル化（Ａｃ）、Ｃ末端β－アラニンリンカー（Ｂ）を有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Ｓ＊は、グルコシル化セリン残基である。ＤＰＥＰ５．７、Ｐｉｐ９ｂ２、およびＰｉｐ６ａは、比較ペプチドである。
Figure 2024506099000041
トリプレットリピート配列に対する２１量体 ＰＭＯアンチセンス配列
別名［ＣＡＧ］７として公知のトリプレットリピート配列（ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１９２））の２１量体ＰＭＯアンチセンス配列を使用した。ペプチドをそのＣ末端カルボキシル基によってＰＭＯの３’末端に複合体化した。これは、２．５当量のＤＩＰＥＡ、およびＤＭＳＯに溶解したＰＭＯに対して２．５倍過剰のペプチドの存在下、ＮＭＰ中の２．５および２当量のＰｙＢＯＰおよびＨＯＡｔをそれぞれ使用して達成した。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ，８０ｐＬ）中のペプチド（２５００ｎｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（ＮＭＰ中０．３Ｍの１９．２ｍＬ）、（１６．７ｍＬの０．３Ｍ ＮＭＰ）中のＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ（１．０ｍＬ）、およびＰＭＯ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１８０ｐＬ）を添加した。混合物を２．５時間、４０℃で放置し、Ｈ２Ｏ（３００ｐＬ）中の０．１％ＴＦＡの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤（２５ｍＭ，ｐＨ７．０）の線形勾配を使用してイオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ４ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＭＯ－ペプチド複合体を精製した。塩化ナトリウム溶液（１Ｍ）を使用して複合体をカラムから４ｍＬ・分－１または６ｍＬ・分－１のどちらかの流速で溶出した。所望の化合物を含有する画分を併せ、直ちに脱塩した。ペプチド－ＰＭＯ複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｕｌｔｒａ－１５ ３Ｋ遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、０．２２ｐｍ酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド－ＰＭＯの濃度は、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中の複合体の２６５ｎｍでのモル吸収により判定した。（収率については表９を参照されたい）。

表９：細胞培養分析および生体内での実験のためのＰ－ＰＭＯ複合体の収率（収率は、凍結乾燥させた精製Ｐ－ＰＭＯの乾燥重量に基づく）。Ｐ－ＰＭＯの純度は、２２０ｎｍおよび２６０ｎｍで順相ＨＰＬＣにより確認して９５％より高い。
Figure 2024506099000042
ペプチド－ＰＭＯ複合体合成
前記の通りにペプチドを合成し、ＰＭＯに複合体化した。ＣＵＧ／ＣＴＧ伸長リピート（５’－ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１９２））を標的とするＰＭＯ配列は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣから購入した。これを本明細書の他の箇所では［ＣＡＧ］７ＰＭＯと呼ぶ。
細胞培養およびペプチド－ＰＭＯ処理
健常個体または２６００のＣＴＧリピートを有するＤＭ１患者からの不死化筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５０ｐｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、２５ｐｇ／ｍｌのフェチュインと、０．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、０．２ｐｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とを補充した、Ｍ１９９：ＤＭＥＭの混合物（１：４比，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる増殖培地で培養した。コンフルエントな細胞培養物を、筋芽細胞用の５ｐｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ培地に切替えることにより、筋分化を誘導した。処理のために、ＷＴまたはＤＭ１細胞を４日間、分化させた。次いで、培地を、１、２、５、１０、２０または４０ｐＭ濃度のペプチド－ＰＭＯ複合体を含有する新鮮分化培地と交換した。処理の４８時間後に分析のために細胞を回収した。ヒト肝細胞への４０μＭのまたはヒト筋芽細胞への１、２、５、１０、２０もしくは４０ｐＭ濃度のペプチド－ＰＭＯのトランスフェクションの２日後に、ヒト肝細胞およびヒト筋芽細胞における細胞生存率を、蛍光ベースアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。
ＲＮＡ単離，ＲＴ－ＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析
マウス組織の場合：ＲＮＡ抽出前に、ＦａｓｔｐｒｅｐシステムおよびＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用してＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で筋肉を破壊した。ヒト細胞の場合：ＲＮＡ抽出前に、細胞をプロテインキナーゼＫ緩衝剤（５００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＫ）に４５分間、５５℃で溶解した。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを製造業者のプロトコールに従って使用して全ＲＮＡを単離した。合計２０ｐＬのＭ－ＭＬＶ第１鎖合成系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、１マイクログラムのＲＮＡを逆転写した。その後、１マイクロリットルのｃＤＮＡ調製物を半定量的ＰＣＲ分析において標準プロトコール（ＲｅｄｄｙＭｉｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用した。それぞれの遺伝子について線形増幅範囲内で２５～３５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．５～２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。エクソンインクルージョン率を、アイソフォームシグナルの全強度に対するインクルージョンのパーセンテージとして定量した。プライマーを次の表１０に示す。

表１０：ＰＣＲ用のプライマー
Figure 2024506099000043
毒物学
上のセクション１．１０で説明したように毒物学評定を行った。
結果
処置したＤＭ１患者由来の筋肉細胞（筋芽細胞）は、ＤＰＥＰ１または３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体が特異的に突然変異型ＣＵＧｅｘｐ－ＤＭＰＫ転写物を標的として、スプライシング欠陥および筋ジストロフィーの原因となる、核ＲＮＡ病巣によるＭＢＮＬ１スプライシング因子の有害な隔離およびその結果としてのＭＢＮＬ１機能低下を抑止することを示した。ＤＰＥＰ１／３ペプチド－［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体は、細胞を透過し、高い有効性でスプライシング正常化を誘導する（図１３）。いわゆる「ＯＲＥＲ１およびＤＰＥＰ３」ペプチドのこれらの新規生成は、ＣＡＧ７リピートアンチセンスオリゴヌクレオチドＰＭＯと複合体したとき生体外でスプライシング欠陥を修正する高い有効性を示した。これは、ＤＭ１の処置のための治療に使用できる可能性があることを示す。
さらに、ＤＰＥＰ１／３を用いて形成した複合体の予備的な毒物学的評価は、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＫＩＭ－１、ＢＵＮ、ＮＧＡＬおよびクレアチニンレベルが、Ｐｉｐ系からの現在利用可能なペプチド担体により典型的に誘導される増加倍数とは対照的に、食塩水対照注射と同様であったことを示す。この予備的データにより、本発明者らは、ＤＰＥＰペプチドと［ＣＡＧ］７ＰＭＯから形成した複合体が、Ｐｉｐ６ａなどの以前のペプチドを用いて形成された複合体と同様に活性であるが、毒性が低いため、より広い治療域を有することを明らかにした（図１５～１９）。
実施例２
１．材料および方法
１．１ 材料
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４６ｍモルｇ－１）、及びＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨ前負荷Ｗａｎｇ樹脂（０．１９又は０．４６ｍモルｇ－１）を、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ホーエンブルン，独国）から得た。Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｈｙｄｒｏｘｙ－ｔｒｉｔｙｌ樹脂をＲａｐｐ ポリマーｅ（チュービンゲン，独国）から購入した。ＨＰＬＣ等級アセトニトリル、メタノール、及び合成等級のＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ラフバラー，英国）から得た。ペプチド合成等級Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジエチルエーテルをＶＷＲ（レスターシャ―，英国）から得た。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をＡｌｆａ Ａｅｓａｒ（ヘイシャム，イングランド）から得た。ＰＭＯをＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．（フィロマス，米国）から購入した。Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，チィエシャー、英国）ワークステーションを使用して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を行った。マトリックスとして、５０％アセトニトリル水溶液中のα－シアノ－４－ヒドロキシ経皮酸又はシナピン酸の０ｍｇｍｌ－１のストック溶液を使用した。Ｖａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ヤーントン，英国）にて、分析及びセミ分取ＨＰＬＣを行った。ＤＭＥＭ培地（３１９６６０４７）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（１０２７０１０６）、抗生物質－抗真菌剤混合溶液（Ａ５９５５）、臭化エチジウム（１５５８５０１１）、２ｘ ＲｅｄｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢ０５７５ＤＣＬＤＢ）、Ｍ－ＭＬＶファーストストランド合成システム（２８０２５０１３）、及びＴＲＩｚｏｌ試薬（１５５９６０２６）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＲｅａｌＴｉｍｅ－Ｇｌｏ（商標名）ＭＴ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ９７１１），Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＳ１０５０）をＰｒｏｍｅｇａから購入した。筋芽細胞を、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ’ｓ骨格筋細胞成長培地キット（Ｃ－２３１６０）にて培養した。インスリン（９１０７７Ｃ）、及びアガロース（Ａ９５３９）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ －ＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒ ５０ｂｐ（ＢＩＯ－３３０３９）をＢｉｏＬｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓから得た。全てのプライマーを、ＩＤＴを通して注文した。尿収集のため、マウスを、単独で、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ（英国）からの代謝ケージに収容し、腎臓損傷マーカー－１（ＫＩＭ－１）用の尿バイオマーカーＥＬＩＳＡ（ＭＫＭ１００）をＲ＆Ｄから得た。他の表示しない限り、他の全ての試薬をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（英国）から得た。
１．２ ペプチド－ＰＭＯ複合体の合成
１．２．１ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを介するペプチドバリアントの合成
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標名）マイクロウエーブＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，英国）及び製造者の推薦に従うＦｍｏｃ化学を使用して、１００ｐモルスケールでペプチドを合成した。リンカーとしてグルタミン酸又はコハク酸を有するペプチドを、ＴＦＡ開裂後、ペプチドのカルボキシル末端でアミドを産生するため、Ｒｉｎｋアミド樹脂にて合成した。前負荷Ｗａｎｇを使用して、β－アラニンリンカーを有するペプチドを合成した。合成方法及びリンカーとともに、合成されたペプチドの全リストを表１１に示す。使用した側鎖保護基はＴＦＡ処理には不安定であり、ＤＩＰＥＡの存在下、ＰｙＢＯＰ（５倍過剰量）を使用して活性化したＦｍｏｃ－保護アミノ酸の５倍過剰量（０．２５ｍモル）を使用して、ペプチドを合成した。Ｎ－Ｆｍｏｃ－保護基を除去するため、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ ＤＭＦ溶液）を使用した。アルギニン残基を除き、マイクロ波電力６０Ｗにおいて、７５℃、５分間で１回カップリングを行い、アルギニン残基については２回ずつカップリングした。各脱保護反応を、マイクロ波電力３５Ｗにおいて、７５℃で２回（３０秒間で１回、ついで、３分間で１回）を行った。合成が完了した後、ＤＭＦ（３×５０ｍｌ）にて樹脂を洗浄し、ＤＩＰＥＡの存在下、室温において、１５分間で、無水酢酸にて、固相に結合したペプチドのＮ－末端をアセチル化した。Ｎ－末端のアセチル化後、ＤＭＦ（３×２０ｍｌ）及びＤＣＭ（３×２０ｍｌ）にて、ペプチド樹脂を洗浄した。Ｎ－末端にコハク酸を有するＤＰＥＰペプチドについては、Ｎ－末端のアセチル化を行わなかった。代わりに、ペプチドの遊離Ｎ－末端を、ＤＩＰＥＡの存在下、室温において、３０分間で無水コハク酸にて処理し、続いて、ＤＭＦ（３×２０ｍｌ）にて洗浄した。Ｎ－末端にリンカーとしてグルタミン酸を有するＤＰＥＰペプチドについては、上述のようにＮ－末端をアセチル化したが、ＰＭＯの結合を、側鎖カルボキシル基において行った。
１．２．２ Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒを介するペプチドバリアントの合成
Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ及び製造者の推薦に従うＦｍｏｃ化学を使用して、室温において、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）Ｃｌ－トリチル樹脂上で、γ－アミノ酪酸リンカーを有するペプチドを合成した。製造者の推薦通りに塩化アセチルを使用して、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）ヒドロキシ－トリチル樹脂からＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）Ｃｌ－トリチル樹脂を調製した。簡潔には、樹脂（１ｇ）を、ＤＭＦ（２×１０ｍｌ）、乾燥ＤＣＭ（３×１０ｌ）、及び乾燥トルエン（３×１０ｍｌ）にて洗浄し、冷却器を具備する丸底フラスコに移した。十分な量のトルエンを添加して樹脂を覆い、ついで、塩化アセチルを１滴ずつ添加し（樹脂１ｍｌｇ－１，全容積１ｍｌ）、緩やかに撹拌しながら、混合物を、６０～７０℃において、３時間加熱した。完了後、樹脂を室温まで冷却し、ついで、トルエン（５×１５ｍｌ）、ＤＭＦ（５×１５ｍｌ）及び最後に乾燥ＤＣＭ（３×１５ｍｌ）にて完全に洗浄した。ついで、樹脂に、ＤＩＥＡ（８当量）とともにＤＣＭ中のＦｍｏｃ－γ－アミノ酪酸（３当量）を負荷し、その後、追加のＤＩＥＡ（４当量）を付加し、反応混合物を計１時間混合した。ついで、１時間後、樹脂をＭｅＯＨ（０．８ｍｌｇ－１）と１５分間カップリングし、ついで、ＤＭＦ（５×１０ｍｌ）及びＤＣＭ（５×１５ｍｌ）にて洗浄した。樹脂の収率及び負荷を、ＵＶ／可視分光光度法に基づく３０４ｎｍでのＦｍｏｃ測定によって行い（０．４１ｍモルｇ－１である）、樹脂を直ちに使用した。
一般的には、ＴＦＡに対して不安定な側鎖保護基を有する標準のＦｍｏｃアミノ酸を使用して、１００ｐモルスケールでペプチドを合成し、４－メチルモルホリンの存在下、ＰｙＢＯＰ（５倍過剰量）を使用して活性化した５倍過剰量のＦｍｏｃ－保護アミノ酸（０．０５ｍモル）を使用して、ペプチドを合成した。ダブルのカップリング工程を使用し、続いて、各工程後に無水酢酸によるキャッピングを行った。ピペリジン（２０％ｖ／ｖ ＤＭＦ溶液）を使用して、Ｎ－Ｆｍｏｃ保護基を除去した。各脱保護化サイクルを、室温において２回行った（各回１０分間）。合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍｌ）にて洗浄し、固相結合ペプチドのＮ－末端を、ＤＩＰＥＡの存在下、室温において、１５分間で、無水酢酸によってアセチル化した。Ｎ－末端のアセチル化の後、ペプチド樹脂を、ＤＭＦ（３×２０ｍｌ）及びＤＣＭ（３×２０ｍｌ）にて洗浄した。

表１１：異なったリンカーを有するペプチドの合成法及び使用した樹脂及び行ったＣ－末端の修飾
Figure 2024506099000044
１．２．３ 固体支持体からの開裂及び半分取ＨＰＬＣを介するペプチドの精製
室温における３時間のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９５：２．５：２．５，１０ｍｌ）からなる開裂カクテルでの処理によって、ペプチドを固体支持体から開裂した。窒素でのパージによって過剰のＴＦＡを除去した。開裂したペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを添加することによって沈殿させ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。粗製のペプチドペレットをジエチルエーテル（３×４０ｍｌ）にて洗浄し、４４５－ＬＣスケールアップモジュール及び４４０－ＬＣフラクションコレクターを具備するＶａｒｉａｎ ９４０－ＬＣ ＨＰＬＣシステムを使用して、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２ＯにおけるＣＨ３ＣＮの線状グラディエント（０～９９％，ＣＨ３ＣＮにおける０．１％ＴＦＡ）を、流量１５ｍｌ／分、１５分で使用して、ＲＰ－Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ）上での半分取ＨＰＬＣによってペプチドを精製した。２２０ｎｍ及び２６０ｎｍにおいて検出を行った。
表１２：実施例において、リンカー及び結合位置を変化させてテストするために合成したペプチドの配列。リンカーａを、それらのシングルアミノ酸略称としてリストした。リンカーの結合ｂは、ペプチドに対するものである；Ｃ－末端＝カルボキシル末端、Ｎ－末端＝アミノ末端。配列番号は、何らの追加Ｎ－末端及びＣ－末端の修飾、例えば、リンカーを持たないペプチドの配列に関する。
Figure 2024506099000045
１．２．４ ペプチド－ＰＭＯ複合体の合成
マウスのジストロフィンエクソン－２３用の２５量体アンチセンス配列：（ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ；配列番号：９０）を使用した。リンカーの結合位置に応じて、そのＣ－末端カルボキシル基又はＮ－末端アミノ基のいずれかを介して、ペプチドをＰＭＯの３’－末端に結合させた。これは、ＤＩＰＥＡ２．３当量の存在下、ペプチドに対して、それぞれ、２．３倍及び２倍の当量のＰｙＢＯＰ及びＨＯＡｔ（ＮＭＰ中）、及びＰＭＯに対して２．５倍過剰量のペプチド（ＤＭＳＯに溶解）を使用することによって達成された。一般に、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ，１００ｍＬ）におけるペプチド（１０ｍモル）溶液に、ＰｙＢＯＰ（０．３Ｍ ＮＭＰ溶液７６．６ｍＬ）、ＨＯＡｔ（０．３Ｍ ＮＭＰ溶液６６．７ｍＬ）、ＤＩＰＥＡ（４．０ｍＬ）及びＰＭＯ（４ｐモル，１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液４００ｐＬ）を添加した。この混合物を４０℃に２時間放置し、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）を添加することによって反応を停止させた。陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ Ｈ ｍｌカラム，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて、２０％ＣＨ３ＣＮを含有するリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ７．０）における塩化ナトリウムの線状グラディエント（０～１Ｍ）を流量６ｍｌ／分で使用することによって、反応混合物を精製した。イオン交換後に集めたフラクションのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－１５ ３Ｋ遠心フィルター装置を介して、過剰の塩のペプチド－ＰＭＯ（Ｐ－ＰＭＯ）からの除去を行った。複合体を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって分析した。複合体を滅菌水に溶解し、使用前に、０．２２ｐｍの酢酸セルロールフィルターを介して精製した。０．１Ｍ ＨＣｌ溶液における２６５ｎｍでの複合体のモル吸光測定によって、Ｐ－ＰＭＯの濃度を測定した。全体の収率（表１３）はＰ－ＰＭＯに基づき２６～６４％であった。

表１３：インビボ分析用の大規模合成したＰ－ＰＭＯ複合体の収率（収率は、ＵＶ／可視分光分析を介して算定し、ＰＭＯの消衰係数に基づく）。Ｐ－ＰＭＯｓについての純度は、順相ＨＰＬＣにより２２０ｎｍ及び２６０ｎｍにおいて確認して、９５％以上である。ペプチドに結合させるために使用したＰＭＯａは、次の配列を有する：５’－ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ－３’（配列番号９０）。ＰＭＯｂの結合位置を、ここでは、太イタリック体で示す。カッコ内はリンカーである。
Figure 2024506099000046
以下の比較用の複合体を合成／獲得し、及び比較用のリンカーを使用して、同じＰＭＯをペプチドに結合した。

表１４：比較用ペプチド
Figure 2024506099000047
１．３ Ｐ－ＰＭＯの定量化及び再構成
Ｐ－ＰＭＯをＲＮａｓｅ－フリー水に溶解した。この溶液からのアリコートを、０．１Ｍ ＨＣｌ中で１００倍希釈し、ＵＶ／可視分光分析を介して２６５ｎｍで測定した。濃度を、ランベルト・ベールの法則：
Figure 2024506099000048
 を使用して測定した。
使用前に、Ｐ－ＰＭＯを室温に解凍し（以前に凍結している場合）、簡単にボルテックスし、ついで、３７℃において３０分間インキュベートした。続いて、Ｐ－ＰＭＯのアリコートを超音波処理浴において、５分間、超音波処理した。最後に、Ｐ－ＰＭＯを簡単にボルテックスし、パルススピンした。
ＲＮａｓｅフリー水に希釈したＰ－ＰＭＯを、所望の濃度で、９％食塩水と合わせることによって注射溶液を調製した（最終濃度：食塩水０．９％）。
１．４ インビボＰ－ＰＭＯ治療の評価
１．４．１ Ｐ－ＰＭＯの全身投与
全ての実験を、オックスフォード大学の生体医学ユニットにおいて、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ（ＵＫ）公認のもと、Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６及び治験倫理レビューに従って実施した。マウスを特殊な病原体フリーの疾病施設に収容し、環境として、１２時間明－暗サイクルで、温度及び湿度を制御した。全ての動物は、自由に、市販の齧歯動物用の餌及び水を取ることができた。
年齢８～１０週の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて実験を行った。マウスに、尾静脈シングルボーラス注入によって、０．９％食塩水、Ｐ－ＰＭＯ１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇを投与した。投与後１週で、マウスを犠牲にし、前脛骨筋、横隔膜、及び心筋を採取し、ドライアイス上で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。
１．４．２ Ｐ－ＰＭＯの毒物学的評価
Ｐ－ＰＭＯ（セクション１．４．１参照）の静脈内投与後、２０時間、代謝ケージに収容し、投与後、２日目及び７日目において、冷蔵条件下で、尿を非侵襲的に収集した。７日目において、頸静脈から血液を収集し、血液を分画し、血漿を収集した。７日目において、解剖の間に、前脛骨筋、横隔膜、及び心筋を収集した。
標準曲線に合わせるために尿を適切に希釈した後、ＥＬＩＳＡによって、腎臓損傷分子－１（ＫＩＭ－１）の尿中レベルを定量した。ＫＩＭ－１値を、尿中クレアチニンレベルに正規化し、尿中クレアチニンレベルを、ＭＲＣ Ｈａｒｗｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｒｙ Ｌｙｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ（オックスフォードシャー，英国）において定量した。
１．４．３ Ｐ－ＰＭＯ惹起エクソンスキッピングのｑＰＣＲ分析
投与後７日間、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、及び心筋について、Ｐ－ＰＭＯ惹起エクソンスキッピングの定量を行った。簡潔には、ＴＲＩｚｏｌ系抽出法を使用して、ホモゲナイズした組織からＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを使用したｃＤＮＡを合成した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってプリマ―／プローブを合成し、スキップされていない生成物を示す第２３番～第２４番エクソンをスパンする領域（ｍＤＭＤ２３－２４、表１４参照）を増幅する、又は第２２番および第２４番エクソンの境界をスパンするプローブ（ｍＤＭＤ２２－２４）を使用して、転写欠失エクソン２３を特異的に増幅するようにデザインした。各転写のレベルを、スキップト及び非スキップト転写によって測定し、全転写（スキップト及び非スキップト）に対するスキップト転写の割合（％）として表示した（配列について表１５参照）。

表１５：ｑＰＣＲ法によるマウスのジストロフィン（第２３番エクソン）エクソンスキッピングの定量用のプライマー及びプローブ配列
Figure 2024506099000049
２．他の実施例
ペプチド－ＰＭＯ複合体の合成
既に記載したように、ペプチドを合成し、ＰＭＯに結合させた。伸長したＣＵＧ反復：（５－ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’：配列番号１９２）を標的とするＰＭＯ配列をＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣから購入し、更なる複合体の作製に使用した。
細胞培養及びペプチド－ＰＭＯ処置
健康な個人又は２６００のＣＴＧ反復を有するＤＭ１患者からの不死化筋芽細胞を、Ｍ１９９：ＤＭＥＭミックス（比１：４；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなり、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲンタマイシン５０ｐｇ／ｍｌ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、フェチュイン２５ｐｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ０．５ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ５ｎｇ／ｍｌ、及びデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）０．２ｐｇ／ｍｌを補足した成長培地において培養した。密集細胞培地を、インスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５ｐｇ／ｍｌを補足した筋芽細胞用ＤＭＥＭ培地に切り替えることによって、筋肉分化を惹起させた。４日間で、ＷＴ又はＤＭ１細胞が分化された。ついで、培地を、１、２、５、１０、２０、又は４０ｐＭの濃度でペプチド－ＰＭＯを含む新鮮な分化用培地に交換した。処置後、４８時間で、分析のため細胞を収集した。ヒト肝細胞において、４０μＭの濃度での、又はヒト筋芽細胞において、１、２、５、１０、２０、又は４０ｐＭの濃度でのペプチド－ＰＭＯのトランスフェクションの２日後に、蛍光検出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞生存率を定量した。
ＲＮＡの単離，ＰＴ－ＰＣＲ
ヒト細胞について：ＲＮＡ抽出前に、細胞を、プロテアーゼＫ緩衝液（ＮａＣｌ５００ｍＭ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２１．５ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭ，２％ＳＤＳ，及びプロテアーゼＫ０．５ｍｇ／ｍｌ）中、５５℃において、４５分間、溶解させた。製造者のプロトコルに従ってＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）を使用して、全ＲＮＡを単離した。製造者の使用説明書に従って、計２０μｌのＭ－ＭＬＶファーストストランド合成システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡ１μｇを逆転写した。続いて、標準プロトコルによる半定量的ＰＣＲ分析（ＲｅｄｄｙＭｉｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ｃＤＮＡ製剤１μｌを使用した。各遺伝子について、増幅の線状範囲内において、２５～３５サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ生成物を、１．５～２％アガロースゲルにおいて分離し、臭化エチジウム染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアにて定量した。エクソン封入率を、イソ型シグナルの全強度に対する封入のパーセンテージとして定量した。ｍＲＮＡの発現を定量するため、製造者の使用説明書に従って、リアルタイムＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクルは、１５分間の変性工程、続く、５０サイクル、１５秒間の９４℃変性工程、２０秒間の５８℃アニーリング、及び２０秒間の７２℃伸展であった。

表１６：ＰＣＲ用プライマー
Figure 2024506099000050
動物実験及びＡＳＯ注射
英国の法律に従って、オックスフォード大学において実験を行った。ＨＳＡ－ＬＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける静脈内注射を、尾静脈を介してシングル又は繰り返し投与によって実施した。ペプチド－ＰＭＯ－ＣＡＧ７の用量３０、１２．５、７．５、及び５ｍｇ／ｋｇを０．９％食塩水にて希釈し、容量５～６ｐＬ／ｇ（体重）で投与した。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスにおけるＫＩＭ－１レベルを、標準曲線内に適合するように希釈したサンプルとともに、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｃａｔ＃ ＭＫＭ１００）によって測定した。尿中タンパク濃度を説明するために、値を尿中クレアチニンレベルに正規化した（Ｈａｒｗｅｌｌ）。

表１７：ＤＰＥＰ系［ＣＡＧ］７ＰＭＯ複合体の注射後のＣ５７ＢＬ６マウスの回復時間は、Ｐｉｐ６ａのような従来のペプチドを使用して形成した複合体の注射後よりも短い。
Figure 2024506099000051
実施例３
上記の実施例１および２に記載された技術および方法を用いて、以下の複合体のいずれかを調製することができる。
Figure 2024506099000052
 ，
Figure 2024506099000053
 ，
Figure 2024506099000054
 ，
Figure 2024506099000055
 ，
Figure 2024506099000056
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Figure 2024506099000057
 ，
Figure 2024506099000058
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Figure 2024506099000059
 ，
Figure 2024506099000060
 ，
Figure 2024506099000061
 ，
Figure 2024506099000062
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Figure 2024506099000063
 ，
Figure 2024506099000064
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Figure 2024506099000065
 ，
Figure 2024506099000066
 ，
Figure 2024506099000067
 ，
Figure 2024506099000068
 ，
Figure 2024506099000069
 ，
Figure 2024506099000070
 ，
Figure 2024506099000071
 ，
Figure 2024506099000072
 ，
Figure 2024506099000073
 ，
Figure 2024506099000074
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Figure 2024506099000075
 ，
Figure 2024506099000076
 ，
Figure 2024506099000077
 ，
Figure 2024506099000078
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Figure 2024506099000079
 ，
Figure 2024506099000080
 ，
Figure 2024506099000081
 ，
または
Figure 2024506099000082
ここで、
（Ｂ）はベータアラニン残基であり、
（Ａｂ）はγ－アミノ酪酸残基であり、
（Ｅ）はグルタミン酸残基であり、ただし、－ＣＯＯＨがグルタミン酸残基に存在する場合は、－ ＣＯＮＨ２で置換されている。
上記の複合体において、オリゴヌクレオチドは、全てのモルフォリノインターヌクレオシド結合が－Ｐ（Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｏ－であり、５’末端に以下の構造で示される基を有するモルフォリノであり得る。
Figure 2024506099000083
 ．
実施例４ 非ヒト霊長類における検討
モルフォリノオリゴヌクレオチドを含む以下に示す複合体１：
Figure 2024506099000084
 （ここで、５’基は、
Figure 2024506099000085
 であり、リンカー（Ｅ）は、
Figure 2024506099000086
 である）を、０．９％滅菌生理食塩水で２５ｍｇ／ｍＬに再構成した。
ＮＨＰ単回注入用量反応試験
複合体１のエクソンスキッピングの有効性を非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で試験した。具体的には、２～４歳の治療未経験のカニクイザルに、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇ／ｋｇで、単回静脈内緩徐ボーラス注射（１～２分）により複合体を投与した（各群ｎ＝１雄，ｎ＝１雌）。
投与後１週間後に動物を屠殺した。予定された病理解剖時に、エクソンスキッピング解析と組織バイオアナリシスのために組織の一部を採取した。
組織バイオアナリシス
複合体１の生体内分布は、ＮＨＰ組織サンプルからの複合体１の高感度かつ特異的な検出を可能にする蛍光検出によるＡＥＸ－ＨＰＬＣ分析法によって評価した。この分析評価は、両末端にＡｔｔｏ４２５色素を結合させた３０量体の相補的ＲＮＡプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。ＲＮＡと親化合物の二本鎖は、蛍光検出器に結合したＡＥＸ－ＨＰＬＣによるその後の分析で特定のシグナルをもたらした。定量は、ＮＨＰ組織の標準希釈系列から生成した外部較正曲線に基づいて行った。５０ｎｇ／ｇから５，０００．０ｎｇ／ｇまでの直線検量線（加重１／Ｘ）を算出した。生体内分布の結果を図３３に示す。
ＲＴ－ＰＣＲ分析
第５１番エクソンスキッピングのレベルはＲＴ－ＰＣＲで決定した。骨格筋、心筋、および平滑筋組織は、ビーズベースのホモジナイゼーション法を用いて均質化した。ＲＮＡは、メーカーの推奨に従って、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ４８装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）とｓｉｍｐｌｙ ＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して抽出した。ＲＮＡの濃度と純度はＣｌａｒｉｏＳｔａｒ（ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈ社）を用いて測定した。表１８に示す熱サイクル条件下で、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（４３６８８１３））を用いて定量化ＲＮＡを逆転写した。

表１８：逆転写熱サイクル条件
Figure 2024506099000087
ネステッドＰＣＲは２回の連続したＰＣＲ反応として行った。１回目のＰＣＲは逆転写ｃＤＮＡテンプレートを用いて行った。２回目のＰＣＲは１回目のＰＣＲで得られた産物を用いて行った。ＰＣＲ反応に使用されるすべてのプライマーを表１９に示し、熱サイクル条件の概要を表２０に示す。最終的なＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動（２％）によって分析した。ゲルはミドリグリーンアドバンス染色試薬（日本ジェネティクス株式会社）を用いて調製した。Ｈｙｐｅｒ Ｌａｄｄｅｒ ５０ ｂｐ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社，ＢＩＯ－３３０３９）とＰＣＲ産物をアガロースゲルにロードし、適切な程度のバンド分離が達成されるまで泳動した。その後、ゲルイメージングシステムＧ：ＢＯＸ（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）を用いて、分解したゲルの画像取得を行った。ネステッドＰＣＲゲルからのスキップされていない天然のバンド、およびスキップされたΔｅｘ ５１のバンドをＩｍａｇｅＪソフトウェア（フィジー）を用いてデンシトメトリー分析した。バンド定量からのデンシトメトリー値を使用し、下記式によりｎｈｐＤＭＤ第５１番エクソンスキッピングを決定した。
ｎｈｐＤＭＤ第５１番エクソンスキッピング式：（［スキップされたフラグメントのピーク面積］／［スキップされたフラグメントのピーク面積＋スキップされなかったフラグメントのピーク面積］）×１００

表１９：プライマーおよびプライマー配列
Figure 2024506099000088

表２０：熱サイクル条件
Figure 2024506099000089

表２０（続き）
Figure 2024506099000090
複合体１を投与された非ヒト霊長類における第５１番エクソンスキッピング効果を、図３４に纏める。
他の実施形態
説明した本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
その他の実施形態は特許請求の範囲に記載されている。

Claims (109)

  1. オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩であって、
    前記ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個のカチオン性ドメインと、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む少なくとも１個の疎水性ドメインとを含み、ただし前記ペプチドは、合計７～４０個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、
    前記オリゴヌクレオチドは、合計１２～４０個の連続した核酸塩基を含み、ただし少なくとも１２個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子中の標的配列に対して相補的であることを特徴とする複合体またはその薬学的に許容される塩。
  2. 前記標的配列は、第４５番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第４５番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
  3. 前記オリゴヌクレオチドは、表１中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか１つ選択される少なくとも１２個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項２に記載の複合体。
  4. 前記オリゴヌクレオチドは、表１中のいずれか１つの配列またはそのチミン置換型を含むことを特徴とする請求項２に記載の複合体。
  5. 表１中の前記配列は、５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）であることを特徴とする請求項３または４に記載の複合体。
  6. 表１中の前記配列は、５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）であることを特徴とする請求項３または４に記載の複合体。
  7. 前記標的配列は、第５１番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第５１番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
  8. 前記オリゴヌクレオチドは、表２中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか１つ選択される少なくとも１２個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項７に記載の複合体。
  9. 前記オリゴヌクレオチドは、表２中のいずれか１つの配列またはそのチミン置換型を含むことを特徴とする請求項７に記載の複合体。
  10. 表２中の前記配列は、５’－ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ－３’（配列番号１３０）であることを特徴とする請求項８または９に記載の複合体。
  11. 表２中の前記配列は、５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）であることを特徴とする請求項８または９に記載の複合体。
  12. 前記標的配列は、第５３番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第５３番エクソンのスプライス部位から５０核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
  13. 前記オリゴヌクレオチドは、表３中のいずれか１つの配列である少なくとも１２個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記オリゴヌクレオチドは、表４中のいずれか１つの配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の複合体。
  15. 表３中の前記配列は、５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の複合体。
  16. 表３中の前記配列は、５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の複合体。
  17. 前記スプライス部位はアクセプタースプライス部位であることを特徴とする請求項２，７または１２に記載の複合体。
  18. 前記スプライス部位はドナースプライス部位であることを特徴とする請求項２，７または１２に記載の複合体。
  19. 前記配列は、ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ（配列番号９０）であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
  20. 前記ペプチドはアミノヘキサン酸（Ｘ）残基を含まず、又は前記ペプチドは６－アミノヘキサン酸残基を含まないことを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  21. 前記ペプチドは天然アミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  22. それぞれのカチオン性ドメインは、４アミノ酸残基から１２アミノ酸残基の間、好ましくは４アミノ酸残基から７アミノ酸残基の間の長さを有することを特徴とする請求項１～２１のいずれか一項に記載の複合体。
  23. それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％のカチオン性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１～２２のいずれか一項に記載の複合体。
  24. それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸を含み、好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のカチオン性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１～２３のいずれか一項に記載の複合体。
  25. それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基、および／またはセリン残基を含み、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および／またはセリン残基からなることを特徴とする請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体。
  26. それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび／またはヒスチジンリッチであり、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアルギニン残基および／またはヒスチジン残基を含むことを特徴とする請求項１～２５のいずれか一項に記載の複合体。
  27. 前記ペプチドは２つのカチオン性ドメインを含むことを特徴とする請求項１～２６のいずれか一項に記載の複合体。
  28. それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）のうちの１つまたはその任意の組合せを含み、
    好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、１つの以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、Ｒ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）またはその任意の組合せからなることを特徴とする請求項１～２７のいずれか一項に記載の複合体。
  29. それぞれの疎水性ドメインは３アミノ酸から６アミノ酸の間の長さを有し、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは５アミノ酸の長さを有することを特徴とする請求項１～２８のいずれか一項に記載の複合体。
  30. それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％の疎水性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１～２９のいずれか一項に記載の複合体。
  31. それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基およびグルタミン残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基および／またはグルタミン残基からなることを特徴とする請求項１～３０のいずれか一項に記載の複合体。
  32. 前記ペプチドは１つの疎水性ドメインを含むことを特徴とする請求項１～３１のいずれか一項に記載の複合体。
  33. 前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはその任意の組合せを含み、好ましくは、前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列：ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、ＷＷＰＷ（配列番号２６）のうちの１つまたはその任意の組合せからなることを特徴とする請求項１～３２のいずれか一項に記載の複合体。
  34. 前記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインおよび１つの疎水性ドメインからなり、好ましくは、前記ペプチドは、２つのカチオン性アームドメインに挟まれた１つの疎水性コアドメインからなることを特徴とする請求項１～３３のいずれか一項に記載の複合体。
  35. 前記ペプチドは、ＲＢＲＲＢＲＲ（配列番号１）、ＲＢＲＢＲ（配列番号２）、ＲＢＲＲ（配列番号３）、ＲＢＲＲＢＲ（配列番号４）、ＲＲＢＲＢＲ（配列番号５）、ＲＢＲＲＢ（配列番号６）、ＢＲＢＲ（配列番号７）、ＲＢＨＢＨ（配列番号８）、ＨＢＨＢＲ（配列番号９）、ＲＢＲＨＢＨＲ（配列番号１０）、ＲＢＲＢＢＨＲ（配列番号１１）、ＲＢＲＲＢＨ（配列番号１２）、ＨＢＲＲＢＲ（配列番号１３）、ＨＢＨＢＨ（配列番号１４）、ＢＨＢＨ（配列番号１５）、ＢＲＢＳＢ（配列番号１６）、ＢＲＢ［Ｈｙｐ］Ｂ（配列番号１７）、Ｒ［Ｈｙｐ］Ｈ［Ｈｙｐ］ＨＢ（配列番号１８）、およびＲ［Ｈｙｐ］ＲＲ［Ｈｙｐ］Ｒ（配列番号１９）から選択される配列をそれぞれ含む２つのカチオン性アームドメインに挟まれた、ＹＱＦＬＩ（配列番号２０）、ＦＱＩＬＹ（配列番号２１）、ＩＬＦＱＹ（配列番号２２）、ＦＱＩＹ（配列番号２３）、ＷＷＷ、ＷＷＰＷＷ（配列番号２４）、ＷＰＷＷ（配列番号２５）、およびＷＷＰＷ（配列番号２６）から選択される配列を含む１つの疎水性コアドメインからなることを特徴とする請求項１～３４のいずれか一項に記載の複合体。
  36. 前記ペプチドは、以下の配列：ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＲＢＲ（配列番号２７）、ＲＢＲＲＢＲＲＹＱＦＬＩＲＢＲＢＲ（配列番号３１）、ＲＢＲＲＢＲＲＩＬＦＱＹＲＢＲＢＲ（配列番号３２）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）、ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＨＢＨＢＲ（配列番号３８）、ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のうちの１つからなることを特徴とする請求項１～３５のいずれか一項に記載の複合体。
  37. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）を有することを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  38. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号３７）を有することを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  39. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）を有することを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 前記ペプチドは、そのＮ末端を通して前記複合体の残りの部分と結合していることを特徴とする請求項１～３９のいずれか一項に記載の複合体。
  41. 前記ペプチドのＮ末端は－ＮＨ２であることを特徴とする請求項４０に記載の複合体。
  42. 前記ペプチドは、そのＣ末端を通して前記複合体の残りの部分と結合していることを特徴とする請求項１～３９のいずれか一項に記載の複合体。
  43. 前記ペプチドは、そのＮ末端がアシル化されていることを特徴とする請求項４２に記載の複合体。
  44. 前記複合体は以下の構造：
    ［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］
    を有することを特徴とする請求項１～４３のいずれか一項に記載の複合体。
  45. 前記複合体は以下の構造：
    Figure 2024506099000091
     または
    Figure 2024506099000092
     を有することを特徴とする請求項１～４３のいずれか一項に記載の複合体。
  46. 前記複合体は以下の構造：
    ［ペプチド］－［リンカー］－［ペプチド］－［リンカー］－［オリゴヌクレオチド］
    を有することを特徴とする請求項１～４３のいずれか一項に記載の複合体。
  47. 各リンカーは、独立して、下記式（Ｉ）による構造を有する：
    －Ｔ１－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－Ｔ２－ （Ｉ）
    ｛ここで、
    Ｔ１は、前記ペプチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
    Ｔ２は、オリゴヌクレオチドに結合する２価の基であり、－ＮＨ－およびカルボニルからなる群から選択され；
    ｎは、１、２又は３であり；
    各Ｒ１は、独立して、式：
    －Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
    ［ここで、
    Ｙ１は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれ、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
    Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｎ（ＲＡ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
    Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＡ４ＲＡ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＡ４及びＲＡ５は、それぞれ独立して、水素および（１－４Ｃ）アルキルからなる群から選択される）から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］
    で示される基であり；
    各Ｒ２は、独立して、式：
    －Ｙ２－Ｘ２－Ｚ２
    ［ここで、
    Ｙ２は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＢ１ＲＢ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３又は４から選ばれる整数であり、ＲＢ１及びＲＢ２は、それぞれ独立して、水素、ＯＨ、又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）で示される基であり；
    Ｘ２は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＢ３）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ３）－、－Ｎ（ＲＢ３）Ｃ（ＮＲＢ３）Ｎ（ＲＢ３）－、－ＳＯ－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＢ３）－、又は－Ｎ（ＲＢ３）ＳＯ２－であり（ここで、各ＲＢ３は、独立して、水素又はメチルから選ばれる）；
    Ｚ２は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＢ４ＲＢ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＢ４及びＲＢ５は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルから選ばれる）からなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基であり；
    ただし、
    ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なる場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨとなることはなく；
    ｎ＝１で、Ｔ１及びＴ２が相互に異なり、Ｒ１及びＲ２の一方がＨである場合、Ｒ１及びＲ２の他方はメチルではなく；
    ｎ＝２で、各Ｒ１及びＲ２がＨである場合、Ｔ１及びＴ２はともに－Ｃ（Ｏ）－であるか、又はともに－ＮＨ－である｝ことを特徴とする請求項１～４６のいずれか一項に記載の複合体。
  48. Ｔ２は－Ｃ（Ｏ）－であることを特徴とする請求項４７に記載の複合体。
  49. 各Ｒ１は、独立して、式：
    －Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
    ［ここで、
    Ｙ１は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
    Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｓ－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
    Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ＮＲＡ４ＲＡ５、および（１－４Ｃ）アルコキシ（ここで、ＲＡ４及びＲＡ５は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）からなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基であることを特徴とする請求項４７または４８に記載の複合体。
  50. 各Ｒ１は、独立して、式：
    －Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
    ［ここで、
    Ｙ１は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
    Ｘ１は、不在か、又は－Ｏ－、Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ３）、－Ｎ（ＲＡ３）Ｃ（ＮＲＡ３）Ｎ（ＲＡ３）－、もしくは－Ｓ－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
    Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基であることを特徴とする請求項４７または４８に記載の複合体。
  51. 各Ｒ１は、独立して、式：
    －Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
    ［ここで、
    Ｙ１は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＡ１ＲＡ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＡ１及びＲＡ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
    Ｘ１は、不在か、又は－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－、もしくは－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）であり（ここで、各ＲＡ３は、水素又はメチルである）；
    Ｚ１は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである（ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる１以上（例えば１，２，３，４または５）の置換基によって置換される）］で示される基であることを特徴とする請求項４７または４８に記載の複合体。
  52. 各Ｒ１は、独立して、式：
    －Ｙ１－Ｘ１－Ｚ１
    ［ここで、Ｙ１は、不在か、又は－（ＣＨ２）－もしくは－（ＣＨ２ＣＨ２）－であり、
    Ｘ１は、不在か、又は－Ｎ（ＲＡ３）－Ｃ（Ｏ）－もしくは－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＡ３）－であり（ここで、各ＲＡ３は、独立して、水素又はメチルである）；
    Ｚ１は、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである］で示される基であることを特徴とする請求項４７または４８に記載の複合体。
  53. 各Ｒ２は、独立して、式：
    －Ｙ２－Ｚ２
    ［ここで、Ｙ２は、不在か、又は式：
    －［ＣＲＢ１ＲＢ２］ｍ－
    （ここで、ｍは、１、２、３、又は４であり、ＲＢ１及びＲＢ２は、それぞれ独立して、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである）で示される基であり；
    Ｚ２は、水素又は（１－６Ｃ）アルキルである］
    で示される基である請求項４７～５１のいずれか一項に記載の複合体。
  54. 各Ｒ２は水素である請求項４７～５１のいずれか一項に記載の複合体。
  55. ｎは２又は３である請求項４７～５４のいずれか一項に記載の複合体。
  56. ｎは１である請求項４７～５４のいずれか一項に記載の複合体。
  57. 前記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ－アミノ酪酸からなる群から選ばれた酸残基であることを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  58. 前記リンカーは、以下の構造：
    Figure 2024506099000093
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  59. 前記リンカーは、以下の構造：
    Figure 2024506099000094
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  60. 前記リンカーは、以下の構造：
    Figure 2024506099000095
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  61. 前記リンカーは、以下の構造：
    Figure 2024506099000096
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  62. 前記リンカーは、以下の構造：
    Figure 2024506099000097
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  63. 前記複合体は、以下の構造：
    Figure 2024506099000098
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  64. 前記複合体は、以下の構造：
    Figure 2024506099000099
    を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  65. 前記複合体は、以下の構造：
    Figure 2024506099000100
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  66. 前記複合体は、以下の構造：
    Figure 2024506099000101
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  67. 前記複合体は、以下の構造：
    Figure 2024506099000102
     を有することを特徴とする請求項１～４４のいずれか一項に記載の複合体。
  68. 前記オリゴヌクレオチドは、その３’末端において、前記リンカーまたは前記ペプチドに結合していることを特徴とする請求項１～６７のいずれか一項に記載の複合体。
  69. 前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
    Figure 2024506099000103
     を含むことを特徴とする請求項１～６８のいずれか一項に記載の複合体。
  70. 前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
    Figure 2024506099000104
     を含むことを特徴とする請求項１～６８のいずれか一項に記載の複合体。
  71. 前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、ヒドロキシルを含むことを特徴とする請求項１～６８のいずれか一項に記載の複合体。
  72. ペプチドＡｃ－ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  73. ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  74. ペプチドＡｃ－ＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩
  75. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  76. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１９４）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  77. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  78. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  79. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１９３）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  80. ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  81. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  82. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  83. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号１９６）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  84. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  85. ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  86. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  87. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  88. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ－３’（配列番号１９５）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  89. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  90. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  91. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  92. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７１）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  93. ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  94. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  95. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  96. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  97. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１６２）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  98. ペプチドＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ－ＮＨ２（配列番号３５）のＮ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  99. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  100. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＲＢＨＢＨ（配列番号４４）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  101. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩。
  102. ペプチドＡｃＲＢＲＲＢＲＦＱＩＬＹＢＲＢＲ（配列番号３５）のＣ末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した３’－末端を有するオリゴヌクレオチド５’－ＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９８）の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の－ＣＯＯＨがある場合、それは－ＣＯＮＨ２に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
  103. 前記オリゴヌクレオチドは、その５’末端として、以下の基：
    Figure 2024506099000105
     を含むことを特徴とする請求項７２～１０２のいずれか一項に記載の複合体。
  104. 前記オリゴヌクレオチドはモルフォリノであることを特徴とする請求項１～１０３のいずれか一項に記載の複合体。
  105. 全てのモルフォリノヌクレオシド間結合は－Ｐ（Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｏ－であることを特徴とする請求項１０４に記載の複合体。
  106. 請求項１～１０５のいずれか一項に記載の複合体、および薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
  107. ＤＭＤまたはＢＭＤを有する被験体の治療における使用のための請求項１０６に記載の医薬組成物。
  108. ＤＭＤまたはＢＭＤを有する被験体の治療方法であって、治療有効量の請求項１～１０５のいずれか一項に記載の複合体または請求項１０６に記載の医薬組成物を、被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
  109. 前記被験体はＤＭＤを有することを特徴とする請求項１０８に記載の方法。
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