JP2024506099A - 細胞透過性のペプチド複合体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体であって、ペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のカチオン性ドメイン、および少なくとも3個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個の疎水性ドメインを含み、但しペプチドは、合計7~40個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、オリゴヌクレオチドは、合計12~40個の連続した核酸塩基を含み、少なくとも12個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子の標的配列に相補的である、複合体を開示する。
Description
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのペプチド複合体、それを含む組成物、およびその使用方法に関する。
核酸薬は、ヒトにおける医療を変容させる可能性を秘めたゲノム薬である。研究からは、そのような治療薬が神経筋疾患を含む広範囲の疾患領域にわたり適用され得ることが示唆されている。プレmRNAスプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの方法が、神経筋疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)に適用されるようになり、この単一遺伝子障害はプレシジョン・メディシンの最先端に置かれている。
しかし、これらの有望なアンチセンス治療薬の治療上の開発は、不十分な細胞透過度と不十分な分布特性が原因で妨げられてきた。この課題は、DMDでは、筋組織基質が大量であることと、その分散特性とによりさらに重要視されている。
DMDは、3500人に1人の新生男児が罹患している。この重篤なX連鎖劣性疾患は、ジストロフィンタンパク質をコードするDMD遺伝子内の変異によってもたらされる。この障害は、呼吸不全と心臓の合併症の出現を伴った進行性の筋肉変性および萎縮を特徴としており、最終的には早死につながる。DMDの根底にある変異の大部分は、オープンリーディングフレーム内の早期トランケーションを誘発するゲノムのアウトオブフレーム欠失であり、これがジストロフィンタンパク質を欠乏させる。
エクソンスキッピング療法は、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド(SSO)を利用してDMD転写物の特定領域を標的とし、個々のエクソンの排除を誘導し、異常リーディングフレームを回復させ、内部的に欠失されているが部分的には機能するジストロフィンタンパク質の生成をもたらす。DMDに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピング療法の可能性は疑う余地がないにもかかわらず、このアプローチの適用の成功は、現在のところ、骨格筋のターゲッティングが比較的非効率であること、ならびに、心臓などの他の罹患組織への一本鎖オリゴヌクレオチドの標的化が不十分であることによって制限されている。
2016年9月に、食品医薬品局(FDA)は、第51番エクソンのスプライシングのモジュレーターである、「eteplirsen」を早期承認した。これは、スプライシングを調節する、最初に米国FDA承認されたオリゴヌクレオチドの先駆けとなったが、ジストロフィンの回復レベルは、正常なジストロフィンレベルの約1%であり、期待外れであった。対立遺伝子障害のベッカー型筋ジストロフィーとの比較と、mdxマウスにおける実験からは、運動による損傷から筋肉を保護するためには、少なくとも約15%の野性型の均一な筋線維鞘ジストロフィン発現が必要であることが示唆されている。
そのため、DMDなどの破壊的な遺伝性疾患に対する新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドをベースとした治療法が必要とされている。
大略的には、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩を提供する。オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子の第45番エクソン,第51番エクソン,または第53番エクソンの内または近位の標的配列に相補的である。
一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩であって、
前記ペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のカチオン性ドメインと、少なくとも3個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個の疎水性ドメインとを含み、ただし前記ペプチドは、合計7~40個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、
前記オリゴヌクレオチドは、合計12~40個の連続した核酸塩基を含み、ただし少なくとも12個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子中の標的配列に対して相補的であることを特徴とする複合体またはその薬学的に許容される塩を提供する。
前記ペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のカチオン性ドメインと、少なくとも3個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個の疎水性ドメインとを含み、ただし前記ペプチドは、合計7~40個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、
前記オリゴヌクレオチドは、合計12~40個の連続した核酸塩基を含み、ただし少なくとも12個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子中の標的配列に対して相補的であることを特徴とする複合体またはその薬学的に許容される塩を提供する。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第45番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第45番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されている。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表1中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか1つ選択される少なくとも12個連続した核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表1中のいずれか1つの配列またはそのチミン置換型を含む。
いくつかの実施形態では、表1中の前記配列は、5’-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)である。
いくつかの実施形態では、表1中の前記配列は、5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)である。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第51番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第51番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されている。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表2中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか1つ選択される少なくとも12個連続した核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表3中のいずれか1つの配列またはそのチミン置換型を含む。
いくつかの実施形態では、表2中の前記配列は、5’-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3’(配列番号130)である。
いくつかの実施形態では、表2中の前記配列は、5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)である。
いくつかの実施形態では、前記標的配列は、第53番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第53番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されている。いくつかの実施形態では、表3中のいずれか1つの配列である少なくとも12個連続した核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、表3中のいずれか1つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、表3中の前記配列は、5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)である。
いくつかの実施形態では、表3中の前記配列は、5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)である。
いくつかの実施形態では、前記スプライス部位はアクセプタースプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記スプライス部位はドナースプライス部位である。
いくつかの実施形態では、前記配列は、GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90)である。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドはアミノヘキサン酸(X)残基を含まない。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは6-アミノヘキサン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは天然アミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、4アミノ酸残基から12アミノ酸残基の間、好ましくは4アミノ酸残基から7アミノ酸残基の間の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、大多数のカチオン性アミノ酸を含み、好ましくは少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインが、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基、および/またはセリン残基を含み、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインが、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および/またはセリン残基からなる。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび/またはヒスチジンリッチであり、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%のアルギニン残基および/またはヒスチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは2つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)のうちの1つまたはその任意の組合せを含み、
好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、1つの以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)またはその任意の組合せからなる。
好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、1つの以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)またはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは3アミノ酸から6アミノ酸の間の長さを有し、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは5アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基およびグルタミン残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基および/またはグルタミン残基からなる。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは1つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはその任意の組合せを含み、前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、2つのカチオン性ドメインおよび1つの疎水性ドメインからなり、好ましくは、前記ペプチドは、2つのカチオン性アームドメインに挟まれた1つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、およびR[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)から選択される配列をそれぞれ含む2つのカチオン性アームドメインに挟まれた、YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、およびWWPW(配列番号26)から選択される配列を含む1つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは以下の配列:RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)、RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)、RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)、RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)、RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)、RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のうちの1つからなる。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)を有する。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのN末端を通して前記複合体の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態では、前記ペプチドのN末端は-NH2である。
いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのC末端を通して前記複合体の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、そのN末端はアシル化されている(例えば、N末端に、アセチル基、またはNH2-もしくはAcNH-を有するアミノ酸残基を有している)。
好ましくは、アミノ酸残基がペプチドのN末端に存在する場合には、それ以外の場合に存在する-COOHの代わりに-CONH2が含まれる。
いくつかの実施形態では、前記複合体は以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]を有する。
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]を有する。
いくつかの実施形態では、前記複合体は以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を有する。
[ペプチド]-[リンカー]-[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を有する。
いくつかの実施形態では、各リンカーは、独立して、下記式(I)による構造を有する:
T1-(CR1R2)n-T2 (I)
{ここで、
T1は、前記ペプチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
T2は、オリゴヌクレオチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
nは、1、2又は3であり;
各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれ、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、もしくは-N(RA3)SO2-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素および(1-4C)アルキルからなる群から選択される)から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
各R2は、独立して、式:
-Y2-X2-Z2
[ここで、
Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれる整数であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X2は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり(ここで、各RB3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z2は、水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RB4及びRB5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルから選ばれる)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
ただし、
n=1で、T1及びT2が相互に異なる場合、R1及びR2は、両方がHとなることはなく;
n=1で、T1及びT2が相互に異なり、R1及びR2の一方がHである場合、R1及びR2の他方はメチルではなく;
n=2で、各R1及びR2がHである場合、T1及びT2はともに-C(O)-であるか、又はともに-NH-である}。
T1-(CR1R2)n-T2 (I)
{ここで、
T1は、前記ペプチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
T2は、オリゴヌクレオチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
nは、1、2又は3であり;
各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれ、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、もしくは-N(RA3)SO2-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素および(1-4C)アルキルからなる群から選択される)から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
各R2は、独立して、式:
-Y2-X2-Z2
[ここで、
Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれる整数であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X2は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり(ここで、各RB3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z2は、水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RB4及びRB5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルから選ばれる)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
ただし、
n=1で、T1及びT2が相互に異なる場合、R1及びR2は、両方がHとなることはなく;
n=1で、T1及びT2が相互に異なり、R1及びR2の一方がHである場合、R1及びR2の他方はメチルではなく;
n=2で、各R1及びR2がHである場合、T1及びT2はともに-C(O)-であるか、又はともに-NH-である}。
いくつかの実施形態では、T2は-C(O)-である。
いくつかの実施形態では、各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
いくつかの実施形態では、各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
いくつかの実施形態では、各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、もしくは-C(O)-N(RA3)であり(ここで、各RA3は、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、もしくは-C(O)-N(RA3)であり(ここで、各RA3は、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基である。
いくつかの実施形態では、各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、Y1は、不在か、又は-(CH2)-もしくは-(CH2CH2)-であり、
X1は、不在か、又は-N(RA3)-C(O)-もしくは-C(O)-N(RA3)-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、水素又は(1-2C)アルキルである]で示される基である。
-Y1-X1-Z1
[ここで、Y1は、不在か、又は-(CH2)-もしくは-(CH2CH2)-であり、
X1は、不在か、又は-N(RA3)-C(O)-もしくは-C(O)-N(RA3)-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、水素又は(1-2C)アルキルである]で示される基である。
いくつかの実施形態では、各R2は、独立して、式:
-Y2-Z2
[ここで、Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
Z2は、水素又は(1-6C)アルキルである]で示される基である。
-Y2-Z2
[ここで、Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
Z2は、水素又は(1-6C)アルキルである]で示される基である。
いくつかの実施形態では、各R2は水素である。
いくつかの実施形態では、nは2又は3である。いくつかの実施形態では、nは1である。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ-アミノ酪酸からなる群から選ばれた酸残基である。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端において、前記リンカーまたは前記ペプチドに結合している。
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、その5’末端として、ヒドロキシルを含む。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAc-RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAc-RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体はペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態では、前記複合体は、ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩である。
オリゴヌクレオチドの3’-末端が、グルタミン酸残基を介してペプチドのC-末端またはN-末端に共有結合している、上記または本明細書の他の箇所に記載の各複合体、またはその薬学的に許容される塩について、前記複合体またはその薬学的に許容される塩は、以下の構造:
、またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の複合体、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、DMDまたはBMDを有する被験体の治療方法であって、治療有効量の本明細書に記載の複合体または本明細書に記載の医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む。本発明はさらに、DMDまたはBMDを有する被験体の治療における使用のための医薬組成物を含む。
いくつかの実施形態では、前記被験体はDMDを有する。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチドはモルフォリノである(より好ましくは、全てのモルフォリノヌクレオシド間結合は-P(O)(NMe2)O-である)。
定義
「X」への言及は、全体を通して、例えば6-アミノヘキサン酸のようなアミノヘキサン酸等のアミノ酸の任意の形態を示す。
「X」への言及は、全体を通して、例えば6-アミノヘキサン酸のようなアミノヘキサン酸等のアミノ酸の任意の形態を示す。
「B」への言及は、全体を通して、アミノ酸のベータアラニンを示す。
「Hyp」への言及は、全体を通して、アミノ酸のヒドロキシプロリンを示す。
「Ac」への言及は、全体を通して、アセチル基(CH3-C(O)-)を示す。
他の大文字への言及は、全体を通して、関連する遺伝的にコードされたアミノ酸残基を、認められているアルファベットのアミノ酸コードに従って示す。
ここで使用される用語「アルキル」は、特記しない限り(例えば、(1-6C)アルキル,(1-4C)アルキル,(1-3C)アルキル,または(1-2C)アルキル)、合計1~20個の炭素原子を含む直鎖状または分岐鎖状の炭化水素基を意味する。アルキルの非限定的な例として、メチル,エチル,1-メチルエチル,プロピル,1-メチルブチル,1-エチルブチル等が含まれる。個々のアルキル基に関する表示、例えば、「プロピル」は、特に直鎖状型のみを意味し、個々の分枝状アルキルに関する表示、例えば、「イソプロピル」は、特に分枝鎖型のみを意味する。
ここで使用される用語「アルケニル」は、特記しない限り(例えば、(2-6C)アルケニル,(2-4C)アルケニル,または(2-3C)アルケニル)、1,2,または3個の炭素-炭素二重結合を有し、合計2~20個の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。アルケニルの非限定的な例として、ビニル,アリル,ホモアリル,イソプレニル等が含まれる。特記しない限り、アルケニルは、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、ヘテロアリール基,オキソ基,ハロゲン基,およびヒドロキシル基からなる群から選ばれた1,2,3,4,または5個の基で任意に置換されていてもよい。
ここで使用される用語「アルキニル」は、特記しない限り(例えば、(2-6C)アルキニル,(2-4C)アルキニル,または(2-3C)アルキニル)、1,2,または3個の炭素-炭素三重結合を有し、合計2~20個の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。アルキニルの非限定的な例として、エチニル,プロパギル,ホモプロパギル,ブタ-2-イン-1-イル,2-メチル-プロパ-2-イン-1-イル等が含まれる。特記しない限り、アルキニルは、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、ヘテロアリール基,オキソ基,ハロゲン基,およびヒドロキシル基からなる群から選ばれた1,2,3,4,または5個の基で任意に置換されていてもよい。
用語アミノ酸「残基」は、アミノ酸の1つのN-H結合が1価の原子価で置換され、1つのカルボン酸C-O結合が1価の原子価で置換された2価の基を意味する。N-H結合またはカルボン酸C-O結合は、例えば、側鎖上にあることがある。
用語「アルギニンリッチ」は、少なくとも40%のカチオン性ドメインが、アルギニン残基により形成されていることを意味する。
ここで使用される用語「人工アミノ酸」は、非生物起源アミノ酸(例えば非蛋白質原性のもの)を指す。例えば、人工アミノ酸は、合成アミノ酸、修飾アミノ酸(例えば糖で修飾したもの)、非天然アミノ酸、人為的アミノ酸、スペーサー、および非ペプチド結合スペーサーを含む。合成アミノ酸は、人間によって化学的に合成されるものであり得る。誤解を避けるために、アミノヘキサン酸(X)は、本発明の文脈における人工アミノ酸である。誤解を避けるために、ベータアラニン(B)およびヒドロキシプロリン(Hyp)は自然界に存在しており、したがって、本発明の文脈においては人工アミノ酸ではなく、天然アミノ酸である。人工アミノ酸は、例えば、6-アミノヘキサン酸(X)、テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(TIC)、1-(アミノ)シクロヘキサンカルボン酸(Cy)、および3-アゼチジン-カルボン酸(Az)、および11-アミノウンデカン酸を含み得る。
ここで使用される用語「アリール」は、少なくとも1つは芳香族である、1つ、2つ、または3つの環を含む炭素環系を意味する。非置換型のアリールは、合計6から14個の炭素原子を含む。用語アリールは、1価の種および2価の種の両方を含む。限定的ではないが、アリール基の例として、フェニル、ナフチル、インダニルなどが含まれる。特定の実施形態では、任意に置換されたアリールは任意に置換されたフェニルである。
ここで使用される用語「架橋環系」は、2つの環が2以上の原子を共有する環系を意味する(例えば、Jerry MarchによるAdvanced Organic Chemistry,4版,Wiley Interscience,p.131-133,1992参照)。架橋複素環系の例としては、アザ-ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、アザ-ビシクロ[2.2.2]オクタン、アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタン、キヌクリジン等が含まれる。
ここで使用される用語「カルボニル」は、以下の構造:-C(O)-の基を意味する。カルボニル基の非限定的な例として、例えばアセトン、酢酸エチル、タンパク原性アミノ酸、アセトアミドなどに見られるものがある。
用語「カチオン性」は、生理的pHにおいて全体的に正電荷を持つアミノ酸またはアミノ酸のドメインを意味する。
単独または接頭辞として使用される用語「(m-nC)」または「(m-nC)基」は、置換されていない場合に、合計でmからn個の炭素原子を有する基を意味する。
核酸塩基配列に関して本明細書で使用する「相補的」という用語は、その核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、生理的条件下で、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することを可能にする連続した核酸塩基のパターンを有する核酸塩基配列を指す。相補的配列には、天然および/または修飾された核酸塩基から形成されるワトソン-クリック型塩基対が含まれる。相補的配列はまた、非ワトソン-クリック型塩基対、例えばウォブル型塩基対(グアノシン-ウラシル、ヒポキサンチン-ウラシル、ヒポキサンチン-アデニン、ヒポキサンチン-シトシン)およびフーグスティーン型塩基対を含むことができる。
ここで使用される用語「シクロアルキル」は、特に断りのない限り、1つまたは2つの環を含み、合計3から10個の炭素原子を含む飽和炭素環系を意味する。2環シクロアルキルは、縮合環系(2つの橋頭炭素原子が互いに直接結合している)、架橋環系(2つの橋頭炭素原子が、少なくとも1つの炭素原子を含む共有結合リンカーを介して互いに結合している)、およびスピロ環系(2つの環が同じ炭素原子で縮合している)として配置することができる。シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチルなどが挙げられる。
特に断らない限り、用語「シクロアルケニル」は、1つまたは2つの環を含み;1つ、2つまたは3つの内環式二重結合を含み;そして合計3~10個の炭素原子を含む、非芳香族で、不飽和の炭素環系を意味する。2環のシクロアルケニルは、縮合環系(2つの橋頭炭素原子が互いに直接結合している)、架橋環系(2つの橋頭炭素原子が、少なくとも1つの炭素原子を含む共有結合リンカーを介して互いに結合している)、およびスピロ環系(2つの環が同じ炭素原子で縮合している)として配置することができる。シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、3-シクロヘキセン-1-イル、シクロオクテニルなどが挙げられる。
ジストロフィンは、棒状の細胞質タンパク質であり、筋繊維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスにつなぐタンパク質複合体の重要な一部である。ジストロフィンは複数の機能ドメインを含んでいる。例えば、ジストロフィンは、約14~240個のアミノ酸のアクチン結合ドメインを含み、約253~3040個のアミノ酸の中央ロッドドメインを含む。この大きな中央ドメインは、約109個のアミノ酸からなる24個のスペクトリン様三重らせん要素によって形成されており、α-アクチニンおよびスペクトリンと相同性を有する。反復配列は、典型的には4つのプロリンに富む非反復部分によって中断され、これはヒンジ領域とも呼ばれる。反復配列の15番および16番は、ジストロフィンのタンパク質分解切断の主要部位と思われる18アミノ酸の伸長によって隔てられている。ほとんどの反復配列間の配列同一性は10~25%である。1つの反復配列には、1,2,3の3つのα-ヘリックスが含まれる。α-ヘリックス1と3はそれぞれ7本のヘリックスターンによって形成されており、おそらく疎水性界面を介してコイルドコイルとして相互作用している。α-ヘリックス2はより複雑な構造を持ち、グリシン残基またはプロリン残基によって隔てられた4つおよび3つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各反復配列は2つのエクソンによってコードされており、通常、α-ヘリックス2の最初の部分のアミノ酸47と48の間でイントロンによって中断されている。もう1つのイントロンは反復配列の異なる位置にあり、通常はヘリックス3上に散在している。ジストロフィンはまた、約3080~3360個のアミノ酸あたりにシステインに富むドメインを含み、粘菌(Dictyostelium discoideum)のα-アクチニンのC末端ドメインと相同性を示すシステインに富むセグメント(すなわち、280個のアミノ酸中に15個のシステイン)を含む。カルボキシ末端ドメインはおよそアミノ酸3361~3685個中にある。
ジストロフィンのアミノ末端はFアクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜でジストロフィン関連蛋白質複合体(DAPC)に結合する。DAPCには、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン、カベオリンが含まれ、これらの成分のいずれかの変異は常染色体遺伝性筋ジストロフィーを引き起こす。ジストロフィンが欠乏するとDAPCは不安定化し、その結果構成タンパク質のレベルが低下し、線維の損傷と膜漏出が進行する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)やベッカー型筋ジストロフィー(BMD)など、さまざまな筋ジストロフィーでは、筋細胞は、主に誤ったスプライシングを引き起こす遺伝子配列の変異により、変化した機能的欠損型のジストロフィンを産生するか、または全くジストロフィンを産生しない。欠損したジストロフィンタンパク質が優勢に発現しているか、またはジストロフィンやジストロフィン様タンパク質が完全に欠如していると、前述のように筋肉の変性が急速に進行する。この点に関して、「欠陥のある」ジストロフィンタンパク質は、当該分野で知られているように、特定のDMDまたはBMDの被験体で産生されるジストロフィンの形態、または検出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴づけられる場合がある。
用語「エクソン」は、タンパク質をコードする核酸の定義された部分、または前処理(または前駆体)RNAのいずれかの部分がスプライシングによって除去された後、RNA分子の成熟形で表される核酸配列を意味する。成熟RNA分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)であることも、rRNAやtRNAのような非コードRNAの機能型であることもある。ヒトのジストロフィン遺伝子には約75個のエクソンがある。
用語「エクソンスキッピング」は、一般に、それによって、エクソン全体またはその一部が所定の前処理RNAから除去され、もってタンパク質に翻訳される成熟mRNAなどの成熟RNAに存在しないようにされるプロセスを指す。そのため、通常はスキップされたエクソンによってコードされているタンパク質の部分は、タンパク質の発現された形では存在せず、通常は機能的ではあるが変化した形のタンパク質を生成する。ある種の実施形態では、スキップされるエクソンはヒトジストロフィン遺伝子の異常エクソンであり、異常エクソンには、別のやり方で異常なスプライシングを引き起こす変異やその他の変化がその配列に含まれている場合がある。特定の実施形態では、スキップされるエクソンは、ヒトジストロフィン遺伝子の第45番エクソン,第51番エクソン、および/または第53番エクソンである。
ここで使用される用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を表す。
用語「ヒスチジンリッチ」は、カチオン性ドメインの少なくとも40%がヒスチジン残基から形成されることを意味する。
ここで互換的に使用される用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、1,2,または3個の環を含む環系化合物であって、それらの環のうち、少なくとも1個は、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選ばれた1~4(例えば、1、2、または3個の)のヘテロ原子を含有する芳香環である環系化合物を意味する。非置換型のヘテロアリール基は、合計1~9個の炭素原子を含む。用語ヘテロアリールは、1価の種及び2価の種の両方を含む。ヘテロアリール基の例としては、5~12の環メンバー、より一般的には、5~10の環メンバーを含有する単環基及び二環基が含まれる。ヘテロアリール基は、例えば、5員、又は6員の単環又は9員又は10員の二環であり、例えば、縮合5及び6員環、又は2つの縮合6員環から形成された二環構造体である。各環は、代表的には窒素、イオウ、及び酸素から選ばれる約4までのヘテロ原子を含有できる。代表的には、ヘテロアリール環は、3以下のヘテロ原子、より一般的には、2以下のヘテロ原子、例えば、1のヘテロ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール環は、少なくとも1の窒素原子を含有する。ヘテロアリール環における窒素原子は、イミダゾール又はピリジンにおけるように塩基性であり、インドール又はピロール窒素の場合のように、本質的に非塩基性である。一般に、ヘテロアリール基に存在する塩基性窒素原子の数は、環の各種のアミノ酸置換基を含めて、少なくとも5以上である。
ヘテロアリールの例としては、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,3,5-トリアゼニル、ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、インダゾリル、プリニル、ベンゾフラザニル、キノリニル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、ナフチリジニル、カルバゾリル、フェナジニル、ベンズイソキノリニル、ピリドピラジニル、チエノ[2,3-b]フラニル、2H-フロ[3,2-b]-ピラニル、5H-ピラジノ[2,3-d]-o-オキサジニル、1H-ピラゾロ[4,3-d]-オキサゾリル、4H-イミダゾ[4,5-d]チアゾリル、ピラジノ[2,3-d]ピリダジニル、イミダゾ[2,1-b]チアゾリル、イミダゾ[1,2-b][1,2,4]トリアジニルが含まれる。「ヘテロアリール」は、少なくとも1の環が、窒素、酸素、又はイオウから選ばれる1以上のヘテロ原子を含有する限り、少なくとも1の環が芳香族環であり、他の環の1以上が非芳香族、飽和又は部分的に飽和の環である部分的に芳香族のジ-又は多環系も含む。部分的に芳香族のヘテロアリール基の例としては、例えば、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、2-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロキノリニル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾフラニル、2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシニル、ベンゾ[1,3]ジオキソリル、2,2-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-2-ベンゾチエニル、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾフラニル、インドリニル、1,2,3,4-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジニル、1,2,3,4-テトラヒドロピリジド[2,3-b]ピラジニル、及び3,4-ジヒドロ-2H-ピリド[3,2-b][1,4]オキサジニルが含まれる。
5員ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、フラザニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、及びテトラゾリル基が含まれるが、これらに限定されない。
6員ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、及びトリアジニルが含まれるが、これらに限定されない。
二環式ヘテロアリール基は、例えば、下記の中から選ばれる基である:
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したベンゼン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したピリジン環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピリミジン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したピロール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピラゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピラジン環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイミダゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したオキサゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイソキサゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したチアゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイソチアゾール環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したチオフェン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したフラン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員の芳香族複素環に縮合したシクロヘキシル環;及び
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員の芳香族複素環に縮合したシクロペンチル環。
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したベンゼン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したピリジン環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピリミジン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したピロール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピラゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したピラジン環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイミダゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したオキサゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイソキサゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したチアゾール環;
環ヘテロ原子1又は2個を含有する5員又は6員環に縮合したイソチアゾール環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したチオフェン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員環に縮合したフラン環;
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員の芳香族複素環に縮合したシクロヘキシル環;及び
環ヘテロ原子1、2、又は3個を含有する5員又は6員の芳香族複素環に縮合したシクロペンチル環。
5員環に縮合した6員環を含有する二環式ヘテロアリール基の特別な例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インドリニル、イソインドリニル、プリニル(例えば、アデニニル、グアニニル)、インダゾリル、ベンゾジオキサリル、及びピラゾロピリジニル基が含まれるが、これらに限定されない。
2つの縮合した6員環を含有する二環式ヘテロアリール基の特別な例としては、キノリニル、イソキノリニル、クロマニル、チオクロマニル、クロメニル、イソクロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ベンゾジオキサニル、キノリジニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾジアジニル、ピリドピリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、及びプテリジニル基が含まれるが、これらに限定されない。
ここで使用される用語「ヘテロシクリル基」は、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される1~4個(例えば、1個、2個、または3個)のヘテロ原子を少なくとも1個含む、1個、2個、または3個の環を含む環系を指し、ただし、環系は、内環式ヘテロ原子も含む芳香族環を含まない。無置換のヘテロシクリル基は、合計2~9個の炭素原子を含む。用語ヘテロシクリルは、1価の種と2価の種の両方を含む。ヘテロシクリル基の例としては、5個から12個の環員を含み、より一般的には5個から10個の環員を含む単環式基と二環式基がある。ヘテロシクリル基は、例えば、5員環または6員環の単環または9員環または10員環の二環であることができ、例えば、縮合した5員環と6員環から形成される二環式構造、または2つの縮合した6員環から形成される二環式構造であることができる。各環は、窒素、硫黄、酸素から典型的に選択されるヘテロ原子を4個まで含むことができる。ヘテロシクリル基の非限定的な例としては、例えば、ピロリジン、ピペラジン、ピペリジン、アゼパン、1,4-ジアゼパン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、1,4-ジオキセパン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、インドリン、ベンゾピロリジン、2,3-ジヒドロベンゾフラン、フタラン、イソクロマン、および2,3-ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。
ここで用いられる用語「ヌクレオシド間結合」という用語は、オリゴヌクレオチドにおいて隣接するヌクレオシド間で共有結合を形成する基または結合を表す。ヌクレオシド間結合は、修飾されていないヌクレオシド間結合または修飾されたヌクレオシド間結合である。「非修飾ヌクレオシド間結合」は、リン酸(-O-P(O)(OH)-O-)ヌクレオシド間結合(「リン酸ホスホジエステル」)である。「修飾ヌクレオシド間結合」は、リン酸ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合である。修飾ヌクレオシド間結合の2つの主要なクラスは、リン原子の有無によって定義される。リン含有ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエートジエステル結合、ホスホロチオエートトリエステル結合、モルフォリノヌクレオシド間結合、メチルホスホナート、ホスホルアミダートなどがある。非限定的な非リン系ヌクレオシド間結合の例としては、メチレンメチルイミノ(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、チオジエステル(-O-C(O)-S-)、チオカルバメート(-O-C(O)(NH)-S-)、シロキサン(-O-Si(H)2-O-)、N,N’-ジメチルヒドラジン(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)などがある。ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素原子の1つが硫黄原子に置換されたホスホジエステル結合およびホスホトリエステル結合である。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、以下の構造の基:
,
[ここで、ZはO,S,またはSeであり;
Yは式:
-X-L-R1
であり;
各Xは、それぞれ独立して、-O-,-S-,-N(-L-R1)-,またはLであり;
各Lは、それぞれ独立して、共有結合またはリンカー(例えば、任意に置換されたC1-60 脂肪族のリンカーまたは任意に置換されたC2-60複素脂肪族のリンカー)であり;
各R1は、それぞれ独立して、水素,-S-S-R2,-O-CO-R2,-S-CO-R2,任意に置換されたC1-9ヘテロシクリル基,または疎水性部位である(ここで、各R2は、それぞれ独立して、任意に置換されたC1-10アルキル,任意に置換されたC2-10ヘテロアルキル,任意に置換されたC6-10アリール,任意に置換されたC6-10アリールC1-6アルキル,任意に置換されたC1-9ヘテロシクリル基,または任意に置換されたC1-9ヘテロシクリルC1-6アルキルである)]である。
[ここで、ZはO,S,またはSeであり;
Yは式:
-X-L-R1
であり;
各Xは、それぞれ独立して、-O-,-S-,-N(-L-R1)-,またはLであり;
各Lは、それぞれ独立して、共有結合またはリンカー(例えば、任意に置換されたC1-60 脂肪族のリンカーまたは任意に置換されたC2-60複素脂肪族のリンカー)であり;
各R1は、それぞれ独立して、水素,-S-S-R2,-O-CO-R2,-S-CO-R2,任意に置換されたC1-9ヘテロシクリル基,または疎水性部位である(ここで、各R2は、それぞれ独立して、任意に置換されたC1-10アルキル,任意に置換されたC2-10ヘテロアルキル,任意に置換されたC6-10アリール,任意に置換されたC6-10アリールC1-6アルキル,任意に置換されたC1-9ヘテロシクリル基,または任意に置換されたC1-9ヘテロシクリルC1-6アルキルである)]である。
Lが共有結合、R1が水素、Zが酸素、すべてのX基が-O-のとき、ヌクレオシド間基はリン酸ホスホジエステルとして知られる。Lが共有結合、R1が水素、Zが硫黄、すべてのX基が-O-のとき、ヌクレオシド間基はホスホロチオエートジエステルとして知られる。Zが酸素であり、すべてのX基が-O-であり、(1)Lがリンカーであるか、または(2)R1が水素でない場合、ヌクレオシド間基はホスホトリエステルとして知られている。Zが硫黄であり、すべてのX基が-O-であり、(1)Lがリンカーであるか、または(2)R1が水素でない場合、インターヌクレオシド基はホスホロチオエートトリエステルとして知られている。ホスホロチオエートトリエステル結合およびホスホトリエステル結合の非限定的な例は、US2017/0037399に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない(遺伝子内の)核酸領域を意味する。イントロンは、前駆体mRNA(プレmRNA)に転写され、その後、成熟RNAの形成中にスプライシングによって除去される非コード領域である。
オリゴヌクレオチドのクラスに関連してここで使用される用語「モルフォリノ」は、モルフォリノヌクレオシド間結合によって相互接続された少なくとも10個のモルフォリノ単量体単位のオリゴマーを表す。
モルフォリノには5’基と3’基を含む。例えば、モルフォリノは、以下の構造:
[ここで、nは少なくとも10(例えば12から30)の整数であり、モルフォリノサブユニットと関連する基Lの数を示す;
各Bは、それぞれ独立に核酸塩基であり;
R1は5’基であり(本明細書ではR1を5’末端と呼ぶことがある);
R2は3’基であり(本明細書ではR2を3’末端と呼ぶことがある);
Lは、(i)モルフォリノヌクレオシド間結合、または(ii)LがR2に結合している場合、共有結合である]であることがある。
[ここで、nは少なくとも10(例えば12から30)の整数であり、モルフォリノサブユニットと関連する基Lの数を示す;
各Bは、それぞれ独立に核酸塩基であり;
R1は5’基であり(本明細書ではR1を5’末端と呼ぶことがある);
R2は3’基であり(本明細書ではR2を3’末端と呼ぶことがある);
Lは、(i)モルフォリノヌクレオシド間結合、または(ii)LがR2に結合している場合、共有結合である]であることがある。
モルフォリノの5’基は、例えば、ヒドロキシル基、疎水性部位、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホスホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチドとリンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部分、中性有機ポリマー、または以下の構造:
または
で示される基である。
モルフォリノの3’基は、例えば、水素、疎水性部分、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホスホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチドとリンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部分、中性有機ポリマー、または以下の構造:
または
で示される基である。
モルフォリノであるオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合または連結されたペプチドとの複合体において、好ましい3’基は、ペプチドへの結合またはペプチド/リンカーの組み合わせへの結合である。
ここで使用される用語「モルフォリノヌクレオシド間結合」は、以下の構造:
,
[ここで、ZはOまたはSであり;
X1は単結合,-CH2-,または-O-であり;
X2は単結合,-CH2-O-,または-O-であり;
Yは-NR2であり(ここで、各Rは、それぞれ独立にHまたはC1-6アルキル(例えばメチル)であるか、あるいは、両Rは、それらが結合している窒素原子と一緒になってC2-9ヘテロシクリルを形成しており(例えばN-ピペラジニル基));
ただし、X1およびX2が同時に単結合であることはない]で示される2価の基を意味する。
[ここで、ZはOまたはSであり;
X1は単結合,-CH2-,または-O-であり;
X2は単結合,-CH2-O-,または-O-であり;
Yは-NR2であり(ここで、各Rは、それぞれ独立にHまたはC1-6アルキル(例えばメチル)であるか、あるいは、両Rは、それらが結合している窒素原子と一緒になってC2-9ヘテロシクリルを形成しており(例えばN-ピペラジニル基));
ただし、X1およびX2が同時に単結合であることはない]で示される2価の基を意味する。
ここで使用される用語「核酸塩基」は、ヌクレオシドのリボフラノース/2’-デオキシリボフラノースの1’位に見られる窒素を含む複素環を表す。核酸塩基は修飾されていないか、または修飾されている。ここで使用されるように、「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核酸塩基としては、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、およびN-2、N-6およびO-6置換プリン、ならびに合成および天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-アルキル(例えば、6-メチル)アデニンおよびグアニン、2-アルキル(例えばアデニンおよびグアニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、5-トリフルオロメチルウラシル、5-トリフルオロメチルシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニン等が含まれる。
ある種の核酸塩基は、核酸の結合親和性を高めるのに特に有用である。例えば、5-置換ピリミジン;6-アザピリミジン;N2-、N6-、および/またはO6-置換プリンなどである。核酸二重鎖の安定性は、例えば5-メチルシトシンを用いて高めることができる。核酸塩基の非限定的な例としては、以下が挙げられる:2-アミノプロピルアデニン、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-N-メチルグアニン、6-N-メチルアデニン、2-プロピルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシル、5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、6-アゾチミン、5-リボシルウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、8-アザおよび他の8-置換プリン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニン、6-N-ベンゾイルアデニン、2-N-イソブチリルグアニン、4-N-ベンゾイルシトシン、4-N-ベンゾイルウラシル、5-メチル4-N-ベンゾイルシトシン、5-メチル4-N-ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、プロミスキャス塩基、サイズ拡大塩基、フッ素化塩基等。
さらなる修飾核酸塩基には、1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン、1,3-ジアザフェノチアジン-2-オン、9-(2-アミノエトキシ)-1,3-ジアザフェノキサジン-2-オン(G-クランプ)などの三環式ピリミジンがある。修飾核酸塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば7-デアザアデニン、7-デアザグアニン、2-アミノピリジン、2-ピリドンなどで置換されたものも含まれる。
さらなる核酸塩基として、Meriganら、米国特許第3,687,808号に開示されているもの;The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.,Ed.,John Wiley&Sons,1990,858-859に開示されているもの;Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613に開示されているもの;Sanghvi,Y.S.,Chapter15,Antisense Research and Applications,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993,273-288に開示されているもの;およびChapters 6 and 15,Antisense Drug Technology,Crooke S.T.,Ed.,CRC Press,2008,163-166 and 442-443に開示されているもの等が含まれる。
ここで使用される用語「ヌクレオシド」は、本技術分野で知られている糖-核酸塩基化合物および基、ならびに本技術分野で知られている修飾または非修飾の2’-デオキシリボフラノース-核酸塩基化合物および基を表す。糖はリボフラノースでもよい。糖は修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。非修飾リボフラノース-核酸塩基は、非修飾核酸塩基にアノマー炭素結合を有するリボフラノースである。非修飾リボフラノース核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジンである。非修飾の2’-デオキシリボフラノース-核酸塩基化合物は、2’-デオキシアデノシン、2’-デオキシシチジン、2’-デオキシグアノシン、およびチミジンである。修飾化合物および基は、本明細書に記載の核酸塩基修飾物および糖修飾物からなる群から選択される1つ以上の修飾物を含む。核酸塩基修飾とは、修飾されていない核酸塩基を修飾された核酸塩基に置き換えることである。糖修飾は、例えば、2’-置換、固定化、炭素環化、または非固定化であってよい。2’-置換とは、リボフラノースの2’-ヒドロキシルを、2’-フルオロ、2’-メトキシ、または2’-(2-メトキシ)エトキシで置換することである。
あるいは、2’-置換は2’-(ara)置換であってもよく、これは以下の構造に相当する:
(Bは核酸塩基であり、Rは2’-(ara)置換基(例えばフルオロ)である)。2’-(ara)置換基は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される他の2’-置換基と同じであり得る。いくつかの実施形態では、2’-(ara)置換基は2’-(ara)-F置換基である(Rはフルオロ)。固定修飾は、リボフラノースの4’-炭素原子と2’-炭素原子の間に架橋を組み込むことである。固定修飾を有するヌクレオシドは、当該技術分野では架橋核酸として知られており、例えば、固定核酸(LNA)、エチレン架橋核酸(ENA)、およびcEt核酸である。架橋核酸は、典型的には親和性増強ヌクレオシドとして使用される。「ヌクレオシド」はまた、モルフォリノサブユニットを意味することがある。
ここで使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合に結合したヌクレオシド、または以下の構造:
-X1-P(X2)(R1)2
[ここで、X1は、O,S,またはNHであり、X2は、存在しないか、=O、または=Sであり、各R1は、それぞれ独立に-OH,-N(R2)2、または-O-CH2CH2CNである(ここで、各R2は、それぞれ独立に、任意に置換されたアルキルであるか、または両R2基は、それら結合している窒素原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル基を形成する)]により表される一価基を表す。
-X1-P(X2)(R1)2
[ここで、X1は、O,S,またはNHであり、X2は、存在しないか、=O、または=Sであり、各R1は、それぞれ独立に-OH,-N(R2)2、または-O-CH2CH2CNである(ここで、各R2は、それぞれ独立に、任意に置換されたアルキルであるか、または両R2基は、それら結合している窒素原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル基を形成する)]により表される一価基を表す。
ここで使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合によって共有結合した10個以上の連続したヌクレオシドを含む構造;10個以上のモルフォリノサブユニットを含むモルフォリノ;または10個以上のモルフォリノサブユニットを含むペプチド核酸を意味する。好ましくは、オリゴヌクレオチドはモルフォリノである。
用語「任意に置換された」は、前述の各々の基について、置換されていても、置換されていなくてもよい基、構造体、又は分子を意味する。用語「ここで、R1基内のCH、CH2、CH3基又はヘテロ原子(すなわち、NH)のいずれかが任意に置換されている」は、R1基の水素原子の(いずれかの)1が、適切に定義された基によって置換されていることを意味する。
本明細書において、用語「作動可能に結合された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列および調節ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドコード配列の発現を調節配列の制御下に置くような方法で共有結合している状況を含み得、そのようなものとして、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列の一部または全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写をもたらすことが可能である。適切な場合には、得られた転写物を所望のペプチドに翻訳することができる。
ここで使用される用語「薬学的に許容される」は、合理的な利益/リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応および他の問題合併症を伴わずに、個体(例えばヒト)の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、および/または投薬フォームを意味する。
ここで使用される用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書に開示される複合体、オリゴヌクレオチド、またはペプチドの薬学的に許容される塩を意味する。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩には、健全な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益/リスク比に見合うものが含まれ得る。薬学的に許容される塩は当技術分野でよく知られている。例えば、薬学的に許容される塩は、Berge et al.,J.Pharmaceutical Sciences 66:1-19,1977およびPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,(Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth),Wiley-VCH,2008に記載されている。その塩は、本明細書に記載の化合物の最終的な単離および精製の際にその場で調製することもできるし、遊離塩基基を適切な酸と反応させることによって別途調製することもできる。代表的な酸付加塩として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩 シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、 2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩 ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、バレレート塩などがある。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む、無毒なアンモニウム、4級アンモニウム、アミンカチオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ここで使用される用語「医薬組成物」は、ここに記載されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を表し、薬学的に許容される賦形剤で調合され、被験体の疾患治療のための治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を得て製造または販売される。
用語「減少させる」または「抑制する」は、一般に、診断技術における日常的な技術に従って測定される、本明細書に記載される疾患または状態の症状のような、関連する生理学的または細胞応答を「減少させる」、本発明の1つ以上の化合物の能力に関連することがある。関連する(生体内または生体外における)生理学的または細胞学的応答は、当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状または病態の軽減、またはDMDもしくはBMDの個体で発現されるジストロフィンの変化形態のような、ジストロフィンの欠損形態の発現の軽減が含まれ得る。反応の「減少」は、アンチセンス化合物または対照組成物を用いない場合に生じる反応と比較して統計的に有意であり、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%の減少を含み、その間のすべての整数を含む。
ここで使用される用語「被験体」は、被験体からの試料の当技術分野で既知の実験室検査の有無にかかわらず、有資格の専門家(例えば、医師または実地看護師)によって決定される、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはその危険性があるヒトまたはヒト以外の動物(例えば、哺乳動物)を表す。疾患、障害、状態の非限定的な例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)やベッカー型筋ジストロフィー(BMD)がある。
用語「糖」または「糖部分」には、フラノース環またはヌクレオシドのフラノース環を置換できる構造を有する、天然に存在する糖が含まれる。本発明のヌクレオシドに含まれる糖は、非フラノース(または4’-置換フラノース)環、環系または開放系であってもよい。このような構造には、天然のフラノース環(例えば、六員環)に対する単純な変化が含まれる。代替の糖としては、フラノース環が、例えばモルフォリノまたはヘキシトール環系のような別の環系に置換された代替糖も含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれ得る有用な糖部位の非限定的な例としては、β-D-リボース、β-D-2’-デオキシリボース、置換糖(例えば、2’,5’,およびビス置換された糖)、4’-S-糖(例えば、4’-S-リボース、4’-S-2’-デオキシリボース、および4’-S-2’-置換リボース)、二環式糖部位(例えば2’-O-CH2-4’または2’-O-(CH2)2-4’架橋リボース由来の二環式糖)および代替糖(リボース環がモルフォリノまたはヘキシトール環系で置換されている場合)等が挙げられる。
ここで使用される用語「治療」および「処置」は、疾患、障害、または状態(例えば、DMDまたはBMD)を改善、緩和、または安定させることを意図した被験体の医学的管理を指す。この用語には、積極的治療(DMDまたはBMDを改善するための治療)、緩和的治療(DMDまたはBMDの症状を緩和するための治療)、支持的治療(他の治療を補完するための治療)が含まれる。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む」および「含有する」およびこれらの変形は、「含むがこれらに限定されない」という意味であり、他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図するものではない(また、除外するものではない)。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の定めがない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、文脈上そうでなければならない場合を除き、本明細書は単数だけでなく複数も想定していると理解される。
用語「複合体」はすべて、その溶媒和物も指す。
用語「オリゴヌクレオチド」はすべて、その塩および溶媒和物も指す。
特記しない限り、本明細書では、すべてのペプチドをN末端からC末端方向(左から右)に示す。特記しない限り、本明細書では、すべてのオリゴヌクレオチドを5’から3’方向(左から右)に示す。
本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学部位または基は、それと両立しない場合を除き、本明細書に記載された他の態様、実施形態または実施例にも適用可能であると理解される。本明細書(添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示されたすべての特徴、および/またはこのように開示された方法もしくはプロセスのすべての工程は、そのような特徴および/または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
概して、本発明は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体、またはその薬学的に許容される塩を提供する。オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子の第45番エクソン,第51番エクソン,または第53番エクソンの内または近位の標的配列に相補的である。ペプチドは少なくとも1つの正電荷ドメインと少なくとも1つの疎水性ドメインを含む。理論に縛られることなく、ペプチドは、例えば、複合体化オリゴヌクレオチドの細胞内送達を改善することによって、複合体化オリゴヌクレオチドの活性を高めるための細胞透過性ペプチドとして作用する可能性がある。有利なことに、以下の例に記載されているように、ここに開示されている複合体は、特定の代替ペプチド構造と比較して毒性が低い。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、DMDの治療に使用するジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングを誘導するためのものである。いくつかの実施形態では、単一エクソンは、DMDに関与する任意のエクソンから選択され、例えば、第45番,第51番または第53番のエクソンのような、ジストロフィン遺伝子の任意のエクソンであり得る。任意の配列のPMOオリゴヌクレオチドは、購入することができる(例えば、米国のGene Tools社から)。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、遺伝子標的のmRNA前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、遺伝子標的のmRNA前駆体と相補的なオリゴヌクレオチドは、mRNA前駆体を変化させて変化したmRNA、ひいては変化した配列のタンパク質をもたらす立体的なブロッキング事象を引き起こす。いくつかの実施形態では、遺伝子標的はジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、立体的な遮断事象は、エクソン封入またはエクソンスキッピングであることがある。いくつかの実施形態では、立体的な遮断事象はエクソンスキッピング、例えばジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングである。
必要に応じて、水溶性を向上させるために、ペプチドに結合させる前に、オリゴヌクレオチド(PMOやPNAなど)の一端または両端に、リジン残基を付加することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの分子量は5,000Da未満、例えば3,000Da未満または1,000Da未満である。
いくつかの実施形態では、ペプチドはC末端でオリゴヌクレオチドと共有結合している。
いくつかの実施形態では、必要に応じて、リンカーを介して、ペプチドをオリゴヌクレオチドに共有結合させる。リンカーは、ペプチド配列をオリゴヌクレオチドから分離するスペーサーとして機能する可能性がある。
リンカーは、任意の適切な配列から選択することができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドとオリゴヌクレオチドの間に存在する。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドおよびオリゴヌクレオチドとは別の基である。従って、リンカーは人工アミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、複合体は、オリゴヌクレオチドにリンカーを介して共有結合したペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を含む。
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を含む。
いくつかの実施形態では、複合体は、以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
からなる。
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
からなる。
いくつかの実施形態では、本発明による複合体には、ここに記載されたペプチドのいずれを用いてもよい。
好ましくは、オリゴヌクレオチドはモルフォリノ(より好ましくは、すべてのモルフォリノヌクレオシド間結合が-P(O)(NMe2)O-であるモルフォリノ)である。通常、モルホリニオヌクレオシド間結合のリン原子は、モルフォリノサブユニットの窒素原子に結合している。
オリゴヌクレオチド
ここに開示された複合体に使用されるオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子内の標的部位に相補的なものであることがある。理論に縛られることなく、ヒトジストロフィン遺伝子内の特定の標的領域にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体スプライシングの際に、第45番エクソン,第51番エクソン,または第53番エクソンのスキップを誘導し、それによってデュシェンヌ型筋ジストロフィーを改善する可能性があると考えられている。本発明のオリゴヌクレオチドで使用することができる核酸塩基配列の非限定的な例は、米国特許第9,018,368号;米国特許第9,079,934号;米国特許第9,447,417号;米国特許第10,385,092号;米国特許第10,781,450号等に見ることができる。あるいは、配列はGGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90)であり、マウスジストロフィン遺伝子の第23番エクソンを標的とする。
ここに開示された複合体に使用されるオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子内の標的部位に相補的なものであることがある。理論に縛られることなく、ヒトジストロフィン遺伝子内の特定の標的領域にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体スプライシングの際に、第45番エクソン,第51番エクソン,または第53番エクソンのスキップを誘導し、それによってデュシェンヌ型筋ジストロフィーを改善する可能性があると考えられている。本発明のオリゴヌクレオチドで使用することができる核酸塩基配列の非限定的な例は、米国特許第9,018,368号;米国特許第9,079,934号;米国特許第9,447,417号;米国特許第10,385,092号;米国特許第10,781,450号等に見ることができる。あるいは、配列はGGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90)であり、マウスジストロフィン遺伝子の第23番エクソンを標的とする。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的な核酸塩基配列を含み、例えば、第45番エクソンスキッピングを誘導することができる。このような配列の非限定的な例を表1に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表1に記載されている配列のいずれかから少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3’(配列番号122)またはそのチミン置換アナログ,5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)からの少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3’(配列番号122)またはそのチミン置換アナログ,および5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、表1に示すオリゴヌクレオチド配列中の1つ以上のウラシル(例えば、全てのウラシル)がチミンに置換されている。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、5’-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3’(配列番号122)であることがある。あるいは、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)であることがある。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的で、例えば、第51番エクソンスキッピングを誘導することができる核酸塩基配列を含む。このような配列の非限定的な例を表2に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表2に記載されている配列のいずれかから、少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3’(配列番号130)またはそのチミン置換アナログ,あるいは5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)からの少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3’(配列番号130)またはそのチミン置換アナログ,および5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、表2に示すオリゴヌクレオチド配列中の1つ以上のウラシル(例えば、全てのウラシル)がチミンに置換されている。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、5’-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3’(配列番号130)であることがある。あるいは、オリゴヌクレオチド配列は、例えば、5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)であることがある。
オリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子に相補的で、例えば、第53番エクソンスキッピングを誘導することができる核酸塩基配列を含む。このような配列の非限定的な例を表3に示す。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、表3に記載されている配列のいずれかから、少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含むことができる。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)または5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)からの少なくとも12個(例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上)の連続した核酸塩基を含む。特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)および5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)からなる群から選ばれた核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、表3に示すオリゴヌクレオチド配列中の1つ以上のチミン(例えば全てのチミン)をウラシルに置換する。いくつかの実施形態では、表3に示すオリゴヌクレオチド配列中の1つ以上のウラシル(例えば、全てのウラシル)がチミンに置換されている。
ペプチド
ここで述べられる複合体に使用可能なペプチドは、国際公開第2020/030927号および国際公開第2020/115494号に開示されているものを含む。好ましくは、ここで述べられる複合体に含まれるペプチドは、人工アミノ酸残基を含まない。
ここで述べられる複合体に使用可能なペプチドは、国際公開第2020/030927号および国際公開第2020/115494号に開示されているものを含む。好ましくは、ここで述べられる複合体に含まれるペプチドは、人工アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸残基のいかなる形態も含まない。いくつかの実施形態では、ペプチドは、6-アミノヘキサン酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは天然アミノ酸残基のみを含み、したがって、天然アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば6-アミノヘキサン酸は、天然アミノ酸に置き換えられる。いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば6-アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンから選択されるアミノ酸に置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、6-アミノヘキサン酸は、ベータアラニンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、6-アミノヘキサン酸は、ヒスチジンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、6-アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンに置き換えられる。
いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドで典型的に使用される人工アミノ酸、例えば6-アミノヘキサン酸は、ベータアラニン、セリン、プロリン、アルギニンおよびヒスチジンまたはヒドロキシプロリンのいずれかの組合せ、例えば、ベータアラニン、ヒスチジン、およびヒドロキシプロリンのいずれかの組合せに置き換えることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも4アミノ酸残基をそれぞれ含む2つ以上のカチオン性ドメインと、少なくとも3アミノ酸残基をそれぞれ含む1つまたは複数の疎水性ドメインを含む、40アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドであって、少なくとも1個のカチオン性ドメインがヒスチジン残基を含むペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも1個のカチオン性ドメインはヒスチジンリッチである。
いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチによって意味されるものは、カチオン性ドメインに関連して本明細書で定義されている。
カチオン性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも2つのカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも2つのカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大4つのカチオン性ドメイン、最大3つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのカチオン性ドメインを含む。
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも4アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する2つ以上のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、4アミノ酸残基から12アミノ酸残基の間の長さ、適切には4アミノ酸残基から7アミノ酸残基の間の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、4、5、6、または7アミノ酸残基の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは同様の長さであり、例えば、それぞれのカチオン性ドメインは同じ長さである。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインはカチオン性アミノ酸を含み、極性アミノ酸および/または非極性アミノ酸も含み得る。
非極性アミノ酸は、アラニン、ベータアラニン、プロリン、グリシン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンから選択することができる。適切には、非極性アミノ酸は電荷を有していない。
極性アミノ酸は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。いくつかの実施形態では、選択された極性アミノ酸は、負電荷を有していない。
カチオン性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシンから選択することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性アミノ酸は、生理学的pHで正電荷を有する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アニオン性アミノ酸残基または負電荷アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および/またはセリン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および/またはセリン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも7.5、少なくとも8.0、少なくとも8.5、少なくとも9.0、少なくとも9.5、少なくとも10.0、少なくとも10.5、少なくとも11.0、少なくとも11.5、少なくとも12.0の等電点(pi)を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも10.0の等電点(pi)を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、10.0から13.0の間の等電点(pi)を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、10.4から12.5の間の等電点(pi)を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインの等電点は、当技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって生理学的pHで算出される。いくつかの実施形態では、IPC(www.isoelectric.org)のLukasz Kozlowski、Biol Direct. 2016;11:55.DOI:10.1186/s13062-016-0159-9によって開発されたwebベースのアルゴリズムを使用する。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも1個のカチオン性アミノ酸、例えば、1カチオン性アミノ酸から5カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも2つのカチオン性アミノ酸、例えば、2カチオン性アミノ酸から5カチオン性アミノ酸の間のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび/またはヒスチジンリッチである。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、ヒスチジンおよびアルギニンの両方を含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン残基および/またはヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%のアルギニン残基および/またはヒスチジン残基を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%のアルギニン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%のヒスチジン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、合計で1ヒスチジン残基から5ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、1アルギニン残基から5アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、1アルギニン残基から5アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、1ヒスチジン残基から5ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、合計で2ヒスチジン残基から5ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基と、3アルギニン残基から5アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、3アルギニン残基から5アルギニン残基の間のアルギニン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、2ヒスチジン残基から5ヒスチジン残基の間のヒスチジン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、1つまたは複数のベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、合計で2ベータアラニン残基から5ベータアラニン残基の間のベータアラニン残基、適切には合計で2ベータアラニン残基または3ベータアラニン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、1つまたは複数のヒドロキシプロリン残基またはセリン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、1ヒドロキシプロリン残基から2ヒドロキシプロリン残基の間のヒドロキシプロリン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、1セリン残基から2セリン残基の間のセリン残基を含み得る。
いくつかの実施形態では、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はヒスチジンであり得るか、あるいは、例えば、所定のカチオン性ドメイン内の全てのカチオン性アミノ酸はアルギニンであり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも1個のヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも1個のアルギニンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも1個のアルギニンリッチカチオン性ドメインと、少なくとも1個のヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのアルギニンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのアルギニンおよびヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、1つのアルギニンリッチカチオン性ドメインと1つのヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、3つ以下の連続するアルギニン残基、例えば、2つ以下の連続するアルギニン残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、連続するヒスチジン残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および/またはベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のアルギニン、ヒスチジン、および/またはベータアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメイン内のアミノ酸残基の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%は、アルギニン、ヒスチジン、および/またはベータアラニン残基である。いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、および/またはベータアラニン残基からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第1のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第1のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、および必要に応じてアルギニン残基を含む第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基を含む第1のカチオン性ドメインと、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基を含む第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第1のカチオン性ドメインと、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニン残基およびベータアラニン残基からなる第1のカチオン性ドメインと、アルギニン残基、ヒスチジン残基およびベータアラニン残基からなる第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも2つのカチオン性ドメインを含み、例えば、これらのカチオン性ドメインはペプチドのアームを形成する。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、ペプチドのN末端およびC末端に位置している。いくつかの実施形態では、したがって、カチオン性ドメインは、カチオン性アームドメインとして公知であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのカチオン性ドメインを含み、1つはペプチドのN末端に位置しており、もう1つはペプチドのC末端に位置している。いくつかの実施形態では、ペプチドのいずれかの末端に位置している。いくつかの実施形態では、末端修飾、リンカーおよび/またはオリゴヌクレオチドなどの他の基を除き、さらなるアミノ酸またはドメインは、ペプチドのN末端およびC末端に存在しない。誤解を避けるために、そのような他の基は、本明細書で記載され、特許請求されている「ペプチド」に加えて存在し得る。いくつかの実施形態では、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、ペプチドの末端を形成する。いくつかの実施形態では、これは、本明細書で記載されているさらなるリンカー基の存在を排除するものではない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大4つのカチオン性ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、両方ともアルギニンリッチである2つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである1つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、両方がアルギニンリッチおよびヒスチジンリッチである2つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アルギニンリッチである1つのカチオン性ドメインと、ヒスチジンリッチである1つのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、以下のR、H、B、RR、HH、BB、RH、HR、RB、BR、HB、BH、RBR、RBB、BRR、BBR、BRB、RBH、RHB、HRB、BRH、HRR、RRH、HRH、HBB、BBH、RHR、BHB、HBHから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインはまた、セリン残基、プロリン残基および/またはヒドロキシプロリン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、以下のRP、PR、RPR、RRP、PRR、PRP、Hyp;R[Hyp]R、RR[Hyp]、[Hyp]RR、[Hyp]R[Hyp]、[Hyp][Hyp]R、R[Hyp][Hyp]、SB、BSから選択されるアミノ酸単位、またはその任意の組合せ、または上記で列挙したアミノ酸単位との任意の組合せをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)のいずれかまたはその任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B、R[Hyp]H[Hyp]HB、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)のいずれかまたはその任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRRBR(配列番号4)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)のうちの1つからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドのそれぞれのカチオン性ドメインは異なる。
疎水性ドメイン
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも1個の疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
本発明は、ある特定の長さを有する少なくとも1個の疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短い細胞透過性ペプチドに関する。
「疎水性」への言及は、本明細書では、水をはじく能力を有するか、または水と混じり合わないアミノ酸またはアミノ酸のドメインを示す。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、最大3つの疎水性ドメイン、最大2つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、1つの疎水性ドメインを含む。
上記で定義したように、ペプチドは、少なくとも3アミノ酸残基の長さをそれぞれ有する1つまたは複数の疎水性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、3アミノ酸から6アミノ酸の間の長さを有する。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、5アミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基を含み得る。
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンから選択することができる。
非極性アミノ酸残基は、プロリン、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンから選択することができる。
極性アミノ酸残基は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択することができる。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインは、親水性アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、疎水性アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも0.3、少なくとも0.4、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも0.3、少なくとも0.35、少なくとも0.4、少なくとも0.45の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも1.2、少なくとも1.25、少なくとも1.3、少なくとも1.35の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、0.4から1.4の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、0.45から0.48の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、1.27から1.39の間の疎水性を含む。
いくつかの実施形態では、疎水性は、WhiteおよびWimley:W.C.Wimley and S.H. White,“Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces”Nature Struct Biol 3:842(1996)によって測定されるものである。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも3疎水性アミノ酸残基、少なくとも4疎水性アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、およびグルタミン残基を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、および/またはグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシンおよび/またはグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、トリプトファンおよび/またはプロリン残基からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、1つの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、ペプチドの中央に位置する。いくつかの実施形態では、したがって、疎水性ドメインは、コア疎水性ドメインとして公知であり得る。いくつかの実施形態では、上記疎水性コアドメインまたはそれぞれの疎水性コアドメインは、両側がアームドメインによって挟まれている。いくつかの実施形態では、アームドメインは、1つまたは複数のカチオン性ドメインと、1つまたは複数のさらなる疎水性ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる2つのアームドメインを含み、それぞれのアームドメインはカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、疎水性コアドメインを挟んでいる2つのカチオン性アームドメインからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはそれらの任意の組合せからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列FQILY(配列番号21)、YQFLI(配列番号20)、ILFQY(配列番号22)のうちの1つからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、FQILY(配列番号21)からなる。
いくつかの実施形態では、ペプチド内のそれぞれの疎水性ドメインは、同じ配列または異なる配列を有し得る。
本発明は、病状の処置における治療用カーゴ分子の輸送で使用するための短い細胞透過性ペプチドに関する。
ペプチドは、連続する単一分子である配列を有し、したがって、ペプチドのドメインは連続している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、N末端からC末端の間に直線的に配置されたいくつかのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ドメインは、上記で記載したカチオン性ドメインおよび疎水性ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、カチオン性ドメインおよび疎水性ドメインからなり、ドメインは上記で定義した通りである。
それぞれのドメインは、上記の関連セクションで記載した共通の配列特性を有するが、それぞれのドメインの正確な配列は変形形態および修飾が可能である。したがって、それぞれのドメインに対して様々な配列が可能である。それぞれの可能なドメイン配列の組合せは、様々なペプチド構造をもたらし、それらのそれぞれが本発明の一部を形成する。ペプチド構造の特徴は以下に記載されている。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインは、任意の2つのカチオン性ドメインを分ける。いくつかの実施形態では、それぞれの疎水性ドメインは、その両側でカチオン性ドメインにより挟まれる。
いくつかの実施形態では、カチオン性ドメインは、別のカチオン性ドメインと連続していない。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配置で2つのカチオン性ドメインにより挟まれている1つの疎水性ドメインを含む:
[カチオン性ドメイン]-[疎水性ドメイン]-[カチオン性ドメイン]。
[カチオン性ドメイン]-[疎水性ドメイン]-[カチオン性ドメイン]。
いくつかの実施形態では、疎水性ドメインはコアドメインとして公知であり得、それぞれのカチオン性ドメインはアームドメインとして公知であり得る。いくつかの実施形態では、疎水性アームドメインは、カチオン性コアドメインをその両側から挟む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのカチオン性ドメインおよび1つの疎水性ドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、2つのカチオン性アームドメインに挟まれた1つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、およびR[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)から選択される配列をそれぞれ含む2つのカチオン性アームドメインに挟まれた、YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、およびWWPW(配列番号26)から選択される配列を含む1つの疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRRBR(配列番号4)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)から選択される配列を含む2つのカチオン性アームドメインに挟まれた、FQILY(配列番号21)、YQFLI(配列番号20)、およびILFQY(配列番号22)から選択される配列を含む1つの疎水性コアドメインからなる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRRBR(配列番号4)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)から選択される配列を含む2つのカチオンのアームドメインに挟まれた、配列:FQILY(配列番号21)を含む1つの疎水性コアドメインからなる。
いずれかのそのような実施形態では、さらなる基、例えば、リンカー、末端修飾および/またはオリゴヌクレオチドが存在し得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、N末端が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、N-アセチル化、N-メチル化、N-トリフルオロアセチル化、N-トリフルオロメチルスルホニル化、またはN-メチルスルホニル化されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、N-アセチル化されている。
必要に応じて、ペプチドのN末端は修飾されていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、N-アセチル化されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、C末端が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カルボキシ基、チオ酸基、アミノオキシ基、ヒドラジノ基、チオエステル基、アジド基、歪みアルキン、歪みアルケン、アルデヒド基、チオール基またはハロアセチル基から選択されるC末端修飾を含む。
有利なことには、C末端修飾は、ペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させるための手段を提供する。
したがって、C末端修飾はリンカーを含むことができ、その逆も同様である。いくつかの実施形態では、C末端修飾はリンカーからなっていてもよく、その逆も同様である。適切なリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、C末端カルボキシル基を含む。
いくつかの実施形態では、C末端カルボキシル基は、グリシンまたはベータアラニン残基によって提供される。
いくつかの実施形態では、C末端カルボキシル基は、ベータアラニン残基によって提供される。いくつかの実施形態では、C末端のベータアラニン残基は、リンカーである。
いくつかの実施形態では、したがって、それぞれのカチオン性ドメインは、N末端修飾またはC末端修飾をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、C末端のカチオン性ドメインは、C末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、N末端のカチオン性ドメインは、N末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、C末端のカチオン性ドメインはリンカー基を含み、いくつかの実施形態では、C末端のカチオン性ドメインはC末端ベータアラニンを含む。いくつかの実施形態では、N末端のカチオン性ドメインは、N-アセチル化されている。
本発明のペプチドは、40アミノ酸残基以下の全長を有するものと定義される。ペプチドは、したがって、オリゴペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、3アミノ酸残基から30アミノ酸残基の間、例えば、5アミノ酸残基から25アミノ酸残基の間、10アミノ酸残基から25アミノ酸残基の間、13アミノ酸残基から23アミノ酸残基の間、15アミノ酸残基から20アミノ酸残基の間の全長を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも12アミノ酸残基、少なくとも13アミノ酸残基、少なくとも14アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも16アミノ酸残基、少なくとも17アミノ酸残基の全長を有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞に透過することが可能である。ペプチドは、したがって、細胞透過性ペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに付着させるためのものである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に輸送するためのものである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達するためのものである。ペプチドは、したがって、担体ペプチドと見なすことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞および組織に、適切には細胞の核に透過することが可能である。例えば、筋肉組織に透過することが可能である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列のいずれかから選択することができる:
RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)
RBRRBRRFQILYRBRR(配列番号28)
RBRRBRFQILYRRBRBR(配列番号29)
RBRBRFQILYRBRRBRR(配列番号30)
RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)
RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)
RBRRBRFQILYRBRBR(配列番号33)
RBRRBFQILYRBRRBR(配列番号34)
RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)
RBRRBFQILYRBRBR(配列番号36)
RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)
RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)
RBRRBRRFQILYHBRBH(配列番号39)
RBRRBRRYQFLIRBHBH(配列番号40)
RBRRBRRILFQYRBHBH(配列番号41)
RBRHBHRFQILYRBRBR(配列番号42)
RBRBBHRFQILYRBHBH(配列番号43)
RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)
RBRRBRFQILYHBHBH(配列番号45)
RBRRBHFQILYRBHBH(配列番号46)
HBRRBRFQILYRBHBH(配列番号47)
RBRRBFQILYRBHBH(配列番号48)
RBRRBRFQILYBHBH(配列番号49)
RBRRBRYQFLIHBHBH(配列番号50)
RBRRBRILFQYHBHBH(配列番号51)
RBRRBRRFQILYHBHBH(配列番号52)
RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)
RBRRBRRFQILYRBRR(配列番号28)
RBRRBRFQILYRRBRBR(配列番号29)
RBRBRFQILYRBRRBRR(配列番号30)
RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)
RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)
RBRRBRFQILYRBRBR(配列番号33)
RBRRBFQILYRBRRBR(配列番号34)
RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)
RBRRBFQILYRBRBR(配列番号36)
RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)
RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)
RBRRBRRFQILYHBRBH(配列番号39)
RBRRBRRYQFLIRBHBH(配列番号40)
RBRRBRRILFQYRBHBH(配列番号41)
RBRHBHRFQILYRBRBR(配列番号42)
RBRBBHRFQILYRBHBH(配列番号43)
RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)
RBRRBRFQILYHBHBH(配列番号45)
RBRRBHFQILYRBHBH(配列番号46)
HBRRBRFQILYRBHBH(配列番号47)
RBRRBFQILYRBHBH(配列番号48)
RBRRBRFQILYBHBH(配列番号49)
RBRRBRYQFLIHBHBH(配列番号50)
RBRRBRILFQYHBHBH(配列番号51)
RBRRBRRFQILYHBHBH(配列番号52)
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下のさらなる配列のいずれかから選択することができる:
RBRRBRFQILYBRBS(配列番号53)
RBRRBRFQILYBRB[Hyp](配列番号54)
RBRRBRFQILYBR[Hyp]R(配列番号55)
RRBRRBRFQILYBRBR(配列番号56)
BRRBRRFQILYBRBR(配列番号57)
RBRRBRWWWBRBR(配列番号58)
RBRRBRWWPWWBRBR(配列番号59)
RBRRBRWPWWBRBR(配列番号60)
RBRRBRWWPWBRBR(配列番号61)
RBRRBRRWWWRBRBR(配列番号62)
RBRRBRRWWPWWRBRBR(配列番号63)
RBRRBRRWPWWRBRBR(配列番号64)
RBRRBRRWWPWRBRBR(配列番号65)
RBRRBRRFQILYBRBR(配列番号66)
RBRRBRRFQILYRBR(配列番号67)
BRBRBWWPWWRBRRBR(配列番号68)
RBRRBRRFQILYBHBH(配列番号69)
RBRRBRRFQIYRBHBH(配列番号70)
RBRRBRFQILYBRBH(配列番号71)
RBRRBRFQILYR[Hyp]H[Hyp]H(配列番号72)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYRBHBH(配列番号73)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYR[Hyp]H[Hyp]H(配列番号74)
RBRRBRWWWRBHBH(配列番号75)
RBRRBRWWPRBHBH(配列番号76)
RBRRBRPWWRBHBH(配列番号77)
RBRRBRWWPWWRBHBH(配列番号78)
RBRRBRWWPWRBHBH(配列番号79)
RBRRBRWPWWRBHBH(配列番号80)
RBRRBRRWWWRBHBH(配列番号81)
RBRRBRRWWPWWRBHBH(配列番号82)
RBRRBRRWPWWRBHBH(配列番号83)
RBRRBRRWWPWRBHBH(配列番号84)
RRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号85)
BRRBRRFQILYRBHBH(配列番号86)
RRBRRBRFQILYBHBH(配列番号87)
BRRBRRFQILYBHBH(配列番号88)
RBRRBHRFQILYRBHBH(配列番号89)
RBRRBRFQILY[Hyp]R[Hyp]R(配列番号101)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYBRBR(配列番号102)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILY[Hyp]R[Hyp]R(配列番号103)
RBRRBRWWWBRBR(配列番号104)
RBRRBRWWPWWBRBR(配列番号105)
RBRRBRFQILYBRBS(配列番号53)
RBRRBRFQILYBRB[Hyp](配列番号54)
RBRRBRFQILYBR[Hyp]R(配列番号55)
RRBRRBRFQILYBRBR(配列番号56)
BRRBRRFQILYBRBR(配列番号57)
RBRRBRWWWBRBR(配列番号58)
RBRRBRWWPWWBRBR(配列番号59)
RBRRBRWPWWBRBR(配列番号60)
RBRRBRWWPWBRBR(配列番号61)
RBRRBRRWWWRBRBR(配列番号62)
RBRRBRRWWPWWRBRBR(配列番号63)
RBRRBRRWPWWRBRBR(配列番号64)
RBRRBRRWWPWRBRBR(配列番号65)
RBRRBRRFQILYBRBR(配列番号66)
RBRRBRRFQILYRBR(配列番号67)
BRBRBWWPWWRBRRBR(配列番号68)
RBRRBRRFQILYBHBH(配列番号69)
RBRRBRRFQIYRBHBH(配列番号70)
RBRRBRFQILYBRBH(配列番号71)
RBRRBRFQILYR[Hyp]H[Hyp]H(配列番号72)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYRBHBH(配列番号73)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYR[Hyp]H[Hyp]H(配列番号74)
RBRRBRWWWRBHBH(配列番号75)
RBRRBRWWPRBHBH(配列番号76)
RBRRBRPWWRBHBH(配列番号77)
RBRRBRWWPWWRBHBH(配列番号78)
RBRRBRWWPWRBHBH(配列番号79)
RBRRBRWPWWRBHBH(配列番号80)
RBRRBRRWWWRBHBH(配列番号81)
RBRRBRRWWPWWRBHBH(配列番号82)
RBRRBRRWPWWRBHBH(配列番号83)
RBRRBRRWWPWRBHBH(配列番号84)
RRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号85)
BRRBRRFQILYRBHBH(配列番号86)
RRBRRBRFQILYBHBH(配列番号87)
BRRBRRFQILYBHBH(配列番号88)
RBRRBHRFQILYRBHBH(配列番号89)
RBRRBRFQILY[Hyp]R[Hyp]R(配列番号101)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYBRBR(配列番号102)
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILY[Hyp]R[Hyp]R(配列番号103)
RBRRBRWWWBRBR(配列番号104)
RBRRBRWWPWWBRBR(配列番号105)
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列のうちの1つから選択することができる:
RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)
RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)
RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)
RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)
RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)
RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)
RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)
RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)
RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)
RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)
RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)
RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)
RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)
RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる:RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる:RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の配列からなる:RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)。
複合体
いくつかの実施形態では、複合体は、以下の配列のうちの1つから選択されるペプチドを含む:RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)およびRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)。いくつかの実施形態では、複合体は、配列番号27~52、配列番号53~89、配列番号101~105、並びに配列番号27,31,32,35,37,38,および44のいずれかから選択されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、表1,表2,または表3に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、複合体は、以下の配列のうちの1つから選択されるペプチドを含む:RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)およびRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)。いくつかの実施形態では、複合体は、配列番号27~52、配列番号53~89、配列番号101~105、並びに配列番号27,31,32,35,37,38,および44のいずれかから選択されたペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、表1,表2,または表3に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、いずれの場合においても、ペプチドは、上記で記載したN末端修飾をさらに含み得る。
適切なリンカーには、例えば、ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール-マレイミド結合を形成することができるC末端システイン残基、ペプチド上の塩基性アミノ酸とオキシム、クリック反応もしくはモルフォリノ結合形成を形成するためのC末端アルデヒド、またはアミノ基に共有的に複合体化してカルボキサミド結合を形成するペプチド上のカルボン酸部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、1アミノ酸から5アミノ酸の間の長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、当技術分野で公知の任意のリンカーを含み得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、以下の配列:G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BXおよびXBのいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、ここで、Xは、6-アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリマー、例えばPEGなどであり得る。
いくつかの実施形態では、リンカーはベータアラニンである。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カルボキサミド結合を介してオリゴヌクレオチドに複合体化されている。
複合体のリンカーは、ペプチドが結合されるオリゴヌクレオチドの一部を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドの結合は、ペプチドのC末端に直接結合され得る。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、リンカーは必要ではない。
あるいは、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに化学的に複合体化され得る。化学結合は、例えば、ジスルフィド、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、アミド、カルボキサミド、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジン、オキシム、ホスフェート、ホスホルアミデート、チオホスフェート、ボラノホスフェート、イミノホスフェート、またはチオール-マレイミドの結合を介し得る。
必要に応じて、システインをオリゴヌクレオチドのN末端に付加してペプチドへのジスルフィド結合の形成させることができるか、またはN末端をブロモアセチル化させてペプチドへのチオエーテルコンジュゲーションを行うことができる。
本発明のペプチドは、複合体を提供するために、同様に、イメージング分子に共有結合させることができる。
いくつかの実施形態では、イメージング分子は、複合体の可視化を可能にする任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、イメージング分子は、複合体の位置を示すことができる。いくつかの実施形態では、生体外または生体内での複合体の位置である。いくつかの実施形態では、複合体を被験体に投与することと、被験体をイメージングして複合体の位置を確認することとを含む、イメージング分子を含む複合体の位置をモニターする方法が提供される。
イメージング分子の例には、検出分子、コントラスト分子、または増強分子が含まれる。適切なイメージング分子は、放射性核種;フルオロフォア;ナノ粒子(例えばナノシェル);ナノケージ;発色剤(例えば酵素)、放射性同位元素、色素、放射線不透性物質、蛍光性化合物、およびその組合せから選択され得る。
いくつかの実施形態では、イメージング分子は、イメージング技術を使用して可視化することができ、これらは細胞イメージング技術または医療用イメージング技術であってもよい。適切な細胞イメージング技術には、例えば、画像サイトメトリー、蛍光顕微鏡法、位相差顕微鏡法、SEM、TEMが含まれる。適切な医療用イメージング技術には、例えば、X線、透視検査、MRI、シンチグラフィー、SPECT、PET、CT、CAT、FNRIが含まれる。
ある場合には、イメージング分子は、診断用分子と見なされ得る。いくつかの実施形態では、診断用分子は、複合体を使用して疾患の診断を可能にする。いくつかの実施形態では、疾患の診断は、イメージング分子を使用して、複合体の位置を決定することにより達成することができる。いくつかの実施形態では、イメージング分子を含む複合体の有効量を被験体に投与することと、複合体の位置をモニターすることとを含む、疾患の診断方法が提供される。
いくつかの実施形態では、イメージング分子を含む複合体の結合などのさらなる詳細は、オリゴヌクレオチドを含む複合体に関して上記で説明したものと同じである。
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、複合体を提供するために、オリゴヌクレオチドおよびイメージング分子に共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、複合体は、細胞および組織に、例えば、細胞の核に透過することが可能である。例えば、筋組織に透過することが可能である。
リンカー
本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載のペプチドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結するリンカーを含み得る。本発明に有用なリンカーは、WO2020/115494に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載のペプチドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結するリンカーを含み得る。本発明に有用なリンカーは、WO2020/115494に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
リンカーは、下記式(I)による構造を有する:
T1-(CR1R2)n-T2 (I)
{ここで、
T1は、ペプチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
T2は、オリゴヌクレオチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
nは、1、2又は3であり;
各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれ、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、もしくは-N(RA3)SO2-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素および(1-4C)アルキルからなる群から選択される)から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
各R2は、独立して、式:
-Y2-X2-Z2
[ここで、
Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれる整数であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X2は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり(ここで、各RB3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z2は、水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RB4及びRB5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルから選ばれる)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
ただし、
n=1で、T1及びT2が相互に異なる場合、R1及びR2は、両方がHとなることはなく;
n=1で、T1及びT2が相互に異なり、R1及びR2の一方がHである場合、R1及びR2の他方はメチルではなく;
n=2で、各R1及びR2がHである場合、T1及びT2はともに-C(O)-であるか、又はともに-NH-である}。
T1-(CR1R2)n-T2 (I)
{ここで、
T1は、ペプチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
T2は、オリゴヌクレオチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
nは、1、2又は3であり;
各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれ、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、もしくは-N(RA3)SO2-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素および(1-4C)アルキルからなる群から選択される)から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
各R2は、独立して、式:
-Y2-X2-Z2
[ここで、
Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれる整数であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X2は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり(ここで、各RB3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z2は、水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RB4及びRB5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルから選ばれる)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
ただし、
n=1で、T1及びT2が相互に異なる場合、R1及びR2は、両方がHとなることはなく;
n=1で、T1及びT2が相互に異なり、R1及びR2の一方がHである場合、R1及びR2の他方はメチルではなく;
n=2で、各R1及びR2がHである場合、T1及びT2はともに-C(O)-であるか、又はともに-NH-である}。
医薬組成物
本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩は、医薬組成物に製剤化することができる。
本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩は、医薬組成物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含み得る。
適切な薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび担体は、当技術分野において周知である。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されている疾患、障害、および状態を医療上の使用の下で緩和、媒介、予防、および処置するために、追加の公知の治療剤、薬物、化合物のプロドラッグへの修飾などをさらに含むことができると理解されたい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬として使用するためのものである。例えば、複合体について本明細書に記載されているのと同じ方法で医薬として使用するためのものである。複合体を使用する医療処置に関して本明細書に記載されている全ての特徴は、本医薬組成物に適用される。
したがって、本発明のさらなる態様では、医薬として使用するための第4の態様に記載の医薬組成物が提供される。さらなる態様では、ここで開示される医薬組成物の有効量を被験体に投与することを含む、疾患状態について被験体を処置する方法が提供される。
医療上の使用
本発明のペプチドを含む複合体は、疾患を処置するための医薬として使用することができる。
本発明のペプチドを含む複合体は、疾患を処置するための医薬として使用することができる。
医薬は、上記で定義した医薬組成物の剤形であり得る。
疾患状態の処置を必要とする患者または被験体を処置する方法であって、治療有効量の複合体を患者または被験体に投与するステップを含む方法も提供される。いくつかの実施形態では、医療処置は、細胞への、例えば、細胞の核へのオリゴヌクレオチドの送達を必要とする。
処置しようとする疾患には、オリゴヌクレオチドによる細胞および/または核膜の透過の改善が治療効果の改善をもたらし得る任意の疾患が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、複合体は、筋神経系の疾患の処置で使用するためのものである。
本発明のペプチドを含む複合体は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)又はブッチャー筋ジストロフィー(BMD)の治療に適している。
いくつかの実施形態では、複合体は、スプライシング欠損によって引き起こされる疾患の処置で使用するためのものである。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、スプライシング欠陥を予防もしくは修正することが可能であり、および/または正しくスプライシングされたmRNA分子の産生を増加させることが可能なオリゴヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態では、複合体は、DMDの処置に使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、DMDの処置において使用するための第2の態様に記載の複合体が提供される。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。いくつかの実施形態では、そのような実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、機能性ジストロフィンタンパク質の発現を増加させるように作動可能である。
いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィン発現を10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%増加させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンの発現を最大50%増加させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の発現を10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%回復させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の発現を最大50%回復させる。
いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の機能を10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%回復させる。いくつかの実施形態では、複合体は、ジストロフィンタンパク質の機能を最大50%回復させる。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン転写中に1つまたは複数のエクソンのスキッピングを引き起こすことによってそうするように作動可能である。
いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子の1つまたは複数のエクソンの10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%のスキッピングを引き起こす。いくつかの実施形態では、複合体のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子の1つまたは複数のエクソンの最大50%のスキッピングを引き起こす。
いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、任意の動物またはヒトであり得る。いくつかの実施形態では、患者または被験体は、非ヒト哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、患者または被験体は、男性または女性であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は男性である。
いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態では、処置しようとする患者または被験体は、0から40歳、例えば0から30歳、例えば0から25歳、例えば0から20歳の間の年齢である。
いくつかの実施形態では、複合体は、例えば、髄内、髄腔内、脳室内、硝子体内、経腸、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、口腔内、鼻腔内の経路によって被験体に全身投与される。
いくつかの実施形態では、複合体は、被験体に静脈内投与するためのものである。
いくつかの実施形態では、複合体は、被験体に注射により静脈内投与するためのものである。
いくつかの実施形態では、複合体は、「治療有効量」で被験体に投与するためのものであり、それによって、その量が個体に利益性を示すのに十分であることが意味される。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置しようとする疾患の性質および重症度に依存する。用量についての決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。技術およびプロトコールの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、pub.Lippincott,Williams&Wilkinsで確認することができる。例示的な用量は、0.01mg/kgと50mg/kgの間、0.05mg/kgと40mg/kgの間、0.1mg/kgと30mg/kgの間、0.5mg/kgと18mg/kgの間、1mg/kgと16mg/kgの間、2mg/kgと15mg/kgの間、5mg/kgと10mg/kgの間、10mg/kgと20mg/kgの間、12mg/kgと18mg/kgの間、13mg/kgと17mg/kgの間であり得る。
有利なことには、本発明の複合体の用量は、例えば、オリゴヌクレオチド単独からのいずれかの効果を見るために必要とされる用量よりも低いオーダーまたは程度でよい。
いくつかの実施形態では、本発明の複合体を投与した後、毒性の1つまたは複数のマーカーは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較して有意に減少する。
毒性の適切なマーカーは、腎毒性のマーカーであり得る。
毒性の適切なマーカーとしては、KIM-1、NGAL、BUN、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態では、KIM-1、NGAL、およびBUNのうちの少なくとも1個のレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後に減少する。
いくつかの実施形態では、KIM-1、NGAL、およびBUNのそれぞれのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後に減少する。
いくつかの実施形態では、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、有意に減少する。
いくつかの実施形態では、前記のマーカーまたはそれぞれのマーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較した場合、本発明の複合体を投与した後、最大5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%減少する。
有利なことには、ペプチドと、それによって得られる複合体の毒性は、以前の細胞透過性ペプチドおよび複合体と比較して有意に減少する。特に、KIM-1およびNGAL-1は毒性のマーカーであり、これらは、現在利用可能なペプチド担体を使用する以前の複合体と比較して最大120倍有意に減少する。
ペプチド調製
本発明のペプチドは、任意の標準のタンパク質合成方法、例えば、化学合成、半化学合成によって、または発現系の使用を介して、生成することができる。
本発明のペプチドは、任意の標準のタンパク質合成方法、例えば、化学合成、半化学合成によって、または発現系の使用を介して、生成することができる。
したがって、本発明はまた、ペプチドをコードするDNAを含むかまたはそれからなるヌクレオチド配列、発現系、例えば、発現および発現の制御に必要な配列と一緒に前記配列を含むベクター、ならびに前記発現系によって形質転換された宿主細胞および宿主生物に関する。
したがって、本発明に記載のペプチドをコードする核酸もまた提供される。
いくつかの実施形態では、核酸は、単離または精製された形態で提供することができる。
本発明に記載のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターもまた提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。
いくつかの実施形態では、ベクターは、制御配列、例えば、本発明に記載のペプチドをコードする核酸に作動可能に結合したプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、適切な細胞、例えば哺乳動物、細菌または真菌の細胞にトランスフェクトされた場合にペプチドを発現することが可能である。
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
発現ベクターは、本発明の核酸が挿入され得る宿主細胞に応じて選択することができる。宿主細胞のそのような形質転換は、従来の技術、例えばSambrookら[Sambrook,J.、Russell,D.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,USA]で教示されているものを含む。適切なベクターの選択は、本技術分野の当業者の技術範囲内である。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、およびウイルスが含まれる。
生成されたペプチドは、任意の適切な方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィー分離、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、宿主細胞から単離および精製することができる。
適切なベクター、宿主および組換え技術は、当技術分野において周知である。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
[実施例]
実施例1
1.材料および方法
1.1 P-PMO合成および調製
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、およびFmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19または0.46mmol・g-1)は、Merck(Hohenbrunn,Germany)から入手した。HPLCグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)は、Fisher Scientific(Loughborough,UK)から購入した。ペプチド合成グレードのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)およびジエチルエーテルは、VWR(Leicestershire,UK)から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸(TFA)は、Alfa Aesar(Heysham,England)から入手した。PMOは、Gene Tools Inc.(Philomath,USA)から購入した。ニワトリ胚抽出物およびウマ血清は、Sera Laboratories International Ltd(West Sussex,UK)から入手した。インターフェロンは、Roche Applied Science(Penzberg,Germany)から入手した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から入手した。MALDI-TOF質量分析は、Voyager DE Pro BioSpectrometryワークステーションを使用して行った。水中50%アセトニトリル中の10mg・mL-1のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±0.1%である。
実施例1
1.材料および方法
1.1 P-PMO合成および調製
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、およびFmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19または0.46mmol・g-1)は、Merck(Hohenbrunn,Germany)から入手した。HPLCグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)は、Fisher Scientific(Loughborough,UK)から購入した。ペプチド合成グレードのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)およびジエチルエーテルは、VWR(Leicestershire,UK)から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸(TFA)は、Alfa Aesar(Heysham,England)から入手した。PMOは、Gene Tools Inc.(Philomath,USA)から購入した。ニワトリ胚抽出物およびウマ血清は、Sera Laboratories International Ltd(West Sussex,UK)から入手した。インターフェロンは、Roche Applied Science(Penzberg,Germany)から入手した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から入手した。MALDI-TOF質量分析は、Voyager DE Pro BioSpectrometryワークステーションを使用して行った。水中50%アセトニトリル中の10mg・mL-1のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±0.1%である。
1.2 H2k mdx細胞におけるスクリーニングのためのP-PMOペプチドの合成
a)ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Fmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19もしくは0.46mmol・g-1,Merck Millipore)を使用して、標準的なFmoc化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して10pmolスケールで調製するか、またはCEM Liberty Blue(商標)Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)を使用して100pmolスケールで調製した。Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して合成する場合、PyBOP/NMMカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。CEM Liberty Blue Peptide Synthesizerを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%:3~10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル(合成規模に依存して15~40mL)の添加および3200rpmで5分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×15mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た。
表4:N末端アセチル化およびC末端ベータ-アラニンリンカーを有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Pip9b2およびR6Glyは、比較ペプチドである。R6Glyは、C末端グリシンをリンカーとして使用する。
a)ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Fmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19もしくは0.46mmol・g-1,Merck Millipore)を使用して、標準的なFmoc化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して10pmolスケールで調製するか、またはCEM Liberty Blue(商標)Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)を使用して100pmolスケールで調製した。Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して合成する場合、PyBOP/NMMカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。CEM Liberty Blue Peptide Synthesizerを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%:3~10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル(合成規模に依存して15~40mL)の添加および3200rpmで5分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×15mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た。
表4:N末端アセチル化およびC末端ベータ-アラニンリンカーを有する、実施例で試験するために合成したペプチド。Pip9b2およびR6Glyは、比較ペプチドである。R6Glyは、C末端グリシンをリンカーとして使用する。
b)PMO-ペプチド複合体のライブラリーの合成
マウスジストロフィン第23番エクソンの25量体PMOアンチセンス配列(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90))を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して2.3当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.3および2当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのC末端カルボキシル基の活性化のために2.3当量のHBTUをPyBOPの代わりに使用した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,80mL)中のペプチド(2500nmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの19.2mL)、(16.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(1.0pL)、およびPMO(DMSO中10mMの100mL)を添加した。混合物を2.5時間、40℃で放置し、H2O(300mL)中の0.1%TFAの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Gilson HPLCシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM、pH7.0)中の塩化ナトリウム(0~1M)の線形勾配を使用して4mL・分-1の流速でイオン交換カラム(Resource S 4mL,GE Healthcare)を用いてPMO-ペプチド複合体を精製した。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチド-PMO誘導体を白色固体として得た。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。(収率については表5を参照されたい)。
表5:細胞培養分析のためのP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製ppmoの乾燥重量に基づく。P-PMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。(a)P-PMOは、PyBOPの代わりにHBTU活性化を使用して合成した。
マウスジストロフィン第23番エクソンの25量体PMOアンチセンス配列(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90))を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して2.3当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.3および2当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのC末端カルボキシル基の活性化のために2.3当量のHBTUをPyBOPの代わりに使用した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,80mL)中のペプチド(2500nmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの19.2mL)、(16.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(1.0pL)、およびPMO(DMSO中10mMの100mL)を添加した。混合物を2.5時間、40℃で放置し、H2O(300mL)中の0.1%TFAの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Gilson HPLCシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM、pH7.0)中の塩化ナトリウム(0~1M)の線形勾配を使用して4mL・分-1の流速でイオン交換カラム(Resource S 4mL,GE Healthcare)を用いてPMO-ペプチド複合体を精製した。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチド-PMO誘導体を白色固体として得た。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。(収率については表5を参照されたい)。
表5:細胞培養分析のためのP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製ppmoの乾燥重量に基づく。P-PMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。(a)P-PMOは、PyBOPの代わりにHBTU活性化を使用して合成した。
1.3 細胞培養
マウスH2k mdx筋芽細胞を、ゼラチン(0.01%)被覆フラスコ内で20%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS Gold,PAA laboratories)と、2%ニワトリ胚抽出物(Seralab)と、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン抗生物質混合物(PSN,Gibco)と、3pg/pLのg-インターフェロン(Roche)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM PPA laboratories)において10%CO2下、33℃で培養した。細胞をゼラチン(0.01%)被覆24ウェルプレートに2×105細胞/mLの密度で播種し、2日間、33℃、10%CO2で放置した。筋管への分化後、5%ウマ血清(Sigma)と1%PSNとを補充したDMEMにおいて37℃で、5%CO2下、2日間細胞をさらに増殖させた。
マウスH2k mdx筋芽細胞を、ゼラチン(0.01%)被覆フラスコ内で20%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS Gold,PAA laboratories)と、2%ニワトリ胚抽出物(Seralab)と、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン抗生物質混合物(PSN,Gibco)と、3pg/pLのg-インターフェロン(Roche)とを補充したダルベッコ変性イーグル培地(DMEM PPA laboratories)において10%CO2下、33℃で培養した。細胞をゼラチン(0.01%)被覆24ウェルプレートに2×105細胞/mLの密度で播種し、2日間、33℃、10%CO2で放置した。筋管への分化後、5%ウマ血清(Sigma)と1%PSNとを補充したDMEMにおいて37℃で、5%CO2下、2日間細胞をさらに増殖させた。
1.4 細胞トランスフェクション
無血清Opti-MEM中で作製した、上記の通り調製したペプチド-PMO複合体とともに、細胞をインキュベートし、350mLをそれぞれのウェルに二重反復で添加し、37℃で4時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を、5%ウマ血清と1%PSNとを補充したDMEMで置換し、細胞をさらに20時間、37℃でインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、0.5mLのTRI RNA(Sigma)単離試薬をそれぞれのウェルに添加した。細胞を-80℃で1時間、凍結させた。
無血清Opti-MEM中で作製した、上記の通り調製したペプチド-PMO複合体とともに、細胞をインキュベートし、350mLをそれぞれのウェルに二重反復で添加し、37℃で4時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を、5%ウマ血清と1%PSNとを補充したDMEMで置換し、細胞をさらに20時間、37℃でインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、0.5mLのTRI RNA(Sigma)単離試薬をそれぞれのウェルに添加した。細胞を-80℃で1時間、凍結させた。
1.5 RNA抽出およびネステッドRT-PCR分析
全細胞RNAを、TRI試薬を使用して抽出し、エタノールでの追加のさらなる沈殿を行った。精製されたRNAを、Nanodrop(登録商標)ND-1000(Thermo Scientific)を使用して定量した。OneStep RT-PCR Kit(Roche,Indianapolis,USA)を使用するRT-PCRの鋳型として、RNA(400ng)を使用した。プライマー配列については、表7を参照されたい。最初の逆転写のサイクル条件は、30分間50℃および7分間94℃を1サイクル、その後、20秒間94℃、40秒間55℃および80秒間68℃を30サイクルであった。1マイクロリットルのRT-PCR産物を第2のPCRステップの鋳型として使用した。0.5UのSuperTAQを使用して、94℃で30秒間、55℃で1分間および72℃で1分間での25サイクルで、増幅を行った。1.5%アガロースゲルを使用して電気泳動により産物を分離した。アガロースゲルの画像をMolecular Imager ChemiDoc(商標)XRS+イメージングシステム(BioRad,UK)で撮影し、Image Lab(V4.1)を使用して画像を解析した。Microsoft Excelを使用してエクソンスキッピングアッセイデータを解析してプロットし、少なくとも3回の独立した実験からの第23番エクソンスキッピングのパーセンテージとして表した。
全細胞RNAを、TRI試薬を使用して抽出し、エタノールでの追加のさらなる沈殿を行った。精製されたRNAを、Nanodrop(登録商標)ND-1000(Thermo Scientific)を使用して定量した。OneStep RT-PCR Kit(Roche,Indianapolis,USA)を使用するRT-PCRの鋳型として、RNA(400ng)を使用した。プライマー配列については、表7を参照されたい。最初の逆転写のサイクル条件は、30分間50℃および7分間94℃を1サイクル、その後、20秒間94℃、40秒間55℃および80秒間68℃を30サイクルであった。1マイクロリットルのRT-PCR産物を第2のPCRステップの鋳型として使用した。0.5UのSuperTAQを使用して、94℃で30秒間、55℃で1分間および72℃で1分間での25サイクルで、増幅を行った。1.5%アガロースゲルを使用して電気泳動により産物を分離した。アガロースゲルの画像をMolecular Imager ChemiDoc(商標)XRS+イメージングシステム(BioRad,UK)で撮影し、Image Lab(V4.1)を使用して画像を解析した。Microsoft Excelを使用してエクソンスキッピングアッセイデータを解析してプロットし、少なくとも3回の独立した実験からの第23番エクソンスキッピングのパーセンテージとして表した。
1.6 H2k mdxマウスにおける試験のためのPMO-ペプチド複合体の合成
a)ペプチド変異体の合成
CEM Liberty Blue(商標)マイクロ波Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)およびFmoc化学を製造業者の推奨手順に従って使用して、ペプチドを100pmol規模で合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、DIPEAの存在下、PyBOP(5倍過剰)を使用して活性化させた5倍過剰のFmoc保護アミノ酸(0.25mmol)を使用してペプチドを合成した。ピペリジン(DMF中20%v/v)を使用して、N-Fmoc保護基を除去した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで1回は3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%,10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。切断されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、3000rpmで5分間、遠心分離した。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×40mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm、Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。
a)ペプチド変異体の合成
CEM Liberty Blue(商標)マイクロ波Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)およびFmoc化学を製造業者の推奨手順に従って使用して、ペプチドを100pmol規模で合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、DIPEAの存在下、PyBOP(5倍過剰)を使用して活性化させた5倍過剰のFmoc保護アミノ酸(0.25mmol)を使用してペプチドを合成した。ピペリジン(DMF中20%v/v)を使用して、N-Fmoc保護基を除去した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで1回は3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%,10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。切断されたペプチドを氷冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、3000rpmで5分間、遠心分離した。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×40mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm、Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。
b)PMO-ペプチド複合体の合成
マウスジストロフィン第23番エクソンの25量体PMOアンチセンス配列(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90))を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して2.3当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.3および2倍当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのC末端カルボキシル基の活性化のためにHBTU(2.3当量)をPyBOPの代わりに使用した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,100mL)中のペプチド(10pmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの76.6mL)、(66.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(4.0mL)、およびPMO(DMSO中10mMの400mL)を添加した。混合物を2時間、40℃で放置し、0.1%TFA(1mL)の添加により反応を停止させた。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM,pH7.0)中の塩化ナトリウム(0~1M)の線形勾配を使用して6mL・分-1の流速でカチオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6mL column、GE Healthcare)を用いて反応物を精製した。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。全収率(表6)は、PMOに基づいて25~36%であった。
表6:生体内での分析のためにより大きい規模で合成したP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製PPMOの乾燥重量に基づく。PPMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。(a)PPMOは、PyBOPの代わりにHBTU活性化を使用して合成した。
マウスジストロフィン第23番エクソンの25量体PMOアンチセンス配列(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90))を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、ペプチドに対して2.3当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.3および2倍当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。少数の例では、ペプチドのC末端カルボキシル基の活性化のためにHBTU(2.3当量)をPyBOPの代わりに使用した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,100mL)中のペプチド(10pmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの76.6mL)、(66.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(4.0mL)、およびPMO(DMSO中10mMの400mL)を添加した。混合物を2時間、40℃で放置し、0.1%TFA(1mL)の添加により反応を停止させた。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM,pH7.0)中の塩化ナトリウム(0~1M)の線形勾配を使用して6mL・分-1の流速でカチオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6mL column、GE Healthcare)を用いて反応物を精製した。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。全収率(表6)は、PMOに基づいて25~36%であった。
表6:生体内での分析のためにより大きい規模で合成したP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製PPMOの乾燥重量に基づく。PPMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。(a)PPMOは、PyBOPの代わりにHBTU活性化を使用して合成した。
1.7 P-PMOによるジストロフィン修復の生体内での評定
実験は、University of OxfordのBiomedical Sciences UnitにおいてHome Office Project Licence authorisationのもとで施設内倫理審査に従って行った。マウスを最小疾患施設で飼育し、環境を12時間の昼夜サイクルで温度制御した。動物は、市販の齧歯動物用固形飼料および水を自由に摂取した。
実験は、University of OxfordのBiomedical Sciences UnitにおいてHome Office Project Licence authorisationのもとで施設内倫理審査に従って行った。マウスを最小疾患施設で飼育し、環境を12時間の昼夜サイクルで温度制御した。動物は、市販の齧歯動物用固形飼料および水を自由に摂取した。
実験は、メス10~12週齢mdxマウスで行った。mdxマウスを拘束した後、10mg/kgのP-PMOの単回尾静脈注射を行った。注射の1週間後、マウスを屠殺し、TA、心臓および横隔膜筋を除去し、ドライアイス冷却イソペンタンで急速凍結させ、-80℃で保管した。
1.8 ウェスタンブロット分析
単回投与後のジストロフィン修復期間を評定するために、筋肉の3分の1(TAおよび横隔膜について)または7pm厚の横断凍結切片(心臓について)を300mlの緩衝剤(50mM Tris pH8,150mM NaCl,1%NP40,0.5%デオキシコール酸ナトリウム,10%SDSおよびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤)に溶解した後、10分間、13000rpmで遠心分離した(Heraeus、#3325B)。上清を回収し、100℃で3分間、加熱した。BCA法によりタンパク質を定量し、40pgタンパク質/試料をNuPage 3~8%Tris酢酸塩ゲルで以前に記載された(19)ように分離した。タンパク質を、孔径0.45pmのPVDF膜に1時間、30Vで、その後、1時間100Vで転写し、モノクローナル抗ジストロフィン(1:200,NCL-DYS1,Novocastra)および抗ビンキュリン(ローディング対照,1:100000,hVIN-1,Sigma)抗体で以前に記載された(37)ようにプローブした。二次抗体IRDye 800CWヤギ抗マウスを1:20000の希釈で使用した(LiCOR)。
単回投与後のジストロフィン修復期間を評定するために、筋肉の3分の1(TAおよび横隔膜について)または7pm厚の横断凍結切片(心臓について)を300mlの緩衝剤(50mM Tris pH8,150mM NaCl,1%NP40,0.5%デオキシコール酸ナトリウム,10%SDSおよびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤)に溶解した後、10分間、13000rpmで遠心分離した(Heraeus、#3325B)。上清を回収し、100℃で3分間、加熱した。BCA法によりタンパク質を定量し、40pgタンパク質/試料をNuPage 3~8%Tris酢酸塩ゲルで以前に記載された(19)ように分離した。タンパク質を、孔径0.45pmのPVDF膜に1時間、30Vで、その後、1時間100Vで転写し、モノクローナル抗ジストロフィン(1:200,NCL-DYS1,Novocastra)および抗ビンキュリン(ローディング対照,1:100000,hVIN-1,Sigma)抗体で以前に記載された(37)ようにプローブした。二次抗体IRDye 800CWヤギ抗マウスを1:20000の希釈で使用した(LiCOR)。
P-PMO処置mdxマウスにおけるジストロフィン修復レベルを、100%と見なしたC57BL/10野生型対照マウスのレベルに対する相対レベルとして表した。このために、P-PMO処置mdx試料と並行して5系列のC57BL/10タンパク質希釈物を含めることにより、標準曲線を作成した。希釈系列は、次の通りであった:レーンごとにローディングした総タンパク質40pgのそれぞれ75%、40%、15%、5%または0%は、C57BL/10タンパク質溶解物からのものであり、残部は、未処置mdxタンパク質溶解物からのものであった。これらの標準物質を分取し、処置mdx試料と並行してそれぞれのウェスタンブロットに使用した。全ての標準物質および処置試料について、ジストロフィン強度の定量をFluorescence Odysseyイメージングシステムにより行い、全ての試料におけるビンキュリン蛍光強度に対する比を算出することにより正規化した。標準正規化値をそれらの既知のジストロフィン濃度に対してプロットして最もよく当てはまる数式を得、この式を使用して、P-PMO処置mdxマウスのそれぞれの試料の正規化値を補間した。
1.9 生体内でのDmd第23エクソンスキッピングのRT-qPCR分析
ペプチド-PMOで処理した骨格筋および心臓組織を用いて、マウスDmd転写物からの第23番エクソンのエクスクルージョンの定量を行った。手短に述べると、均質化された組織からTrizolに基づく抽出法を使用してRNAを抽出し、ランダムプライマーを使用してcDNAを合成した。プライマー/プローブは、Integrated DNA Technologiesによって合成され、非スキップ産物を表す第23~24番エクソンにわたる領域を増幅するように設計された(mDMD23-24、表7を参照されたい)または第22番エクソンと第24番エクソンの境界にわたるプローブを使用して第23番エクソンを欠いている転写物を特異的に増幅するように設計された(mDMD22-24)。既知の転写物量を使用して作成した標準曲線に対してそれぞれの転写物レベルを較正し、[スキップ]/[スキップ+非スキップ]によりスキッピングパーセンテージを導出した。
表7:ネステッドRT-PCR法または定量的RT-PCR法による第23番エクソンスキッピングの定量のためのプライマーおよびプローブ配列
ペプチド-PMOで処理した骨格筋および心臓組織を用いて、マウスDmd転写物からの第23番エクソンのエクスクルージョンの定量を行った。手短に述べると、均質化された組織からTrizolに基づく抽出法を使用してRNAを抽出し、ランダムプライマーを使用してcDNAを合成した。プライマー/プローブは、Integrated DNA Technologiesによって合成され、非スキップ産物を表す第23~24番エクソンにわたる領域を増幅するように設計された(mDMD23-24、表7を参照されたい)または第22番エクソンと第24番エクソンの境界にわたるプローブを使用して第23番エクソンを欠いている転写物を特異的に増幅するように設計された(mDMD22-24)。既知の転写物量を使用して作成した標準曲線に対してそれぞれの転写物レベルを較正し、[スキップ]/[スキップ+非スキップ]によりスキッピングパーセンテージを導出した。
表7:ネステッドRT-PCR法または定量的RT-PCR法による第23番エクソンスキッピングの定量のためのプライマーおよびプローブ配列
1.10 ペプチド-PMOの毒物学的評定
8~10週齢のメスC57BL/6マウスに0.9%食塩水中のペプチド-PMOの単一用量30mg/kgを尾静脈へのボーラス静脈内注射により投与した。投与後2日目および7日目に、代謝ケージ(Tecniplast,UK)に20時間収容した後、冷却条件下で尿を非侵襲的に採取した。7日目の剖検時に頸静脈から血清を採取し、前脛骨筋、横隔膜および心臓組織も採取した。
8~10週齢のメスC57BL/6マウスに0.9%食塩水中のペプチド-PMOの単一用量30mg/kgを尾静脈へのボーラス静脈内注射により投与した。投与後2日目および7日目に、代謝ケージ(Tecniplast,UK)に20時間収容した後、冷却条件下で尿を非侵襲的に採取した。7日目の剖検時に頸静脈から血清を採取し、前脛骨筋、横隔膜および心臓組織も採取した。
尾静脈への静脈内注射による0.9%食塩水中のペプチド-PMOの2.5mg/kgから50mg/kgまでにわたる異なる単一投薬量で同じ手順を踏んだ。
標準曲線に当てはまるように尿を適切に希釈した後、ELISAによりKIM-1(腎損傷分子-1)およびNGAL(好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン)の尿中レベルを定量した(KIM-1 R&Dカタログ番号MKM100,NGAL R&Dカタログ番号MLCN20)。MRC Harwell Institute,Mary Lyon Centre,Oxfordshire,UKで定量した尿中クレアチニンレベルに対して値を正規化した。血清血中尿素窒素レベルは、MRC Harwell Institute,Mary Lyon Centre,Oxfordshire,UKで定量した。
全てのレベルをAU680 Clinical Chemistry Analyser,Beckman Coulterで定量した。
エクソンスキッピングの有効性の定量を第23番エクウソンスキップおよび非スキップ転写物の定量的RT-PCRにより判定し、スキップ転写物の全(スキップおよび非スキップ)転写物(配列については表7を参照されたい)に対するパーセンテージとして表した。
2.結果
ここで提供する結果は、細胞内でのエクソンスキッピング活性においてここで生成したペプチド-PMO複合体の明らかな用量応答効果を実証する(図1,2および12)。これらの図は、DPEP1およびDPEP3系の全て、すなわち本発明のペプチドが、治療上の使用の考慮に足る細胞内への十分な細胞透過有効性を有することも強調する。
ここで提供する結果は、細胞内でのエクソンスキッピング活性においてここで生成したペプチド-PMO複合体の明らかな用量応答効果を実証する(図1,2および12)。これらの図は、DPEP1およびDPEP3系の全て、すなわち本発明のペプチドが、治療上の使用の考慮に足る細胞内への十分な細胞透過有効性を有することも強調する。
ここで提供する結果は、疾患の適切なマウスモデルにおける生体内でのペプチド-PMO複合体の活性をさらに強調する(図3~4)。全体的に見て、これらの結果は、このような複合体の活性が、前脛骨筋で最大であり、次に横隔膜、その次に心臓であることを示唆している。これらの図は、本発明のDPEPペプチド複合体が、生体内で良好なエクソンスキッピング活性を有すること、および生体内でジストロフィンタンパク質発現の増加をもたらすことを実証する。さらに、本発明のDPEP複合体は、同じ複合体を使用したとき、両方の点で、「PIP」ペプチドおよびR6Glyなどの以前の細胞透過性ペプチドと比べて勝るとも劣らない。
DPEPペプチド複合体化合物の投与後のKIM-1およびNGAL(これらは腎毒性の指標である)のレベルが、以前の細胞透過性ペプチドとの複合体より有意に低いことも、ここで実証される。DPEP1.9および3.8複合体は、そのようなマーカーの最低レベルを示した(図5,6および11)。血清血中尿素窒素レベル(腎機能障害のもう1つのマーカー)も、Pip9b2との複合体についてのみ上昇し、本発明のDPEPペプチドとの複合体については上昇しなかった(図7)。第2の主要な発見は、投与の7日後、KIM-1およびNGALレベルが全てのDPEPペプチド複合体についてほぼ食塩水レベルに低下することであり、これは、腎臓関連毒性の何らかの逆転および改善もあることを示唆している。このような効果は、以前の細胞透過性ペプチドを使用する複合体では見られなかった。毒性のこの逆転効果は、本発明のDEDPペプチドでは50mg/kgの高用量で与えたときでさえ見られる(図11)。以前の細胞透過性ペプチドは、7日後には毒性の減少を示さず、全体を通して毒性マーカーがはるかに高いままであった。
エクソンスキッピング活性が、DPEPペプチド複合体の全てについて30および50mg/kgのより高用量でTAおよび横隔膜において高いままであり(図10および12)、これは、腎障害マーカーのレベル低下で裏付けられ、毒性マーカーが何倍も低いのでこれらの化合物のより広い治療指数を示唆する。DPEPペプチド複合体の全てが、複合体中の公知R6Glyコンパレーターより高い活性を有し、その上、同様の毒性マーカーレベルを少なくとも維持すること、および複合体中の公知PIPペプチドコンパレーターと同様の活性を有し、その上、はるかに低い毒性マーカーレベルを有することも、注目に値する。一部の場合には、本発明のDPEPペプチド複合体は、公知R6Gly複合体と比較して活性の増加ばかりでなく、毒性マーカーの低減も示す。
したがって、本発明のDPEP1および3ペプチドは、ヒトにおける神経筋障害の処置のための治療用複合体の有効性を改善し、毒性を低下させるために有望な細胞透過性ペプチドを提供する。
3.さらなる実施例
P-PMO合成および調製
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、およびFmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19または0.46mmol・g-1)は、Merck(Hohenbrunn,Germany)から入手した。1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)は、Sigma-Aldrichから入手した。HPLCグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)は、Fisher Scientific(Loughborough,UK)から購入した。ペプチド合成グレードのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)およびジエチルエーテルは、VWR(Leicestershire,UK)から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸(TFA)は、Alfa Aesar(Heysham,England)から入手した。PMOは、Gene Tools Inc.(Philomath,USA)から購入した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から入手した。MALDI-TOF質量分析は、Voyager DE Pro BioSpectrometryワークステーションを使用して行った。水中50%アセトニトリル中の10mg・mL-1のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±0.1%である。
P-PMO合成および調製
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、およびFmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19または0.46mmol・g-1)は、Merck(Hohenbrunn,Germany)から入手した。1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)は、Sigma-Aldrichから入手した。HPLCグレードのアセトニトリル、メタノールおよび合成グレードのN-メチル-2-ピロリドン(NMP)は、Fisher Scientific(Loughborough,UK)から購入した。ペプチド合成グレードのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)およびジエチルエーテルは、VWR(Leicestershire,UK)から入手した。ピペリジンおよびトリフルオロ酢酸(TFA)は、Alfa Aesar(Heysham,England)から入手した。PMOは、Gene Tools Inc.(Philomath,USA)から購入した。全ての他の試薬は、別段の記述がない限り、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)から入手した。MALDI-TOF質量分析は、Voyager DE Pro BioSpectrometryワークステーションを使用して行った。水中50%アセトニトリル中の10mg・mL-1のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸またはシナピン酸の保存液を鋳型として使用した。エラーバーは、±0.1%である。
細胞におけるスクリーニングのためのP-PMOペプチドの合成
a)ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Fmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19もしくは0.46mmol・g-1,Merck Millipore)を使用して、標準的なFmoc化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して10pmolスケールで調製するか、またはCEM Liberty Blue(商標)Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)を使用して100pmolスケールで調製した。Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して合成する場合、PyBOP/NMMカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。CEM Liberty Blue Peptide Synthesizerを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%:3~10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル(合成規模に依存して15~40mL)の添加および3200rpmで5分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×15mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た(収率について表8を参照されたい)。
表8:N末端アセチル化(Ac)、C末端β-アラニンリンカー(B)を有する、実施例で試験するために合成したペプチド。S*は、グルコシル化セリン残基である。DPEP5.7、Pip9b2、およびPip6aは、比較ペプチドである。
a)ペプチド変異体のライブラリーの調製
ペプチドは、Fmoc^-Ala-OHがプレローディングされているWang樹脂(0.19もしくは0.46mmol・g-1,Merck Millipore)を使用して、標準的なFmoc化学を適用し、製造業者の推奨手順に従うことにより、Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して10pmolスケールで調製するか、またはCEM Liberty Blue(商標)Peptide Synthesizer(Buckingham,UK)を使用して100pmolスケールで調製した。Intavis Parallel Peptide Synthesizerを使用して合成する場合、PyBOP/NMMカップリング混合物での二重カップリングステップを使用し、続いて、それぞれのステップ後に無水酢酸のキャッピングを行った。CEM Liberty Blue Peptide Synthesizerを使用する場合、二重カップリングによって行ったアルギニンを除いて、全てのアミノ酸に対して一本鎖カップリングを実行した。カップリングは、それぞれ2回カップリングしたアルギニン残基を除いて、1回、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で行った。それぞれの脱保護反応は、75℃で2回、1回は30秒間、次いで3分間、35ワットのマイクロ波出力で行った。合成が完了したら、樹脂をDMF(3×50mL)で洗浄し、固相結合ペプチドのN末端をDIPEAの存在下、室温で、無水酢酸でアセチル化した。N末端のアセチル化後、ペプチド樹脂をDMF(3×20mL)およびDCM(3×20mL)で洗浄した。トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIPS)(95%:2.5%:2.5%:3~10mL)からなる切断カクテルでの3時間、室温での処理により、ペプチドを固体支持体から切断した。ペプチド放出後、過剰なTFAを窒素でのスパージングにより除去した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル(合成規模に依存して15~40mL)の添加および3200rpmで5分間の遠心分離により沈殿させた。粗ペプチドペレットを、3回、冷ジエチルエーテル(3×15mL)で洗浄し、445-LC Scale-upモジュールと440-LCフラクションコレクターとを取り付けたVarian 940-LC HPLC Systemを使用してRP-HPLCにより精製した。0.1%TFA/H2O中のCH3CNの線形勾配を使用して15mL・分-1の流速でRP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)を用いて半分取HPLCによりペプチドを精製した。検出は、220nmおよび260nmで行った。所望のペプチドを含有する画分を併せ、凍結乾燥させて、ペプチドを白色固体として得た(収率について表8を参照されたい)。
表8:N末端アセチル化(Ac)、C末端β-アラニンリンカー(B)を有する、実施例で試験するために合成したペプチド。S*は、グルコシル化セリン残基である。DPEP5.7、Pip9b2、およびPip6aは、比較ペプチドである。
トリプレットリピート配列に対する21量体 PMOアンチセンス配列
別名[CAG]7として公知のトリプレットリピート配列(CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号192))の21量体PMOアンチセンス配列を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、2.5当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.5および2当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,80pL)中のペプチド(2500nmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの19.2mL)、(16.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(1.0mL)、およびPMO(DMSO中10mMの180pL)を添加した。混合物を2.5時間、40℃で放置し、H2O(300pL)中の0.1%TFAの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Gilson HPLCシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM,pH7.0)の線形勾配を使用してイオン交換カラム(Resource S 4mL,GE Healthcare)を用いてPMO-ペプチド複合体を精製した。塩化ナトリウム溶液(1M)を使用して複合体をカラムから4mL・分-1または6mL・分-1のどちらかの流速で溶出した。所望の化合物を含有する画分を併せ、直ちに脱塩した。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。(収率については表9を参照されたい)。
表9:細胞培養分析および生体内での実験のためのP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製P-PMOの乾燥重量に基づく)。P-PMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。
別名[CAG]7として公知のトリプレットリピート配列(CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号192))の21量体PMOアンチセンス配列を使用した。ペプチドをそのC末端カルボキシル基によってPMOの3’末端に複合体化した。これは、2.5当量のDIPEA、およびDMSOに溶解したPMOに対して2.5倍過剰のペプチドの存在下、NMP中の2.5および2当量のPyBOPおよびHOAtをそれぞれ使用して達成した。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,80pL)中のペプチド(2500nmol)の溶液に、PyBOP(NMP中0.3Mの19.2mL)、(16.7mLの0.3M NMP)中のHOAt、DIPEA(1.0mL)、およびPMO(DMSO中10mMの180pL)を添加した。混合物を2.5時間、40℃で放置し、H2O(300pL)中の0.1%TFAの添加により反応を停止させた。この溶液を、改造Gilson HPLCシステムを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝剤(25mM,pH7.0)の線形勾配を使用してイオン交換カラム(Resource S 4mL,GE Healthcare)を用いてPMO-ペプチド複合体を精製した。塩化ナトリウム溶液(1M)を使用して複合体をカラムから4mL・分-1または6mL・分-1のどちらかの流速で溶出した。所望の化合物を含有する画分を併せ、直ちに脱塩した。ペプチド-PMO複合体からの過剰な塩の除去は、イオン交換後に回収した画分を、Amicon(登録商標)ultra-15 3K遠心式フィルターデバイスを使用して濾過することにより行った。複合体を凍結乾燥させ、MALDI-TOFにより分析した。使用前に、複合体を滅菌水に溶解し、0.22pm酢酸セルロース膜に通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度は、0.1N HCl溶液中の複合体の265nmでのモル吸収により判定した。(収率については表9を参照されたい)。
表9:細胞培養分析および生体内での実験のためのP-PMO複合体の収率(収率は、凍結乾燥させた精製P-PMOの乾燥重量に基づく)。P-PMOの純度は、220nmおよび260nmで順相HPLCにより確認して95%より高い。
ペプチド-PMO複合体合成
前記の通りにペプチドを合成し、PMOに複合体化した。CUG/CTG伸長リピート(5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(配列番号192))を標的とするPMO配列は、Gene Tools LLCから購入した。これを本明細書の他の箇所では[CAG]7PMOと呼ぶ。
前記の通りにペプチドを合成し、PMOに複合体化した。CUG/CTG伸長リピート(5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(配列番号192))を標的とするPMO配列は、Gene Tools LLCから購入した。これを本明細書の他の箇所では[CAG]7PMOと呼ぶ。
細胞培養およびペプチド-PMO処理
健常個体または2600のCTGリピートを有するDM1患者からの不死化筋芽細胞を、20%FBS(Life technologies)と、50pg/mlのゲンタマイシン(Life technologies)と、25pg/mlのフェチュインと、0.5ng/mlのbFGFと、5ng/mlのEGFと、0.2pg/mlのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich)とを補充した、M199:DMEMの混合物(1:4比,Life technologies)からなる増殖培地で培養した。コンフルエントな細胞培養物を、筋芽細胞用の5pg/mlのインスリン(Sigma-Aldrich)を補充したDMEM培地に切替えることにより、筋分化を誘導した。処理のために、WTまたはDM1細胞を4日間、分化させた。次いで、培地を、1、2、5、10、20または40pM濃度のペプチド-PMO複合体を含有する新鮮分化培地と交換した。処理の48時間後に分析のために細胞を回収した。ヒト肝細胞への40μMのまたはヒト筋芽細胞への1、2、5、10、20もしくは40pM濃度のペプチド-PMOのトランスフェクションの2日後に、ヒト肝細胞およびヒト筋芽細胞における細胞生存率を、蛍光ベースアッセイ(Promega)を使用して定量した。
健常個体または2600のCTGリピートを有するDM1患者からの不死化筋芽細胞を、20%FBS(Life technologies)と、50pg/mlのゲンタマイシン(Life technologies)と、25pg/mlのフェチュインと、0.5ng/mlのbFGFと、5ng/mlのEGFと、0.2pg/mlのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich)とを補充した、M199:DMEMの混合物(1:4比,Life technologies)からなる増殖培地で培養した。コンフルエントな細胞培養物を、筋芽細胞用の5pg/mlのインスリン(Sigma-Aldrich)を補充したDMEM培地に切替えることにより、筋分化を誘導した。処理のために、WTまたはDM1細胞を4日間、分化させた。次いで、培地を、1、2、5、10、20または40pM濃度のペプチド-PMO複合体を含有する新鮮分化培地と交換した。処理の48時間後に分析のために細胞を回収した。ヒト肝細胞への40μMのまたはヒト筋芽細胞への1、2、5、10、20もしくは40pM濃度のペプチド-PMOのトランスフェクションの2日後に、ヒト肝細胞およびヒト筋芽細胞における細胞生存率を、蛍光ベースアッセイ(Promega)を使用して定量した。
RNA単離,RT-PCRおよびqPCR分析
マウス組織の場合:RNA抽出前に、FastprepシステムおよびLysing Matrix Dチューブ(MP biomedicals)を使用してTriReagent(Sigma-Aldrich)で筋肉を破壊した。ヒト細胞の場合:RNA抽出前に、細胞をプロテインキナーゼK緩衝剤(500mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.2,1.5mM MgCl2,10mM EDTA,2%SDSおよび0.5mg/mlのプロテインキナーゼK)に45分間、55℃で溶解した。TriReagentを製造業者のプロトコールに従って使用して全RNAを単離した。合計20pLのM-MLV第1鎖合成系(Life Technologies)を製造業者の使用説明書に従って使用して、1マイクログラムのRNAを逆転写した。その後、1マイクロリットルのcDNA調製物を半定量的PCR分析において標準プロトコール(ReddyMix,Thermo Scientific)に従って使用した。それぞれの遺伝子について線形増幅範囲内で25~35サイクルのPCR増幅を行った。PCR産物を1.5~2%アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ImageJソフトウェアで定量した。エクソンインクルージョン率を、アイソフォームシグナルの全強度に対するインクルージョンのパーセンテージとして定量した。プライマーを次の表10に示す。
表10:PCR用のプライマー
マウス組織の場合:RNA抽出前に、FastprepシステムおよびLysing Matrix Dチューブ(MP biomedicals)を使用してTriReagent(Sigma-Aldrich)で筋肉を破壊した。ヒト細胞の場合:RNA抽出前に、細胞をプロテインキナーゼK緩衝剤(500mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.2,1.5mM MgCl2,10mM EDTA,2%SDSおよび0.5mg/mlのプロテインキナーゼK)に45分間、55℃で溶解した。TriReagentを製造業者のプロトコールに従って使用して全RNAを単離した。合計20pLのM-MLV第1鎖合成系(Life Technologies)を製造業者の使用説明書に従って使用して、1マイクログラムのRNAを逆転写した。その後、1マイクロリットルのcDNA調製物を半定量的PCR分析において標準プロトコール(ReddyMix,Thermo Scientific)に従って使用した。それぞれの遺伝子について線形増幅範囲内で25~35サイクルのPCR増幅を行った。PCR産物を1.5~2%アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ImageJソフトウェアで定量した。エクソンインクルージョン率を、アイソフォームシグナルの全強度に対するインクルージョンのパーセンテージとして定量した。プライマーを次の表10に示す。
表10:PCR用のプライマー
毒物学
上のセクション1.10で説明したように毒物学評定を行った。
上のセクション1.10で説明したように毒物学評定を行った。
結果
処置したDM1患者由来の筋肉細胞(筋芽細胞)は、DPEP1または3ペプチド-[CAG]7PMO複合体が特異的に突然変異型CUGexp-DMPK転写物を標的として、スプライシング欠陥および筋ジストロフィーの原因となる、核RNA病巣によるMBNL1スプライシング因子の有害な隔離およびその結果としてのMBNL1機能低下を抑止することを示した。DPEP1/3ペプチド-[CAG]7PMO複合体は、細胞を透過し、高い有効性でスプライシング正常化を誘導する(図13)。いわゆる「ORER1およびDPEP3」ペプチドのこれらの新規生成は、CAG7リピートアンチセンスオリゴヌクレオチドPMOと複合体したとき生体外でスプライシング欠陥を修正する高い有効性を示した。これは、DM1の処置のための治療に使用できる可能性があることを示す。
処置したDM1患者由来の筋肉細胞(筋芽細胞)は、DPEP1または3ペプチド-[CAG]7PMO複合体が特異的に突然変異型CUGexp-DMPK転写物を標的として、スプライシング欠陥および筋ジストロフィーの原因となる、核RNA病巣によるMBNL1スプライシング因子の有害な隔離およびその結果としてのMBNL1機能低下を抑止することを示した。DPEP1/3ペプチド-[CAG]7PMO複合体は、細胞を透過し、高い有効性でスプライシング正常化を誘導する(図13)。いわゆる「ORER1およびDPEP3」ペプチドのこれらの新規生成は、CAG7リピートアンチセンスオリゴヌクレオチドPMOと複合体したとき生体外でスプライシング欠陥を修正する高い有効性を示した。これは、DM1の処置のための治療に使用できる可能性があることを示す。
さらに、DPEP1/3を用いて形成した複合体の予備的な毒物学的評価は、ALP、ALT、AST、KIM-1、BUN、NGALおよびクレアチニンレベルが、Pip系からの現在利用可能なペプチド担体により典型的に誘導される増加倍数とは対照的に、食塩水対照注射と同様であったことを示す。この予備的データにより、本発明者らは、DPEPペプチドと[CAG]7PMOから形成した複合体が、Pip6aなどの以前のペプチドを用いて形成された複合体と同様に活性であるが、毒性が低いため、より広い治療域を有することを明らかにした(図15~19)。
実施例2
1.材料および方法
1.1 材料
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、Rinkアミド樹脂(0.46mモルg-1)、及びFmoc-β-Ala-OH前負荷Wang樹脂(0.19又は0.46mモルg-1)を、Merck Millipore(ホーエンブルン,独国)から得た。Tentagel Hydroxy-trityl樹脂をRapp ポリマーe(チュービンゲン,独国)から購入した。HPLC等級アセトニトリル、メタノール、及び合成等級のN-メチル-2-ピロリドン(NMP)を、Fisher Scientific(ラフバラー,英国)から得た。ペプチド合成等級N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)及びジエチルエーテルをVWR(レスターシャ―,英国)から得た。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸(TFA)をAlfa Aesar(ヘイシャム,イングランド)から得た。PMOをGene Tools Inc.(フィロマス,米国)から購入した。Voyager DE Pro BioSpectrometry(Applied Biosystems,チィエシャー、英国)ワークステーションを使用して、MALDI-TOF質量分析を行った。マトリックスとして、50%アセトニトリル水溶液中のα-シアノ-4-ヒドロキシ経皮酸又はシナピン酸の0mgml-1のストック溶液を使用した。Varian 940-LC HPLC System(ヤーントン,英国)にて、分析及びセミ分取HPLCを行った。DMEM培地(31966047)、ウシ胎児血清(FBS)(10270106)、抗生物質-抗真菌剤混合溶液(A5955)、臭化エチジウム(15585011)、2x ReddyMix PCR Master Mix(AB0575DCLDB)、M-MLVファーストストランド合成システム(28025013)、及びTRIzol試薬(15596026)を、ThermoFisher Scientificから購入した。RealTime-Glo(商標名)MT Cell Viability Assay(G9711),Maxwell(登録商標)16 Total RNA Purification Kit(AS1050)をPromegaから購入した。筋芽細胞を、PromoCell’s骨格筋細胞成長培地キット(C-23160)にて培養した。インスリン(91077C)、及びアガロース(A9539)をSigma-Aldrichから得た。DNA Marker -HyperLadder 50bp(BIO-33039)をBioLine Reagentsから得た。全てのプライマーを、IDTを通して注文した。尿収集のため、マウスを、単独で、Tecniplast(英国)からの代謝ケージに収容し、腎臓損傷マーカー-1(KIM-1)用の尿バイオマーカーELISA(MKM100)をR&Dから得た。他の表示しない限り、他の全ての試薬をSigma-Aldrich(英国)から得た。
1.材料および方法
1.1 材料
9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)、Rinkアミド樹脂(0.46mモルg-1)、及びFmoc-β-Ala-OH前負荷Wang樹脂(0.19又は0.46mモルg-1)を、Merck Millipore(ホーエンブルン,独国)から得た。Tentagel Hydroxy-trityl樹脂をRapp ポリマーe(チュービンゲン,独国)から購入した。HPLC等級アセトニトリル、メタノール、及び合成等級のN-メチル-2-ピロリドン(NMP)を、Fisher Scientific(ラフバラー,英国)から得た。ペプチド合成等級N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)及びジエチルエーテルをVWR(レスターシャ―,英国)から得た。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸(TFA)をAlfa Aesar(ヘイシャム,イングランド)から得た。PMOをGene Tools Inc.(フィロマス,米国)から購入した。Voyager DE Pro BioSpectrometry(Applied Biosystems,チィエシャー、英国)ワークステーションを使用して、MALDI-TOF質量分析を行った。マトリックスとして、50%アセトニトリル水溶液中のα-シアノ-4-ヒドロキシ経皮酸又はシナピン酸の0mgml-1のストック溶液を使用した。Varian 940-LC HPLC System(ヤーントン,英国)にて、分析及びセミ分取HPLCを行った。DMEM培地(31966047)、ウシ胎児血清(FBS)(10270106)、抗生物質-抗真菌剤混合溶液(A5955)、臭化エチジウム(15585011)、2x ReddyMix PCR Master Mix(AB0575DCLDB)、M-MLVファーストストランド合成システム(28025013)、及びTRIzol試薬(15596026)を、ThermoFisher Scientificから購入した。RealTime-Glo(商標名)MT Cell Viability Assay(G9711),Maxwell(登録商標)16 Total RNA Purification Kit(AS1050)をPromegaから購入した。筋芽細胞を、PromoCell’s骨格筋細胞成長培地キット(C-23160)にて培養した。インスリン(91077C)、及びアガロース(A9539)をSigma-Aldrichから得た。DNA Marker -HyperLadder 50bp(BIO-33039)をBioLine Reagentsから得た。全てのプライマーを、IDTを通して注文した。尿収集のため、マウスを、単独で、Tecniplast(英国)からの代謝ケージに収容し、腎臓損傷マーカー-1(KIM-1)用の尿バイオマーカーELISA(MKM100)をR&Dから得た。他の表示しない限り、他の全ての試薬をSigma-Aldrich(英国)から得た。
1.2 ペプチド-PMO複合体の合成
1.2.1 Microwave Synthesiserを介するペプチドバリアントの合成
CEM Liberty Blue(商標名)マイクロウエーブPeptide Synthesizer(Buckingham,英国)及び製造者の推薦に従うFmoc化学を使用して、100pモルスケールでペプチドを合成した。リンカーとしてグルタミン酸又はコハク酸を有するペプチドを、TFA開裂後、ペプチドのカルボキシル末端でアミドを産生するため、Rinkアミド樹脂にて合成した。前負荷Wangを使用して、β-アラニンリンカーを有するペプチドを合成した。合成方法及びリンカーとともに、合成されたペプチドの全リストを表11に示す。使用した側鎖保護基はTFA処理には不安定であり、DIPEAの存在下、PyBOP(5倍過剰量)を使用して活性化したFmoc-保護アミノ酸の5倍過剰量(0.25mモル)を使用して、ペプチドを合成した。N-Fmoc-保護基を除去するため、ピペリジン(20%v/v DMF溶液)を使用した。アルギニン残基を除き、マイクロ波電力60Wにおいて、75℃、5分間で1回カップリングを行い、アルギニン残基については2回ずつカップリングした。各脱保護反応を、マイクロ波電力35Wにおいて、75℃で2回(30秒間で1回、ついで、3分間で1回)を行った。合成が完了した後、DMF(3×50ml)にて樹脂を洗浄し、DIPEAの存在下、室温において、15分間で、無水酢酸にて、固相に結合したペプチドのN-末端をアセチル化した。N-末端のアセチル化後、DMF(3×20ml)及びDCM(3×20ml)にて、ペプチド樹脂を洗浄した。N-末端にコハク酸を有するDPEPペプチドについては、N-末端のアセチル化を行わなかった。代わりに、ペプチドの遊離N-末端を、DIPEAの存在下、室温において、30分間で無水コハク酸にて処理し、続いて、DMF(3×20ml)にて洗浄した。N-末端にリンカーとしてグルタミン酸を有するDPEPペプチドについては、上述のようにN-末端をアセチル化したが、PMOの結合を、側鎖カルボキシル基において行った。
1.2.1 Microwave Synthesiserを介するペプチドバリアントの合成
CEM Liberty Blue(商標名)マイクロウエーブPeptide Synthesizer(Buckingham,英国)及び製造者の推薦に従うFmoc化学を使用して、100pモルスケールでペプチドを合成した。リンカーとしてグルタミン酸又はコハク酸を有するペプチドを、TFA開裂後、ペプチドのカルボキシル末端でアミドを産生するため、Rinkアミド樹脂にて合成した。前負荷Wangを使用して、β-アラニンリンカーを有するペプチドを合成した。合成方法及びリンカーとともに、合成されたペプチドの全リストを表11に示す。使用した側鎖保護基はTFA処理には不安定であり、DIPEAの存在下、PyBOP(5倍過剰量)を使用して活性化したFmoc-保護アミノ酸の5倍過剰量(0.25mモル)を使用して、ペプチドを合成した。N-Fmoc-保護基を除去するため、ピペリジン(20%v/v DMF溶液)を使用した。アルギニン残基を除き、マイクロ波電力60Wにおいて、75℃、5分間で1回カップリングを行い、アルギニン残基については2回ずつカップリングした。各脱保護反応を、マイクロ波電力35Wにおいて、75℃で2回(30秒間で1回、ついで、3分間で1回)を行った。合成が完了した後、DMF(3×50ml)にて樹脂を洗浄し、DIPEAの存在下、室温において、15分間で、無水酢酸にて、固相に結合したペプチドのN-末端をアセチル化した。N-末端のアセチル化後、DMF(3×20ml)及びDCM(3×20ml)にて、ペプチド樹脂を洗浄した。N-末端にコハク酸を有するDPEPペプチドについては、N-末端のアセチル化を行わなかった。代わりに、ペプチドの遊離N-末端を、DIPEAの存在下、室温において、30分間で無水コハク酸にて処理し、続いて、DMF(3×20ml)にて洗浄した。N-末端にリンカーとしてグルタミン酸を有するDPEPペプチドについては、上述のようにN-末端をアセチル化したが、PMOの結合を、側鎖カルボキシル基において行った。
1.2.2 Intavis Multipep Synthesiserを介するペプチドバリアントの合成
Intavis Multipep Synthesiser及び製造者の推薦に従うFmoc化学を使用して、室温において、Tentagel(登録商標)Cl-トリチル樹脂上で、γ-アミノ酪酸リンカーを有するペプチドを合成した。製造者の推薦通りに塩化アセチルを使用して、Tentagel(登録商標)ヒドロキシ-トリチル樹脂からTentagel(登録商標)Cl-トリチル樹脂を調製した。簡潔には、樹脂(1g)を、DMF(2×10ml)、乾燥DCM(3×10l)、及び乾燥トルエン(3×10ml)にて洗浄し、冷却器を具備する丸底フラスコに移した。十分な量のトルエンを添加して樹脂を覆い、ついで、塩化アセチルを1滴ずつ添加し(樹脂1mlg-1,全容積1ml)、緩やかに撹拌しながら、混合物を、60~70℃において、3時間加熱した。完了後、樹脂を室温まで冷却し、ついで、トルエン(5×15ml)、DMF(5×15ml)及び最後に乾燥DCM(3×15ml)にて完全に洗浄した。ついで、樹脂に、DIEA(8当量)とともにDCM中のFmoc-γ-アミノ酪酸(3当量)を負荷し、その後、追加のDIEA(4当量)を付加し、反応混合物を計1時間混合した。ついで、1時間後、樹脂をMeOH(0.8mlg-1)と15分間カップリングし、ついで、DMF(5×10ml)及びDCM(5×15ml)にて洗浄した。樹脂の収率及び負荷を、UV/可視分光光度法に基づく304nmでのFmoc測定によって行い(0.41mモルg-1である)、樹脂を直ちに使用した。
Intavis Multipep Synthesiser及び製造者の推薦に従うFmoc化学を使用して、室温において、Tentagel(登録商標)Cl-トリチル樹脂上で、γ-アミノ酪酸リンカーを有するペプチドを合成した。製造者の推薦通りに塩化アセチルを使用して、Tentagel(登録商標)ヒドロキシ-トリチル樹脂からTentagel(登録商標)Cl-トリチル樹脂を調製した。簡潔には、樹脂(1g)を、DMF(2×10ml)、乾燥DCM(3×10l)、及び乾燥トルエン(3×10ml)にて洗浄し、冷却器を具備する丸底フラスコに移した。十分な量のトルエンを添加して樹脂を覆い、ついで、塩化アセチルを1滴ずつ添加し(樹脂1mlg-1,全容積1ml)、緩やかに撹拌しながら、混合物を、60~70℃において、3時間加熱した。完了後、樹脂を室温まで冷却し、ついで、トルエン(5×15ml)、DMF(5×15ml)及び最後に乾燥DCM(3×15ml)にて完全に洗浄した。ついで、樹脂に、DIEA(8当量)とともにDCM中のFmoc-γ-アミノ酪酸(3当量)を負荷し、その後、追加のDIEA(4当量)を付加し、反応混合物を計1時間混合した。ついで、1時間後、樹脂をMeOH(0.8mlg-1)と15分間カップリングし、ついで、DMF(5×10ml)及びDCM(5×15ml)にて洗浄した。樹脂の収率及び負荷を、UV/可視分光光度法に基づく304nmでのFmoc測定によって行い(0.41mモルg-1である)、樹脂を直ちに使用した。
一般的には、TFAに対して不安定な側鎖保護基を有する標準のFmocアミノ酸を使用して、100pモルスケールでペプチドを合成し、4-メチルモルホリンの存在下、PyBOP(5倍過剰量)を使用して活性化した5倍過剰量のFmoc-保護アミノ酸(0.05mモル)を使用して、ペプチドを合成した。ダブルのカップリング工程を使用し、続いて、各工程後に無水酢酸によるキャッピングを行った。ピペリジン(20%v/v DMF溶液)を使用して、N-Fmoc保護基を除去した。各脱保護化サイクルを、室温において2回行った(各回10分間)。合成の完了後、樹脂をDMF(3×50ml)にて洗浄し、固相結合ペプチドのN-末端を、DIPEAの存在下、室温において、15分間で、無水酢酸によってアセチル化した。N-末端のアセチル化の後、ペプチド樹脂を、DMF(3×20ml)及びDCM(3×20ml)にて洗浄した。
表11:異なったリンカーを有するペプチドの合成法及び使用した樹脂及び行ったC-末端の修飾
表11:異なったリンカーを有するペプチドの合成法及び使用した樹脂及び行ったC-末端の修飾
1.2.3 固体支持体からの開裂及び半分取HPLCを介するペプチドの精製
室温における3時間のTFA/H2O/トリイソプロピルシラン(TIPS)(95:2.5:2.5,10ml)からなる開裂カクテルでの処理によって、ペプチドを固体支持体から開裂した。窒素でのパージによって過剰のTFAを除去した。開裂したペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを添加することによって沈殿させ、3000rpmで5分間遠心分離した。粗製のペプチドペレットをジエチルエーテル(3×40ml)にて洗浄し、445-LCスケールアップモジュール及び440-LCフラクションコレクターを具備するVarian 940-LC HPLCシステムを使用して、RP-HPLCによって精製した。0.1%TFA/H2OにおけるCH3CNの線状グラディエント(0~99%,CH3CNにおける0.1%TFA)を、流量15ml/分、15分で使用して、RP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)上での半分取HPLCによってペプチドを精製した。220nm及び260nmにおいて検出を行った。
表12:実施例において、リンカー及び結合位置を変化させてテストするために合成したペプチドの配列。リンカーaを、それらのシングルアミノ酸略称としてリストした。リンカーの結合bは、ペプチドに対するものである;C-末端=カルボキシル末端、N-末端=アミノ末端。配列番号は、何らの追加N-末端及びC-末端の修飾、例えば、リンカーを持たないペプチドの配列に関する。
室温における3時間のTFA/H2O/トリイソプロピルシラン(TIPS)(95:2.5:2.5,10ml)からなる開裂カクテルでの処理によって、ペプチドを固体支持体から開裂した。窒素でのパージによって過剰のTFAを除去した。開裂したペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを添加することによって沈殿させ、3000rpmで5分間遠心分離した。粗製のペプチドペレットをジエチルエーテル(3×40ml)にて洗浄し、445-LCスケールアップモジュール及び440-LCフラクションコレクターを具備するVarian 940-LC HPLCシステムを使用して、RP-HPLCによって精製した。0.1%TFA/H2OにおけるCH3CNの線状グラディエント(0~99%,CH3CNにおける0.1%TFA)を、流量15ml/分、15分で使用して、RP-C18カラム(10×250mm,Phenomenex Jupiter)上での半分取HPLCによってペプチドを精製した。220nm及び260nmにおいて検出を行った。
表12:実施例において、リンカー及び結合位置を変化させてテストするために合成したペプチドの配列。リンカーaを、それらのシングルアミノ酸略称としてリストした。リンカーの結合bは、ペプチドに対するものである;C-末端=カルボキシル末端、N-末端=アミノ末端。配列番号は、何らの追加N-末端及びC-末端の修飾、例えば、リンカーを持たないペプチドの配列に関する。
1.2.4 ペプチド-PMO複合体の合成
マウスのジストロフィンエクソン-23用の25量体アンチセンス配列:(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT;配列番号:90)を使用した。リンカーの結合位置に応じて、そのC-末端カルボキシル基又はN-末端アミノ基のいずれかを介して、ペプチドをPMOの3’-末端に結合させた。これは、DIPEA2.3当量の存在下、ペプチドに対して、それぞれ、2.3倍及び2倍の当量のPyBOP及びHOAt(NMP中)、及びPMOに対して2.5倍過剰量のペプチド(DMSOに溶解)を使用することによって達成された。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,100mL)におけるペプチド(10mモル)溶液に、PyBOP(0.3M NMP溶液76.6mL)、HOAt(0.3M NMP溶液66.7mL)、DIPEA(4.0mL)及びPMO(4pモル,10mM DMSO溶液400pL)を添加した。この混合物を40℃に2時間放置し、H2O(1ml)を添加することによって反応を停止させた。陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6 H mlカラム,GE Healthcare)にて、20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝液(25mM,pH7.0)における塩化ナトリウムの線状グラディエント(0~1M)を流量6ml/分で使用することによって、反応混合物を精製した。イオン交換後に集めたフラクションのAmicon(登録商標)ウルトラ-15 3K遠心フィルター装置を介して、過剰の塩のペプチド-PMO(P-PMO)からの除去を行った。複合体を凍結乾燥し、MALDI-TOFによって分析した。複合体を滅菌水に溶解し、使用前に、0.22pmの酢酸セルロールフィルターを介して精製した。0.1M HCl溶液における265nmでの複合体のモル吸光測定によって、P-PMOの濃度を測定した。全体の収率(表13)はP-PMOに基づき26~64%であった。
表13:インビボ分析用の大規模合成したP-PMO複合体の収率(収率は、UV/可視分光分析を介して算定し、PMOの消衰係数に基づく)。P-PMOsについての純度は、順相HPLCにより220nm及び260nmにおいて確認して、95%以上である。ペプチドに結合させるために使用したPMOaは、次の配列を有する:5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’(配列番号90)。PMObの結合位置を、ここでは、太イタリック体で示す。カッコ内はリンカーである。
マウスのジストロフィンエクソン-23用の25量体アンチセンス配列:(GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT;配列番号:90)を使用した。リンカーの結合位置に応じて、そのC-末端カルボキシル基又はN-末端アミノ基のいずれかを介して、ペプチドをPMOの3’-末端に結合させた。これは、DIPEA2.3当量の存在下、ペプチドに対して、それぞれ、2.3倍及び2倍の当量のPyBOP及びHOAt(NMP中)、及びPMOに対して2.5倍過剰量のペプチド(DMSOに溶解)を使用することによって達成された。一般に、N-メチルピロリドン(NMP,100mL)におけるペプチド(10mモル)溶液に、PyBOP(0.3M NMP溶液76.6mL)、HOAt(0.3M NMP溶液66.7mL)、DIPEA(4.0mL)及びPMO(4pモル,10mM DMSO溶液400pL)を添加した。この混合物を40℃に2時間放置し、H2O(1ml)を添加することによって反応を停止させた。陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 6 H mlカラム,GE Healthcare)にて、20%CH3CNを含有するリン酸ナトリウム緩衝液(25mM,pH7.0)における塩化ナトリウムの線状グラディエント(0~1M)を流量6ml/分で使用することによって、反応混合物を精製した。イオン交換後に集めたフラクションのAmicon(登録商標)ウルトラ-15 3K遠心フィルター装置を介して、過剰の塩のペプチド-PMO(P-PMO)からの除去を行った。複合体を凍結乾燥し、MALDI-TOFによって分析した。複合体を滅菌水に溶解し、使用前に、0.22pmの酢酸セルロールフィルターを介して精製した。0.1M HCl溶液における265nmでの複合体のモル吸光測定によって、P-PMOの濃度を測定した。全体の収率(表13)はP-PMOに基づき26~64%であった。
表13:インビボ分析用の大規模合成したP-PMO複合体の収率(収率は、UV/可視分光分析を介して算定し、PMOの消衰係数に基づく)。P-PMOsについての純度は、順相HPLCにより220nm及び260nmにおいて確認して、95%以上である。ペプチドに結合させるために使用したPMOaは、次の配列を有する:5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’(配列番号90)。PMObの結合位置を、ここでは、太イタリック体で示す。カッコ内はリンカーである。
以下の比較用の複合体を合成/獲得し、及び比較用のリンカーを使用して、同じPMOをペプチドに結合した。
表14:比較用ペプチド
表14:比較用ペプチド
1.3 P-PMOの定量化及び再構成
P-PMOをRNase-フリー水に溶解した。この溶液からのアリコートを、0.1M HCl中で100倍希釈し、UV/可視分光分析を介して265nmで測定した。濃度を、ランベルト・ベールの法則:
を使用して測定した。
P-PMOをRNase-フリー水に溶解した。この溶液からのアリコートを、0.1M HCl中で100倍希釈し、UV/可視分光分析を介して265nmで測定した。濃度を、ランベルト・ベールの法則:
使用前に、P-PMOを室温に解凍し(以前に凍結している場合)、簡単にボルテックスし、ついで、37℃において30分間インキュベートした。続いて、P-PMOのアリコートを超音波処理浴において、5分間、超音波処理した。最後に、P-PMOを簡単にボルテックスし、パルススピンした。
RNaseフリー水に希釈したP-PMOを、所望の濃度で、9%食塩水と合わせることによって注射溶液を調製した(最終濃度:食塩水0.9%)。
1.4 インビボP-PMO治療の評価
1.4.1 P-PMOの全身投与
全ての実験を、オックスフォード大学の生体医学ユニットにおいて、Home Office Project Licence(UK)公認のもと、The Animals(Scientific Procedures)Act 1986及び治験倫理レビューに従って実施した。マウスを特殊な病原体フリーの疾病施設に収容し、環境として、12時間明-暗サイクルで、温度及び湿度を制御した。全ての動物は、自由に、市販の齧歯動物用の餌及び水を取ることができた。
1.4.1 P-PMOの全身投与
全ての実験を、オックスフォード大学の生体医学ユニットにおいて、Home Office Project Licence(UK)公認のもと、The Animals(Scientific Procedures)Act 1986及び治験倫理レビューに従って実施した。マウスを特殊な病原体フリーの疾病施設に収容し、環境として、12時間明-暗サイクルで、温度及び湿度を制御した。全ての動物は、自由に、市販の齧歯動物用の餌及び水を取ることができた。
年齢8~10週の雌C57BL/6マウスについて実験を行った。マウスに、尾静脈シングルボーラス注入によって、0.9%食塩水、P-PMO10mg/kg、30mg/kg、又は50mg/kgを投与した。投与後1週で、マウスを犠牲にし、前脛骨筋、横隔膜、及び心筋を採取し、ドライアイス上で瞬間凍結し、-80℃で保存した。
1.4.2 P-PMOの毒物学的評価
P-PMO(セクション1.4.1参照)の静脈内投与後、20時間、代謝ケージに収容し、投与後、2日目及び7日目において、冷蔵条件下で、尿を非侵襲的に収集した。7日目において、頸静脈から血液を収集し、血液を分画し、血漿を収集した。7日目において、解剖の間に、前脛骨筋、横隔膜、及び心筋を収集した。
P-PMO(セクション1.4.1参照)の静脈内投与後、20時間、代謝ケージに収容し、投与後、2日目及び7日目において、冷蔵条件下で、尿を非侵襲的に収集した。7日目において、頸静脈から血液を収集し、血液を分画し、血漿を収集した。7日目において、解剖の間に、前脛骨筋、横隔膜、及び心筋を収集した。
標準曲線に合わせるために尿を適切に希釈した後、ELISAによって、腎臓損傷分子-1(KIM-1)の尿中レベルを定量した。KIM-1値を、尿中クレアチニンレベルに正規化し、尿中クレアチニンレベルを、MRC Harwell Institute,Mary Lyon Centre(オックスフォードシャー,英国)において定量した。
1.4.3 P-PMO惹起エクソンスキッピングのqPCR分析
投与後7日間、前脛骨筋(TA)、横隔膜、及び心筋について、P-PMO惹起エクソンスキッピングの定量を行った。簡潔には、TRIzol系抽出法を使用して、ホモゲナイズした組織からRNAを抽出し、ランダムプライマーを使用したcDNAを合成した。Integrated DNA Technologiesによってプリマ―/プローブを合成し、スキップされていない生成物を示す第23番~第24番エクソンをスパンする領域(mDMD23-24、表14参照)を増幅する、又は第22番および第24番エクソンの境界をスパンするプローブ(mDMD22-24)を使用して、転写欠失エクソン23を特異的に増幅するようにデザインした。各転写のレベルを、スキップト及び非スキップト転写によって測定し、全転写(スキップト及び非スキップト)に対するスキップト転写の割合(%)として表示した(配列について表15参照)。
表15:qPCR法によるマウスのジストロフィン(第23番エクソン)エクソンスキッピングの定量用のプライマー及びプローブ配列
投与後7日間、前脛骨筋(TA)、横隔膜、及び心筋について、P-PMO惹起エクソンスキッピングの定量を行った。簡潔には、TRIzol系抽出法を使用して、ホモゲナイズした組織からRNAを抽出し、ランダムプライマーを使用したcDNAを合成した。Integrated DNA Technologiesによってプリマ―/プローブを合成し、スキップされていない生成物を示す第23番~第24番エクソンをスパンする領域(mDMD23-24、表14参照)を増幅する、又は第22番および第24番エクソンの境界をスパンするプローブ(mDMD22-24)を使用して、転写欠失エクソン23を特異的に増幅するようにデザインした。各転写のレベルを、スキップト及び非スキップト転写によって測定し、全転写(スキップト及び非スキップト)に対するスキップト転写の割合(%)として表示した(配列について表15参照)。
表15:qPCR法によるマウスのジストロフィン(第23番エクソン)エクソンスキッピングの定量用のプライマー及びプローブ配列
2.他の実施例
ペプチド-PMO複合体の合成
既に記載したように、ペプチドを合成し、PMOに結合させた。伸長したCUG反復:(5-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’:配列番号192)を標的とするPMO配列をGene Tools LLCから購入し、更なる複合体の作製に使用した。
ペプチド-PMO複合体の合成
既に記載したように、ペプチドを合成し、PMOに結合させた。伸長したCUG反復:(5-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’:配列番号192)を標的とするPMO配列をGene Tools LLCから購入し、更なる複合体の作製に使用した。
細胞培養及びペプチド-PMO処置
健康な個人又は2600のCTG反復を有するDM1患者からの不死化筋芽細胞を、M199:DMEMミックス(比1:4;Life technologies)からなり、20%FBS(Life technologies)、ゲンタマイシン50pg/ml(Life technologies)、フェチュイン25pg/ml、bFGF0.5ng/ml、EGF5ng/ml、及びデキサメタゾン(Sigma-Aldrich)0.2pg/mlを補足した成長培地において培養した。密集細胞培地を、インスリン(Sigma-Aldrich)5pg/mlを補足した筋芽細胞用DMEM培地に切り替えることによって、筋肉分化を惹起させた。4日間で、WT又はDM1細胞が分化された。ついで、培地を、1、2、5、10、20、又は40pMの濃度でペプチド-PMOを含む新鮮な分化用培地に交換した。処置後、48時間で、分析のため細胞を収集した。ヒト肝細胞において、40μMの濃度での、又はヒト筋芽細胞において、1、2、5、10、20、又は40pMの濃度でのペプチド-PMOのトランスフェクションの2日後に、蛍光検出アッセイ(Promega)によって細胞生存率を定量した。
健康な個人又は2600のCTG反復を有するDM1患者からの不死化筋芽細胞を、M199:DMEMミックス(比1:4;Life technologies)からなり、20%FBS(Life technologies)、ゲンタマイシン50pg/ml(Life technologies)、フェチュイン25pg/ml、bFGF0.5ng/ml、EGF5ng/ml、及びデキサメタゾン(Sigma-Aldrich)0.2pg/mlを補足した成長培地において培養した。密集細胞培地を、インスリン(Sigma-Aldrich)5pg/mlを補足した筋芽細胞用DMEM培地に切り替えることによって、筋肉分化を惹起させた。4日間で、WT又はDM1細胞が分化された。ついで、培地を、1、2、5、10、20、又は40pMの濃度でペプチド-PMOを含む新鮮な分化用培地に交換した。処置後、48時間で、分析のため細胞を収集した。ヒト肝細胞において、40μMの濃度での、又はヒト筋芽細胞において、1、2、5、10、20、又は40pMの濃度でのペプチド-PMOのトランスフェクションの2日後に、蛍光検出アッセイ(Promega)によって細胞生存率を定量した。
RNAの単離,PT-PCR
ヒト細胞について:RNA抽出前に、細胞を、プロテアーゼK緩衝液(NaCl500mM,Tris-HCl(pH7.2)10mM、MgCl21.5mM、EDTA10mM,2%SDS,及びプロテアーゼK0.5mg/ml)中、55℃において、45分間、溶解させた。製造者のプロトコルに従ってTriReagent(登録商標)を使用して、全RNAを単離した。製造者の使用説明書に従って、計20μlのM-MLVファーストストランド合成システム(Life Technologies)を使用して、RNA1μgを逆転写した。続いて、標準プロトコルによる半定量的PCR分析(ReddyMix,Thermo Scientific)において、cDNA製剤1μlを使用した。各遺伝子について、増幅の線状範囲内において、25~35サイクルでPCR増幅を行った。PCR生成物を、1.5~2%アガロースゲルにおいて分離し、臭化エチジウム染色し、ImageJソフトウエアにて定量した。エクソン封入率を、イソ型シグナルの全強度に対する封入のパーセンテージとして定量した。mRNAの発現を定量するため、製造者の使用説明書に従って、リアルタイムPCRを実施した。PCRサイクルは、15分間の変性工程、続く、50サイクル、15秒間の94℃変性工程、20秒間の58℃アニーリング、及び20秒間の72℃伸展であった。
表16:PCR用プライマー
ヒト細胞について:RNA抽出前に、細胞を、プロテアーゼK緩衝液(NaCl500mM,Tris-HCl(pH7.2)10mM、MgCl21.5mM、EDTA10mM,2%SDS,及びプロテアーゼK0.5mg/ml)中、55℃において、45分間、溶解させた。製造者のプロトコルに従ってTriReagent(登録商標)を使用して、全RNAを単離した。製造者の使用説明書に従って、計20μlのM-MLVファーストストランド合成システム(Life Technologies)を使用して、RNA1μgを逆転写した。続いて、標準プロトコルによる半定量的PCR分析(ReddyMix,Thermo Scientific)において、cDNA製剤1μlを使用した。各遺伝子について、増幅の線状範囲内において、25~35サイクルでPCR増幅を行った。PCR生成物を、1.5~2%アガロースゲルにおいて分離し、臭化エチジウム染色し、ImageJソフトウエアにて定量した。エクソン封入率を、イソ型シグナルの全強度に対する封入のパーセンテージとして定量した。mRNAの発現を定量するため、製造者の使用説明書に従って、リアルタイムPCRを実施した。PCRサイクルは、15分間の変性工程、続く、50サイクル、15秒間の94℃変性工程、20秒間の58℃アニーリング、及び20秒間の72℃伸展であった。
表16:PCR用プライマー
動物実験及びASO注射
英国の法律に従って、オックスフォード大学において実験を行った。HSA-LR C57BL/6マウスにおける静脈内注射を、尾静脈を介してシングル又は繰り返し投与によって実施した。ペプチド-PMO-CAG7の用量30、12.5、7.5、及び5mg/kgを0.9%食塩水にて希釈し、容量5~6pL/g(体重)で投与した。C57BL6雌マウスにおけるKIM-1レベルを、標準曲線内に適合するように希釈したサンプルとともに、ELISA(R&D cat# MKM100)によって測定した。尿中タンパク濃度を説明するために、値を尿中クレアチニンレベルに正規化した(Harwell)。
表17:DPEP系[CAG]7PMO複合体の注射後のC57BL6マウスの回復時間は、Pip6aのような従来のペプチドを使用して形成した複合体の注射後よりも短い。
英国の法律に従って、オックスフォード大学において実験を行った。HSA-LR C57BL/6マウスにおける静脈内注射を、尾静脈を介してシングル又は繰り返し投与によって実施した。ペプチド-PMO-CAG7の用量30、12.5、7.5、及び5mg/kgを0.9%食塩水にて希釈し、容量5~6pL/g(体重)で投与した。C57BL6雌マウスにおけるKIM-1レベルを、標準曲線内に適合するように希釈したサンプルとともに、ELISA(R&D cat# MKM100)によって測定した。尿中タンパク濃度を説明するために、値を尿中クレアチニンレベルに正規化した(Harwell)。
表17:DPEP系[CAG]7PMO複合体の注射後のC57BL6マウスの回復時間は、Pip6aのような従来のペプチドを使用して形成した複合体の注射後よりも短い。
実施例3
上記の実施例1および2に記載された技術および方法を用いて、以下の複合体のいずれかを調製することができる。
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または
上記の実施例1および2に記載された技術および方法を用いて、以下の複合体のいずれかを調製することができる。
または
ここで、
(B)はベータアラニン残基であり、
(Ab)はγ-アミノ酪酸残基であり、
(E)はグルタミン酸残基であり、ただし、-COOHがグルタミン酸残基に存在する場合は、- CONH2で置換されている。
(B)はベータアラニン残基であり、
(Ab)はγ-アミノ酪酸残基であり、
(E)はグルタミン酸残基であり、ただし、-COOHがグルタミン酸残基に存在する場合は、- CONH2で置換されている。
実施例4 非ヒト霊長類における検討
モルフォリノオリゴヌクレオチドを含む以下に示す複合体1:
(ここで、5’基は、
であり、リンカー(E)は、
である)を、0.9%滅菌生理食塩水で25mg/mLに再構成した。
モルフォリノオリゴヌクレオチドを含む以下に示す複合体1:
NHP単回注入用量反応試験
複合体1のエクソンスキッピングの有効性を非ヒト霊長類(NHP)で試験した。具体的には、2~4歳の治療未経験のカニクイザルに、20mg/kg、40mg/kg、または60mg/kgで、単回静脈内緩徐ボーラス注射(1~2分)により複合体を投与した(各群n=1雄,n=1雌)。
複合体1のエクソンスキッピングの有効性を非ヒト霊長類(NHP)で試験した。具体的には、2~4歳の治療未経験のカニクイザルに、20mg/kg、40mg/kg、または60mg/kgで、単回静脈内緩徐ボーラス注射(1~2分)により複合体を投与した(各群n=1雄,n=1雌)。
投与後1週間後に動物を屠殺した。予定された病理解剖時に、エクソンスキッピング解析と組織バイオアナリシスのために組織の一部を採取した。
組織バイオアナリシス
複合体1の生体内分布は、NHP組織サンプルからの複合体1の高感度かつ特異的な検出を可能にする蛍光検出によるAEX-HPLC分析法によって評価した。この分析評価は、両末端にAtto425色素を結合させた30量体の相補的RNAプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。RNAと親化合物の二本鎖は、蛍光検出器に結合したAEX-HPLCによるその後の分析で特定のシグナルをもたらした。定量は、NHP組織の標準希釈系列から生成した外部較正曲線に基づいて行った。50ng/gから5,000.0ng/gまでの直線検量線(加重1/X)を算出した。生体内分布の結果を図33に示す。
複合体1の生体内分布は、NHP組織サンプルからの複合体1の高感度かつ特異的な検出を可能にする蛍光検出によるAEX-HPLC分析法によって評価した。この分析評価は、両末端にAtto425色素を結合させた30量体の相補的RNAプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。RNAと親化合物の二本鎖は、蛍光検出器に結合したAEX-HPLCによるその後の分析で特定のシグナルをもたらした。定量は、NHP組織の標準希釈系列から生成した外部較正曲線に基づいて行った。50ng/gから5,000.0ng/gまでの直線検量線(加重1/X)を算出した。生体内分布の結果を図33に示す。
RT-PCR分析
第51番エクソンスキッピングのレベルはRT-PCRで決定した。骨格筋、心筋、および平滑筋組織は、ビーズベースのホモジナイゼーション法を用いて均質化した。RNAは、メーカーの推奨に従って、Maxwell RSC 48装置(Promega)とsimply RNA Tissue Kit(Promega)を使用して抽出した。RNAの濃度と純度はClarioStar(BMG LabTech社)を用いて測定した。表18に示す熱サイクル条件下で、高容量cDNA逆転写キット(ThermoFisher Scientific社(4368813))を用いて定量化RNAを逆転写した。
表18:逆転写熱サイクル条件
第51番エクソンスキッピングのレベルはRT-PCRで決定した。骨格筋、心筋、および平滑筋組織は、ビーズベースのホモジナイゼーション法を用いて均質化した。RNAは、メーカーの推奨に従って、Maxwell RSC 48装置(Promega)とsimply RNA Tissue Kit(Promega)を使用して抽出した。RNAの濃度と純度はClarioStar(BMG LabTech社)を用いて測定した。表18に示す熱サイクル条件下で、高容量cDNA逆転写キット(ThermoFisher Scientific社(4368813))を用いて定量化RNAを逆転写した。
表18:逆転写熱サイクル条件
ネステッドPCRは2回の連続したPCR反応として行った。1回目のPCRは逆転写cDNAテンプレートを用いて行った。2回目のPCRは1回目のPCRで得られた産物を用いて行った。PCR反応に使用されるすべてのプライマーを表19に示し、熱サイクル条件の概要を表20に示す。最終的なPCR産物は、アガロースゲル電気泳動(2%)によって分析した。ゲルはミドリグリーンアドバンス染色試薬(日本ジェネティクス株式会社)を用いて調製した。Hyper Ladder 50 bp(Bioline社,BIO-33039)とPCR産物をアガロースゲルにロードし、適切な程度のバンド分離が達成されるまで泳動した。その後、ゲルイメージングシステムG:BOX(Syngene社)を用いて、分解したゲルの画像取得を行った。ネステッドPCRゲルからのスキップされていない天然のバンド、およびスキップされたΔex 51のバンドをImageJソフトウェア(フィジー)を用いてデンシトメトリー分析した。バンド定量からのデンシトメトリー値を使用し、下記式によりnhpDMD第51番エクソンスキッピングを決定した。
nhpDMD第51番エクソンスキッピング式:([スキップされたフラグメントのピーク面積]/[スキップされたフラグメントのピーク面積+スキップされなかったフラグメントのピーク面積])×100
表19:プライマーおよびプライマー配列
nhpDMD第51番エクソンスキッピング式:([スキップされたフラグメントのピーク面積]/[スキップされたフラグメントのピーク面積+スキップされなかったフラグメントのピーク面積])×100
表19:プライマーおよびプライマー配列
複合体1を投与された非ヒト霊長類における第51番エクソンスキッピング効果を、図34に纏める。
他の実施形態
説明した本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
その他の実施形態は特許請求の範囲に記載されている。
説明した本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって自明である、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
その他の実施形態は特許請求の範囲に記載されている。
Claims (109)
- オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合しているか、リンカーを介して結合しているペプチドとの複合体またはその薬学的に許容される塩であって、
前記ペプチドは、少なくとも4個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のカチオン性ドメインと、少なくとも3個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個の疎水性ドメインとを含み、ただし前記ペプチドは、合計7~40個のアミノ酸残基を含み、人工アミノ酸残基を含まず、
前記オリゴヌクレオチドは、合計12~40個の連続した核酸塩基を含み、ただし少なくとも12個の連続した核酸塩基は、ヒトジストロフィン遺伝子中の標的配列に対して相補的であることを特徴とする複合体またはその薬学的に許容される塩。 - 前記標的配列は、第45番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第45番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表1中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか1つ選択される少なくとも12個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項2に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表1中のいずれか1つの配列またはそのチミン置換型を含むことを特徴とする請求項2に記載の複合体。
- 表1中の前記配列は、5’-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)であることを特徴とする請求項3または4に記載の複合体。
- 表1中の前記配列は、5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)であることを特徴とする請求項3または4に記載の複合体。
- 前記標的配列は、第51番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第51番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表2中の配列およびそれらのチミン置換型からいずれか1つ選択される少なくとも12個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項7に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表2中のいずれか1つの配列またはそのチミン置換型を含むことを特徴とする請求項7に記載の複合体。
- 表2中の前記配列は、5’-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3’(配列番号130)であることを特徴とする請求項8または9に記載の複合体。
- 表2中の前記配列は、5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)であることを特徴とする請求項8または9に記載の複合体。
- 前記標的配列は、第53番エクソンのスプライス部位を含んでいるか、第53番エクソンのスプライス部位から50核酸塩基以内に配置されていることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表3中のいずれか1つの配列である少なくとも12個連続した核酸塩基を含むことを特徴とする請求項12に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、表4中のいずれか1つの配列を含むことを特徴とする請求項12に記載の複合体。
- 表3中の前記配列は、5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)であることを特徴とする請求項13または14に記載の複合体。
- 表3中の前記配列は、5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)であることを特徴とする請求項13または14に記載の複合体。
- 前記スプライス部位はアクセプタースプライス部位であることを特徴とする請求項2,7または12に記載の複合体。
- 前記スプライス部位はドナースプライス部位であることを特徴とする請求項2,7または12に記載の複合体。
- 前記配列は、GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT(配列番号90)であることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
- 前記ペプチドはアミノヘキサン酸(X)残基を含まず、又は前記ペプチドは6-アミノヘキサン酸残基を含まないことを特徴とする請求項1~18のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは天然アミノ酸残基からなることを特徴とする請求項1~18のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、4アミノ酸残基から12アミノ酸残基の間、好ましくは4アミノ酸残基から7アミノ酸残基の間の長さを有することを特徴とする請求項1~21のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%のカチオン性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1~22のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸を含み、好ましくは少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%のカチオン性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1~23のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基、および/またはセリン残基を含み、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニン残基、ヒスチジン残基、ベータアラニン残基、ヒドロキシプロリン残基および/またはセリン残基からなることを特徴とする請求項1~24のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、アルギニンリッチおよび/またはヒスチジンリッチであり、好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%のアルギニン残基および/またはヒスチジン残基を含むことを特徴とする請求項1~25のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは2つのカチオン性ドメインを含むことを特徴とする請求項1~26のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)のうちの1つまたはその任意の組合せを含み、
好ましくは、それぞれのカチオン性ドメインは、1つの以下の配列:RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)またはその任意の組合せからなることを特徴とする請求項1~27のいずれか一項に記載の複合体。 - それぞれの疎水性ドメインは3アミノ酸から6アミノ酸の間の長さを有し、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは5アミノ酸の長さを有することを特徴とする請求項1~28のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれの疎水性ドメインは、大多数の疎水性アミノ酸残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%の疎水性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項1~29のいずれか一項に記載の複合体。
- それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基およびグルタミン残基を含み、好ましくは、それぞれの疎水性ドメインは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、プロリン残基および/またはグルタミン残基からなることを特徴とする請求項1~30のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは1つの疎水性ドメインを含むことを特徴とする請求項1~31のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはその任意の組合せを含み、好ましくは、前記疎水性ドメインまたはそれぞれの疎水性ドメインは、以下の配列:YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、WWPW(配列番号26)のうちの1つまたはその任意の組合せからなることを特徴とする請求項1~32のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、2つのカチオン性ドメインおよび1つの疎水性ドメインからなり、好ましくは、前記ペプチドは、2つのカチオン性アームドメインに挟まれた1つの疎水性コアドメインからなることを特徴とする請求項1~33のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、RBRRBRR(配列番号1)、RBRBR(配列番号2)、RBRR(配列番号3)、RBRRBR(配列番号4)、RRBRBR(配列番号5)、RBRRB(配列番号6)、BRBR(配列番号7)、RBHBH(配列番号8)、HBHBR(配列番号9)、RBRHBHR(配列番号10)、RBRBBHR(配列番号11)、RBRRBH(配列番号12)、HBRRBR(配列番号13)、HBHBH(配列番号14)、BHBH(配列番号15)、BRBSB(配列番号16)、BRB[Hyp]B(配列番号17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(配列番号18)、およびR[Hyp]RR[Hyp]R(配列番号19)から選択される配列をそれぞれ含む2つのカチオン性アームドメインに挟まれた、YQFLI(配列番号20)、FQILY(配列番号21)、ILFQY(配列番号22)、FQIY(配列番号23)、WWW、WWPWW(配列番号24)、WPWW(配列番号25)、およびWWPW(配列番号26)から選択される配列を含む1つの疎水性コアドメインからなることを特徴とする請求項1~34のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、以下の配列:RBRRBRRFQILYRBRBR(配列番号27)、RBRRBRRYQFLIRBRBR(配列番号31)、RBRRBRRILFQYRBRBR(配列番号32)、RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)、RBRRBRRFQILYHBHBR(配列番号38)、RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のうちの1つからなることを特徴とする請求項1~35のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)を有することを特徴とする請求項1~18のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRRFQILYRBHBH(配列番号37)を有することを特徴とする請求項1~18のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)を有することを特徴とする請求項1~18のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、そのN末端を通して前記複合体の残りの部分と結合していることを特徴とする請求項1~39のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドのN末端は-NH2であることを特徴とする請求項40に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、そのC末端を通して前記複合体の残りの部分と結合していることを特徴とする請求項1~39のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチドは、そのN末端がアシル化されていることを特徴とする請求項42に記載の複合体。
- 前記複合体は以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を有することを特徴とする請求項1~43のいずれか一項に記載の複合体。 - 前記複合体は以下の構造:
[ペプチド]-[リンカー]-[ペプチド]-[リンカー]-[オリゴヌクレオチド]
を有することを特徴とする請求項1~43のいずれか一項に記載の複合体。 - 各リンカーは、独立して、下記式(I)による構造を有する:
-T1-(CR1R2)n-T2- (I)
{ここで、
T1は、前記ペプチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
T2は、オリゴヌクレオチドに結合する2価の基であり、-NH-およびカルボニルからなる群から選択され;
nは、1、2又は3であり;
各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれ、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、もしくは-N(RA3)SO2-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素および(1-4C)アルキルからなる群から選択される)から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]
で示される基であり;
各R2は、独立して、式:
-Y2-X2-Z2
[ここで、
Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4から選ばれる整数であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素、OH、又は(1-2C)アルキルから選ばれる)で示される基であり;
X2は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり(ここで、各RB3は、独立して、水素又はメチルから選ばれる);
Z2は、水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールから選ばれる(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RB4及びRB5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルから選ばれる)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基であり;
ただし、
n=1で、T1及びT2が相互に異なる場合、R1及びR2は、両方がHとなることはなく;
n=1で、T1及びT2が相互に異なり、R1及びR2の一方がHである場合、R1及びR2の他方はメチルではなく;
n=2で、各R1及びR2がHである場合、T1及びT2はともに-C(O)-であるか、又はともに-NH-である}ことを特徴とする請求項1~46のいずれか一項に記載の複合体。 - T2は-C(O)-であることを特徴とする請求項47に記載の複合体。
- 各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、(2-6C)アルケニル、(2-6C)アルキニル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、(3-6C)シクロアルケニル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、および(1-4C)アルコキシ(ここで、RA4及びRA5は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)からなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基であることを特徴とする請求項47または48に記載の複合体。 - 各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-O-、C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、もしくは-S-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基であることを特徴とする請求項47または48に記載の複合体。 - 各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、
Y1は、不在か、又は式:
-[CRA1RA2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
X1は、不在か、又は-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、もしくは-C(O)-N(RA3)であり(ここで、各RA3は、水素又はメチルである);
Z1は、更なるオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、もしくはヘテロアリールである(ここで、各(1-6C)アルキル、アリール、(3-6C)シクロアルキル、およびヘテロアリールは、任意に、(1-4C)アルキル、ハロ、およびヒドロキシからなる群から選ばれる1以上(例えば1,2,3,4または5)の置換基によって置換される)]で示される基であることを特徴とする請求項47または48に記載の複合体。 - 各R1は、独立して、式:
-Y1-X1-Z1
[ここで、Y1は、不在か、又は-(CH2)-もしくは-(CH2CH2)-であり、
X1は、不在か、又は-N(RA3)-C(O)-もしくは-C(O)-N(RA3)-であり(ここで、各RA3は、独立して、水素又はメチルである);
Z1は、水素又は(1-2C)アルキルである]で示される基であることを特徴とする請求項47または48に記載の複合体。 - 各R2は、独立して、式:
-Y2-Z2
[ここで、Y2は、不在か、又は式:
-[CRB1RB2]m-
(ここで、mは、1、2、3、又は4であり、RB1及びRB2は、それぞれ独立して、水素又は(1-2C)アルキルである)で示される基であり;
Z2は、水素又は(1-6C)アルキルである]
で示される基である請求項47~51のいずれか一項に記載の複合体。 - 各R2は水素である請求項47~51のいずれか一項に記載の複合体。
- nは2又は3である請求項47~54のいずれか一項に記載の複合体。
- nは1である請求項47~54のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ-アミノ酪酸からなる群から選ばれた酸残基であることを特徴とする請求項1~44のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その3’末端において、前記リンカーまたは前記ペプチドに結合していることを特徴とする請求項1~67のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドは、その5’末端として、ヒドロキシルを含むことを特徴とする請求項1~68のいずれか一項に記載の複合体。
- ペプチドAc-RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAc-RBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3’(配列番号194)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3’(配列番号193)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3’(配列番号196)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3’(配列番号195)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3’(配列番号171)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3’(配列番号162)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドRBRRBRFQILYBRBR-NH2(配列番号35)のN末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYRBHBH(配列番号44)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、ベータアラニン残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩。
- ペプチドAcRBRRBRFQILYBRBR(配列番号35)のC末端に、グルタミン酸残基を介して共有結合した3’-末端を有するオリゴヌクレオチド5’-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3’(配列番号198)の複合体またはその薬学的に許容される塩であって、前記グルタミン酸残基中に遊離の-COOHがある場合、それは-CONH2に置換されている複合体またはその薬学的に許容される塩。
- 前記オリゴヌクレオチドはモルフォリノであることを特徴とする請求項1~103のいずれか一項に記載の複合体。
- 全てのモルフォリノヌクレオシド間結合は-P(O)(NMe2)O-であることを特徴とする請求項104に記載の複合体。
- 請求項1~105のいずれか一項に記載の複合体、および薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
- DMDまたはBMDを有する被験体の治療における使用のための請求項106に記載の医薬組成物。
- DMDまたはBMDを有する被験体の治療方法であって、治療有効量の請求項1~105のいずれか一項に記載の複合体または請求項106に記載の医薬組成物を、被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記被験体はDMDを有することを特徴とする請求項108に記載の方法。
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