KR20240006019A

KR20240006019A - 세포 투과 펩티드 접합체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20240006019A
Application number: KR1020237029218A
Authority: KR
Inventors: 매튜 우드; 라퀠 만자노; 라?? 만자노; 캐롤라인 고드프리; 그라함 맥로리; 리차드 라즈; 마이클 게이트; 앤드리 알주마노브; 리즈 오도너번; 가렛 하젤; 애쉴링 홀랜드; 미구엘 바렐라; 수바시스 바네르지
Original assignee: 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드; 유나이티드 킹덤 리서치 앤드 이노베이션
Priority date: 2021-02-12
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2024-01-12
Also published as: CA3211042A1; WO2022172019A1; JP2024506099A; WO2022171972A1; EP4291244A1; CN117295525A; IL305117A; BR112023016183A2; CA3211038A1; AU2022220252A1; AU2021427595A1

Abstract

올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 링커를 통해 공유적으로 결합되거나 연결된 펩타이드의 접합체가 개시되며, 상기 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 양이온성 도메인 및 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 소수성 도메인을 포함하고, 단, 상기 펩타이드는 총 7 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하고 임의의 인공 아미노산 잔기를 포함하지 않으며; 상기 올리고뉴클레오타이드는 총 12 내지 40개의 연속 핵 염기를 포함하고, 여기서, 적어도 12개의 연속 핵 염기는 사람 디스트로핀 유전자 내의 표적 서열에 대해 상보적이다.

Description

세포 투과 펩티드 접합체 및 이의 사용 방법

본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 펩타이드 접합체, 이를 함유하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

핵산 약물은 사람의 건강 관리를 혁신시킬 수 있는 잠재력을 갖는 게놈 약이다. 연구에 따르면, 이러한 치료제는 신경근 질환을 비롯한 광범위한 질환 영역에 걸쳐 적용될 수 있는 것으로 나타났다. 신경근 질환인 뒤시엔느 근 이영양증 (Duchenne muscular dystrophy: DMD)에서 pre-mRNA 스플라이싱을 조절하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 방법의 적용은 이러한 단일 유전자 장애를 정밀 의학 발전의 선두에 두었다.

그러나, 이러한 유망한 안티센스 치료제의 치료학적 개발은 불충분한 세포 투과성과 불량한 분포 특성 - DMD에서 근육 조직 기질의 큰 부피와 분산된 특성에 의해 더욱 강조되는 문제 - 에 의해 제한되었다.

DMD는 3500명의 신생 남아 중 1명에서 발병한다. 이러한 중증 X 연관 열성 질환은 디스트로핀 단백질을 인코딩하는 DMD 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 상기 장애는 궁극적으로 조기 사망으로 이어지는 호흡 부전 및 심장 합병증의 발병과 함께 진행성 근육 퇴행 및 쇠약을 특징으로 한다. DMD의 기저를 이루는 돌연변이의 대부분은 디스트로핀 단백질의 부재를 초래하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)에서의 조기 절단을 유도하는 게놈 프레임외 결실 (genomic out-of-frame deletion)이다.

엑손 스키핑 요법 (exon skipping therapy)은 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (splice switching antisense oligonucleotide: SSO)를 활용하여, DMD 전사물의 특정 영역을 표적화하고 개별 엑손의 제외를 유도하고 비정상적인 리딩 프레임의 복구를 초래하고 내부 결실되었지만 아직 부분적으로 기능하는 디스트로핀 단백질의 생산을 초래한다. DMD에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 엑손 스키핑 요법의 의심할 여지없는 잠재력에도 불구하고, 이러한 접근법의 성공적인 적용은 골격근의 상대적으로 비효율적인 표적화 뿐만 아니라 심장과 같은 다른 이환 조직에 대한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 불충분한 표적화로 인해 현재 제한된다. 2016년 9월에, 미국 식품 의약국 (Food and Drug Administration: FDA)은 엑손 51 스플라이싱의 조절제인 에테플러센 (eteplirsen)에 대한 신속 승인을 허여하였다. 이는 스플라이싱을 조절하는 최초 미국 FDA 승인된 올리고뉴클레오타이드를 예고하였지만, 디스트로핀 복구 수준은 정상 디스트로핀 수준의 대략 1%로 실망스러웠다. 대립 유전자 장애인 베커 근 이영양증과의 비교 및 mdx 마우스 실험에 따르면, 운동 유발 손상으로부터 근육을 보호하기 위해서는 야생형의 적어도 약 15%의 동종 근형질막 디스트로핀 발현이 필요한 것으로 나타났다.

그러므로, DMD와 같은 치명적인 유전 질환을 위한 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제가 필요하다.

일반적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 링커를 통해 공유적으로 결합되거나 공유적으로 연결된 펩타이드의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 사람 디스트로핀 유전자의 엑손 45, 엑손 51 또는 엑손 53의 내에 있거나 이에 근접한 표적 서열에 대해 상보적이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 링커를 통해 공유적으로 결합되거나 연결된 펩타이드의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며,

상기 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 양이온성 도메인 및 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 소수성 도메인을 포함하고, 단, 상기 펩타이드는 총 7 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하고 임의의 인공 아미노산 잔기를 포함하지 않고;

상기 올리고뉴클레오타이드는 총 12 내지 40개의 연속 핵 염기 (nucleobase)를 포함하고, 여기서, 적어도 12개의 연속 핵 염기는 사람 디스트로핀 유전자 내의 표적 서열에 대해 상보적이다.

일부 실시 형태에서, 상기 표적 서열은 엑손 45에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 45에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기 및 이의 티민 치환된 버전을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 어느 하나의 서열 또는 이의 티민 치환된 버전을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 표 1의 서열은 하기와 같다:

5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193).

일부 실시 형태에서, 상기 표 1의 서열은 하기와 같다:

5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194).

일부 실시 형태에서, 상기 표적 서열은 엑손 51에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 51에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 2의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기 및 이의 티민 치환된 버전을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 3의 어느 하나의 서열 또는 이의 티민 치환된 버전을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 표 2의 서열은 하기와 같다:

5'-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3' (서열 번호 130).

일부 실시 형태에서, 상기 표 2의 서열은 하기와 같다:

5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195).

일부 실시 형태에서, 상기 표적 서열은 엑손 53에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 53에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 3의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 표 3의 어느 하나의 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 표 3의 서열은 하기와 같다:

5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162).

일부 실시 형태에서, 상기 표 3의 서열은 하기와 같다:

5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171).

일부 실시 형태에서, 상기 스플라이스 부위는 수용자 스플라이스 부위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 스플라이스 부위는 공여자 스플라이스 부위이다.

일부 실시 형태에서, 상기 서열은 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 90)이다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아미노헥산산 (X) 잔기를 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 6-아미노헥산산 잔기를 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 천연 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 4 내지 12개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 4 내지 7개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%의 양이온성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 대다수(a majority of)의 양이온성 아미노산, 바람직하게는 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 양이온성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기를 포함하고, 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌 풍부하고/하거나 히스티딘 풍부하고, 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 60%, 적어도 65% 또는 적어도 70%의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1 ), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18), R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나를 포함하고; 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18), R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 3~6개 아미노산의 길이를 갖고, 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 5개 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 대다수의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 소수성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및 글루타민 잔기를 포함하고; 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및/또는 글루타민 잔기로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 1개의 소수성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나를 포함하고; 바람직하게는, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인 및 1개의 소수성 도메인으로 이루어지고, 바람직하게는, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 아암 (arm) 도메인에 의해 플랭킹된 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18) 및 R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19)로부터 선택된 서열을 각각 포함하는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된, YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25) 및 WWPW (서열 번호 26)으로부터 선택된 서열을 포함하는 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRRFQILYRBRBR (서열 번호 27), RBRRBRRYQFLIRBRBR (서열 번호 31), RBRRBRRILFQYRBRBR (서열 번호 32), RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35), RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37), RBRRBRRFQILYHBHBR (서열 번호 38), RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 이의 N-말단을 통해 상기 접합체의 나머지에 결합되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드의 C-말단은 -NH₂이다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 이의 C-말단을 통해 상기 접합체의 나머지에 결합되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 이의 N-말단에서 (예를 들어, 이의 N-말단에서 아세틸기, 또는 NH₂- 또는 AcNH-를 갖는 아미노산 잔기로) 아실화된다. 바람직하게는, 상기 아미노산 잔기가 펩타이드의 N-말단에 존재하는 경우, 이는 그렇지 않으면 존재할 임의의 -COOH 대신에 -CONH₂를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 갖는다:

[펩타이드]―[링커]―[올리고뉴클레오타이드]

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 갖는다:

또는

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 갖는다:

[펩타이드]―[링커]―[펩타이드]―[링커]―[올리고뉴클레오타이드]

일부 실시 형태에서, 각각의 링커는 독립적으로 하기 화학식 (I)을 갖는다:

[화학식 (I)]

T₁-(CR¹R²)_n-T₂

화학식 I에서,

T₁은 상기 펩타이드에 대한 부착을 위한 2가 기이며, -NH- 및 카보닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

T₂는 올리고뉴클레오타이드에 대한 부착을 위한 2가 기이며, -NH- 및 카보닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

n은 1, 2 또는 3이고;

각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고,

여기서,

Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소, OH 또는 (1-2C)알킬이고;

X¹은 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH(OR^A3)-, -N(R^A3)-, -N(R^A3)-C(O)-, -N(R^A3)-C(O)O-, -C(O)-N(R^A3)-, -N(R^A3)C(O)N(R^A3)-, -N(R^A3)C(NR^A3)N(R^A3)-, -SO-, -S-, -SO₂-, -S(O)₂N(R^A3)- 또는 -N(R^A3)SO₂-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되고;

Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴이고,

여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^A4R^A5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^A4　및 R^A5는 각각 독립적으로 수소 및 (1-4C)알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

각각의 R²는 독립적으로 -Y²-X²-Z²이고, 여기서,

Y²는 부재하거나 화학식 -[CR^B1R^B2]_m-의 기이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4로부터 선택된 정수이고, R^B1 및 R^B2는 각각 독립적으로 수소, OH 또는 (1-2C)알킬로부터 선택되고;

X²는 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH(OR^B3)-, -N(R^B3)-, -N(R^B3)-C(O)-, -N(R^B3)-C(O)O-, -C(O)-N(R^B3)-, -N(R^B3)C(O)N(R^B3)-, -N(R^B3)C(NR^B3)N(R^B3)-, -SO-, -S-, -SO₂-, -S(O)₂N(R^B3)- 또는 -N(R^B3)SO₂-이고, 여기서, 각각의 R^B3은 독립적으로 수소 또는 메틸로부터 선택되고;

Z²는 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^B4R^B5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^B4　및 R^B5는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고; 단, n=1이고 T₁과 T₂가 서로 상이할 때, R¹과 R²는 모두 H가 아니거나; n=1이고 T₁과 T₂가 서로 상이하고 R¹과 R²　중 하나가 H일 때, R¹과 R²　중 다른 하나는 메틸이 아니거나; n=2이고 R¹과 R²가 각각 H일 때, T₁과 T₂는 모두 -C(O)-이거나 모두 -NH-이다.

일부 실시 형태에서, T₂는 -C(O)-이다.

일부 실시 형태에서, 각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고, 여기서,

Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 수소 또는 (1-2C)알킬이고;

X¹은 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(R^A3)-, -N(R^A3)-C(O)-, -C(O)-N(R^A3)-, -N(R^A3)C(O)N(R^A3)-, -N(R^A3)C(NR^A3)N(R^A3)- 또는 -S-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 또는 메틸이고;

Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^A4R^A5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^A4　및 R^A5는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이다.

Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;

Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 할로 및 하이드록시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환된다.

Y¹은 부재하거나 화학식 -(CR^A1R^A2)_m-의 기이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;

X¹은 부재하거나, -C(O)-, -C(O)O-, -N(R^A3)-C(O)- 또는 -C(O)-N(R^A3)-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 수소 또는 메틸이고;

일부 실시 형태에서, 각각의 R¹은 독립적으로 화학식 -Y¹-X¹-Z¹의 기이고, 여기서,

Y¹은 부재하거나, -(CH₂)- 또는 -(CH₂CH₂)-이고;

X¹은 부재하거나, -N(R^A3)-C(O)- 또는 -C(O)-N(R^A3)-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 또는 메틸이고;

Z¹는 수소 또는 (1-2C)알킬이다.

일부 실시 형태에서, 각각의 R²는 독립적으로 -Y²-Z²이고, 여기서,

Y²는 부재하거나 -(CR^B1R^B2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^B1　및 R^B2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;

Z²는 수소 또는 (1-6C)알킬이다.

일부 실시 형태에서, 각각의 R²는 수소이다.

일부 실시 형태에서, n은 2 또는 3이다. 일부 실시 형태에서, n은 1이다.

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 글루탐산, 석신산 및 감마-아미노부티르산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 상기 링커는 하기 구조를 갖는다:

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 하기 구조를 갖는다:

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 갖는다:

일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 3'-말단에서 상기 링커 또는 펩타이드에 결합되어 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하기 기를 포함한다:

일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하이드록실을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이며, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

그러므로, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단이 글루탐산 잔기를 통해 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 공유적으로 연결되어 있는 상기 또는 본 출원의 다른 곳에서 언급된 각각의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 경우, 상기 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 염은 하기 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다:

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 출원에 기재된 접합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

더 또 다른 양태에서, 본 발명은 DMD 또는 BMD를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 본 출원에 기재된 접합체 또는 본 출원에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 DMD 또는 BMD를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 본 출원에 기재된 조성물을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 DMD을 앓고 있다.

바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 (보다 바람직하게는, 모든 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합이 -P(O)(NMe₂)O-인 모르폴리노)이다.

도 1은 네스티드 (nested) RT-PCR의 밀도 측정 분석에 의해 측정될 때 H2K-mdx 세포에서 0.25 mM, 0.5 mM 및 1 mM의 안티센스 치료제 PMO에 접합된 펩타이드의 일부 DPEP1 시리즈의 시험관내 엑손 23 스키핑 효능을 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=3);
도 2는 네스티드 RT-PCR의 밀도 측정 분석에 의해 측정될 때 H2K-mdx 세포에서 0.25 mM, 0.5 mM 및 1 mM의 안티센스 치료제 PMO에 접합된 펩타이드의 일부 DPEP3 시리즈의 시험관내 엑손 23 스키핑 효능을 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=3);
도 3은 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR로 측정될 때 mdx 마우스에 대한 단일 10 mg/kg 정맥내 투여 후 (A) 전경골근, (B) 횡격막 및 (C) 심근에서 안티센스 치료제 PMO에 접합된 펩타이드의 일부 DPEP1 시리즈의 생체내 효능을 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=3);
도 4는 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR로 측정될 때 mdx 마우스에 대한 단일 10 mg/kg 정맥내 투여 후 (A) 전경골근, (B) 횡격막 및 (C) 심근에서 안티센스 치료제 PMO에 접합된 펩타이드의 일부 DPEP3 시리즈의 생체내 효능을 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=3);
도 5는 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량 투여 후 2 일차 및 7 일차에 C67BL/6 마우스의 소변에서 측정된 상대적 KIM-1 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=6);
도 6은 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량 투여 후 2 일차 및 7 일차에 C67BL/6 마우스의 소변에서 측정된 상대적 NGAL 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=6);
도 7은 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량 투여 후 7 일차에 C67BL/6 마우스에서 측정된 BUN 혈청 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=6);
도 8은 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량 투여 후 7 일차에 C67BL/6 마우스에서 측정된 크레아티닌 혈청 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=6);
도 9는 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량 투여 후 7 일차에 C57BL/6 마우스에서 측정된 (A) 알라닌 트랜스퍼라아제, (B) 알칼리성 포스파타아제 및 (C) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 혈청 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이고 (오차 막대: 표준 편차, n=6);
도 10은 안티센스 치료제 PMO에 접합된 다양한 DPEP 펩타이드의 단일 30 mg/kg 정맥내 투여 후 C57BL/6 마우스의 (A) 전경골근, (B) 횡격막 및 (C) 심장에서 qRT-PCR에 의해 평가된 엑손 23 스키핑의 생체내 효능을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 및 식염수와 비교하여 도시한 것이다.
도 11의 a 및 b는 8~10 주령의 C57BL6 마우스 (n=4~6)에 대한 2.5 내지 50 mg/kg의 상이한 양의 펩타이드-PMO의 단일 용량 투여 후 2 일차 또는 7 일차에 요중 KIM-1 수준을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체와 비교한 평가를 도시한 것이다. KIM-1 수준을 ELISA에 의해 측정하고, 요중 크레아티닌 수준에 대해 정규화하였다. 데이터는 식염수 주사된 마우스 대조군 KIM-1 수준에 대한 배수 변화로서 제시되어 있다 (n=10).
도 12는 8~10 주령의 C57BL6 마우스 (n=3~6)에 대한 2.5~50 mg/kg의 증가하는 양의 단일 용량 투여 후 펩타이드-PMO의 생체내 엑손 스키핑 효능을, 동일한 안티센스 치료제 PMO에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체와 비교한 용량-반응 비교 연구를 도시한 것이다. 엑손 23 제외의 qPCR 분석은 투여 7일 후에 (A) 전경골근, (B) 횡격막 및 (C) 심장에서 평가되었다.
도 13은 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체가 다양한 농도에서 DMPK 유전자 내에 2600개의 반복부를 갖는 DM 1 환자로부터 유래된 DM 1 환자 근모세포에서 시험관내 Mbnl1 전사물의 스플라이싱 결함을 교정하는 것을 도시한 것이고 (n=1~3);
도 14는 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체가 다양한 농도에서 DMPK 유전자 내에 2600개의 반복부를 갖는 DM 1 환자로부터 유래된 DM 1 환자 근모세포에서 시험관내 DMD 전사물의 스플라이싱 결함을 교정하는 것을 도시한 것이고 (오차 막대: 평균 ± SEM, n=1~3);
도 15는 표준 곡선 내에 맞도록 희석된 샘플로 ELISA에 의해 측정된 C57BL6 암컷 마우스에 대한 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 주사 후 2 일차 및 7 일차에 소변에서 평가된 상대적 KIM-1 수준을 도시한 것이다. 값을 요중 크레아티닌 수준에 대해 정규화하여 요중 단백질 농도를 설명하였다. KIM-1 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다 (오차 막대: 평균 ± SEM, n=4~10).
도 16은 표준 곡선 내에 맞도록 희석된 샘플로 ELISA에 의해 측정된 C57BL6 암컷 마우스에서 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 주사 후 2 일차 및 7 일차에 소변에서 측정된 상대적 NGAL 수준을 도시한 것이다. 값을 요중 크레아티닌 수준에 대해 정규화하여 요중 단백질 농도를 설명하였다. NGAL 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다 (오차 막대: 평균 ± SEM, n=4~10).
도 17은 C57BL6 암컷 마우스에서 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 주사 후 7 일차에 혈청에서 평가된 BUN 수준을 식염수와 비교하여 도시한 것이다. BUN 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다 (오차 막대: 평균 ± SEM, n=4~10).
도 18은 C57BL6 암컷 마우스에서 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 주사 후 7 일차에 혈청에서 평가된 크레아티닌 수준을 식염수와 비교하여 도시한 것이다. 크레아티닌 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다 (오차 막대: 평균 ± SEM, n=4~10).
도 19는 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 볼루스 IV (꼬리 정맥) 주사에 의해 투여된 C57BL6 암컷 마우스 유래의 혈청에서 주사 후 7일차에 수집물에서 평가된 (A) 알라닌 트랜스퍼라아제 (ALT), (B) 알칼리성 포스파타아제 (ALP) 및 (C) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST) 수준을 식염수와 비교하여 도시한 것이다. ALP, ALT, AST 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다.
도 20은 상이한 링커를 통해 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 DPEP3.1 펩타이드 30 mg/kg의 단일 용량의 투여 후 2 일차 및 7 일차에 C57BL/6 마우스의 소변에서 측정된 요중 크레아티닌으로 정규화된 요중 신장 손상 마커-1 (kidney-injury marker-1: KIM-1)의 상대적 수준을, 0.9% 식염수 대조군 및 동일한 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 (R6Gly- 및 Pip9b2-)와 비교하여 도시한 것이다 (오차 막대: SEM을 갖는 평균, n= 3~10).
도 21은 C57BL/6 마우스에서 단일 30 mg/kg 정맥내 볼루스 투여 후 전경골근 (도 21a), 횡격막 (도 21b) 및 심장 근육 (도 21c)에서 다양한 링커를 통해 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 DPEP3.1 펩타이드의 생체내 효능을 도시한 것이다. 디스트로핀 (엑손 23)의 엑손 스키핑에 대한 효능을 qPCR에 의해 투여 후 7 일차에 측정하였다. 엑손 스키핑 효능은 0.9% 식염수 대조군 및 동일한 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 (R6Gly- 및 Pip9b2-)와의 비교에 사용되었다. DPEP3.1 d-PMO^DMD의 이상 값 (outlier)은 주사 누락을 시사한다 (오류 막대: SEM을 갖는 평균, n=3~10).
도 22은 상이한 링커를 통해 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 DPEP1.9 펩타이드 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 50 mg/kg의 단일 용량의 투여 후 2 일차 및 7 일차에 C57BL/6 마우스의 소변에서 측정된 요중 크레아티닌으로 정규화된 요중 신장 손상 마커-1 (kidney-injury marker-1: KIM-1)의 상대적 수준을, 0.9% 식염수 대조군 및 동일한 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 (R6Gly- 및 Pip9b2-)와 비교하여 도시한 것이다 (오차 막대: SEM을 갖는 평균, n= 3~10).
도 23은 C57BL/6 마우스에서 단일 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 50 mg/kg 정맥내 볼루스 투여 후 전경골근 (도 23a), 횡격막 (도 23b) 및 심장 근육 (도 23c)에서 다양한 링커를 통해 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 DPEP1.9 펩타이드의 생체내 효능을 도시한 것이다. 디스트로핀 (엑손 23)의 엑손 스키핑에 대한 효능을 qPCR에 의해 투여 후 7 일차에 측정하였다. 엑손 스키핑 효능은 0.9% 식염수 대조군 및 동일한 치료제 안티센스 PMO^DMD에 접합된 현재 이용 가능한 펩타이드 담체 (R6Gly- 및 Pip9b2-)와의 비교에 사용되었다 (오차 막대: SEM을 갖는 평균, n= 3~10).
도 24 및 도 25는 다양한 농도에서 링커 a, b 및 d를 사용하는 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ 접합체가 DMPK 유전자에 2600개의 CTG 반복부를 갖는 DM1 환자로부터 유래된 DM1 환자 근모세포에서 MbnH 의존적 전사물의 스플라이싱 결함을 교정하였음을 도시한 것이고;
도 26은 다양한 농도에서 링커 a, b 및 d를 사용하는 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체가 다양한 농도에서 DMPK 유전자에 2600개의 반복부를 갖는 DM1 환자로부터 유래된 DM1 환자 근모세포에서 시험관내 DMD 전사물의 스플라이싱 결함을 교정한다는 것을 도시한 것이고;
도 27은 링커 a, b 및 d를 사용하는 다양한 용량의 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ 접합체로 48 시간 동안 형질 감염된 2600개의 CTG 반복부를 갖는 DM1 환자 근모세포의 근모세포 세포 생존율 퍼센트를 도시한 것이다. 접합체의 농도는 세포 사멸을 유발하지 않고 치료학적 수준보다 몇 배 증가될 수 있다.
도 28은 링커 a, b 및 d를 사용하는 40 uM의 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ 접합체로 형질 감염된 간세포 세포 생존율 퍼센트를 도시한 것이다. 접합체의 농도는 Pip6a 접합체와는 반대로 세포 사멸을 유발하지 않고 치료학적 수준보다 몇 배 증가될 수 있다.
도 29 및 도 30은 표준 곡선 내에 맞도록 희석된 샘플로 ELISA (R&D cat# MKM100)에 의해 측정된 C57BL6 암컷 마우스에 대한 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇ PMO 접합체의 주사 후 2 일차 및 7 일차의 소변 독성 마커를 도시한 것이다. 값을 요중 크레아티닌 수준 (Harwell)에 대해 정규화하여 요중 단백질 농도를 설명하였다. KIM-1 수준은 펩타이드 담체의 종래 Pip 시리즈에 의해 유도된 배수 증가와 비교하여 식염수 대조군 주사와 유사하였다.
도 31 및 도 32는 상이한 링커를 갖는 상이한 DPEP1/3-[CAG]₇　PMO 접합체의 볼루스 IV (꼬리 정맥) 주사로 투여된 C57BL6 암컷 마우스 (8~10 주령, 그룹 당 n=5) 유래의 혈청에서 평가된 독성 마커를 도시한 것이다. 주사 후 7 일차에, 혈청 수집물을 식염수와 비교하였다. 모든 수준은 주사 후 7 일차에 식염수 대조군 주사와 유사하였다.
도 33은 접합체 처리된 동물에서 주요 골격, 심장, 평활근 및 중추 신경계 조직 중의 생체 분포를 입증하는 플롯이다. 주요 근육 조직은 도달하기 어려운 심장 조직을 포함한다. 플롯은 또한 접합체가 혈뇌 장벽을 가로질러 전달된다는 것을 입증한다.
도 34는 골격 및 심장 근육 조직에서 엑손 51 스키핑 효능을 입증하는 플롯이다. TA는 전경골근이고 DIAPH는 횡격막이다.

정의

전체에 걸쳐 "X"에 대한 언급은 6-아미노헥산산과 같은 아미노산 아미노헥산산의 임의의 형태를 나타낸다.

전체에 걸쳐 "B"에 대한 언급은 아미노산 베타-알라닌을 나타낸다.

전체에 걸쳐 "[Hyp]"에 대한 언급은 아미노산 하이드록시프롤린을 나타낸다.

전체에 걸쳐 "Ac"에 대한 언급은 아세틸기 (CH₃-C(O)-)를 나타낸다.

전체에 걸쳐 기타 대문자에 대한 언급은 허용된 알파벳 아미노산 코드에 따른 관련 유전자 인코딩된 아미노산 잔기를 나타낸다.

본 출원에 사용되는 "알킬"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는다면, 총 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기 (예를 들어, (1-6C)알킬, (1-4C)알킬, (1-3C)알킬 또는 (1-2C)알킬)를 지칭한다. 알킬의 비제한적인 예는 메틸, 에틸, 1-메틸에틸, 프로필, 1-메틸부틸, 1-에틸부틸 등을 포함한다. "프로필"과 같은 개별 알킬기에 대한 언급은 직쇄 버전에만 특정되며, "이소프로필"과 같은 개별 분지쇄 알킬기에 대한 언급은 분지쇄 버전에만 특정된다.

본 출원에 사용되는 "알케닐"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는다면, 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 총 2 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방족기 (예를 들어, (2-6C)알케닐, (2-4C)알케닐 또는 (2-3C)알케닐)를 지칭한다. 알케닐의 비제한적인 예는 비닐, 알릴, 호모알릴, 이소프레닐 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는다면, 알케닐은 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 옥소, 할로겐 및 하이드록실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본 출원에 사용되는 "알키닐"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는다면, 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하고 총 2 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방족기 (예를 들어, (2-6C)알키닐), (2-4C)알키닐 또는 (2-3C)알키닐)를 지칭한다. 알키닐의 비제한적인 예는 에티닐, 프로파길, 호모프로파길, 부트-2-인-1-일, 2-메틸-프로프-2-인-1-일 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는다면, 알키닐은 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 옥소, 할로겐 및 하이드록실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

아미노산 "잔기"라는 용어는 1개의 N-H 결합이 원자가(valency)로 대체되고 1개의 카복실 C-O 결합이 원자가로 대체되는 아미노산인 2가 기를 지칭한다. N-H 결합 또는 카복실 C-O 결합은, 예를 들어, 측쇄 상에 있을 수 있다.

"아르기닌 풍부 (arginine rich)"는 상기 양이온성 도메인 중 적어도 40%가 아르기닌 잔기로 형성되어 있음을 의미한다.

본 출원에 사용되는 "인공 아미노산"이라는 용어는 비생물성 (abiogenic) (예를 들어, 비-단백질 생성성 (non-proteinogenic)) 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 인공 아미노산은 합성 아미노산, 변형된 아미노산 (예를 들어, 당으로 변형된 것), 비-천연 아미노산, 인조 아미노산, 스페이서 및 비-펩타이드 결합된 스페이서를 포함할 수 있다. 합성 아미노산은 사람에 의해 화학적으로 합성된 것들일 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 아미노헥산산 (X)은 본 발명의 맥락에서 인공 아미노산이다. 의심의 여지를 없애기 위해, 베타-알라닌 (B) 및 하이드록시프롤린 (Hyp)은 자연에서 발생하므로, 본 발명의 맥락에서 인공 아미노산이 아니라 천연 아미노산이다. 인공 아미노산은, 예를 들어, 6-아미노헥산산 (X), 테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산 (TIC), 1-(아미노)사이클로헥산카복실산 (Cy) 및 3-아제티딘-카복실산 (Az), 11-아미노운데칸산을 포함할 수 있다.

본 출원에 사용되는 "아릴"이라는 용어는 1, 2 또는 3개의 환을 함유하고 이 중 적어도 1개가 방향족인 카보사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 비치환된 아릴은 총 6 내지 14개의 탄소 원자를 함유한다. 아릴이라는 용어는 1가 종과 2가 종을 모두 포함한다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 인다닐 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 특별한 실시 형태에서, 임의로 치환된 아릴은 임의로 치환된 페닐이다.

본 출원에서 사용되는 "브릿지된 환 시스템"은 2개의 환이 2개 초과의 원자를 공유하는 환 시스템을 의미하며, 예를 들어, 문헌 [Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4^th　Edition, Wiley Interscience, pages 131 -133, 1992]을 참조한다. 브릿지된 헤테로사이클릴 환 시스템의 예는 아자-바이사이클로[2.2.1]헵탄, 2-옥사-5-아자바이사이클로[2.2.1]헵탄, 아자-바이사이클로[2.2.2]옥탄, 아자-바이사이클로[3.2.1]옥탄, 퀴누클리딘 등을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "카보닐"이라는 용어는 -C(O)- 구조의 기를 지칭한다. 카보닐기의 비제한적인 예는, 예를 들어, 아세톤, 에틸 아세테이트, 단백질 생성성 아미노산, 아세트아미드 등에서 발견되는 것들을 포함한다.

본 출원에서 "양이온성"에 대한 언급은 생리학적 pH에서 전체 양전하를 갖는 아미노산 또는 아미노산의 도메인을 나타낸다.

단독으로 또는 접두사로 사용되는 "(m-nC)" 또는 "(m-nC) 기"라는 용어는, 비치환될 때, 총 m 내지 n개의 탄소 원자를 갖는 기를 지칭한다.

핵 염기 서열과 관련하여 본 출원에 사용되는 "상보적인"이라는 용어는, 핵 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또 다른 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산에 하이브리드화되어 생리학적 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성할 수 있도록 하는 연속 핵 염기의 패턴을 갖는 핵 염기 서열을 지칭한다. 상보적 서열은 천연 및/또는 변형된 핵 염기로부터 형성된 왓슨-크릭 염기 쌍을 포함한다. 상보적 서열은 또한 워블(wobble) 염기 쌍 (구아노신-우라실, 하이포크산틴-우라실, 하이포크산틴-아데닌 및 하이포크산틴-사이토신) 및 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍과 같은 비-왓슨-크릭 염기 쌍을 포함할 수 있다.

본 출원에 사용되는 "사이클로알킬"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는다면, 1 또는 2개의 환을 함유하고 총 3 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 포화 카보사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 2환 사이클로알킬은 융합 환 시스템 (2개의 교두보 탄소 원자가 서로 직접 결합됨), 브릿지된 환 시스템 (2개의 교두보 탄소 원자가 적어도 1개의 탄소 원자를 함유하는 공유 링커를 통해 서로 연결됨) 및 스피로 환 시스템 (2개의 환이 동일한 탄소 원자에서 융합됨)으로 배열될 수 있다. 사이클로알킬의 비제한적인 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 바이사이클로[2.2.1]헵틸 등을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "사이클로알케닐"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는다면, 1 또는 2개의 환을 함유하고; 1, 2 또는 3개의 엔도사이클릭 이중 결합을 함유하고; 3 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 비방향족, 불포화, 카보사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 2환 사이클로알케닐은 융합 환 시스템 (2개의 교두보 탄소 원자가 서로 직접 결합됨), 브릿지된 환 시스템 (2개의 교두보 탄소 원자가 적어도 1개의 탄소 원자를 함유하는 공유 링커를 통해 서로 연결됨) 및 스피로 환 시스템 (2개의 환이 동일한 탄소 원자에서 융합됨)으로 배열될 수 있다. 사이클로알케닐의 비제한적인 예는 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헵테닐, 3-사이클로헥센-1-일, 사이클로옥테닐 등을 포함한다.

"디스트로핀"은 막대 형상의 세포질 단백질이며, 세포막을 통해 근 섬유의 세포 골격을 주위 세포외 매트릭스에 연결하는 단백질 복합체의 필수 부분이다. 디스트로핀은 여러 기능성 도메인을 포함한다. 예를 들어, 디스트로핀은 약 아미노산 14~240에 액틴 결합 도메인과 약 아미노산 253~3040에 중앙 막대 도메인을 포함한다. 이러한 큰 중앙 도메인은 알파-액티닌 및 스펙트린과 상동성을 갖는 약 109개의 아미노산의 24개 스펙트린 유사 삼중 나선 요소에 의해 형성된다. 반복부는 전형적으로는 힌지 영역으로도 또한 지칭되는 4개의 프롤린 풍부 비반복 분절에 의해 중단된다. 반복부 15 및 16은 디스트로핀의 단백질 가수분해 절단을 위한 주요 부위를 제공하는 것으로 보이는 18개 아미노산 스트레치(stretch)에 의해 분리된다. 대부분의 반복부들 사이의 서열 동일성은 10~25%의 범위이다. 하나의 반복부는 3개의 알파-나선 1, 2 및 3을 포함한다. 알파-나선 1과 3은, 아마도 소수성 계면을 통해 코일형 코일 (coiled-coil)로서 상호 작용하는 7개의 나선 턴 (turn)에 의해 각각 형성된다. 알파-나선 2는 보다 복잡한 구조를 가지며, 글리신 또는 프롤린 잔기에 의해 분리된 4 및 3개의 나선 턴의 분절에 의해 형성된다. 각각의 반복부는 전형적으로는 알파-나선 2의 첫 부분에 있는 아미노산 47과 48 사이의 인트론에 의해 중단된 2개의 엑손에 의해 인코딩된다. 다른 인트론은 일반적으로는 나선-3 위에 흩어져 있는 반복부의 다른 위치에서 발견된다. 디스트로핀은 또한 점균류 (딕티오스텔리움 디스코이데움 (Dictyostelium discoideum)) 알파-액티닌의 C-말단 도메인과 상동성을 나타내는 시스테인 풍부 분절 (즉, 280개 아미노산 중의 15개 시스테인)을 비롯하여 약 아미노산 3080~3360에 시스테인 풍부 도메인을 포함한다. 카복시-말단 도메인은 약 아미노산 3361~3685에 있다.

디스트로핀의 아미노-말단은 F-액틴에 결합하며, 카복시-말단은 근형질막에서 디스트로핀 연관 단백질 복합체 (dystrophin-associated protein complex: DAPC)에 결합한다. DAPC는 디스트로글리칸, 사르코글리칸, 인테그린 및 카베올린을 포함하며, 이러한 구성 요소들 중 임의의 구성 요소의 돌연변이는 상염색체 유전성 근 이영양증을 유발한다. DAPC는 디스트로핀 부재시에 불안정해지며, 이는 구성원 단백질의 수준 감소를 초래하고 결국 진행성 섬유 손상과 막 누출을 초래한다. 뒤시엔느 근 이영양증 (DMD) 및 베커 근 이영양증 (Becker's muscular dystrophy: BMD)과 같은 다양한 형태의 근 이영양증에서, 근육 세포는 주로 부정확한 스플라이싱을 초래하는 유전자 서열의 돌연변이로 인해 변경 및 기능적 결함 형태의 디스트로핀을 생산하거나 디스트로핀을 전혀 생산하지 않는다. 결함 디스트로핀 단백질의 우세한 발현, 또는 디스트로핀 또는 디스트로핀 유사 단백질의 완전한 결핍은 상기에서 언급된 바와 같이 근육 퇴행의 급속한 진행을 초래한다. 이와 관련하여, "결함" 디스트로핀 단백질은 당해 분야에 공지된 바와 같이 DMD 또는 BMD를 앓고 있는 특정 대상체에서 생산되는 디스트로핀의 형태, 또는 검출 가능한 디스트로핀의 부재를 특징으로 할 수 있다.

"엑손"은 단백질을 인코딩하는 핵산의 정의된 절편, 또는 예비 가공된 (또는 전구체) RNA의 일부가 스플라이싱에 의해 제거된 후 RNA 분자의 성숙 형태로 표시되는 핵산 서열을 지칭한다. 성숙 RNA 분자는 전령 RNA (mRNA)이거나 rRNA 또는 tRNA와 같은 비-코딩 RNA의 기능적 형태일 수 있다. 사람 디스트로핀 유전자는 약 75개의 엑손을 갖는다.

"엑손 스키핑"은, 전체 엑손 또는 이의 일부가 주어진 예비 가공된 RNA로부터 제거되어 성숙 RNA, 예를 들어, 단백질로 번역되는 성숙 mRNA의 존재가 제외되는 과정을 일반적으로 지칭한다. 따라서, 스키핑된 엑손에 의해 인코딩되는 단백질 부분은 발현된 단백질 형태에 존재하지 않으며, 전형적으로 여전히 기능적이긴 하지만 변경된 형태의 단백질을 생성한다. 특정 실시 형태에서, 스키핑되는 엑손은 비정상적 스플라이싱을 유발하는 이의 서열 내의 돌연변이 또는 다른 변경을 포함할 수 있는 사람 디스트로핀 유전자의 비정상적 엑손이다. 특정 실시 형태에서, 스키핑되는 엑손은 사람 디스트로핀 유전자의 엑손 45, 51 및/또는 53이다.

본 출원에 사용되는 "할로" 또는 "할로게노"라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 지칭한다.

"히스티딘 풍부"는 상기 양이온성 도메인 중 적어도 40%가 히스티딘 잔기로 형성되어 있음을 의미한다.

본 출원에서 상호 교환적으로 사용되는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"이라는 용어는 1, 2 또는 3개의 환을 함유하고 이 중 적어도 1개가 방향족이고 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개 (예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 헤테로원자를 함유하는 환 시스템을 지칭한다. 비치환된 헤테로아릴기는 총 1 내지 9개의 탄소 원자를 함유한다. 헤테로아릴이라는 용어는 1가 종과 2가 종을 모두 포함한다. 헤테로아릴기의 예는 5 내지 12개의 환 구성원, 보다 일반적으로는 5 내지 10개의 환 구성원을 함유하는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 기이다. 헤테로아릴기는, 예를 들어, 5원 또는 6원 모노사이클릭 환 또는 9원 또는 10원 바이사이클릭 환, 예를 들어, 융합된 5원 및 6원 환 또는 2개의 융합된 6원 환으로부터 형성된 바이사이클릭 구조일 수 있다. 각각의 환은 전형적으로 질소, 황 및 산소로부터 선택된 약 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 헤테로아릴 환은 전형적으로는 3개 이하의 헤테로원자, 보다 일반적으로는 2개 이하, 예를 들어, 단일 헤테로원자를 함유할 것이다. 일부 실시 형태에서, 헤테로아릴 환은 적어도 1개의 환 질소 원자를 함유한다. 헤테로아릴 환 중의 질소 원자는 이미다졸 또는 피리딘의 경우와 같이 염기성이거나 인돌 또는 피롤 질소의 경우와 같이 본질적으로 비염기성일 수 있다. 일반적으로, 환의 임의의 아미노기 치환기를 비롯하여 헤테로아릴기에 존재하는 염기성 질소 원자의 수는 5개 미만일 것이다.

헤테로아릴의 예는 푸릴, 피롤릴, 티에닐, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 1,3,5-트리아제닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조옥사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아졸릴, 인다졸릴, 퓨리닐, 벤조푸라자닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 나프티리디닐, 카바졸릴, 페나지닐, 벤즈이소퀴놀리닐, 피리도피라지닐, 티에노[2,3-b]푸라닐, 2H-푸로[3,2-b]-피라닐, 5H-피리도[2,3-d]-o-옥사지닐, 1H-피라졸로[4,3-d ]-옥사졸릴, 4H-이미다조[4,5-d]티아졸릴, 피라지노[2,3-d]피리다지닐, 이미다조[2,1-b]티아졸릴 및 이미다조[1,2-b][1,2,4]트리아지닐을 포함한다. "헤테로아릴"은, 적어도 1개의 환이 방향족 환이고 다른 환(들) 중 1개 이상이 비방향족, 포화 또는 부분 포화 환이고, 단, 적어도 1개의 환이 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 함유하는 부분 방향족 바이사이클릭 또는 폴리사이클릭 환 시스템을 또한 포함한다. 부분 방향족 헤테로아릴기의 예는, 예를 들어, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 2-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀리닐, 디하이드로벤조티에닐, 디하이드로벤조푸라닐, 2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥시닐, 벤조[1,3]디옥솔릴, 2,2-디옥소-1,3-디하이드로-2-벤조티에닐, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조푸라닐, 인돌리닐, 1,2,3,4-테트라하이드로-1,8-나프티리디닐, 1,2,3,4-테트라하이드로피리도[ 2,3-b]피라지닐 및 3,4-디하이드로-2W-피리도[3,2-b][1,4]옥사지닐을 포함한다. 5원 헤테로아릴기의 예는 피롤릴, 푸라닐, 티에닐, 이미다졸릴, 푸라자닐, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사트리아졸릴, 이소옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴 및 테트라졸릴 기를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 6원 헤테로아릴기의 예는 피리딜, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐 및 트리아지닐을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바이사이클릭 헤테로아릴기는, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 벤젠 환; 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 피리딘 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 피리미딘 환; 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 피롤 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 피라졸 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 피라진 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 이미다졸 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 옥사졸 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 이소옥사졸 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 티아졸 환; 1 또는 2개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 이소티아졸 환; 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 티오펜 환; 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 환에 융합된 푸란 환; 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로방향족 환에 융합된 사이클로헥실 환; 및 1, 2 또는 3개의 환 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원 헤테로방향족 환에 융합된 사이클로펜틸 환으로부터 선택된 기일 수 있다. 5원 환에 융합된 6원 환을 함유하는 바이사이클릭 헤테로아릴기의 특별한 예는 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤즈이소옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 이소벤조푸라닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퓨리닐 (예를 들어, 아데니닐, 구아니닐), 인다졸릴, 벤조디옥솔릴 및 피라졸로피리디닐 기를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 2개의 융합된 6원 환을 함유하는 바이사이클릭 헤테로아릴기의 특별한 예는 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 크로마닐, 티오크로마닐, 크로메닐, 이소크로메닐, 크로마닐, 이소크로마닐, 벤조디옥사닐, 퀴놀리지닐, 벤조옥사지닐, 벤조디아지닐, 피리도피리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐 기를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에 사용되는 "헤테로사이클릴"이라는 용어는 1, 2 또는 3개의 환을 함유하고 이 중 적어도 1개가 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개 (예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 헤테로원자를 함유하고, 단, 환 시스템은 엔도사이클릭 헤테로원자를 또한 포함하는 방향족 환을 함유하지 않는 환 시스템을 지칭한다. 비치환된 헤테로사이클릴기는 총 2 내지 9개의 탄소 원자를 함유한다. 헤테로사이클릴이라는 용어는 1가 종과 2가 종을 모두 포함한다. 헤테로사이클릴의 예는 5 내지 12개의 환 구성원, 보다 일반적으로는 5 내지 10개의 환 구성원을 함유하는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 기이다. 헤테로사이클릴기는, 예를 들어, 5원 또는 6원 모노사이클릭 환 또는 9원 또는 10원 바이사이클릭 환, 예를 들어, 융합된 5원 및 6원 환 또는 2개의 융합된 6원 환으로부터 형성된 바이사이클릭 구조일 수 있다. 각각의 환은 전형적으로 질소, 황 및 산소로부터 선택된 약 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 헤테로사이클릴 기의 비제한적 예는, 예를 들어, 피롤리딘, 피페라진, 피페리딘, 아제판, 1,4-디아제판, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 옥세판, 1,4-디옥세판, 테트라하이드로티오펜, 테트라하이드로티오피란, 인돌린, 벤조피롤리딘, 2,3-디하이드로벤조푸란, 프탈란, 이소크로만 및 2,3-디하이드로벤조티오펜을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "뉴클레오사이드간 결합"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 내의 인접한 뉴클레오사이드 사이에 공유 결합을 형성하는 기 또는 결합을 나타낸다. 뉴클레오사이드간 결합은 비변형된 뉴클레오사이드간 결합 또는 변형된 뉴클레오사이드간 결합이다. "비변형된 뉴클레오사이드간 결합"은 포스페이트 (-O-P(O)(OH)-O-) 뉴클레오사이드간 결합 ("포스페이트 포스포디에스테르")이다. "변형된 뉴클레오사이드간 결합"은 포스페이트 포스포디에스테르 이외의 뉴클레오사이드간 결합이다. 변형된 뉴클레오사이드간 결합의 두 가지 주요 클래스는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 인 함유 뉴클레오사이드간 결합의 비제한적인 예는 포스포디에스테르 결합, 포스포트리에스테르 결합, 포스포로티오에이트 디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합, 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합, 메틸포스포네이트 및 포스포르아미데이트를 포함한다. 비-인 뉴클레오사이드간 결합의 비제한적인 예는 메틸렌메틸이미노 (―CH₂―N(CH₃)―O―CH₂―), 티오디에스테르 (―O―C(O)―S―), 티오노카바메이트 (―O―C(O)(NH)―S―), 실록산 (―O―Si(H)₂―O―) 및 N,N'-디메틸하이드라진 (―CH₂―N(CH₃)―N(CH₃)―)을 포함한다. 포스포로티오에이트 결합은 비-브릿지된 산소 원자 중 하나가 황 원자로 대체된 포스포디에스테르 결합 및 포스포트리에스테르 결합이다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오사이드간 결합은 하기 구조의 기이다:

여기서,

Z는 O, S 또는 Se이고;

Y는 -X-L-R¹이고;

각각의 X는 독립적으로 -O-, -S-, -N(-L-R¹)- 또는 L이고;

각각의 L은 독립적으로 공유 결합 또는 링커 (예를 들어, 임의로 치환된 C_1-60 지방족 링커 또는 임의로 치환된 C_2-60 헤테로지방족 링커)이고;

각각의 R¹은 독립적으로 수소, -S-S-R², -O-CO-R², -S-CO-R², 임의로 치환된 C_1-9 헤테로사이클릴 또는 소수성 모이어티 (moiety)이고;

각각의 R²는 독립적으로 임의로 치환된 C_1-10 알킬, 임의로 치환된 C_2-10 헤테로알킬, 임의로 치환된 C_6-10 아릴, 임의로 치환된 C_6-10 아릴 C_1-6 알킬, 임의로 치환된 C_1-9 헤테로사이클릴 또는 임의로 치환된 C_1-9 헤테로사이클릴 C_1-6 알킬이다.

L이 공유 결합이고 R¹이 수소이고 Z가 산소이고 모든 X 기가 -O-일 때, 뉴클레오사이드간 기는 포스페이트 포스포디에스테르로 공지되어 있다. L이 공유 결합이고 R¹이 수소이고 Z가 황이고 모든 X 기가 -O-일 때, 뉴클레오사이드간 기는 포스포로티오에이트 디에스테르로 공지되어 있다. Z가 산소이고 모든 X 기가 -O-이고 (1) L이 링커이거나 (2) R¹이 수소가 아닐 때, 뉴클레오사이드간 기는 포스포트리에스테르로 공지되어 있다. Z가 황이고 모든 X 기가 -O-이고 (1) L이 링커이거나 (2) R¹이 수소가 아닐 때, 뉴클레오사이드간 기는 포스포로티오에이트 트리에스테르로 공지되어 있다. 포스포로티오에이트 트리에스테르 결합 및 포스포트리에스테르 결합의 비제한적인 예는 미국 출원공개 US 2017/0037399에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 본 출원에 참조로서 포함된다.

"인트론"은 단백질로 번역되지 않는 핵산 영역 (유전자 내)을 지칭한다. 인트론은 전구체 mRNA (pre-mRNA)로 전사된 후 성숙 RNA의 형성 동안 스플라이싱에 의해 제거되는 비-코딩 절편이다.

올리고뉴클레오타이드의 클래스와 관련하여 본 출원에 사용되는 "모르폴리노"라는 용어는 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합에 의해 상호 연결된 적어도 10개의 모르폴리노 단량체 단위의 올리고머를 나타낸다. 모르폴리노는 5' 기와 3' 기를 포함한다. 예를 들어, 모르폴리노는 하기 구조를 가질 수 있다:

여기서,

n은 모르폴리노 서브유닛 및 관련 L 기의 수를 나타내는 적어도 10의 정수 (예를 들어, 12 내지 30)이고;

각각의 B는 독립적으로 핵 염기이고;

R¹은 5' 기이고 (R¹은 본 출원에서 5'-말단으로 지칭될 수 있음);

R²는 3' 기이고 (R²는 본 출원에서 3'-말단으로 지칭될 수 있음);

L은 (i) 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합이거나, (ii) L이 R²에 부착된 경우, 공유 결합이다.

모르폴리노의 5' 기는, 예를 들어, 하이드록실, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디포스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 펩타이드에 대한 결합, 펩타이드/링커 조합에 대한 결합, 엔도솜 탈출 모이어티 (endosomal escape moiety), 중성 유기 중합체 또는 하기 구조의 기일 수 있다:

또는

바람직한 5' 기는 하이드록실 및 하기 구조의 기이다:

또는

보다 바람직한 5' 기는 하기 구조를 갖는다:

모르폴리노의 3' 기는, 예를 들어, 수소, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디포스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 펩타이드에 대한 결합, 펩타이드/링커 조합에 대한 결합, 엔도솜 탈출 모이어티, 중성 유기 중합체 또는 하기 구조의 기일 수 있다:

또는

모르폴리노인 올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 결합되거나 연결된 펩타이드의 접합체에서, 바람직한 3' 기는 펩타이드에 대한 결합 또는 펩타이드/링커 조합에 대한 결합이다.

본 출원에 사용되는 "모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합"이라는 용어는 하기 구조의 2가 기를 나타낸다:

여기서,

Z는 O 또는 S이고;

X¹은 결합, -CH₂- 또는 -O-이고;

X²는 결합, -CH₂-O- 또는 -O-이고;

Y는 -NR₂이고, 여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C_1-6 알킬 (예를 들어, 메틸)이거나 두 R 모두는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 조합하여 C_2-9 헤테로사이클릴 (예를 들어, N-피페라지닐)을 형성하고;

단, X¹과 X² 모두는 동시에 결합이 아니다.

본 출원에 사용되는 "모르폴리노 서브유닛"이라는 용어는 하기 구조를 지칭한다:

여기서, B는 핵 염기이다.

본 출원에서 사용되는 "핵 염기"라는 용어는 뉴클레오사이드의 리보푸라노오스/2'-데옥시리보푸라노오스의 1' 위치에서 발견된 질소 함유 헤테로 사이클릭 환을 나타낸다. 핵 염기는 비변형 또는 변형된다. 본 출원에서 사용되는 "비변형된" 또는 "천연" 핵 염기는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵 염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 알킬 또는 알키닐 치환된 피리미딘, 알킬 치환된 퓨린, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 뿐만 아니라, 합성 및 천연 핵 염기, 예를 들어, 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-알킬 (예를 들어, 6-메틸) 아데닌 및 구아닌, 2-알킬 (예를 들어, 2-프로필) 아데닌 및 구아닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오사이토신, 5-할로우라실, 5-할로사이토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 사이토신, 5-트리플루오로메틸 우라실, 5-트리플루오로메틸 사이토신, 7-메틸 구아닌, 7-메틸 아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 특정 핵 염기는 핵산, 예를 들어, 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; N2-, N6- 및/또는 O6-치환된 퓨린의 결합 친화도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 핵산 듀플렉스 안정성은, 예를 들어, 5-메틸사이토신을 사용하여 증진될 수 있다. 핵 염기의 비제한적인 예는 2-아미노프로필아데닌, 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-N-메틸구아닌, 6-N-메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-프로피닐 (―C≡C―CH₃) 우라실, 5-프로피닐사이토신, 6-아조우라실, 6-아조사이토신, 6-아조티민, 5-리보실우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실, 8-아자 및 기타 8-치환된 퓨린, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 5-할로우라실 및 5-할로사이토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 2-N-이소부티릴구아닌, 4-N-벤조일사이토신, 4-N-벤조일우라실, 5-메틸 4-N-벤조일사이토신, 5-메틸 4-N-벤조일우라실, 유니버셜 염기, 소수성 염기, 뒤섞인 염기 (promiscuous base), 크기-확장된 염기 및 불소화 염기를 포함한다. 추가의 변형된 핵 염기는 1,3-디아자페녹사진-2-온, 1,3-디아자페노티아진-2-온 및 9-(2-아미노에톡시)-1,3-디아자페녹사진-2-온 (G-클램프)과 같은 트리사이클릭 피리미딘을 포함한다. 변형된 핵 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 2-아미노피리딘 또는 2-피리돈으로 대체된 것들을 또한 포함할 수 있다. 추가의 핵 염기는 Merigan 등의 미국 특허 US 3,687,808에 개시된 것들, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859]; [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]; [Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288]에 개시된 것들; 및 문헌 [Chapters 6 and 15, Antisense Drug Technology, Crooke S. T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 and 442-443]에 개시된 것들을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "뉴클레오사이드"라는 용어는 당해 분야에 공지된 당-핵 염기 화합물 및 기 뿐만 아니라, 당해 분야에 공지된 변형 또는 비변형된 2'-데옥시리보푸라노오스-핵 염기 화합물 및 기를 나타낸다. 당은 리보푸라노오스일 수 있다. 당은 변형 또는 비변형될 수 있다. 비변형된 리보푸라노오스-핵 염기는 비변형된 핵 염기에 대한 아노머 탄소 결합을 갖는 리보푸라노오스이다. 비변형된 리보푸라노오스-핵 염기는 아데노신, 사이티딘, 구아노신 및 우리딘이다. 비변형된 2'-데옥시리보푸라노오스-핵 염기 화합물은 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시사이티딘, 2'-데옥시구아노신 및 티미딘이다. 변형된 화합물 및 기는 본 출원에 기재된 핵 염기 변형 및 당 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 변형을 포함한다. 핵 염기 변형은 비변형된 핵 염기를 변형된 핵 염기로 대체하는 것이다. 당 변형은, 예를 들어, 2'-치환, 잠금(locking), 카보사이클화 또는 잠금 해제(unlocking)일 수 있다. 2'-치환은 리보푸라노오스의 2'-하이드록실을 2'-플루오로, 2'-메톡시 또는 2'-(2-메톡시)에톡시로 대체하는 것이다. 대안으로, 2'-치환은 하기 구조에 대응하는 2'-(ara) 치환일 수 있다:

여기서, B는 핵 염기이고, R은 2'-(ara) 치환기 (예를 들어, 플루오로)이다. 2'-(ara) 치환기는 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 출원에 기재된 다른 2'-치환기와 동일할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 2'-(ara) 치환기는 2'-(ara)-F 치환기이다 (R은 플루오로임). 잠금 변형은 리보푸라노오스의 4'-탄소 원자와 2'-탄소 원자 사이에 브릿지를 통합하는 것이다. 잠금 변형을 갖는 뉴클레오사이드는 브릿지된 핵산, 예를 들어, 잠금 핵산 (locked nucleic acid: LNA), 에틸렌-브릿지된 핵산 (ethylene-bridged nucleic acid: ENA) 및 cEt 핵산으로 당해 분야에 공지되어 있다. 브릿지된 핵산은 전형적으로는 친화도 강화 뉴클레오사이드로 사용된다. "뉴클레오사이드"는 또한 모르폴리노 서브유닛을 지칭할 수 있다.

본 출원에 사용되는 "뉴클레오타이드"라는 용어는 뉴클레오사이드간 결합 또는 -X¹-P(X²)(R¹)₂ 구조의 1가 기에 결합된 뉴클레오사이드를 나타내며, 여기서, X¹은 O, S 또는 NH이고, X²는 부재하거나 =O 또는 =S이고, 각각의 R¹은 독립적으로 -OH, -N(R²)₂ 또는 -O-CH₂CH₂CN이고, 여기서, 각각의 R²는 독립적으로 임의로 치환된 알킬이거나, 두 R² 기 모두는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 조합하여 임의로 치환된 헤테로사이클릴을 형성한다.

본 출원에 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 뉴클레오사이드간 결합에 의해 함께 공유적으로 결합된 10개 이상의 연속 뉴클레오사이드를 함유하는 구조; 10개 이상의 모르폴리노 서브유닛을 함유하는 모르폴리노; 또는 10개 이상의 모르폴리노 서브유닛을 함유하는 펩타이드 핵산을 나타낸다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노이다.

"임의로 치환된"이라는 용어는 각각의 개별 기에 대해 기재된 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있는 기, 구조 또는 분자를 지칭한다. "여기서, R¹ 기 내의 하나의/임의의 CH, CH₂, CH₃ 기 또는 헤테로원자 (즉, NH)가 임의로 치환된다"라는 문구는 R¹ 기의 수소 라디칼들 중 (임의의) 하나가 관련된 규정된 기에 의해 치환된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서, "작동 가능하게 연결된"이라는 문구는 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 코딩 서열의 발현을 조절 서열의 제어 하에 배치하는 방식으로 공유적으로 연결된 상황을 포함할 수 있고, 이와 같이, 상기 조절 서열은 선택된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 전부를 형성하는 뉴클레오타이드 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있다. 그 다음, 적절한 경우, 생성된 전사물을 목적하는 펩타이드로 번역할 수 있다.

본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는"이라는 문구는, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 소지의 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 부합하는, 개체 (예를 들어, 사람)의 조직과 접촉시키기에 적합한 이러한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태 (dosage form)를 지칭한다.

본 출원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 본 출원에 개시된 접합체, 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드의 임의의 약제학적으로 허용되는 염을 의미한다. 본 출원에 기재된 화합물들 중 임의의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극 및 알러지 반응 없이, 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 부합하는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염은 문헌 [Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences 66:1-19, 1977] 및 [Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth), Wiley-VCH, 2008]에 기재되어 있다. 상기 염은 본 출원에 기재된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안에 동일계에서 제조될 수 있거나, 유리 염기 기를 적합한 산과 반응시켜 별도로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설포네이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 굴루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토 금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라, 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "약제학적 조성물"이라는 용어는, 본 출원에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 함유하고 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되고 대상체에서 질환의 치료를 위한 치료 요법의 일부로서 정부 규제 기관의 승인으로 제조 또는 판매되는 조성물을 나타낸다.

"감소시키다" 또는 "억제하다"라는 용어는 일반적으로는, 진단 분야의 일상적인 기술에 따라 측정될 때, 본 출원에 기재된 질환 또는 병태의 증상과 같은 관련 생리 반응 또는 세포 반응을 "감소시키는" 본 발명의 1개 이상의 화합물의 능력과 관련될 수 있다. 관련 생리 반응 또는 세포 반응 (생체내 또는 시험관내)은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이며, 근 이영양증의 증상 또는 병리 감소, 또는 DMD 또는 BMD 개체에서 발현되는 디스트로핀의 변경된 형태와 같은 디스트로핀의 결함 형태의 발현 감소를 포함할 수 있다. 반응의 "감소"는 안티센스 화합물 부재 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응과 비교하여 통계상으로 유의할 수 있으며, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 감소를 포함할 수 있다 (이들 사이의 모든 정수 포함).

본 출원에 사용되는 "대상체"라는 용어는 대상체 샘플(들)의 당해 분야에 공지된 실험실 테스트(들) 유무에 관계 없이 자격을 갖춘 전문가 (예를 들어, 의사 또는 전문 간호사)에 의해 결정될 때 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 앓고 있을 위험이 있는 사람 또는 비-사람 동물 (예를 들어, 포유 동물)을 나타낸다. 질환, 장애 및 병태의 비제한적인 예는 뒤시엔느 근 이영양증 (DMD) 및 베커 근 이영양증 (BMD)을 포함한다.

"당" 또는 "당 모이어티"는 푸라노오스 환, 또는 뉴클레오사이드의 푸라노오스 환을 대체할 수 있는 구조를 갖는 천연 당류를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오사이드에 포함된 당류는 비-푸라노오스 (또는 4'-치환된 푸라노오스) 환 또는 환 시스템 또는 개환 시스템일 수 있다. 이러한 구조는 천연 푸라노오스 환 (예를 들어, 6원 환)에 대한 단순한 변화를 포함한다. 대체 당류는 푸라노오스 환을, 예를 들어, 모르폴리노 또는 헥시톨 환 시스템과 같은 또 다른 환 시스템으로 대체한 당 대용물을 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 유용한 당 모이어티의 비제한적인 예는 β-D-리보오스, β-D-2'-데옥시리보오스, 치환된 당류 (예를 들어, 2', 5' 및 비스-치환된 당류), 4'-S-당류 (예를 들어, 4'-S-리보오스, 4'-S-2'-데옥시리보오스 및 4'-S-2'-치환된 리보오스), 바이사이클릭 당 모이어티 (예를 들어, 2'-O―CH₂-4' 또는 2'-O―(CH₂)₂-4' 브릿지된 리보오스 유도된 바이사이클릭 당류) 및 당 대용물 (리보오스 환을 모르폴리노 또는 헥시톨 환 시스템으로 대체한 경우)을 포함한다.

본 출원에 사용되는 "치료" 및 "치료하는"은 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, DMD 또는 BMD)를 향상, 개선 또는 안정화시키려는 의도를 갖는 대상체의 의학적 관리를 지칭한다. 이러한 용어는 활성 치료 (DMD 또는 BMD를 개선하기 위한 치료), 완화 치료 (DMD 또는 BMD의 증상 완화를 위해 디자인된 치료); 및 지원 치료 (또 다른 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료)를 포함한다.

본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, "~을 포함하다" 및 "~을 함유하다"라는 문구 및 이들의 변형어는 "~을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아님"을 의미하며, 이들은 다른 모이어티, 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 제외하려는 것이 아니다 (제외하지 않는다). 본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단수는 문맥이 달리 요구하지 않는다면 복수를 포함한다. 특히, 부정관사가 사용되는 경우, 본 명세서는 문맥이 달리 요구하지 않는다면 단수 뿐만 아니라 복수도 고려하는 것으로 이해되어야 한다.

"접합체"에 대한 모든 언급은 또한 이의 용매화물을 지칭한다.

"올리고뉴클레오타이드"에 대한 모든 언급은 또한 이의 염 및 용매화물을 지칭한다.

달리 명시되지 않는다면, 모든 펩타이드는 본 출원에서 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 (좌측으로부터 우측으로) 표시된다. 달리 명시되지 않는다면, 모든 올리고뉴클레오타이드는 본 출원에서 5'로부터 3' 방향으로 (좌측으로부터 우측으로) 표시된다.

본 발명의 특정 양태, 실시 형태 또는 실시예와 관련하여 기재된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 모이어티 또는 그룹은, 함께 양립할 수 없다면, 본 출원에서 기재된 임의의 다른 양태, 실시 형태 또는 실시예에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 (임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면 포함)에서 개시된 모든 특징 및/또는 이렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 이러한 특징 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 링커를 통해 공유적으로 결합되거나 공유적으로 연결된 펩타이드의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 사람 디스트로핀 유전자의 엑손 45, 엑손 51 또는 엑손 53의 내에 있거나 이에 근접한 표적 서열에 대해 상보적이다. 상기 펩타이드는 적어도 1개의 양으로 하전된 도메인과 적어도 1개의 소수성 도메인을 포함한다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 상기 펩타이드는, 예를 들어, 접합된 올리고뉴클레오타이드의 세포내 전달을 개선함으로써, 접합된 올리고뉴클레오타이드의 활성을 증진시키는 세포 투과성 펩타이드로서 역할을 할 수 있다. 유리하게는, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 출원에 개시된 접합체는 특정 대체 펩타이드 구조에 비해 감소된 독성을 나타낸다.

일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 DMD 치료에 사용하기 위한 디스트로핀 유전자의 단일 엑손의 엑손 스키핑을 유도하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 단일 엑손은, 예를 들어, 엑손 45, 51 또는 53과 같은 디스트로핀 유전자 내 임의의 엑손일 수 있는 DMD에 연루된 임의의 엑손으로부터 선택된다. 임의의 서열의 PMO 올리고뉴클레오타이드는 (예를 들어, 미국 Gene Tools Inc로부터) 구입할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 유전자 표적의 pre-mRNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드이다.

일부 실시 형태에서, 상기 유전자 표적의 pre-mRNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 pre-mRNA를 변경하여 변경된 mRNA로 이어지고, 이에 따라 변경된 서열의 단백질로 이어지는 입체 차단 이벤트 (steric blocking event)를 생기게 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 유전자 표적은 디스트로핀 유전자이다. 일부 실시 형태에서, 상기 입체 차단 이벤트는 엑손 포함 또는 엑손 스키핑일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 입체 차단 이벤트는 엑손 스키핑, 예를 들어, 디스트로핀 유전자의 단일 엑손의 엑손 스키핑이다. 임의로, 상기 펩타이드에 대한 부착 전에 라이신 잔기를 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, PMO 또는 PNA)의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부가하여 수 용해도를 개선시킬 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 5,000 Da 미만, 예를 들어, 3,000 Da 미만 또는 1,000 Da 미만의 분자량을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 C-말단에서 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 연결된다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 필요한 경우 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 연결된다. 상기 링커는 상기 펩타이드 서열을 올리고뉴클레오타이드로부터 분리하기 위한 스페이서로서 역할을 할 수 있다.

상기 링커는 임의의 적합한 서열로부터 선택될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 상기 펩타이드와 올리고뉴클레오타이드 사이에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 상기 링커는 상기 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드에 대해 별개의 기이다. 따라서, 상기 링커는 인공 아미노산을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 연결된 펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 포함한다:

[펩타이드] - [링커]-[올리고뉴클레오타이드]

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 하기 구조로 이루어진다:

[펩타이드] - [링커]-[올리고뉴클레오타이드]

일부 실시 형태에서, 본 출원에 열거된 펩타이드들 중 임의의 펩타이드가 본 발명에 따른 접합체에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 (보다 바람직하게는, 모든 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합이 -P(O)(NMe₂)O-인 모르폴리노)이다. 전형적으로는, 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합의 인 원자는 모르폴리노 서브유닛의 질소 원자에 결합된다.

올리고뉴클레오타이드

본 출원에 개시된 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 유전자 내의 표적 부위에 대해 상보적인 것일 수 있다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 사람 디스트로핀 유전자 내의 특정 표적 영역에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 45, 엑손 51 또는 엑손 53의 스키핑을 유발하여 뒤시엔느 근 이영양증을 개선시킬 수 있는 것으로 믿어진다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 사용될 수 있는 핵 염기 서열의 비제한적인 예는 미국 특허 US 9,018,368; US 9,079,934; US 9,447,417; US 10,385,092; US 10,781,450에서 발견될 수 있다. 대안으로, 상기 서열은 쥐과 동물의 디스트로핀 유전자의 엑손 23을 표적화하는 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 90)이다.

올리고뉴클레오타이드는 사람 디스트로핀 유전자에 대해 상보적이고, 예를 들어, 엑손 45 스키핑을 유도할 수 있는 핵 염기 서열을 포함한다. 이러한 서열의 비제한적인 예는 표 1에 열거되어 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표 1에 열거된 서열 중 어느 하나로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함할 수 있다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3' (서열 번호 122), 또는 이의 티민 치환 유사체인 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함한다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3' (서열 번호 122), 또는 이의 티민 치환 유사체인 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵 염기 서열을 포함한다.

[표 1]

일부 실시 형태에서, 표 1에 제시된 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 1개 이상의 우라실 (예를 들어, 모든 우라실)은 티민으로 대체된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 5'-CAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG-3' (서열 번호 122)일 수 있다. 대안으로, 상기 올리고뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)일 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 사람 디스트로핀 유전자에 대해 상보적이고, 예를 들어, 엑손 51 스키핑을 유도할 수 있는 핵 염기 서열을 포함한다. 이러한 서열의 비제한적인 예는 표 2에 열거되어 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표 2에 열거된 서열 중 어느 하나로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함할 수 있다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3' (서열 번호 130), 또는 이의 티민 치환 유사체인 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함한다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3' (서열 번호 130), 또는 이의 티민 치환 유사체인 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵 염기 서열을 포함한다.

[표 2]

일부 실시 형태에서, 표 2에 제시된 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 1개 이상의 우라실 (예를 들어, 모든 우라실)은 티민으로 대체된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 5'-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3' (서열 번호 130)일 수 있다. 대안으로, 상기 올리고뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)일 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 사람 디스트로핀 유전자에 대해 상보적이고, 예를 들어, 엑손 53 스키핑을 유도할 수 있는 핵 염기 서열을 포함한다. 이러한 서열의 비제한적인 예는 표 3에 열거되어 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표 3에 열거된 서열 중 어느 하나로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함할 수 있다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162) 또는 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)로부터의 적어도 12개 (예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개)의 연속 핵 염기를 포함한다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162) 및 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵 염기 서열을 포함한다.

[표 3]

일부 실시 형태에서, 표 3에 제시된 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 1개 이상의 티민 (예를 들어, 모든 티민)은 우라실로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 표 3에 제시된 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 1개 이상의 우라실 (예를 들어, 모든 우라실)은 티민으로 대체된다.

펩타이드

본 출원에 기재된 접합체에 사용될 수 있는 펩타이드는 국제공개공보 WO 2020/030927 및 WO 2020/115494에 개시된 것들을 포함한다. 바람직하게는, 본 출원에 기재된 접합체에 포함된 펩타이드는 인공 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아미노헥산산 잔기를 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 임의 형태의 아미노헥산산 잔기를 함유하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 6-아미노헥산산 잔기를 함유하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 천연 아미노산 잔기만을 함유하므로, 천연 아미노산 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 세포 투과성 펩타이드에 전형적으로 사용되는 6-아미노헥산산과 같은 인공 아미노산은 천연 아미노산으로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 세포 투과성 펩타이드에 전형적으로 사용되는 6-아미노헥산산과 같은 인공 아미노산은 베타-알라닌, 세린, 프롤린, 아르기닌 및 히스티딘 또는 하이드록시프롤린으로부터 선택된 아미노산으로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 아미노헥산산은 베타-알라닌으로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 6-아미노헥산산은 베타-알라닌으로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 아미노헥산산은 히스티딘으로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 6-아미노헥산산은 히스티딘으로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 아미노헥산산은 하이드록시프롤린으로 대체된다. 일부 실시 형태에서, 6-아미노헥산산은 하이드록시프롤린으로 대체된다.

일부 실시 형태에서, 세포 투과성 펩타이드에 전형적으로 사용되는 6-아미노헥산산과 같은 인공 아미노산은 베타-알라닌, 세린, 프롤린, 아르기닌 및 히스티딘 또는 하이드록시프롤린의 임의의 조합, 예를 들어, 베타-알라닌, 히스티딘 및 하이드록시프롤린의 임의의 조합으로 대체될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 40개 이하의 아미노산 잔기의 총 길이를 갖는 펩타이드가 제공되며, 상기 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 각각 포함하는 2개 이상의 양이온성 도메인; 및 적어도 3개의 아미노산 잔기를 각각 포함하는 1개 이상의 소수성 도메인을 포함하고; 여기서, 적어도 1개의 양이온성 도메인은 히스티딘 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 1개의 양이온성 도메인은 히스티딘 풍부하다.

일부 실시 형태에서, 히스티딘 풍부의 의미는 본 출원에서 양이온성 도메인과 관련하여 정의된다.

양이온성 도메인

본 발명은 특정 길이를 갖는 적어도 2개의 양이온성 도메인이 있는 특정 구조를 갖는 짧은 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 4개 이하의 양이온성 도메인, 3개 이하의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인을 포함한다.

상기에 정의된 바와 같이, 상기 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기의 길이를 각각 갖는 2개 이상의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 4 내지 12개의 아미노산 잔기의 길이, 예를 들어, 4 내지 7개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 유사한 길이를 가지며, 예를 들어, 각각의 양이온성 도메인은 동일한 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 양이온성 아미노산을 포함하고, 또한 극성 및/또는 비극성 아미노산을 함유할 수 있다.

비극성 아미노산은 알라닌, 베타-알라닌, 프롤린, 글리신, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트립토판 및 페닐알라닌으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비극성 아미노산은 전하를 갖지 않는다.

극성 아미노산은 세린, 아스파라긴, 하이드록시프롤린, 히스티딘, 아르기닌, 트레오닌, 타이로신 및 글루타민으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 선택된 극성 아미노산은 음전하를 갖지 않는다.

양이온성 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 아미노산은 생리학적 pH에서 양전하를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 음이온성 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%의 양이온성 아미노산을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 대다수의 양이온성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 양이온성 아미노산을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 7.5, 적어도 8.0, 적어도 8.5, 적어도 9.0, 적어도 9.5, 적어도 10.0, 적어도 10.5, 적어도 11.0, 적어도 11.5 또는 적어도 12.0의 등전점 (pi)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 10.0의 등전점 (pi)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 10.0 내지 13.0의 등전점 (pi)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 10.4 내지 12.5의 등전점 (pi)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 양이온성 도메인의 등전점은 생리학적 pH에서 당해 분야에서 이용 가능한 임의의 적합한 수단에 의해, 일부 실시 형태에서는 문헌 [Lukasz Kozlowski, Biol Direct. 2016; 11 : 55. DOI: 10.1186/s 13062-016-0159-9]에 의해 개발된 웹 기반 알고리즘인 I PC (www.isoelectric.org)를 사용하여 계산된다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 1개의 양이온성 아미노산, 예를 들어, 1~5개의 양이온성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 2개의 양이온성 아미노산, 예를 들어, 2~5개의 양이온성 아미노산을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌 풍부하고/하거나 히스티딘 풍부하다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 히스티딘과 아르기닌 모두를 함유할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 대다수의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 60%, 적어도 65% 또는 적어도 70%의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 60%, 적어도 65% 또는 적어도 70%의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 총 1~5개의 히스티딘 및 1~5개의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 1~5개의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 1~5개의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 총 2~5개의 히스티딘 및 3~5개의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 3~5개의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 2~5개의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 1개 이상의 베타-알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 총 2~5개의 베타-알라닌 잔기, 예를 들어, 총 2개 또는 3개의 베타-알라닌 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 1개 이상의 하이드록시프롤린 잔기 또는 세린 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 1~2개의 하이드록시프롤린 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 1~2개의 세린 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 주어진 양이온성 도메인 내의 모든 양이온성 아미노산은 히스티딘일 수 있고, 대안으로, 예를 들어, 주어진 양이온성 도메인 내의 모든 양이온성 아미노산은 아르기닌일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 적어도 1개의 히스티딘 풍부 양이온성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 적어도 1개의 아르기닌 풍부 양이온성 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 적어도 1개의 아르기닌 풍부 양이온성 도메인 및 적어도 1개의 히스티딘 풍부 양이온성 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 아르기닌 풍부 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 히스티딘 풍부 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 아르기닌 및 히스티딘 풍부 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 1개의 아르기닌 풍부 양이온성 도메인 및 1개의 히스티딘 풍부 양이온성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 3개 이하의 연속 아르기닌 잔기, 예를 들어, 2개 이하의 연속 아르기닌 잔기를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 연속 히스티딘 잔기를 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘 및/또는 베타-알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 대다수의 아르기닌, 히스티딘 및/또는 베타-알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인 내의 아미노산 잔기 중 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100%는 아르기닌, 히스티딘 및/또는 베타-알라닌 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘 및/또는 베타-알라닌 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기를 포함하는 제1 양이온성 도메인, 및 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기를 포함하는 제2 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기를 포함하는 제1 양이온성 도메인, 및 히스티딘, 베타-알라닌 및 임의로 아르기닌 잔기를 포함하는 제2 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기를 포함하는 제1 양이온성 도메인, 및 히스티딘 및 베타-알라닌 잔기를 포함하는 제2 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기로 이루어진 제1 양이온성 도메인, 및 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기로 이루어진 제2 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 및 베타-알라닌 잔기로 이루어진 제1 양이온성 도메인, 및 아르기닌, 히스티딘 및 베타-알라닌 잔기로 이루어진 제2 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 적어도 2개의 양이온성 도메인을 포함하고, 예를 들어, 이러한 양이온성 도메인들은 상기 펩타이드의 아암을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 양이온성 도메인은 상기 펩타이드의 N 및 C-말단에 위치한다. 그러므로, 일부 실시 형태에서, 상기 양이온성 도메인은 양이온성 아암 도메인으로 공지될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인을 포함하고, 여기서, 하나는 상기 펩타이드의 N-말단에 위치하고, 다른 하나는 상기 펩타이드의 C-말단에 위치한다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드의 각각의 말단에 위치한다. 일부 실시 형태에서, 말단 변형, 링커 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 기를 제외하고, 어떠한 추가의 아미노산 또는 도메인도 상기 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 존재하지 않는다. 의심의 여지를 없애기 위해, 이러한 다른 기는 본 출원에 기재되고 청구된 '펩타이드'에 추가하여 존재할 수 있다. 그러므로, 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 상기 펩타이드의 말단을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 이는 본 출원에 기재된 바와 같은 추가의 링커 기의 존재를 제외하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 4개 이하의 양이온성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 모두 아르기닌 풍부한 2개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 풍부한 1개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 모두 아르기닌과 히스티딘 둘 다 풍부한 2개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 아르기닌 풍부한 1개의 양이온성 도메인 및 히스티딘 풍부한 1개의 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 양이온성 도메인은 R, H, B, RR, HH, BB, RH, HR, RB, BR, HB, BH, RBR, RBB, BRR, BBR, BRB, RBH, RHB, HRB, BRH, HRR, RRH, HRH, HBB, BBH, RHR, BHB, HBH 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 아미노산 단위를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 양이온성 도메인은 또한 세린, 프롤린 및/또는 하이드록시프롤린 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 양이온성 도메인은 RP, PR, RPR, RRP, PRR, PRP, Hyp; R[Hyp]R, RR[Hyp], [Hyp]RR, [Hyp]R[Hyp], [Hyp][Hyp]R, R[Hyp][Hyp], SB, BS 또는 이들의 임의의 조합, 또는 상기에 열거된 아미노산 단위들과의 임의의 조합로으부터 선택된 아미노산 단위를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18), R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 임의의 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B, R[Hyp]H[Hyp]HB, R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 임의의 서열로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRRBR (서열 번호 4), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8) 및 HBHBR (서열 번호 9)의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드 내의 각각의 양이온성 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드 내의 각각의 양이온성 도메인은 상이하다.

소수성 도메인

본 발명은 특정 길이를 갖는 적어도 1개의 소수성 도메인이 있는 특정 구조를 갖는 짧은 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.

본 출원에서 '소수성'에 대한 언급은 물에 반발하는 능력을 갖거나 물과 혼합되지 않는 아미노산 또는 아미노산의 도메인을 나타낸다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 3개 이하의 소수성 도메인 또는 2개 이하의 소수성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 1개의 소수성 도메인을 포함한다.

상기에 정의된 바와 같이, 상기 펩타이드는 적어도 3개의 아미노산 잔기의 길이를 각각 갖는 1개 이상의 소수성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 3~6개 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 5개 아미노산의 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 비극성, 극성 및 소수성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

소수성 아미노산 잔기는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 타이로신, 메티오닌 및 트립토판으로부터 선택될 수 있다.

비극성 아미노산 잔기는 프롤린, 글리신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트립토판, 페닐알라닌 및 메티오닌으로부터 선택될 수 있다.

극성 아미노산 잔기는 세린, 아스파라긴, 하이드록시프롤린, 히스티딘, 아르기닌, 트레오닌, 타이로신 및 글루타민으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 소수성 도메인은 친수성 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 대다수의 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 소수성 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 소수성 아미노산 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1, 적어도 1.2 또는 적어도 1.3의 소수도 (hydrophobicity)를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 적어도 0.3, 적어도 0.35, 적어도 0.4 또는 적어도 0.45의 소수도를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 적어도 1.2, 적어도 1.25, 적어도 1.3 또는 적어도 1.35의 소수도를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 0.4 내지 1.4의 소수도를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 0.45 내지 0.48의 소수도를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 1.27 내지 1.39의 소수도를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 소수도는 문헌 [White and Wimley: W.C. Wimley and S.H. White, "Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces" Nature Struct Biol 3:842 (1996)]에 의해 측정되는 바와 같다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 소수성 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및 글루타민 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및/또는 글루타민 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신 및/또는 글루타민 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 트립토판 및/또는 프롤린 잔기로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 1개의 소수성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 상기 펩타이드의 중심에 위치한다. 그러므로, 일부 실시 형태에서, 상기 소수성 도메인은 코어 소수성 도메인으로 공지될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 코어 도메인은 아암 도메인에 의해 각각의 측면에 플랭킹된다. 일부 실시 형태에서, 상기 아암 도메인은 1개 이상의 양이온성 도메인 및 1개 이상의 추가의 소수성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 아암 도메인은 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 소수성 코어 도메인을 플랭킹하는 2개의 아암 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 각각의 아암 도메인은 양이온성 도메인을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 소수성 코어 도메인을 플랭킹하는 2개의 양이온성 아암 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 FQILY (서열 번호 21), YQFLI (서열 번호 20) 및 ILFQY (서열 번호 22)의 서열들 중 하나로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 FQILY (서열 번호 21)로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드 내의 각각의 소수성 도메인은 동일한 서열 또는 상이한 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 의학적 병태의 치료에서 치료학적 카고(cargo) 분자를 수송하는데 사용하기 위한 짧은 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.

상기 펩타이드는 연속 단일 분자인 서열을 가지므로, 상기 펩타이드의 도메인은 연속적이다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 N-말단과 C-말단 사이에 선형 배열로 수개의 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 도메인은 상기에 기재된 양이온성 도메인 및 소수성 도메인으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 양이온성 도메인 및 소수성 도메인으로 이루어지며, 여기서, 상기 도메인은 상기에 정의된 바와 같다.

각각의 도메인은 상기 관련 섹션에 기재된 바와 같이 공통 서열 특성을 갖지만, 각각의 도메인의 정확한 서열은 변이 및 변형 가능하다. 따라서, 다양한 서열이 각각의 도메인에 대해 가능하다. 각각의 가능한 도메인 서열의 조합은 다양한 펩타이드 구조를 생성하며, 이들 각각은 본 발명의 일부를 형성한다. 상기 펩타이드 구조의 특징은 하기에 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 소수성 도메인은 임의의 2개의 양이온성 도메인들을 분리한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 소수성 도메인은 양이온성 도메인에 의해 이의 각각의 측면에 플랭킹된다.

일부 실시 형태에서, 어떠한 양이온성 도메인도 또 다른 양이온성 도메인과 연속적이지 않다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 하기 배열로 2개의 양이온성 도메인들에 의해 플랭킹된 1개의 소수성 도메인을 포함한다:

[양이온성 도메인] - [소수성 도메인] - [양이온성 도메인]

그러므로, 일부 실시 형태에서, 상기 소수성 도메인은 코어 도메인으로 공지될 수 있고, 상기 각각의 양이온성 도메인은 아암 도메인으로 공지될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 소수성 아암 도메인은 각각의 측면에서 양이온성 코어 도메인을 플랭킹시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인 및 1개의 소수성 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18) 및 R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19)로부터 선택된 서열을 각각 포함하는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된, YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25) 및 WWPW (서열 번호 26)로부터 선택된 서열을 포함하는 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRRBR (서열 번호 4), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9)로부터 선택된 서열을 포함하는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된, FQILY (서열 번호 21), YQFLI (서열 번호 20) 및 ILFQY (서열 번호 22)로부터 선택된 서열을 포함하는 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRRBR (서열 번호 4), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8)로부터 선택된 서열을 포함하는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된 FQILY (서열 번호 21)의 서열을 포함하는 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어진다.

이러한 임의의 실시 형태에서, 링커, 말단 변형 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 추가의 기가 존재할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 N-말단에서 변형된다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 N-아세틸화, N-메틸화, N-트리플루오로아세틸화, N-트리플루오로메틸설포닐화 또는 N-메틸설포닐화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 N-아세틸화된다.

임의로, 상기 펩타이드의 N-말단은 변형되지 않을 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 N-아세틸화된다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 C-말단 변형된다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 카복시기, 티오산기, 아미노옥시기, 하이드라지노기, 티오에스테르기, 아지드, 긴장된 알킨 (strained alkyne), 긴장된 알켄, 알데하이드기, 티올 또는 할로아세틸기로부터 선택된 C-말단 변형을 포함한다.

유리하게는, 상기 C-말단 변형은 올리고뉴클레오타이드에 대한 펩타이드의 연결을 위한 수단을 제공한다.

따라서, 상기 C-말단 변형은 링커를 포함할 수 있고, 그 반대도 마찬가지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 C-말단 변형은 링커로 이루어질 수 있고, 그 반대도 마찬가지일 수 있다. 적합한 링커는 본 출원의 다른 곳에 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 C-말단 카복실기를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 C-말단 카복실기는 글리신 또는 베타-알라닌 잔기에 의해 제공된다.

일부 실시 형태에서, 상기 C-말단 카복실기는 베타-알라닌 잔기에 의해 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 C-말단 베타-알라닌 잔기는 링커이다.

그러므로, 일부 실시 형태에서, 각각의 양이온성 도메인은 N 또는 C-말단 변형을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 C-말단의 양이온성 도메인은 C-말단 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 N-말단의 양이온성 도메인은 N-말단 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 C-말단의 양이온성 도메인은 링커 기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 C-말단의 양이온성 도메인은 C-말단 베타-알라닌을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 N-말단의 양이온성 도메인은 N-아세틸화된다.

본 발명의 펩타이드는 40개 이하의 아미노산 잔기의 총 길이를 갖는 것으로 정의된다. 그러므로, 상기 펩타이드는 올리고펩타이드로 간주될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 3~30개 아미노산 잔기, 예를 들어, 5~25개 아미노산 잔기, 10~25개 아미노산 잔기, 13~23개 아미노산 잔기 또는 15~20개 아미노산 잔기의 총 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개 또는 적어도 17개 아미노산 잔기의 총 길이를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 세포를 투과할 수 있다. 그러므로, 상기 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드로 간주될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 올리고뉴클레오타이드에 부착하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 올리고뉴클레오타이드를 표적 세포 내로 수송하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 올리고뉴클레오타이드를 표적 세포 내로 전달하기 위한 것이다. 그러므로, 상기 펩타이드는 담체 펩타이드로 간주될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 세포 및 조직 내로, 예를 들어, 세포 핵 내로, 일부 실시 형태에서는 근육 조직 내로 투과할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 하기 서열들 중 임의의 서열로부터 선택될 수 있다:

RBRRBRRFQILYRBRBR (서열 번호: 27)

RBRRBRRFQILYRBRR (서열 번호: 28)

RBRRBRFQILYRRBRBR (서열 번호: 29)

RBRBRFQILYRBRRBRR (서열 번호: 30)

RBRRBRRYQFLIRBRBR (서열 번호: 31)

RBRRBRRILFQYRBRBR (서열 번호: 32)

RBRRBRFQILYRBRBR (서열 번호: 33)

RBRRBFQILYRBRRBR (서열 번호: 34)

RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호: 35)

RBRRBFQILYRBRBR (서열 번호: 36)

RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호: 37)

RBRRBRRFQILYHBHBR (서열 번호: 38)

RBRRBRRFQILYHBRBH (서열 번호: 39)

RBRRBRRYQFLIRBHBH (서열 번호: 40)

RBRRBRRILFQYRBHBH (서열 번호: 41)

RBRHBHRFQILYRBRBR (서열 번호: 42)

RBRBBHRFQILYRBHBH (서열 번호: 43)

RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호: 44)

RBRRBRFQILYHBHBH (서열 번호: 45)

RBRRBHFQILYRBHBH (서열 번호: 46)

HBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호: 47)

RBRRBFQILYRBHBH (서열 번호: 48)

RBRRBRFQILYBHBH (서열 번호: 49)

RBRRBRYQFLIHBHBH (서열 번호: 50)

RBRRBRILFQYHBHBH (서열 번호: 51)

RBRRBRRFQILYHBHBH (서열 번호: 52)

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 하기 추가의 서열들 중 임의의 서열로부터 선택될 수 있다:

RBRRBRFQILYBRBS (서열 번호: 53)

RBRRBRFQILYBRB[Hyp] (서열 번호: 54)

RBRRBRFQILYBR[Hyp]R (서열 번호: 55)

RRBRRBRFQILYBRBR (서열 번호: 56)

BRRBRRFQILYBRBR (서열 번호: 57)

RBRRBRWWWBRBR (서열 번호: 58)

RBRRBRWWPWWBRBR (서열 번호: 59)

RBRRBRWPWWBRBR (SEQ ID NQ: 60)

RBRRBRWWPWBRBR (서열 번호: 61)

RBRRBRRWWWRBRBR (서열 번호: 62)

RBRRBRRWWPWWRBRBR (서열 번호: 63)

RBRRBRRWPWWRBRBR (서열 번호: 64)

RBRRBRRWWPWRBRBR (서열 번호: 65)

RBRRBRRFQILYBRBR (서열 번호: 66)

RBRRBRRFQILYRBR (서열 번호: 67)

BRBRBWWPWWRBRRBR (서열 번호: 68)

RBRRBRRFQILYBHBH (서열 번호: 69)

RBRRBRRFQIYRBHBH (서열 번호: 70)

RBRRBRFQILYBRBH (서열 번호: 71)

RBRRBRFQILYR[Hyp]H[Hyp]H (서열 번호: 72)

R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYRBHBH (서열 번호: 73)

R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYR[Hyp]H[Hyp]H (서열 번호: 74)

RBRRBRWWWRBHBH (서열 번호: 75)

RBRRBRWWPRBHBH (서열 번호: 76)

RBRRBRPWWRBHBH (서열 번호: 77)

RBRRBRWWPWWRBHBH (서열 번호: 78)

RBRRBRWWPWRBHBH (서열 번호: 79)

RBRRBRWPWWRBHBH (서열 번호: 80)

RBRRBRRWWWRBHBH (서열 번호: 81)

RBRRBRRWWPWWRBHBH (서열 번호: 82)

RBRRBRRWPWWRBHBH (서열 번호: 83)

RBRRBRRWWPWRBHBH (서열 번호: 84)

RRBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호: 85)

BRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호: 86)

RRBRRBRFQILYBHBH (서열 번호: 87)

BRRBRRFQILYBHBH (서열 번호: 88)

RBRRBHRFQILYRBHBH (서열 번호: 89)

RBRRBRFQILY[Hyp]R[Hyp]R (서열 번호: 101)

R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYBRBR (서열 번호: 102)

R[Hyp]RR[Hyp]RFQILY[Hyp]R[Hyp]R (서열 번호: 103)

RBRRBRWWWBRBR (서열 번호: 104)

RBRRBRWWPWWBRBR (서열 번호: 105)

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 하기 서열들 중 하나로부터 선택될 수 있다:

RBRRBRRFQILYRBRBR (서열 번호: 27)

RBRRBRRYQFLIRBRBR (서열 번호: 31)

RBRRBRRILFQYRBRBR (서열 번호: 32)

RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호: 35)

RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호: 37)

RBRRBRRFQILYHBHBR (서열 번호: 38)

RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호: 44)

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 서열로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37)의 서열로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 서열로 이루어진다.

접합체

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35), RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37) 및 RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 서열들 중 하나로부터 선택된 펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 서열 번호 27~52; 서열 번호 53~89; 서열 번호 101~105; 및 서열 번호 27, 31, 32, 35, 37, 38 및 44 중 어느 하나로부터 선택된 펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 표 1, 표 2 또는 표 3의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 임의의 경우, 상기 펩타이드는 상기에 기재된 바와 같이 N-말단 변형을 추가로 포함할 수 있다.

적합한 링커는, 예를 들어, 디설파이드, 티오에테르 또는 티올-말레이미드 결합의 형성을 가능하게 하는 C-말단 시스테인 잔기, 옥심을 형성하기 위한 C-말단 알데하이드, 상기 펩타이드 상의 염기성 아미노산과 모르폴리노 결합의 클릭 반응 또는 형성, 또는 카복스아미드 결합을 형성하도록 아미노기에 공유적으로 접합되는 펩타이드 상의 카복실산 모이어티를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 1 내지 5개 아미노산의 길이이다. 일부 실시 형태에서, 상기 링커는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 링커는 G, BC, XC, C, GGC, BBC, BXC, XBC, X, XX, B, BB, BX 및 XB의 서열들 중 임의의 서열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 X는 6-아미노헥산산이다.

일부 실시 형태에서, 상기 링커는, 예를 들어, PEG와 같은 중합체일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 베타-알라닌이다.

일부 실시 형태에서, 상기 펩타이드는 카복스아미드 연결을 통해 올리고뉴클레오타이드에 접합된다.

상기 접합체의 링커는 상기 펩타이드가 부착되는 올리고뉴클레오타이드의 일부를 형성할 수 있다. 대안으로, 상기 올리고뉴클레오타이드의 부착은 상기 펩타이드의 C-말단에 직접 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 실시 형태에서, 어떠한 링커도 필요하지 않다.

대안으로, 상기 펩타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 접합될 수 있다. 화학적 연결은, 예를 들어, 디설파이드, 알케닐, 알키닐, 아릴, 에테르, 티오에테르, 트리아졸, 아미드, 카복스아미드, 우레아, 티오우레아, 세미카바자이드, 카바자이드, 하이드라진, 옥심, 포스페이트, 포스포르아미데이트, 티오포스페이트, 보라노포스페이트, 이미노포스페이트 또는 티올-말레이미드 결합을 통해 이루어질 수 있다.

임의로, 상기 펩타이드에 대한 디설파이드 결합 형성을 가능하게 하도록 시스테인을 올리고뉴클레오타이드의 N-말단에 부가할 수 있거나, 상기 펩타이드에 대한 티오에테르 접합을 위해 브로모아세틸화를 N-말단에 수행할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 이미징 분자에 동등하게 공유적으로 연결되어 접합체를 제공할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 이미징 분자는 상기 접합체의 시각화를 가능하게 하는 임의의 분자일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 이미징 분자는 상기 접합체의 위치를 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 시험관내 또는 생체내에서 상기 접합체의 위치를 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 접합체를 대상체에게 투여하는 단계 및 상기 대상체를 이미징하여 상기 접합체의 위치를 찾는 단계를 포함하는, 이미징 분자를 포함하는 접합체의 위치를 모니터링하는 방법이 제공된다.

이미징 분자의 예는 검출 분자, 조영제 분자 (contrast molecule) 또는 증강 분자 (enhancing molecule)를 포함한다. 적합한 이미징 분자는 방사성 핵종; 형광단; 나노입자 (예를 들어, 나노쉘); 나노케이지; 발색제 (예를 들어, 효소), 방사성 동위원소, 염료, 방사선 불투과성 재료, 형광 화합물 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 이미징 분자는 이미징 기술을 사용하여 시각화되며, 이들은 세포 이미징 기술 또는 의료 이미징 기술일 수 있다. 적합한 세포 이미징 기술은, 예를 들어, 이미지 세포 측정법, 형광 현미경 검사, 위상차 현미경 검사, SEM, TEM을 포함한다. 적합한 의료 이미징 기술은, 예를 들어, X-선, 형광 투시법, MRI, 섬광 조영술, SPECT, PET, CT, CAT, FNRI를 포함한다.

일부 경우에서, 상기 이미징 분자는 진단 분자로 간주될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 진단 분자는 상기 접합체를 사용하여 질환의 진단을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 질환의 진단은 이미징 분자를 사용하여 상기 접합체의 위치를 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미징 분자를 포함하는 접합체를 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계 및 상기 접합체의 위치를 모니터링하는 단계를 포함하는 질환의 진단 방법이 제공된다.

일부 실시 형태에서, 이미징 분자를 포함하는 접합체의 연결과 같은 추가의 상세 사항은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 접합체와 관련하여 상기에 기재된 바와 같다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 펩타이드는 올리고뉴클레오타이드 및 이미징 분자에 공유적으로 연결되어 접합체를 제공할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 세포 및 조직 내로, 예를 들어, 세포 핵 내로, 예를 들어, 근육 조직 내로 투과할 수 있다.

링커

본 출원에 기재된 접합체는 본 출원에 기재된 펩타이드를 본 출원에 기재된 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 링커는 국제공개공보 WO 2020/115494에서 발견될 수 있으며, 이의 개시 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.

상기 링커는 하기 화학식 I을 가질 수 있다:

[화학식 I]

T₁-(CR¹R²)_n-T₂

상기 화학식 I에서,

n은 1, 2 또는 3이고;

각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고,

여기서,

각각의 R²는 독립적으로 -Y²-X²-Z²이고, 여기서,

일부 실시 형태에서, 상기 링커는 하기 구조를 갖는다:

또는 .

약제학적 조성물

본 발명의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제, 아쥬반트 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 약제학적으로 허용되는 희석제, 아쥬반트 및 담체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

본 개시 내용의 약제학적 조성물은 의학적 용도 하에서 본 출원에 기재된 질환, 장애 및 병태를 완화, 매개, 예방 및 치료하기 위한 추가의 공지된 치료제, 약물, 화합물의 프로드럭으로의 변형 등을 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다.

일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 약제로서 사용하기 위한, 예를 들어, 상기 접합체에 대해 본 출원에 기재된 바와 동일한 방식으로 약제로서 사용하기 위한 것이다. 상기 접합체를 사용하는 의학적 치료와 관련하여 본 출원에 기재된 모든 특징은 상기 약제학적 조성물에 적용된다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 제4 양태에 따른 약제학적 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 본 출원에 개시된 약제학적 조성물을 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 상태에 대해 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

의학적 용도

본 발명의 펩타이드를 포함하는 접합체는 질환 치료를 위한 약제로서 사용될 수 있다.

상기 약제는 상기에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 형태일 수 있다.

질환 상태에 대해 치료를 필요로 하는 환자 또는 대상체의 치료 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 접합체를 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 의학적 치료는 상기 올리고뉴클레오타이드를 세포 내로, 예를 들어, 세포 핵 내로 전달하는 것을 필요로 한다.

치료하고자 하는 질환은 올리고뉴클레오타이드에 의한 세포 및/또는 핵막 투과 개선이 치료학적 효과 개선으로 이어질 수 있는 임의의 질환을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 신경근계 질환 치료에 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 펩타이드를 포함하는 접합체는 뒤시엔느 근 이영양증 (DMD) 또는 베커 근 이영양증 (BMD)의 치료에 적합하다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 스플라이싱 결함에 기인하는 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 스플라이싱 결함을 방지 또는 교정하고/하거나 올바르게 스플라이싱된 mRNA 분자의 생산을 증가시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 DMD 치료에 사용하기 위한 것이다.

일부 실시 형태에서, DMD 치료에 사용하기 위한 제2 양태에 따른 접합체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 이러한 일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 단백질의 발현을 증가시키도록 작동 가능하다. 일부 실시 형태에서, 이러한 일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 기능성 디스트로핀 단백질의 발현을 증가시키도록 작동 가능하다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 발현을 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%까지 증가시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 발현을 최대 50%까지 증가시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 단백질 발현을 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%까지 복구시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 단백질 발현을 최대 50%까지 복구시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 단백질 기능을 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70%까지 복구시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 디스트로핀 단백질 기능을 최대 50%까지 복구시킨다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 전사 동안 1개 이상의 엑손의 스키핑을 유발함으로써 그와 같이 수행하도록 작동 가능하다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 유전자의 1개 이상의 엑손의 스키핑을 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 유발한다. 일부 실시 형태에서, 상기 접합체의 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 유전자의 1개 이상의 엑손의 스키핑을 최대 50% 유발한다.

일부 실시 형태에서, 치료하고자 하는 환자 또는 대상체는 임의의 동물 또는 사람일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 환자 또는 대상체는 비-사람 포유 동물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 환자 또는 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 남성이다.

일부 실시 형태에서, 치료하고자 하는 환자 또는 대상체는 임의의 연령일수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료하고자 하는 환자 또는 대상체는 0~40세, 예를 들어, 0~30세, 예를 들어, 0~25세, 예를 들어, 0~20세이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 대상체에게, 예를 들어, 골수내, 경막내, 뇌실내, 유리체내, 장내, 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 종양내, 피하, 경구 또는 비강 경로에 의해 전신으로 투여하기 위한 것이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 대상체에게 정맥내 투여하기 위한 것이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 대상체에게 주사로 정맥내 투여하기 위한 것이다.

일부 실시 형태에서, 상기 접합체는 "치료학적 유효량"으로 대상체에게 투여하기 위한 것이며, 이는 상기 양이 개체에게 유익을 나타내기에 충분함을 의미한다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료할 질환의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 투약량에 대한 결정은 일반 전문의 및 다른 의사의 책임내에 있다. 상기 기술 및 프로토콜의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wlkins]에서 발견될 수 있다. 예시적인 용량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.05 mg/kg 내지 40 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.5 mg/kg 내지 18 mg/kg, 1 mg/kg 내지 16 mg/kg, 2 mg/kg 내지 15 mg/kg, 5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 10 mg/kg 내지 20 mg/kg, 12 mg/kg 내지 18 mg/kg, 13 mg/kg 내지 17 mg/kg일 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 접합체의 투약량은 올리고뉴클레오타이드 단독으로부터의 임의의 효과를 확인하는데 필요한 투여량보다, 예컨대 한 자릿수, 더 낮을 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체의 투여 후, 1개 이상의 독성 마커가 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교하여 유의하게 감소된다.

적합한 독성 마커는 신독성(nephrotoxicity) 마커일 수 있다.

적합한 독성 마커는 KIM-1, NGAL, BUN, 크레아티닌, 알칼리성 포스파타아제, 알라닌 트랜스퍼라아제 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체의 투여 후, KIM-1, NGAL 및 BUN 중 적어도 1개의 수준이 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교할 때 감소된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체의 투여 후, KIM-1, NGAL 및 BUN 각각의 수준이 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교할 때 감소된다.

일부 실시 형태에서, 상기 또는 각각의 마커/마커들의 수준이 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교할 때 유의하게 감소된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체의 투여 후, 상기 또는 각각의 마커/마커들의 수준이 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교할 때 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%까지 감소된다.

유리하게는, 상기 펩타이드 및 이에 따라 생성된 접합체의 독성은 종래 세포 투과성 펩타이드 및 접합체와 비교하여 유의하게 감소된다. 특히, KIM-1 및 NGAL-1은 독성 마커이고, 이들은 현재 이용 가능한 펩타이드 담체를 사용하는 종래 접합체와 비교하여 최대 120배까지 유의하게 감소된다.

펩타이드 제조

본 발명의 펩타이드는 임의의 표준 단백질 합성 방법, 예를 들어, 화학적 합성, 반-화학적 합성에 의해 또는 발현 시스템의 사용을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 펩타이드를 인코딩하는 DNA를 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오타이드 서열, 발현 시스템, 예를 들어, 발현 및 발현 제어에 필요한 서열을 동반하는 상기 서열을 포함하는 벡터, 및 상기 발현 시스템에 의해 형질 전환된 숙주 세포 및 숙주 유기체에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 펩타이드를 인코딩하는 핵산이 또한 제공된다.

일부 실시 형태에서, 상기 핵산은 단리된 형태 또는 정제된 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 또한 제공된다.

일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 플라스미드이다.

일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 본 발명에 따른 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들어, 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 적합한 세포, 예를 들어, 포유류, 세균 또는 진균 세포 내로 형질 감염될 때 상기 펩타이드를 발현할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.

발현 벡터는 본 발명의 핵산이 삽입될 수 있는 숙주 세포에 따라 선택될 수 있다. 상기 숙주 세포의 이러한 형질 전환은 문헌 [Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA]에 교시된 바와 같은 통상의 기술을 포함한다. 적합한 벡터의 선택은 당해 분야의 지식을 가진 자의 기술 범위 내에 있다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 바이러스를 포함한다.

생산된 펩타이드는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 침전 또는 크로마토그래피 분리, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 숙주 세포로부터 단리 및 정제될 수 있다.

적합한 벡터, 숙주 및 재조합 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 1

1. 재료 및 방법

1.1. P-PMO 합성 및 준비

9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호된 L-아미노산, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 (PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 Fmoc-Ala-OH 예비 로딩된 Wang 수지 (0.19 또는 0.46 mmol g^-1)는 Merck (Hohenbrunn, Germany)에서 입수하였다. HPLC 등급 아세토니트릴, 메탄올 및 합성 등급 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)은 Fisher Scientific (Loughborough, UK)에서 구입하였다. 펩타이드 합성 등급 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 및 디에틸 에테르는 VWR (Leicestershire, UK)에서 입수하였다. 피페리딘 및 트리플루오로아세트산 (TFA)은 Alfa Aesar (Heysham, England)에서 입수하였다. PMO는 Gene Tools Inc. (Philomath, USA)에서 구입하였다. 닭 배아 추출물 및 말 혈청은 Sera Laboratories International Ltd (West Sussex, UK)에서 입수하였다. 인터페론은 Roche Applied Science (Penzberg, Germany)에서 입수하였다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는다면 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 입수하였다. MALDI-TOF 질량 분광법은 Voyager DE Pro BioSpectrometry 워크스테이션을 사용하여 수행되었다. 물 중 50% 아세토니트릴 중의 α-시아노-4-하이드록시신남산 또는 시나핀산의 10 mg mL^-1의 스톡 용액을 매트릭스로서 사용하였다. 오차 막대는 ± 0.1%이다.

1.2. H2k mdx 세포에서 스크리닝을 위한 P-PMO 펩타이드의 합성

a) 펩타이드 변이체 라이브러리의 제조

펩타이드를, Intavis Parallel Peptide Synthesizer를 사용하여 10 pmol 규모로, 또는 CEM Liberty Blue^TM Peptide Synthesizer (Buckingham, UK)를 사용하여 100 pmol 규모로, Fmoc-Ala-OH 예비 로딩된 Wang 수지 (0.19 또는 0.46 mmol g^-1, Merck Millipore)를 사용하고 표준 Fmoc 화학을 적용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 제조하였다. 상기 Intavis Parallel Peptide Synthesizer를 사용한 합성의 경우, PyBOP/NMM 커플링 혼합물을 사용한 이중 커플링 단계를 사용하고, 각각의 단계 후에 아세트산 무수물 캡핑을 수행하였다. CEM Liberty Blue Peptide Synthesizer를 사용한 합성의 경우, 이중 커플링이 수행되는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산에 대해 단일 표준 커플링을 실시하였다. 각각 2회 커플링된 아르기닌 잔기를 제외하고, 상기 커플링을 60 와트 마이크로파 전력에서 5분 동안 75℃에서 1회 수행하였다. 각각의 탈보호 반응을 35 와트 마이크로파 전력에서 75℃에서 2회, 즉, 한번은 30초 동안, 그 다음은 3분 동안 수행하였다. 일단 합성이 완료되면, 상기 수지를 DMF (3 x 50 mL)로 세척하고, 고체상 결합된 펩타이드의 N-말단을 실온에서 DIPEA의 존재 하에 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. N-말단의 아세틸화 후, 상기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 20 mL) 및 DCM (3 x 20 mL)으로 세척하였다. 3 시간 동안 실온에서 트리플루오로아세트산 (TFA): H₂O: 트리이소프로필실란 (TIPS) (95%: 2.5%: 2.5%: 3~10 mL)으로 이루어진 절단 칵테일에 의한 처리에 의해 상기 펩타이드를 고체 지지체로부터 절단하였다. 펩타이드 방출 후, 질소를 살포하여 과량의 TFA를 제거하였다. 냉 디에틸 에테르 (합성 규모에 따라 15~40 mL)의 첨가에 의해 조질 펩타이드를 침전시키고, 3200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 조질 펩타이드 펠렛을 냉 디에틸 에테르 (3 x 15 mL)로 3회 세척하고, 445-LC 규모 확대 모듈 및 440-LC 분획 수집기로 장착된 Varian 940-LC HPLC 시스템을 사용하여 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 15 mL min^-1의 유속으로 0.1% TFA/H₂O 중의 CH₃CN의 선형 구배를 사용하여 RP-C18 컬럼 (10 x 250 mm, Phenomenex Jupiter) 상에서 반-분취용 HPLC에 의해 펩타이드를 정제하였다. 검출을 220 nm 및 260 nm에서 수행하였다. 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획물들을 합하고, 동결 건조하여 펩타이드를 백색 고체로 수득하였다.

[표 4]

실시예에서 테스트하기 위해 N-말단 아세틸화 및 C-말단 베타-알라닌 링커로 합성된 펩타이드

Pip9b2 및 R6Gly는 비교 펩타이드이다. R6Gly는 C-말단 글리신을 링커로 사용한다.

b) PMO-펩타이드 접합체의 라이브러리의 합성

마우스 디스트로핀 엑손-23에 대한 25량체 PMO 안티센스 서열 (GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 90))을 사용하였다. 상기 펩타이드를 이의 C-말단 카복실기를 통해 PMO의 3'-말단에 접합하였다. 이는 펩타이드에 대해 2.3 당량의 DIPEA, 및 DMSO에 용해된 PMO에 대해 2.5배 과량의 펩타이드의 존재 하에 NMP 중의 각각 2.3 및 2 당량의 PyBOP 및 HOAt를 사용하여 달성되었다. 몇몇 예에서, 상기 펩타이드의 C-말단 카복실기의 활성화를 위해 PyBOP 대신에 2.3 당량의 HBTU를 사용하였다. 일반적으로, N-메틸피롤리돈 (NMP, 80 mL) 중 펩타이드 (2500 nmol)의 용액에 PyBOP (19.2 mL의 NMP 중의 0.3 M), HOAt (16.7 mL의 0.3 M NMP), DIPEA (1.0 pL) 및 PMO (100 mL의 DMSO 중의 10 mM)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 40℃에서 2.5 시간 동안 정치시키고, H₂O 중의 0.1% TFA (300 mL)의 첨가에 의해 반응을 ??칭하였다. 변환된 Gilson HPLC 시스템을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 용액을 정제하였다. 4 mL min^-1의 유속으로 20% CH₃CN을 함유하는 나트륨 포스페이트 완충액 (25 mM, pH 7.0) 중의 염화 나트륨 (0 내지 1M)의 선형 구배를 사용하여 상기 PMO-펩타이드 접합체를 이온 교환 컬럼 (Resource S 4 mL, GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 목적하는 화합물을 함유하는 분획물들을 합하고, 동결 건조하여 펩타이드-PMO 유도체를 백색 고체로 수득하였다. Amicon® ultra-15 3K 원심 분리 필터 장치를 사용하여 이온 교환 후에 수집된 분획물의 여과를 통해 펩타이드-PMO 접합체로부터 과량의 염을 제거하였다. 상기 접합체를 동결 건조시키고, MALDI-TOF로 분석하였다. 상기 접합체를 멸균수에 용해시키고, 사용 전에 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 여과하였다. 펩타이드-PMO의 농도를 0.1 N의 HCl 용액에서 접합체의 265 nm의 몰 흡광에 의해 결정하였다 (수율에 대해 표 5 참조).

[표 5]

세포 배양 분석을 위한 P-PMO 접합체의 수율 (상기 수율은 동결 건조된 정제된 P-PMO의 건물 중량을 기초로 함. 상기 P-PMO의 순도는 220 nm 및 260 nm에서 순상 HPLC로 확인된 바와 같이 95% 초과임. (a) 상기 P-PMO는 PyBOP 대신에 HBTU 활성화를 사용하여 합성되었음.)

1.3. 세포 배양

20% 열 불활성화 우태아 혈청 (FBS Gold; PAA laboratories), 2% 닭 배아 추출물 (Seralab), 1% 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 항생제 혼합물 (PSN; Gibco) 및 3 pg/μL의 γ-인터페론 (Roche)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco’s modified Eagles medium: DMEM; PAA laboratories) 중에서 10% CO₂ 하에 33℃에서 젤라틴 (0.01%) 코팅된 플라스크에서 쥐과 동물 H2k mdx 근모세포를 배양하였다. 세포를 젤라틴 (0.01%) 코팅된 24-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포/mL의 밀도로 씨딩하고, 33℃, 10% CO₂에서 2일 동안 정치하였다. 근관으로 분화시키기 위해, 세포를 5% 말 혈청 (Sigma) 및 1% PSN으로 보충된 DMEM 중에서 37℃, 5% CO₂ 하에 2일 동안 추가로 성장시켰다.

1.4. 세포 형질 감염

무혈청 Opti-MEM으로 구성된 상기에 기재된 바와 같이 제조된 펩타이드-PMO 접합체와 함께 세포를 인큐베이션하고, 350 mL를 중복으로 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 형질 감염 배지를 5% 말 혈청 및 1% PSN으로 보충된 DMEM으로 교체하고, 상기 세포를 37℃에서 20 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 0.5 mL의 TRI RNA (Sigma) 단리 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 -80℃에서 1 시간 동안 동결시켰다.

1.5. RNA 추출 및 네스티드 RT-PCR 분석

전체 세포 RNA를 에탄올에 의한 추가의 침전과 함께 TRI 시약을 사용하여 추출하였다. 상기 정제된 RNA를 Nanodrop® ND-1000 (Thermo Scientific)을 사용하여 정량화하였다. 상기 RNA (400 ng)를 OneStep RT-PCR 키트 (Roche, Indianapolis, USA)를 사용하는 RT-PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 프라이머 서열에 대해서는 표 7을 참조한다. 초기 역전사를 위한 주기 조건은 30분 동안 50℃ 및 7분 동안 94℃의 1회 주기 후, 20초 동안 94℃, 40초 동안 55℃ 및 80초 동안 68℃의 30회 주기이었다. 1 마이크로리터의 RT-PCR 산물을 제2 PCR 단계를 위한 주형으로 사용하였다. 0.5 U의 SuperTAQ를 사용하여 30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃의 25회 주기로 증폭을 수행하였다. 상기 산물들을 1.5% 아가로오스 겔을 사용하여 전기 영동에 의해 분리하였다. 아가로오스 겔의 이미지를 Molecular Imager ChemiDoc^TMXRS+ 이미징 시스템 (BioRad, UK) 상에서 촬영하였고, 이미지를 Image Lab (V4.1)을 사용하여 분석하였다. Microsoft Excel을 사용하여, 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터 엑손-23 스키핑의 퍼센트로 표현된 엑손-스키핑 검정 데이터를 분석 및 플롯팅하였다.

1.6. H2k mdx 마우스에서 테스트하기 위한 PMO-펩타이드 접합체의 합성

a) 펩타이드 변이체의 합성

제조업체의 권장 사항에 따라 CEM Liberty Blue^TM 마이크로파 Peptide Synthesizer (Buckingham, UK) 및 Fmoc 화학을 사용하여 펩타이드들을 100 pmol 규모로 합성하였다. 사용된 측쇄 보호기는 트리플루오로아세트산 처리에 불안정하였으며, DIPEA의 존재 하에 PyBOP (5배 과량)를 사용하여 활성화된 5배 과량의 Fmoc 보호된 아미노산 (0.25 mmol)을 사용하여 펩타이드들을 합성하였다. 피페리딘 (DMF 중의 20% v/v)을 사용하여 N-Fmoc 보호기를 제거하였다. 각각 2회 커플링된 아르기닌 잔기를 제외하고, 상기 커플링을 60 와트 마이크로파 전력에서 5분 동안 75℃에서 1회 수행하였다. 각각의 탈보호 반응을 35 와트 마이크로파 전력에서 75℃에서 2회, 즉, 한번은 30초 동안, 그 다음 한번은 3분 동안 수행하였다. 일단 합성이 완료되면, 상기 수지를 DMF (3 x 50 mL)로 세척하고, 고체상 결합된 펩타이드의 N-말단을 실온에서 DIPEA의 존재 하에 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. N-말단의 아세틸화 후, 상기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 20 mL) 및 DCM (3 x 20 mL)으로 세척하였다. 3 시간 동안 실온에서 트리플루오로아세트산 (TFA): H₂O: 트리이소프로필실란 (TIPS) (95%: 2.5%: 2.5%: 10 mL)으로 이루어진 절단 칵테일에 의한 처리에 의해 상기 펩타이드를 고체 지지체로부터 절단하였다. 질소를 살포하여 과량의 TFA를 제거하였다. 빙냉 디에틸 에테르의 첨가를 통해 절단된 펩타이드를 침전시키고, 3000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 조질 펩타이드 펠렛을 냉 디에틸 에테르 (3 x 40 mL)로 3회 세척하고, 445-LC 규모 확대 모듈 및 440-LC 분획 수집기로 장착된 Varian 940-LC HPLC 시스템을 사용하여 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 15 mL min^-1의 유속으로 0.1% TFA/H₂O 중의 CH₃CN의 선형 구배를 사용하여 RP-C18 컬럼 (10 x 250 mm, Phenomenex Jupiter) 상에서 반-분취용 HPLC에 의해 펩타이드를 정제하였다. 검출을 220 nm 및 260 nm에서 수행하였다.

b) PMO-펩타이드 접합체의 합성

마우스 디스트로핀 엑손-23에 대한 25량체 PMO 안티센스 서열 (GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 90))을 사용하였다. 상기 펩타이드를 이의 C-말단 카복실기를 통해 PMO의 3'-말단에 접합하였다. 이는 펩타이드에 대해 2.3 당량의 DIPEA, 및 DMSO에 용해된 PMO에 대해 2.5배 과량의 펩타이드의 존재 하에 NMP 중의 각각 2.3 및 2배 당량의 PyBOP 및 HOAt를 사용하여 달성되었다. 몇몇 예에서, 상기 펩타이드의 C-말단 카복실기의 활성화를 위해 PyBOP 대신에 HBTU (2.3 당량)를 사용하였다. 일반적으로, N-메틸피롤리돈 (NMP, 100 mL) 중 펩타이드 (10 pmol)의 용액에 PyBOP (76.6 mL의 NMP 중의 0.3 M), HOAt (66.7 mL의 0.3 M NMP), DIPEA (4.0 mL) 및 PMO (400 mL의 DMSO 중의 10 mM)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 40℃에서 2 시간 동안 정치시키고, 0.1% TFA (1 mL)의 첨가에 의해 반응을 ??칭하였다. 6 mL min^-1의 유속으로 20% CH₃CN을 함유하는 나트륨 포스페이트 완충액 (25 mM, pH 7.0) 중의 염화 나트륨 (0 내지 1M)의 선형 구배를 사용하여 반응물을 이온 교환 컬럼 (Resource S 6 mL 컬럼, GE Healthcare) 상에서 정제하였다. Amicon® ultra-15 3K 원심 분리 필터 장치를 사용하여 이온 교환 후에 수집된 분획물의 여과를 통해 펩타이드-PMO 접합체로부터 과량의 염을 제거하였다. 상기 접합체를 동결 건조시키고, MALDI-TOF로 분석하였다. 상기 접합체를 멸균수에 용해시키고, 사용 전에 0.22 pm 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 여과하였다. 펩타이드-PMO의 농도를 0.1 N의 HCl 용액에서 접합체의 265 nm의 몰 흡광에 의해 결정하였다. 전체 수율 (표 6)은 PMO를 기준으로 25~36%이었다.

[표 6]

생체내 분석을 위한 더 큰 규모로 합성된 P-PMO 접합체의 수율 (상기 수율은 동결 건조된 정제된 P-PMO의 건조 중량을 기초로 함. 상기 P-PMO의 순도는 220 nm 및 260 nm에서 정상 HPLC로 확인된 바와 같이 95% 초과임. (a) 상기 P-PMO는 PyBOP 대신에 HBTU 활성화를 사용하여 합성되었음.)

1.7. P-PMO에 의한 디스트로핀 복구의 생체내 평가

옥스포드 대학교 생의학 과학부의 기관 윤리 검토 후 홈 오피스 프로젝트 라이센스 승인 하에 실험을 수행하였다. 마우스를 최소 질환 시설에 수용하였으며; 환경은 12 시간의 명암 주기로 제어되는 온도이었다. 모든 동물은 시판되는 설치류 사료와 물을 무제한으로 공급받았다.

실험을 10~12 주령의 암컷 mdx 마우스에서 수행하였다. 10 mg/kg의 P-PMO의 단일 꼬리 정맥 주사 전에 Mdx 마우스를 구속하였다. 주사 1 주일 후에 마우스를 희생시키고, TA, 심장 및 횡격막 근육을 제거하고, 드라이아이스로 냉각된 이소펜탄에서 순간 동결시키고, -80℃에 보관하였다.

1.8. 웨스턴 블롯 분석

단일 투여 후에 디스트로핀 복구 기간을 평가하기 위해, 상기 근육 (TA 및 횡격막의 경우)의 1/3 또는 90개의 7 pm 두께의 횡 저온 절편 (심장의 경우)을 300 ml 완충액 (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 10% SDS 및 프로테아제/포스파타아제 억제제) 중에 용해시킨 후, 10분 동안 13000 rpm (Heraeus, #3325B)으로 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고, 100℃에서 3분 동안 가열하였다. 단백질을 BCA 방법으로 정량화하고, 40 pg의 단백질/샘플을 이전에 기재된 바 (19)와 같이 NuPage 3~8% 트리스-아세테이트 겔에서 분할하였다. 단백질을 0.45 pm 공극 크기의 PVDF 막으로 30V에서 1 시간 동안, 이어서 100V에서 1시간 동안 전달하고, 이전에 기재된 바와 같이 (37) 단클론 항-디스트로핀 (1:200, NCL-DYS1, Novocastra) 및 항-빈쿨린 (로딩 대조군, 1:100 000, hVIN-1, Sigma) 항체로 탐침하였다. 2차 항체 IRDye 800CW 염소 항-마우스를 1:20000 (LiCOR)으로 희석하여 사용하였다.

P-PMO 처리된 mdx 마우스의 디스트로핀 복구 수준은 100%로 간주되는 C57BL/10 야생형 대조군 마우스의 수준에 대해 표현되었다. 이를 위해, P-PMO 처리된 mdx 샘플과 병행하여 5개의 일련의 C57BL/10 단백질 희석물들을 포함시킴으로써 표준 곡선을 생성하였다. 희석 시리즈는 하기와 같았다: 레인 (lane) 당 로딩된 40 pg의 총 단백질 중 각각 75%, 40%, 15%, 5% 또는 0%는 C57BL/10 단백질 용해물로부터 유래되었고, 나머지는 미처리된 mdx 단백질 용해물로부터 유래되었다. 이들 표준물을 분취하고, 처리된 mdx 샘플과 병행하여 각각의 웨스턴 블롯에 사용하였다. 모든 표준물 및 처리된 샘플에 대해, 디스트로핀 세기 정량화를 형광 오디세이 이미징 시스템에 의해 수행하고, 모든 샘플에서 빈쿨린 형광 세기에 대한 비율을 계산하여 정규화하였다. 디스트로핀의 공지된 농도에 대해 표준 정규화된 값을 플롯팅하여 최적의 수학적 표현을 수득하고, 이러한 표현을 사용하여 P-PMO 처리된 mdx 마우스의 각각의 샘플의 정규화된 값을 보간하였다.

1.9. 생체내 Dmd 엑손 23 스키핑의 RT-qPCR 분석

마우스 Dmd 전사물로부터 엑손 23 제외의 정량화는 펩타이드-PMO로 처리된 골격근 및 심장 조직에 대해 수행되었다. 간단히 말하면, 트리졸 기반 추출 방법을 사용하여 균질화된 조직으로부터 RNA를 추출하고, 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 프라이머/프로브를 Integrated DNA Technologies에 의해 합성하고, 스키핑되지 않은 산물을 나타내는 엑손 23~24에 걸친 영역 (mDMD23~24, 표 7 참조)을 증폭시키거나, 엑손 22 및 24의 경계에 걸친 프로브 (mDMD22~24)를 사용하여 엑손 23 결여된 전사물을 특별히 증폭시키도록 디자인하였다. 공지된 전사물 양을 사용하여 제조된 표준 곡선에 대한 보정에 의해 각각의 전사물의 수준을 결정하고, 스키핑 퍼센트를 [skip]/[skip+unskip]에 의해 유도하였다.

[표 7]

네스티드 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR 방법에 의한 엑손 23 스키핑의 정량화를 위한 프라이머 및 프로브 서열

1.10. 펩타이드-PMO의 독성학적 평가

8~10 주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 볼루스 정맥내 꼬리 정맥 주사에 의해 0.9% 식염수 중의 30 mg/kg 단일 용량의 펩타이드-PMO를 투여하였다. 대사 케이지 (Tecniplast, UK)에서 20시간 동안 수용 후에 투여 후 2 일차 및 7 일차에 냉장 조건 하에 소변을 비-침습적으로 수집하였다. 7 일차에 부검에서 경정맥으로부터 혈청을 수집하고, 전경골근, 횡격막 및 심장 조직도 수집하였다.

0.9% 식염수 중의 2.5 mg/kg 내지 50 mg/kg 범위의 펩타이드-PMO의 다양한 단일 투약량으로 정맥내 꼬리 정맥 주사에 의해 동일한 절차를 따랐다.

표준 곡선에 맞도록 소변의 적절한 희석 후에 요중 신장 손상 분자-1 (KIM-1) 및 호중구 젤라티나아제 연관 리포칼린 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin: NGAL) 수준을 ELISA (KIM-1 R&D cat# MKM100, NGAL R&D cat# MLCN20)에 의해 정량화하였다. MRC Harwell Institute (Mary Lyon Centre, Oxfordshire, UK)에서 정량화된 요중 크레아티닌 수준에 대해 값들을 정규화하였다. 혈청 혈중 요소 질소 수준을 MRC Harwell Institute (Mary Lyon Centre, Oxfordshire, UK)에서 정량화하였다.

모든 수준을 AU680 Clinical Chemistry Analyser (Beckman Coulter) 상에서 정량화하였다.

엑손 스키핑 효능의 정량화를 엑손 23 스키핑된 전사물과 스키핑되지 않은 전사물의 정량적 RT-PCR에 의해 결정하고, 전체 전사물 (스키핑된 전사물과 스키핑되지 않은 전사물)에 대한 스키핑된 전사물의 퍼센트로 표현하였다 (서열에 대해 표 7 참조).

2. 결과

본 출원에 제공된 결과는 세포내 엑손 스키핑 활성에 있어서 본 출원에서 생성된 펩타이드-PMO 접합체의 명확한 용량 반응 효과를 입증한다 (도 1, 2 및 12). 이들 도면은 또한 모든 DPEP1 및 DPEP3 시리즈, 즉, 본 발명의 펩타이드가 치료학적 용도로 고려될 수 있을 정도로 세포에서 충분한 세포 투과 효능을 가짐을 강조한다.

본 출원에 제공된 결과는 질환의 관련 마우스 모델에서 생체내 펩타이드-PMO 접합체의 활성을 추가로 강조한다 (도 3~4). 전반적으로, 결과는 이러한 접합체의 활성이 전경골근 > 횡격막 > 심장에서 가장 크다는 것을 시사한다. 이들 도면은 본 발명의 DPEP 펩타이드 접합체가 생체내에서 양호한 엑손 스키핑 활성을 가지며, 생체내에서 디스트로핀 단백질 발현의 증가를 제공함을 입증한다. 또한, 본 발명의 DPEP 접합체는 동일한 접합체에서 사용될 때 'PIP' 펩타이드 및 R6Gly와 같은 이전의 세포 투과성 펩타이드와 두 양태들 모두에서 유리하게 비교된다. DPEP 펩타이드 접합체 화합물 투여 후의 KIM-1 및 NGAL (신독성의 인디케이터임)의 수준이 이전의 세포 투과성 펩타이드와의 접합체보다 모두 유의하게 더 낮다는 것이 또한 본 출원에서 입증된다. DPEP 1.9 및 3.8 접합체들은 이러한 마커들의 최저 수준을 나타냈다 (도 5, 6 및 11). 혈청 혈중 요소 질소 수준 (신장 기능 장애의 또 다른 마커)은 또한 Pip9b2를 갖는 접합체에 대해서만 상승하고, 본 발명의 DPEP 펩타이드를 갖는 접합체에 대해서는 상승하지 않았다 (도 7). 두 번째 주요 발견은 투여 후 7 일차의 KIM-1 및 NGAL 수준이 모든 DPEP 펩타이드 접합체에 대해 거의 식염수 수준으로 감소된다는 것인데, 이는 신장 관련 독성의 일부 역전 및 개선이 또한 있음을 시사한다. 이전의 세포 투과성 펩타이드를 사용하는 접합체에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다. 이러한 독성 역전 효과는 50 mg/kg의 고용량으로 투여될 때 본 발명의 DPEP 펩타이드에서 여전히 관찰된다 (도 11). 이전의 세포 투과성 펩타이드는 7일 후에 독성 감소를 나타내지 않았고, 독성 마커가 전체에 걸쳐 훨씬 더 높게 유지되었다.

엑손 스키핑 활성은 30 및 50 mg/kg의 더 높은 용량에서 TA 및 횡격막 (도 10 및 12)에서 모든 DPEP 펩타이드 접합체에 대해 높게 유지된다는 것이 추가로 입증되었는데, 이는 감소된 수준의 신장 손상 마커로 확증될 때, 독성 마커가 여러 배 더 낮기 때문에 이러한 화합물들에 대한 더 넓은 치료 지수를 시사한다. 모든 DPEP 펩타이드 접합체는 접합체 중의 공지된 R6Gly 비교체보다 더 높은 활성을 가지면서도 적어도 유사한 수준의 독성 마커를 유지하고, 접합체 중의 공지된 PIP 펩타이드 비교체와 유사한 활성을 가지면서도 훨씬 더 낮은 수준의 독성 마커를 갖는다는 것에 또한 주목할 필요가 있다. 일부 경우에서, 본 발명의 DPEP 펩타이드 접합체는 공지된 R6Gly 접합체와 비교하여 증가된 활성뿐만 아니라 감소된 독성 마커도 나타낸다.

그러므로, 본 발명의 DPEP1 및 DPEP3 펩타이드들은 사람의 신경근 장애 치료를 위한 치료학적 접합체의 효능을 개선시키고 독성을 감소시키는 유망한 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.

3. 추가의 실시예

P-PMO 합성 및 준비

9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호된 L-아미노산, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 (PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 Fmoc-Ala-OH 예비 로딩된 Wang 수지 (0.19 또는 0.46 mmol g^-1)는 Merck (Hohenbrunn, Germany)에서 입수하였다. 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt)은 Sigma-Aldrich에서 입수하였다. HPLC 등급 아세토니트릴, 메탄올 및 합성 등급 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)은 Fisher Scientific (Loughborough, UK)에서 구입하였다. 펩타이드 합성 등급 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 및 디에틸 에테르는 VWR (Leicestershire, UK)에서 입수하였다. 피페리딘 및 트리플루오로아세트산 (TFA)은 Alfa Aesar (Heysham, England)에서 입수하였다. PMO는 Gene Tools Inc. (Philomath, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는다면 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 입수하였다. MALDI-TOF 질량 분광법은 Voyager DE Pro BioSpectrometry 워크스테이션을 사용하여 수행되었다. 물 중 50% 아세토니트릴 중의 α-시아노-4-하이드록시신남산 또는 시나핀산의 10 mg mL^-1의 스톡 용액을 매트릭스로서 사용하였다. 오차 막대는 ± 0.1%이다.

세포에서 스크리닝을 위한 P-PMO 펩타이드의 합성

a) 펩타이드 변이체 라이브러리의 제조

펩타이드를, Intavis Parallel Peptide Synthesizer를 사용하여 10 pmol 규모로, 또는 CEM Liberty Blue^TM Peptide Synthesizer (Buckingham, UK)를 사용하여 100 pmol 규모로, Fmoc-Ala-OH 예비 로딩된 Wang 수지 (0.19 또는 0.46 mmol g^-1, Merck Millipore)를 사용하고 표준 Fmoc 화학을 적용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 제조하였다. 상기 Intavis Parallel Peptide Synthesizer를 사용한 합성의 경우, PyBOP/NMM 커플링 혼합물을 사용한 이중 커플링 단계를 사용하고, 각각의 단계 후에 아세트산 무수물 캡핑을 수행하였다. CEM Liberty Blue Peptide Synthesizer를 사용한 합성의 경우, 이중 커플링이 수행되는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산에 대해 단일 표준 커플링을 실시하였다. 각각 2회 커플링된 아르기닌 잔기를 제외하고, 상기 커플링을 60 와트 마이크로파 전력에서 5분 동안 75℃에서 1회 수행하였다. 각각의 탈보호 반응을 35 와트 마이크로파 전력에서 75℃에서 2회, 즉, 한번은 30초 동안, 그 다음은 3분 동안 수행하였다. 일단 합성이 완료되면, 상기 수지를 DMF (3 x 50 mL)로 세척하고, 고체상 결합된 펩타이드의 N-말단을 실온에서 DIPEA의 존재 하에 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. N-말단의 아세틸화 후, 상기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 20 mL) 및 DCM (3 x 20 mL)으로 세척하였다. 3 시간 동안 실온에서 트리플루오로아세트산 (TFA): H₂O: 트리이소프로필실란 (TIPS) (95%: 2.5%: 2.5%: 3~10 mL)으로 이루어진 절단 칵테일에 의한 처리에 의해 상기 펩타이드를 고체 지지체로부터 절단하였다. 펩타이드 방출 후, 질소를 살포하여 과량의 TFA를 제거하였다. 냉 디에틸 에테르 (합성 규모에 따라 15~40 mL)의 첨가에 의해 조질 펩타이드를 침전시키고, 3200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 조질 펩타이드 펠렛을 냉 디에틸 에테르 (3 x 15 mL)로 3회 세척하고, 445-LC 규모 확대 모듈 및 440-LC 분획 수집기로 장착된 Varian 940-LC HPLC 시스템을 사용하여 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 15 mL min^-1의 유속으로 0.1% TFA/H₂O 중의 CH₃CN의 선형 구배를 사용하여 RP-C18 컬럼 (10 x 250 mm, Phenomenex Jupiter) 상에서 반-분취용 HPLC에 의해 펩타이드를 정제하였다. 검출을 220 nm 및 260 nm에서 수행하였다. 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획물들을 합하고, 동결 건조하여 펩타이드를 백색 고체로 수득하였다 (수율에 대해 표 8 참조).

[표 8]

실시예에서 테스트하기 위해 N-말단 아세틸화 (Ac), C-말단 β-알라닌 링커 (B)로 합성된 펩타이드

S*는 글루코실화된 세린 잔기이다. DPEP5.7, Pip9b2 및 Pip6a는 비교 펩타이드이다.

b) 펩타이드-PMO 접합체 라이브러리의 합성

달리 [CAG]₇로 공지된 트리플렛 반복 서열에 대한 21량체 PMO 안티센스 서열 CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG (서열 번호 192)을 사용하였다. 상기 펩타이드를 이의 C-말단 카복실기를 통해 PMO의 3'-말단에 접합하였다. 이는 2.5 당량의 DIPEA, 및 DMSO에 용해된 PMO에 대해 2.5배 과량의 펩타이드의 존재 하에 NMP 중의 각각 2.5 및 2 당량의 PyBOP 및 HOAt를 사용하여 달성되었다. 일반적으로, N-메틸피롤리돈 (NMP, 80 pL) 중 펩타이드 (2500 nmol)의 용액에 PyBOP (19.2 mL의 NMP 중의 0.3 M), HOAt (16.7 mL의 0.3 M NMP), DIPEA (1.0 mL) 및 PMO (180 pL의 DMSO 중의 10 mM)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 40℃에서 2.5 시간 동안 정치시키고, H₂O 중의 0.1% TFA (300 pL)의 첨가에 의해 반응을 ??칭하였다. 변환된 Gilson HPLC 시스템을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 용액을 정제하였다. 20% CH₃CN을 함유하는 나트륨 포스페이트 완충액 (25 mM, pH 7.0)의 선형 구배를 사용하여 상기 PMO-펩타이드 접합체를 이온 교환 컬럼 (Resource S 4 mL, GE Healthcare) 상에서 정제하였다. 염화 나트륨 용액 (1 M)을 사용하여 4 mL min^-1 또는 6 mL min^-1의 유속으로 컬럼으로부터 접합체를 용출시켰다. 목적하는 화합물을 함유하는 분획물들을 합하여 즉시 탈염하였다. Amicon® ultra-15 3K 원심 분리 필터 장치를 사용하여 이온 교환 후에 수집된 분획물의 여과를 통해 펩타이드-PMO 접합체로부터 과량의 염을 제거하였다. 상기 접합체를 동결 건조시키고, MALDI-TOF로 분석하였다. 상기 접합체를 멸균수에 용해시키고, 사용 전에 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 여과하였다. 펩타이드-PMO의 농도를 0.1 N의 HCl 용액에서 접합체의 265 nm의 몰 흡광에 의해 결정하였다 (수율에 대해 표 9 참조).

[표 9]

세포 배양 분석 및 생체내 실험을 위한 P-PMO 접합체의 수율 (상기 수율은 동결 건조된 정제된 P-PMO의 건조 중량을 기초로 함. 상기 P-PMO의 순도는 220 nm 및 260 nm에서 순상 HPLC로 확인된 바와 같이 95% 초과임.)

펩타이드-PMO 접합체의 합성

펩타이드를 이전에 기재된 바와 같이 합성하고 PMO에 접합시켰다. CUG/CTG 확장된 반복부를 표적화하는 PMO 서열 (5-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3' (서열 번호 192))은 Gene Tools LLC에서 구입하였다. 이는 본 출원의 다른 곳에 언급된 [CAG]₇ PMO이다.

세포 배양 및 펩타이드-PMO 처리

건강한 개체 또는 2600 CTG 반복부를 갖는 DM1 환자 유래의 불멸화 근모세포를, 20% FBS (Life Technologies), 50 pg/ml의 겐타마이신 (Life Technologies), 25 pg/ml의 페투인, 0.5 ng/ml의 bFGF, 5 ng/ml의 EGF 및 0.2 pg/ml의 덱사메타손 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 M199: DMEM의 믹스 (1:4 비율; Life technologies)로 이루어진 성장 배지에서 배양하였다. 근모세포에 대해 5 pg/ml의 인슐린 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 DMEM 배지로 컨플루언트 세포 배양물 (confluent cell cultures)을 변경하여 근육 세포 분화를 유도하였다. 처리를 위해, WT 또는 DM1 세포를 4일 동안 분화시켰다. 그 다음, 1, 2, 5, 10, 20 또는 40 pM 농도의 펩타이드-PMO 접합체를 갖는 새로운 분화 배지로 배지를 교체하였다. 처리 후 48 시간에 분석을 위해 세포를 수확하였다. 형광 기반 검정 (Promega)를 사용하여 사람 간세포에서 40 uM, 또는 사람 근모세포에서 1, 2, 5, 10, 20 또는 40 pM 농도의 펩타이드-PMO의 형질 감염 2일 후에 세포 생존율을 정량화하였다.

RNA 단리, RT-PCR 및 qPCR 분석

마우스 조직의 경우: RNA 추출 전에, Fastprep 시스템 및 Lysing Matrix D 튜브 (MP biomedicals)를 사용하여 TriReagent (Sigma-Aldrich)에서 근육을 파쇄하였다. 사람 세포의 경우: RNA 추출 전에, 세포를 프로테이나아제 K 완충액 (500 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM EDTA, 2% SDS 및 0.5 mg/ml의 프로테이나아제 K) 중에 45분 동안 55℃에서 용해시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 TriReagent를 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. 제조업체의 지침에 따라 총 20 pL의 M-MLV 1차 가닥 합성 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 1 마이크로그램의 RNA를 역전사시켰다. 이후에, 1 마이크로리터의 cDNA 제제를 표준 프로토콜 (ReddyMix, Thermo Scientific)에 따라 반정량적 PCR 분석에 사용하였다. PCR 증폭을 각각의 유전자에 대한 선형 증폭 범위 내에서 25~35회 주기 동안 수행하였다. PCR 산물을 1.5~2%의 아가로오스 겔 상에서 분할하고, 에티듐 브로마이드 염색하고, ImageJ 소프트웨어로 정량화하였다. 엑손 포함 비율을 이소형 신호의 전체 세기에 대한 포함 퍼센트로 정량화하였다. 프라이머는 하기 표 10에 나타나 있다.

[표 10]

PCR을 위한 프라이머

독성학

섹션 1.10에서 상기에 기재된 바와 같이 독성 평가를 수행하였다.

결과

처리된 DM1 환자 유래 근육 세포 (근모세포)는 상기 DPEP 1 또는 3 펩타이드-[CAG]₇ PMO 접합체가 돌연 변이체 CUGexp-DMPK 전사물을 특이적으로 표적화하여 핵 RNA 촛점(foci)에 의한 MBNL1 스플라이싱 인자의 유해한 격리, 및 결과적으로, 스플라이싱 결함 및 근육 기능 장애의 원인이 되는 MBNL1 기능 소실을 방지한다는 것을 나타냈다. DPEP1/3 펩타이드-[CAG]₇ PMO 접합체는 세포를 투과하여 스플라이싱 정상화를 높은 효능으로 유도한다 (도 13). 소위 'ORER1 및 DPEP3' 펩타이드의 이러한 새로운 생성은 CAG7 반복 안티센스 올리고뉴클레오타이드 PMO에 접합될 때 시험관내 스플라이싱 결함을 교정하는데 높은 효능을 나타냈는데, 이는 DM1 치료를 위한 강력한 치료학적 용도를 나타낸다.

또한, DPEP1/3으로 형성된 접합체의 예비 독성 평가는 ALP, ALT, AST, KIM-1, BUN, NGAL 및 크레아티닌 수준이 Pip 시리즈로부터 현재 이용 가능한 펩타이드 담체에 의해 전형적으로 유도된 배수 증가와 대조적으로 식염수 대조군 주사와 유사하였음을 나타낸다. 이러한 예비 데이터를 통해, 본 발명자들은 [CAG]₇ PMO와 DPEP 펩타이드로부터 형성된 접합체가 Pip6a와 같은 종래 펩타이드로 형성된 접합체만큼 활성을 가지면서도 보다 적은 독성 때문에 더 넓은 치료 범위를 갖는다는 것을 밝혀냈다 (도 15~19).

실시예 2

1. 재료 및 방법

1.1. 재료

9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호된 L-아미노산, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 (PyBOP), Rink 아미드 수지 (0.46 mmol g^-1) 및 Fmoc-P-Ala-OH 예비 로딩된 Wang 수지 (0.19 또는 0.46 mmol g^-1)는 Merck Millipore (Hohenbrunn, Germany)에서 입수하였다. Tentagel 하이드록시-트리틸 수지는 Rapp Polymere (Tuebingen, Germany)에서 구입하였다. HPLC 등급 아세토니트릴, 메탄올 및 합성 등급 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)은 Fisher Scientific (Loughborough, UK)에서 구입하였다. 펩타이드 합성 등급 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 및 디에틸 에테르는 VWR (Leicestershire, UK)에서 입수하였다. 피페리딘 및 트리플루오로아세트산 (TFA)은 Alfa Aesar (Heysham, England)에서 입수하였다. PMO는 Gene Tools Inc. (Philomath, USA)에서 구입하였다. MALDI-TOF 질량 분광법은 Voyager DE Pro BioSpectrometry (Applied Biosystems, Cheshire UK) 워크스테이션을 사용하여 수행되었다. 물 중 50% 아세토니트릴 중의 α-시아노-4-하이드록시신남산 또는 시나핀산의 10 mg mL^-1의 스톡 용액을 매트릭스로서 사용하였다. 분석용 및 반분취용 HPLC를 Varian 940-LC HPLC 시스템 (Yarnton, UK) 상에서 수행하였다. DMEM 배지 (31966047), 소 태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) (10270106), 항생제 항진균 용액 (A5955), 에티듐 브로마이드 (15585011), 2x ReddyMix PCR Master Mix (AB0575DCLDB), M-MLV 1차 가닥 합성 시스템 (28025013) 및 TRIzol 시약 (15596026)은 ThermoFisher Scientific에서 구입하였다. RealTime-GIo^TM MT 세포 생존율 검정 (G9711), Maxwell® 16 전체 RNA 정제 키트 (AS1050)는 Promega에서 구입하였다. 근모세포 세포를 PromoCell 골격근 세포 성장 배지 키트 (C-23160)를 사용하여 배양하였다. 인슐린 (91077C)과 아가로오스 (A9539)는 SigmaAldrich에서 구입하였다. DNA 마커 - HyperLadder 50bp (BIO-33039)는 BioLine Reagents에서 구입하였다. 모든 프라이머는 IDT를 통해 주문하였다. 소변 수집을 위해, 마우스를 Tecniplast (UK)의 대사 케이지에 한마리씩 사육하였으며, 신장 손상 마커-1 (KIM-1) (MKM100)에 대한 소변 바이오마커 ELISA는 R&D에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는다면 Sigma-Aldrich (United Kingdom)에서 입수하였다.

1.2. 펩타이드-PMO 접합체의 합성

1.2.1. 마이크로파 합성기를 통한 펩타이드 변이체의 합성

제조업체의 권장 사항에 따라 CEM Liberty Blue^TM 마이크로파 Peptide Synthesizer (Buckingham, UK) 및 Fmoc 화학을 사용하여 펩타이드들을 100 pmol 규모로 합성하였다. 링커로서 글루탐산 또는 석신산으로 합성된 펩타이드는 Rink 아미드 수지로 합성되어 TFA 절단 후 펩타이드의 카복실 말단 상에 아미드를 제공한다. 예비 로딩된 Wang 수지를 사용하여 β--알라닌 링커를 갖는 펩타이드를 합성하였다. 상기 방법과 링커를 사용하여 합성된 펩타이드의 전체 목록은 표 11에 요약되어 있다. 사용된 측쇄 보호기는 TFA 처리에 불안정하였으며, DIPEA의 존재 하에 PyBOP (5배 과량)를 사용하여 활성화된 5배 과량의 Fmoc 보호된 아미노산 (0.25 mmol)을 사용하여 펩타이드들을 합성하였다. 피페리딘 (DMF 중의 20% v/v)을 사용하여 N-Fmoc 보호기를 제거하였다. 각각 2회 커플링된 아르기닌 잔기를 제외하고, 상기 커플링을 60 와트 마이크로파 전력에서 5분 동안 75℃에서 1회 수행하였다. 각각의 탈보호 반응을 35 와트 마이크로파 전력에서 75℃에서 2회, 즉, 한번은 30초 동안, 그 다음 한번은 3분 동안 수행하였다. 일단 합성이 완료되면, 상기 수지를 DMF (3 x 50 mL)로 세척하고, 고체상 결합된 펩타이드의 N-말단을 15분 동안 실온에서 DIPEA의 존재 하에 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. N-말단의 아세틸화 후, 상기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 20 mL) 및 DCM (3 x 20 mL)으로 세척하였다. N-말단 상에 석신산을 갖는 DPEP 펩타이드의 경우, N-말단의 아세틸화가 수행되지 않았다. 대신, 펩타이드의 유리 N-말단을 DIPEA 존재 하에 실온에서 30분 동안 무수 석신산으로 처리한 후 DMF (3 x 20 mL)로 세척하였다. 링커로서 N-말단 상에 글루탐산을 보유하는 DPEP 펩타이드의 경우, N-말단을 기재된 바와 같이 아세틸화하였지만, PMO의 부착을 측쇄 카복실기 상에서 수행하였다.

1.2.2. Intavis Multipep 합성기를 통한 펩타이드 변이체의 합성

제조업체의 권장 사항에 따라 Intavis Multipep 합성기 및 Fmoc 화학을 사용하여 γ-아미노부티르산 링커로 합성된 펩타이드를 실온에서 Tentagel Cl-트리틸 수지 상에서 합성하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라 아세틸 클로라이드를 사용하여 Tentagel® Cl-트리틸 수지를 Tentagel® 하이드록시-트리틸 수지로부터 제조하였다. 간단히 말하면, 수지 (1 g)를 DMF (2 x 10 mL), 건조 DCM (3 x 10 mL) 및 건조 톨루엔 (3 x 10 mL)으로 세척하여 콘덴서가 장착된 둥근 바닥 튜브로 옮겼다. 수지를 덮을 만큼 충분한 톨루엔을 첨가한 다음, 아세틸 클로라이드를 적가하고 (1 mL g^-1의 수지, 총 부피 1 mL), 혼합물을 온화하게 교반하면서 60~70℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 완료되면, 수지를 실온으로 냉각시킨 다음, 톨루엔 (5 x 15 mL), DMF (5 x 15 mL) 및 최종적으로 건조 DCM (3 x 15 mL)로 완전히 세척하였다. 그 다음, DIEA (8 당량)가 포함된 DCM 중의 Fmoc-γ-아미노부티르산 (3 당량)을 수지에 15분 동안 로딩한 후, 추가의 DIEA (4 당량)를 첨가하고 반응물을 총 1 시간 동안 혼합하였다. 1 시간 후, 그 다음, 수지를 MeOH (0.8 mL g^-1)로 15분 동안 캡핑한 다음, DMF (5 x 10 mL) 및 DCM (5 x 15 mL)으로 세척하였다. 0.41 mmol g^-1이 되도록 304 nm에서 UV/가시 광선 분광 광도계 상의 Fmoc 측정에 의해 수지의 수율 및 로딩을 수행하고 수지를 즉시 사용하였다.

전형적으로, TFA에 불안정한 측쇄 보호기를 갖는 표준 Fmoc 아미노산을 사용하여 펩타이드를 100 pmol 규모로 합성하였고, 4-메틸모르폴린의 존재 하에 PyBOP (5배 과량)를 사용하여 활성화된 5배 과량의 Fmoc 보호 아미노산 (0.50 mmol)을 사용하여 펩타이드를 합성하였다. 이중 커플링 단계를 사용한 후, 각각의 단계 후에 아세트산 무수물 캡핑을 수행하였다. 피페리딘 (DMF 중의 20% v/v)을 사용하여 N-Fmoc 보호기를 제거하였다. 각각의 탈보호 주기를 실온에서 각각 10분 동안 2회 수행하였다. 일단 합성이 완료되면, 상기 수지를 DMF (3 x 50 mL)로 세척하고, 고체상 결합된 펩타이드의 N-말단을 15분 동안 실온에서 DIPEA의 존재 하에 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. N-말단의 아세틸화 후, 상기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 20 mL) 및 DCM (3 x 20 mL)으로 세척하였다.

[표 11]

다양한 링커를 갖는 펩타이드의 합성 방법 및 사용된 수지와 생성된 C-말단 변형

1.2.3. 고체 지지체 절단 및 반-분취용 HPLC를 통한 펩타이드 정제

3 시간 동안 실온에서 TFA/H₂O/트리이소프로필실란 (TIPS) (95:2.5:2.5: 10 mL)으로 이루어진 절단 칵테일에 의한 처리에 의해 상기 펩타이드를 고체 지지체로부터 절단하였다. 질소를 살포하여 과량의 TFA를 제거하였다. 빙냉 디에틸 에테르의 첨가를 통해 절단된 펩타이드를 침전시키고, 3000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 조질 펩타이드 펠렛을 냉 디에틸 에테르 (3 x 40 mL)로 3회 세척하고, 445-LC 규모 확대 모듈 및 440-LC 분획 수집기로 장착된 Varian 940-LC HPLC 시스템을 사용하여 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 15분에 걸쳐 15 mL min^-1의 유속으로 0.1% TFA/H₂O 중의 CH₃CN (0~99%, CH₃CN 중의 0.1% TFA)의 선형 구배를 사용하여 RP-C18 컬럼 (10 x 250 mm, Phenomenex Jupiter) 상에서 반-분취용 HPLC에 의해 펩타이드를 정제하였다. 검출을 220 nm 및 260 nm에서 수행하였다.

[표 12]

실시예에서 다양한 링커 및 부착 지점으로 테스트하기 위해 합성된 펩타이드 서열

^a링커는 단일 아미노산 약어로 열거된다. ^b링커 부착은 펩타이드에 대해 C-말단 = 카복실 말단, N-말단 = 아미노-말단이다. 서열 번호는 링커와 같은 임의의 추가의 N 및 C-말단 변형이 없는 펩타이드의 서열을 지칭한다.

1.2.4. 펩타이드-PMO 접합체의 합성

마우스 디스트로핀 엑손-23에 대한 25량체 PMO 안티센스 서열 (GGCC AAACCT CGGCTT ACCT G AAAT (서열 번호 90)을 사용하였다. 펩타이드를 링커 부착 부위에 따라 C-말단 카복실기 또는 N-말단 아미노기를 통해 PMO의 3'-말단에 접합시켰다. 이는 펩타이드에 대해 2.3 당량의 DIPEA, 및 DMSO에 용해된 PMO에 대해 2.5배 과량의 펩타이드의 존재 하에 NMP 중의 각각 2.3 및 2배 당량의 PyBOP 및 HOAt를 사용하여 달성되었다. 일반적으로, N-메틸피롤리돈 (NMP, 100 mL) 중 펩타이드 (10 mmol)의 용액에 PyBOP (76.6 mL의 NMP 중의 0.3 M), HOAt (66.7 mL의 0.3 M NMP), DIPEA (4.0 mL) 및 PMO (4 pmol, 400 pL의 DMSO 중의 10 mM)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 40℃에서 2 시간 동안 정치시키고, H₂O (1 mL)의 첨가에 의해 반응을 ??칭하였다. 6 mL min^-1의 유속으로 20% CH₃CN을 함유하는 나트륨 포스페이트 완충액 (25 mM, pH 7.0) 중의 염화 나트륨 (0 내지 1M)의 선형 구배를 사용하여 반응물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (Resource S 6 H mL 컬럼, GE Healthcare) 상에서 정제하였다. Amicon® ultra-15 3K 원심 분리 필터 장치를 사용하여 이온 교환 후에 수집된 분획물의 여과를 통해 펩타이드-PMO (P-PMO) 접합체로부터 과량의 염을 제거하였다. 상기 접합체를 동결 건조시키고, MALDI-TOF로 분석하였다. 상기 접합체를 멸균수에 용해시키고, 사용 전에 0.22 pm 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 여과하였다. P-PMO의 농도를 0.1 M HCl 용액에서 접합체의 265 nm의 몰 흡광에 의해 결정하였다. 전체 수율 (표 13)은 P-PMO를 기준으로 26~64%이었다.

[표 13]

생체내 분석을 위해 더 큰 규모로 합성된 P-PMO 접합체의 수율 (상기 수율은 UV-Vis 분광법을 통해 계산되며 PMO의 흡광 계수를 기반으로 함).

상기 P-PMO의 순도는 220 nm 및 260 nm에서 순상 HPLC로 확인된 바와 같이 95% 초과이다. ^a펩타이드에 접합시키는 데 사용되는 PMO는 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3' (서열 번호 90)의 서열을 갖는다. PMO의 부착은 여기서 굵은 이탤릭체로 제공되고 링커는 괄호 안에 제공된다.

하기 비교 접합체를 또한 합성하고/수득하였고, 동일한 PMO를 비교 링커를 사용하여 펩타이드에 접합시켰다.

[표 14]

비교 펩타이드

1.3. P-PMO의 정량화 및 재구성

P-PMO를 RNase 무함유 물 중에 용해시켰다. 이러한 용액으로부터, 분취량을 0.1 M HCl 중에 100배 희석하고, 265nm에서 UV-VIS를 통해 측정하였다. 하기 Beer-Lambert 법칙을 사용하여 농도를 결정하였다:

사용하기 전에, P-PMO를 실온으로 해동하고 (미리 냉동한 경우), 잠시 와동시킨 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후에, P-PMO 분취량을 초음파 처리기 수조에서 5분 동안 초음파 처리하였다. 마지막으로, P-PMO를 잠시 와동시키고 펄스 회전시켰다.

(0.9% 식염수의 최종 농도까지) RNase 무함유 물 및 9% 식염수에 희석된 목적하는 처리 농도로 P-PMO를 합하여 주사 용액을 제조하였다.

1.4. 생체내 P-PMO 치료 평가

1.4.1. P-PMO의 전신 투여

Home Office Project License (UK) 허가 하에 The Animals (Scientific Procedures) Act 1986 및 기관 윤리 검토에 따라 옥스퍼드 대학교 생의학 과학부에서 모든 동물 실험을 수행하였다. 마우스를 특정 병원체 없는 질환 시설에 수용하였으며; 환경은 12 시간의 명암 주기로 제어되는 온도 및 습도이었다. 모든 동물은 시판되는 설치류 사료와 물을 무제한으로 공급받았다.

실험을 8~10주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행하였다. 마우스에게 0.9% 식염수, 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 50 mg/kg의 P-PMO의 단일 볼루스 정맥내 꼬리 정맥 주사를 투여하였다. 주사 1 주일 후에 마우스를 희생시키고, 전경골근, 횡격막 및 심장 근육을 제거하고, 드라이아이스에서 순간 동결시키고, -80℃에 보관하였다.

1.4.2. P-PMO의 독성학적 평가

P-PMO (섹션 1.4.1 참조)의 정맥내 투여 후, 대사 케이지에 20 시간 동안 수용한 후 투여 후 2 일차 및 7 일차에 냉각 조건 하에 소변을 비침습적으로 수집하였다. 혈액을 부검 동안 7 일차에 경정맥으로부터 수집하고, 혈액을 분획화하고, 혈청을 수집하였다. 전경골근, 횡격막 및 심장 조직을 부검 동안 7 일차에 수집하였다. 표준 곡선에 맞도록 소변의 적절한 희석 후 ELISA에 의해 요중 신장 손상 분자-1 (KIM-1) 수준을 정량화하였다. MRC Harwell Institute (Mary Lyon Centre, Oxfordshire, UK)에서 정량화된 요중 크레아티닌 수준에 대해 KIM-1 값들을 정규화하였다.

1.4.3. P-PMO 유도된 엑손 스키핑의 qPCR 분석

P-PMO 유도된 엑손 스키핑의 정량화를 투여 후 7 일차에 전경골근 (TA), 횡격막 및 심장 근육에 대해 수행하였다. 간단히 말하면, 트리졸 기반 추출 방법을 사용하여 균질화된 조직으로부터 RNA를 추출하고, 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 프라이머/프로브를 Integrated DNA Technologies에 의해 합성하고, 스키핑되지 않은 산물을 나타내는 엑손 23~24에 걸친 영역 (mDMD23-24, 표 14 참조)을 증폭시키거나, 엑손 22 및 24의 경계에 걸친 프로브 (mDMD22-24)를 사용하여 엑손 23 결여된 전사물을 특별히 증폭시키도록 디자인하였다. 각각의 전사물 수준을 스키핑된 전사물과 스키핑되지 않은 전사물에 의해 결정하고, 전체 전사물 (스키핑된 전사물과 스키핑되지 않은 전사물)에 대한 스키핑된 전사물의 퍼센트로 표현하였다 (서열에 대해 표 15 참조).

[표 15]

qPCR 방법에 의한 마우스 디스트로핀 (엑손 23) 엑손 스키핑의 정량화를 위한 프라이머 및 프로브 서열

2. 추가의 실시예

펩타이드-PMO 접합체의 합성. 펩타이드를 이전에 기재된 바와 같이 합성하고 PMO에 접합시켰다. CUG 확장된 반복부를 표적화하는 PMO 서열 (5-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3' (서열 번호 192)은 Gene Tools LLC에서 구입하고 추가의 접합체를 제조하는데 사용하였다.

세포 배양 및 Peptide-PMO 처리

건강한 개체 또는 2600 CTG 반복부를 갖는 DM1 환자 유래의 불멸화 근모세포를, 20% FBS (Life Technologies), 50 pg/ml의 겐타마이신 (Life Technologies), 25 pg/ml의 페투인, 0.5 ng/ml의 bFGF, 5 ng/ml의 EGF 및 0.2 pg/ml의 덱사메타손 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 M199: DMEM의 믹스 (1:4 비율; Life technologies)로 이루어진 성장 배지에서 배양하였다. 근모세포에 대해 5 pg/ml의 인슐린 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 DMEM 배지로 컨플루언트 세포 배양물을 변경하여 근육 세포 분화를 유도하였다. 처리를 위해, WT 또는 DM1 세포를 4일 동안 분화시켰다. 그 다음, 1, 2, 5, 10, 20 또는 40 pM 농도의 펩타이드-PMO를 갖는 새로운 분화 배지로 배지를 교체하였다. 처리 후 48 시간에 분석을 위해 세포를 수확하였다. 형광 기반 검정 (Promega)를 사용하여 사람 간세포에서 40 uM, 또는 사람 근모세포에서 1, 2, 5, 10, 20 또는 40 pM 농도의 펩타이드-PMO의 형질 감염 2일 후에 세포 생존율을 정량화하였다.

RNA 단리, RT-PCR

사람 세포의 경우: RNA 추출 전에, 세포를 프로테이나아제 K 완충액 (500 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM EDTA, 2% SDS 및 0.5 mg/ml의 프로테이나아제 K) 중에 45분 동안 55℃에서 용해시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 TriReagent를 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. 제조업체의 지침에 따라 총 20 pL의 M-MLV 1차 가닥 합성 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 1 마이크로그램의 RNA를 역전사시켰다. 이후에, 1 마이크로리터의 cDNA 제제를 표준 프로토콜 (ReddyMix, Thermo Scientific)에 따라 반정량적 PCR 분석에 사용하였다. PCR 증폭을 각각의 유전자에 대한 선형 증폭 범위 내에서 25~35회 주기 동안 수행하였다. PCR 산물을 1.5~2%의 아가로오스 겔 상에서 분할하고, 에티듐 브로마이드 염색하고, ImageJ 소프트웨어로 정량화하였다. 엑손 포함 비율을 이소형 신호의 전체 세기에 대한 포함 퍼센트로 정량화하였다. mRNA 발현을 정량화하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 주기는 15분 변성 단계 후에, 15초 동안 94℃ 변성, 20초 동안 58℃ 어닐링 및 20초 동안 72℃ 연장의 50회 주기이었다.

[표 16]

PCR을 위한 프라이머

동물 실험 및 ASO 주사.

영국 법률에 따라 옥스퍼드 대학교에서 실험을 수행하였다. HSA-LR C57BL/6 마우스의 정맥내 주사를 꼬리 정맥을 통한 단일 또는 반복 투여에 의해 수행하였다. 30, 12.5, 7.5 및 5 mg/kg의 펩타이드-PMO-CAG7 용량을 0.9% 식염수 중에 희석하여 5~6 pL/체중 g의 부피로 제공하였다. 표준 곡선 내에 맞도록 희석된 샘플로 ELISA (R&D cat# MKM100)에 의해 C57BL6 암컷 마우스의 KIM-1 수준을 측정하였다. 값을 요중 크레아티닌 수준 (Harwell)에 대해 정규화하여 요중 단백질 농도를 설명하였다.

[표 17]

DPEP 기반 [CAG]₇　PMO 접합체의 주사 후의 C57BL6 마우스의 회복 시간은 Pip6a와 같은 종래 펩타이드 담체로 형성된 접합체의 주사 후보다 짧다.

실시예 3

상기 실시예 1 및 2에 기재된 기법 및 방법을 사용하여 하기 접합체 중 임의의 접합체를 제조할 수 있다:

또는

여기서,

(B)는 베타-알라닌 잔기이고,

(Ab)는 감마-아미노부티르산 잔기이고,

(E)는 글루탐산 잔기이고, 단, -COOH는, 글루탐산 잔기에 존재하는 경우, -CONH₂로 대체된다.

상기 접합체에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 모든 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합이 -P(O)(NMe₂)O-이고 5'-말단에 하기 구조의 기를 갖는 모르폴리노일 수 있다:

실시예 4. 비-사람 영장류 연구

모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 하기에 표시된 접합체 1을 0.9% 멸균 식염수에 의해 25 mg/mL로 재구성하였다.

, 여기서, 5' 기는 이고, 링커 (E)는 이다.

NHP 단일 주입 용량 반응 연구

접합체 1의 엑손 스키핑 효능을 비-사람 영장류 (non-human primate: NHP)에서 테스트하였다. 구체적으로, 2~4세의 나이브 (naive) 시노몰구스 원숭이에게 20 mg/kg, 40 mg/kg 또는 60 mg/kg의 단일 정맥내 느린 볼루스 주사 (1~2분)에 의해 접합체를 투여하였다 (그룹 당 n=수컷 1 마리 및 n=암컷 1 마리).

투여 1 주일 후에 동물을 희생시켰다. 예정된 부검에서, 엑손 스키핑 분석 및 조직 생체 분석을 위해 조직의 절편을 수집하였다.

조직 생체 분석

NHP 조직 샘플로부터 접합체 1의 민감한 특정 검출을 가능하게 하는 형광 검출을 갖는 AEX-HPLC 분석 방법에 의해 접합체 1의 생체 분포를 평가하였다. 상기 검정은 Atto425 염료와 두 말단 모두에 접합된 30량체 상보적 RNA-프로브의 특정 하이브리드화를 기반으로 한다. RNA와 모 화합물의 듀플렉스는 형광 검출기에 결합된 AEX-HPLC에 의한 후속 분석에서 특정 신호를 생성하였다. NHP 조직에서 표준 희석 시리즈로부터 생성된 외부 검량선을 기반으로 정량화를 수행하였다. 선형 검량선 (가중치 1/X)을 50 ng/g부터 5,000.0 ng/g까지 계산한다. 생체 분포 결과는 도 33에 도시되어 있다.

RT-PCR 분석

엑손 51 스키핑 수준을 RT-PCR에 의해 결정하였다. 비드 기반 균질화 방법을 사용하여 골격, 심장 및 평활근 조직을 균질화하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라 Maxwell RSC 48 기기 (Promega)와 simplyRNA Tissue Kit (Promega)를 사용하여 RNA를 추출하였다. ClarioStar (BMG LabTech)를 사용하여 RNA의 농도와 순도를 결정하였다. 표 18에 기재된 열 주기 조건 하에서 고용량 cDNA 역전사 키트 (ThermoFisher Scientific, 4368813)를 사용하여 정량화된 RNA를 역전사하였다.

[표 18]

역전사 열 주기 조건

네스티드 PCR을 2회의 연속 PCR 반응으로 수행하였다. 역전사된 cDNA 주형을 사용하여 첫 번째 PCR을 수행하였다. 첫 번째 PCR의 산물을 사용하여 두 번째 PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용된 모든 프라이머는 표 19에 식별되어 있으며, 열 주기 조건은 표 20에 요약되어 있다. 최종 PCR 산물을 아가로오스 (2%) 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. Midori Green Advance Stain (Nippon Genetics)을 사용하여 겔을 제조하였다. HyperLadder 50 bp (Bioline, BIO-33039) 및 PCR 산물을 아가로오스 겔 상에 로딩하고, 적절한 정도의 밴드 분리가 달성될 때까지 실행하였다. 이후에, G:BOX (Syngene) 겔 이미징 시스템을 사용하여 분할된 겔 상에서 겔 이미지 획득을 수행하였다. 네스티드 PCR 겔로부터의 스키핑되지 않은/본래 및 스키핑된/Δex51 밴드를 ImageJ 소프트웨어 (Fiji)를 사용하여 밀도 측정 분석에 적용하였다. 하기 수학식을 사용하여, 밴드 정량화로부터의 밀도 측정 값을 사용하여 nhpDMD 엑손 51 스키핑을 결정하였다:

nhpDMD 엑손 51 스키핑 수학식: ([스키핑된 단편의 피크 면적] / [스키핑된 단편의 피크 면적 + 스키핑되지 않은 단편의 피크 면적]) x 100

[표 19]

프라이머 및 프라이머 서열

[표 20]

열 주기 조건

접합체 1을 투여받은 비-사람 영장류의 엑손 51 스키핑 효율은 도 34에 요약되어 있다.

기타 실시 형태

상기에 기재된 발명의 다양한 변형 및 개조는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 실시 형태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시 형태에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 당해 분야의 통상의 기술자들에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

기타 실시 형태는 청구범위에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited United Kingdom Research and Innovation <120> CELL-PENETRATING PEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF THEIR USE <130> 51558-016WO1 <140> PCT/GB2022/050371 <141> 2022-02-11 <150> PCT/GB2021/050357 <151> 2021-02-12 <160> 230 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 1 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is bAla <400> 2 Arg Xaa Arg Xaa Arg 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X is bAla <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <400> 3 Arg Xaa Arg Arg 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 4 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 5 Arg Arg Xaa Arg Xaa Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 6 Arg Xaa Arg Arg Xaa 1 5 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is bAla <400> 7 Xaa Arg Xaa Arg 1 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is bAla <400> 8 Arg Xaa His Xaa His 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is bAla <400> 9 His Xaa His Xaa Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 10 Arg Xaa Arg His Xaa His Arg 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 11 Arg Xaa Arg Xaa Xaa His Arg 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 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(3)..(3) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 16 Xaa Arg Xaa Ser Xaa 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <400> 17 Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is bAla <400> 18 Arg Xaa His Xaa His Xaa 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is 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<223> Xaa is bAla <400> 88 Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His 1 5 10 15 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 89 Arg Xaa Arg Arg Xaa His Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa 1 5 10 15 His <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 ggccaaacct cggcttacct gaaat 25 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 cagaattctg ccaattgctg ag 22 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 ttcttcagct tgtgtcatcc 20 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 cccagtctac caccctatca gagc 24 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 cctgccttta aggcttcctt 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 caggccattc ctctttcagg 20 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 gaaactttcc tcccagttgg t 21 <210> 97 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Labelled with FAM <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Residues no. 9 and no. 10 are linked through an internal quencher ZEN <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Labelled with IABkFQ <400> 97 tcaacttcag ccatccattt ctgtaaggt 29 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 98 ctgaatatga aataatggag gagagactcg 30 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 cttcagccat ccatttctgt aaggt 25 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Labelled with FAM <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> residues no. 9 and no. 10 are linked through an internal quencher ZEN <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Labelled with IABkFQ <400> 100 atgtgattct gtaatttcc 19 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is hydroxyproline <400> 101 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <400> 102 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is hydroxyproline <400> 103 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <400> 104 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <400> 105 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 106 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 106 ccaaugccau ccuggaguuc cuguaagaua 30 <210> 107 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 107 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua 30 <210> 108 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 108 caaugccauc cuggaguucc uguaaga 27 <210> 109 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua 30 <210> 110 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 110 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua agauaccaa 39 <210> 111 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 gcccaaugcc auccuggagu uccuguaaga 30 <210> 112 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 ugccauccug gaguuccugu aagauacc 28 <210> 113 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCCCAAUGCCAUCCUGGAGUUCCUG <400> 113 gcccaaugcc auccuggagu uccug 25 <210> 114 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 gcugcccaau gccauccugg aguuccug 28 <210> 115 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 ugccauccug gaguuccugu aagau 25 <210> 116 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 caaugccauc cuggaguucc uguaagau 28 <210> 117 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 117 gcccaaugcc auccuggagu uccuguaaga u 31 <210> 118 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 uugccgcugc ccaaugccau ccuggaguuc 30 <210> 119 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua 30 <210> 120 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 gcccaaugcc auccuggagu uccuguaa 28 <210> 121 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 gccgcugccc aaugccaucc uggaguuccu 30 <210> 122 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 caaugccauc cuggaguucc ug 22 <210> 123 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 gcugcccaau gccauccugg aguuccugua a 31 <210> 124 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 caaugccauc cuggaguucc uguaagauac c 31 <210> 125 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 125 accagaguaa cagucugagu aggagc 26 <210> 126 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 cucauaccuu cugcuugaug auc 23 <210> 127 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 127 uucuguccaa gcccgguuga aauc 24 <210> 128 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 128 acaucaagga agauggcauu ucuaguuugg 30 <210> 129 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 129 acaucaagga agauggcauu ucuag 25 <210> 130 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 130 cuccaacauc aaggaagaug gcauuucuag 30 <210> 131 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 aucauuuuuu cucauaccuu cugcuag 27 <210> 132 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 aucauuuuuu 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Construct <400> 140 tgcctccggt tctgaaggtg ttcttgta 28 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 141 ccggttctga aggtgttctt gt 22 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 142 tccggttctg aaggtgttct tgt 23 <210> 143 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 143 ctccggttct gaaggtgttc ttgt 24 <210> 144 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 144 cctccggttc tgaaggtgtt cttgt 25 <210> 145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 145 gcctccggtt ctgaaggtgt tcttgt 26 <210> 146 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 146 tgcctccggt tctgaaggtg ttcttgt 27 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 147 ccggttctga aggtgttctt g 21 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 148 tccggttctg aaggtgttct tg 22 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 149 ctccggttct gaaggtgttc ttg 23 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 150 cctccggttc tgaaggtgtt cttg 24 <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 151 gcctccggtt ctgaaggtgt tcttg 25 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 152 tgcctccggt tctgaaggtg ttcttg 26 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 153 ccggttctga aggtgttctt 20 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 154 tccggttctg aaggtgttct t 21 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 155 ctccggttct gaaggtgttc tt 22 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 156 cctccggttc tgaaggtgtt ctt 23 <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 157 gcctccggtt ctgaaggtgt tctt 24 <210> 158 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 158 tgcctccggt tctgaaggtg ttctt 25 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 159 ccggttctga aggtgttct 19 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 160 tccggttctg aaggtgttct 20 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 161 ctccggttct gaaggtgttc t 21 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 162 cctccggttc tgaaggtgtt ct 22 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 163 gcctccggtt ctgaaggtgt tct 23 <210> 164 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 164 tgcctccggt tctgaaggtg ttct 24 <210> 165 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 165 ccggttctga aggtgttc 18 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 166 tccggttctg aaggtgttc 19 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 167 ctccggttct gaaggtgttc 20 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 168 cctccggttc tgaaggtgtt c 21 <210> 169 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 169 gcctccggtt ctgaaggtgt tc 22 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 170 tgcctccggt tctgaaggtg ttc 23 <210> 171 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 171 gttgcctccg gttctgaagg tgttc 25 <210> 172 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 172 cauucaacug uugccuccgg uucugaaggu g 31 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is glucosylated serine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <400> 173 Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 <210> 174 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa is bAla <400> 174 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa 1 5 10 15 Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 20 <210> 175 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <400> 175 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 176 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly 1 5 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 177 gctgcccaat accaggtcaa c 21 <210> 178 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 178 tggtgggaga aatgctgtat gc 22 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 179 ttagaggagg tgatggagca 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 180 gatactaagg actccatcgc 20 <210> 181 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <400> 181 Glu Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 <210> 182 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is aminobutyric acid <400> 182 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa 1 5 10 15 His Xaa <210> 183 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 183 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa 1 5 10 15 His Glu <210> 184 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is bAla <400> 184 Glu Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His 1 5 10 15 Xaa His <210> 185 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <400> 185 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His 1 5 10 15 Glu <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 186 caggccattc ctctttcagg 20 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 187 gaaactttcc tcccagttgg t 21 <210> 188 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Labelled with FAM <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Residues no. 9 and no. 10 are linked through an internal quencher ZEN <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Labelled with IABkFQ <400> 188 tcaacttcag ccatccattt ctgtaaggt 29 <210> 189 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 189 ctgaatatga aataatggag gagg 24 <210> 190 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 190 cttcagccat ccatttctgt aaggt 25 <210> 191 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Labelled with FAM <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> Residues no. 9 and no. 10 are linked through an internal quencher ZEN <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Labelled with IABkFQ <400> 191 atgtgattct gtaatttcc 19 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 192 cagcagcagc agcagcagca g 21 <210> 193 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 193 gctgcccaat gccatcctgg agttcctgta a 31 <210> 194 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 194 caatgccatc ctggagttcc tg 22 <210> 195 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 195 ctccaacatc aaggaagatg gcatttctag 30 <210> 196 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 196 acatcaagga agatggcatt tctagtttgg 30 <210> 197 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <400> 197 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg Glu 1 5 10 15 <210> 198 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 198 cattcaactg 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is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <400> 203 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 204 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <400> 204 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Ile Leu Phe Gln Tyr Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 205 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is bAla <400> 205 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa <210> 206 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is bAla <400> 206 Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa <210> 207 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 207 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 <210> 208 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 208 Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 <210> 209 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <400> 209 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa 1 5 10 15 His Xaa <210> 210 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is bAla <400> 210 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr His Xaa His Xaa 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 211 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <220> <221> 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Leu Tyr His Xaa His Xaa His 1 5 10 15 Xaa <210> 218 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is bAla <400> 218 Arg Xaa Arg Arg Xaa His Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His 1 5 10 15 Xaa <210> 219 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is bAla <400> 219 His Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His 1 5 10 15 Xaa <210> 220 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 220 Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His Xaa 1 5 10 15 <210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is bAla <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is bAla <400> 221 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His Xaa 1 5 10 15 <210> 222 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Claims

올리고뉴클레오타이드와 상기 올리고뉴클레오타이드에 링커를 통해 공유적으로 결합되거나 연결된 펩타이드의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서,
상기 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 양이온성 도메인 및 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 1개의 소수성 도메인을 포함하고, 단, 상기 펩타이드는 총 7 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하고 임의의 인공 아미노산 잔기를 포함하지 않으며;
상기 올리고뉴클레오타이드는 총 12 내지 40개의 연속 핵 염기를 포함하고, 여기서, 적어도 12개의 연속 핵 염기는 사람 디스트로핀 유전자 내의 표적 서열에 대해 상보적인 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,
상기 표적 서열은 엑손 45에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 45에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되는 것인, 접합체.
제2항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기 및 이의 티민 치환된 버전을 포함하는 것인, 접합체.
제2항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 1의 어느 하나의 서열 또는 이의 티민 치환된 버전을 포함하는 것인, 접합체.
제3항 또는 제4항에 있어서,
표 1의 서열은,
5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)인, 접합체.
제3항 또는 제4항에 있어서,
표 1의 서열은,
5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)인, 접합체.
제1항에 있어서,
상기 표적 서열은 엑손 51에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 51에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되는 것인, 접합체.
제7항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 2의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기 및 이의 티민 치환된 버전을 포함하는 것인, 접합체.
제7항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 2의 어느 하나의 서열 또는 이의 티민 치환된 버전을 포함하는 것인, 접합체.
제8항 또는 제9항에 있어서,
표 2의 서열은,
5'-CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG-3' (서열 번호 130)인, 접합체.
제8항 또는 제9항에 있어서,
표 2의 서열은,
5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)인, 접합체.
제1항에 있어서,
상기 표적 서열은 엑손 53에 대한 스플라이스 부위를 포함하거나, 엑손 53에 대한 스플라이스 부위의 50개 핵 염기 내에 배치되는 것인, 접합체.
제12항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 3의 어느 하나의 서열로부터의 적어도 12개의 연속 핵 염기를 포함하는 것인, 접합체.
제12항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 표 4의 어느 하나의 서열을 포함하는 것인, 접합체.
제13항 또는 제14항에 있어서,
표 3의 서열은,
5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)인, 접합체.
제13항 또는 제14항에 있어서,
표 3의 서열은,
5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)인, 접합체.
제2항, 제7항 또는 제12항에 있어서,
상기 스플라이스 부위는 수용자 스플라이스 부위인, 접합체.
제2항, 제7항 또는 제12항에 있어서,
상기 스플라이스 부위는 공여자 스플라이스 부위인, 접합체.
제1항에 있어서,
상기 서열은 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (서열 번호 90)인, 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 아미노헥산산 (X) 잔기를 함유하지 않거나, 상기 펩타이드는 6-아미노헥산산 잔기를 함유하지 않는 것인, 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 천연 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 4 내지 12개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 4 내지 7개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것인, 접합체.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%의 양이온성 아미노산을 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 대다수의 양이온성 아미노산, 바람직하게는 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 양이온성 아미노산을 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기를 포함하고, 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 아르기닌, 히스티딘, 베타-알라닌, 하이드록시프롤린 및/또는 세린 잔기로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 아르기닌 풍부하고/하거나 히스티딘 풍부하고, 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 60%, 적어도 65% 또는 적어도 70%의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인을 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1 ), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18), R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나를 포함하고; 바람직하게는, 각각의 양이온성 도메인은 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18), R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 소수성 도메인은 3~6개 아미노산의 길이를 갖고, 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 5개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 접합체.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 소수성 도메인은 대다수의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 소수성 아미노산을 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및 글루타민 잔기를 포함하고; 바람직하게는, 각각의 소수성 도메인은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 프롤린 및/또는 글루타민 잔기로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 1개의 소수성 도메인을 포함하는 것인, 접합체.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 또는 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나를 포함하고; 바람직하게는, 상기 또는 각각의 소수성 도메인은 YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25), WWPW (서열 번호 26) 또는 이들의 임의의 조합의 서열들 중 하나로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 2개의 양이온성 도메인 및 1개의 소수성 도메인으로 이루어지고, 바람직하게는, 상기 펩타이드는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 RBRRBRR (서열 번호 1), RBRBR (서열 번호 2), RBRR (서열 번호 3), RBRRBR (서열 번호 4), RRBRBR (서열 번호 5), RBRRB (서열 번호 6), BRBR (서열 번호 7), RBHBH (서열 번호 8), HBHBR (서열 번호 9), RBRHBHR (서열 번호 10), RBRBBHR (서열 번호 11), RBRRBH (서열 번호 12), HBRRBR (서열 번호 13), HBHBH (서열 번호 14), BHBH (서열 번호 15), BRBSB (서열 번호 16), BRB[Hyp]B (서열 번호 17), R[Hyp]H[Hyp]HB (서열 번호 18) 및 R[Hyp]RR[Hyp]R (서열 번호 19)로부터 선택된 서열을 각각 포함하는 2개의 양이온성 아암 도메인에 의해 플랭킹된, YQFLI (서열 번호 20), FQILY (서열 번호 21), ILFQY (서열 번호 22), FQIY (서열 번호 23), WWW, WWPWW (서열 번호 24), WPWW (서열 번호 25) 및 WWPW (서열 번호 26)로부터 선택된 서열을 포함하는 1개의 소수성 코어 도메인으로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 RBRRBRRFQILYRBRBR (서열 번호 27), RBRRBRRYQFLIRBRBR (서열 번호 31), RBRRBRRILFQYRBRBR (서열 번호 32), RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35), RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37), RBRRBRRFQILYHBHBR (서열 번호 38) 및 RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 서열들 중 하나로 이루어지는 것인, 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 아미노산 서열을 갖는 것인, 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 RBRRBRRFQILYRBHBH (서열 번호 37)의 아미노산 서열을 갖는 것인, 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 아미노산 서열을 갖는 것인, 접합체.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 이의 N-말단을 통해 상기 접합체의 나머지에 결합되어 있는 것인, 접합체.
제40항에 있어서,
상기 펩타이드의 C-말단은 -NH₂인, 접합체.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 이의 C-말단을 통해 상기 접합체의 나머지에 결합되어 있는 것인, 접합체.
제42항에 있어서,
상기 펩타이드는 이의 N-말단에서 아실화되어 있는 것인, 접합체.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
[펩타이드]―[링커]―[올리고뉴클레오타이드]
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
또는 .
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
[펩타이드]―[링커]―[펩타이드]―[링커]―[올리고뉴클레오타이드]
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 링커는 독립적으로 하기 화학식 (I)을 갖는 것인, 접합체:
[화학식 (I)]
T₁-(CR¹R²)_n-T₂
상기 화학식 (I)에서,
T₁은 상기 펩타이드에 대한 부착을 위한 2가 기이며, -NH- 및 카보닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
T₂는 올리고뉴클레오타이드에 대한 부착을 위한 2가 기이며, -NH- 및 카보닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
n은 1, 2 또는 3이고;
각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고,
여기서,
Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소, OH 또는 (1-2C)알킬이고;
X¹은 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH(OR^A3)-, -N(R^A3)-, -N(R^A3)-C(O)-, -N(R^A3)-C(O)O-, -C(O)-N(R^A3)-, -N(R^A3)C(O)N(R^A3)-, -N(R^A3)C(NR^A3)N(R^A3)-, -SO-, -S-, -SO₂-, -S(O)₂N(R^A3)- 또는 -N(R^A3)SO₂-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되고;
Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴이고,
여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^A4R^A5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^A4　및 R^A5는 각각 독립적으로 수소 및 (1-4C)알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
각각의 R²는 독립적으로 -Y²-X²-Z²이고, 여기서,
Y²는 부재하거나 화학식 -[CR^B1R^B2]_m-의 기이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4로부터 선택된 정수이고, R^B1　및 R^B2는 각각 독립적으로 수소, OH 또는 (1-2C)알킬로부터 선택되고;
X²는 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH(OR^B3)-, -N(R^B3)-, -N(R^B3)-C(O)-, -N(R^B3)-C(O)O-, -C(O)-N(R^B3)-, -N(R^B3)C(O)N(R^B3)-, -N(R^B3)C(NR^B3)N(R^B3)-, -SO-, -S-, -SO₂-, -S(O)₂N(R^B3)- 또는 -N(R^B3)SO₂-이고, 여기서, 각각의 R^B3은 독립적으로 수소 또는 메틸로부터 선택되고;
Z²는 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^B4R^B5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^B4　및 R^B5는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고; 단, n=1이고 T₁과 T₂가 서로 상이할 때, R¹과 R²는 모두 H가 아니거나; n=1이고 T₁과 T₂가 서로 상이하고 R¹과 R²　중 하나가 H일 때, R¹과 R²　중 다른 하나는 메틸이 아니거나; n=2이고 R¹과 R²가 각각 H일 때, T₁과 T₂는 모두 -C(O)-이거나 모두 -NH-이다.
제47항에 있어서,
T₂는 -C(O)-인, 접합체.
제47항 또는 제48항에 있어서,
각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고, 여기서,
Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
X¹은 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(R^A3)-, -N(R^A3)-C(O)-, -C(O)-N(R^A3)-, -N(R^A3)C(O)N(R^A3)-, -N(R^A3)C(NR^A3)N(R^A3)- 또는 -S-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 또는 메틸이고;
Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, 아릴, (3-6C)사이클로알킬, (3-6C)사이클로알케닐 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 옥소, 할로, 시아노, 니트로, 하이드록시, 카복시, NR^A4R^A5 및 (1-4C)알콕시로 이루어진 그룹로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되고, 여기서, R^A4　및 R^A5는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬인, 접합체.
제47항 또는 제48항에 있어서,
각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고, 여기서,
Y¹은 부재하거나 -(CR^A1R^A2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
X¹은 부재하거나, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N(R^A3)-, -N(R^A3)-C(O)-, -C(O)-N(R^A3)-, -N(R^A3)C(O)N(R^A3)-, -N(R^A3)C(NR^A3)N(R^A3)- 또는 -S-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 또는 메틸이고;
Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 할로 및 하이드록시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되는 것인, 접합체.
제47항 또는 제48항에 있어서,
각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고, 여기서,
Y¹은 부재하거나 화학식 -(CR^A1R^A2)_m-의 기이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^A1　및 R^A2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
X¹은 부재하거나, -C(O)-, -C(O)O-, -N(R^A3)-C(O)- 또는 -C(O)-N(R^A3)-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 수소 또는 메틸이고;
Z¹은 추가의 올리고뉴클레오타이드이거나, 수소, (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 각각의 (1-6C)알킬, 아릴, (3-6C)사이클로알킬 및 헤테로아릴은 (1-4C)알킬, 할로 및 하이드록시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 치환기에 의해 임의로 치환되는 것인, 접합체.
제47항 또는 제48항에 있어서,
각각의 R¹은 독립적으로 -Y¹-X¹-Z¹이고, 여기서,
Y¹은 부재하거나, -(CH₂)- 또는 -(CH₂CH₂)-이고;
X¹은 부재하거나, -N(R^A3)-C(O)- 또는 -C(O)-N(R^A3)-이고, 여기서, 각각의 R^A3은 독립적으로 수소 또는 메틸이고;
Z¹은 수소 또는 (1-2C)알킬인, 접합체.
제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 R²는 독립적으로 -Y²-Z²이고,
여기서, Y²는 부재하거나 -(CR^B1R^B2)_m-이고, 여기서, m은 1, 2, 3 또는 4이고, R^B1　및 R^B2는 각각 독립적으로 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
Z²는 수소 또는 (1-6C)알킬인, 접합체.
제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 R²는 수소인, 접합체.
제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
n은 2 또는 3인, 접합체.
제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
n은 1인, 접합체.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 글루탐산, 석신산 및 감마-아미노부티르산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산 잔기인, 접합체.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접합체는 하기 구조를 갖는 것인, 접합체:
.
제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 3'-말단에서 상기 링커 또는 펩타이드에 결합되어 있는 것인, 접합체.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하기 기를 포함하는 것인, 접합체:
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하기 기를 포함하는 것인, 접합체:
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하이드록실을 포함하는 것인, 접합체.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열 번호 194)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA-3' (서열 번호 193)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG-3' (서열 번호 196)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (서열 번호 195)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' (서열 번호 171)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' (서열 번호 162)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 RBRRBRFQILYBRBR-NH₂ (서열 번호 35)의 N-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYRBHBH (서열 번호 44)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
베타-알라닌 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
글루탐산 잔기를 통해 펩타이드 Ac-RBRRBRFQILYBRBR (서열 번호 35)의 C-말단에 공유적으로 연결된 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드 5'-CATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTG-3' (서열 번호 198)의 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로서, 여기서, 상기 글루탐산 잔기 중의 유리 -COOH는, 존재하는 경우, -CONH₂로 대체되는 것인, 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
제72항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이의 5'-말단으로서 하기 기를 포함하는 것인, 접합체:
제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노인, 접합체.
제104항에 있어서,
모든 모르폴리노 뉴클레오사이드간 결합은 -P(O)(NMe₂)O-인, 접합체.
제1항 내지 제105항 중 어느 한 항의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제106항에 있어서,
DMD 또는 BMD를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
DMD 또는 BMD를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제106항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제108항에 있어서,
상기 대상체는 DMD를 앓고 있는 것인, 방법.