JP6705953B2 - ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を標的にアルキル化する新規アルキル化剤 - Google Patents

Description

本発明は、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を標的にアルキル化する新規アルキ
ル化剤に関する。

現在、ドライバーオンコジーン（必須癌原遺伝子）を標的にした分子標的治療が広く開発
されている。ドライバーオンコジーンとは、癌細胞で特異的に変異（点突然変異や小欠失
、挿入もしくは転座、増幅等）を起こし、それが主たる原因で癌化すると考えられている
遺伝子変異を有する癌原遺伝子のことである。したがって、ドライバーオンコジーンを標
的にして、その機能を抑制する薬剤を開発することは、癌患者に対する特効薬開発の極め
て有効な方法であることが実証されている。例えば、変異ＥＧＦＲを有する肺癌患者に劇
的な有効性を示すイレッサ、ＨＥＲ２の高発現に由来する乳癌患者に有効なトラスツズマ
ブ、融合蛋白質ＢＣＲ−ＡＢＬの活性阻害剤イマチニブ等が挙げられる。

ドライバーオンコジーンが有する遺伝子変異は、（１）遺伝子配列の変化（点変異、染色
体転座、欠失または／および挿入）（また欠失や転座変異には正常細胞ではヘテロアレル
となるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなる変異も含まれ
る）と（２）遺伝子コピー数の変化（遺伝子の発現上昇）の２種類に分けることができる
。前記（１）の変異を有するドライバーオンコジーンとして、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡ
Ｓ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、
ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／
２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、
Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、前記（２）の変異を有す
るものとして、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＥＴ等が知られてい
る。その他のドライバーオンコジーンは、癌遺伝子変異データベース（ＣＯＳＭＩＣ［Ｃ
ａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ］
）等に登録されている。

現在までに、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的に阻害する薬剤を開発す
ることが頻繁に行われている。しかし、そのような薬剤は正常細胞が必要とする正常遺伝
子の働きも抑えてしまうことがあり、目的の薬剤が開発できていないというのが現状であ
る。

ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は抗生物質デスタマイシンをモチーフとし
て開発された人工小分子であり、２本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブへ配列特異的に結合す
ることが報告されており、ＰＩＰによる標的配列の遺伝子の発現抑制に関する研究は、多
く報告されている。さらにマウスを用いた動物実験により腎障害に対する薬剤や抗癌剤、
角膜外傷、肥厚性瘢痕、骨疾患等に対する治療薬としての研究も進められている。また近
年では、ｉＰＳ細胞の研究の一環として京都大学のｉＰＳ細胞プロジェクトであるｉＣｅ
Ｍｓの研究においてもＰＩＰによるｉＰＳ細胞誘導の研究が行われている等、ＰＩＰは、
様々な研究成果が期待されている有機小分子である。

ＰＩＰの特徴として、（１）任意の遺伝子配列をターゲットとして設計することが可能、
（２）ＤＮＡに対する結合能が転写因子よりも強い、（３）ベクターやドラッグデリバリ
ーシステム（ＤＤＳ）無しに細胞の核に取り込まれること、（４）核酸分解酵素に分解さ
れず、細胞や生体内で安定であり、尿胆汁より未分解物として排泄される、（５）Ｎ及び
Ｃ末端を容易に修飾することが可能であり、様々な機能性小分子との複合体の形成が可能
であること等が挙げられる。

ＰＩＰは、Ｐｙ／ＩｍペアがＣＧ、Ｐｙ／ＰｙペアがＡＴまたはＴＡ、Ｉｍ／Ｐｙペアが
ＧＣを認識し、これにより様々な任意の二重鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することが可能
である。標的遺伝子に結合したＰＩＰは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺
伝子発現を抑制する遺伝子スイッチとして研究されている。

本発明者は、配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を利用して、アルキル化官能基とＰＩＰと
の複合体を合成し、ＤＮＡの特定塩基配列をアルキル化するインドール誘導体（特許文献
２）、ヒストン修飾制御剤とＰＩＰとの複合体を合成し、標的遺伝子特異的ヒストン修飾
制御剤に係る発明（特許文献１）をそれぞれ完成することに成功していた。しかし、ＰＩ
Ｐを用いるというコンセプトを基にして、ドライバーオンコジーンのドライバーミューテ
ーション（癌を引き起こす主因となる遺伝子変異）を標的として薬剤を合成し、実際に腫
瘍抑制効果が得られるということはいまだに報告されていない。

ＷＯ２０１０／００１９３３ ＷＯ２００５／０８７７６２

上述のとおり、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に対して特異的に作用する治療
薬が求められていた。そこで、本発明は、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を標
的にアルキル化する新規アルキル化剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ドライバーオンコジーンの
遺伝子変異部位に特異的に結合するピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）を設計
し、設計したＰＩＰにアルキル反応部位を結合させた化合物を合成し、ドライバーオンコ
ジーンの遺伝子変異部位を特異的に認識して結合し、アルキル化する新規化合物を合成す
ることに成功し、さらに新規化合物が効率的に腫瘍細胞や腫瘍幹細胞にも送達されること
を確認し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と
、アルキル化剤との複合体。
（２）遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化及び／または遺伝子コピー数の変化である、（
１）に記載の複合体。
（３）ドライバーオンコジーンが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ
ＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、
ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１
、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ
１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥ
Ｔ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子から選ばれる少なくとも１つ
である、（１）および（２）のいずれか１つに記載の複合体。
（４）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌ
ｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ結合蛋白複合体、ピロ
ール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ））、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩ
Ｐ）修飾物またはＤＮＡ結合蛋白もしくはその複合体である、（１）〜（３）のいずれか
１つに記載の複合体。
（５）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基
を有する化合物である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の複合体。
（６）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（５）に記載の複合体。
（７）（１）〜（６）のいずれか１つに記載の複合体を含む、ドライバーオンコジーン遺
伝子変異特異的アルキル化剤。
（８）下式で表される（１）に記載の複合体。

（９）下式で表される（１）に記載の複合体。
（１０）下式で表される（１）に記載の複合体。
（１１）下式で表される（１）に記載の複合体。
（１２）下式で表される（１）に記載の複合体。
（１３）下式で表される（１）に記載の複合体。
（１４）（８）に記載の複合体を含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異アルキル化剤。
（１５）（９）に記載の複合体を含むＡＬＫ遺伝子Ｆ１１７４Ｌ変異アルキル化剤。
（１６）（１０）および（１１）のいずれか１つに記載の複合体を含むＰＩＫ３ＣＡ遺伝
子Ｅ５４５Ｋ変異アルキル化剤。
（１７）（１２）および（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含むＭＹＣＮ遺伝子増
幅変異アルキル化剤。
（１８）（１）〜（６）および（８）〜（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む医
薬組成物。
（１９）医薬組成物が抗癌剤である（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）（１）〜（６）および（８）〜（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含むキ
ット。
（２１）（１）〜（６）および（８）〜（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む研
究試薬キット。
（２２）（１）〜（６）および（８）〜（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む治
療用キット。
（２３）（１）ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するようにＤＮ
Ａ結合化合物を設計する工程、
（２）設計したＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤とを結合させる工程を含む、
ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的にアルキル化する複合体の製造方法。
（２４）遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化または遺伝子コピー数の変化である、（２３
）に記載の製造方法。
（２５）ドライバーオンコジーンが、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−
ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３
、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２
、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥ
Ｔ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ
およびＭＥＴ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子からなる群から選
ばれる少なくとも１つである、（２３）または（２４）に記載の製造方法。
（２６）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、
Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ結合蛋白複合体、ピ
ロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ））、ピロール・イミダゾールポリアミド（Ｐ
ＩＰ）修飾物またはＤＮＡ結合蛋白もしくはその複合体のいずれかである、（２３）〜（
２５）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２７）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能
基を有する化合物である、（２３）〜（２６）のいずれか１つに記載の複合体の製造方法
。
（２８）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（２７）に記載の製造方法。
（２９）（２３）〜（２８）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた複合体の医薬組
成物の製造のための使用。
（３０）（２３）〜（２８）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた複合体の抗癌剤
の製造のための使用。

本発明により、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を有する癌細胞を特異的にアルキル
化するための複合体が提供される。本発明の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、
医薬組成物または抗癌剤として用いることができる。本発明の別の好ましい態様によれば
、本発明の複合体は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異を特異的にアルキル化する化合物
（ＫＲ１２）である。本発明の別の好ましい態様によれば、ゲノムコピー数の増加したＭ
ＹＣＮ遺伝子を特異的にアルキル化する化合物（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮ
Ａ３）である。また、本発明の別の好ましい態様として、本発明の複合体は、ＡＬＫ遺伝
子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）を標的としたＡＬＫ−ＦＬ−１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（
Ｅ５４５Ｋ）を標的としたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２である。

本発明により、アルキル化剤にドライバーオンコジーンの遺伝子変異を特異的に結合する
ポリアミドを付加するという方法論が、腫瘍特異的な様々な変異を認識する新規抗癌剤の
創出にとって極めて有効なアプローチの１つであることが明らかとなった。具体的には、
塩基配列特異的に結合する有機小分子であるＰＩＰにアルキル化剤であるＣＢＩを付加し
、ＤＮＡとの強い結合力を有し、少量でも効果的に遺伝子発現を抑制する抗変異ドライバ
ーオンコジーン治療薬を開発することが明らかになった。この効果は、アルキル化による
ＤＮＡ損傷が細胞死シグナルを誘導し、その抑制を行うオンコジーンが抑制されることで
、通常細胞死を起こさないがん細胞を含めて細胞死を誘導できるためと考えられる。

つまり、本発明は、アルキル化剤を特定のゲノム配列に送達する技術を提供するものであ
り、この技術を応用するとＫＲＡＳ癌遺伝子だけではなく、癌特異的な変異を有する様々
なドライバー癌遺伝子に対して変異配列を特異的に認識できる治療薬を次々にデザイン・
合成することを可能とするものである。そして、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ：antibody-d
rug conjugate）技術と同様の考え方も適用でき、合成も容易であるため幅広い用途に応
用できる。

本発明の複合体であるＫＲ１２は、低濃度で変異ＲＡＳドライバー癌遺伝子をもつ癌細胞
に対し、特異的に強い抗癌活性を示し（ピコモルから細胞増殖抑制を生じる）、自動合成
が可能であり、腫瘍への集積性・蓄積性が高く、核内に局在し、体重減少といった副作用
も認められないといった優れた効果を有している。そのため、本発明の複合体であるＫＲ
１２は、臨床上問題となっているＲＡＳ遺伝子変異を持つ癌に対する治療薬を提供するだ
けでなく、開発が困難であるＲＡＳ遺伝子変異を標的とする分子標的治療薬に対して、新
たな画期的治療薬の開発を可能とするものである。今後、本発明の複合体であるＫＲ１２
は、臨床試験開始に向けた開発研究（物性試験、安全性試験、薬物動態、ＧＭＰでの大量
合成）の推進が期待されている。また、本発明の方法を応用すれば、ＫＲ１２と同様の効
果を奏するさらなる画期的な治療薬の開発が可能である。

ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異（Ｇ１２Ｄ）を示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子と化合物の結合位置を示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１３）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子の野生型コドン１２の塩基配列を認識するＰＩＰ（ＷＴ）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲ１２からアルキル化能を持つＣＢＩ基を除いたＰＩＰ（Ｃ１２−Ｄｐ）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異の塩基配列のアルキル化確認実験の結果を示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＫＲ１２、ＷＴ、非アルキル化Ｃ１２−ＤＰの処理後のＬＳ１８０細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＷＳＴアッセイによりＫＲ１２処理後の６種類の細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＫＲ１２処理癌細胞の細胞周期変化、細胞死の誘導によるＤＮＡラダーの確認、細胞損傷、アポトーシスのマーカーの蛋白解析を行った結果を示す図である。 ＫＲ１２処理癌細胞の半定量的遺伝子発現（ＲＴ−ＰＣＲ）を解析した図である。 ＫＲ１２処理ＬＳ１８０細胞のＲＡＳ活性測定の結果を示す図である。 ＫＲ１２処理ＨＴ２９細胞のＲＡＳ活性測定の結果を示す図である。 ヌードマウスを用いた腫瘍増殖抑制評価実験の結果を示す図である。 ヌードマウスを用いたＣＢＩ、ＫＲ１３投与との比較実験および単回投与腫瘍増殖抑制評価実験の結果を示す図である。 ＫＲ１２のＬＳ１８０細胞における細胞内局在を示す図である。 ＫＲ１２のスフェア形成大腸癌細胞における細胞内局在を示す図である。 ＫＲ１２の担癌ヌードマウスにおける体内動態を観察した図である。 ＫＲ１２の各種臓器における蓄積を観察した図である。 ＫＲ１２の腫瘍、肝臓、腎臓の細胞における細胞内局在を観察した図である。 ＡＬＫ遺伝子のＦ１１７４Ｌ変異とＰＩＰの設計を示す図である。 ＡＬＫ遺伝子のＦ１１７４Ｌ変異アルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＡＬＫ−ＦＬ−１処理後の神経芽腫細胞、乳癌細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異とＰＩＰの設計を示す図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異アルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異アルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２処理後の乳癌細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のエキソン３とＭＹＣＮ３の結合部位を示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ３）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 Ｉｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡でＭＹＣＮＡ１およびＭＹＣＮＡ２処理細胞の細胞観察をして作成した細胞成長曲線を示す図である。 ＭＹＣＮＡ１処理神経芽腫細胞を用いた細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定結果を示す図である。 ＭＹＣＮＡ３処理神経芽腫細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、正常線維芽細胞を用いた細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例え
ば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組
み込まれる。

配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を用いて遺伝子配列特異的なアルキル化剤を合成できる
ことは既知であるが、このコンセプトを元にして薬剤として疾患の治療に応用できるかは
不明であった。また、ＰＩＰにアルキル化剤をコンジュゲートさせた化合物により、標的
配列を持つ遺伝子の発現を抑制できることは報告されていたが、実際にドライバーオンコ
ジーンのドライバーミューテーションを標的として薬剤を合成し、腫瘍抑制効果が得られ
るという事実は未だに不明であった。本発明者は、アルキル化剤がＤＮＡ損傷を誘導し、
そのことで細胞死を誘導することと、癌においてはＤＮＡ損傷による細胞死を抑制するメ
カニズムが働くことで、癌細胞が不死の状態となり増殖し続けるという事実に注目した。
ドライバーオンコジーンはがん細胞の不死化に強く関与していると考えられており、特に
ＫＲＡＳ遺伝子の変異では、細胞死を抑制することがよく知られている。そこで、本発明
者は、コドン１２変異を特異的に抑制しながらＤＮＡ損傷を誘導する薬剤を合成できれば
、癌細胞に細胞死を誘導できると仮説を立てた。

この仮説に基づきＫＲ１２を合成し、コドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持つ癌細
胞株とコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持たない癌細胞株で細胞死の誘導を比較
したところ、ＫＲ１２は極めて低濃度でコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持つ癌
細胞株を細胞死に誘導した。またコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異ＫＲＡＳ遺伝子
を特異的に転写抑制していることも確認できた。さらに細胞死が誘導できること及びマウ
スに移植されたヒト大腸がんにおいてもＫＲ１２が認識できる変異をもつ腫瘍で特異的に
ＫＲ１２投与による増殖抑制効果が確認されたことより、ＫＲ１２は、標的癌遺伝子のド
ライバーミューテーションを抑制すること、そして、抗癌特性を得ることが出来る抗癌剤
であることを見出した。

さらに、ドライバーオンコジーン遺伝子変異として知られるＡＬＫ遺伝子の変異（Ｆ１１
７４Ｌ）およびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）を持つ癌細胞株に対して、ＡＬ
Ｋ遺伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）を標的としたＡＬＫ−ＦＬ−１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の
変異（Ｅ５４５Ｋ）を標的としたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２をそれぞれ合
成し、対応する変異をもつ癌細胞株に投与した結果、より効果的に細胞死を誘導し、増殖
を抑制することを確認した。

また、本発明者は、ＫＲ１２と同様に特定のゲノム配列をアルキル化する化合物が増幅し
てコピー数が多くなった癌遺伝子を標的にして作成した場合も効果を発揮すると考え、小
児の神経芽腫等で高頻度に増幅し、予後不良因子となるＭＹＣＮを標的としたＭＹＣＮア
ルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）を合成した。ＭＹＣＮＡ
１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３は、ＭＹＣＮ遺伝子が増幅した神経芽腫細胞の増殖を抑
制した。特にＭＹＣＮＡ３では、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅が強い細胞でより効果的に細胞増
殖を抑制し、正常細胞や他の癌細胞では効果が低かった。

以上の結果から、配列特異的な遺伝子認識ポリアミド化合物を合成できること、さらにＤ
ＮＡのアルキル化を誘導できる薬剤との複合体コンジュゲートを合成する方法を使えば、
様々な種類のドライバーオンコジーンのドライバーミューテーションを標的にした抗癌剤
を合成できることが明らかになった。

ドライバーオンコジーン（必須癌原遺伝子）とは、癌細胞で特異的に変異（点突然変異や
小欠失、挿入もしくは転座、増幅等）を起こし、それが主たる原因で癌化すると考えられ
ている遺伝子変異を有する癌原遺伝子のことである。なお、欠失や転座変異には正常細胞
ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルと
なる変異も含まれている。本発明のドライバーオンコジーンは、癌の遺伝子変異データベ
ースに登録されるものが含まれている。癌の遺伝子変異データベースは、ＣＯＳＭＩＣ（
［Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅ
ｒ］）等であり、その他のデータベースも含まれている。ドライバーオンコジーンが有す
る変異は、（１）遺伝子配列の変化（点変異、染色体転座、欠失または／および挿入、ま
た欠失や転座変異には正常細胞ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモ
ノアレルもしくはホモアレルとなる変異も含まれる）と（２）遺伝子コピー数の変化（遺
伝子の発現上昇）の２種類に分けることができる。前記（１）の変異を有するドライバー
オンコジーンとして、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−
ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、Ｅ
ＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、
ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１
１、ＰＴＣＨ等が挙げられ、前記（２）の変異を有するものとして、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、
ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＥＴ等が挙げられる。

ＲＡＳ遺伝子は、ドライバーオンコジーンに属する癌原遺伝子であり、約２１ｋＤａの膜
結合ｐ２１−ｒａｓ蛋白質をコードしている。ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、活性化型（ＲＡ
Ｓ−ＧＴＰ）と不活性型（ＲＡＳ−ＧＤＰ）の間を循環する低分子量グアニルピロホスフ
ァターゼ（ＧＴＰアーゼ）である。ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、グアニンヌクレオチド交換
因子（ＧＥＦ）により活性化型に変換され、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（ＧＡＰ）によっ
て不活性型に変換される。このような変換機構を通じてＲＡＳ遺伝子は、ＭＡＰキナーゼ
経路、ＰＩ３キナーゼ経路等の細胞の成長及び分化に関わるシグナル伝達経路の活性制御
を行っている。

ＲＡＳ遺伝子ファミリーには、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳ遺伝子の３つのメンバー
が存在する。ＲＡＳ遺伝子は、動物種の間で広く保存されている。ＲＡＳ遺伝子ファミリ
ーは癌原遺伝子であり、変異したＲＡＳ遺伝子ファミリーは種々の癌においてみられ、ヒ
ト癌腫瘍の２０〜３０％において認められている。とりわけ、ＫＲＡＳ遺伝子の変異はヒ
ト癌腫瘍において最も一般的にみられる遺伝子変異である。ＫＲＡＳ遺伝子の変異は、膵
臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頭頚部癌および子宮内膜癌で高頻度に同定され、さ
らに、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫等の前癌状態でも同定されている。統計
的には、大腸癌の約３５〜４０％、膵臓癌の約９０％でＫＲＡＳ遺伝子の変異が認められ
ている。

ＫＲＡＳ遺伝子の変異としては、コドン１２、１３、６１または１４６における１塩基対
置換（ミスセンス変異）が知られている。頻度としては、コドン１２（約８０％）、コド
ン１３（約２０％）である。癌で頻度の高いＫＲＡＳ遺伝子の変異が生じると、恒常的に
活性化したｐ２１−ｒａｓ蛋白質が発現する。この点変異ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、不活
性化型にならないため、恒常的に下流のシグナル伝達経路を活性化する。その結果、細胞
は過剰な増殖シグナルを受け、成長と分化を制御できずに癌細胞へと形質転換する。

ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異とは、ＫＲＡＳ遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿０
３３３６０．２）のエキソン２のコドン１２（野生型ＧＧＴ、アミノ酸Ｇｌｙ）のＧＣＴ
（Ａｌａ）、ＧＡＴ（Ａｓｐ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ
）またはＧＴＴ（Ｖａｌ）の一塩基置換変異である。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異
が生じると、ｐ２１−ｒａｓ蛋白質のＰ−ループに点変異が存在し、恒常的活性化型ｐ２
１−ｒａｓ蛋白質が発現する。図１には、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）からＧＡＴ（Ａｓｐ）への一
塩基置換変異を示した。

ＭＹＣＮ遺伝子はドライバーオンコジーンに属する癌原遺伝子であり、ＭＹＣＮの増幅は
、神経芽腫の早期例の４〜８％、進行例の約３０％に認められ、増幅例は悪性度が高いこ
とが知られている。ＭＹＣＮの増幅が急速な腫瘍の進行と悪性度に強く関連していること
が知られており、現在では、神経芽腫のリスク分類に基づく治療プロトコールにおいてＭ
ＹＣＮの増幅の有無は必要不可欠な検査項目になっている。図２には、ＭＹＣＮ遺伝子の
増幅部分が図示されている。

現在までに、ＫＲＡＳ遺伝子の変異、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅を標的にした様々な診断薬ま
たは治療薬が開発されているが、有効な抗癌剤が開発されていないのが現状である。

複合体の構成要素であるドライバーオンコジーンの遺伝子変異認識ポリアミドは、ドライ
バーオンコジーンの変異を認識するように設計されたポリアミドである。「ドライバーオ
ンコジーンの変異を認識する」とは、ドライバーオンコジーンの変異塩基配列および／ま
たはその近傍にドライバーオンコジーンの変異認識ポリアミドが結合等(例えば水素結合
または架橋形成（クロスリンキング)による結合等)することを意味する。ドライバーオン
コジーンの変異認識化合物としては、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）（環
状、ヘアピン構造、ヘアピン構造をつなげたタンデム型を含むＰＩＰ化合物）、Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ジンクフィンガ
ー等のＤＮＡ結合蛋白やそのキメラ蛋白、ＤＮＡ結合蛋白複合体やガイドＲＮＡ蛋白複合
体のような複合体等のＤＮＡ結合化合物を挙げることができる。さらには、ＤＮＡに対す
る結合能力を維持または向上するように修飾したＰＩＰ修飾物も含まれる。ＰＩＰ修飾物
としては、例えば、ＰＩＰのγ−アミノ酪酸のα位またはβ位にアミンを付加した修飾物
、Ｎ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、Ｎ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸の置換された側鎖を有する
修飾物、また前記修飾物をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩＰのＮ末
端をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、Ｃ末端がイソフタル酸等の分子で修
飾した修飾物等が挙げられる。ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物

ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）とＮ
−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）とγ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、Ｐ
ｙとＩｍとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結さ
れる（Ｔｒａｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３８２，５５９−６１（１９９６）
；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，５６９−７８（１９９７）；お
よびＤｅｒｖａｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９，２２１５−３５（２００１
））。ＰＩＰは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りた
たまれてＵ字型のコンフォメーション（へアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーショ
ンにおいては、リンカーを挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の
鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ
対、またはＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合するこ
とができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対
はＧ−Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ−Ｔ塩基対およびＴ−
Ａ塩基対の両方に結合することができる（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ
．，４，５６９−７８（１９９７）；Ｄｅｒｖａｎ：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
，９，２２１５−３５（２００１））。また、ＰＩＰには、他に３−ヒドロキシピロール
（Ｈｐ）、またはβアラニンが含まれていても良い。Ｈｐについては、Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ
−Ａ塩基対に結合することができる（Ｗｈｉｔｅ ａｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，
４６８−７１（１９９８））。また、γ−リンカーについてはアミノ基を持つＮ−α−Ｎ
−γ−アミノ酪酸及びＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸のような側鎖をもち、またこれらがＦ
ＩＴＣやビオチン等の分子で修飾されていても良い。またＰＩＰのＮ末端はアセチル基だ
けでなくＦＩＴＣやビオチン等の分子が修飾されていても良い。βアラニン／βアラニン
については、Ｔ−Ａ塩基対もしくはＡ−Ｔ塩基対に結合することができる。よって、標的
のＤＮＡ配列に合わせてＰｙとＩｍの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝
子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法
は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号および
ＷＯ０３／０００６８３）。

ＰＩＰは、遺伝子配列を認識できることより、例えば、図１に示すＧＧＴがＧＡＴもしく
はＧＴＴに変化したＫＲＡＳドライバーオンコジーン遺伝子の変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２
Ｖを認識させるために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペアで
はなく、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを
設計することとした。また、インドール基をピロール基とｓｅｃｏＣＢＩ間に配置するこ
とで、構造解析上、アデニンのＮ３にアルキル化部位が近接し、良好な角度が得られよう
合成することとした。また、ＫＲＡＳの転写テンプレートＤＮＡにアルキル化が生じるよ
う配慮しＫＲ１２の設計を行った。図７に示すようにＫＲ１２はＧ１２Ｄ変異５’−ＡＣ
ＧＣＣＡＴＣＡ−３’およびＧ１２Ｖ変異５’−ＡＣＧＣＣＡＡＣＡ−３’を認識し、３
’のアデニンのＮ３をアルキル化する化合物として合成された。このように塩基置換をＰ
ＩＰの塩基認識能もしくはｓｅｃｏＣＢＩのアデニンの認識能を利用することで様々な点
変異もしくは腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなり正常ではヘテロアレルとなるＳ
ＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノもしくはホモアレルとなる多型を認識できる化合物を合
成することで抗腫瘍効果が期待できるものと考えられる。

Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）またはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、
ＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をメチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＢＮ
ＡまたはＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４
’−ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）として
合成することができる。ＬＮＡはＰｒｏｌｉｇｏ社からも入手可能である。

アルキル化剤とはＤＮＡをアルキル化する官能基を有する化合物を含むものである。アル
キル化剤としては、ＤＮＡ中に存在する特定の塩基配列に対して、アルキル化能と配列認
識能を兼ね備えた化合物を含むものであればどのようなものでもよく特に制限されるもの
ではない。例えば、ＷＯ２０１０／００１９３３に記載の官能基を含む化合物を用いるこ
とができる。アルキル化剤は、ＤＮＡのグアニンＮ−７位やアデニンＮ−３位にアルキル
基を導入し、付加体形成やグアニン同士、アデニン同士等の架橋反応を引き起こす。架橋
反応を生じた二本鎖ＤＮＡや付加体形成した二本鎖ＤＮＡは修復機構によって修復するこ
とが困難であり、結果としてＤＮＡの転写及び複製が出来なくなり、細胞増殖の停止やア
ポトーシスによる細胞死が誘導されることになる。ＤＮＡ結合蛋白にはジンクフィンガー
等の結合蛋白、ＴＡＬＥＮ（ターレン、ＴＡＬＥ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）のようなキメラ蛋
白およびガイド核酸を利用したクリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）のような複合蛋白が含まれる
。

ｓｅｃｏＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ
［ｅ］インドール）は、下式３で表される化合物である。ｓｅｃｏＣＢＩはＤＮＡをアル
キル化する公知の化合物の１つである。ｓｅｃｏＣＢＩは、公知の文献に記載の方法によ
って合成できる（（ａ）Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｙｕｎ，Ｗ．Ｙ．；Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ
，Ｂ．Ｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，２８７３．（ｂ）Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．
Ｌ．；ＭｃＫｉｅ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，１２７１．（ｃ）
Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｔ．；Ｋｉｔｏｓ，Ｐ．Ａ．；Ｓｕｎｔｏｒ
ｎｗａｔ，Ｏ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，５８２３．）。

本発明の複合体は上記ポリアミドと上記アルキル化剤とを結合すること等により合成する
ことができる。合成方法は公知の方法によって行うことができる（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
ＳＯＣ．１９９５，１１７，２４７９−２４９０）。「結合」は、直接でも良いし、リン
カーを介しても良い。リンカーとしては、アルキル化剤の作用を妨げず、かつドライバー
オンコジーンの遺伝子変異部位の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、
アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合等を例示
することができる。

本発明の複合体を含むアルキル化剤は、使用目的に応じ、本発明の複合体に加えて、担体
や添加物を含むものであっても良い。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機
溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポ
リマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン
酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、
メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天
、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリ
ン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニト
ール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。本発明の複合体の使用量
は、使用目的に応じて適宜調節することができる。

本発明の複合体として、以下のものが例示できる。

本発明の医薬組成物は、上記複合体を含む組成物である。当該医薬組成物を生体内に投与
することにより、種々の疾患を治療及び予防をすることができる。本発明の医薬組成物は
、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物とくに哺乳動物（例、ヒト、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）の疾患を対象にすることができる。
本発明の医薬組成物の対象疾患は、遺伝子の変異を伴う疾患たとえば癌、神経疾患／精神
性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患
および感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、甲状腺ホルモン不応症、老
化、嚢胞性線維症、ならびに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうち癌としては、例
えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌
、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺
癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫
、線維肉腫等）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫
、多発性骨髄腫（ＭＭ）等）、小児固形腫瘍（脳腫瘍、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫、ユー
イング肉腫等）、網膜芽腫およびメラノーマ等を挙げることができる。生活習慣病として
は、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病等を挙げることができる。皮膚科、眼科、
または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚
炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症等を挙げることができる。アレルギー性疾患としては
、アトピー性皮膚炎、花粉症等を挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては
、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着等を挙げることができる。神経疾患／精神性疾患
としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡
眠障害、痴呆等を挙げることができる。

本発明の医薬組成物の好ましい対象疾患は、ドライバーオンコジーンの変異に由来する全
ての疾患が含まる。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅、ＡＬＫ遺
伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）に由来する全て
の疾患も含まれる。例えば、大腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頭頚部癌、
子宮内膜癌、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等である。本発明の医
薬組成物は、正常細胞ではなく、ドライバーオンコジーンの変異を有する細胞により効果
的に作用して、アルキル化によってＤＮＡの架橋形成を促進し、ＤＮＡ損傷による細胞死
メカニズムを誘導し、さらにドライバーオンコジーンの発現を抑制し、細胞増殖を阻害す
ることによって疾患原因細胞を死滅させ、疾患の治療及び予防をすることができる。

本発明の医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれの剤形でも良い。これらの剤
形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むも
のであっても良い。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有
機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニル
ポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギ
ン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン
、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒
天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセ
リン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニ
トール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げら
れる。

上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わ
せから選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤
、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、または適当な
剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型
の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射等により全身
又は局部的に投与することができる。

例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば生理食塩水
、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清ア
ルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加え
たものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥
したものであっても良い。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖
等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投
与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０
．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇで
ある。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば数日間隔に１
回、１日当たり、１回または２〜４回に分けても良い。

本発明の医薬組成物は、抗癌剤として用いることができる。対象になる癌の種類は、例え
ば、大腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頚部癌、子宮内膜癌、骨髄異形成症
候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等であるが、これに限定されることはなく、ドラ
イバーオンコジーンの変異に由来する全ての癌、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異または
ＭＹＣＮ遺伝子の増幅に由来する全ての癌が対象である。本発明の抗癌剤は、上述の医薬
組成物、アルキル化剤と同様に使用目的に応じて担体や組成物を含んでも良い。

本発明のキットは、本発明の化合物の他、医薬的に許容される担体や添加物、試薬類、補
助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含むものである。本発明のキ
ットは、癌治療用キット、研究試薬キットとしても使用することができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限
定されるものではない。

１．概要
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異は、現在、最も治療の困難な膵臓癌に多く見られるほ
か、化学療法抵抗性の転移を有する大腸癌患者または肺癌患者にも見られる遺伝子変異で
ある。現在、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異に対する有効な治療薬が望まれている。本
実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異配列を標的とするヘアピン型ＰＩＰ（ｈ
ＰＩＰ）にＤＮＡ塩基の副溝側のアデニンを特異的にアルキル化するｓｅｃｏＣＢＩを縮
合させることでＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異を特異的に認識するｈＰＩＰ−ｓｅｃ
ｏＣＢＩ（ＫＲ１２）を合成した。ＫＲ１２を用いて、（１）ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２
変異の塩基配列のアルキル化確認実験、（２）大腸癌細胞に対する５０％阻害濃度の測定
、（３）細胞増殖及び細胞形態の観察、（４）細胞周期変化の解析、（５）半定量的遺伝
子発現解析、（６）コロニーシークエンス、（７）ＲＡＳ活性測定、（８）癌細胞を移植
したヌードマウスの腫瘍抑制評価実験（９）がん細胞およびスフェア形成細胞への取り込
みと薬剤排泄メカニズムからの回避の確認実験（１０）腫瘍細胞核内への集積性の確認実
験を行った。

ＫＲ１２は、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異をもった大腸癌細胞に対して低濃度で十分な
腫瘍増殖抑制能を有し、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異がヘテロで認められるＬＳ１８０
細胞（大腸癌由来）を皮下移植したヌードマウスに対して統計学的に有意な腫瘍増殖抑制
効果を示し、ＫＲＡＳコドン１２変異がホモで認められるＳＷ４８０細胞（大腸癌由来）
においても、同細胞の移植によって形成された腫瘍の縮小効果を示した。一方で、ＫＲ１
２は、ＫＲＡＳ遺伝子が野生型のＨＴ２９細胞（大腸癌由来）では抑制効果は示さなかっ
た。この結果から、ＫＲ１２は、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異をもった癌細胞に対して
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかになった。

これらの結果から、ＫＲ１２はＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異の塩基配列を特異的にア
ルキル化し、コドン１２変異を有するＫＲＡＳ遺伝子の発現を選択的に阻害し、ＫＲＡＳ
遺伝子のコドン１２変異に起因する癌細胞の増殖を特異的に抑制する効果があることが分
かった。この結果は、アルキル化反応部位にＰＩＰを付加するという方法論が、腫瘍特異
的な様々な変異を認識する新規抗癌剤の創出にとって極めて有効なアプローチの１つであ
ることを示唆するものである。

２．ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の合成
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の化学構造は以下の化学
式１４で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カルボン酸末端を
持つＰＩＰをＤＭＦ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、２．８６μｍｏ
ｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を撹拌しながら
室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの活性体が出来
ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ_２−インドールｓｅｃｏ−ＣＢＩ（０．６
ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌し、溶媒で
あるＤＭＦを除き、残渣をジクロロメタンとジエチルエーテルで分液した。反応物の層は
ＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニアグラジエント
、０〜３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異ア
ルキル化ＰＩポリアミド（ＫＲ１２）が白い粉末で得られた（ＬＣ−ＭＳｍ／ｅ Ｃ_８９
Ｈ_９４ＣｌＮ_３１Ｏ_１６［Ｍ＋２Ｈ］２＋ 計算値：９４３．８６、実測値９４４．２５
、図３）。
また、上述の方法を適用して、下記の化学式１５で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２
と野生型の配列を認識しないコドン１３変異を標的にしたアルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１３）
も合成した（図４）。そして、下記の化学式１６、１７に示す通り、ＫＲＡＳ遺伝子の野
生型コドン１２の塩基配列を認識するＷＴ（図５）、ＫＲ１２からアルキル化能を持つＣ
ＢＩ基を除いたＣ１２−Ｄｐも合成した（図６）。

３．ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異遺伝子配列のアルキル化確認
（１）プラスミドＤＮＡのクローニング
２５μＭの２つの断片対（５’−ＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧ
ＴＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１）、３’−ＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＣＧＣＧＡＣ
ＡＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧ−５’（配列番号２））を含む最終容量５０μＬをアニールして
ＤＮＡ断片を得た。アニール化された断片をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＧＥＭ−
Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒｓに連結した。産物をプロメガ製のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
・Ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）コンピテントセルに形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシ
リンを加えたＬＢ培地のプレートで３７℃、一晩培養した。目的の形質転換されたホワイ
トコロニーは５００ｎＭのプライマーセット（Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３）、ｓｐ６：５’−ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡ
ＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号４））とプロメガ製の１Ｕ ＧｏＴａｑ(R) Ｇｒｅ
ｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含む１０μＬの反応溶液を用いたコロニーダイレクトＰＣ
Ｒにより同定した。増幅サイクルは以下のように行った。反応溶液を９５℃で２分間イン
キュベートした後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応サイクル
を３０回繰り返した後に最後の伸長反応を７２℃で７分間の反応サイクルで行った。コロ
ニーは１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃で一晩培
養した。この導入されたプラスミドはシグマアルドリッチ製のＧｅｎＥｌｕｔｅＰｌａｓ
ｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔにより回収した。

（２）高解像度−ゲル電気泳動
５’末端がテキサスレッドで標識された２１３塩基対のＤＮＡ断片を上記で作成したプラ
スミドとプライマー（ｓｐ６：５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配
列番号５）、Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号
６）、５’末端はテキサスレッド標識）で合成した。得られた５’末端がテキサスレッド
で標識されたＤＮＡ断片をシグマ製のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｋｉｔで精製し、濃度
をＵＶ吸収により決定した。各種アルキル化ＰＩＰを含む１０μＬの反応溶液（５’末端
がテキサスレッドにより標識された二本鎖ＤＮＡ断片１０ｎＭと５ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０））を２３℃で１７時間インキュベートした。反応後、過剰なアル
キル化ＰＩＰを１０ｍｇ／ｍＬのｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ ＤＮＡ（１μＬ）で除去し、
９５℃で１０分間加熱することで標的アルキル化部位でのＤＮＡの切断を引き起こした。
減圧蒸留で溶媒を除去した後、７μＬのｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅを加える。このサンプル
を９５℃で２５分間加熱した後、迅速に氷上で冷却した。１．２μＬのサンプルをＨｉｔ
ａｃｈｉ５５００−Ｓ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにセットした６％の変性ポリアクリ
ルアミドゲルに乗せ電気泳動を行った（図７）。

実験結果を図７に示した。図７ＡはＳＷ４８０細胞（大腸癌）、図７ＢはＡｓＰＣ−１細
胞（膵臓癌）のＫＲＡＳ変異配列を用いた結果である。ＫＲ１２は、ＳＷ４８０細胞（Ｇ
１２Ｖ）及びＡｓＰＣ−１細胞（Ｇ１２Ｄ）のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異配列を特
異的に、濃度依存的なアルキル化を誘導していた。

４．大腸癌細胞ＬＳ１８０に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
ＬＳ１８０大腸細胞株を用い３０００〜５０００個の細胞／ウェルになるように９６穴マ
イクロプレートの１ウェル毎に細胞を播いて、一晩培養した。翌日、コドン１２の変異を
認識するＫＲ１２、野生型ＫＲＡＳを認識するＷＴ、アルキル化剤を付加していないＫＲ
１２と同様の構造を持つＣ１２−Ｄｐを１ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３０
０ｎＭ、１μＭの濃度でそれぞれ細胞に添加、４８時間処理した。その後、ｃｅｌｌ ｃ
ｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェル毎
に添加して、２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色
分析法によって細胞数を計測した。細胞数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値
をだす、２）各ウェルからｍｅｄｉｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、
４）Ｍｅｄｉｕｍ引いた値をＤＭＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と
標準偏差をだし、グラフ作成を行った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ
／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：
５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂでの阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を用いた。

実験結果を図８に示した。ＬＳ１８０細胞は、ＫＲ１２処理によるＩＣ５０が５３ｎＭと
最も低く、ＷＴでは１９３ｎＭであった。またＫＲ１２と同様のＤＮＡ認識をするＰＩＰ
化合物でアルキル化剤を持たないＣ１２−Ｄｐでは、細胞増殖抑制は認められなかった。

５．種々の癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
大腸がん及びすい臓がん細胞株を用い３０００〜５０００個の細胞／ウェルになるように
９６穴マイクロプレートの１ウェル毎に細胞を播いて、一晩培養した。翌日、１ｎＭ、１
０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭの濃度のコドン１２の変異を認識す
るＫＲ１２でそれぞれの細胞を４８時間処理した。その後、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ
ｋｉｔ−８を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェル毎に添加して、２時間反応させた後、
マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色分析法によって細胞数を計測した。
細胞数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値をだす、２）各ウェルからｍｅｄｉ
ｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、４）Ｍｅｄｉｕｍを引いた値をＤＭ
ＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と標準偏差をだし、グラフ作成を行
った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ
）＋ＬＯＧ（Ｂ））、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂで
の阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を用いた。

実験に用いた細胞は、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ、ＬＳ１８０、ＳＷ１４
６３、ＤＬＤ−１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ−２のヒト癌細胞株（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で購入）である。
実験結果を表１に示した。ＫＲ１２に対するＩＣ５０について、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０
、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ、ＬＳ１８０、ＨＣＴ１１６は低い値を示し、ＳＷ１４６３、ＤＬＤ−
１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ−２は高い値を示した。つまり、ＫＲ１２が認識するコドン１２
の変異を持つ細胞株では、ＩＣ５０が１００ｎＭ以下の低い値を示した。ＳＷ１４６３、
ＤＬＤ−１、ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２はＫＲ１２が認識するコドン１２の変異を持たな
い細胞株であり、これらのＩＣ５０は１００ｎＭ以上の値を示した。図９に、ＫＲ１２が
認識するコドン１２の変異を持たないＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＳＷ１４６３と変異を持つ
ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＬＳ１８０の濃度依存的細胞増殖抑制効果のグラフを示した。

６−１．細胞周期変化の解析
細胞周期を観察するために、処理した細胞と未処理の細胞をＤＮａｓｅフリーのＰＢＳで
２回洗浄した後、７０％エタノール（冷凍）で固定した。固定した細胞は、１０ｇ／ｍＬ
ＲＮａｓｅＡ、５０ｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳで暗所に室温、３０分
間放置して処理した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）のＦＬ−２Ｈフィルターを用いて蛍光強度を測定
した。細胞周期の比率は、得られたデータをＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）で分析して決定した。細胞処理は、ＬＳ１
８０を５０ｎＭ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３で７２時間処理及
び長期処理実験として１４日間培養実験を行った。コントロールは１０％ＦＢＳ、０．１
２５％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ培地で１４日間培養した。

実験結果は図１０Ａに示した。５０ｎＭのＫＲ１２で処理するとＬＳ１８０のＳ期の細胞
が増加し、ＫＲ１２を長期投与するとＳｕｂＧ１期の細胞が顕著に増加していた。Ｓ期、
Ｇ２Ｍ期は細胞周期の停止、ＳｕｂＧ１期は細胞死を示している。したがって、ＫＲ１２
は濃度の増加に伴ってＬＳ１８０細胞を細胞周期の停止から細胞死に導くことが分かった
。同様にコドン１２の変異を認識しないＫＲ１３の処理（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）では、Ｓ期
の細胞及びＧ２Ｍがわずかに増加するが、長期投与でもＳｕｂＧ１期の増加は顕著でなか
った。

６−２．ＤＮＡのフラグメント化による細胞死（アポトーシス）の確認
細胞処理は、ＬＳ１８０を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／３０ｍｍ ｄｉｓｈでＭＥＭ（ｇ
ｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）＋１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｎ＋１００μｇ／ｍｌ Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）培養液で培養、５０ｎ
Ｍ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３で長期処理実験として１４日間
培養実験及び７２時間投与後、コントロール１０％ＦＢＳ、０．１２５％ＤＭＳＯを含む
ＭＥＭ培地で１１日間培養した群並びにコントロールの１０％ＦＢＳ、０．１２５％ＤＭ
ＳＯ投与１４日培養群で検討した。それぞれの群の細胞をトリプシン処理後、細胞を回収
、５０μｌのＰＢＳ溶液に撹拌、３μｌの１．５％ＴｒｉｔｏｎＸ（ｉｎ ｗａｔｅｒ）
と３μｌのＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ）を加え３７°Ｃで３０分間処
理、つぎに３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え３７°Ｃで３０分
間処理、さらに１２μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、６５°Ｃで１０分
間処理後すぐに２０μｌを２％アガロースゲルでＴＢＥ液、１００Ｖで電気泳動し、エチ
ジウムで染色した。

実験結果は図１０Ｂに示した。長期投与において、コントロール処理（レーン１）、ＫＲ
１３処理（レーン３）ではＤＮＡの断片化が見られなかったが、ＫＲ１２処理（レーン２
）では細胞死によって誘導されるＤＮＡの断片化が見られた。７２時間処理群では、ＫＲ
１２、ＫＲ１３ともにＤＮＡの断片化が見られなかった（レーン４、５）。このことは、
ＫＲ１２の短期投与によりＬＳ１８０細胞の細胞死（アポトーシス）が誘導されるが、Ｋ
Ｒ１３の長期投与および短期の投与では細胞死が誘導されないことを示唆している。

６−３．ＤＮＡ損傷とその修復、細胞死（アポトーシス）の誘導マーカーをウェスタン解
析で検討
５０ｎＭ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３の１４日間の長期投与実
験後のＬＳ１８０細胞を１×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに溶解、１００度で５
分処理後、蛋白量をＢｒａｄｆｏｒｄ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）で判定
、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉ
ｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）にトランスファーし、５％ｄｒ
ｙ ｍｉｌｋをＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）ｐｌｕｓ０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０をブロッキング剤として、ａｎｔｉ−γＨ２ＡＸ（２Ｆ３，ＢｉｏＬｅｇ
ｅｎｄ，ＣＡ）、ａｎｔｉ−ｐ５３（ＤＯ−１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）、もしくはａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（２０−
３３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）をそれぞれ加え、さらにＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎ
ｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧもしくはａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇ
ｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）で処理した。２次抗体処理前に適宜１
次抗体の洗浄を行った。その後ＴＢＳ ｐｌｕｓ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＥＣ
Ｌ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）で蛋白質を同定した。

実験結果は図１０Ｃに示した。ＫＲ１２の長期投与により、ＤＮＡ損傷マーカーであるγ
Ｈ２ＡＸが誘導され、ｐ５３の誘導も見られた、さらにＰＡＲＰ蛋白が切断されているこ
とより、細胞死（アポトーシス）が誘導されていることが認められる。ところがコントロ
ール及びＫＲ１３の処理では顕著なＤＮＡ損傷、細胞死の誘導は認められない。蛋白量を
確認するアクチンのバンドは揃っている。このことよりＫＲ１２の長期投与により、大腸
がん細胞株にＤＮＡ損傷が誘導されさらに細胞死が誘導されていることが示唆される。

７．ＲＴ−ＰＣＲによる半定量的遺伝子発現解析
ＨＴ２９、ＬＳ１８０を１２穴プレートで培養した。翌日、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、
ＫＲ１３で処理した後、４８時間培養して、細胞を集めてＲＮＡを抽出した。前記抽出に
はＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた。次
に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮ
Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写用のｃ
ＤＮＡを調製した。前記ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲのは９４℃で５分間の後、９４
℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、最後に７２℃で７分間の
伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。ＰＣＲ産
物量はエチジウムブロマイドで染色した写真によって算出した。
ＰＣＲには下記のプライマーセットを使用した。

変異遺伝子も野生型も同時に増幅するフォワードプライマー（センス）とリバースプライ
マー（アンチセンス）および内部標準としてＲＰＳ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓ１８）遺伝子のフォワードプライマー（センス）とリバースプライマー（アン
チセンス）を下記に示す。
ＫＲＡＳ遺伝子
フォワードプライマー（センス）：
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号７）
リバースプライマー（アンチセンス）：
５’−ＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴ−３’（配列番号８）
ＲＰＳ１８（内部標準）
フォワードプライマー（センス）：
５’−ＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＴ−３’（配列番号９）
リバースプライマー（アンチセンス）：
５’−ＴＣＴＴＣＡＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴ−３’（配列番号１０）

実験結果は、図１１に示した。ＨＴ２９（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が無い野生型
）では、ＫＲＡＳ遺伝子の発現はＫＲ１２によって変化が見られなかった（図１１Ａ）。
一方、ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が有り）では、ＫＲＡＳ遺伝子の発
現はＫＲ１２投与で有意に抑制されていた（図１１Ｂ）。

８．コロニーシークエンス
６．５×１０^４個の細胞を播いて、一晩培養した後、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、ＫＲ１
３で処理した後、４８時間培養して、細胞を集めてＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮ
ｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた。次に、抽
出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写用のｃＤＮＡ
を調製した。前記ｃＤＮＡをテンプレートに配列番号７及び配列番号８のプライマーを用
い、ＰＣＲは９４℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を
２０サイクル、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ
Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いてクローニングした。そして
、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｊａｐａｎ）に形質転換し、形質転
換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、１ｍｇ Ｘ−ｇａｌ、１ｍｇイソプロピル−β−チ
オガラクトピラノシドを含むＬＢプレートで３７℃、一晩培養した。白いコロニーをコロ
ニーダイレクトＰＣＲによって同定した。ＰＣＲ反応のサイクルは９４℃で５分間の後、
９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル行って、最後に７２℃
で７分間の伸長反応を行った。下記のプライマーセットＭ１３−Ｆ１プライマーとＭ１３
−Ｒ１プライマーを増幅に使用した。増幅したＤＮＡを、シークエンサーでシークエンス
用プライマーＫＲＡＳ−２Ｒを用いて配列を解読し、一つ一つのコロニーのＫＲＡＳ遺伝
子変異部位を同定した。

Ｍ１３−Ｆ１プライマー：
５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１１）
Ｍ１３−Ｒ１プライマー：
５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１２）
シークエンス用プライマーＫＲＡＳ−２Ｒ：
５’−ＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴ−３’（配列番号１３）

９．コロニーＰＣＲ
ＫＲＡＳコドン１２のＧＡＴ変異遺伝子（ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−ＦとＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｒ
）と野生型遺伝子（ＫＲＡＳ−ＷＴ−ＦとＫＲＡＳ−ＷＴ−Ｒ）を特異的に増幅するプラ
イマーを用いて直接前記白いコロニーの大腸菌細胞を用いてＰＣＲを行い、目的のバンド
がどちらのプライマーセットで増幅するかで、変異ＫＲＡＳ遺伝子か野生型かをコロニー
ごとに判断した。
ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＡＴ変異認識）
ＫＲＡＳ−ＷＴ−Ｆ：
５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号１４）
ＫＲＡＳ −ＷＴ−Ｒ：
５’−ＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）
ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｆ：
５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＡ−３’（配列番号１６）
ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｒ：
５’−ＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号１７）

実験結果を表２−４に示した。コドン１２の変異ＫＲＡＳ遺伝子と変異していない野生型
のＫＲＡＳ遺伝子を持つ、ヘテロ接合型の大腸がん細胞株ＬＳ１８０に対し、コドン１２
の変異遺伝子を特異的にアルキル化すると考えられるＫＲ１２を投与後４８時間に、ＲＮ
Ａを抽出し、ＫＲＡＳ遺伝子を定量的に増幅、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットにより、プラ
スミドにクローニングし、コンピテント細胞に導入、ＬＢ／ａｍｐ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａ
ｌプレートによるブルー・ホワイトセレクションにより、インサートを持つ白色コロニー
をピックアップし直接シークエンスするか、コロニーＰＣＲ法によりコドン１２の変異の
有無をコロニーごとに検討した。ＬＳ１８０細胞においては、コロニーシークエンス法で
、ＫＲ１２の投与によりＤＭＳＯでは均等に増幅される変異遺伝子と野生遺伝子の数がＫ
Ｒ１２投与群では変異遺伝子のコロニーが半分であり、ＫＲ１３ではむしろ増加した（表
２）。同様にコロニーＰＣＲでもＫＲ１２投与により、変異がん遺伝子の発現の減少が確
認できた（表３）。同様にヘテロ接合型のすい臓がん株ＰＡＮＣ−１においても表４に示
す通り、コントロールでは、変異ＫＲＡＳ遺伝子が３倍近く高発現しているが、ＫＲ１２
の投与により、その発現は野生型の遺伝子を同レベルに減少した。このことは、ＫＲ１２
がＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にヘテロに変異を持つ細胞株で、変異遺伝子を優位に発現
抑制していることを示す結果と言える。

１０．ＲＡＳ活性測定
２×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍプレートまたは１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍプ
レートの細胞数を完全栄養培地で培養し、翌日、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、ＫＲ１３で
処理し、４８時間培養した後、細胞をマグネシウム溶解バッファー（ＭＬＢ）に溶解し、
ＲＡＳ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を使
ってＲＡＳ活性レベルを測定した。

実験結果を図１２、図１３に示す。ＨＴ２９（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が無い野
生型）では、活性型のＫＲＡＳ蛋白質（ｐ２１−ｒａｓ蛋白質）はほとんど検出できなか
った（図１３Ａ）。一方、ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が有り）では、
活性型のＫＲＡＳ蛋白質が検出できた（図１２Ａ）。さらに、ＫＲ１２によって、検出し
たＫＲＡＳ蛋白質の活性は低下し（図１２Ａ）、細胞増殖も抑制された（図１２Ｂ）。こ
の結果は、ＬＳ１８０においてＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異によって常に活性型のＫ
ＲＡＳ蛋白質が発現していたところ、ＫＲ１２によって、変異遺伝子の発現が抑制され、
活性型のＫＲＡＳ蛋白質が減少し、細胞死の誘導が促進されたと考えられる。

１１．ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＬＳ１８０を移植したヌードマウスにおけるＫＲ１２の腫
瘍増殖抑制評価実験
細胞を含む下記３種類のＰＢＳ溶液をヌードマウスの大腿部の皮下に移植した後（ＨＴ２
９を７匹、ＬＳ１８０を７匹、ＳＷ４８０を６匹）、腫瘍が生着し、腫瘍容積が約１００
mm^３になった時点で、３．４ｍｍｏｌのＫＲ１２（１．３６ｍＭのＫＲ１２をＤＭＳＯ２
．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬに溶解）、ＤＭＳＯ／ＰＢＳコントロール（ＤＭＳＯ２
．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬ）の各組成で薬剤を調整し、１０分間ソニケーション後
、２００μＬをマウス尾静脈より投与した。体重、腫瘍の大きさは３日に１回計測し、腫
瘍の大きさは０．５２×Ｌ×Ｗ×Ｄ（１／６×π×Ｌ×Ｗ×Ｄ）の方法で測定した。

ヌードマウスへ移植した細胞株の詳細は下記の通りである。
ＨＴ２９（ＫＲＡＳ−ＷＴ）：（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰＢＳを皮下に移植
、ＫＲＡＳコドン１２野生株でコドン１２の変異を持たない細胞株）
ＳＷ４８０（ＫＲＡＳ−ＭＵＴｈｏｍｏ）：（５×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰＢＳ
を皮下に移植、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異 Ｇ１２Ｖをホモでもつ細胞株）
ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ−ＭＵＴｈｅｔｅｒｏ）：（３×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰ
ＢＳを皮下に移植、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異Ｇ１２Ｄをヘテロでもつ細胞株）

実験結果は図１４に示した。その結果、コドン１２の変異を持たないＨＴ２９細胞に対し
てはＫＲ１２の投与による腫瘍の増殖を抑制することはできなかった（図１４Ａ）が、コ
ドン１２の変異をホモで持つＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにおいてＫＲ１２の
投与によって腫瘍の大きさは顕著に縮小した（図１４Ｃ）。ＫＲ１２の変異アレルと野生
型をヘテロに持つＬＳ１８０細胞を移植したヌードマウスもＫＲ１２の投与によって有意
な腫瘍の増殖抑制が見られた（図１４Ｂ）。ＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにＤ
ＭＳＯ／ＰＢＳコントロールを投与した場合、腫瘍の大きさは拡大するばかりであったの
に対して、ＫＲ１２を投与すると２カ月後には腫瘍の大きさが有意に縮小し、３カ月後に
は腫瘍が極めて小さく硬い硬結となった（図１４Ａ−Ｃ、剖検時（３カ月後もしくは腫瘍
が直径２ｃｍ以上になった時）の写真）。

コントロールとしてＤＭＳＯ／ＰＢＳの代わりにコドン１２の変異を認識しないＰＩＰ−
インドール−ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（ＫＲ１３）および８．４ｍｍｏｌのｓｅｃｏＣＢＩ（３
．３６ｍＭのＣＢＩをＤＭＳＯ２．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬに溶解）を用いて、上
記１１と同じ手法で実験を行った結果を図１５に示す。ＳＷ４８０細胞を移植したヌード
マウスにＫＲ１２は、ＫＲ１３を投与した場合よりも有意に高い癌腫瘍抑制効果を示した
。また、ｓｅｃｏ−ＣＢＩでは認められた体重減少傾向がＫＲ１２およびＫＲ１３では認
められなかった。つまり、ＫＲ１２は、Ｇ１２Ｄ変異配列を認識しないＫＲ１３が示さな
い腫瘍増殖抑制を認めかつ体重減少や健康状態の異常といった副作用を引き起こさない結
果が得られた。また、ＫＲ１２を投与したヌードマウスは、毛の逆立ち、摂餌量の低下、
運動量の減少、異常行動等も見られなかった。

１２．細胞局在解析
Ｃ１２ＤＰのＮ末端にβアラニンを導入し、続いてＦＩＴＣのカップリングを行った。Ｆ
ＩＴＣのカップリングは、４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ
、ＨＣＴＵをＤＭＦに溶解したものをカラムに通して６０分振とうして行った。ＬＳ１８
０細胞は、ＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）＋１００ｕｎｉｔｓ／ｍ
ｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１００ｇ／ｍｌ Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）培
養液で培養し、約５０％コンフルエンスの状態で、ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏ
ｌ）を添加し、２時間後に封入（ＶＥＣＴＯＲ ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）し、ＤＡＰＩ
による核染色を行いコンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰＥ）で観察した。

実験結果は図１６に示した。ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）をＬＳ１８０細胞
の培養培地内に投与後2時間で確認したところＬＳ１８０細胞の核内に蛍光集積が見られ
、ＫＲ１２が大腸がん培養細胞の核内に移行し、局在することが確認された。

１３．癌幹細胞への標的性試験
２種類の大腸がん細胞株ＳＷ４８０細胞とＬｏＶｏ細胞を用いて実験を行った。それぞれ
２ｘ１０^５個をＳｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ：ＤＭＥＭ／Ｈａ
ｍ‘ｓ Ｆ−１２培養液にＢ２７（ミルテニー社、２％）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、
ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬを添加した培養液）とともに培養し、４日目にＦＩＴＣ標識し
たＫＲ１２（１μＭｏｌ）もしくはＤｏｘｉｓｏｒｂｉｃｉｎ（１μＭｏｌ）を添加し、
一時間後にＰＢＳで２度洗浄し、再びＳＦＭで培養を始め、０時間、４時間、２４時間に
封入し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＰｒｏＬｏｎｇ(R) Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ（Ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ））、コンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−
ＳＰＥ）で観察した。

実験結果は図１７に示した。ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）を癌幹細胞のモデ
ルであるスフェア形成した大腸癌に投与した結果、スフェア内細胞の核内に蛍光が見られ
た。そして、蛍光は２４時間後も持続して観察された。ドキソルビシンのような低分子化
合物は、ＡＢＣトランスポーターの活性化したスフェア形成大腸癌細胞から、速やかに排
泄されることが知られている。これに対して、ＫＲ１２の示した結果は、長時間排泄され
ることなく、細胞の核内に滞在していた。このことは、ＫＲ１２が、癌幹細胞の核内に到
達するため、薬剤耐性のメカニズムに拠る薬剤排泄機構の影響を受けにくく、癌幹細胞治
療にも有効である可能性を示唆している。ＫＲ１２が核内に移行するのは、ＰＩＰ構造上
の脂溶性部分から細胞内に取り込まれやすく、細胞質から速やかに核内に移行し、ＤＮＡ
に結合する性質を有するためであると考えられる。よって、本発明で用いた複合体がＰＩ
Ｐの機能により、薬剤送達技術であるＤＤＳを特別に必要としないことを示すものであり
、ＰＩＰ自体が様々な小分子化合物を特定のゲノムに送達させるＤＤＳになることを裏付
けるものである。

１４．腫瘍蓄積性試験
４週齢で購入したメスＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに対し、５週齢時に５ｘ１０^６
のＳＷ４８０細胞を皮下に移植後、腫瘍が直径１５ｍｍに達した時にＦＩＴＣ標識したＫ
Ｒ１２（１０ｎｍｏｌを１．２５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）もしくはＦＩＴＣ（
１ｍｇ／ｋｇを１．２５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）、１．２５％ＤＭＳＯを２０
０μｌ尾静脈より投与し、インビボイメージングシステム（ＮＩＰＰＯＮ ＲＯＰＥＲ：
Ｌｕｍａｚｏｎｅ ＦＡ）で０時間から２時間おきに１０時間まで撮影し、１日後３日後
にも蛍光レベルとマウス個体を撮影した（図１８）。さらに同様の処理を行ったマウスを
２４時間後に解剖し、それぞれの臓器及び腫瘍を取り出し、インビボイメージングシステ
ム（ＮＩＰＰＯＮ ＲＯＰＥＲ：Ｌｕｍａｚｏｎｅ ＦＡ）で撮影した（図１９）。また
同様のヒト大腸がん皮下移植マウスに１ｍｇ／ｋｇのＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１．２
５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）、１．２５％ＤＭＳＯを ２００μｌ尾静脈より投
与し、２４時間後に腫瘍を摘出しＯＣＴコンパウンドにいれ凍結、１０ミクロンの凍結切
片をＬＥＩＣＡ ＣＭ１５１０Ｓで作成し、コンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ
−ＳＰＥ）で観察した（図２０）。

実験結果は図１８−図２０に示した。ＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにＦＩＴＣ
で蛍光標識したＫＲ１２（１０ｎＭｏｌ）を静脈内に投与し、その後蛍光イメージで経時
的に観察した結果、ＫＲ１２は全身に分布した後、腫瘍に集積を残し、肝臓、腎臓より徐
々に排出されるという腫瘍集積性を示した（図１８）。さらに静脈注射後の全身から腫瘍
へ経時的に蓄積され、投与してから3日後にも腫瘍で蛍光が認められた。そして、投与後
２４時間でマウスを解剖し、各臓器のＦＩＴＣの取り込みを観察したところ、腫瘍で最も
強い蛍光が確認され、他の臓器（心臓、胃、膵臓、脾臓、肺、脳）では蛍光が見られない
か、または蛍光が低く、ほとんど排泄されていた（図１９）。また、腫瘍、肝臓、腎臓の
各細胞におけるＫＲ１２の局在を蛍光顕微鏡で確認したところ、核内に蛍光が確認された
（図２０）。マウス尿中、胆汁中においてＫＲ１２とその分解産物の有無を質量分析した
ところ、ＫＲ１２は代謝分解を受けない状態で排泄されていた。腫瘍細胞では細胞分裂に
伴い細胞膜等の合成に脂質が必要であり、一般的に脂質の取り込みが増加する、またリン
パ管を介した排泄が未発達である。このことにより、ＫＲ１２の特異的な腫瘍蓄積性は、
ＫＲ１２の有するＰＩＰの脂溶性部分が、ＫＲ１２の癌細胞内への取り込みを促進し、Ｋ
Ｒ１２の腫瘍内からの排出を妨げたことによると考えられる。正常細胞でもＫＲ１２の肝
臓、腎臓への集積性は認められるが、細胞内に留まることができないため、胆汁中・尿中
に排泄され、これらの臓器から排泄される。つまり、ＫＲ１２は、正常細胞からは速やか
に排泄され、癌細胞に対しては長期に滞留するという優れた効果を備えている。

１．概要
ＡＬＫ遺伝子は、肺癌の原因となる融合遺伝子を形成したり、神経芽腫において、恒常的
に活性化する点変異を有し、癌化を促進するドライバーオンコジーン遺伝子である。ＡＬ
Ｋ阻害剤がＡＬＫ遺伝子の変異を持つ癌細胞に有効であることは知られているが、多くの
場合癌細胞はＡＬＫ阻害剤に耐性となり、再発することが多い。神経芽腫におけるＡＬＫ
遺伝子変異Ｆ１１７４Ｌ（３５２２Ｃ＞Ａ）は、神経芽腫細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＭＳ−
ＳＡＮ、ＫＥＬＬＹ、ＬＡＮ−１において認められている。そこで、この変異配列を特異
的に認識する１０塩基認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物ＡＬＫ−ＦＬ
−１をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した（図２１）。

２．ＡＬＫ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の合成
ＡＬＫ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の化学構造は以下の化学式で表さ
れる（図２２）。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。Ｆ１１７４Ｌ（３５
２２Ｃ＞Ａ）変異は１０塩基を認識するＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩで野生型
の５’−ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡ−３’配列の３’側から２番目のグアニンを認識できない
ピロールを配置することで変異型５’−ＴＧＧＴＧＧＴＴＴＡ−３’を認識させる化合物
として設計した。

３．神経芽腫細胞、乳癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、Ｋｅｌｌｙ細胞
、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰＭＩ１６４
０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル ｐｌａｔｅに各細胞
を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて
２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添加、混和した。再び３
７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋ
ｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３７℃、５％ＣＯ２、飽
室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＭＴＰ−３１０
Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後、ＩＣ５０値を算出し
た。

実験結果は、図２３、表５に示した。ＡＬＫ−ＦＬ−１を投与すると、Ｆ１１７４Ｌ変異
を有する神経芽腫細胞で高い細胞増殖抑制効果を示した（図２３Ａ）。具体的には、Ｋｅ
ｌｌｙ細胞株ではＩＣ５０が０．０９ｎＭ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株ではＩＣ５０が０．１
３ｎＭがあったのに対して、野生型の神経芽腫であるＩＭＲ−３２細胞株ではＩＣ５０は
０．４６ｎＭ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株ではＩＣ５０は２．６ｎＭ、Ｆ１１７４Ｌ変異を有
さない乳癌細胞（ＡＬＫ遺伝子野生型）であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のＩＣ５０は
７．５ｎＭであった（図２３Ａ−Ｄ、表５）。以上のことから、ＡＬＫ−ＦＬ−１は、Ｆ
１１７４Ｌ変異を持つ神経芽腫細胞株に対して特異的により強い増殖抑制を示した。

１．概要
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、エキソン１０のヘリカルドメインにあたるＥ５４５Ｋ、Ｅ５４２
Ｋとエキソン２１のキナーゼドメインにあたるＨ１０４７Ｒの３か所のホットスポットに
変異が集中し、それらの変異は、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝癌および脳膠芽腫で高頻
度に生じることが報告されている。一方で点変異を伴わないＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の増幅は
、頸癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌で認められている。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、ＰＩ
３キナーゼ−Ａｋｔ経路で、癌ドライバー遺伝子として働くため、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を
標的にしたＰＩ３Ｋ阻害剤が開発されているが、毒性の問題等により未だ臨床応用に至っ
ていないのが現状である。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）変異は、
乳癌細胞株ＭＣＦ７で認められている。そこで、この変異配列を特異的に認識する９塩基
認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１とＰ３Ａ−Ｅ５
Ｋ−２をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した（図２４）。

２．ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の合成
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の化学構造は以下の化学
式で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである（図２５、２６）。Ｅ５
４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）変異を認識させるため５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡ−３’を認
識するＰＩＰ−Ｉｎｄｏｌｅ―ｓｅｃｏ−ＣＢＩをデザインした。この化合物は野生型の
５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡ−３’を３`から２番目のシトシンが認識できず、３`のアデ
ニンをアルキル化できないが変異配列ではアルキル化できるよう設計した。

３．乳癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、ＭＣＦ７細胞、
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ
培地とＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル
ｐｌａｔｅに各細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ２、飽湿条件下にて２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ
ｅｎｔｒａｔｉｏｎ １，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添
加、混和した。再び３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ
Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３
７℃、５％ＣＯ２、飽室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅ
ｒ ＭＴＰ−３１０ Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後
、ＩＣ５０値を算出した。

実験結果は、図２７に示した。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）の変
異を有する乳癌細胞株であるＭＣＦ７に対して、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１はＩＣ５０が５３．
８ｎＭ、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２は＞１００ｎＭであった（図２７Ａ）。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子
が野生型である乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１は
ＩＣ５０が＞１００ｎＭであった（図２７Ｂ）。これらの結果から、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子
のＥ５４５Ｋ変異癌細胞株に対して作製されたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１は有意にＥ５４５Ｋ変
異乳癌細胞株で腫瘍増殖抑制効果が変異のない乳癌細胞株に比べ有意に強いことが明らか
になった。

１．概要
癌細胞特異的な変異として、点変異や転座ではなく遺伝子配列の変化を伴わない、遺伝子
の増幅がある。これはコピーナンバーチェンジ変異と言われ、特定のがん関連遺伝子の領
域が増幅し、結果としてがん遺伝子の発現量が上昇することで癌化を促すものである。我
々は本発明のように特定のゲノム配列をアルキル化する化合物が、増幅してコピー数が多
くなった遺伝子を標的にして作成した場合も効果を発揮すると考え小児の神経芽腫等で高
頻度に増幅し、予後不良因子となるＭＹＣＮを標的としたＭＹＣＮアルキル化ＰＩＰ（Ｍ
ＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）を合成した。ＭＹＣＮ遺伝子は、神経芽腫に
おいて高頻度に増幅する遺伝子で、神経芽腫のドライバーオンコジーン遺伝子と考えられ
ている。このＭＹＣＮ遺伝子に対し、図２に示ように８塩基を認識するＰＩＰ−ｉｎｄｏ
ｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２）及びエキソン３の配列を特
異的に認識する９塩基認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物（ＭＹＣＮＡ
３）（図２８）をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した。

２．ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）
の合成
ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）の化
学構造は以下の化学式で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カ
ルボン酸末端を持つＰＩＰをＤＭＦ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、
２．８６μｍｏｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液
を撹拌しながら室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル
の活性体が出来ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ_２−インドールｓｅｃｏ−
ＣＢＩ（０．６ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩
撹拌し、溶媒であるＤＭＦを除き、残渣をジクロロメタンとジエチルエーテルで分液した
。反応物の層はＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニ
アグラジエント、０〜３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるアルキル化ＰＩポリ
アミド、ＭＹＣＮＡ１が白い粉末で得られた（図２９）。ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３も
同様の方法で得られた（図３０、３１）。ＭＹＣＮを標的としたＰＩＰの設計方法は図２
に示されている。

３．Ｉｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡による細胞増殖及び細胞形態の確認
細胞を９６穴プレートで１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ２、飽湿条件下にて２４時間培養し、翌日、ＤＭＳＯコントロール、１ｎＭ、３ｎＭ、
１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭのＭＹＣＮＡ１を添加した培養液に取り換え、細胞をＩ
ｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡（Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ
Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で６時間おきに観察した。成長曲線はＩｎｃｕｃｙｔｅ ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いたイメ
ージングプレートから作成した。実験に用いた細胞は、ＭＹＣＮ領域の増幅が見られる神
経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２細胞（ＭＹＣＮ２５コピー）、ＴＧＷ細胞（ＭＹＣＮ６０コピ
ー）であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰＭＩ１６４
０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。

成長曲線の結果は図３２に示した。ＭＹＣＮ遺伝子が高発現しているＩＭＲ―３２細胞、
ＴＧＷ細胞はＭＹＣＮＡ１によって濃度依存的に細胞増殖が抑制されていた（図３２）。

４．神経芽腫細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、ＩＭＲ−３２細
胞、ＴＧＷ細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰ
ＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル ｐｌａｔ
ｅに各細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿
条件下にて２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎ １，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添加、混和し
た。再び３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ
ｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３７℃、５％
ＣＯ２、飽室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＭＴＰ
−３１０ Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後、ＩＣ５０
値を算出した。

実験結果を図３３に示した。ＭＹＣＮＡ１のＩＭＲ−３２細胞に対するＩＣ５０は９．７
ｎＭであり、ＴＧＷ細胞に対しては１２．９ｎＭがあった。ＭＹＣＮＡ２のＩＭＲ−３２
細胞に対するＩＣ５０は１２．１ｎＭであり、ＴＧＷ細胞に対しては１１．２ｎＭがあっ
た。つまり、ＭＹＣＮＡ１およびＭＹＣＮＡ２は低濃度でＭＹＣＮ遺伝子の発現が高い癌
細胞の増殖抑制を誘導できるものと考えられる。

図３４は、ＭＹＣＮＡ３を使用して、ＩＭＲ−３２細胞（ＭＹＣＮ増幅有り、神経芽腫細
胞）、ＴＧＷ細胞（ＭＹＣＮ増幅有り、神経芽腫細胞）、ＮＢ６９細胞（ＭＹＣＮ増幅無
し、神経芽腫細胞）、ＭＣＦ７細胞（乳癌細胞）、ＨＴ２９細胞（大腸癌細胞）、ＨＤＦ
細胞（角膜上皮皮膚繊維芽細胞）に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した結果と
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡（Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎ
ｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で細胞増殖を観察した結果（ＭＹＣＮＡ３処理７２時間後）であ
る。表６は、０．３−３００ｎＭ、７２時間処理条件で行った細胞増殖測定試験の結果で
ある。これらの結果、ＩＭＲ−３２細胞でＩＣ５０が１．１ｎＭ、ＴＧＷ細胞で３．７ｎ
Ｍ、ＭＢ６９細胞で７７．０ｎＭ、ＭＣＦ７細胞で１５２．２ｎＭ、ＨＴ２９細胞で２３
９．６ｎＭ、ＨＤＦ細胞で５６．６ｎＭと神経芽腫細胞、特にＭＹＣＮ増幅を伴う神経芽
腫細胞で増殖抑制が見られる結果であった。このことから、ＭＹＣＮＡ３の細胞増殖抑制
効果はＭＹＣＮ増幅を伴う神経芽腫細胞で特に高く、他の癌種やＭＹＣＮ増幅の見られな
い神経芽腫、正常組織由来の細胞株では効果が低いことが分かった（図３４、表６）。

配列番号１：合成ＤＮＡ、
配列番号２：合成ＤＮＡ、
配列番号３：合成ＤＮＡ、
配列番号４：合成ＤＮＡ、
配列番号５：合成ＤＮＡ、
配列番号６：合成ＤＮＡ、
配列番号７：合成ＤＮＡ、
配列番号８：合成ＤＮＡ、
配列番号９：合成ＤＮＡ、
配列番号１０：合成ＤＮＡ、
配列番号１１：合成ＤＮＡ、
配列番号１２：合成ＤＮＡ、
配列番号１３：合成ＤＮＡ、
配列番号１４：合成ＤＮＡ、
配列番号１５：合成ＤＮＡ、
配列番号１６：合成ＤＮＡ、
配列番号１７：合成ＤＮＡ。

Claims (18)

1. ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、ア
   ルキル化剤との複合体であって、
   下記式で表される、前記複合体。
   
2. ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、ア
   ルキル化剤との複合体であって、
   下記式で表される、前記複合体。
   
3. ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、ア
   ルキル化剤との複合体であって、
   下記式で表される、前記複合体。
   または、
   
4. ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、ア
   ルキル化剤との複合体であって、
   下記式で表される、前記複合体。
   または、
   
5. 遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化及び／または遺伝子コピー数の変化である、請求項
   １〜４のいずれか１項に記載の複合体。
6. ドライバーオンコジーンが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦ
   Ｒ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣ
   Ｌ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、Ｍ
   ＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、
   ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥＴ、
   並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子から選ばれる少なくとも１つであ
   る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
7. ＤＮＡ結合化合物がピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、およびピロール・
   イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物のいずれかである、請求項１〜６のいずれか１
   項に記載の複合体。
8. アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含む、ドライバーオンコジーン遺伝子変
   異特異的アルキル化剤。
10. 請求項１に記載の複合体を含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異アルキル化剤。
11. 請求項２に記載の複合体を含むＡＬＫ遺伝子Ｆ１１７４Ｌ変異アルキル化剤。
12. 請求項３に記載の複合体を含むＰＩＫ３ＣＡ遺伝子Ｅ５４５Ｋ変異アルキル化剤。
13. 請求項４に記載の複合体を含むＭＹＣＮ遺伝子増幅変異アルキル化剤。
14. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
15. 医薬組成物が抗癌剤である請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含むキット。
17. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含む研究試薬キット。
18. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含む治療用キット。