CN106068266A - 以癌症驱动基因的基因突变为靶点进行烷基化的新型烷基化剂 - Google Patents

以癌症驱动基因的基因突变为靶点进行烷基化的新型烷基化剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种特异性地结合于癌症驱动基因的基因突变部位的新型烷基化剂。本发明还提供使特异性地结合于癌症驱动基因的基因突变部位的聚酰胺与烷基化剂结合而成的复合体、包含该复合体的癌症驱动基因突变特异性烷基化剂、及包含该复合体的医药组合物。

Description

以癌症驱动基因的基因突变为靶点进行烷基化的新型烷基 化剂
技术领域
本发明涉及以癌症驱动基因(driver oncogene)的基因突变部位为靶点进行烷基化的新型烷基化剂。
背景技术
现在正在广泛地开发以癌症驱动基因(必需原癌基因)为靶点的分子靶向治疗。癌症驱动基因是指具有基因突变的原癌基因，所述基因突变可以认为是在癌细胞中发生特异性突变(点突变、小缺失、插入或易位、扩增等)并以此为主要原因而发生癌化的基因突变。因此，已经证明，以癌症驱动基因作为靶点开发能够抑制其功能的药物是开发对癌症患者的特效药的极其有效的方法。可以列举例如：对具有突变EGFR的肺癌患者显示出极高有效性的易瑞沙(Iressa)、对HER2高表达导致的乳腺癌患者有效的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、融合蛋白BCR-ABL的活性抑制剂伊马替尼(Imatinib)等。
具有癌症驱动基因的基因突变可以分为以下两种：(1)基因序列的变化(点突变、染色体易位、缺失和/或插入)(另外，缺失、易位突变中也包含正常细胞中的成为异等位基因(heteroallelic)的SNP(单核苷酸多态性)在肿瘤中成为单等位基因(monoallelic)或同等位基因(homoallelic)的突变)，以及(2)基因拷贝数的变化(基因的表达增加)。作为具有上述(1)的突变的癌症驱动基因，已知有RAS、KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH，作为具有上述(2)的突变的癌症驱动基因，已知有Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN、MET等。其它的癌症驱动基因注册在癌基因突变数据库(COSMIC[Catalogue of somatic mutations in cancer])等中。
至今已经进行了许多特异性地抑制癌症驱动基因的基因突变部位的药物的开发。但是，这样的药物有时也会抑制正常细胞所必需的正常基因的作用，现状是尚未开发成功目标药物。
吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)是以抗生素偏端霉素(distamycin)为基序而开发的人工合成小分子，报告了其能序列特异性地结合于双链DNA的小沟，关于PIP抑制靶点序列的基因表达的研究也有很多报告。进而，通过使用小鼠的动物实验，推进了对肾病的药物、抗癌剂、对角膜外伤、增生性瘢痕、骨病等的治疗药的研究。而且近年来，作为iPS细胞研究的一环，在京都大学的iPS细胞项目的iCeMs研究中也进行了由PIP诱导iPS细胞的研究等，PIP是被期待能取得各种研究成果的有机小分子。
作为PIP的特征，可以列举：(1)能够以任意的基因序列为靶点进行设计，(2)对DNA的结合能力大于转录因子，(3)在无载体、无药物传递系统(DDS)的情况下进入细胞的核，(4)不被核酸酶分解，在细胞、生物体内稳定，作为未分解物而通过尿、胆汁排泄，(5)能够容易地对N和C末端进行修饰，从而能够与各种功能性小分子形成复合体等。
对于PIP而言，Py/Im对识别CG、Py/Py对识别AT或TA、Im/Py对识别GC，由此能够序列特异性地结合于各种任意的双链DNA。结合于靶点基因的PIP会阻碍转录因子对DNA的结合，作为抑制特定基因表达的基因开关而进行了研究。
本发明人利用序列识别特异性高的PIP结构分别成功地完成了以下发明：合成了烷基化官能团与PIP的复合体从而完成了对DNA的特定碱基序列进行烷基化的吲哚衍生物(专利文献2)，合成了组蛋白修饰控制剂与PIP的复合体从而完成了与靶点基因特异性组蛋白修饰控制剂有关的发明(专利文献1)。但是，以使用PIP的概念为基础，以癌症驱动基因的驱动突变(driver mutation)(引起癌的主要原因的基因突变)作为靶点来合成药物尚未有能够实际上取得抑制肿瘤的效果的报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/001933
专利文献2：WO2005/087762
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，需要对癌症驱动基因的基因突变部位有特异性作用的治疗药。因此，本发明的目的在于提供一种以癌症驱动基因的基因突变部位为靶点进行烷基化的新型烷基化剂。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，设计与癌症驱动基因的基因突变部位特异性结合的吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)，并合成使烷基化反应部位与设计的PIP结合的化合物，成功地合成了新型化合物，所述新型化合物可以特异性地识别癌症驱动基因的基因突变部位，与其结合并进行烷基化，进而确认了新型化合物可以有效地传递至肿瘤细胞、肿瘤干细胞，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种复合体，其是特异性结合于癌症驱动基因的基因突变部位的DNA结合化合物与烷基化剂的复合体。
(2)根据(1)所述的复合体，其中，基因突变部位为基因序列的变化和/或基因拷贝数的变化。
(3)根据(1)或(2)中任一项所述的复合体，其中，癌症驱动基因为选自KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH、Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN和MET、以及在癌的基因突变数据库中注册的基因中的至少一种。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的复合体，其中，DNA结合化合物为桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)、Locked Nucleic Acid(锁核酸，LNA)、PNA、DNA结合蛋白复合体、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物或DNA结合蛋白、或者其复合体。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的复合体，其中，烷基化剂是具有对DNA的特定碱基序列有烷基化能力的官能团的化合物。
(6)根据(5)所述的复合体，其中，烷基化剂为secoCBI。
(7)一种癌症驱动基因突变特异性烷基化剂，其含有(1)～(6)中任一项所述的复合体。
(8)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式1]
(9)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式2]
(10)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式3]
(11)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式4]
(12)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式5]
(13)根据(1)所述的复合体，其以下式表示。
[化学式6]
(14)一种KRAS基因密码子12突变烷基化剂，其含有(8)所述的复合体。
(15)一种ALK基因F1174L突变烷基化剂，其含有(9)所述的复合体。
(16)一种PIK3CA基因E545K突变烷基化剂，其含有(10)和(11)中任一项所述的复合体。
(17)一种MYCN基因扩增突变烷基化剂，其含有(12)和(13)中任一项所述的复合体。
(18)一种医药组合物，其含有(1)～(6)及(8)～(13)中任一种所述的复合体。
(19)根据(18)所述的医药组合物，其中，医药组合物为抗癌剂。
(20)一种试剂盒，其含有(1)～(6)及(8)～(13)中任一项所述的复合体。
(21)一种研究试剂试剂盒，其含有(1)～(6)及(8)～(13)中任一项所述的复合体。
(22)一种治疗用试剂盒，其含有(1)～(6)及(8)～(13)中任一项所述的复合体。
(23)一种复合体的制造方法，所述复合体特异性地对癌症驱动基因的基因突变部位进行烷基化，该方法包括：
(1)设计DNA结合化合物使其特异性地结合于癌症驱动基因的基因突变部位的工序，
(2)使设计的DNA结合化合物与烷基化剂结合的工序。
(24)根据(23)所述的制造方法，其中，基因突变部位为基因序列的变化或基因拷贝数的变化。
(25)根据(23)或(24)所述的制造方法，其中，癌症驱动基因为选自RAS、KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH、Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN和MET、以及在癌的基因突变数据库注册的基因中的至少一种。
(26)根据(23)～(25)中任一项所述的制造方法，其中，DNA结合化合物为桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)、Locked Nucleic Acid(锁核酸，LNA)、PNA、DNA结合蛋白复合体、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物或DNA结合蛋白或者其复合体中的任一种。
(27)根据(23)～(26)中任一项所述的复合体的制造方法，其中，烷基化剂是具有对DNA的特定碱基序列有烷基化能力的官能团的化合物。
(28)根据(27)所述的制造方法，其中，烷基化剂为secoCBI。
(29)根据(23)～(28)中任一项所述制造方法得到的复合体在用于制造医药组合物中的用途。
(30)根据(23)～(28)中任一项所述制造方法得到的复合体在用于制造抗癌剂中的用途。
发明的效果
根据本发明可以提供一种用于对癌症驱动基因具有基因突变的癌细胞进行特异性烷基化的复合体。根据本发明的优选方式，本发明的复合体可以用作医药组合物或抗癌剂。根据本发明的另一优选方式，本发明的复合体为对KRAS基因的密码子12突变特异性地进行烷基化的化合物(KR12)。根据本发明的另一优选方式，其是对基因组拷贝数增加的MYCN基因特异性地进行烷基化的化合物(MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3)。另外，作为本发明的另一优选方式，本发明的复合体为以ALK基因的突变(F1174L)为靶点的ALK-FL-1、以PIK3CA基因的突变(E545K)为靶点的P3A-E5K-1、P3A-E5K-2。
根据本发明可知，向烷基化剂中附加与癌症驱动基因的基因突变特异性结合的聚酰胺这样的方法论，对于创制识别肿瘤特异性的各种突变的新型抗癌剂而言是有效的途径之一。具体而言可知，向作为碱基序列特异性结合的有机小分子的PIP附加作为烷基化剂的CBI，可开发与DNA具有较强结合力、且即使少量也能有效地抑制基因表达的抗突变癌症驱动基因治疗药。可以认为这是由于，对于该效果而言，烷基化导致的DNA损伤会诱导细胞死亡信号，通过抑制对该细胞死亡进行抑制的癌基因，能够诱导包括通常不发生细胞死亡的癌细胞在内的细胞死亡。
即，本发明提供一种将烷基化剂传递到特定基因组序列的技术，如果应用该技术，则不仅可以设计/合成对于KRAS癌基因而言能够特异性地识别突变序列的治疗药，而且可以陆续地设计/合成对于具有癌特异性突变的各种癌症驱动基因而言能够特异性地识别突变序列的治疗药。而且，还可以应用与抗体-药物缀合物(ADC：antibody-drug conjugate)技术相同的思想，由于容易合成，因此可以应用于广泛的用途。
作为本发明的复合体的KR12，对于含有低浓度的突变RAS癌症驱动基因的癌细胞显示出特异性强的抗癌活性(从皮摩尔水平抑制细胞增殖)，能够自动合成，对肿瘤的聚集性/积蓄性高，局部分布于核内，具有没有发现体重减轻这样的副作用的优异的效果。因此，本发明的复合体的KR12不仅提供了对临床上成为问题的具有RAS基因突变的癌的治疗药，对于难以开发的以RAS基因突变为靶点的分子靶向治疗药而言，还能够开发新型的划时代的治疗药。今后，期待能推进本发明的复合体KR12面向开始临床试验的开发研究(物性试验、安全性试验、药动学、以GMP标准进行大量合成)。另外，如果应用本发明的方法，则能够开发与KR12起到同样效果的进一步划时代的治疗药。
附图说明
图1是示出KRAS基因的密码子12突变(G12D)的图。
图2是示出MYCN基因与化合物的结合位置的图。
图3是示出与KRAS基因的密码子12突变烷基化PIP(KR12)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图4是示出与KRAS基因的密码子13突变烷基化PIP(KR13)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图5是示出与识别KRAS基因的野生型密码子12的碱基序列的PIP(WT)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图6是示出与从KR12中除去具有烷基化能力的CBI基团而得到的PIP(C12-Dp)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图7是示出KRAS基因密码子12突变的碱基序列的烷基化确认实验的结果的图。
图8是通过WST检测法对KR12、WT、非烷基化C12-DP处理后的LS180细胞进行细胞增殖测定，测定了IC50(50％抑制浓度)而得到的图。
图9是通过WST检测法对KR12处理后的6种细胞进行细胞增殖测定，测定了IC50(50％抑制浓度)而得到的图。
图10是示出KR12处理癌细胞的细胞周期变化的结果、确认细胞死亡的诱导引起的DNA梯型(ladder)的结果、进行细胞损伤、细胞凋亡标志的蛋白分析的结果的图。
图11是对KR12处理癌细胞进行半定量地基因表达(RT-PCR)分析得到的图。
图12是示出KR12处理LS180细胞的RAS活性测定的结果的图。
图13是示出KR12处理HT29细胞的RAS活性测定的结果的图。
图14是示出使用了裸鼠的肿瘤增殖抑制评价实验的结果的图。
图15是示出使用了裸鼠且给药CBI、KR13的比较实验及单次给药肿瘤增殖抑制评价实验的结果的图。
图16是示出KR12在LS180细胞的细胞内局部分布的图。
图17是示出KR12在成球大肠癌细胞(スフェア形成大腸癌細胞)中的细胞内局部分布的图。
图18是观察KR12在荷癌裸鼠中的体内动态的图。
图19是观察KR12在各种脏器中的蓄积的图。
图20是观察KR12在肿瘤、肝脏、肾脏的细胞中的细胞内局部分布的图。
图21是示出ALK基因的F1174L突变与PIP的设计的图。
图22是示出与ALK基因的F1174L突变烷基化PIP(ALK-FL-1)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图23是通过WST检测法对ALK-FL-1处理后的成神经瘤细胞、乳腺癌细胞进行细胞增殖测定，测定了IC50(50％抑制浓度)而得到的图。
图24是示出PIK3CA基因的E545K突变与PIP的设计的图。
图25是示出与PIK3CA基因的E545K突变烷基化PIP(P3A-E5K-1)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图26是示出与PIK3CA基因的E545K突变烷基化PIP(P3A-E5K-2)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图27是通过WST检测法对P3A-E5K-1、P3A-E5K-2处理后的乳腺癌细胞进行细胞增殖测定，测定了IC50(50％抑制浓度)而得到的图。
图28是示出MYCN基因的外显子3与MYCN3的结合部位的图。
图29是示出与MYCN基因的烷基化PIP(MYCNA1)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图30是示出与MYCN基因的烷基化PIP(MYCNA2)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图31是示出与MYCN基因的烷基化PIP(MYCNA3)的合成相关的HPLC和LC-MS的色谱图的图。
图32是示出使用Incucyte培养延时显微镜(time-lapse microscope)对MYCNA1和MYCNA2处理细胞进行细胞观察而制成的细胞生长曲线的图。
图33是示出使用了MYCNA1处理成神经瘤细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定结果的图。
图34是示出使用了MYCNA3处理成神经瘤细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞、正常成纤维细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定结果的图。
具体实施方式
以下，详细地对本发明进行说明。需要说明的是，以参照的方式将本说明书中引用的全部出版物，例如现有技术文献、及公开公报、专利公报等其它专利文献引用到本说明书中。
使用序列识别特异性高的PIP结构能够合成基因序列特异性的烷基化剂是已知的，但是基于该概念是否能够制成药剂而应用于疾病的治疗尚不明确。而且，虽然报告了通过将烷基化剂与PIP复合而得到的化合物能够抑制具有靶点序列的基因的表达，但是实际上以癌症驱动基因的驱动突变为靶点合成药剂是否能够得到肿瘤抑制效果的实际情况尚不明确。本发明人着眼于以下事实：烷基化剂诱导DNA损伤、且由此诱导细胞死亡；以及，在癌中，癌细胞由于具有抑制因DNA损伤而导致的细胞死亡的功能，从而能够处于永生化的状态而持续增殖。可以认为癌症驱动基因与癌细胞的永生化化密切相关，特别是已知KRAS基因的突变会抑制细胞死亡。因此，本发明人如果能够合成在特异性地抑制密码子12突变的同时诱导DNA损伤的药剂，则能够对癌细胞诱导细胞死亡的假说成立。
基于该假说而合成KR12，将具有密码子12的KR12能够识别的突变的癌细胞株与不具有密码子12的KR12能够识别的突变的癌细胞株进行了细胞死亡诱导的比较，结果发现，KR12以极低浓度将具有密码子12的KR12能够识别的突变的癌细胞株诱导至细胞死亡。而且，还可以确认到特异性地抑制了密码子12的KR12能够识别的突变KRAS基因的转录。进而，确认了能够诱导细胞死亡，以及确认了即使对于移植到小鼠中的人大肠癌而言，在具有KR12能够识别的突变的肿瘤中特异性的由给药KR12引起的增殖抑制效果，由此发现了KR12可以抑制靶点癌基因的驱动突变(driven mutation)，且是能够获得抗癌特性的抗癌剂。
进而，对于具有已知作为癌症驱动基因突变的ALK基因的突变(F1174L)和PIK3CA基因的突变(E545K)的癌细胞株而言，分别合成以ALK基因的突变(F1174L)为靶点的ALK-FL-1、以PIK3CA基因的突变(E545K)为靶点的P3A-E5K-1、P3A-E5K-2，对具有对应的突变的癌细胞株进行给药，其结果确认了能够更有效地诱导细胞死亡，抑制增殖。
另外，本发明人认为与KR12同样地，对特定基因组序列进行烷基化的化合物制成以扩增且拷贝数增多的癌基因为靶点的情况下也能发挥效果，在幼儿的成神经细胞瘤等中高频率地进行扩增，合成了以成为预后不良因素的MYCN为靶点的MYCN烷基化PIP(MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3)。MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3抑制了MYCN基因扩增的成神经瘤细胞的增殖。特别是MYCNA3，在MYCN基因扩增多的细胞中更有效地抑制细胞增殖，而在正常细胞、其它癌细胞中效果较低。
由以上结果可知，能够合成序列特异性的基因识别聚酰胺化合物，进而，如果采用合成与能够诱导DNA烷基化的药剂形成复合体结合物的方法，则可以合成以各种癌症驱动基因的驱动突变为靶点的抗癌剂。
癌症驱动基因(必需原癌基因)是指具有基因突变的原癌基因，该基因突变可以认为是在癌细胞中特异性地发生突变(点突变、小缺失、插入或易位、扩增等)并以此为主要原因而癌化的基因突变。需要说明的是，缺失、易位突变包含其中SNP(单核苷酸多态性)在正常细胞中成为异等位基因而在肿瘤中成为单等位基因或同等位基因的突变。本发明的癌症驱动基因包含在癌的基因突变数据库中注册的癌症驱动基因。癌的基因突变数据库为COSMIC([Catalogue of somatic mutations in cancer])等，也包括其它数据库。具有癌症驱动基因的突变可以分为以下两种：(1)基因序列的变化(点突变、染色体易位、缺失和/或插入，另外，缺失、易位突变也包含其中SNP(单核苷酸多态性)在正常细胞中成为异等位基因而在肿瘤中成为单等位基因或同等位基因的突变)，以及(2)基因拷贝数的变化(基因的表达增加)。作为具有上述(1)的突变的癌症驱动基因，可以列举：KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH等，作为具有上述(2)的突变的癌症驱动基因，可以列举：Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN、MET等。
RAS基因是属于癌症驱动基因的原癌基因，编码约21kDa的膜结合p21-ras蛋白质。p21-ras蛋白质是在活性型(RAS-GTP)与非活性型(RAS-GDP)之间循环的低分子量鸟苷酸焦磷酸酶(GTP酶)。p21-ras蛋白质通过鸟苷酸转换因子(GEF)转变成活性型，通过GTP酶活性蛋白质(GAP)转变成非活性型。通过这样的转换机理，RAS基因对MAP激酶通路、PI3激酶通路等与细胞生长和分化相关的信号传导通路的活性进行控制。
RAS基因家族中存在有HRAS、KRAS及NRAS基因这三个成员。RAS基因在动物之间广泛保守。RAS基因家族是原癌基因，突变的RAS基因家族在各种癌中可以观察到，可以确认人癌肿瘤的20～30％中有突变的RAS基因家族。特别是KRAS基因的突变是人癌肿瘤中最常见到的基因突变。KRAS基因的突变在胰腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、头颈癌及子宫内膜癌中被高频地鉴定出来，进而，即使在骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)、甲状腺及结肠的腺瘤等癌前状态中也能被鉴定出来。在统计上，大肠癌的约35～40％、胰腺癌的约90％中确认到了KRAS基因的突变。
作为KRAS基因的突变，已知有密码子12、13、61或146中的一个碱基对置换(错义突变)。频率为密码子12(约80％)、密码子13(约20％)。如果发生在癌中频率高的KRAS基因的突变，则会表达恒定活性化的p21-ras蛋白质。由于该点突变p21-ras蛋白质不会变成非活性型，因此恒定地使下游的信号传导通路活性化。其结果是使细胞受到过量的增殖信号，无法控制生长和分化而转化成癌细胞。
KRAS基因的密码子12突变是指KRAS基因(登记号：NM＿033360.2)中外显子2的密码子12(野生型GGT、氨基酸Gly)的GCT(Ala)、GAT(Asp)、CGT(Arg)、TGT(Cys)、AGT(Ser)或GTT(Val)的一个碱基置换突变。如果KRAS基因的密码子12发生突变，则p21-ras蛋白质的P-环存在点突变，会表达恒定活性型p21-ras蛋白质。图1中示出了从GGT(Gly)向GAT(Asp)的一个碱基置换突变。
MYCN基因是属于癌症驱动基因的原癌基因，在成神经细胞瘤的早期例的4～8％、发展期例的约30％中确认到了MYCN的扩增，已知扩增例的恶性程度较高。已知MYCN的扩增与肿瘤的快速发展和恶性程度密切相关，现在，在成神经细胞瘤的基于风险分类的治疗方案中，是否有MYCN的扩增成为了必需的检查项目。图2中图示了MYCN基因的扩增部分。
迄今为止，虽然开发了以KRAS基因的突变、MYCN基因的扩增为靶点的各种诊断药或治疗药，但现状是仍未开发出有效的抗癌剂。
作为复合体的构成要素的癌症驱动基因的基因突变识别聚酰胺是设计成能够识别癌症驱动基因的突变的聚酰胺。“识别癌症驱动基因的突变”是指癌症驱动基因的突变识别聚酰胺在癌症驱动基因的突变碱基序列和/或其附近结合等(例如，通过氢键或形成交联(crosslinking)而结合等)。作为癌症驱动基因的突变识别化合物，可以列举：吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)(包含环状、发卡结构、发卡结构连接而成的串联型的PIP化合物)、肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)、桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)、锁核酸(LockedNucleic Acid,LNA)、锌指等DNA结合蛋白及其的嵌合蛋白、DNA结合蛋白复合体及指导RNA蛋白复合体这样的复合体等DNA结合化合物。进一步还包括进行了修饰，使其保持或提高了对DNA的结合能力的PIP修饰物。作为PIP修饰物，可以例举例如：在PIP的γ-氨基丁酸的α位或β位附加了胺而得到的修饰物、N-α-N-γ-氨基丁酸、N-β-N-γ-氨基丁酸的具有被取代支链的修饰物、以及用FITC或生物素等分子对上述修饰物进行了修饰而得到的修饰物、用FITC、生物素等分子对PIP的N末端进行了修饰而得到的修饰物、用间苯二甲酸等分子对C末端进行了修饰而得到的修饰物等。吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物。
吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)是包含N-甲基吡咯单元(Py)、N-甲基咪唑单元(Im)和γ-氨基丁酸部分的聚酰胺，Py、Im和γ-氨基丁酸部分相互以酰胺键(-C(＝O)-NH-)连接(Trauger et al,Nature,382,559-61(1996)；White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；以及Dervan,Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001))。PIP的γ-氨基丁酸部分形成接头(γ-接头)，整体折叠而形成U字型的构象(发卡型)。在U字型的构象中，包含Py和Im的双链夹着接头而并列排列。在该双链之间的Py与Im所成的对为特定的组合(Py/Im对、Im/Py对、Py/Py对、或Im/Im对)时，能够以高亲和性结合于DNA中的特定碱基对。例如，Py/Im对能够结合于C-G碱基对，Im/Py对能够结合于G-C碱基对。另外，Py/Py对能够与A-T碱基对和T-A碱基对两者结合(White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；Dervan:Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001))。另外，PIP中还可以含有其它3-羟基吡咯(Hp)、或β丙氨酸。对于Hp而言，Hp/Py对能够结合于T-A碱基对(White at al,Nature,391,468-71(1998))。另外，对于γ-接头而言，可以具有带氨基的N-α-N-γ-氨基丁酸及N-β-N-γ-氨基丁酸这样的支链，而且这些支链也可以用FITC、生物素等分子进行修饰。另外，PIP的N末端不仅是乙酰基，还可以用FITC、生物素等分子进行修饰。对于β丙氨酸/β丙氨酸而言，能够与T-A碱基对或A-T碱基对结合。因此，通过根据靶点DNA序列对Py-Im对的组合等进行变更，可以设计识别靶点基因的调节区域的PIP。PIP的设计方法和制造方法是公知的(例如，专利第3045706号、日本特开2001-136974号及WO03/000683)。
对于PIP而言，由于能够识别基因序列，为了识别例如图1所示的GGT变更为GAT或GTT而形成的KRAS癌症驱动基因的突变G12D和G12V，不使用识别鸟嘌呤、胞嘧啶的咪唑、吡咯对，而使用识别腺嘌呤、胸腺嘧啶的吡咯、β丙氨酸对来对聚酰胺进行设计。而且，通过将吲哚基设置于吡咯基与secoCBI之间来进行合成，在结构分析上，烷基化部位接近腺嘌呤的N3，能够获得良好的角度。另外，考虑到需要对KRAS的转录模板DNA产生烷基化而进行了KR12的设计。如图7所示，KR12是作为识别G12D突变5’-ACGCCATCA-3’和G12V突变5’-ACGCCAACA-3’并对3’的腺嘌呤的N3进行烷基化的化合物而合成的。如上所述，碱基置换形成了各种点突变或者在肿瘤中形成单等位基因或同等位基因，通过利用PIP的碱基识别能力或secoCBI的腺嘌呤的识别能力，可以合成能够识别多态性的化合物，由此可以期待其抗肿瘤效果，所述多态性是指在正常细胞中为异等位基因且在肿瘤中为单等位基因或同等位基因的SNP(单核苷酸多态性)。
使桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)或锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)进行序列识别，使其识别靶点基因的调节区域，能够合成将RNA的2’位氧原子与4’位碳原子之间用亚甲基链连接而成的2’,4’-BNA或者将RNA的2’位氧原子与4’位碳原子之间用亚乙基链连接而成的2’,4’-ENA(Ethylene-Bridged Nucleic Acids)。LNA可以从Proligo公司获得。
烷基化剂实质含有具有使DNA烷基化的官能团的化合物的物质。作为烷基化剂，只要含有对于DNA中存在的特定碱基序列兼具烷基化能力和序列识别能力的化合物即可，没有特别限制。例如，可以使用含有WO2010/001933中记载的官能团的化合物。烷基化剂在DNA的鸟嘌呤N-7位、腺嘌呤N-3位导入烷基，引起形成附加物，引起鸟嘌呤之间、腺嘌呤之间等的交联反应。发生了交联反应的双链DNA、形成了附加物的双链DNA难以通过修复功能进行修复，结果是无法进行DNA的转录和复制，诱导了细胞增殖的停止、由细胞凋亡导致的细胞死亡。DNA结合蛋白包括锌指等结合蛋白、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶、TALENuclease)这样的嵌合蛋白、以及利用指导核酸的CRISPR(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat)这样的复合蛋白。
secoCBI(1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚)是下式3所表示的化合物。secoCBI是使DNA烷基化的公知的化合物之一。secoCBI可以根据公知的文献所记载的方法而合成((a)Boger,D.L.；Yun,W.Y.；Teegarden,B.R.J.Org.Chem.1992,57,2873.(b)Boger,D.L.；McKie,J.A.J.Org.Chem.1995,60,1271.(c)Boger,D.L.；Ishizaki,T.；Kitos,P.A.；Suntornwat,O.J.Org.Chem.1990,55,5823.)。
[化学式7]
本发明的复合体可以通过将上述聚酰胺与上述烷基化剂结合等而合成。合成方法可以使用公知的方法来进行(J.Am.Chem.SOC.1995,117,2479-2490)。“结合”可以直接结合，也可以经由接头结合。作为接头，只要不阻碍烷基化剂的作用，且不阻碍癌症驱动基因的基因突变部位的识别即可，没有特别限定，可以例示出例如：酰胺键、膦酰二硫(phosphodisulfide)键、酯键、配位键、醚键等。
对于本发明的包含复合体的烷基化剂而言，根据使用目的，除了本发明的复合体以外，还可以含有载体、添加物。作为这样的载体和添加物，可以列举：水、乙酸、有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶(xanthan gum)、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、双甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等。本发明的复合体的使用量可以根据使用目的适当调节。
作为本发明的复合体，可以例示如下。
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
本发明的医药组合物为含有上述复合体的组合物。通过将该医药组合物给药于生物体内，能够治疗和预防各种疾病。本发明的医药组合物可以以利用双链DNA进行生物学控制的所有的生物的疾病作为对象，特别是可以以哺乳动物(例如，人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)的疾病作为对象。本发明的医药组合物的对象疾病可以例举：由基因突变而导致的疾病例如癌、神经疾病/精神性疾病、生活习惯病、睡眠障碍、皮肤科、眼科、以及耳鼻科领域的局部症状严重的疾病和传染病、过敏性疾病、与细胞衰老相关的疾病、甲状腺激素抵抗综合征、衰老、囊性纤维化病、以及消化系统疾病等。作为对象疾病中的癌，可以列举例如：脑肿瘤、颈癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、小肠或十二指肠的癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、膀胱癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆囊癌、喉癌、肉瘤(例如，骨肉瘤、软骨肉瘤、卡波西肉瘤、肌肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤等)、白血病(例如，慢性髓细胞性白血病(CML)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)及急性淋巴性白血病(ALL)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)等)、小儿实体瘤(脑肿瘤、成神经细胞瘤、肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)等)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)及黑色素瘤等。作为生活习惯病，没有特别限定，可以列举例如：高血压、糖尿病等。作为皮肤科、眼科、或者耳鼻科领域的局部症状严重的疾病和传染病，可以列举例如：银屑病、慢性皮肤炎、鼻窦炎、青光眼、视网膜色素变性症等。作为过敏性疾病，可以列举：特应性皮炎、花粉病等。作为与细胞衰老相关的疾病，可以列举例如：皮肤的皱纹、松弛、色素沉积等。作为神经疾病/精神性疾病，可以列举例如：躁狂症、抑郁症、精神分裂症、自闭症、双相型障碍、阿尔茨海默病、睡眠障碍、痴呆等。
本发明的医药组合物的优选对象疾病包括源自癌症驱动基因的突变的全部疾病。也包括源自KRAS基因的密码子12突变、MYCN基因的扩增、ALK基因的突变(F1174L)、PIK3CA基因的突变(E545K)的全部疾病。例如：大肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、头颈癌、子宫内膜癌、骨髓增生异常综合征、甲状腺及结肠的腺瘤、成神经细胞瘤等。本发明的医药组合物不作用于正常细胞，而更有效地作用于癌症驱动基因有突变的细胞，通过烷基化而促进形成DNA的交联，诱导由DNA损伤导致的细胞死亡机制，进而抑制癌症驱动基因的表达，阻碍细胞增殖，由此使导致疾病的原因的细胞亡，从而能够进行疾病的治疗和预防。
本发明的医药组合物可以是经口给药和非经口给药的任一种剂型。这些剂型可以按照通常方法进行制剂，可以含有医药上允许的载体、添加物。作为这样的载体和添加物，可以列举：水、乙酸、医药上允许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、允许作为医药添加物的表面活性剂等。
上述添加物可以根据本发明的医药组合物的剂型从上述当中选择单独一种或选择适当组合。作为剂型，在经口给药的情况下，可以制成片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、液体制剂、糖浆剂、喷雾剂、涂布剂、滴眼剂、外用剂等而给药，或者可以通过适当的剂型进行给药。在非经口给药的情况下，可以举出注射剂等。在注射剂的情况下，可以通过例如输液等静脉内注射、皮下注射、腹腔内注射、肿瘤内注射等进行全身或局部性地给药。
例如，在作为注射用制剂使用的情况下，可以使用将本发明的医药组合物溶解于溶剂(例如，生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液、0.1％乙酸等)并向其中加入适当的添加剂(人血清白蛋白、PEG、甘露糖修饰树形分子、环糊精结合体等)而得到的制剂。或者，也可以是用于制成在使用前溶解的剂型而进行了冷冻干燥所得到的制剂。作为冷冻干燥用赋形剂，可以使用例如：甘露醇、葡萄糖等糖醇、糖类。
本发明的医药组合物或本发明的化合物的给药量根据年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同。对于给药量而言，例如在成人(60kg)的情况下为每天0.01～1000mg，优选为0.1～100mg，更优选为1～30mg。给药方法根据患者的年龄、症状而适当选择。例如可以间隔数天给药1次，每天可以1次或者可以分成2～4次。
本发明的医药组合物可以用作抗癌剂。作为对象的癌的种类为例如：大肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、颈部癌、子宫内膜癌、骨髓增生异常综合征、甲状腺及结肠的腺瘤、成神经细胞瘤等，但是并不限定于这些，源自癌症驱动基因的突变的全部的癌、源自KRAS基因的密码子12突变或源自MYCN基因的扩增的全部的癌均为对象。根据与上述医药组合物、烷基化剂相同的使用目的，本发明的抗癌剂还可以含有载体、组合物。
本发明的试剂盒除了包含本发明的化合物以外，还包含医药上允许的载体、添加物、试剂类、助剂、专用容器、其它必需的附件、说明书等。本发明的试剂盒可以作为癌治疗用试剂盒、研究试剂试剂盒使用。
以下，通过实施例进一步具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
1.概要
KRAS基因的密码子12突变多见于目前最难治疗的胰腺癌，此外，也是具有化学疗法抵抗性的转移的大肠癌患者或肺癌患者中能见到的基因突变。目前期望对KRAS基因的密码子12突变有效的治疗药。在本实施例中，通过将特异性地对DNA碱基的小沟侧的腺嘌呤进行烷基化的secoCBI与以KRAS基因的密码子12的突变序列为靶点的发卡型PIP(hPIP)缩合，合成了特异性地识别KRAS基因的密码子12突变的hPIP-secoCBI(KR12)。使用KR12进行了如下实验：(1)KRAS基因密码子12突变的碱基序列的烷基化确认实验、(2)对于大肠癌细胞的50％抑制浓度的测定、(3)细胞增殖及细胞形态的观察、(4)细胞周期变化的分析、(5)半定量基因表达分析、(6)集落测序(colony sequence)、(7)RAS活性测定、(8)移植了癌细胞的裸鼠的肿瘤抑制评价实验、(9)进入癌细胞和成球细胞的确认实验以及避开药物排泄机制的确认实验、(10)向肿瘤细胞核内的富集性的确认实验。
对于具有KRAS基因密码子12突变的大肠癌细胞，KR12在低浓度下就具有足够的肿瘤增殖抑制能力，对于皮下移植了KRAS基因密码子12突变确认为杂合的LS180细胞(源自大肠癌)的裸鼠显示出统计学上显著的肿瘤增殖抑制效果，即使对于KRAS密码子12突变确认为纯合的SW480细胞(源自大肠癌)也显示出由于相同细胞的移植而形成的肿瘤的缩小效果。另一方面，KR12在KRAS基因为野生型的HT29细胞(源自大肠癌)中未显示出抑制效果。从该结果可知，KR12对于具有KRAS基因密码子12突变的癌细胞在体外、体内的条件下显示出肿瘤增殖抑制效果。
由这些结果可知，KR12特异性地对KRAS基因的密码子12突变的碱基序列进行烷基化，选择性地抑制具有密码子12突变的KRAS基因的表达，具有特异性地抑制由KRAS基因的密码子12突变引起的癌细胞的增殖的效果。该结果暗示了在烷基化反应部位附加PIP的方法论对于创制识别肿瘤特异性的各种突变的新型抗癌剂而言是极其有效的途径之一。
2.KRAS基因的密码子12突变烷基化PIP(KR12)的合成
KRAS基因的密码子12突变烷基化PIP(KR12)的化学结构用以下的化学式14表示。本发明的化合物的制作方法如下所述。将具有羧酸末端的PIP溶解于DMF 100μL，加入iPr2NEt(0.5μL、2.86μmol)和PyBOP(1.0mg、1.95μmol)。一边搅拌反应溶液，一边在室温下反应2小时，然后通过HPLC确认是否得到了1-羟基苯并三唑酯的活性体。确认之后向反应容器中加入NH2-吲哚seco-CBI(0.6mg、1.58μmol)，在室温、氮气氛围下搅拌过夜，除去作为溶剂的DMF，用二氯甲烷和乙醚对残渣进行分液。用HPLC对反应物层进行纯化(0.1％TFA/CH3CN、30-75％线性梯度、0～30分钟)，并通过冷冻干燥以白色粉末的形式得到了作为目标化合物的KRAS基因的密码子12突变烷基化PI聚酰胺(KR12)(LC-MSm/e C89H94ClN31O16[M+2H]2+计算值：943.86、实测值944.25、图3)。
另外，使用上述方法还合成了下述化学式15所表示的以KRAS基因的密码子13突变为靶点的烷基化PIP(KR13)(图4)，该烷基化PIP不识别KRAS基因的密码子12和野生型序列。然后，如下述化学式16、17所示，还合成了识别KRAS基因的野生型密码子12的碱基序列的WT(图5)、以及从KR12中去除了具有烷基化能力的CBI基而得到的C12-Dp(图6)。
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
3.KRAS基因密码子12突变基因序列的烷基化确认
(1)质粒DNA的克隆
将含有25μM的两个片段对(5’-GCCTACGCCATCAGCGCTGTTGGCGTAGGCA-3’(序列号1)、3’-ACGGATGCGGTAGTCGCGACAACCGCATCCG-5’(序列号2))的最终容量50μL进行退火，得到了DNA片段。将退火化得到的片段连接于Sigma-Aldrich制造的pGEM-T easy载体。将产物转化入Promega制造的Escherichia·Coli(JM109)感受态细胞(competent cell)，在加入了100μg/mL氨苄西林的LB培养基的平板中于37℃下培养过夜。目标的转化得到的白色菌落通过菌落直接PCR进行鉴定，所述菌落直接PCR使用了含有500nM引物组(T7：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’(序列号3)、sp6：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’(序列号4))和Promega制造的1U GoTaq(R)Green Master Mix的反应溶液10μL。扩增循环如下所述进行。在95℃培养反应溶液2分钟后，重复95℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下30秒钟的反应循环30次，然后以72℃下7分钟的反应循环进行最后的延伸反应。将菌落转移至含有100μg/mL的氨苄西林的LB培养基5mL中，在37℃下培养过夜。用Sigma-Aldrich制造的GenElutePlasmid miniprep kit回收了上述导入了的质粒。
(2)高分辨率-凝胶电泳
用上述制成的质粒和引物(sp6：5’-ATTTAGGTGACACTATAG-3’(序列号5)、T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(序列号6)、5’末端为德克萨斯红标记)合成了用德克萨斯红标记了5’末端的213碱基对的DNA片段。使用Sigma公司制造的PCR-Clean Up Kit对得到的用德克萨斯红标记了5’末端的DNA片段进行纯化，通过UV吸收确定了浓度。将含有各种烷基化PIP的10μL反应溶液(用德克萨斯红标记了5’末端的双链DNA片段10nM和5mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0))在23℃下培养17小时。反应后，用10mg/mL的calfthymus DNA(1μL)除去过量的烷基化PIP，在95℃下加热10分钟，由此引起靶点烷基化部位的DNA的切断。在用减压蒸留除去溶剂之后，加入7μL的上样染料。将该样品在95℃加热25分钟，然后迅速在冰上冷却。将1.2μL的样品载样于安装在Hitachi5500-S DNA Sequencer上的6％的改性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(图7)。
将实验结果示于图7。图7A是使用了SW480细胞(大肠癌)的KRAS突变序列的结果，图7B是使用了AsPC-1细胞(胰腺癌)的KRAS突变序列的结果。KR12特异性地诱导了对SW480细胞(G12V)和AsPC-1细胞(G12D)的KRAS基因的密码子12突变序列的浓度依赖性烷基化。
4.对大肠癌细胞LS180的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定
使用LS180大肠细胞株在96孔微量滴定板的每个孔中接种细胞，使其达到3000～5000个细胞/孔，培养过夜。第二天，以1nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM的浓度向各个细胞添加识别密码子12的突变的KR12、识别野生型KRAS的WT、与未附加烷基化剂的KR12具有相同结构的C12-Dp，并进行48小时的处理。然后，使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)在每个孔中添加WST-8试剂，反应2小时，然后用酶标仪以450nm波长通过比色分析法测定细胞数量。细胞数量的计算方法如下：1)求出仅培养基的平均值，2)各孔减去培养基的平均值，3)求出DMSO的平均值，4)将减去培养基得到的值除以DMSO的平均值×100，5)求出各处理区的平均值和标准差并制成图表。IC50计算式使用了IC50＝10(LOG(A/B)×(50-C)/(D-C)+LOG(B))，A：隔着50％的两点中较高的浓度，B：隔着50％的两点中较低的浓度，C：B的抑制率，D：A的抑制率。
将实验结果示于图8。对于LS180细胞而言，由KR12处理引起的IC50最低，为53nM，而WT的情况为193nM。另外，对于与KR12同样地进行DNA识别的PIP化合物且不具有烷基化剂的C12-Dp而言，没有确认到细胞增殖抑制。
5.对各种癌细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定
使用大肠癌和胰腺癌细胞株在96孔微量滴定板的每个孔中接种细胞，使其达到3000～5000个细胞/孔，培养过夜。第二天，以1nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM的浓度的识别密码子12突变的KR12对各个细胞进行48小时的处理。然后，使用细胞计数试剂盒-8在每个孔中添加WST-8试剂，反应2小时，然后用酶标仪(microplate reader)以450nm波长通过比色分析法测定细胞数量。细胞数量的计算方法如下：1)求出仅培养基的平均值，2)各孔减去培养基的平均值，3)求出DMSO的平均值，4)将减去培养基得到的值除以DMSO的平均值×100，5)求出各处理区的平均值和标准差并制成图表。IC50计算式使用了IC50＝10(LOG(A/B)×(50-C)/(D-C)+LOG(B))，A：隔着50％的两点中较高的浓度，B：隔着50％的两点中较低的浓度，C：B的抑制率，D：A的抑制率。
实验中使用的细胞为SW480、SW620、SNU-C2B、LS180、SW1463、DLD-1、HT29、Caco-2的人癌细胞株(从European Collection of Cell Cultures(ECACC)购入)。
将实验结果示于表1。对KR12的IC50而言，SW480、SW620、SNU-C2B、LS180、HCT116显示出较低的值，SW1463、DLD-1、HT29、Caco-2显示出较高的值。即，对于具有KR12识别的密码子12突变的细胞株而言，IC50显示出100nM以下的较低的值。SW1463、DLD-1、HT-29、Caco-2是不具有KR12识别的密码子12突变的细胞株，它们的IC50显示出100nM以上的值。图9中示出了不具有KR12识别的密码子12突变的HT29、Caco2、SW1463与具有突变的SW480、SW620、LS180的浓度依赖性细胞增殖抑制效果的图表。
[表1]
6-1.细胞周期变化的分析
为了观察细胞周期，用无DNase的PBS对处理过的细胞和未处理的细胞清洗2次，然后用70％乙醇(冷冻)固定。使用含有10g/mL RNaseA、50g/mL碘化丙啶的PBS在暗处将固定后的细胞于室温下放置30分钟进行处理。使用FACS Calibur流式细胞仪(BectonDickinson，USA)的FL-2H滤光器测定了荧光强度。用Cell Quest软件(Becton Dickinson，USA)分析得到的数据从而确定了细胞周期的比率。对于细胞处理而言，用50nM(溶解于0.125％DMSO)的KR12、KR13对LS180进行72小时处理并进行了14天培养实验作为长期处理实验。对照使用含有10％FBS、0.125％DMSO的MEM培养基进行了14天培养。
将实验结果示于图10A。用50nM的KR12处理时，LS180的S期细胞增加，长期给药KR12时，SubG1期细胞显著增加。S期、G2M期表示细胞周期的停止，SubG1期表示细胞死亡。由此可知，随着浓度的增加，KR12使LS180细胞由细胞周期的停止导致细胞死亡。同样地，用不识别密码子12突变的KR13进行处理时(错配)，S期细胞和G2M仅稍有增加，即使长期给药，SubG1期的增加也不明显。
6-2.DNA的片段化导致细胞死亡(细胞凋亡)的确认
细胞处理如下所述，并对如下所述实验进行了探讨：使用MEM(gibco)+10％FBS(gibco)+100单位/ml盘尼西林+100μg/ml链霉素(gibco)培养液以1.0×105细胞/30mm培养皿培养LS180，并用50nM(溶解于0.125％DMSO)的KR12、KR13进行14天培养实验作为长期处理实验；在给药72小时之后，用对照的含有10％FBS、0.125％DMSO的MEM培养基培养11天而得到的组；以及对照的给药10％FBS、0.125％DMSO的14天培养组。将各组细胞进行胰蛋白酶处理，然后回收细胞，在50μl的PBS溶液中搅拌并加入3μl 1.5％TritonX(溶于水)和3μl的RNase(1mg/ml溶于水)，在37℃下处理30分钟，接着加入3μl的proteinase K(1mg/ml)，在37℃下处理30分钟，再加入12μl的6×loading buffer，在65℃下处理10分钟，然后立即用2％琼脂糖凝胶在TBE液、100V的条件下20μl进行电泳，并用乙啡啶染色。
将实验结果示于图10B。对于长期给药而言，在对照处理(泳道1)、KR13处理(泳道3)中未观察到DNA的片段化，但在KR12处理(泳道2)中观察到了由细胞死亡所诱导的DNA片段化。在72小时处理组中，KR12、KR13均未观察到DNA的片段化(泳道4、5)。该结果表明，通过短期给药KR12能够诱导LS180细胞的细胞死亡(细胞凋亡)，但是长期给药和短期给药KR13不会诱导细胞死亡。
6-3.通过蛋白质印迹分析对DNA损伤及其修复、细胞死亡(细胞凋亡)的诱导标志进行研究
将50nM(溶解于0.125％DMSO)KR12、KR13的14天长期给药实验后的LS180细胞溶解于1×SDS-样品缓冲液，在100度下处理5分钟，然后用Bradford试剂(Bio-Rad，CA)确定蛋白量，用10％SDS-PAGE进行电泳，然后转入聚偏氟乙烯膜(Millipore，MA)，以5％奶粉和Tris-缓冲盐(TBS)加上0.1％Tween20作为封闭液，分别加入抗γH2AX(2F3，BioLegend，CA)、抗p53(DO-1，Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗PARP(Cell Signaling Technologies，MA)、或抗肌动蛋白抗体(20-33，Sigma，MO)，进而用HRP-缀合的抗小鼠IgG或抗兔IgG(CellSignaling Technologies，MA)进行处理。在2次抗体处理前适当地进行1次抗体的清洗。然后用TBS加上0.1％Tween20清洗，用ECL化学发光(Amersham Biosciences，NJ)鉴定了蛋白质。
将实验结果示于图10C。通过长期给药KR12，诱导了作为DNA损伤标志的γH2AX，也观察到了p53的诱导，进而确认了由于PARP蛋白被切断而诱导了细胞死亡(细胞凋亡)。但是在对照和KR13处理中，没有确认到明显的DNA损伤、细胞死亡的诱导。确认蛋白量的肌动蛋白的条带一致。该结果表明，通过长期给药KR12，能够在大肠癌细胞株中诱导DNA损伤，进而诱导细胞死亡。
7.利用RT-PCR的半定量基因表达分析
在12孔板中培养HT29、LS180。第二天，用50nM的KR12、KR13对细胞进行处理，然后培养48小时，收集细胞并提取RNA。上述提取使用了Rneasy mini kit(Qiagen，CA)RT-PCR。接着，以提取出的上述RNA为模板按照Super Script VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen，CA)制备逆转录用的cDNA。以上述cDNA为模板的PCR在94℃下5分钟之后，进行94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下30秒钟的20循环，最后在72℃下进行7分钟的延伸反应。PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行了电泳分析。PCR产物量通过用溴化乙啶染色而得到的照片计算。
PCR中使用了下述引物组。
将突变基因和野生型同时扩增的正向引物(正义)和反向引物(反义)及作为内标的RPS18(ribosomal protein S18)基因的正向引物(正义)和反向引物(反义)示于以下。
KRAS基因
正向引物(正义)：
5’-GGAGAGAGGCCTGCTGAA-3’(序列号7)
反向引物(反义)：
5’-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3’(序列号8)
RPS18(内标)
正向引物(正义)：
5’-GAGGATGAGGTGGAACGTGT-3’(序列号9)
反向引物(反义)：
5’-TCTTCAGTCGCTCCAGGTCT-3’(序列号10)
将实验结果示于图11。在HT29(KRAS基因密码子12中无突变的野生型)中，没有观察到KRAS基因的表达由KR12引起的变化(图11A)。另一方面，在LS180(KRAS基因密码子12中有突变)中，KRAS基因的表达被KR12的给药明显地抑制了(图11B)。
8.菌落测序
接种6.5×104个细胞并培养过夜，然后用50nM的KR12、KR13处理细胞，然后培养48小时，收集细胞，提取RNA。上述提取使用了Rneasy mini kit(Qiagen，CA)RT-PCR。接着，以提取出的上述RNA为模板按照Super Script VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen，CA)制备逆转录用的cDNA。以上述cDNA为模板，使用序列号7和序列号8的引物，PCR在94℃下5分钟之后，进行94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下30秒钟的20循环，最后在72℃下进行7分钟的延伸反应。使用pGEM-T Easy vector(Promega，WI)对PCR产物进行了克隆。然后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(Toyobo，Japan)，用含有50μg/mL氨苄西林、1mg X-gal、1mg异丙基-β-硫代半乳糖苷的LB平板在37℃下培养转化体过夜。通过菌落直接PCR鉴定了白色菌落。PCR反应的循环为94℃下5分钟之后进行94℃下30秒钟、55℃下30秒钟、72℃下30秒钟的30循环，最后在72℃下进行7分钟的延伸反应。扩增中使用了下述引物组M13-F1引物和M13-R1引物。对于扩增得到的DNA而言，通过测序仪使用测序用引物KRAS-2R解读了序列，逐个地鉴定了菌落的KRAS基因突变部位。
M13-F1引物：
5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(序列号11)
M13-R1引物：
5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3’(序列号12)
测序用引物KRAS-2R：
5’-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3’(序列号13)
9.菌落PCR
使用特异性地扩增KRAS密码子12的GAT突变基因(KRAS-MUT-F和KRAS-MUT-R)和野生型基因(KRAS-WT-F和KRAS-WT-R)的引物，直接使用上述白色菌落的大肠杆菌细胞进行PCR，根据目标条带由哪种引物组扩增来判断各个菌落是突变KRAS基因还是野生型。
等位基因特异性引物(GAT突变识别)
KRAS-WT-F：
5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTCG-3’(序列号14)
KRAS-WT-R：
5’-TCCAAGAGACAGGTTTCTCCA-3’(序列号15)
KRAS-MUT-F：
5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTCA-3’(序列号16)
KRAS-MUT-R：
5’-CATGTACTGGTCCCTCATTGC-3’(序列号17)
将实验结果示于表2-4。可以认为KR12具有密码子12的突变KRAS基因和未突变的野生型KRAS基因且对杂合型大肠癌细胞株LS180特异性地使密码子12突变基因烷基化，给药上述KR12，48小时后提取RNA，定量地扩增KRAS基因，通过TA克隆试剂盒在质粒中克隆化，导入感受态细胞，通过利用LB/amp/IPTG/X-Gal盘的蓝白筛选挑选具有插入片段的白色菌落，通过直接测序或菌落PCR法对各个菌落研究了有无密码子12的突变。在LS180细胞中，按照菌落测序法，通过给药KR12，DMSO组中等量扩增的突变基因与野生基因的数量为KR12给药组中突变基因的菌落的一半，而KR13组中有所增加(表2)。同样地按照菌落PCR也可以确认，通过给药KR12，突变癌基因的表达减少(表3)。同样地，在杂合型胰腺癌株PANC-1中，如表4所示，在对照组中，突变KRAS基因高表达接近3倍，但通过给药KR12，其表达减少到与野生型基因相同的水平。从该结果可知，在KRAS基因的密码子12中具有杂合突变的细胞株中，KR12显著地抑制了突变基因的表达。
表2
WT MUT
DMSO 19 19
KR12 29 14
KR13 15 22
表3
WT MUT
DMSO 16 11
KR12 27 11
KR13 14 13
表4
WT MUT
DMSO 13 33
KR12 21 24
KR13 8 18
10.RAS活性测定
使用完全营养培养基培养2×106细胞/100mm平板或1×106细胞/100mm平板的细胞数量，第二天，用50nM的KR12、KR13处理细胞，培养48小时，然后将细胞溶解于溶解有镁的缓冲液(MLB)，使用RAS活性测定试剂盒(Millipore，MA)测定了RAS活性水平。
将实验结果示于图12、图13。在HT29(KRAS基因密码子12中无突变的野生型)中，基本上无法检测到活性型的KRAS蛋白质(p21-ras蛋白质)(图13A)。另一方面，在LS180(KRAS基因密码子12中有突变)中，能够检测出活性型的KRAS蛋白质(图12A)。进而，通过KR12，检测出的KRAS蛋白质的活性降低(图12A)，且细胞增殖也被抑制(图12B)。可以认为该结果表明，在LS180中，由于KRAS基因的密码子12突变而使一直为活性型的KRAS蛋白质得到表达，但是通过KR12，抑制了突变基因的表达，活性型的KRAS蛋白质减少，促进了细胞死亡的诱导。
11.移植了HT29、SW480、LS180的裸鼠中的KR12的肿瘤增殖抑制评价实验
将含有细胞的下述3种PBS溶液移植至裸鼠的大腿部皮下(HT29：7只、LS180：7只、SW480：6只)，然后在肿瘤存活且肿瘤体积达到约100mm3的时刻，按照3.4mmol的KR12(将1.36mM的KR12溶解于DMSO2.5μL和PBS197.5μL中)、DMSO/PBS对照(DMSO2.5μL和PBS197.5μL)的各组成制备药剂，经过10分钟声处理(sonication)之后，通过小鼠尾静脉给药200μL。3天测量1次体重、肿瘤的大小，肿瘤的大小按照0.52×L×W×D(1/6×π×L×W×D)的方法来测定。
移植到裸鼠的细胞株的详细情况如下所述。
HT29(KRAS-WT)：(将2×106细胞/100μlPBS移植于皮下，KRAS密码子12野生株中不具有密码子12突变的细胞株)
SW480(KRAS-MUThomo)：(将5×106细胞/100μlPBS移植于皮下，纯合地具有KRAS基因密码子12突变G12V的细胞株)
LS180(KRAS-MUThetero)：(将3×106细胞/100μlPBS移植于皮下，杂合地具有KRAS基因密码子12突变G12D的细胞株)
将实验结果示于图14。其结果为，虽然对于不具有密码子12突变的HT29细胞，无法通过给药KR12来抑制肿瘤的增殖(图14A)，但在移植了纯合地具有密码子12突变的SW480细胞的裸鼠中，由于给药KR12而使肿瘤的大小显著缩小(图14C)。移植了杂合地具有KR12的突变型等位基因和野生型的LS180细胞的裸鼠中也观察到了由于给药KR12而明显地抑制了肿瘤的增殖(图14B)。在向移植了SW480细胞的裸鼠中给药DMSO/PBS对照的情况下，肿瘤的大小不断增大，相比之下，如果给药KR12，则在2个月后肿瘤的大小明显缩小，3个月后肿瘤变得极小，形成较硬的硬结(图14A-C，剖检时(3个月或肿瘤的直径为2cm以上时)的照片)。
使用不识别密码子12突变的PIP-吲哚-seco-CBI(KR13)和8.4mmol的secoCBI(将3.36mM的CBI溶解于DMSO 2.5μL和PBS 197.5μL)代替DMSO/PBS作为对照，用与上述11相同的方法进行实验，将结果示于图15。在移植了SW480细胞的裸鼠中，KR12显示出了比给药KR13的情况明显更高的癌肿瘤抑制效果。而且，在seco-CBI的情况中确认到的体重减少倾向没有在KR12和KR13的情况中得到确认。即，得到了如下结果：对于KR12而言，确认了其具有不识别G12D突变序列的KR13所不显示出的肿瘤增殖抑制效果，且不会引起体重减少、健康状态异常这样的副作用。另外，给药了KR12的裸鼠也没有观察到毛发倒竖、摄食量降低、运动量减少、异常行为等。
12.细胞局部分布分析
在C12DP的N末端导入β丙氨酸，接着进行了FITC的偶联。FITC的偶联通过以下方式进行：将4倍过量的荧光素(0.40mmol)和DIEA、HCTU溶解于DMF得到溶液，使得到的溶液通过柱子，然后振动60分钟。LS180细胞用MEM(gibco)+10％FBS(gibco)+100单位/ml盘尼西林+100g/ml链霉素(gibco)培养液进行培养，在约50％融合的状态下添加FITC标记的KR12(1μMol)，在2小时后进行封片(VECTOR VECTASHIELD)，进行利用DAPI的核染色，使用共聚焦显微镜(Leica TCS-SPE)进行观察。
将实验结果示于图16。将FITC标记的KR12(1μMol)投入LS180细胞的培养培养基内之后2小时确认时，观察到了荧光富集于LS180细胞的核内，KR12转移至大肠癌培养细胞的核内，确认了局部分布。
13.对癌干细胞靶向性试验
使用2种大肠癌细胞株SW480细胞和LoVo细胞进行了实验。分别将2×105个每种类型的细胞在成球培养基(SFM，在DMEM/Ham’s F-12培养液中添加了B27(Miltenyi公司、2％)、EGF(20ng/mL)、FGF2(20ng/mL)而得到的培养液)中进行培养，在第4天添加FITC标记的KR12(1μMol)或Doxisorbicin(1μMol)，在一个小时后用PBS清洗2次，再次开始用SFM进行培养，在0小时、4小时、24小时进行封片(Invitrogen：ProLong(R)Gold Antifade Reagent(With DAPI))，用共聚焦显微镜(Leica TCS-SPE)进行了观察。
将实验结果示于图17。将FITC标记的KR12(1μMol)给药于作为癌干细胞模型的成球的大肠癌，其结果是在球内细胞的核内观察到了荧光。而且，荧光在24小时后仍能持续观察到。已知阿霉素(doxorubicin)这样的低分子化合物会从包含活化的ABC运载体的成球大肠癌细胞中迅速地排泄。相比之下，KR12所显示的结果为长时间不排泄且在细胞的核内滞留。该结果说明，KR12到达了癌干细胞的核内，因此不容易受到耐药性机理所引起的药剂排泄机制的影响，对癌干细胞治疗也可能有效。KR12转移至核内可以认为是由于容易从PIP结构上的脂溶性部分被摄入到细胞内，从细胞质快速地转移至核内，且具有与DNA结合的性质。因此，对于本发明中使用的复合体而言，由于PIP的功能，显示出不必特别需要作为药剂传递技术的DDS的性质，证明了PIP自身可以成为将各种小分子化合物传递到特定基因组的DDS。
14.肿瘤蓄积性试验
对4周龄购入的雌性BALB/c(nu/nu)小鼠，在5周龄时皮下移植5×106的SW480细胞，然后在肿瘤直径达到15mm时通过尾静脉给药FITC标记的KR12(将10nmol溶解于1.25％DMSO(200μl))或FITC(将1mg/kg溶解于1.25％DMSO(200μl))、1.25％DMSO 200μl，用活体成像系统(NIPPON ROPER：Lumazone FA)从0小时起每隔2小时进行拍摄，直至10小时，在1天后、3天后也拍摄了荧光水平和小鼠个体(图18)。进而，在24小时后将进行了相同处理的小鼠解剖，取出各个脏器和肿瘤，用活体成像系统(NIPPON ROPER：Lumazone FA)进行拍摄(图19)。另外，通过尾静脉向相同的皮下移植了人大肠癌的小鼠给药1mg/kg的FITC标记的KR12(溶解于1.25％DMSO(200μl))、1.25％DMSO 200μl，在24小时后取出肿瘤，放入OCT包埋剂中冷冻，用LEICA CM1510S制成10微米的冷冻切片，用共聚焦显微镜(Leica TCS-SPE)进行观察(图20)。
将实验结果示于图18～图20。向移植了SW480细胞的裸鼠在静脉内给药以FITC进行了荧光标记的KR12(10nMol)，然后通过荧光成像经时地进行观察，其结果显示出肿瘤富集性，所述肿瘤富集性是指在KR12分布于全身之后，富集残留于肿瘤，通过肝脏、肾脏缓慢排出(图18)。进而确认了，在静脉注射后从全身经时地蓄积至肿瘤，即使在给药起3天后仍能在肿瘤中确认到荧光。然后，在给药后24小时解剖小鼠，观察了摄入各脏器中的FITC，结果在肿瘤中确认到了最强的荧光，在其它脏器(心脏、胃、胰脏、脾脏、肺、脑)中没有观察到荧光或者荧光很弱，基本上全部被排泄了(图19)。另外，用荧光显微镜确认了肿瘤、肝脏、肾脏的各细胞中的KR12的局部分布，其结果是在核内确认到了荧光(图20)。对小鼠尿中、胆汁中是否有KR12及其分解产物进行了质量分析，其结果是KR12以未代谢分解的状态被排泄出来。在肿瘤细胞中，随着细胞分裂，在细胞膜等的合成中需要脂质，通常脂质的摄入会增加且经由淋巴管进行的排泄不发达。由此可以认为，KR12的特异性肿瘤蓄积性是由于KR12所具有的PIP的脂溶性部分促进了KR12进入癌细胞内，而阻碍了KR12从肿瘤内排出。虽然在正常细胞中也确认了KR12对肝脏、肾脏的富集性，但由于不会滞留于细胞内，因此排泄于胆汁中/尿中，可以从这些脏器中排泄出来。即，KR12具有从正常细胞中快速排泄，且在癌细胞中长期滞留的优异的效果。
实施例2
1.概要
ALK基因形成导致肺癌的融合基因，在成神经细胞瘤中是具有恒定活性化的点突变，促进癌化的癌症驱动基因的基因。已知ALK抑制剂对于具有ALK基因突变的癌细胞有效，但在多数情况下，癌细胞对ALK抑制剂产生耐性，多会复发。在成神经瘤细胞SK-N-SH、SMS-SAN、KELLY、LAN-1中确认了成神经细胞瘤中的ALK基因突变F1174L(3522C＞A)。因此，用与KR12的合成相同的方法合成了特异性地识别上述突变序列的10碱基识别PIP-吲哚-secoCBI化合物ALK-FL-1(图21)。
2.ALK基因的烷基化PIP(ALK-FL-1)的合成
ALK基因的烷基化PIP(ALK-FL-1)的化学结构用以下的化学式表示(图22)。本发明的化合物的制备方法如下所述。通过在识别F1174L(3522C＞A)突变的10个碱基的PIP-吲哚-secoCBI中设置不能识别野生型的5’-TGGTGGTTGA-3’序列的3’侧起第2个鸟嘌呤的吡咯，从而设计了识别突变型5’-TGGTGGTTTA-3’的化合物。
[化学式18]
3.对成神经瘤细胞、乳腺癌细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定
与使用KR12的情况同样地进行了实验。实验中使用的细胞为Kelly细胞、SK-N-SH细胞、IMR-32细胞、SK-N-AS细胞、MDA-MB-231细胞，分别用DMEM、10％FBS、1％Pen/St培养基、RPMI1640、10％FBS、1％Pen/St培养基进行培养。在96孔板中接种各种细胞1000细胞/50μl/孔，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时，然后将试剂(终浓度1、3、10、30、100nM)稀释于培养基后，添加50μl/孔，进行混和。再在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72小时。添加细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)10μl/孔并混和，然后在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养2小时。用Microplate Reader MTP-310Lab(COLONA ELECTORIC)测定吸光度，然后计算出IC50值。
将实验结果示于图23、表5。给药ALK-FL-1时，在具有F1174L突变的成神经瘤细胞中显示出较高的细胞增殖抑制效果(图23A)。具体而言，在Kelly细胞株中IC50为0.09nM、SK-N-SH细胞株中IC50为0.13nM，相比之下，作为野生型的成神经细胞瘤的IMR-32细胞株中IC50为0.46nM、SK-N-AS细胞株中IC50为2.6nM、没有F1174L突变的乳腺癌细胞(ALK基因野生型)的MDA-MB-231细胞株中IC50为7.5nM(图23A-D、表5)。以上的结果表明，ALK-FL-1对具有F1174L突变的成神经瘤细胞株特异性地显示出较强的增殖抑制。
表5
ALK-FL-1 IMR-32 SK-N-AS Kelly SK-N-SH MDA-MB-231
IC50 0.46 2.6 0.09 0.13 7.5
浓度(nM)
实施例3
1.概要
对于PIK3CA基因而言，突变集中于位于外显子10的螺旋结构域的E545K、E542K和位于外显子21的激酶结构域的H1047R的3处热点，已经报告了这些突变在乳腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、肝癌及脑成胶质细胞瘤中高频发生。另一方面，不伴随点突变的PIK3CA基因的扩增在颈癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌中得到了确认。PIK3CA基因通过PI3激酶-Akt通路作为癌驱动基因而发挥作用，因此虽然开发了以PIK3CA基因为靶点的PI3K抑制剂，但是现状是由于毒性的问题等而尚未达到临床应用。PIK3CA基因的E545K(1633G＞A)突变在乳腺癌细胞株MCF7中得到了确认。因此，用与KR12的合成相同的方法合成了特异性识别上述突变序列的9碱基识别PIP-吲哚-secoCBI化合物P3A-E5K-1和P3A-E5K-2(图24)。
2.PIK3CA基因的烷基化PIP(P3A-E5K-1)的合成
PIK3CA基因的烷基化PIP(P3A-E5K-1)的化学结构用以下的化学式表示。本发明的化合物的制备方法如下所述(图25、26)。为了识别E545K(1633G＞A)突变，设计了识别5’-CTCCTGCTTA-3’的PIP-吲哚-seco-CBI。该化合物不能识别野生型的5’-CTCCTGCTCA-3’从3’起第2个胞嘧啶，经过设计，使其不能烷基化3’的腺嘌呤，但在突变序列中能够进行烷基化。
[化学式19]
[化学式20]
3.对乳腺癌细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定
与使用KR12的情况同样地进行了实验。实验中使用的细胞为MCF7细胞、MDA-MB-231细胞，分别用DMEM、10％FBS、1％Pen/St培养基和RPMI1640、10％FBS、1％Pen/St培养基进行培养。在96孔板中接种各种细胞1000细胞/50μl/孔，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时，然后将试剂(终浓度1、3、10、30、100nM)稀释于培养基后，添加50μl/孔，进行混和。再在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72小时。添加细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)10μl/孔并混和，然后在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养2小时。用Microplate Reader MTP-310 Lab(COLONA ELECTORIC)测定吸光度，然后计算出IC50值。
将实验结果示于图27。对于PIK3CA基因具有E545K(1633G＞A)突变的乳腺癌细胞株MCF7，P3A-E5K-1的IC50为53.8nM、P3A-E5K-2为＞100nM(图27A)。对于PIK3CA基因为野生型的乳腺癌细胞株MDA-MB-231，P3A-E5K-1的IC50为＞100nM(图27B)。由上述结果可知，对于PIK3CA基因的E545K突变癌细胞株，制成的P3A-E5K-1在E545K突变乳腺癌细胞株中的肿瘤增殖抑制效果明显强于没有突变的乳腺癌细胞株。
实施例4
1.概要
作为癌细胞特异性突变，还有不是点突变、易位的、不伴随基因序列变化的基因扩增。这被称为拷贝数变化，通过特定的癌相关基因的区域扩增，在结果上增加了癌基因的表达量，从而促进癌化。本发明人等认为，如本发明一样对特定基因组序列进行烷基化的化合物在以扩增而拷贝数增多的基因为靶点的情况下也能发挥效果，合成了以MYCN为靶点的MYCN烷基化PIP(MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3)，所述MYCN在小儿的成神经细胞瘤等中高频扩增，成为预后不良因素。MYCN基因是在成神经细胞瘤中高频扩增的基因，可以认为是成神经细胞瘤的癌症驱动基因。对于该MYCN基因，用与KR12的合成相同的方法合成了如图2所示识别8个碱基的PIP-吲哚-secoCBI化合物(MYCNA1、MYCNA2)及特异性地识别外显子3的序列的9碱基识别PIP-吲哚-secoCBI化合物(MYCNA3)(图28)。
2.MYCN基因的烷基化PIP(MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3)的合成
MYCN基因的烷基化PIP(MYCNA1、MYCNA2、MYCNA3)的化学结构用以下的化学式表示。本发明的化合物的制备方法如下所述。将具有羧酸末端的PIP溶解于DMF 100μL，加入iPr2NEt(0.5μL、2.86μmol)和PyBOP(1.0mg、1.95μmol)。一边搅拌反应溶液，一边在室温下反应2小时，然后用HPLC确认是否得到了1-羟基苯并三唑酯的活性体。确认后将NH2-吲哚seco-CBI(0.6mg、1.58μmol)加入反应容器，在室温、氮气氛围下搅拌过夜，除去作为溶媒的DMF，用二氯甲烷和乙醚对残渣进行分液。用HPLC对反应物层进行纯化(0.1％TFA/CH3CN、30-75％线性梯度、0～30分钟)，通过冷冻干燥以白色粉末的形式得到了作为目标化合物的烷基化PI聚酰胺、MYCNA1(图29)。用相同的方法也得到了MYCNA2、MYCNA3(图30、31)。图2示出了以MYCN为靶点的PIP的设计方法。
[化学式21]
[化学式22]
[化学式23]
3.利用Incucyte培养延时显微镜(time-lapse microscopy)的细胞增殖及细胞形态的确认
在96孔板中接种细胞1000细胞/50μl/孔，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时，第二天更换为添加了DMSO对照、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM的MYCNA1的培养液，用Incucyte培养延时显微镜(Essen Instruments、Ann Arbor、MI)每隔6小时对细胞进行观察。生长曲线由使用了Incucyte system(Essen Instruments、Ann Arbor、MI)的成像板绘制。实验中使用的细胞为能观察到MYCN区域的扩增的成神经瘤细胞株IMR-32细胞(MYCN25拷贝)、TGW细胞(MYCN60拷贝)，分别使用DMEM、10％FBS、1％Pen/St培养基、RPMI1640、10％FBS、1％Pen/St培养基进行培养。
将生长曲线的结果示于图32。对于MYCN基因高表达的IMR-32细胞、TGW细胞而言，通过MYCNA1，浓度依赖性地抑制了细胞增殖(图32)。
4.对成神经瘤细胞的细胞毒性试验和50％抑制浓度(IC50)的测定
与使用KR12的情况同样地进行了实验。实验中使用的细胞为IMR-32细胞、TGW细胞，分别用DMEM、10％FBS、1％Pen/St培养基、RPMI1640、10％FBS、1％Pen/St培养基进行培养。在96孔板中接种各种细胞1000细胞/50μl/孔，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时，然后将试剂(终浓度1、3、10、30、100nM)稀释于培养基后，添加50μl/孔，进行混和。再在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72小时。添加细胞计数试剂盒-8(DOJINDO)10μl/孔并混和，然后在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养2小时。用Microplate Reader MTP-310Lab(COLONA ELECTORIC)测定吸光度，然后计算出IC50值。
将实验结果示于图33。MYCNA1对IMR-32细胞的IC50为9.7nM，对TGW细胞为12.9nM。MYCNA2对IMR-32细胞的IC50为12.1nM，对TGW细胞为11.2nM。即，可以认为MYCNA1和MYCNA2能够在低浓度下诱导MYCN基因高表达的癌细胞的增殖抑制。
图34是使用MYCNA3对IMR-32细胞(有MYCN扩增、成神经瘤细胞)、TGW细胞(有MYCN扩增、成神经瘤细胞)、NB69细胞(无MYCN扩增、成神经瘤细胞)、MCF7细胞(乳腺癌细胞)、HT29细胞(大肠癌细胞)、HDF细胞(角膜上皮皮肤成纤维细胞)的50％抑制浓度(IC50)进行测定的结果和用Incucyte培养延时显微镜(Essen Instruments、Ann Arbor、MI)对细胞增殖进行观察的结果(MYCNA3处理72小时后)。表6是在0.3-300nM、72小时处理条件下进行的细胞增殖测定试验的结果。由这些结果可知，IMR-32细胞中的IC50为1.1nM、TGW细胞中为3.7nM、MB69细胞中为77.0nM、MCF7细胞中为152.2nM、HT29细胞中为239.6nM、HDF细胞中为56.6nM，并且在成神经瘤细胞、特别是伴有MYCN扩增的成神经瘤细胞中观察到了增殖抑制。由该结果可知，MYCNA3的细胞增殖抑制效果在伴有MYCN扩增的成神经瘤细胞中特别好，而在其它癌、未观察到MYCN扩增的成神经细胞瘤、源自正常组织的细胞株中效果较差(图34、表6)。
表6
细胞 IC50(nM)
IMR32 1.1
TGW 3.7
MB69 77.0
MCF7 152.2
HT29 239.6
HDF 56.6
序列号1：合成DNA、
序列号2：合成DNA、
序列号3：合成DNA、
序列号4：合成DNA、
序列号5：合成DNA、
序列号6：合成DNA、
序列号7：合成DNA、
序列号8：合成DNA、
序列号9：合成DNA、
序列号10：合成DNA、
序列号11：合成DNA、
序列号12：合成DNA、
序列号13：合成DNA、
序列号14：合成DNA、
序列号15：合成DNA、
序列号16：合成DNA、
序列号17：合成DNA。

Claims (30)

1.一种复合体，其是特异性结合于癌症驱动基因的基因突变部位的DNA结合化合物与烷基化剂的复合体。
2.根据权利要求1所述的复合体，其中，基因突变部位为基因序列的变化和/或基因拷贝数的变化。
3.根据权利要求1或2所述的复合体，其中，癌症驱动基因为选自下述中的至少一种：KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH、Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN和MET、以及在癌的基因突变数据库中注册的基因。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的复合体，其中，DNA结合化合物为桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)、锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)、PNA、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白及DNA结合蛋白复合体中的任一种。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的复合体，其中，烷基化剂是具有对DNA的特定碱基序列有烷基化能力的官能团的化合物。
6.根据权利要求5所述的复合体，其中，烷基化剂为secoCBI。
7.一种癌症驱动基因突变特异性烷基化剂，其含有权利要求1～6中任一项所述的复合体。
8.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
9.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
10.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
11.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
12.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
13.根据权利要求1所述的复合体，其以下式表示，
14.一种KRAS基因密码子12突变烷基化剂，其含有权利要求8所述的复合体。
15.一种ALK基因F1174L突变烷基化剂，其含有权利要求9所述的复合体。
16.一种PIK3CA基因E545K突变烷基化剂，其含有权利要求10或11所述的复合体。
17.一种MYCN基因扩增突变烷基化剂，其含有权利要求12或13所述的复合体。
18.一种医药组合物，其含有权利要求1～6及8～13中任一项所述的复合体。
19.根据权利要求18所述的医药组合物，其中，医药组合物为抗癌剂。
20.一种试剂盒，其含有权利要求1～6及8～13中任一项所述的复合体。
21.一种研究试剂试剂盒，其含有权利要求1～6及8～13中任一项所述的复合体。
22.一种治疗用试剂盒，其含有权利要求1～6及8～13中任一项所述的复合体。
23.一种复合体的制造方法，所述复合体特异性地对癌症驱动基因的基因突变部位进行烷基化，该方法包括：
(1)设计DNA结合化合物使其特异性地结合于癌症驱动基因的基因突变部位的工序；
(2)使设计的所述DNA结合化合物与烷基化剂结合的工序。
24.根据权利要求23所述的制造方法，其中，基因突变部位为基因序列的变化或基因拷贝数的变化。
25.根据权利要求23或24所述的制造方法，其中，癌症驱动基因为选自下述中的至少一种：RAS、KRAS、HRAS、NRAS、BCR-ABL、EGFR、c-KIT、BRAF、PI3K、ALK、PIK3CA、FLT3、MET、BCL2、EML4-ALK、APC、BRCA1/2、TP53、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、RB1、PTEN、VHL、P16、MEN1、RET、CDH1、STK11、PTCH、Her2/neu、EGFR、MYC、MYCN和MET、以及在癌的基因突变数据库注册的基因。
26.根据权利要求23～25中任一项所述的制造方法，其中，DNA结合化合物为桥接核酸(Bridged Nucleic Acid)、锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)、PNA、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)、吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)修饰物、DNA结合蛋白及DNA结合蛋白复合体中的任一种。
27.根据权利要求23～26中任一项所述的复合体的制造方法，其中，烷基化剂是具有对DNA的特定碱基序列有烷基化能力的官能团的化合物。
28.根据权利要求27所述的制造方法，其中，烷基化剂为secoCBI。
29.通过权利要求23～28中任一项所述的制造方法所得到的复合体在制造医药组合物中的用途。
30.通过权利要求23～28中任一项所述的制造方法所得到的复合体在制造抗癌剂中的用途。
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