WO2015053413A1 - ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を標的にアルキル化する新規アルキル化剤 - Google Patents

ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を標的にアルキル化する新規アルキル化剤 Download PDF

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WO2015053413A1
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cells
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dna
cancer
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PCT/JP2014/077766
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浩喜 永瀬
弘 杉山
俊和 板東
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千葉県
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
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    • C08G73/0616—Polycondensates containing five-membered rings, not condensed with other rings, with nitrogen atoms as the only ring hetero atoms with only two nitrogen atoms in the ring

Definitions

  • the present invention relates to a novel alkylating agent that alkylates a gene mutation site of a driver oncogene as a target.
  • driver oncogene essential proto-oncogenes
  • Driver oncogene is a proto-oncogene that has mutations specifically in cancer cells (point mutations, small deletions, insertions or translocations, amplifications, etc.), and has gene mutations that are thought to cause cancer. It is a gene. Therefore, it has been demonstrated that targeting a driver oncogene and developing a drug that suppresses its function is an extremely effective method for developing a specific drug for cancer patients. Examples include Iressa, which shows dramatic efficacy in lung cancer patients with mutant EGFR, trastuzumab effective in breast cancer patients derived from high expression of HER2, and imatinib, an activity inhibitor of fusion protein BCR-ABL.
  • the gene mutation of the driver oncogene is (1) gene sequence change (point mutation, chromosomal translocation, deletion or / and insertion).
  • (Polymorphism) includes tumors that are monoallelic or homoallelic in tumors) and (2) changes in gene copy number (increased gene expression).
  • driver oncogene having the mutation of (1) RAS, KRAS, HRAS, NRAS, BCR-ABL, EGFR, c-KIT, BRAF, PI3K, ALK, PIK3CA, FLT3, MET, BCL2, EML4-ALK, APC, BRCA1 / 2, TP53, MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, RB1, PTEN, VHL, P16, MEN1, RET, CDH1, STK11, PTCH, Her2 / neu, EGFR, MYC , MYCN, MET, etc. are known.
  • Other driver oncogenes are registered in the oncogene mutation database (COSMIC [Catalogue of somatic mutations in cancer]) and the like.
  • Pyrrole / imidazole polyamide is an artificial small molecule developed with the antibiotic destamycin as a motif, and has been reported to bind to the minor groove of double-stranded DNA in a sequence-specific manner. Many studies on gene expression suppression have been reported. In addition, research on drugs for renal disorders, anticancer agents, corneal trauma, hypertrophic scars, bone diseases, etc. are being conducted through animal experiments using mice. In recent years, as part of iPS cell research, research on iPS cell induction by PIP has also been conducted in research on iCeMs, an iPS cell project at Kyoto University. It is a small organic molecule.
  • PIP PIP-like protein
  • the characteristics of PIP are (1) It is possible to design an arbitrary gene sequence as a target, (2) The binding ability to DNA is stronger than a transcription factor, (3) The cell without a vector or drug delivery system (DDS) Incorporated into the nucleus, (4) Not degraded by nucleolytic enzymes, stable in cells and in vivo, and excreted as undegraded product from urine bile, (5) Easy modification of N and C terminus It is possible to form a complex with various functional small molecules.
  • DDS drug delivery system
  • PIP recognizes Py / Im pairs as CG, Py / Py pairs as AT or TA, and Im / Py pairs as GCs, which can bind sequence-specifically to various arbitrary double-stranded DNAs. is there. PIP bound to a target gene has been studied as a gene switch that inhibits binding of transcription factors to DNA and suppresses specific gene expression.
  • the present inventor synthesized a complex of an alkylated functional group and PIP using a PIP structure with high sequence recognition specificity, and alkylated a specific base sequence of DNA (Patent Document 2), histone
  • Patent Document 2 The present inventors have succeeded in synthesizing a complex of a modification control agent and PIP and completing the invention relating to the target gene-specific histone modification control agent (Patent Document 1).
  • PIP target gene-specific histone modification control agent
  • drugs can be synthesized by targeting driver mutations (genetic mutations that cause cancer) of driver oncogene, and actually have a tumor-suppressing effect. Not.
  • an object of the present invention is to provide a novel alkylating agent that alkylates a gene mutation site of a driver oncogene as a target.
  • the present inventor designed pyrrole-imidazole polyamide (PIP) that specifically binds to a gene mutation site of a driver oncogene, and binds an alkyl reaction site to the designed PIP. And synthesized a novel compound that specifically recognizes and binds to the gene mutation site of the driver oncogene and alkylates it, and the new compound is also efficiently applied to tumor cells and tumor stem cells. The delivery was confirmed and the present invention was completed.
  • PIP pyrrole-imidazole polyamide
  • the present invention is as follows. (1) A complex of a DNA binding compound that specifically binds to a gene mutation site of a driver oncogene and an alkylating agent. (2) The complex according to (1), wherein the gene mutation site is a change in gene sequence and / or a change in gene copy number.
  • Driver Oncogene is KRAS, HRAS, NRAS, BCR-ABL, EGFR, c-KIT, BRAF, PI3K, ALK, PIK3CA, FLT3, MET, BCL2, EML4-ALK, APC, BRCA1 / 2, TP53, MSH2 , MLH1, MSH6, PMS2, RB1, PTEN, VHL, P16, MEN1, RET, CDH1, STK11, PTCH, Her2 / neu, EGFR, MYC, MYCN, and MET, and genes registered in the cancer gene mutation database
  • the complex according to any one of (1) and (2), which is at least one selected from the group consisting of: (4) DNA binding compound is Bridged Nucleic Acid (crosslinked nucleic acid), Locked Nucleic Acid (LNA), PNA, DNA binding protein complex, pyrrole / imidazole polyamide (PIP)), modified pyrrole / imidazole polyamide (PIP) or
  • a KRAS gene codon 12 mutant alkylating agent comprising the complex according to (8).
  • An ALK gene F1174L mutant alkylating agent comprising the complex according to (9).
  • a PIK3CA gene E545K mutant alkylating agent comprising the complex according to any one of (10) and (11).
  • a MYCN gene amplified mutant alkylating agent comprising the complex according to any one of (12) and (13).
  • a pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of (1) to (6) and (8) to (13).
  • a kit comprising the complex according to any one of (1) to (6) and (8) to (13).
  • a research reagent kit comprising the complex according to any one of (1) to (6) and (8) to (13).
  • a therapeutic kit comprising the complex according to any one of (1) to (6) and (8) to (13).
  • (23) (1) Designing a DNA binding compound so as to specifically bind to a gene mutation site of a driver oncogene, (2) including a step of binding the designed DNA-binding compound and an alkylating agent; A method for producing a complex in which a gene mutation site of a driver oncogene is specifically alkylated.
  • Driver oncogene is RAS, KRAS, HRAS, NRAS, BCR-ABL, EGFR, c-KIT, BRAF, PI3K, ALK, PIK3CA, FLT3, MET, BCL2, EML4-ALK, APC, BRCA1 / 2, TP53 , MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, RB1, PTEN, VHL, P16, MEN1, RET, CDH1, STK11, PTCH, Her2 / neu, EGFR, MYC, MYCN and MET, and genes registered in the cancer gene mutation database
  • the DNA-binding compound is Bridged Nucleic Acid (cross-linked nucleic acid), Locked Nucleic Acid (LNA), PNA, DNA-binding protein complex, pyrrole / imidazole polyamide (PIP)), pyrrole / imidazole
  • the present invention provides a complex for specifically alkylating cancer cells having a driver oncogene gene mutation.
  • the complex of the present invention can be used as a pharmaceutical composition or an anticancer agent.
  • the complex of the present invention is a compound (KR12) that specifically alkylates the codon 12 mutation of the KRAS gene.
  • the compound (MYCNA1, MYCNA2, MYCNA3) specifically alkylates the MYCN gene having an increased genome copy number.
  • the complex of the present invention is ALK-FL-1, which targets the ALK gene mutation (F1174L), and P3A-E5K-, which targets the PIK3CA gene mutation (E545K). 1, P3A-E5K-2.
  • the methodology of adding a polyamide that specifically binds a driver oncogene gene mutation to an alkylating agent is one of the most effective approaches for creating new anticancer agents that recognize various tumor-specific mutations. It became clear that there was. Specifically, CBI, which is an alkylating agent, is added to PIP, which is an organic small molecule that specifically binds to a base sequence, and has a strong binding force to DNA and effectively suppresses gene expression even in small amounts. It became clear to develop a therapeutic drug for mutation driver oncogene. This effect is thought to be due to the fact that DNA damage caused by alkylation induces cell death signals and suppresses oncogenes that suppress them, thereby inducing cell death including cancer cells that do not normally cause cell death. .
  • the present invention provides a technique for delivering an alkylating agent to a specific genomic sequence.
  • this technique is applied, not only the KRAS oncogene but also various driver oncogenes having cancer-specific mutations are provided.
  • it is possible to design and synthesize therapeutic agents that can specifically recognize mutant sequences one after another.
  • the same idea as the antibody-drug complex (ADC) technology can be applied, and since it is easy to synthesize, it can be applied to a wide range of applications.
  • ADC antibody-drug complex
  • KR12 which is a complex of the present invention, exhibits strong anticancer activity specifically against cancer cells having a mutated RAS driver oncogene at a low concentration (resulting in cell growth suppression from picomolar), and can be automatically synthesized. It has excellent effects such as high accumulation and accumulation in tumors, localization in the nucleus, and no side effects such as weight loss. Therefore, KR12, which is the complex of the present invention, not only provides a therapeutic agent for cancer having a RAS gene mutation, which is a clinical problem, but also targets a RAS gene mutation that is difficult to develop. This will enable the development of new and innovative therapeutic drugs.
  • KR12 which is the complex of the present invention, is expected to promote development research (physical property testing, safety testing, pharmacokinetics, mass synthesis with GMP) toward the start of clinical trials. Further, if the method of the present invention is applied, it is possible to develop a further innovative therapeutic agent that exhibits the same effect as KR12.
  • KR12 was synthesized, and the induction of cell death was compared between a cancer cell line having a mutation that can recognize KR12 at codon 12 and a cancer cell line having no mutation that could recognize KR12 at codon 12.
  • a cancer cell line having a mutation capable of recognizing KR12 of codon 12 at a low concentration was induced to cell death.
  • the mutant KRAS gene that can be recognized by KR12 at codon 12 was specifically transcriptionally suppressed.
  • KR12 is a target oncogene because of its ability to induce cell death and to confirm the growth-inhibiting effect of KR12 administration specifically in tumors having mutations that can be recognized by KR12 in human colon cancer transplanted into mice. It has been found that it is an anticancer agent capable of suppressing driver mutation and obtaining anticancer properties.
  • ALK-FL-1 which targets the ALK gene mutation (F1174L) against a cancer cell line having an ALK gene mutation (F1174L) and a PIK3CA gene mutation (E545K) known as a driver oncogene mutation
  • ALK-FL-1 which targets the ALK gene mutation (F1174L) against a cancer cell line having an ALK gene mutation (F1174L) and a PIK3CA gene mutation (E545K) known as a driver oncogene mutation
  • MYCN alkylated PIPs (MYCNA1, MYCNA2, MYCNA3) were synthesized that were frequently amplified in tumors and the like and targeted to MYCN, which is a poor prognosis factor.
  • MYCNA1, MYCNA2, and MYCNA3 suppressed the proliferation of neuroblastoma cells in which the MYCN gene was amplified.
  • MYCNA3 suppressed cell growth more effectively in cells with strong MYCN gene amplification, and was less effective in normal cells and other cancer cells.
  • Driver oncogene (essential proto-oncogene) is thought to cause mutations (point mutations, small deletions, insertions or translocations, amplifications, etc.) specifically in cancer cells, leading to canceration mainly. It is a proto-oncogene having a gene mutation. Deletion and translocation mutations include mutations in which SNPs (single nucleotide polymorphisms) that are heteroalleles in normal cells become monoallelic or homoallelic in tumors.
  • the driver oncogene of the present invention includes those registered in a cancer gene mutation database.
  • the cancer gene mutation database is COSMIC ([Catalogue of somatic mutations in cancer]), and other databases are also included.
  • Mutations of driver oncogenes are: (1) gene sequence changes (point mutations, chromosomal translocations, deletions and / or insertions, and deletions and translocation mutations in SNPs (single nucleotide polymorphisms) that are heteroallelic in normal cells ) Also includes mutations that become monoallelic or homoallelic in tumors) and (2) changes in gene copy number (increased gene expression).
  • KRAS As the driver oncogene having the mutation (1), KRAS, HRAS, NRAS, BCR-ABL, EGFR, c-KIT, BRAF, PI3K, ALK, PIK3CA, FLT3, MET, BCL2, EML4-ALK, APC, BRCA1 / 2, TP53, MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, RB1, PTEN, VHL, P16, MEN1, RET, CDH1, STK11, PTCH, etc., and those having the mutation (2), Her2 / neu, EGFR , MYC, MYCN, MET and the like.
  • the RAS gene is a proto-oncogene belonging to the driver oncogene and encodes a membrane-bound p21-ras protein of about 21 kDa.
  • the p21-ras protein is a low molecular weight guanyl pyrophosphatase (GTPase) that circulates between activated (RAS-GTP) and inactive (RAS-GDP).
  • GTPase guanyl pyrophosphatase
  • the p21-ras protein is converted to an activated form by a guanine nucleotide exchange factor (GEF) and converted to an inactive form by a GTPase activating protein (GAP).
  • GEF guanine nucleotide exchange factor
  • GAP GTPase activating protein
  • the RAS gene controls the activity of signal transduction pathways related to cell growth and differentiation such as the MAP kinase pathway and PI3 kinase pathway.
  • the RAS gene family is widely conserved among animal species.
  • the RAS gene family is a proto-oncogene, and the mutated RAS gene family is found in various cancers and has been found in 20-30% of human cancer tumors.
  • mutations in the KRAS gene are the most common gene mutations found in human cancer tumors. Mutations in the KRAS gene are frequently identified in pancreatic cancer, colorectal cancer, thyroid cancer, lung cancer, head and neck cancer, and endometrial cancer, and precancerous conditions such as myelodysplastic syndrome, thyroid and colon adenoma But it has been identified.
  • mutations in the KRAS gene are observed in about 35 to 40% of colorectal cancers and about 90% of pancreatic cancers.
  • the codon 12 mutation KRAS gene, KRAS gene (accession number: NM_033360.2) exon 2 of the codon 12 (wild type GGT, amino acids Gly) of G C T of (Ala), G A T ( Asp), C It is a single base substitution mutation of GT (Arg), T GT (Cys), A GT (Ser), or G T T (Val).
  • a mutation occurs in codon 12 of the KRAS gene, a point mutation is present in the P-loop of the p21-ras protein, and the constitutively activated p21-ras protein is expressed.
  • FIG. 1 shows a single base substitution mutation from GGT (Gly) to G A T (Asp).
  • the MYCN gene is a proto-oncogene belonging to the driver oncogene, and MYCN amplification is observed in 4 to 8% of early cases of neuroblastoma and about 30% of advanced cases. It has been. It is known that MYCN amplification is strongly associated with rapid tumor progression and malignancy. At present, the presence or absence of MYCN amplification is an essential test item in treatment protocols based on neuroblastoma risk classification. It has become.
  • FIG. 2 shows the amplified portion of the MYCN gene.
  • Driver oncogene gene mutation recognition polyamide which is a component of the complex, is a polyamide designed to recognize driver oncogene mutation. “Recognize driver oncogene mutation” means that the driver oncogene mutation-recognizing polyamide binds to the driver oncogene mutation base sequence and / or the vicinity thereof (for example, bonding by hydrogen bonding or cross-linking). Means.
  • Driver oncogene mutation recognition compounds include pyrrole / imidazole polyamide (PIP) (cyclic, hairpin structure, PIP compound including tandem type connecting hairpin structures), Peptide Nucleic Acid (PNA), and Bridged Nucleic Acid (crosslinked nucleic acid).
  • DNA binding compounds such as DNA binding proteins such as Locked Nucleic Acid (LNA) and zinc fingers, chimeric proteins thereof, DNA binding protein complexes and complexes such as guide RNA protein complexes.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • a modified PIP modified to maintain or improve the binding ability to DNA is also included.
  • the modified PIP include a modified product obtained by adding an amine to the ⁇ -position or ⁇ -position of ⁇ -aminobutyric acid of PIP, N- ⁇ -N- ⁇ -aminobutyric acid, and N- ⁇ -N- ⁇ -aminobutyric acid.
  • a modified product having a substituted side chain a modified product obtained by modifying the modified product with a molecule such as FITC or biotin, a modified product obtained by modifying the N-terminus of PIP with a molecule such as FITC or biotin, and the C-terminus having isophthalic acid, etc.
  • Modification products modified with the above molecule may be mentioned.
  • the pyrrole-imidazole polyamide is a polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im), and a ⁇ -aminobutyric acid part. What are Py, Im, and ⁇ -aminobutyric acid part? They are linked to each other by an amide bond (—C ( ⁇ O) —NH—) (Trauger et al, Nature, 382, 559-61 (1996); White et al, Chem. Biol., 4, 569-78 (1997). And Dervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35 (2001)).
  • PIP takes a U-shaped conformation (hairpin type) by folding the entire ⁇ -aminobutyric acid moiety as a linker ( ⁇ -linker).
  • ⁇ -linker linker
  • two chains containing Py and Im are arranged in parallel across the linker.
  • a specific base pair in DNA when the Py and Im pair between the two strands is a specific combination (Py / Im pair, Im / Py pair, Py / Py pair, or Im / Im pair) can be bound with high affinity.
  • a Py / Im pair can bind to a CG base pair
  • an Im / Py pair can bind to a GC base pair.
  • Py / Py pairs can bind to both AT base pairs and TA base pairs (White et al, Chem. Biol., 4, 569-78 (1997); Dervan: Bioorg. Med). Chem., 9, 2215-35 (2001)).
  • PIP may contain 3-hydroxypyrrole (Hp) or ⁇ -alanine.
  • Hp 3-hydroxypyrrole
  • the Hp / Py pair can bind to a TA base pair (White at al, Nature, 391, 468-71 (1998)).
  • the ⁇ -linker has side chains such as N- ⁇ -N- ⁇ -aminobutyric acid and N- ⁇ -N- ⁇ -aminobutyric acid having amino groups, and these are molecules such as FITC and biotin. It may be modified.
  • N-terminal of PIP may be modified not only with an acetyl group but also with a molecule such as FITC or biotin.
  • ⁇ -Alanine / ⁇ -alanine can be bound to a TA base pair or an AT base pair. Therefore, a PIP that recognizes the regulatory region of the target gene can be designed by changing the combination of Py and Im pairs according to the target DNA sequence.
  • a PIP design method and manufacturing method are known (for example, Japanese Patent No. 3045706, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-136974, and WO 03/000683).
  • PIP can recognize the gene sequence, for example, a pair of imidazole and pyrrole that recognize guanine and cytosine in order to recognize mutations G12D and G12V of the KRAS driver oncogene gene in which GGT shown in FIG. 1 is changed to GAT or GTT.
  • the polyamide was designed using a pair of pyrrole and ⁇ -alanine that recognizes adenine and thymine.
  • an indole group between the pyrrole group and secoCBI it was decided to synthesize so that a good angle could be obtained due to the proximity of the alkylation site to N3 of adenine for structural analysis.
  • KR12 was designed in consideration of the occurrence of alkylation in the KRAS transcription template DNA. As shown in FIG. 7, KR12 was synthesized as a compound that recognizes G12D mutation 5'-ACGCCATCA-3 'and G12V mutation 5'-ACGCCAACA-3' and alkylates N3 of 3 'adenine.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Bridged Nucleic Acid cross-linked nucleic acid
  • Locked Nucleic Acid LNA
  • Bridged Nucleic Acid cross-linked nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 2 ′, 4′-BNA or 2 ′, 4′-ENA Ethylene-Bridged Nucleic Acids in which the 2 ′ oxygen atom and the 4 ′ carbon atom of RNA are bridged by an ethylene chain can be synthesized.
  • LNA is also available from Proligo.
  • the alkylating agent includes a compound having a functional group that alkylates DNA. Any alkylating agent may be used as long as it contains a compound having both an alkylating ability and a sequence recognizing ability with respect to a specific base sequence present in DNA, and is not particularly limited. For example, a compound containing a functional group described in WO2010 / 001933 can be used.
  • the alkylating agent introduces an alkyl group into the guanine N-7 position or adenine N-3 position of DNA, and causes an adduct formation or a cross-linking reaction between guanines or adenines.
  • Double-stranded DNA that has undergone a cross-linking reaction or double-stranded DNA that has been formed as an adduct is difficult to repair by the repair mechanism. As a result, DNA cannot be transcribed or replicated, resulting in cell growth arrest or cell death due to apoptosis. Will be induced.
  • DNA binding proteins include binding proteins such as zinc fingers, chimeric proteins such as TALEN (TALE Nuclease), and complex proteins such as Crisper using guide nucleic acids (CRISPR).
  • secoCBI (1-chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benzo [e] indole) is a compound represented by the following formula 3.
  • secoCBI is one of the known compounds that alkylate DNA.
  • secoCBI can be synthesized by methods described in known literature ((a) Boger, DL; Yun, WY; Teegarden, BRJ Org. Chem. 1992, 57, 2873.
  • the composite of the present invention can be synthesized by bonding the polyamide and the alkylating agent.
  • the synthesis method can be carried out by a known method (J. Am. Chem. SOC. 1995, 117, 2479-2490).
  • “Binding” may be direct or via a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the action of the alkylating agent and does not prevent recognition of the gene mutation site of the driver oncogene. For example, an amide bond, phosphodisulfide bond, ester bond, coordination bond, An ether bond etc. can be illustrated.
  • the alkylating agent containing the complex of the present invention may contain a carrier or an additive in addition to the complex of the present invention depending on the purpose of use.
  • Such carriers and additives include water, acetic acid, organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin , Methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactant, etc. Can be mentioned.
  • complex of this invention can be suitably adjusted according to a use purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a composition comprising the complex.
  • Various diseases can be treated and prevented by administering the pharmaceutical composition in vivo.
  • the pharmaceutical composition of the present invention targets all organisms that use double-stranded DNA for biological control, particularly mammals (eg, humans, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). can do.
  • the target diseases of the pharmaceutical composition of the present invention include diseases with gene mutations such as cancer, neurological / psychiatric diseases, lifestyle-related diseases, sleep disorders, dermatology, ophthalmology, or diseases with strong local symptoms in the otolaryngological region.
  • Examples include infectious diseases, allergic diseases, diseases involving cellular aging, thyroid hormone refractory disease, aging, cystic fibrosis, and gastrointestinal diseases.
  • examples of cancer include brain tumor, cervical cancer, esophageal cancer, tongue cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, small intestine or duodenal cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), bladder cancer, renal cancer.
  • sarcoma eg, osteosarcoma, chondrosarcoma, Kaposi's sarcom
  • the lifestyle-related diseases are not particularly limited, and examples thereof include hypertension and diabetes.
  • diseases and infectious diseases having strong local symptoms in the dermatology, ophthalmology, or otolaryngological region include psoriasis, chronic dermatitis, sinusitis, glaucoma, retinal degeneration, and the like.
  • allergic diseases include atopic dermatitis and hay fever.
  • diseases involving cell aging include skin wrinkles, sagging, and pigmentation.
  • neurological / psychiatric disorders include so, depression, schizophrenia, autism, bipolar disorder, Alzheimer's disease, sleep disorder, dementia and the like.
  • Preferred target diseases of the pharmaceutical composition of the present invention include all diseases derived from mutations in driver oncogene. All diseases derived from codon 12 mutation of KRAS gene, amplification of MYCN gene, mutation of ALK gene (F1174L), mutation of PIK3CA gene (E545K) are also included. For example, colon cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, thyroid cancer, lung cancer, head and neck cancer, endometrial cancer, myelodysplastic syndrome, thyroid and colon adenoma, neuroblastoma and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention acts more effectively on cells having a driver oncogene mutation rather than normal cells, promotes DNA cross-linking by alkylation, induces cell death mechanisms due to DNA damage, By suppressing the expression of the driver oncogene and inhibiting cell proliferation, the disease-causing cells can be killed, and the disease can be treated and prevented.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in any dosage form for oral administration and parenteral administration.
  • dosage forms can be formulated according to conventional methods, and may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and additives include water, acetic acid, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, Sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose And surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the additive is selected from the above alone or in combination as appropriate depending on the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • oral administration tablets, capsules, fine granules, powders, granules, solutions, syrups, sprays, coatings, eye drops, external preparations, etc. or appropriate dosage forms for oral administration Can be administered.
  • parenteral administration examples include an injection form.
  • injection form it can be administered systemically or locally by intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intratumoral injection, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when used as an injectable preparation, is dissolved in a solvent (eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, 0.1% acetic acid, etc.) and an appropriate additive (human serum) Albumin, PEG, mannose-modified dendrimer, cyclodextrin conjugate, etc.) can be used.
  • a solvent eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, 0.1% acetic acid, etc.
  • an appropriate additive human serum
  • Albumin human serum
  • PEG mannose-modified dendrimer
  • cyclodextrin conjugate etc.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that dissolves before use.
  • the freeze-drying excipient for example, sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention or the compound of the present invention varies depending on age, sex, symptom, route of administration, frequency of administration, and dosage form.
  • the dosage is 0.01 to 1000 mg per day, preferably 0.1 to 100 mg, more preferably 1 to 30 mg.
  • the administration method is appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. Administration may be divided, for example, once every several days, once per day, or divided into 2 to 4 times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an anticancer agent.
  • the types of cancer to be targeted are, for example, colon cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, thyroid cancer, lung cancer, cervical cancer, endometrial cancer, myelodysplastic syndrome, thyroid and colon adenoma, neuroblastoma, etc.
  • the present invention is not limited thereto, and all cancers derived from driver oncogene mutations, all cancers derived from codon 12 mutation of KRAS gene or amplification of MYCN gene are targeted.
  • the anticancer agent of the present invention may contain a carrier and a composition according to the purpose of use, like the above-described pharmaceutical composition and alkylating agent.
  • the kit of the present invention contains pharmaceutically acceptable carriers and additives, reagents, adjuvants, dedicated containers, other necessary accessories, instructions and the like in addition to the compound of the present invention.
  • the kit of the present invention can also be used as a cancer treatment kit and a research reagent kit.
  • codon 12 of the KRAS gene is obtained by condensing secoCBI that specifically alkylates the adenine on the minor groove side of the DNA base to a hairpin type PIP (hPIP) that targets the mutated sequence of codon 12 of the KRAS gene.
  • hPIP hairpin type PIP
  • HPIP-secoCBI KR12
  • KR12 has sufficient ability to suppress tumor growth at a low concentration against colorectal cancer cells having the KRAS gene codon 12 mutation, and subcutaneously transplants LS180 cells (derived from colorectal cancer) in which the KRAS gene codon 12 mutation is heterozygous.
  • SW480 cells derived from colorectal cancer
  • KR12 did not show an inhibitory effect on HT29 cells (derived from colon cancer) in which the KRAS gene was wild type. From these results, it was revealed that KR12 exhibits a tumor growth inhibitory effect in vitro and in vivo against cancer cells having the KRAS gene codon 12 mutation.
  • KR12 specifically alkylates the nucleotide sequence of codon 12 mutation of KRAS gene, selectively inhibits the expression of KRAS gene having codon 12 mutation, and cancer cells caused by codon 12 mutation of KRAS gene It has been found that there is an effect of specifically suppressing the growth of the. This result suggests that the methodology of adding PIP to the alkylation reaction site is one of the most effective approaches for creating new anticancer agents that recognize various tumor-specific mutations.
  • codon 12 mutant alkylated PIP (KR12) of KRAS gene The chemical structure of codon 12 mutant alkylated PIP (KR12) of KRAS gene is represented by the following chemical formula 14.
  • the method for producing the compound of the present invention is as follows. PIP having a carboxylic acid end was dissolved in 100 ⁇ L of DMF, and iPr2NEt (0.5 ⁇ L, 2.86 ⁇ mol) and PyBOP (1.0 mg, 1.95 ⁇ mol) were added. After reacting the reaction solution at room temperature for 2 hours with stirring, it was confirmed by HPLC whether or not an active form of 1-hydroxybenzotriazole ester was formed.
  • the target transformed white colonies were 500 nM primer set (T7: 5′-TAATACGACTCACTATAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 3), sp6: 5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)) and 1U GoTaq from Promega. (R) Identified by colony direct PCR using a 10 ⁇ L reaction solution containing Green Master Mix. The amplification cycle was performed as follows. After incubating the reaction solution at 95 ° C. for 2 minutes, the reaction was repeated 30 times at 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C.
  • FIG. 7A shows the results of using K480 mutant sequences of SW480 cells (colon cancer) and FIG. 7B of AsPC-1 cells (pancreatic cancer).
  • KR12 specifically induced a concentration-dependent alkylation of the codon 12 mutant sequence of the KRAS gene in SW480 cells (G12V) and AsPC-1 cells (G12D).
  • Cytotoxicity test for colon cancer cell LS180 and measurement of 50% inhibitory concentration (IC50) Using LS180 colon cell line, cells were seeded per well of 96-well microplate so as to be 3000 to 5000 cells / well, Cultured overnight. The next day, KR12 recognizing codon 12 mutation, WT recognizing wild-type KRAS, and C12-Dp having the same structure as KR12 to which no alkylating agent is added are 1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 ⁇ M Each concentration was added to the cells and treated for 48 hours. Then, using cell counting kit-8 (DOJINDO), WST-8 reagent was added per well and allowed to react for 2 hours.
  • DOJINDO cell counting kit-8
  • IC50 10 (LOG (A / B) ⁇ (50-C) / (DC) + LOG (B)), A: high concentration sandwiching 50%, B: low concentration sandwiching 50% , C: inhibition rate with B, D: inhibition rate with A were used.
  • Cytotoxicity test for various cancer cells and measurement of 50% inhibitory concentration (IC50) Using colon cancer and pancreatic cancer cell lines, each well of a 96-well microplate was adjusted to 3000 to 5000 cells / well. Cells were seeded and cultured overnight. The next day, each cell was treated for 48 hours with KR12 which recognizes the codon 12 mutation at concentrations of 1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 ⁇ M. Then, using cell counting kit-8, WST-8 reagent was added per well and reacted for 2 hours, and then the number of cells was measured by colorimetric analysis at a wavelength of 450 nm with a microplate reader.
  • IC50 50% inhibitory concentration
  • the number of cells is calculated by 1) calculating the average value of only the medium, 2) subtracting the average value of medium from each well, 3) calculating the average value of DMSO, and 4) calculating the average value of DMSO by subtracting the medium. Divided by x100, 5) The average value and standard deviation of each treatment section were calculated, and a graph was prepared.
  • the cells used in the experiments are SW480, SW620, SNU-C2B, LS180, SW1463, DLD-1, HT29, and Caco-2 human cancer cell lines (purchased from European Collection of Cell Cultures (ECACC)).
  • the experimental results are shown in Table 1.
  • IC50 for KR12, SW480, SW620, SNU-C2B, LS180, and HCT116 showed low values, and SW1463, DLD-1, HT29, and Caco-2 showed high values. That is, in the cell line having the mutation of codon 12 recognized by KR12, IC50 showed a low value of 100 nM or less.
  • SW1463, DLD-1, HT-29, and Caco-2 are cell lines that do not have the mutation of codon 12 recognized by KR12, and their IC50s showed values of 100 nM or more.
  • FIG. 9 shows a graph of the concentration-dependent cell growth inhibitory effects of HT29, Caco2, and SW1463 that do not have the mutation of codon 12 recognized by KR12, and SW480, SW620, and LS180 that have the mutation.
  • LS180 was treated with 50 nM (dissolved in 0.125% DMSO) KR12 and KR13 for 72 hours and a long-term treatment experiment was conducted for 14 days.
  • the control was cultured for 14 days in a MEM medium containing 10% FBS and 0.125% DMSO.
  • FIG. 10A The experimental results are shown in FIG. 10A.
  • Treatment with 50 nM KR12 increased S phase cells of LS180, and prolonged administration of KR12 significantly increased SubG1 phase cells.
  • the S phase and G2M phase indicate cell cycle arrest, and the SubG1 phase indicates cell death.
  • KR12 was found to lead LS180 cells from cell cycle arrest to cell death with increasing concentrations.
  • treatment with KR13 that does not recognize the codon 12 mutation slightly increased S-phase cells and G2M, but the increase in SubG1 phase was not significant even with long-term administration.
  • the cells were collected, stirred in 50 ⁇ l of PBS solution, 3 ⁇ l of 1.5% Triton X (in water) and 3 ⁇ l of RNase (1 mg / ml in water) were added at 37 ° C. for 30 minutes. Treatment for 3 minutes, then add 3 ⁇ l proteinase K (1 mg / ml) for 30 minutes at 37 ° C, add 12 ⁇ l of 6xloading buffer, treat for 10 minutes at 65 ° C and immediately 20 ⁇ l with 2% agarose gel in TBE. The solution was electrophoresed at 100 V and stained with ethidium.
  • the amount of protein was determined by Bradford reagent (Bio-Rad, CA), migrated by 10% SDS-PAGE, transferred to polyvinylidene fluoride membranes (Millipore, MA), 5% dry milk using Tris-buffered saline (TBS) plus 0.1% Tween 20 as a blocking agent, anti- ⁇ H2AX (2F3, BioLegend, CA), anti-p53 (D O-1, Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PARP (Cell Signaling Technologies, MA), or anti-actin antibody (20-33, Sigma, MO), respectively, and further HRP-conjugated anti-IgG -Treated with rabbit IgG (Cell Signaling Technologies, MA). Before the secondary antibody treatment, the primary antibody was appropriately washed. Thereafter, it was washed with TBS plus 0.1% Tween 20, and the protein was identified by ECL chemiluminescence (Amersham Biosciences, NJ).
  • RT-PCR HT29 and LS180 were cultured in 12-well plates. The next day, the cells were treated with 50 nM KR12 and KR13, and then cultured for 48 hours. The cells were collected and RNA was extracted. RNeasy mini kit (Qiagen, CA) RT-PCR was used for the extraction. Next, using the extracted RNA as a template, cDNA for reverse transcription was prepared according to Super Script VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, CA). Using the cDNA as a template, PCR was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 20 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C.
  • the PCR product was subjected to electrophoretic analysis on a 2% agarose gel. The amount of PCR product was calculated from a photograph stained with ethidium bromide. The following primer sets were used for PCR.
  • the forward primer (sense) and reverse primer (antisense) that simultaneously amplify the mutant gene and the wild type, and the forward primer (sense) and reverse primer (antisense) of the RPS18 (ribosomal protein S18) gene as internal standards are shown below.
  • the following primer set M13-F1 primer and M13-R1 primer were used for amplification.
  • the sequence of the amplified DNA was decoded with a sequencer using the sequencing primer KRAS-2R, and the KRAS gene mutation site of each colony was identified.
  • M13-F1 primer M13-R1 primer:
  • RAS activity measurement The number of cells on 2 ⁇ 10 6 cells / 100 mm plate or 1 ⁇ 10 6 cells / 100 mm plate was cultured in complete nutrient medium, and the next day, cells were treated with 50 nM KR12, KR13 and cultured for 48 hours, Cells were lysed in magnesium lysis buffer (MLB) and RAS activity levels were measured using RAS activation assay kit (Millipore, Mass.).
  • MLB magnesium lysis buffer
  • HT29 (2 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ l PBS transplanted subcutaneously, KRAS codon 12 wild type cell line without codon 12 mutation)
  • SW480 KRAS-MUTomo: (cell line having 5 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ l PBS subcutaneously and homozygous for KRAS gene codon 12 mutation G12V)
  • LS180 KRAS-MUThetero: (cell line having 3 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ l PBS subcutaneously and heterozygous for KRAS gene codon 12 mutation G12D)
  • HT29 cells having no codon 12 mutation could not suppress tumor growth by administration of KR12 (FIG. 14A), but SW480 cells having codon 12 mutation homozygous were transplanted.
  • administration of KR12 significantly reduced tumor size (FIG. 14C).
  • Nude mice transplanted with LS180 cells heterozygous for the mutant allele of KR12 and the wild type also showed significant suppression of tumor growth by administration of KR12 (FIG. 14B).
  • DMSO / PBS control was administered to nude mice transplanted with SW480 cells, the tumor size only expanded, whereas when KR12 was administered, the tumor size decreased significantly after 2 months. The tumor became very small and hard after 3 months (FIGS. 14A-C, photographs taken at autopsy (after 3 months or when the tumor became more than 2 cm in diameter)).
  • FIG. 15 shows the result of an experiment conducted by the same method as in 11 above.
  • KR12 showed significantly higher cancer tumor suppression effect than nude mice transplanted with SW480 cells than when KR13 was administered.
  • the weight loss tendency observed in seco-CBI was not observed in KR12 and KR13.
  • KR12 recognized tumor growth inhibition not exhibited by KR13 that does not recognize the G12D mutant sequence, and did not cause side effects such as weight loss or abnormal health.
  • Nude mice administered with KR12 also did not show hair handstand, decreased food intake, decreased exercise, abnormal behavior, or the like.
  • ⁇ -alanine was introduced into the N-terminus of C12DP, followed by FITC coupling.
  • FITC coupling was performed by passing a 4-fold excess of fluorescein (0.40 mmol), DIEA, and HCTU dissolved in DMF through a column and shaking for 60 minutes.
  • LS180 cells were cultured in MEM (gibco) + 10% FBS (gibco) +100 units / ml Penicillin + 100 g / ml Streptmycin (gibco) culture medium, added with FITC-labeled KR12 (1 ⁇ Mol) in a state of about 50% confluence. After time, it was encapsulated (VECTOR VECTASHIELD), stained with DAPI, and observed with a confocal microscope (Leica TCS-SPE).
  • KR12 reaches the nucleus of cancer stem cells, it is unlikely to be affected by the mechanism of drug excretion due to the mechanism of drug resistance and may be effective for cancer stem cell therapy. It is considered that KR12 moves into the nucleus because it has a property of being easily taken into the cell from the fat-soluble portion of the PIP structure, quickly moving into the nucleus from the cytoplasm, and binding to DNA. Therefore, it is shown that the complex used in the present invention does not require DDS, which is a drug delivery technique, due to the function of PIP, and PDS itself delivers various small molecule compounds to a specific genome. It is to support becoming.
  • mice purchased at 4 weeks of age were transplanted subcutaneously with 5 ⁇ 10 6 SW480 cells at 5 weeks of age, and then FITC-labeled KR12 when the tumor reached 15 mm in diameter. (10 nmol dissolved in 1.25% DMSO (200 ⁇ l)) or FITC (1 mg / kg dissolved in 1.25% DMSO (200 ⁇ l)), 1.25% DMSO was administered from 200 ⁇ l tail vein, and an in vivo imaging system ( NIPPON ROPER: Lumazone FA) was photographed from 0 hour to 10 hours every 2 hours, and the fluorescence level and the individual mouse were also photographed 3 days after 1 day (FIG. 18).
  • NIPPON ROPER Lumazone FA
  • mouth which performed the same process was dissected 24 hours afterward, each organ and tumor were taken out, and it image
  • 1 mg / kg FITC-labeled KR12 (dissolved in 1.25% DMSO (200 ⁇ l)) and 1.25% DMSO were administered from 200 ⁇ l tail vein to subcutaneous mice transplanted with human colon cancer.
  • a frozen 10-micron section was prepared with LEICA CM1510S and observed with a confocal microscope (Leica TCS-SPE) (Fig. 20).
  • NK12 (10 nMol) fluorescently labeled with FITC was intravenously administered to nude mice transplanted with SW480 cells, and then observed over time with a fluorescent image.
  • KR12 was distributed throughout the body and remained accumulated in the tumor, and the liver It showed tumor accumulation property that was gradually discharged from the kidney (FIG. 18).
  • it accumulated over time from the whole body after intravenous injection to the tumor, and fluorescence was observed in the tumor 3 days after administration. Then, 24 hours after administration, mice were dissected and the FITC uptake of each organ was observed.
  • the specific tumor accumulation property of KR12 is considered to be due to the fact that the lipid-soluble portion of PIP possessed by KR12 promoted uptake of KR12 into cancer cells and prevented KR12 from being excreted from the tumor. It is done. Even in normal cells, KR12 accumulates in the liver and kidney, but cannot remain in the cells, so it is excreted in bile and urine and excreted from these organs. That is, KR12 has an excellent effect of being rapidly excreted from normal cells and staying for a long time against cancer cells.
  • the ALK gene is a driver oncogene gene that forms a fusion gene that causes lung cancer and has a point mutation that is constitutively activated in neuroblastoma and promotes canceration. Although it is known that ALK inhibitors are effective for cancer cells having a mutation in the ALK gene, in many cases, cancer cells become resistant to ALK inhibitors and often relapse.
  • ALK gene mutation F1174L (3522C> A) in neuroblastoma is recognized in neuroblastoma cells SK-N-SH, SMS-SAN, KELLY, and LAN-1. Therefore, a 10-base-recognized PIP-indole-secoCBI compound ALK-FL-1 that specifically recognizes this mutant sequence was synthesized in the same manner as the synthesis of KR12 (FIG. 21).
  • alkylated PIP (ALK-FL-1) of ALK gene
  • the chemical structure of alkylated PIP (ALK-FL-1) of ALK gene is represented by the following chemical formula (FIG. 22).
  • the method for producing the compound of the present invention is as follows.
  • the F1174L (3522C> A) mutation is a PIP-indole-secoCBI that recognizes 10 bases, and a pyrrole that cannot recognize the second guanine from the 3 'side of the wild-type 5'-TGGTGGTTGA-3' sequence is arranged. It was designed as a compound that recognizes 5′-TGGTGGTTTA-3 ′.
  • Cytotoxicity tests on neuroblastoma cells and breast cancer cells and measurement experiments of 50% inhibitory concentration (IC50) were performed in the same manner as when KR12 was used.
  • the cells used in the experiment were Kelly cells, SK-N-SH cells, IMR-32 cells, SK-N-AS cells, and MDA-MB-231 cells, respectively DMEM, 10% FBS, 1% Pen / St. Culture was performed in a medium, RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen / St medium.
  • Each cell was seeded in a 96-well plate at 1000 cells / 50 ⁇ l / well, cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated conditions for 24 hours, and then the reagent (final concentration 1, 3, 10, 30, 100 nM) in Medium. After dilution, 50 ⁇ l / well was added and mixed. The cells were again cultured for 72 hours at 37 ° C., 5% CO 2, and saturated conditions. Cell Counting Kit-8 (DOJINDO) was added at 10 ⁇ l / well, mixed, and then cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated room conditions for 2 hours. After measuring the absorbance with Microplate Reader MTP-310 Lab (COLONA ELECTRIC), the IC50 value was calculated.
  • FIG. 23A The experimental results are shown in FIG.
  • the Kelly cell line had an IC50 of 0.09 nM and the SK-N-SH cell line had an IC50 of 0.13 nM
  • the wild-type neuroblastoma IMR-32 cell line IC50 is 0.46 nM
  • SK-N-AS cell line has an IC50 of 2.6 nM
  • MDA-MB-231 cell line which is a breast cancer cell (ALK gene wild type) without F1174L mutation has an IC50 of 7.5 nM ( Figures 23A-D, Table 5).
  • ALK-FL-1 showed stronger and more specific growth inhibition against the neuroblastoma cell line having the F1174L mutation.
  • the PIK3CA gene has mutations concentrated in three hot spots, E545K, E542K, which is the helical domain of exon 10, and H1047R, which is the kinase domain of exon 21, and these mutations include breast cancer, colon cancer, endometrial cancer, It has been reported to occur frequently in liver cancer and glioblastoma.
  • PIK3CA gene amplification without point mutation has been observed in cervical cancer, lung cancer, gastric cancer, ovarian cancer, and head and neck cancer.
  • PIK3CA gene acts as a cancer driver gene in the PI3 kinase-Akt pathway, PI3K inhibitors targeting the PIK3CA gene have been developed, but the current situation is that they have not yet reached clinical application due to toxicity problems and the like. .
  • An E545K (1633G> A) mutation in the PIK3CA gene has been observed in the breast cancer cell line MCF7. Therefore, 9-base-recognized PIP-indole-secoCBI compounds P3A-E5K-1 and P3A-E5K-2 that specifically recognize this mutant sequence were synthesized by the same method as the synthesis of KR12 (FIG. 24).
  • Cytotoxicity test for breast cancer cells and measurement experiment of 50% inhibitory concentration (IC50) were performed in the same manner as in the case of using KR12.
  • the cells used in the experiment were MCF7 cells and MDA-MB-231 cells, which were cultured in DMEM, 10% FBS, 1% Pen / St medium and RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen / St medium, respectively.
  • Each cell was seeded in a 96-well plate at 1000 cells / 50 ⁇ l / well, cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated conditions for 24 hours, and then the reagent (final concentration 1, 3, 10, 30, 100 nM) in Medium. After dilution, 50 ⁇ l / well was added and mixed.
  • the cells were again cultured for 72 hours at 37 ° C., 5% CO 2, and saturated conditions.
  • Cell Counting Kit-8 (DOJINDO) was added at 10 ⁇ l / well, mixed, and then cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated room conditions for 2 hours. After measuring the absorbance with Microplate Reader MTP-310 Lab (COLONA ELECTRIC), the IC50 value was calculated.
  • P3A-E5K-1 had an IC50 of 53.8 nM and P3A-E5K-2> 100 nM, compared to MCF7, a breast cancer cell line having a mutation of E545K (1633G> A) in the PIK3CA gene (FIG. 27A). Compared to MDA-MB-231, a breast cancer cell line in which the PIK3CA gene is wild type, P3A-E5K-1 had an IC50 of> 100 nM (FIG. 27B).
  • the P3A-E5K-1 prepared against the E545K mutant cancer cell line of the PIK3CA gene is significantly stronger than the breast cancer cell line having a tumor growth inhibitory effect which is significantly different from the E545K mutant breast cancer cell line. Became clear.
  • Cancer cell-specific mutations include gene amplification that is not point mutations or translocations but changes in gene sequence. This is called a copy number change mutation, and a specific cancer-related gene region is amplified, and as a result, the expression level of the oncogene is increased to promote canceration.
  • a compound that alkylates a specific genomic sequence as in the present invention is effective even when it is produced by targeting a gene that has been amplified and increased in copy number.
  • MYCN alkylated PIP (MYCNA1, MYCNA2, MYCNA3) targeting MYCN, which is a poor prognosis factor, was synthesized.
  • the MYCN gene is a gene that is frequently amplified in neuroblastoma, and is considered to be a driver oncogene gene of neuroblastoma.
  • a PIP-indole-secoCBI compound (MYCNA1, MYCNA2) that recognizes 8 bases and a 9-base recognition PIP-indole-secoCBI compound that specifically recognizes the sequence of exon 3 ( MYCNA3) (FIG. 28) was synthesized in the same manner as KR12.
  • alkylated PIP (MYCNA1, MYCNA2, MYCNA3) of MYCN gene
  • the chemical structure of alkylated PIP (MYCNA1, MYCNA2, MYCNA3) of MYCN gene is represented by the following chemical formula.
  • the method for producing the compound of the present invention is as follows. PIP having a carboxylic acid end was dissolved in 100 ⁇ L of DMF, and iPr2NEt (0.5 ⁇ L, 2.86 ⁇ mol) and PyBOP (1.0 mg, 1.95 ⁇ mol) were added. After reacting the reaction solution at room temperature for 2 hours with stirring, it was confirmed by HPLC whether or not an active form of 1-hydroxybenzotriazole ester was formed.
  • the cells used in the experiment were neuroblastoma cell lines IMR-32 cells (MYCN25 copies) and TGW cells (MYCN60 copies) in which amplification of the MYCN region was observed, and each was DMEM, 10% FBS, 1% Pen / St medium. , RPMI1640, 10% FBS, 1% Pen / St medium.
  • Cytotoxicity test for neuroblastoma cells and measurement experiment of 50% inhibitory concentration (IC50) were performed in the same manner as in the case of using KR12.
  • the cells used in the experiment were IMR-32 cells and TGW cells, which were cultured in DMEM, 10% FBS, 1% Pen / St medium, RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen / St medium, respectively.
  • Each cell was seeded in a 96-well plate at 1000 cells / 50 ⁇ l / well, cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated conditions for 24 hours, and then the reagent (final concentration 1, 3, 10, 30, 100 nM) in Medium. After dilution, 50 ⁇ l / well was added and mixed.
  • the cells were again cultured for 72 hours at 37 ° C., 5% CO 2, and saturated conditions.
  • Cell Counting Kit-8 (DOJINDO) was added at 10 ⁇ l / well, mixed, and then cultured at 37 ° C., 5% CO 2, under saturated room conditions for 2 hours. After measuring the absorbance with Microplate Reader MTP-310 Lab (COLONA ELECTRIC), the IC50 value was calculated.
  • the experimental results are shown in FIG.
  • the IC50 of MYCNA1 for IMR-32 cells was 9.7 nM and for TGW cells was 12.9 nM.
  • the IC50 of MYCNA2 for IMR-32 cells was 12.1 nM and for TGW cells was 11.2 nM. That is, MYCNA1 and MYCNA2 are considered to be capable of inducing growth inhibition of cancer cells in which the expression of the MYCN gene is high at a low concentration.
  • FIG. 34 shows that using MYCNA3, IMR-32 cells (with MYCN amplification, neuroblastoma cells), TGW cells (with MYCN amplification, neuroblastoma cells), NB69 cells (without MYCN amplification, neuroblastoma cells) , MCF7 cells (breast cancer cells), HT29 cells (colon cancer cells), HDF cells (corneal epithelial skin fibroblasts) 50% inhibitory concentration (IC50) measurement results and Incubate culture time-lapse microscope (Essen Instruments, Ann Arbor, (MI) is the result of observation of cell proliferation (72 hours after MYCNA3 treatment). Table 6 shows the results of the cell proliferation measurement test performed under the treatment conditions of 0.3 to 300 nM for 72 hours.
  • IC50 was 1.1 nM for IMR-32 cells, 3.7 nM for TGW cells, 77.0 nM for MB69 cells, 152.2 nM for MCF7 cells, 239.6 nM for HT29 cells, and 56.6 nM for HDF cells.
  • the cell growth inhibitory effect of MYCNA3 is particularly high in neuroblastoma cells with MYCN amplification, and the effect is low in other cancer types, neuroblastoma in which MYCN amplification is not observed, and cell lines derived from normal tissues. Okay ( Figure 34, Table 6).
  • SEQ ID NO: 1 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 2 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 3 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 5 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 8 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 9 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 10 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 13 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 14 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 15 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 16 synthetic DNA
  • Sequence number 17 Synthetic DNA.

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Abstract

本発明は、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的に結合する新規アルキル化剤を提供する。ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するポリアミドにアルキル化剤を結合させた複合体、当該複合体を含むドライバーオンコジーン遺伝子変異特異的アルキル化剤、及び当該複合体を含む医薬組成物。

Description

ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を標的にアルキル化する新規アルキル化剤
本発明は、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を標的にアルキル化する新規アルキル化剤に関する。
現在、ドライバーオンコジーン（必須癌原遺伝子）を標的にした分子標的治療が広く開発されている。ドライバーオンコジーンとは、癌細胞で特異的に変異（点突然変異や小欠失、挿入もしくは転座、増幅等）を起こし、それが主たる原因で癌化すると考えられている遺伝子変異を有する癌原遺伝子のことである。したがって、ドライバーオンコジーンを標的にして、その機能を抑制する薬剤を開発することは、癌患者に対する特効薬開発の極めて有効な方法であることが実証されている。例えば、変異ＥＧＦＲを有する肺癌患者に劇的な有効性を示すイレッサ、ＨＥＲ２の高発現に由来する乳癌患者に有効なトラスツズマブ、融合蛋白質ＢＣＲ−ＡＢＬの活性阻害剤イマチニブ等が挙げられる。
ドライバーオンコジーンが有する遺伝子変異は、（１）遺伝子配列の変化（点変異、染色体転座、欠失または／および挿入）（また欠失や転座変異には正常細胞ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなる変異も含まれる）と（２）遺伝子コピー数の変化（遺伝子の発現上昇）の２種類に分けることができる。前記（１）の変異を有するドライバーオンコジーンとして、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、前記（２）の変異を有するものとして、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＥＴ等が知られている。その他のドライバーオンコジーンは、癌遺伝子変異データベース（ＣＯＳＭＩＣ［Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ］）等に登録されている。
現在までに、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的に阻害する薬剤を開発することが頻繁に行われている。しかし、そのような薬剤は正常細胞が必要とする正常遺伝子の働きも抑えてしまうことがあり、目的の薬剤が開発できていないというのが現状である。
ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は抗生物質デスタマイシンをモチーフとして開発された人工小分子であり、２本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブへ配列特異的に結合することが報告されており、ＰＩＰによる標的配列の遺伝子の発現抑制に関する研究は、多く報告されている。さらにマウスを用いた動物実験により腎障害に対する薬剤や抗癌剤、角膜外傷、肥厚性瘢痕、骨疾患等に対する治療薬としての研究も進められている。また近年では、ｉＰＳ細胞の研究の一環として京都大学のｉＰＳ細胞プロジェクトであるｉＣｅＭｓの研究においてもＰＩＰによるｉＰＳ細胞誘導の研究が行われている等、ＰＩＰは、様々な研究成果が期待されている有機小分子である。
ＰＩＰの特徴として、（１）任意の遺伝子配列をターゲットとして設計することが可能、（２）ＤＮＡに対する結合能が転写因子よりも強い、（３）ベクターやドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）無しに細胞の核に取り込まれること、（４）核酸分解酵素に分解されず、細胞や生体内で安定であり、尿胆汁より未分解物として排泄される、（５）Ｎ及びＣ末端を容易に修飾することが可能であり、様々な機能性小分子との複合体の形成が可能であること等が挙げられる。
ＰＩＰは、Ｐｙ／ＩｍペアがＣＧ、Ｐｙ／ＰｙペアがＡＴまたはＴＡ、Ｉｍ／ＰｙペアがＧＣを認識し、これにより様々な任意の二重鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することが可能である。標的遺伝子に結合したＰＩＰは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺伝子発現を抑制する遺伝子スイッチとして研究されている。
本発明者は、配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を利用して、アルキル化官能基とＰＩＰとの複合体を合成し、ＤＮＡの特定塩基配列をアルキル化するインドール誘導体（特許文献２）、ヒストン修飾制御剤とＰＩＰとの複合体を合成し、標的遺伝子特異的ヒストン修飾制御剤に係る発明（特許文献１）をそれぞれ完成することに成功していた。しかし、ＰＩＰを用いるというコンセプトを基にして、ドライバーオンコジーンのドライバーミューテーション（癌を引き起こす主因となる遺伝子変異）を標的として薬剤を合成し、実際に腫瘍抑制効果が得られるということはいまだに報告されていない。
ＷＯ２０１０／００１９３３ ＷＯ２００５／０８７７６２
上述のとおり、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に対して特異的に作用する治療薬が求められていた。そこで、本発明は、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を標的にアルキル化する新規アルキル化剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）を設計し、設計したＰＩＰにアルキル反応部位を結合させた化合物を合成し、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的に認識して結合し、アルキル化する新規化合物を合成することに成功し、さらに新規化合物が効率的に腫瘍細胞や腫瘍幹細胞にも送達されることを確認し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、アルキル化剤との複合体。
（２）遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化及び／または遺伝子コピー数の変化である、（１）に記載の複合体。
（３）ドライバーオンコジーンが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥＴ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子から選ばれる少なくとも１つである、（１）および（２）のいずれか１つに記載の複合体。
（４）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ結合蛋白複合体、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ））、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物またはＤＮＡ結合蛋白もしくはその複合体である、（１）~（３）のいずれか１つに記載の複合体。
（５）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、（１）~（４）のいずれか１つに記載の複合体。
（６）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（５）に記載の複合体。
（７）（１）~（６）のいずれか１つに記載の複合体を含む、ドライバーオンコジーン遺伝子変異特異的アルキル化剤。
（８）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （９）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （１０）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （１１）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （１２）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （１３）下式で表される（１）に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （１４）（８）に記載の複合体を含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異アルキル化剤。
（１５）（９）に記載の複合体を含むＡＬＫ遺伝子Ｆ１１７４Ｌ変異アルキル化剤。
（１６）（１０）および（１１）のいずれか１つに記載の複合体を含むＰＩＫ３ＣＡ遺伝子Ｅ５４５Ｋ変異アルキル化剤。
（１７）（１２）および（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含むＭＹＣＮ遺伝子増幅変異アルキル化剤。
（１８）（１）~（６）および（８）~（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物。
（１９）医薬組成物が抗癌剤である（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）（１）~（６）および（８）~（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含むキット。
（２１）（１）~（６）および（８）~（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む研究試薬キット。
（２２）（１）~（６）および（８）~（１３）のいずれか１つに記載の複合体を含む治療用キット。
（２３）（１）ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するようにＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
（２）設計したＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤とを結合させる工程を含む、
ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的にアルキル化する複合体の製造方法。
（２４）遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化または遺伝子コピー数の変化である、（２３）に記載の製造方法。
（２５）ドライバーオンコジーンが、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥＴ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、（２３）または（２４）に記載の製造方法。
（２６）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ結合蛋白複合体、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ））、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物またはＤＮＡ結合蛋白もしくはその複合体のいずれかである、（２３）~（２５）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２７）アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、（２３）~（２６）のいずれか１つに記載の複合体の製造方法。
（２８）アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、（２７）に記載の製造方法。
（２９）（２３）~（２８）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた複合体の医薬組成物の製造のための使用。
（３０）（２３）~（２８）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた複合体の抗癌剤の製造のための使用。
本発明により、ドライバーオンコジーンの遺伝子変異を有する癌細胞を特異的にアルキル化するための複合体が提供される。本発明の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、医薬組成物または抗癌剤として用いることができる。本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異を特異的にアルキル化する化合物（ＫＲ１２）である。本発明の別の好ましい態様によれば、ゲノムコピー数の増加したＭＹＣＮ遺伝子を特異的にアルキル化する化合物（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）である。また、本発明の別の好ましい態様として、本発明の複合体は、ＡＬＫ遺伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）を標的としたＡＬＫ−ＦＬ−１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）を標的としたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２である。
本発明により、アルキル化剤にドライバーオンコジーンの遺伝子変異を特異的に結合するポリアミドを付加するという方法論が、腫瘍特異的な様々な変異を認識する新規抗癌剤の創出にとって極めて有効なアプローチの１つであることが明らかとなった。具体的には、塩基配列特異的に結合する有機小分子であるＰＩＰにアルキル化剤であるＣＢＩを付加し、ＤＮＡとの強い結合力を有し、少量でも効果的に遺伝子発現を抑制する抗変異ドライバーオンコジーン治療薬を開発することが明らかになった。この効果は、アルキル化によるＤＮＡ損傷が細胞死シグナルを誘導し、その抑制を行うオンコジーンが抑制されることで、通常細胞死を起こさないがん細胞を含めて細胞死を誘導できるためと考えられる。
つまり、本発明は、アルキル化剤を特定のゲノム配列に送達する技術を提供するものであり、この技術を応用するとＫＲＡＳ癌遺伝子だけではなく、癌特異的な変異を有する様々なドライバー癌遺伝子に対して変異配列を特異的に認識できる治療薬を次々にデザイン・合成することを可能とするものである。そして、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）技術と同様の考え方も適用でき、合成も容易であるため幅広い用途に応用できる。
本発明の複合体であるＫＲ１２は、低濃度で変異ＲＡＳドライバー癌遺伝子をもつ癌細胞に対し、特異的に強い抗癌活性を示し（ピコモルから細胞増殖抑制を生じる）、自動合成が可能であり、腫瘍への集積性・蓄積性が高く、核内に局在し、体重減少といった副作用も認められないといった優れた効果を有している。そのため、本発明の複合体であるＫＲ１２は、臨床上問題となっているＲＡＳ遺伝子変異を持つ癌に対する治療薬を提供するだけでなく、開発が困難であるＲＡＳ遺伝子変異を標的とする分子標的治療薬に対して、新たな画期的治療薬の開発を可能とするものである。今後、本発明の複合体であるＫＲ１２は、臨床試験開始に向けた開発研究（物性試験、安全性試験、薬物動態、ＧＭＰでの大量合成）の推進が期待されている。また、本発明の方法を応用すれば、ＫＲ１２と同様の効果を奏するさらなる画期的な治療薬の開発が可能である。
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異（Ｇ１２Ｄ）を示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子と化合物の結合位置を示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１３）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子の野生型コドン１２の塩基配列を認識するＰＩＰ（ＷＴ）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲ１２からアルキル化能を持つＣＢＩ基を除いたＰＩＰ（Ｃ１２−Ｄｐ）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異の塩基配列のアルキル化確認実験の結果を示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＫＲ１２、ＷＴ、非アルキル化Ｃ１２−ＤＰの処理後のＬＳ１８０細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＷＳＴアッセイによりＫＲ１２処理後の６種類の細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＫＲ１２処理癌細胞の細胞周期変化、細胞死の誘導によるＤＮＡラダーの確認、細胞損傷、アポトーシスのマーカーの蛋白解析を行った結果を示す図である。 ＫＲ１２処理癌細胞の半定量的遺伝子発現（ＲＴ−ＰＣＲ）を解析した図である。 ＫＲ１２処理ＬＳ１８０細胞のＲＡＳ活性測定の結果を示す図である。 ＫＲ１２処理ＨＴ２９細胞のＲＡＳ活性測定の結果を示す図である。 ヌードマウスを用いた腫瘍増殖抑制評価実験の結果を示す図である。 ヌードマウスを用いたＣＢＩ、ＫＲ１３投与との比較実験および単回投与腫瘍増殖抑制評価実験の結果を示す図である。 ＫＲ１２のＬＳ１８０細胞における細胞内局在を示す図である。 ＫＲ１２のスフェア形成大腸癌細胞における細胞内局在を示す図である。 ＫＲ１２の担癌ヌードマウスにおける体内動態を観察した図である。 ＫＲ１２の各種臓器における蓄積を観察した図である。 ＫＲ１２の腫瘍、肝臓、腎臓の細胞における細胞内局在を観察した図である。 ＡＬＫ遺伝子のＦ１１７４Ｌ変異とＰＩＰの設計を示す図である。 ＡＬＫ遺伝子のＦ１１７４Ｌ変異アルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＡＬＫ−ＦＬ−１処理後の神経芽腫細胞、乳癌細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異とＰＩＰの設計を示す図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異アルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異アルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＷＳＴアッセイによりＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２処理後の乳癌細胞の細胞増殖測定を行って、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を測定した図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のエキソン３とＭＹＣＮ３の結合部位を示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ２）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ３）の合成に係るＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳのクロマトグラムを示す図である。 Ｉｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡でＭＹＣＮＡ１およびＭＹＣＮＡ２処理細胞の細胞観察をして作成した細胞成長曲線を示す図である。 ＭＹＣＮＡ１処理神経芽腫細胞を用いた細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定結果を示す図である。 ＭＹＣＮＡ３処理神経芽腫細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、正常線維芽細胞を用いた細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
配列認識特異性の高いＰＩＰ構造を用いて遺伝子配列特異的なアルキル化剤を合成できることは既知であるが、このコンセプトを元にして薬剤として疾患の治療に応用できるかは不明であった。また、ＰＩＰにアルキル化剤をコンジュゲートさせた化合物により、標的配列を持つ遺伝子の発現を抑制できることは報告されていたが、実際にドライバーオンコジーンのドライバーミューテーションを標的として薬剤を合成し、腫瘍抑制効果が得られるという事実は未だに不明であった。本発明者は、アルキル化剤がＤＮＡ損傷を誘導し、そのことで細胞死を誘導することと、癌においてはＤＮＡ損傷による細胞死を抑制するメカニズムが働くことで、癌細胞が不死の状態となり増殖し続けるという事実に注目した。ドライバーオンコジーンはがん細胞の不死化に強く関与していると考えられており、特にＫＲＡＳ遺伝子の変異では、細胞死を抑制することがよく知られている。そこで、本発明者は、コドン１２変異を特異的に抑制しながらＤＮＡ損傷を誘導する薬剤を合成できれば、癌細胞に細胞死を誘導できると仮説を立てた。
この仮説に基づきＫＲ１２を合成し、コドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持つ癌細胞株とコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持たない癌細胞株で細胞死の誘導を比較したところ、ＫＲ１２は極めて低濃度でコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異を持つ癌細胞株を細胞死に誘導した。またコドン１２のＫＲ１２が認識できる変異ＫＲＡＳ遺伝子を特異的に転写抑制していることも確認できた。さらに細胞死が誘導できること及びマウスに移植されたヒト大腸がんにおいてもＫＲ１２が認識できる変異をもつ腫瘍で特異的にＫＲ１２投与による増殖抑制効果が確認されたことより、ＫＲ１２は、標的癌遺伝子のドライバーミューテーションを抑制すること、そして、抗癌特性を得ることが出来る抗癌剤であることを見出した。
さらに、ドライバーオンコジーン遺伝子変異として知られるＡＬＫ遺伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）およびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）を持つ癌細胞株に対して、ＡＬＫ遺伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）を標的としたＡＬＫ−ＦＬ−１、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）を標的としたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２をそれぞれ合成し、対応する変異をもつ癌細胞株に投与した結果、より効果的に細胞死を誘導し、増殖を抑制することを確認した。
また、本発明者は、ＫＲ１２と同様に特定のゲノム配列をアルキル化する化合物が増幅してコピー数が多くなった癌遺伝子を標的にして作成した場合も効果を発揮すると考え、小児の神経芽腫等で高頻度に増幅し、予後不良因子となるＭＹＣＮを標的としたＭＹＣＮアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）を合成した。ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３は、ＭＹＣＮ遺伝子が増幅した神経芽腫細胞の増殖を抑制した。特にＭＹＣＮＡ３では、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅が強い細胞でより効果的に細胞増殖を抑制し、正常細胞や他の癌細胞では効果が低かった。
以上の結果から、配列特異的な遺伝子認識ポリアミド化合物を合成できること、さらにＤＮＡのアルキル化を誘導できる薬剤との複合体コンジュゲートを合成する方法を使えば、様々な種類のドライバーオンコジーンのドライバーミューテーションを標的にした抗癌剤を合成できることが明らかになった。
ドライバーオンコジーン（必須癌原遺伝子）とは、癌細胞で特異的に変異（点突然変異や小欠失、挿入もしくは転座、増幅等）を起こし、それが主たる原因で癌化すると考えられている遺伝子変異を有する癌原遺伝子のことである。なお、欠失や転座変異には正常細胞ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなる変異も含まれている。本発明のドライバーオンコジーンは、癌の遺伝子変異データベースに登録されるものが含まれている。癌の遺伝子変異データベースは、ＣＯＳＭＩＣ（［Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ］）等であり、その他のデータベースも含まれている。ドライバーオンコジーンが有する変異は、（１）遺伝子配列の変化（点変異、染色体転座、欠失または／および挿入、また欠失や転座変異には正常細胞ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなる変異も含まれる）と（２）遺伝子コピー数の変化（遺伝子の発現上昇）の２種類に分けることができる。前記（１）の変異を有するドライバーオンコジーンとして、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ等が挙げられ、前記（２）の変異を有するものとして、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＥＴ等が挙げられる。
ＲＡＳ遺伝子は、ドライバーオンコジーンに属する癌原遺伝子であり、約２１ｋＤａの膜結合ｐ２１−ｒａｓ蛋白質をコードしている。ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、活性化型（ＲＡＳ−ＧＴＰ）と不活性型（ＲＡＳ−ＧＤＰ）の間を循環する低分子量グアニルピロホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）である。ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により活性化型に変換され、ＧＴＰアーゼ活性化蛋白質（ＧＡＰ）によって不活性型に変換される。このような変換機構を通じてＲＡＳ遺伝子は、ＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３キナーゼ経路等の細胞の成長及び分化に関わるシグナル伝達経路の活性制御を行っている。
ＲＡＳ遺伝子ファミリーには、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳ遺伝子の３つのメンバーが存在する。ＲＡＳ遺伝子は、動物種の間で広く保存されている。ＲＡＳ遺伝子ファミリーは癌原遺伝子であり、変異したＲＡＳ遺伝子ファミリーは種々の癌においてみられ、ヒト癌腫瘍の２０~３０％において認められている。とりわけ、ＫＲＡＳ遺伝子の変異はヒト癌腫瘍において最も一般的にみられる遺伝子変異である。ＫＲＡＳ遺伝子の変異は、膵臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頭頚部癌および子宮内膜癌で高頻度に同定され、さらに、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫等の前癌状態でも同定されている。統計的には、大腸癌の約３５~４０％、膵臓癌の約９０％でＫＲＡＳ遺伝子の変異が認められている。
ＫＲＡＳ遺伝子の変異としては、コドン１２、１３、６１または１４６における１塩基対置換（ミスセンス変異）が知られている。頻度としては、コドン１２（約８０％）、コドン１３（約２０％）である。癌で頻度の高いＫＲＡＳ遺伝子の変異が生じると、恒常的に活性化したｐ２１−ｒａｓ蛋白質が発現する。この点変異ｐ２１−ｒａｓ蛋白質は、不活性化型にならないため、恒常的に下流のシグナル伝達経路を活性化する。その結果、細胞は過剰な増殖シグナルを受け、成長と分化を制御できずに癌鈿胞へと形質転換する。
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異とは、ＫＲＡＳ遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿０３３３６０．２）のエキソン２のコドン１２（野生型ＧＧＴ、アミノ酸Ｇｌｙ）のＧＣＴ（Ａｌａ）、ＧＡＴ（Ａｓｐ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）またはＧＴＴ（Ｖａｌ）の一塩基置換変異である。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異が生じると、ｐ２１−ｒａｓ蛋白質のＰ−ループに点変異が存在し、恒常的活性化型ｐ２１−ｒａｓ蛋白質が発現する。図１には、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）からＧＡＴ（Ａｓｐ）への一塩基置換変異を示した。
ＭＹＣＮ遺伝子はドライバーオンコジーンに属する癌原遺伝子であり、ＭＹＣＮの増幅は、神経芽腫の早期例の４~８％、進行例の約３０％に認められ、増幅例は悪性度が高いことが知られている。ＭＹＣＮの増幅が急速な腫瘍の進行と悪性度に強く関連していることが知られており、現在では、神経芽腫のリスク分類に基づく治療プロトコールにおいてＭＹＣＮの増幅の有無は必要不可欠な検査項目になっている。図２には、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅部分が図示されている。
現在までに、ＫＲＡＳ遺伝子の変異、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅を標的にした様々な診断薬または治療薬が開発されているが、有効な抗癌剤が開発されていないのが現状である。
複合体の構成要素であるドライバーオンコジーンの遺伝子変異認識ポリアミドは、ドライバーオンコジーンの変異を認識するように設計されたポリアミドである。「ドライバーオンコジーンの変異を認識する」とは、ドライバーオンコジーンの変異塩基配列および／またはその近傍にドライバーオンコジーンの変異認識ポリアミドが結合等（例えば水素結合または架橋形成（クロスリンキング）による結合等）することを意味する。ドライバーオンコジーンの変異認識化合物としては、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）（環状、ヘアピン構造、ヘアピン構造をつなげたタンデム型を含むＰＩＰ化合物）、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ジンクフィンガー等のＤＮＡ結合蛋白やそのキメラ蛋白、ＤＮＡ結合蛋白複合体やガイドＲＮＡ蛋白複合体のような複合体等のＤＮＡ結合化合物を挙げることができる。さらには、ＤＮＡに対する結合能力を維持または向上するように修飾したＰＩＰ修飾物も含まれる。ＰＩＰ修飾物としては、例えば、ＰＩＰのγ−アミノ酪酸のα位またはβ位にアミンを付加した修飾物、Ｎ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、Ｎ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸の置換された側鎖を有する修飾物、また前記修飾物をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩＰのＮ末端をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、Ｃ末端がイソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物
ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）とγ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、ＰｙとＩｍとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Ｔｒａｕｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３８２，５５９−６１（１９９６）；Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，５６９−７８（１９９７）；およびＤｅｒｖａｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９，２２１５−３５（２００１））。ＰＩＰは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーション（ヘアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカーを挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ対、またはＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ−Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ−Ｔ塩基対およびＴ−Ａ塩基対の両方に結合することができる（Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，５６９−７８（１９９７）；Ｄｅｒｖａｎ：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９，２２１５−３５（２００１））。また、ＰＩＰには、他に３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、またはβアラニンが含まれていても良い。Ｈｐについては、Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ−Ａ塩基対に結合することができる（Ｗｈｉｔｅ　ａｔ　ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，４６８−７１（１９９８））。また、γ−リンカーについてはアミノ基を持つＮ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸及びＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸のような側鎖をもち、またこれらがＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾されていても良い。またＰＩＰのＮ末端はアセチル基だけでなくＦＩＴＣやビオチン等の分子が修飾されていても良い。βアラニン／βアラニンについては、Ｔ−Ａ塩基対もしくはＡ−Ｔ塩基対に結合することができる。よって、標的のＤＮＡ配列に合わせてＰｙとＩｍの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号およびＷＯ０３／０００６８３）。
ＰＩＰは、遺伝子配列を認識できることより、例えば、図１に示すＧＧＴがＧＡＴもしくはＧＴＴに変化したＫＲＡＳドライバーオンコジーン遺伝子の変異Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖを認識させるために、グアニン、シトシンを認識するイミダゾール、ピロールのペアではなく、アデニン、チミンを認識するピロールとβアラニンのペアを用いてポリアミドを設計することとした。また、インドール基をピロール基とｓｅｃｏＣＢＩ間に配置することで、構造解析上、アデニンのＮ３にアルキル化部位が近接し、良好な角度が得られよう合成することとした。また、ＫＲＡＳの転写テンプレートＤＮＡにアルキル化が生じるよう配慮しＫＲ１２の設計を行った。図７に示すようにＫＲ１２はＧ１２Ｄ変異５’−ＡＣＧＣＣＡＴＣＡ−３’およびＧ１２Ｖ変異５’−ＡＣＧＣＣＡＡＣＡ−３’を認識し、３’のアデニンのＮ３をアルキル化する化合物として合成された。このように塩基置換をＰＩＰの塩基認識能もしくはｓｅｃｏＣＢＩのアデニンの認識能を利用することで様々な点変異もしくは腫瘍でモノアレルもしくはホモアレルとなり正常ではヘテロアレルとなるＳＮＰ（単塩基多型）が腫瘍でモノもしくはホモアレルとなる多型を認識できる化合物を合成することで抗腫瘍効果が期待できるものと考えられる。
Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）またはＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、ＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をメチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＢＮＡまたはＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４’−ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）として合成することができる。ＬＮＡはＰｒｏｌｉｇｏ社からも入手可能である。
アルキル化剤とはＤＮＡをアルキル化する官能基を有する化合物を含むものである。アルキル化剤としては、ＤＮＡ中に存在する特定の塩基配列に対して、アルキル化能と配列認識能を兼ね備えた化合物を含むものであればどのようなものでもよく特に制限されるものではない。例えば、ＷＯ２０１０／００１９３３に記載の官能基を含む化合物を用いることができる。アルキル化剤は、ＤＮＡのグアニンＮ−７位やアデニンＮ−３位にアルキル基を導入し、付加体形成やグアニン同士、アデニン同士等の架橋反応を引き起こす。架橋反応を生じた二本鎖ＤＮＡや付加体形成した二本鎖ＤＮＡは修復機構によって修復することが困難であり、結果としてＤＮＡの転写及び複製が出来なくなり、細胞増殖の停止やアポトーシスによる細胞死が誘導されることになる。ＤＮＡ結合蛋白にはジンクフィンガー等の結合蛋白、ＴＡＬＥＮ（ターレン、ＴＡＬＥ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）のようなキメラ蛋白およびガイド核酸を利用したクリスパー（ＣＲＩＳＰＲ）のような複合蛋白が含まれる。
ｓｅｃｏＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）は、下式３で表される化合物である。ｓｅｃｏＣＢＩはＤＮＡをアルキル化する公知の化合物の１つである。ｓｅｃｏＣＢＩは、公知の文献に記載の方法によって合成できる（（ａ）Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｙｕｎ，Ｗ．Ｙ．；Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ，Ｂ．Ｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，２８７３．（ｂ）Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．；ＭｃＫｉｅ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，１２７１．（ｃ）Ｂｏｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｔ．；Ｋｉｔｏｓ，Ｐ．Ａ．；Ｓｕｎｔｏｒｎｗａｔ，Ｏ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，５８２３．）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
本発明の複合体は上記ポリアミドと上記アルキル化剤とを結合すること等により合成することができる。合成方法は公知の方法によって行うことができる（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＯＣ．１９９５，１１７，２４７９−２４９０）。「結合」は、直接でも良いし、リンカーを介しても良い。リンカーとしては、アルキル化剤の作用を妨げず、かつドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合等を例示することができる。
本発明の複合体を含むアルキル化剤は、使用目的に応じ、本発明の複合体に加えて、担体や添加物を含むものであっても良い。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。本発明の複合体の使用量は、使用目的に応じて適宜調節することができる。
本発明の複合体として、以下のものが例示できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
本発明の医薬組成物は、上記複合体を含む組成物である。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を治療及び予防をすることができる。本発明の医薬組成物は、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物とくに哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）の疾患を対象にすることができる。本発明の医薬組成物の対象疾患は、遺伝子の変異を伴う疾患たとえば癌、神経疾患／精神性疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、甲状腺ホルモン不応症、老化、嚢胞性線維症、ならびに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうち癌としては、例えば、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸または十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫等）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）等）、小児固形腫瘍（脳腫瘍、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫等）、網膜芽腫およびメラノーマ等を挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病等を挙げることができる。皮膚科、眼科、または耳鼻科領域の局所症状の強い疾患および感染症としては、例えば、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症等を挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症等を挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着等を挙げることができる。神経疾患／精神性疾患としては、例えば、そう、うつ、統合失調、自閉症、双極性障害、アルツハイマー病、睡眠障害、痴呆等を挙げることができる。
本発明の医薬組成物の好ましい対象疾患は、ドライバーオンコジーンの変異に由来する全ての疾患が含まる。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異、ＭＹＣＮ遺伝子の増幅、ＡＬＫ遺伝子の変異（Ｆ１１７４Ｌ）、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異（Ｅ５４５Ｋ）に由来する全ての疾患も含まれる。例えば、大腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等である。本発明の医薬組成物は、正常細胞ではなく、ドライバーオンコジーンの変異を有する細胞により効果的に作用して、アルキル化によってＤＮＡの架橋形成を促進し、ＤＮＡ損傷による細胞死メカニズムを誘導し、さらにドライバーオンコジーンの発現を抑制し、細胞増殖を阻害することによって疾患原因細胞を死滅させ、疾患の治療及び予防をすることができる。
本発明の医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれの剤形でも良い。これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであっても良い。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせから選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであっても良い。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０．０１~１０００ｍｇ、好ましくは０．１~１００ｍｇ、より好ましくは１~３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば数日間隔に１回、１日当たり、１回または２~４回に分けても良い。
本発明の医薬組成物は、抗癌剤として用いることができる。対象になる癌の種類は、例えば、大腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、肺癌、頚部癌、子宮内膜癌、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等であるが、これに限定されることはなく、ドライバーオンコジーンの変異に由来する全ての癌、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異またはＭＹＣＮ遺伝子の増幅に由来する全ての癌が対象である。本発明の抗癌剤は、上述の医薬組成物、アルキル化剤と同様に使用目的に応じて担体や組成物を含んでも良い。
本発明のキットは、本発明の化合物の他、医薬的に許容される担体や添加物、試薬類、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含むものである。本発明のキットは、癌治療用キット、研究試薬キットとしても使用することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．概要
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異は、現在、最も治療の困難な膵臓癌に多く見られるほか、化学療法抵抗性の転移を有する大腸癌患者または肺癌患者にも見られる遺伝子変異である。現在、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異に対する有効な治療薬が望まれている。本実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異配列を標的とするヘアピン型ＰＩＰ（ｈＰＩＰ）にＤＮＡ塩基の副溝側のアデニンを特異的にアルキル化するｓｅｃｏＣＢＩを縮合させることでＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異を特異的に認識するｈＰＩＰ−ｓｅｃｏＣＢＩ（ＫＲ１２）を合成した。ＫＲ１２を用いて、（１）ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異の塩基配列のアルキル化確認実験、（２）大腸癌細胞に対する５０％阻害濃度の測定、（３）細胞増殖及び細胞形態の観察、（４）細胞周期変化の解析、（５）半定量的遺伝子発現解析、（６）コロニーシークエンス、（７）ＲＡＳ活性測定、（８）癌細胞を移植したヌードマウスの腫瘍抑制評価実験（９）がん細胞およびスフェア形成細胞への取り込みと薬剤排泄メカニズムからの回避の確認実験（１０）腫瘍細胞核内への集積性の確認実験を行った。
ＫＲ１２は、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異をもった大腸癌細胞に対して低濃度で十分な腫瘍増殖抑制能を有し、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異がヘテロで認められるＬＳ１８０細胞（大腸癌由来）を皮下移植したヌードマウスに対して統計学的に有意な腫瘍増殖抑制効果を示し、ＫＲＡＳコドン１２変異がホモで認められるＳＷ４８０細胞（大腸癌由来）においても、同細胞の移植によって形成された腫瘍の縮小効果を示した。一方で、ＫＲ１２は、ＫＲＡＳ遺伝子が野生型のＨＴ２９細胞（大腸癌由来）では抑制効果は示さなかった。この結果から、ＫＲ１２は、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異をもった癌細胞に対して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかになった。
これらの結果から、ＫＲ１２はＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異の塩基配列を特異的にアルキル化し、コドン１２変異を有するＫＲＡＳ遺伝子の発現を選択的に阻害し、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異に起因する癌細胞の増殖を特異的に抑制する効果があることが分かった。この結果は、アルキル化反応部位にＰＩＰを付加するという方法論が、腫瘍特異的な様々な変異を認識する新規抗癌剤の創出にとって極めて有効なアプローチの１つであることを示唆するものである。
２．ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の合成
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１２）の化学構造は以下の化学式１４で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カルボン酸末端を持つＰＩＰをＤＭＦ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、２．８６μｍｏｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を撹拌しながら室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの活性体が出来ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ２−インドールｓｅｃｏ−ＣＢＩ（０．６ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌し、溶媒であるＤＭＦを除き、残渣をジクロロメタンとジエチルエーテルで分液した。反応物の層はＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニアグラジエント、０~３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異アルキル化ＰＩポリアミド（ＫＲ１２）が白い粉末で得られた（ＬＣ−ＭＳｍ／ｅ　Ｃ８９Ｈ９４ＣｌＮ３１Ｏ１６［Ｍ＋２Ｈ］２＋　計算値：９４３．８６、実測値９４４．２５、図３）。
また、上述の方法を適用して、下記の化学式１５で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２と野生型の配列を認識しないコドン１３変異を標的にしたアルキル化ＰＩＰ（ＫＲ１３）も合成した（図４）。そして、下記の化学式１６、１７に示す通り、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型コドン１２の塩基配列を認識するＷＴ（図５）、ＫＲ１２からアルキル化能を持つＣＢＩ基を除いたＣ１２−Ｄｐも合成した（図６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
３．ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異遺伝子配列のアルキル化確認
（１）プラスミドＤＮＡのクローニング
２５μＭの２つの断片対（５’−ＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１）、３’−ＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＣＧＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧ−５’（配列番号２））を含む最終容量５０μＬをアニールしてＤＮＡ断片を得た。アニール化された断片をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＧＥＭ−Ｔ　ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒｓに連結した。産物をプロメガ製のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・Ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）コンピテントセルに形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地のプレートで３７℃、一晩培養した。目的の形質転換されたホワイトコロニーは５００ｎＭのプライマーセット（Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３）、ｓｐ６：５’−ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号４））とプロメガ製の１Ｕ　ＧｏＴａｑ（Ｒ）　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを含む１０μＬの反応溶液を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより同定した。増幅サイクルは以下のように行った。反応溶液を９５℃で２分間インキュベートした後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応サイクルを３０回繰り返した後に最後の伸長反応を７２℃で７分間の反応サイクルで行った。コロニーは１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に移し、３７℃で一晩培養した。この導入されたプラスミドはシグマアルドリッチ製のＧｅｎＥｌｕｔｅＰｌａｓｍｉｄ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔにより回収した。
（２）高解像度−ゲル電気泳動
５’末端がテキサスレッドで標識された２１３塩基対のＤＮＡ断片を上記で作成したプラスミドとプライマー（ｓｐ６：５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号５）、Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号６）、５’末端はテキサスレッド標識）で合成した。得られた５’末端がテキサスレッドで標識されたＤＮＡ断片をシグマ製のＰＣＲ−Ｃｌｅａｎ　Ｕｐ　Ｋｉｔで精製し、濃度をＵＶ吸収により決定した。各種アルキル化ＰＩＰを含む１０μＬの反応溶液（５’末端がテキサスレッドにより標識された二本鎖ＤＮＡ断片１０ｎＭと５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を２３℃で１７時間インキュベートした。反応後、過剰なアルキル化ＰＩＰを１０ｍｇ／ｍＬのｃａｌｆｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡ（１μＬ）で除去し、９５℃で１０分間加熱することで標的アルキル化部位でのＤＮＡの切断を引き起こした。減圧蒸留で溶媒を除去した後、７μＬのｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅを加える。このサンプルを９５℃で２５分間加熱した後、迅速に氷上で冷却した。１．２μＬのサンプルをＨｉｔａｃｈｉ５５００−Ｓ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにセットした６％の変性ポリアクリルアミドゲルに乗せ電気泳動を行った（図７）。
実験結果を図７に示した。図７ＡはＳＷ４８０細胞（大腸癌）、図７ＢはＡｓＰＣ−１細胞（膵臓癌）のＫＲＡＳ変異配列を用いた結果である。ＫＲ１２は、ＳＷ４８０細胞（Ｇ１２Ｖ）及びＡｓＰＣ−１細胞（Ｇ１２Ｄ）のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異配列を特異的に、濃度依存的なアルキル化を誘導していた。
４．大腸癌細胞ＬＳ１８０に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
ＬＳ１８０大腸細胞株を用い３０００~５０００個の細胞／ウェルになるように９６穴マイクロプレートの１ウェル毎に細胞を播いて、一晩培養した。翌日、コドン１２の変異を認識するＫＲ１２、野生型ＫＲＡＳを認識するＷＴ、アルキル化剤を付加していないＫＲ１２と同様の構造を持つＣ１２−Ｄｐを１ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭの濃度でそれぞれ細胞に添加、４８時間処理した。その後、ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェル毎に添加して、２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色分析法によって細胞数を計測した。細胞数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値をだす、２）各ウェルからｍｅｄｉｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、４）Ｍｅｄｉｕｍ引いた値をＤＭＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と標準偏差をだし、グラフ作成を行った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂでの阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を用いた。
実験結果を図８に示した。ＬＳ１８０細胞は、ＫＲ１２処理によるＩＣ５０が５３ｎＭと最も低く、ＷＴでは１９３ｎＭであった。またＫＲ１２と同様のＤＮＡ認識をするＰＩＰ化合物でアルキル化剤を持たないＣ１２−Ｄｐでは、細胞増殖抑制は認められなかった。
５．種々の癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
大腸がん及びすい臓がん細胞株を用い３０００~５０００個の細胞／ウェルになるように９６穴マイクロプレートの１ウェル毎に細胞を播いて、一晩培養した。翌日、１ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭの濃度のコドン１２の変異を認識するＫＲ１２でそれぞれの細胞を４８時間処理した。その後、ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ−８を用いて、ＷＳＴ−８試薬を１ウェル毎に添加して、２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長で比色分析法によって細胞数を計測した。細胞数の計算方法は、１）Ｍｅｄｉｕｍのみの平均値をだす、２）各ウェルからｍｅｄｉｕｍの平均値を引く、３）ＤＭＳＯの平均値をだす、４）Ｍｅｄｉｕｍを引いた値をＤＭＳＯの平均値で割る×１００、５）各処理区の平均値と標準偏差をだし、グラフ作成を行った。ＩＣ５０計算式は、ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））、Ａ：５０％を挟む高い濃度、Ｂ：５０％を挟む低い濃度、Ｃ：Ｂでの阻害率、Ｄ：Ａでの阻害率を用いた。
実験に用いた細胞は、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ、ＬＳ１８０、ＳＷ１４６３、ＤＬＤ−１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ−２のヒト癌細胞株（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で購入）である。
実験結果を表１に示した。ＫＲ１２に対するＩＣ５０について、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ、ＬＳ１８０、ＨＣＴ１１６は低い値を示し、ＳＷ１４６３、ＤＬＤ−１、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ−２は高い値を示した。つまり、ＫＲ１２が認識するコドン１２の変異を持つ細胞株では、ＩＣ５０が１００ｎＭ以下の低い値を示した。ＳＷ１４６３、ＤＬＤ−１、ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２はＫＲ１２が認識するコドン１２の変異を持たない細胞株であり、これらのＩＣ５０は１００ｎＭ以上の値を示した。図９に、ＫＲ１２が認識するコドン１２の変異を持たないＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＳＷ１４６３と変異を持つＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＬＳ１８０の濃度依存的細胞増殖抑制効果のグラフを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
６−１．細胞周期変化の解析
細胞周期を観察するために、処理した細胞と未処理の細胞をＤＮａｓｅフリーのＰＢＳで２回洗浄した後、７０％エタノール（冷凍）で固定した。固定した細胞は、１０ｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅＡ、５０ｇ／ｍＬ　ヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳで暗所に室温、３０分間放置して処理した。ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ　ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）のＦＬ−２Ｈフィルターを用いて蛍光強度を測定した。細胞周期の比率は、得られたデータをＣｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）で分析して決定した。細胞処理は、ＬＳ１８０を５０ｎＭ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３で７２時間処理及び長期処理実験として１４日間培養実験を行った。コントロールは１０％ＦＢＳ、０．１２５％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ培地で１４日間培養した。
実験結果は図１０Ａに示した。５０ｎＭのＫＲ１２で処理するとＬＳ１８０のＳ期の細胞が増加し、ＫＲ１２を長期投与するとＳｕｂＧ１期の細胞が顕著に増加していた。Ｓ期、Ｇ２Ｍ期は細胞周期の停止、ＳｕｂＧ１期は細胞死を示している。したがって、ＫＲ１２は濃度の増加に伴ってＬＳ１８０細胞を細胞周期の停止から細胞死に導くことが分かった。同様にコドン１２の変異を認識しないＫＲ１３の処理（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）では、Ｓ期の細胞及びＧ２Ｍがわずかに増加するが、長期投与でもＳｕｂＧ１期の増加は顕著でなかった。
６−２．ＤＮＡのフラグメント化による細胞死（アポトーシス）の確認
細胞処理は、ＬＳ１８０を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／３０ｍｍ　ｄｉｓｈでＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）＋１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１００μｇ／ｍｌ　Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）培養液で培養、５０ｎＭ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３で長期処理実験として１４日間培養実験及び７２時間投与後、コントロール１０％ＦＢＳ、０．１２５％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ培地で１１日間培養した群並びにコントロールの１０％ＦＢＳ、０．１２５％ＤＭＳＯ投与１４日培養群で検討した。それぞれの群の細胞をトリプシン処理後、細胞を回収、５０μｌのＰＢＳ溶液に撹拌、３μｌの１．５％ＴｒｉｔｏｎＸ（ｉｎ　ｗａｔｅｒ）と３μｌのＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ）を加え３７°Ｃで３０分間処理、つぎに３μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え３７°Ｃで３０分間処理、さらに１２μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加え、６５°Ｃで１０分間処理後すぐに２０μｌを２％アガロースゲルでＴＢＥ液、１００Ｖで電気泳動し、エチジウムで染色した。
実験結果は図１０Ｂに示した。長期投与において、コントロール処理（レーン１）、ＫＲ１３処理（レーン３）ではＤＮＡの断片化が見られなかったが、ＫＲ１２処理（レーン２）では細胞死によって誘導されるＤＮＡの断片化が見られた。７２時間処理群では、ＫＲ１２、ＫＲ１３ともにＤＮＡの断片化が見られなかった（レーン４、５）。このことは、ＫＲ１２の短期投与によりＬＳ１８０細胞の細胞死（アポトーシス）が誘導されるが、ＫＲ１３の長期投与および短期の投与では細胞死が誘導されないことを示唆している。
６−３．ＤＮＡ損傷とその修復、細胞死（アポトーシス）の誘導マーカーをウェスタン解析で検討
５０ｎＭ（０．１２５％ＤＭＳＯに溶解）のＫＲ１２、ＫＲ１３の１４日間の長期投与実験後のＬＳ１８０細胞を１×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒに溶解、１００度で５分処理後、蛋白量をＢｒａｄｆｏｒｄ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）で判定、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）にトランスファーし、５％ｄｒｙ　ｍｉｌｋをＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）ｐｌｕｓ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０をブロッキング剤として、ａｎｔｉ−γＨ２ＡＸ（２Ｆ３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡ）、ａｎｔｉ−ｐ５３（ＤＯ−１，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）、もしくはａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（２０−３３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）をそれぞれ加え、さらにＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧもしくはａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＡ）で処理した。２次抗体処理前に適宜１次抗体の洗浄を行った。その後ＴＢＳ　ｐｌｕｓ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＥＣＬ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）で蛋白質を同定した。
実験結果は図１０Ｃに示した。ＫＲ１２の長期投与により、ＤＮＡ損傷マーカーであるγＨ２ＡＸが誘導され、ｐ５３の誘導も見られた、さらにＰＡＲＰ蛋白が切断されていることより、細胞死（アポトーシス）が誘導されていることが認められる。ところがコントロール及びＫＲ１３の処理では顕著なＤＮＡ損傷、細胞死の誘導は認められない。蛋白量を確認するアクチンのバンドは揃っている。このことよりＫＲ１２の長期投与により、大腸がん細胞株にＤＮＡ損傷が誘導されさらに細胞死が誘導されていることが示唆される。
７．ＲＴ−ＰＣＲによる半定量的遺伝子発現解析
ＨＴ２９、ＬＳ１８０を１２穴プレートで培養した。翌日、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、ＫＲ１３で処理した後、４８時間培養して、細胞を集めてＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写用のｃＤＮＡを調製した。前記ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲのは９４℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。ＰＣＲ産物量はエチジウムブロマイドで染色した写真によって算出した。
ＰＣＲには下記のプライマーセットを使用した。
変異遺伝子も野生型も同時に増幅するフォワードプライマー（センス）とリバースプライマー（アンチセンス）および内部標準としてＲＰＳ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１８）遺伝子のフォワードプライマー（センス）とリバースプライマー（アンチセンス）を下記に示す。
ＫＲＡＳ遺伝子
フォワードプライマー（センス）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
リバースプライマー（アンチセンス）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
ＲＰＳ１８（内部標準）
フォワードプライマー（センス）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
リバースプライマー（アンチセンス）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
実験結果は、図１１に示した。ＨＴ２９（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が無い野生型）では、ＫＲＡＳ遺伝子の発現はＫＲ１２によって変化が見られなかった（図１１Ａ）。一方、ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が有り）では、ＫＲＡＳ遺伝子の発現はＫＲ１２投与で有意に抑制されていた（図１１Ｂ）。
８．コロニーシークエンス
６．５×１０４個の細胞を播いて、一晩培養した後、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、ＫＲ１３で処理した後、４８時間培養して、細胞を集めてＲＮＡを抽出した。前記抽出にはＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）ＲＴ−ＰＣＲを用いた。次に、抽出した前記ＲＮＡをテンプレートにＳｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に従って逆転写用のｃＤＮＡを調製した。前記ｃＤＮＡをテンプレートに配列番号７及び配列番号８のプライマーを用い、ＰＣＲは９４℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いてクローニングした。そして、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｊａｐａｎ）に形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、１ｍｇ　Ｘ−ｇａｌ、１ｍｇイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含むＬＢプレートで３７℃、一晩培養した。白いコロニーをコロニーダイレクトＰＣＲによって同定した。ＰＣＲ反応のサイクルは９４℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル行って、最後に７２℃で７分間の伸長反応を行った。下記のプライマーセットＭ１３−Ｆ１プライマーとＭ１３−Ｒ１プライマーを増幅に使用した。増幅したＤＮＡを、シークエンサーでシークエンス用プライマーＫＲＡＳ−２Ｒを用いて配列を解読し、一つ一つのコロニーのＫＲＡＳ遺伝子変異部位を同定した。
Ｍ１３−Ｆ１プライマー：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
Ｍ１３−Ｒ１プライマー：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
９．コロニーＰＣＲ
ＫＲＡＳコドン１２のＧＡＴ変異遺伝子（ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−ＦとＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｒ）と野生型遺伝子（ＫＲＡＳ−ＷＴ−ＦとＫＲＡＳ−ＷＴ−Ｒ）を特異的に増幅するプライマーを用いて直接前記白いコロニーの大腸菌細胞を用いてＰＣＲを行い、目的のバンドがどちらのプライマーセットで増幅するかで、変異ＫＲＡＳ遺伝子か野生型かをコロニーごとに判断した。
ａｌｌｅｌｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ（ＧＡＴ変異認識）
ＫＲＡＳ−ＷＴ−Ｆ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
ＫＲＡＳ　−ＷＴ−Ｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｆ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
ＫＲＡＳ−ＭＵＴ−Ｒ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
実験結果を表２−４に示した。コドン１２の変異ＫＲＡＳ遺伝子と変異していない野生型のＫＲＡＳ遺伝子を持つ、ヘテロ接合型の大腸がん細胞株ＬＳ１８０に対し、コドン１２の変異遺伝子を特異的にアルキル化すると考えられるＫＲ１２を投与後４８時間に、ＲＮＡを抽出し、ＫＲＡＳ遺伝子を定量的に増幅、ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキットにより、プラスミドにクローニングし、コンピテント細胞に導入、ＬＢ／ａｍｐ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレートによるブルー・ホワイトセレクションにより、インサートを持つ白色コロニーをピックアップし直接シークエンスするか、コロニーＰＣＲ法によりコドン１２の変異の有無をコロニーごとに検討した。ＬＳ１８０細胞においては、コロニーシークエンス法で、ＫＲ１２の投与によりＤＭＳＯでは均等に増幅される変異遺伝子と野生遺伝子の数がＫＲ１２投与群では変異遺伝子のコロニーが半分であり、ＫＲ１３ではむしろ増加した（表２）。同様にコロニーＰＣＲでもＫＲ１２投与により、変異がん遺伝子の発現の減少が確認できた（表３）。同様にヘテロ接合型のすい臓がん株ＰＡＮＣ−１においても表４に示す通り、コントロールでは、変異ＫＲＡＳ遺伝子が３倍近く高発現しているが、ＫＲ１２の投与により、その発現は野生型の遺伝子を同レベルに減少した。このことは、ＫＲ１２がＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にヘテロに変異を持つ細胞株で、変異遺伝子を優位に発現抑制していることを示す結果と言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
１０．ＲＡＳ活性測定
２×１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍプレートまたは１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍプレートの細胞数を完全栄養培地で培養し、翌日、細胞を５０ｎＭのＫＲ１２、ＫＲ１３で処理し、４８時間培養した後、細胞をマグネシウム溶解バッファー（ＭＬＢ）に溶解し、ＲＡＳ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を使ってＲＡＳ活性レベルを測定した。
実験結果を図１２、図１３に示す。ＨＴ２９（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が無い野生型）では、活性型のＫＲＡＳ蛋白質（ｐ２１−ｒａｓ蛋白質）はほとんど検出できなかった（図１３Ａ）。一方、ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２に変異が有り）では、活性型のＫＲＡＳ蛋白質が検出できた（図１２Ａ）。さらに、ＫＲ１２によって、検出したＫＲＡＳ蛋白質の活性は低下し（図１２Ａ）、細胞増殖も抑制された（図１２Ｂ）。この結果は、ＬＳ１８０においてＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異によって常に活性型のＫＲＡＳ蛋白質が発現していたところ、ＫＲ１２によって、変異遺伝子の発現が抑制され、活性型のＫＲＡＳ蛋白質が減少し、細胞死の誘導が促進されたと考えられる。
１１．ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＬＳ１８０を移植したヌードマウスにおけるＫＲ１２の腫瘍増殖抑制評価実験
細胞を含む下記３種類のＰＢＳ溶液をヌードマウスの大腿部の皮下に移植した後（ＨＴ２９を７匹、ＬＳ１８０を７匹、ＳＷ４８０を６匹）、腫瘍が生着し、腫瘍容積が約１００ｍｍ３になった時点で、３．４ｍｍｏｌのＫＲ１２（１．３６ｍＭのＫＲ１２をＤＭＳＯ２．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬに溶解）、ＤＭＳＯ／ＰＢＳコントロール（ＤＭＳＯ２．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬ）の各組成で薬剤を調整し、１０分間ソニケーション後、２００μＬをマウス尾静脈より投与した。体重、腫瘍の大きさは３日に１回計測し、腫瘍の大きさは０．５２×Ｌ×Ｗ×Ｄ（１／６×π×Ｌ×Ｗ×Ｄ）の方法で測定した。
ヌードマウスへ移植した細胞株の詳細は下記の通りである。
ＨＴ２９（ＫＲＡＳ−ＷＴ）：（２×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰＢＳを皮下に移植、ＫＲＡＳコドン１２野生株でコドン１２の変異を持たない細胞株）
ＳＷ４８０（ＫＲＡＳ−ＭＵＴｈｏｍｏ）：（５×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰＢＳを皮下に移植、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異Ｇ１２Ｖをホモでもつ細胞株）
ＬＳ１８０（ＫＲＡＳ−ＭＵＴｈｅｔｅｒｏ）：（３×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌＰＢＳを皮下に移植、ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異Ｇ１２Ｄをヘテロでもつ細胞株）
実験結果は図１４に示した。その結果、コドン１２の変異を持たないＨＴ２９細胞に対してはＫＲ１２の投与による腫瘍の増殖を抑制することはできなかった（図１４Ａ）が、コドン１２の変異をホモで持つＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにおいてＫＲ１２の投与によって腫瘍の大きさは顕著に縮小した（図１４Ｃ）。ＫＲ１２の変異アレルと野生型をヘテロに持つＬＳ１８０細胞を移植したヌードマウスもＫＲ１２の投与によって有意な腫瘍の増殖抑制が見られた（図１４Ｂ）。ＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにＤＭＳＯ／ＰＢＳコントロールを投与した場合、腫瘍の大きさは拡大するばかりであったのに対して、ＫＲ１２を投与すると２カ月後には腫瘍の大きさが有意に縮小し、３カ月後には腫瘍が極めて小さく硬い硬結となった（図１４Ａ−Ｃ、剖検時（３カ月後もしくは腫瘍が直径２ｃｍ以上になった時）の写真）。
コントロールとしてＤＭＳＯ／ＰＢＳの代わりにコドン１２の変異を認識しないＰＩＰ−インドール−ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（ＫＲ１３）および８．４ｍｍｏｌのｓｅｃｏＣＢＩ（３．３６ｍＭのＣＢＩをＤＭＳＯ２．５μＬとＰＢＳ１９７．５μＬに溶解）を用いて、上記１１と同じ手法で実験を行った結果を図１５に示す。ＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにＫＲ１２は、ＫＲ１３を投与した場合よりも有意に高い癌腫瘍抑制効果を示した。また、ｓｅｃｏ−ＣＢＩでは認められた体重減少傾向がＫＲ１２およびＫＲ１３では認められなかった。つまり、ＫＲ１２は、Ｇ１２Ｄ変異配列を認識しないＫＲ１３が示さない腫瘍増殖抑制を認めかつ体重減少や健康状態の異常といった副作用を引き起こさない結果が得られた。また、ＫＲ１２を投与したヌードマウスは、毛の逆立ち、摂餌量の低下、運動量の減少、異常行動等も見られなかった。
１２．細胞局在解析
Ｃ１２ＤＰのＮ末端にβアラニンを導入し、続いてＦＩＴＣのカップリングを行った。ＦＩＴＣのカップリングは、４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ、ＨＣＴＵをＤＭＦに溶解したものをカラムに通して６０分振とうして行った。ＬＳ１８０細胞は、ＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）＋１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１００ｇ／ｍｌ　Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）培養液で培養し、約５０％コンフルエンスの状態で、ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）を添加し、２時間後に封入（ＶＥＣＴＯＲ　ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）し、ＤＡＰＩによる核染色を行いコンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ−ＳＰＥ）で観察した。
実験結果は図１６に示した。ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）をＬＳ１８０細胞の培養培地内に投与後２時間で確認したところＬＳ１８０細胞の核内に蛍光集積が見られ、ＫＲ１２が大腸がん培養細胞の核内に移行し、局在することが確認された。
１３．癌幹細胞への標的性試験
２種類の大腸がん細胞株ＳＷ４８０細胞とＬｏＶｏ細胞を用いて実験を行った。それぞれ２×１０５個をＳｐｈｅｒｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ：ＤＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓ　Ｆ−１２培養液にＢ２７（ミルテニー社、２％）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬを添加した培養液）とともに培養し、４日目にＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）もしくはＤｏｘｉｓｏｒｂｉｃｉｎ（１μＭｏｌ）を添加し、一時間後にＰＢＳで２度洗浄し、再びＳＦＭで培養を始め、０時間、４時間、２４時間に封入し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＰｒｏＬｏｎｇ（Ｒ）　Ｇｏｌｄ　Ａｎｔｉｆａｄｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ））、コンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ−ＳＰＥ）で観察した。
実験結果は図１７に示した。ＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１μＭｏｌ）を癌幹細胞のモデルであるスフェア形成した大腸癌に投与した結果、スフェア内細胞の核内に蛍光が見られた。そして、蛍光は２４時間後も持続して観察された。ドキソルビシンのような低分子化合物は、ＡＢＣトランスポーターの活性化したスフェア形成大腸癌細胞から、速やかに排泄されることが知られている。これに対して、ＫＲ１２の示した結果は、長時間排泄されることなく、細胞の核内に滞在していた。このことは、ＫＲ１２が、癌幹細胞の核内に到達するため、薬剤耐性のメカニズムに拠る薬剤排泄機構の影響を受けにくく、癌幹細胞治療にも有効である可能性を示唆している。ＫＲ１２が核内に移行するのは、ＰＩＰ構造上の脂溶性部分から細胞内に取り込まれやすく、細胞質から速やかに核内に移行し、ＤＮＡに結合する性質を有するためであると考えられる。よって、本発明で用いた複合体がＰＩＰの機能により、薬剤送達技術であるＤＤＳを特別に必要としないことを示すものであり、ＰＩＰ自体が様々な小分子化合物を特定のゲノムに送達させるＤＤＳになることを裏付けるものである。
１４．腫瘍蓄積性試験
４週齢で購入したメスＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに対し、５週齢時に５ｘ１０６のＳＷ４８０細胞を皮下に移植後、腫瘍が直径１５ｍｍに達した時にＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１０ｎｍｏｌを１．２５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）もしくはＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｋｇを１．２５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）、１．２５％ＤＭＳＯを２００μｌ尾静脈より投与し、インビボイメージングシステム（ＮＩＰＰＯＮ　ＲＯＰＥＲ：Ｌｕｍａｚｏｎｅ　ＦＡ）で０時間から２時間おきに１０時間まで撮影し、１日後３日後にも蛍光レベルとマウス個体を撮影した（図１８）。さらに同様の処理を行ったマウスを２４時間後に解剖し、それぞれの臓器及び腫瘍を取り出し、インビボイメージングシステム（ＮＩＰＰＯＮ　ＲＯＰＥＲ：Ｌｕｍａｚｏｎｅ　ＦＡ）で撮影した（図１９）。また同様のヒト大腸がん皮下移植マウスに１ｍｇ／ｋｇのＦＩＴＣ標識したＫＲ１２（１．２５％ＤＭＳＯ（２００μｌ）に溶解）、１．２５％ＤＭＳＯを　２００μｌ尾静脈より投与し、２４時間後に腫瘍を摘出しＯＣＴコンパウンドにいれ凍結、１０ミクロンの凍結切片をＬＥＩＣＡ　ＣＭ１５１０Ｓで作成し、コンフォーカル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ−ＳＰＥ）で観察した（図２０）。
実験結果は図１８−図２０に示した。ＳＷ４８０細胞を移植したヌードマウスにＦＩＴＣで蛍光標識したＫＲ１２（１０ｎＭｏｌ）を静脈内に投与し、その後蛍光イメージで経時的に観察した結果、ＫＲ１２は全身に分布した後、腫瘍に集積を残し、肝臓、腎臓より徐々に排出されるという腫瘍集積性を示した（図１８）。さらに静脈注射後の全身から腫瘍へ経時的に蓄積され、投与してから３日後にも腫瘍で蛍光が認められた。そして、投与後２４時間でマウスを解剖し、各臓器のＦＩＴＣの取り込みを観察したところ、腫瘍で最も強い蛍光が確認され、他の臓器（心臓、胃、膵臓、脾臓、肺、脳）では蛍光が見られないか、または蛍光が低く、ほとんど排泄されていた（図１９）。また、腫瘍、肝臓、腎臓の各細胞におけるＫＲ１２の局在を蛍光顕微鏡で確認したところ、核内に蛍光が確認された（図２０）。マウス尿中、胆汁中においてＫＲ１２とその分解産物の有無を質量分析したところ、ＫＲ１２は代謝分解を受けない状態で排泄されていた。腫瘍細胞では細胞分裂に伴い細胞膜等の合成に脂質が必要であり、一般的に脂質の取り込みが増加する、またリンパ管を介した排泄が未発達である。このことにより、ＫＲ１２の特異的な腫瘍蓄積性は、ＫＲ１２の有するＰＩＰの脂溶性部分が、ＫＲ１２の癌細胞内への取り込みを促進し、ＫＲ１２の腫瘍内からの排出を妨げたことによると考えられる。正常細胞でもＫＲ１２の肝臓、腎臓への集積性は認められるが、細胞内に留まることができないため、胆汁中・尿中に排泄され、これらの臓器から排泄される。つまり、ＫＲ１２は、正常細胞からは速やかに排泄され、癌細胞に対しては長期に滞留するという優れた効果を備えている。
１．概要
ＡＬＫ遺伝子は、肺癌の原因となる融合遺伝子を形成したり、神経芽腫において、恒常的に活性化する点変異を有し、癌化を促進するドライバーオンコジーン遺伝子である。ＡＬＫ阻害剤がＡＬＫ遺伝子の変異を持つ癌細胞に有効であることは知られているが、多くの場合癌細胞はＡＬＫ阻害剤に耐性となり、再発することが多い。神経芽腫におけるＡＬＫ遺伝子変異Ｆ１１７４Ｌ（３５２２Ｃ＞Ａ）は、神経芽腫細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＭＳ−ＳＡＮ、ＫＥＬＬＹ、ＬＡＮ−１において認められている。そこで、この変異配列を特異的に認識する１０塩基認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物ＡＬＫ−ＦＬ−１をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した（図２１）。
２．ＡＬＫ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の合成
ＡＬＫ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＡＬＫ−ＦＬ−１）の化学構造は以下の化学式で表される（図２２）。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。Ｆ１１７４Ｌ（３５２２Ｃ＞Ａ）変異は１０塩基を認識するＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩで野生型の５’−ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡ−３’配列の３’側から２番目のグアニンを認識できないピロールを配置することで変異型５’−ＴＧＧＴＧＧＴＴＴＡ−３’を認識させる化合物として設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
３．神経芽腫細胞、乳癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、Ｋｅｌｌｙ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル　ｐｌａｔｅに各細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添加、混和した。再び３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３７℃、５％ＣＯ２、飽室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＭＴＰ−３１０　Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ　ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後、ＩＣ５０値を算出した。
実験結果は、図２３、表５に示した。ＡＬＫ−ＦＬ−１を投与すると、Ｆ１１７４Ｌ変異を有する神経芽腫細胞で高い細胞増殖抑制効果を示した（図２３Ａ）。具体的には、Ｋｅｌｌｙ細胞株ではＩＣ５０が０．０９ｎＭ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株ではＩＣ５０が０．１３ｎＭがあったのに対して、野生型の神経芽腫であるＩＭＲ−３２細胞株ではＩＣ５０は０．４６ｎＭ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株ではＩＣ５０は２．６ｎＭ、Ｆ１１７４Ｌ変異を有さない乳癌細胞（ＡＬＫ遺伝子野生型）であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のＩＣ５０は７．５ｎＭであった（図２３Ａ−Ｄ、表５）。以上のことから、ＡＬＫ−ＦＬ−１は、Ｆ１１７４Ｌ変異を持つ神経芽腫細胞株に対して特異的により強い増殖抑制を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
１．概要
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、エキソン１０のヘリカルドメインにあたるＥ５４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋとエキソン２１のキナーゼドメインにあたるＨ１０４７Ｒの３か所のホットスポットに変異が集中し、それらの変異は、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝癌および脳膠芽腫で高頻度に生じることが報告されている。一方で点変異を伴わないＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の増幅は、頸癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌で認められている。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、ＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔ経路で、癌ドライバー遺伝子として働くため、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を標的にしたＰＩ３Ｋ阻害剤が開発されているが、毒性の問題等により未だ臨床応用に至っていないのが現状である。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）変異は、乳癌細胞株ＭＣＦ７で認められている。そこで、この変異配列を特異的に認識する９塩基認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１とＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した（図２４）。
２．ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の合成
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１）の化学構造は以下の化学式で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである（図２５、２６）。Ｅ５４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）変異を認識させるため５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡ−３’を認識するＰＩＰ−Ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏ−ＣＢＩをデザインした。　この化合物は野生型の５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡ−３’を３｀から２番目のシトシンが認識できず、３｀のアデニンをアルキル化できないが変異配列ではアルキル化できるよう設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
３．乳癌細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地とＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル　ｐｌａｔｅに各細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添加、混和した。再び３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３７℃、５％ＣＯ２、飽室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＭＴＰ−３１０　Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ　ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後、ＩＣ５０値を算出した。
実験結果は、図２７に示した。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ（１６３３Ｇ＞Ａ）の変異を有する乳癌細胞株であるＭＣＦ７に対して、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１はＩＣ５０が５３．８ｎＭ、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−２は＞１００ｎＭであった（図２７Ａ）。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子が野生型である乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、Ｐ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１はＩＣ５０が＞１００ｎＭであった（図２７Ｂ）。これらの結果から、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＥ５４５Ｋ変異癌細胞株に対して作製されたＰ３Ａ−Ｅ５Ｋ−１は有意にＥ５４５Ｋ変異乳癌細胞株で腫瘍増殖抑制効果が変異のない乳癌細胞株に比べ有意に強いことが明らかになった。
１．概要
癌細胞特異的な変異として、点変異や転座ではなく遺伝子配列の変化を伴わない、遺伝子の増幅がある。これはコピーナンバーチェンジ変異と言われ、特定のがん関連遺伝子の領域が増幅し、結果としてがん遺伝子の発現量が上昇することで癌化を促すものである。我々は本発明のように特定のゲノム配列をアルキル化する化合物が、増幅してコピー数が多くなった遺伝子を標的にして作成した場合も効果を発揮すると考え小児の神経芽腫等で高頻度に増幅し、予後不良因子となるＭＹＣＮを標的としたＭＹＣＮアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）を合成した。ＭＹＣＮ遺伝子は、神経芽腫において高頻度に増幅する遺伝子で、神経芽腫のドライバーオンコジーン遺伝子と考えられている。このＭＹＣＮ遺伝子に対し、図２に示ように８塩基を認識するＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２）及びエキソン３の配列を特異的に認識する９塩基認識のＰＩＰ−ｉｎｄｏｌｅ−ｓｅｃｏＣＢＩ化合物（ＭＹＣＮＡ３）（図２８）をＫＲ１２の合成と同様の方法で合成した。
２．ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）の合成
ＭＹＣＮ遺伝子のアルキル化ＰＩＰ（ＭＹＣＮＡ１、ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３）の化学構造は以下の化学式で表される。本発明の化合物の作製方法は以下のとおりである。カルボン酸末端を持つＰＩＰをＤＭＦ１００μＬに溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５μＬ、２．８６μｍｏｌ）とＰｙＢＯＰ（１．０ｍｇ、１．９５μｍｏｌ）を加えた。反応溶液を撹拌しながら室温で２時間反応させた後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの活性体が出来ているかをＨＰＬＣで確認した。確認後、ＮＨ２−インドールｓｅｃｏ−ＣＢＩ（０．６ｍｇ、１．５８μｍｏｌ）を反応容器に加え、室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌し、溶媒であるＤＭＦを除き、残渣をジクロロメタンとジエチルエーテルで分液した。反応物の層はＨＰＬＣにより精製し（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、３０−７５％リニアグラジエント、０~３０分間）、凍結乾燥により目的化合物であるアルキル化ＰＩポリアミド、ＭＹＣＮＡ１が白い粉末で得られた（図２９）。ＭＹＣＮＡ２、ＭＹＣＮＡ３も同様の方法で得られた（図３０、３１）。ＭＹＣＮを標的としたＰＩＰの設計方法は図２に示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
３．Ｉｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡による細胞増殖及び細胞形態の確認
細胞を９６穴プレートで１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて２４時間培養し、翌日、ＤＭＳＯコントロール、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭのＭＹＣＮＡ１を添加した培養液に取り換え、細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡（Ｅｓｓｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で６時間おきに観察した。成長曲線はＩｎｃｕｃｙｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いたイメージングプレートから作成した。実験に用いた細胞は、ＭＹＣＮ領域の増幅が見られる神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２細胞（ＭＹＣＮ２５コピー）、ＴＧＷ細胞（ＭＹＣＮ６０コピー）であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。
成長曲線の結果は図３２に示した。ＭＹＣＮ遺伝子が高発現しているＩＭＲ−３２細胞、ＴＧＷ細胞はＭＹＣＮＡ１によって濃度依存的に細胞増殖が抑制されていた（図３２）。
４．神経芽腫細胞に対する細胞毒性試験と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定
実験はＫＲ１２を用いた場合と同様にして行った。実験に用いた細胞は、ＩＭＲ−３２細胞、ＴＧＷ細胞であり、それぞれＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔ培地で培養した。９６ウェル　ｐｌａｔｅに各細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ウェル播種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて２４時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍに試薬（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１，３，１０，３０，１００ｎＭ）を希釈後、５０μｌ／ウェル添加、混和した。再び３７℃、５％ＣＯ２、飽湿条件下にて７２時間培養した。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１０μｌ／ウェル添加、混和後、３７℃、５％ＣＯ２、飽室条件下にて２時間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＭＴＰ−３１０　Ｌａｂ（ＣＯＬＯＮＡ　ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ）にて吸光度を測定後、ＩＣ５０値を算出した。
実験結果を図３３に示した。ＭＹＣＮＡ１のＩＭＲ−３２細胞に対するＩＣ５０は９．７ｎＭであり、ＴＧＷ細胞に対しては１２．９ｎＭがあった。ＭＹＣＮＡ２のＩＭＲ−３２細胞に対するＩＣ５０は１２．１ｎＭであり、ＴＧＷ細胞に対しては１１．２ｎＭがあった。つまり、ＭＹＣＮＡ１およびＭＹＣＮＡ２は低濃度でＭＹＣＮ遺伝子の発現が高い癌細胞の増殖抑制を誘導できるものと考えられる。
図３４は、ＭＹＣＮＡ３を使用して、ＩＭＲ−３２細胞（ＭＹＣＮ増幅有り、神経芽腫細胞）、ＴＧＷ細胞（ＭＹＣＮ増幅有り、神経芽腫細胞）、ＮＢ６９細胞（ＭＹＣＮ増幅無し、神経芽腫細胞）、ＭＣＦ７細胞（乳癌細胞）、ＨＴ２９細胞（大腸癌細胞）、ＨＤＦ細胞（角膜上皮皮膚繊維芽細胞）に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した結果とＩｎｃｕｃｙｔｅ培養タイムラプス顕微鏡（Ｅｓｓｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で細胞増殖を観察した結果（ＭＹＣＮＡ３処理７２時間後）である。表６は、０．３−３００ｎＭ、７２時間処理条件で行った細胞増殖測定試験の結果である。これらの結果、ＩＭＲ−３２細胞でＩＣ５０が１．１ｎＭ、ＴＧＷ細胞で３．７ｎＭ、ＭＢ６９細胞で７７．０ｎＭ、ＭＣＦ７細胞で１５２．２ｎＭ、ＨＴ２９細胞で２３９．６ｎＭ、ＨＤＦ細胞で５６．６ｎＭと神経芽腫細胞、特にＭＹＣＮ増幅を伴う神経芽腫細胞で増殖抑制が見られる結果であった。このことから、ＭＹＣＮＡ３の細胞増殖抑制効果はＭＹＣＮ増幅を伴う神経芽腫細胞で特に高く、他の癌種やＭＹＣＮ増幅の見られない神経芽腫、正常組織由来の細胞株では効果が低いことが分かった（図３４、表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　配列番号１：合成ＤＮＡ、
　配列番号２：合成ＤＮＡ、
　配列番号３：合成ＤＮＡ、
　配列番号４：合成ＤＮＡ、
　配列番号５：合成ＤＮＡ、
　配列番号６：合成ＤＮＡ、
　配列番号７：合成ＤＮＡ、
　配列番号８：合成ＤＮＡ、
　配列番号９：合成ＤＮＡ、
　配列番号１０：合成ＤＮＡ、
　配列番号１１：合成ＤＮＡ、
　配列番号１２：合成ＤＮＡ、
　配列番号１３：合成ＤＮＡ、
　配列番号１４：合成ＤＮＡ、
　配列番号１５：合成ＤＮＡ、
　配列番号１６：合成ＤＮＡ、
　配列番号１７：合成ＤＮＡ。

Claims (30)

  1. 　ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するＤＮＡ結合化合物と、アルキル化剤との複合体。
  2. 　遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化及び／または遺伝子コピー数の変化である、請求項１に記載の複合体。
  3. 　ドライバーオンコジーンが、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥＴ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子から選ばれる少なくとも１つである、請求項１および２のいずれか１項に記載の複合体。
  4. 　ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白、およびＤＮＡ結合蛋白複合体のいずれかである、請求項１~３のいずれか１項に記載の複合体。
  5. 　アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、請求項１~４のいずれか１項に記載の複合体。
  6. 　アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、請求項５に記載の複合体。
  7. 　請求項１~６のいずれか１項に記載の複合体を含む、ドライバーオンコジーン遺伝子変異特異的アルキル化剤。
  8. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  9. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  10. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  11. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  12. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  13. 　下式で表される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  14. 　請求項８に記載の複合体を含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２変異アルキル化剤。
  15. 　請求項９に記載の複合体を含むＡＬＫ遺伝子Ｆ１１７４Ｌ変異アルキル化剤。
  16. 　請求項１０および１１のいずれか１項に記載の複合体を含むＰＩＫ３ＣＡ遺伝子Ｅ５４５Ｋ変異アルキル化剤。
  17. 　請求項１２および１３のいずれか１項に記載の複合体を含むＭＹＣＮ遺伝子増幅変異アルキル化剤。
  18. 　請求項１~６および８~１３のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
  19. 　医薬組成物が抗癌剤である請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 　請求項１~６および８~１３のいずれか１項に記載の複合体を含むキット。
  21. 　請求項１~６および８~１３のいずれか１項に記載の複合体を含む研究試薬キット。
  22. 　請求項１~６および８~１３のいずれか１項に記載の複合体を含む治療用キット。
  23. （１）ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位に特異的に結合するようにＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
    （２）設計した前記ＤＮＡ結合化合物とアルキル化剤とを結合させる工程を含む、
    ドライバーオンコジーンの遺伝子変異部位を特異的にアルキル化する複合体の製造方法。
  24. 　遺伝子変異部位が遺伝子配列の変化または遺伝子コピー数の変化である、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 　ドライバーオンコジーンが、ＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＬＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＬＴ３、ＭＥＴ、ＢＣＬ２、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１／２、ＴＰ５３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＲＢ１、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、Ｐ１６、ＭＥＮ１、ＲＥＴ、ＣＤＨ１、ＳＴＫ１１、ＰＴＣＨ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＥＴ、並びに癌の遺伝子変異データベースに登録される遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項２３および２４のいずれか１項に記載の製造方法。
  26. 　ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白、およびＤＮＡ結合蛋白複合体のいずれかである、請求項２３~２５のいずれか１項に記載の製造方法。
  27. 　アルキル化剤が、ＤＮＡの特定の塩基配列に対して、アルキル化能を有する官能基を有する化合物である、請求項２３~２６のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
  28. 　アルキル化剤がｓｅｃｏＣＢＩである、請求項２７に記載の製造方法。
  29. 　請求項２３~２８のいずれか１項に記載の製造方法で得られた複合体の医薬組成物の製造のための使用。
  30. 　請求項２３~２８のいずれか１項に記載の製造方法で得られた複合体の抗癌剤の製造のための使用。
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