JP2003505521A - 合成ポリアミドによる癌遺伝子転写の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 癌遺伝子の転写の阻害能を有するポリアミドが提供される。芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３の相補対を含む好ましいポリアミドは二本鎖ＤＮＡの小溝に結合する。各ポリアミドについて、いくつかのまたはすべてのポリアミド芳香族カルボキサミド残基を相補対合に付し、癌遺伝子のプロモーター領域にある同定されているｄｓＤＮＡ標的の標的ヌクレオチド配列を決定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、１９９８年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／０９９
８５４号（本発明の一部として参照する）の優先権を主張する。 本発明は内因性癌遺伝子の発現を防止するための遺伝子のプロモータ領域内に
位置する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の小溝中の所定のヌクレオチド配列に結合
する特定のポリアミドに関する。

【０００２】 （背景技術） チロシンキナーゼ膜成長因子受容体ＨＥＲ２／ｎｅｕは、ｐ１８５ＨＥＲ２と
もいい、卵巣、子宮内膜、卵管および子宮頚管などの女性生殖系腺癌を含むヒト
乳癌の２０ないし３０％において過剰発現され、増幅される同じ名前の細胞癌遺
伝子によりコードされる。Ｂａｅｒｔ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
７０、５９０−５９７（１９９７）；Ｂｅｎｚ、Ｃ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１５、１５１３−１５２５（１９９７）；Ｃｈａｎｇ、Ｃ．Ｈ．ら、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ １４、１６１７−１６２２（１９９７）；Ｓｃｏｔｔ、Ｇ．Ｋ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１９８４８−１９８５８（１９９４）；Ｐａｓ
ｌｅａｕ、Ｆ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８、８４９−８５４（１９９３）；Ｔａ
ｌ、Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
７、２５９７−２６０１（１９８７）参照。

【０００３】 ｎｅｕ癌遺伝子産物は、最初、齧歯類において化学的に誘発された（エチルニ
トロソ尿素）腫瘍において記載された。その後、ヒト同等物であるｃ−ｅｒｂＢ
−２またはＨｅｒ−２／ｎｅｕがＥＧＦ受容体、蛋白チロシンキナーゼ活性を有
する１８５ｋＤａ膜貫通型蛋白と相同であることが見いだされた。ＨＥＲ２／ｎ
ｅｕの過剰発現は、腫瘍が転移してその結果として患者の予後が悪くなる可能性
があることに関連する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子の突然変異、増幅、および
過剰発現は乳癌進行、初期転移および予後不良と関連することが報告されている
。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅は、リンパ節転移と直接関連する。さらに、
動物モデルにおいて、突然変異の活性化は急速な腫瘍進行につながる。その結果
、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ蛋白は細胞運動性に関与し、したがって転移に関与する可
能性があると考えられている。このように、ＤＮＡレベルでの直接的干渉による
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子発現の阻害は転移性疾患の有効な療法である可能性が
ある。

【０００４】 いくつかの転写因子、例えばＥＳＸ、ＡＰ−２およびＴＢＰはこの受容体の発
現の調節において重要な役割を果たす。Ｂａｅｒｔら、前出；Ｂｅｎｚら、前出
；Ｃｈａｎｇら、前出；Ｂｏｓｈｅｒ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、７４４−７４７（１９９５）参照。これらの転写
因子はＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター内の部位との結合によりｐ１８５ＨＥＲ２
の発現を活性化する。ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのヌクレオチド配列および
概略図を図１に示す。ＥＳＸ結合部位とＴＢＰ結合部位（ＴＡＴＡボックス）は
互いに近接し、ＯＢ２−１（ＡＰ−２転写因子ファミリーの要素）部位は約１８
０塩基対さらに上流に位置する。

【０００５】 ＥＳＸは転写因子のＥｓｔファミリーに属する。Ｅｓｔ蛋白はへリックス−タ
ーン−へリックスモチーフ（ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ）
において結合部位の側面上の小溝に接するＤＮＡの主溝に結合する。Ｋａｒｉｍ
、Ｆ．Ｄ．ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９０、１４
５１−１４５３（１９９０）；Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ、Ｌ．Ｗ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ １５、１２５−１３４（１９９６）；Ｇｒａｖｅｓ．Ｂ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ １９９６、３８４、３２２；Ｎｙｅ、Ｊ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９２、９７５−９９０（１９９２）；Ｋｏ
ｄａｎｄａｐａｎｉ、Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０、４５６−４６０（１９９
６）。

【０００６】 対照的に、ＡＰ−２はＤＮＡの主溝に二量体として結合する；すなわち、その
ＤＮＡ結合領域はロイシンジッパー蛋白と同様にして構成される。Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ、Ｔ．＆Ｔｊｉａｎ、Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１、１０６７−１０７１（
１９９１）。ＤＮＡ結合ならびに蛋白／蛋白相互作用（二量化）の原因となる構
造要素はへリックス−スパン−へリックスモチーフ（ｈｅｌｉｘ−ｓｐａｎ−ｈ
ｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ）からなると予想される。約８０アミノ酸からなるスパン
サブユニットがＤＮＡの小溝と接するかどうかは明らかではない。

【０００７】 ＴＢＰはほとんどの蛋白コード化遺伝子の活性化に関与する転写因子である。
ＴＢＰは二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）の小溝と相互作用するＤＮＡ結合蛋白
である。ＥＳＸ、ＡＰ−２、およびＴＢＰとは別に、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよび他
の癌遺伝子プロモーター内に他の潜在的な転写因子結合部位があることに注意し
なければならない。 生体細胞における遺伝子発現を妨げる方法を考案するために、この研究から治
療法が得られることを期待して当業界においてかなりの工夫がなされてきた。こ
れらの方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞中に導入することによる
か、またはリボザイムによる特定のＲＮＡの分解により、メッセンジャーＲＮＡ
の蛋白中への翻訳を妨害することを含む。遺伝子転写を直接阻害するいくつかの
方法が試みられてきた；これらは、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド、
所定の配列を認識するデザインされたかまたは選択された亜鉛フィンガーペプチ
ド、およびＤＮＡ結合カリシェミシンオリゴ糖を含む。

【０００８】 遺伝子発現の妨害に基づく任意の治療法を効果的にするためには、治療薬はい
くつかの基準を満たさなければならない；第一に、薬剤は一般的な細胞毒性を有
してはならない；第二に、薬剤は細胞透過性でなければならず、ＤＮＡ結合剤の
場合においては、化合物は核に移動し、細胞クロマチンに関してその標的配列に
高い親和性および特異性を持って結合しなければならない；第三に、薬剤のその
ＤＮＡ標的配列への結合は、遺伝子転写を妨害しなければならない。前記の有効
な方法のそれぞれには独自の条件がある。たとえば、三重らせん形成オリゴヌク
レオチドは配列選択性についての可能性を有し、インビトロで有効に転写を阻害
できるが、これらの分子は細胞透過性が不十分で、有効な遺伝子阻害のためには
透過可能にされた細胞を用いられなければならない。同様に、亜鉛フィンガーペ
プチドは直接細胞中に侵入できないので、これらのペプチドは適当なウイルスま
たは非ウイルス発現ベクターを用いた遺伝子療法により導入されなければならな
い。対照的に、カリシェミシンオリゴ糖は細胞膜を通過するのに十分疎水性であ
るが、これらの分子は非常に制限された配列特異性（４ｂｐ）を有し、非常に低
い親和性でＤＮＡと結合する（蛋白ＤＮＡ相互作用には１００μＭまたはそれ以
上必要）。このように、高度のＤＮＡ配列特異性と親和性を有する新種の細胞透
過性分子がヒト遺伝子治療法を実行可能にするために必要である。

【０００９】 さらなる方法は、特定のＤＮＡ配列を標的とする細胞透過性低分子を利用する
。これらの分子は遺伝子発現の調節に有用である。ＤＮＡ二重らせん中の特定の
配列を認識する低分子合成ＤＮＡ結合リガンドのデザインすることが化学の分野
での長い間の目標であった。三重らせんの形成により二重らせんＤＮＡの主溝を
認識するオリゴデオキシヌクレオチドは広範囲の配列と高い親和性および特異性
で結合する。オリゴヌクレオチドおよびその類似体が遺伝子発現を妨害すること
が証明されているが、三重らせん法はプリントラックに限定され、細胞取り込み
が不十分である。

【００１０】 他の低分子もＤＮＡ結合リガンドとして重要である。Ｗａｄｅらは、二量体サ
イドバイサイドモチーフ（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ｍｏｔｉｆ）により５’
−（Ａ，Ｔ）Ｇ（Ａ，Ｔ）Ｃ（Ａ，Ｔ）−３’配列の小溝において結合するペプ
チドのデザインを報告している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、８７８
３−８７９４（１９９２））。Ｍｒｋｓｉｃｈらは、デザインされたペプチド１
−メチルイミダゾール−２−カルボキサミドネトロプシンによるＤＮＡの小溝に
おける配列特異性認識のための逆平行サイドバイサイドモチーフを報告している
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、７５８６−７５９０
（１９９２））。Ｐｅｌｔｏｎ、Ｊ．Ｇ．＆Ｗｅｍｍｅｒ、Ｄ．Ｅ．は二次元Ｎ
ＭＲによる２−１ジスタマイシンＡ−ｄ（ＣＧＣＡＡＡＴＴＴＧＧＣ）複合体の
構造の特徴化を報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６、５７２３−５７２７（１９８９））。

【００１１】 Ｄｅｒｖａｎと共同研究者らは、合成ピロール−イミダゾールポリアミドが優
れた特異性と多くの配列特異性転写因子の親和性を越える非常に高い親和性でＤ
ＮＡと結合することを証明した（Ｔｒａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２、５
５９−５６１（１９９６））。彼らは更に、１ナノモル以下の濃度でデザインさ
れたリガンドによるＤＮＡの認識を記載する。ＤＮＡ認識は小溝におけるイミダ
ゾール−ピロールまたはピロール−ピロール対のサイドバイサイドアミノ酸対合
に依存する。Ｗｈｉｔｅ、Ｓ．ら（１９９６）は、ＤＮＡの小溝におけるピロー
ル−イミダゾールポリアミド認識のＡ・Ｔ／Ｔ・Ａ縮重の影響を報告している（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、６１４７−６１５２（１９９６））。Ｗｈｉ
ｔｅら（１９９７）は、ピロール−イミダゾールポリアミドによるＤＮＡの小溝
における認識についての対合則を報告し（Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．４、５６９−
５７８）、小溝におけるポリアミド結合についての５’−３’−Ｎ−Ｃ配向優先
性を明らかにした。このように、ポリアミド分子は小溝において蛋白ＤＮＡ相互
作用の阻害物質として作用する可能性を有する。

【００１２】 Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）およびＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）アミノ酸
由来の小溝結合ポリアミドについての対合則の発展により、配列特異性を賦与す
るさらなる意味が得られる。Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ・ＣとＣ・Ｇを識別し、これらの
いずれをもＡ・ＴまたはＴ・Ａ塩基対から識別し、一方Ｉｍ／ＰｙはＣ・Ｇ塩基
対を標的とする。Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ・ＴとＧ・Ｃを特定するが、Ａ・ＴとＴ・Ａ
を識別しない。この配列特異性ＤＮＡリガンドの合理的デザイン法の一般性は直
接的ＮＭＲ構造研究（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６、６
４６−６５０（１９９４））および見かけの解離定数が０．０３ｎＭである６塩
基対配列を標的とする８リングヘアピンポリアミドの合成に最近成功したことに
より支持される。さらに、１つのアミノ酸残基で配列が異なる２つの８リングピ
ロールーイミダゾールポリアミドはそれぞれ配列の１つの塩基対が異なる６塩基
対標的部位と特異的に結合する。１つの窒素原子をＣ−Ｈと置換することにより
特異性および親和性を１００倍阻害することができる。

【００１３】 ６塩基対配列はヒトゲノムにおいて非常に多い（４キロベースごとに１回ラン
ダムに起こるか、またはヒトゲノムにおいて５０００００倍）ので、ポリアミド
は非常に長い配列を認識するように合成される。たとえば、１２リング二重ヘア
ピンポリアミドは１２ｂｐ部位を標的とするようにデザインされ、ナノモル親和
性での結合が観察される。このような配列１６００００００塩基対ごとに１回の
みランダムに起こるか、またはヒトゲノムにおいて１２５倍である。このような
分子は、前記のような条件を満たすことができるならばインビボでの遺伝子転写
の特異的阻害物質として、またヒト治療薬として作用する可能性を有する。

【００１４】 （発明の要約） 本発明は遺伝子、特に癌遺伝子の転写を低減することにより、遺伝子発現また
は過剰発現を調整または調節する方法および組成物に関する。特定の個々の標的
癌遺伝子の転写が低減されるかまたは阻害されることが好ましい。このような低
減は標的遺伝子のプロモーター領域内の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の小溝に結
合またはそれと相互作用するポリアミドを適用する結果として得られる。好まし
くは、結合または相互作用はプロモーター領域内の所定の標的核酸配列について
行われ、転写を阻害するかまたはダウンレギュレートする。

【００１５】 本発明において、「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、遺伝子
発現に必要な核酸配列を意味し、ＲＮＡポリメラーゼを結合させてプロモーター
に関連する遺伝子の転写を開始することに関与するＤＮＡの領域を含む。転写を
開始するためにＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡとの会合を促進する他の蛋白と結合
する配列も含む。プロモーターはエンハンサー領域も含むことができる。 本発明は、細胞透過性であり、癌遺伝子転写を阻害することができる配列特異
性ＤＮＡ結合低分子を使用することにより遺伝子発現および過剰発現を低減する
。このような分子を適切に施用することにより、内因性癌遺伝子の異常な発現ま
たは活性化を阻害することができ、癌をはじめとする種々の疾患を治療する基本
的に新規な治療法が得られる。本発明の低分子は、標的遺伝子のプロモーター領
域内の核酸配列と結合するかまたは相互作用するポリアミドである。好ましくは
、これらの配列は１またはそれ以上の転写因子により認識されるか、または認識
されるものに類似している。

【００１６】 本発明のポリアミド化合物は、ヌクレオチド塩基のポリアミドサブユニット認
識のための対合則にしたがってｄｓＤＮＡと結合する。より詳細には、ピロール
、イミダゾール、３−ヒドロキシピロールの誘導体、および層状に位置する脂肪
族アミノ酸残基は、ｄｓＤＮＡの小溝において特定の標的ヌクレオチド塩基対を
認識する構造を形成する。選択された芳香族および脂肪族アミノ酸はポリアミド
中に組み込まれ、該残基は他のアミノ酸残基と対になっていないままである。ポ
リアミド分子は二本鎖ＤＮＡの小溝と複合体を形成できる三日月形である。ＮＭ
Ｒ研究により、これらの化合物はＤＮＡと、２つのリガンドが逆平行に、互いに
近接して並んでいる２：１モチーフにおいて結合できることが判明した。Ｐｅｌ
ｔｏｎ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、５７
２３−５７２７（１９８６）；Ｍｒｋｓｉｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、５７２３−５７２７（１９８６）；Ｍｒｋｓｉｃｈ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、７５８６−７５９
０（１９９２）；Ｗａｄｅ、Ｊ．ら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、８７８
３（１９９２）。

【００１７】 結合親和性を増大させるために、２つのポリアミドをγ−アミノ酪酸などのタ
ーンユニットにより共有結合させることができる。Ｍｒｋｓｉｃｈら、Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６、７９８３（１９９４）。このようなポリアミドは
、ＤＮＡ複合体においてヘアピン様構造をとるので「ヘアピンポリアミド」と呼
ばれる。ポリアミドにおけるイミダゾールおよびピロールカルボキサミドの配列
は前記のヌクレオチド対を認識するカルボキサミドのスキームにしたがってリガ
ンドのＤＮＡ配列特異性を決定する。場合によって、ＤＮＡとポリアミドの湾曲
を調節するために１またはいくつかのピロールカルボキサミド単位をβ−アラニ
ン部分と置換することが有用である。ターンユニットとしてγ−アミノ酪酸の代
わりにキラルＲ２，４−ジアミノ酪酸を有するポリアミドは更に高い親和性でＤ
ＮＡと結合することが判明した。Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチルピロ
ールカルボキサミドを含むポリアミドが真核細胞における遺伝子発現を阻害する
ことができることが最近明らかにされた。Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３８７、２０３−２０４（１９９７）。

【００１８】 芳香族アミノ酸、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルピロール（Ｈｐ）はポリアミド
中に組み入れることができ、相対するＰｙと対になって、Ａ・Ｔヌクレオチド対
とＴ・Ａヌクレオチド対とを区別するポリアミドＤＮＡ結合リガンドをデザイン
し、合成しうることが判明した。Ｈｐ／Ｐｙ対合においてピロール上の１つの水
素原子をヒドロキシ基と置換することにより、親和性およびポリアミドの特異性
が１０倍制限される。芳香族アミノ酸残基の４つの対（Ｉｍ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ
、Ｈｐ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｈｐ）においてＨｐをＰｙおよびＩｍと共に用いる
ことにより、二本鎖ＤＮＡの小溝における４つのワトソン−クリック塩基対すべ
てを選択的に識別するポリアミドをデザインし、合成することができる。

【００１９】 本発明はＤＮＡの小溝と結合する向上したポリアミドならびに所望の標的ＤＮ
Ａのヌクレオチド配列に対応し、これと選択的に結合する特定のポリアミドのデ
ザイン法および合成法を包含する。ＤＮＡの小溝における結合のためのポリアミ
ドの調製および使用は当業界において広く記載されている。本発明の好ましい態
様において、ＤＮＡの小溝においてＴ・Ａ塩基対と結合するＨｐ／Ｐｙカルボキ
サミドまたはＤＮＡの小溝においてＡ・Ｔ塩基対と結合するＰｙ／Ｈｐカルボキ
サミドを得るために、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルピロールを用いた改良ポリア
ミドが用いられる。

【００２０】 好ましい態様において、本発明はｄｓＤＮＡの小溝におけるＡ・Ｔ、Ｔ・Ａ、
Ｃ・Ｇ、およびＧ・Ｃ塩基対を識別する３またはそれ以上のカルボキサミド結合
を有するポリアミドを提供する。本発明はγ−アミノ酪酸を有し、その各末端上
のそれぞれのカルボキサミド対の要素とともにヘアピンループを形成するポリア
ミドを包含する。好ましくは、γ−アミノ酪酸はキラル（Ｒ）−２，４−ジアミ
ノ酪酸である。

【００２１】 本発明は、通常は特定のヌクレオチド対と対合するカルボキサミド結合対にお
いて用いられるＰｙと置換されたβ−アラニンを含むポリアミドも包含する。β
−アラニンは式においてβとして表す。βはカルボキサミド結合対のメンバーと
なり、隣接するアミノ酸部分のヌクレオチド対との水素結合を最適化するように
働く。本発明はさらにβ・β結合対の非Ｈｐ含有結合対との置換を包含する。こ
のように、結合対は、Ｈｐ／ＰｙおよびＰｙ／Ｈｐに加えて、Ｐｙ／Ｐｙ、Ｉｍ
／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／β、β／Ｉｍ、Ｐｙ／β、β／Ｐｙ、およびβ／β
である。

【００２２】 一般に、本発明は内因性癌遺伝子の転写を阻害するのに適したポリアミドを提
供し、該ポリアミドは、同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応す
るように選択された芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３つの相補対、グリ
シン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ２，４−ジアミノ酪酸、および５−ア
ミノ吉草酸からなる群から選択される少なくとも２つの脂肪族アミノ酸残基、お
よび少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基を含む。同定されたｄｓＤＮＡの
ヌクレオチド配列に対応するように選択された芳香族カルボキサミド残基の相補
対は、ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、ヌクレオチド対Ｃ／Ｇに対
応するＰｙ／Ｉｍ、ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ／Ｐｙ、ヌクレオチド
対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐからなる群から選択される（ここで、ＩｍはＮ−
メチルイミダゾールであり、ＰｙはＮ−メチルピロールであり、Ｈｐは３−ヒド
ロキシ−Ｎ−メチルピロールである）。当業者に明らかなように、本発明のポリ
アミドはウイルス性癌遺伝子からの転写を防止、阻害、または低減するためにも
用いることができる。

【００２３】 好ましくは、ポリアミドは、癌遺伝子の転写および発現を制御するプロモータ
ー領域中の二本鎖ＤＮＡの小溝と結合する。好ましい態様において、ポリアミド
は、５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’、５’−ＴＧＡ
ＧＧＡＡ−３’、５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、
５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、５’−ＡＴＧＡＡＧＴ−３’、５’−ＡＧＴＡＴ
ＡＡ−３’、５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、５’
−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、５’−ＡＡＣＧＧＣＴ
−３’、５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、５’−
ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、および５’−ＡＧＧＣＡＡ−３’からなる群から選択
される同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列と結合する。好ましくは、
遺伝子の転写は、ｄｓＤＮＡの蛋白転写因子の結合を調整することにより阻害さ
れる。好ましい態様において、転写因子は、ＥＳＸ、ＥＴＳ，ＡＰ−２、ＯＢ２
−１、およびＴＢＰである。

【００２４】 好ましいポリアミドは、少なくとも１つのβ−アラニンである脂肪族アミノ酸
残基を含む。好ましい態様において、末端アルキルアミノ残基はＮ，Ｎ−ジメチ
ルアミノプロピル残基である。適当なポリアミドは、Ａ／ＴおよびＴ／Ａの群か
ら選択されるヌクレオチド対に対応する相補対残基を形成するように並べた少な
くとも２つのβ−アラニン残基を含むことができる。別法として、対応する対は
、たとえばＩｍ／β、β／Ｉｍ、Ｐｙ／β、β／Ｐｙなど脂肪族アミノ酸と芳香
族カルボキサミド間で形成される。好ましいポリアミドにおいて、ヘアピン分子
は、脂肪族アミノ酸残基、例えばγ−アミノ酪酸またはより好ましくはＲ２，４
−ジアミノ酪酸により形成される。

【００２５】 適当なポリアミドは、少なくとも１０^９Ｍ^−１のｄｓＤＮＡ標的配列での結合
親和性と少なくとも２の選択性を有し、選択性は、同定されたｄｓＤＮＡ標的配
列についての結合親和性の１塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ配列に対する結合親和
性の比と定義される。好ましい態様において、少なくとも９０％の１つの塩基ミ
スマッチ配列に対する選択性は約１０を越える。

【００２６】 本発明は、同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するように選
択された芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３の相補対、グリシン、β−ア
ラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ２，４−ジアミノ酪酸、および５−アミノ吉草酸か
らなる群から選択される少なくとも２つの脂肪族アミノ酸残基、少なくとも１の
末端アルキルアミノ残基を含む癌遺伝子の転写を阻害するのに適したポリアミド
であって、標的ｄｓＤＮＡ配列で少なくとも１０^９Ｍ^−１の結合親和性と少なく
とも２の選択性を有する（選択性は同定された標的ｄｓＤＮＡ配列に対する結合
親和性の、１塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ配列に対する結合親和性に対する比と
定義される）ポリアミドを提供する。

【００２７】 関連した態様において、本発明は医薬上許容される賦形剤と転写阻害量の少な
くとも１つの本発明のポリアミドを含む組成物に関する。好ましくは、ポリアミ
ドは遺伝子、特に癌遺伝子の転写および発現を制御するプロモーター領域におけ
る二本鎖ＤＮＡの小溝と結合する。好ましくは、選択された癌遺伝子の転写は、
好ましくは遺伝子のプロモーター領域におけるｄｓＤＮＡに対する蛋白転写因子
の結合を調整することにより阻害される。好ましい態様において、転写因子は、
ＥＳＸ、ＥＴＳ、ＡＰ−２、ＯＢ２−１、およびＴＢＰである。

【００２８】 ＨＩＶ−１プロモータの転写活性の阻害に関する従来の研究により、ポリアミ
ドがＴＢＰならびにＥｓｔファミリー転写因子の結合をブロックできることが明
らかになった（ＰＣＴ公開出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２４４４、ＷＯ９８／３５
０７２（その明細書は本発明の一部として参照される））。原則として、いずれ
の種類の転写因子もｄｓＤＮＡの小溝と接するかまたは結合するポリアミドによ
り阻害することができる。小溝と接する蛋白のＤＮＡ複合化は直接的立体障害、
反発、排除または別法としてアロステリック効果により阻害される。たとえば、
主溝結合蛋白の結合は、ポリアミドにより誘発されるＤＮＡ立体配座の変化によ
り阻害することができる。もちろん、阻害は他の方法、例えばＤＮＡ開裂剤の所
望の部位を標的とするポリアミドとの接合、またはポリアミドに結合した化学的
反応性部分の用いたＤＮＡを化学的修飾によっても達成することができる。

【００２９】 このように、本発明のさらなる態様において、癌遺伝子の発現または過剰発現
は、ｄｓＤＮＡにおける特定のヌクレオチド塩基配列、特に特定の癌遺伝子のプ
ロモーター領域における標的配列を標的とするポリアミドを用いることにより低
減または阻害される。好ましくは、癌遺伝子は癌に関与するウイルス性または内
因性細胞癌遺伝子である。本発明の癌遺伝子の標的の一例はＨＥＲ−２／ｎｅｕ
遺伝子であり、これはＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター領域内の標的配列と結合
するポリアミドを使用することによりダウンレギュレーションまたは阻害するこ
とができる。好ましくは、ポリアミドにより標的とされる配列は、癌遺伝子プロ
モーター内の転写因子結合部位であるかまたはこれに近似している。ポリアミド
と標的配列間の相互作用または結合は標的癌遺伝子の転写を阻害することができ
る。癌遺伝子発現の阻害の程度は広範囲におよび、過剰発現の阻害を包含するの
で、病気でない状態に関連する発現のレベルが回復される。もちろん、個々の使
用によってはさらに高い阻害を達成することができる。本発明はさらに癌遺伝子
発現に関連する種々の腫瘍または癌（乳癌を含む）の治療にポリアミドを用いる
ことを包含する。

【００３０】 適当なポリアミドは最も好ましくはｄｓＤＮＡ標的配列で少なくとも１０^９Ｍ ^−１ の結合親和性および少なくとも約２の選択性を有する。選択性は、同定され
たｄｓＤＮＡ標的配列についての結合親和性の、１塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ
配列についての結合親和性の比と定義される。好ましい態様において、少なくと
も９０％の１塩基ミスマッチ配列に対する選択性は約１０を越える。

【００３１】 本発明の関連する態様において、医薬上許容される賦形剤と転写阻害量の少な
くとも１つの本発明のポリアミドを含む組成物が提供される。各ポリアミドは少
なくとも３つの芳香族カルボキサミド残基の相補対を含み、該対はｄｓＤＮＡの
同定されたヌクレオチド配列に対応するように選択される。好ましくは、ポリア
ミドは更に、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ−２，４−ジアミノ
酪酸、および５−アミノ吉草酸からなる群から選択される少なくとも２の脂肪族
アミノ酸残基、および少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基を含み、ポリア
ミドは標的ｄｓＤＮＡ配列で少なくとも１０^９Ｍ^−１の結合親和性と少なくとも
２の選択性を有し、選択性は、同定された標的ｄｓＤＮＡ配列に対する結合親和
性の、１つの塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ配列についての結合親和性の比と定義
される。

【００３２】 本発明は更に細胞癌遺伝子の異常な発現に関連する状態の患者を治療するのに
適した方法を提供する。患者は好ましくはヒト患者であり、より詳細には、乳癌
または異常なＨｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子発現に関連する他の病気または症状に苦
しんでいる患者である。

【００３３】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） 本発明は、癌遺伝子の転写、特に癌、特にヒト癌に関与する癌遺伝子の転写を
低減または阻害することにより、癌遺伝子発現または過剰発現を調整または調節
するための方法および組成物に関する。遺伝子転写の低減は、ポリアミドと標的
癌遺伝子のプロモーター領域内のｄｓＤＮＡの小溝間の結合または他の相互作用
の結果として得られる。好ましくは、ポリアミドはプロモーター領域内の特定の
標的核酸配列と結合または相互作用して、癌遺伝子転写を阻害するかまたはダウ
ンレギュレートする。好ましくは、配列は、標的癌遺伝子のプロモーター領域と
結合するかまたは機能的に相互作用する１またはそれ以上の転写因子により認識
されるかまたは認識されるものに近似する。

【００３４】 本発明において用いられる「癌遺伝子」とは、細胞内の発現により形質転換（
すなわち、腫瘍形成、または腫瘍原性状態への変換）を引き起こす遺伝子を意味
する。癌遺伝子は、起源がウイルスであったり、突然変異（点突然変異（たとえ
ば、置換、欠失、および挿入）、染色体配列換え（たとえば、挿入、転座、およ
びコピー数増幅）、または内因性細胞癌原遺伝子の異常な発現から生じることも
ある。現在のところ、約１００の癌遺伝子が同定されている。癌遺伝子は活性に
基づいて分類され、転写因子に対して膜貫通型蛋白（例えば細胞表面受容体）で
あるものおよび他の核蛋白（例えば、腫瘍阻害因子、例えばｐ５３）を包含する
。癌原遺伝子からの癌遺伝子の発生は、機能の変化、より典型的には機能の増加
または損失を示し、この場合、遺伝子は突然変異、構成発現、過剰発現、または
不適切な発現の阻害により引き起こされるように不当に活性化される。

【００３５】 多くの癌遺伝子動物ウイルスが知られており、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの
いずれも包含する。例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、肝炎ウ
イルス、およびレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルス癌遺伝子の代表例
、およびこれに関連する疾患（かっこ内参照）としては、ｓｒｃ（肉腫）、Ｈ−
ｒａｓ（肉腫、赤白血病）、Ｋ−ｒａｓ（肉腫、赤白血病）、ｍｏｓ（肉腫）、
ｆｏｓ（軟骨肉腫）、ｓｉｓ（肉腫）、ｆｍｓ（線維肉腫）、ｆｅｓ（線維肉腫
）、ｊｕｎ（線維肉腫）、ｆｐｓ（肉腫）、ｍｙｃ（癌腫、肉腫、骨髄球腫）、
ａｂｌ（Ｂ細胞白血病）、ｒｅｌ（リンパ性白血病）、ｅｒｂＡ（赤白血病、線
維肉腫）、ｅｒｂＢ（赤白血病、線維肉腫）、ｍｙｂ（骨髄芽球性白血病）が挙
げられる。他の癌遺伝子としては、ｒｅｌおよびＮ−ｒａｓが挙げられる。細胞
性癌遺伝子の代表例としては、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｅｒ
ｂＢ、ｃ−Ｋ−ｒａｓ、およびｍｄｍ２が挙げられ、これらはすべて関連する種
々の腫瘍において（遺伝子のコピー数に関して）増幅される。別法として、癌遺
伝子の発現は特定の腫瘍において向上させることができるが、遺伝子のコーディ
ング配列は腫瘍によってはｃ−ｍｙｃに関して起こるように変化しない。ｃ−ｍ
ｙｃの発現は、たとえばレトロウイルスを遺伝子のビシニティーに挿入するなど
いくつかのメカニズムにより増加することが知られている。増加したｃ−ｍｙｃ
発現は、その有効なプロモーター配列またはエンハンサーによりウイルス長末端
反復配列（ＬＴＲ）から開始される構成転写による結果と考えられる。レトロウ
イルスゲノムを組み込むことにより活性化される他の細胞癌遺伝子としては、限
定するものではなく、ｃ−ｅｒｂＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｒａｆ、ｃ
−ｗｎｔ１、ｃ−ｉｎｔ２、およびｃ−Ｈ−ｒａｓが挙げられる。ｃ−ｍｙｃ発
現はさらに、腫瘍によっては、特に免疫系の腫瘍において、転座の結果、ならび
に遺伝子増幅により増加することが知られている。

【００３６】 癌遺伝子または癌原遺伝子によりコードされる遺伝子産物は種々の細胞機能を
有する。これらの遺伝子産物には、成長因子（たとえば、ｃ−ｓｉｓ、ＫＳ／Ｈ
ＳＴ、ｗｎｔ１、およびｉｎｔ２）、成長因子受容体（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ、
ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕともいう）、ｅｒｂ２，３、ｃ−ｆｍｓ、
ｃ−ｋｉｔ、およびｍａｓのウイルス性癌遺伝子相対物）、シグナル導入蛋白（
例えば、ｃ−ｒａｓ）、細胞内チロシンキナーゼ（たとえば、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−
ａｂｌ、ｃ−ｆｐｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｙｅｓ、ｖ−ｆｇｌ、ｖ−ｆｐｓ／ｆｅ
ｓ、ｖ−ａｂｌ、およびｖ−ｒｏｓ）、細胞内セリン／トレオニンキナーゼ（た
とえば、ｃ−ｒａｆおよびｃ−ｍｏｓ）、シグナル化蛋白（たとえば、ｃｒｋお
よびｖａｖ）、または転写因子（たとえば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏ
ｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒｅｌ、およびｃ−ｅｒｂＡ）がある。

【００３７】 当業者により理解されるように、本発明のポリアミド、ならびにこれを用いた
組成物および方法は、現在公知であっても将来発見されるものであっても、任意
の癌遺伝子の発現を阻害するかまたはダウンレギュレートするために用いること
ができる。簡単に言うと、特定の癌遺伝子の制御に影響するＤＮＡ結合蛋白の認
識および／または結合配列は同定され、これらの配列を標的とするポリアミドが
デザインされ、合成され、その後これを所望により開示された組成物中に組み込
み、インビボであっても、インビトロであっても、所望の癌遺伝子の転写を阻害
するために用いることができる。

【００３８】 ポリアミドは好ましくは細胞透過性であり、インビボ、インビトロ、または無
細胞系における遺伝子転写を阻害することができる。このようなポリアミド分子
は、癌を含む、種々の疾患の治療としてウイルス性または内因性癌遺伝子の発現
または過剰発現を阻害するために適切に用いることができる。

【００３９】 好ましい態様において、ポリアミドは、標的癌遺伝子の転写および発現を制御
するプロモーター領域における二本鎖ＤＮＡの小溝と結合する。好ましい標的癌
遺伝子は、癌形成または進行に関与する内因性癌遺伝子である。動物、特に哺乳
動物、特にヒトおよび／またはウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、および／また
はブタに感染するウイルスのゲノムによりコードされる癌遺伝子も好ましい。好
ましくは、癌遺伝子の転写は，蛋白、例えば転写因子の、ポリアミドが結合また
は相互作用する同じプロモーター領域との結合を調整することにより阻害される
。特に好ましい態様において、転写因子は１またはそれ以上の下記に示すもので
ある：ＥＳＸ；ＥＴＳ；ＡＰ−２、およびＴＢＰ。

【００４０】 ＨＩＶ−１プロモーターでの転写活性の阻害は、ポリアミドがＴＢＰならびに
Ｅｔｓファミリー転写因子の結合をブロックできることを示す。ＷＯ９８／３５
７０２参照（ポリアミド合成の議論も包含する）。本発明は、特定の認識および
／または結合配列で転写因子の活性を阻害または調整するポリアミドの使用を包
含する。本発明の方法は、ｄｓＤＮＡの小溝と接するかまたは結合する１または
それ以上のポリアミドを使用することにより転写因子活性に影響する。このよう
な接触または結合は、直接的反発、アロステリック効果、または他のメカニズム
（たとえば、ｄｓＤＮＡの開裂または化学的修飾）により小溝におけるＤＮＡ転
写因子複合体の形成を阻害することができる。加えて、ＴＢＰなどの主溝ＤＮＡ
結合蛋白の結合は、隣接する小溝との会合によりＤＮＡ構造においてポリアミド
により起こる変化により阻害することができる。

【００４１】 本発明の好ましい態様において、癌遺伝子、特にウイルス性または内因性細胞
癌遺伝子の発現または過剰発現が標的とされる。好ましくは、癌遺伝子は癌に関
与するものであり、その発現または過剰発現は、癌遺伝子プロモーターの領域に
おける小溝と接触するかまたは結合するポリアミドにより阻害される。好ましく
は、プロモーター領域の接触または結合部分は、転写因子結合部位であるかまた
はこれに近似する。阻害の程度は、好ましくは大規模で、より好ましくは遺伝子
のコピー数が増加する場合に癌遺伝子の過剰発現さえも阻害するのに十分なもの
である。

【００４２】 本発明の癌遺伝子標的の一例はＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子であり、これはＨＥ
Ｒ−２／ｎｅｕプロモーター領域内の標的配列と結合するポリアミドを使用する
ことによりダウンレギュレートできるかまたは阻害できる。好ましくは、これら
の配列はＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーター内の転写因子結合部位であるかまたは
これに近似するものである。これらの転写因子としては、ＴＢＰ、ＥＳＸ、およ
びＡＰ−２が挙げられる。ポリアミドと標的配列間の相互作用または結合により
、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子転写が阻害される。

【００４３】 本発明は、遺伝子発現または過剰発現を阻害するための、医薬上許容される賦
形剤と転写阻害量の少なくとも１つのポリアミドを含む組成物を包含する。これ
らの組成物は、乳癌をはじめとする種々の腫瘍または癌の治療にも用いることが
できる。本発明はさらに遺伝子発現または過剰発現を阻害するためにこのような
組成物を投与する方法も提供する。該方法および組成物は好ましくは、細胞癌遺
伝子の異常な発現に関連する症状を有する患者を治療するのに適したものである
。患者は好ましくはヒト患者、特に癌、特に乳癌に苦しんでいる患者である。

【００４４】 （ポリアミドのデザイン） ＥＳＸ結合部位を含むＨＥＲ−２／ｎｅｕプロモーターの領域のヌクレオチド
配列を図２Ａに示す。この領域をそれぞれ７塩基対からなる４つの重複する標的
部位に分割した。Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド残基、Ｎ−メチルピロ
ールカルボキサミド残基、および０、または２つのβ−アラニン脂肪族アミノ酸
残基からなる２つのポリアミドをこれらの標的部位のそれぞれのＤＮＡ配列に対
応するようにデザインした（図２Ｂ）。Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド
残基およびＮ−メチルピロールカルボキサミド残基の配列を前記の対合則にした
がって選択した。ポリアミド１は、ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−２，４ＤＡ−Ｐｙ
Ｐｙ−β−ＩｍＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド２はＩｍＰｙＰ
ｙＰｙＰｙ−２，４ＤＡ−ＰｙＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた
。ポリアミド３は、ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−２，４ＤＡ−ＰｙＰｙ−β−Ｐｙ
Ｐｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド４は、ＩｍＰｙＰｙＰｙＩｍ−
２，４ＤＡ−ＰｙＰｙＰｙＩｍＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド
５は、ＩｍＩｍ−β−ＰｙＩｍ−２，４ＤＡ−ＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄ
ｐの構造を有していた。ポリアミド６は、ＩｍＩｍ−β−ＰｙＩｍ−２，４ＤＡ
−ＰｙＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド７は、Ｉｍ
−β−ＩｍＩｍＰｙ−２，４ＤＡ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐｙ−β−Ｄｐの構造を
有していた。ポリアミド８は、Ｉｍ−β−ＩｍＩｍＰｙ−２，４ＤＡ−ＰｙＰｙ
ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。

【００４５】 （ポリアミドの調製） ポリアミドの固相合成に必要なビルディングブロックを確立された手順に従っ
て大規模（５０ないし２００ｇ）で調製した。すべてのポリアミドを適当な置換
レベル（０．６１５ミリモル／ｇ）において商業的に入手可能なＢｏｃ−β−ア
ラニン−ＰＡＭ樹脂上で固相合成により調製した。ポリアミド１の合成を代表例
として図３に示す。すべてのポリアミドをＭＡＬＤＩ−ＭＳにより特徴づけ；実
験的に得られたデータは予想値と良好に一致した。図４はＥＳＸ結合部位と結合
するようにデザインされた８つのポリアミドの構造式、ならびに各化合物を特徴
づけるＭＡＬＤＩ−ＭＳデータを示す。

【００４６】 （医薬および治療用組成物） 本発明のポリアミド、ならびにその医薬上許容される塩は、医薬または治療用
組成物、処方、または製剤に処方することができる。本発明のポリアミド化合物
の医薬上許容される塩は、適当な場合には強または中程度、非毒性、有機または
無機酸または塩基を用いて当業界で公知の方法により形成される。本発明に含ま
れる塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホ
ン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、
塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および硝酸塩である。

【００４７】 前記のように、本発明のポリアミド化合物は、多くの疾患または症状のいずれ
か、とりわけ癌の治療において利用される性質である癌遺伝子の発現または過剰
発現を阻害する能力を有する。本発明の組成物はそれ自体活性であってもよいし
、インビボで活性形態に変換される「プロドラッグ」として作用することもでき
る。 本発明の化合物、ならびにその医薬上許容される塩は、カプセル、埋込ウェフ
ァー、錠剤、または注射可能な製剤などの通常の剤型中に組み入れることができ
る。固体または液体の医薬上許容される担体を用いることができる。遅延放出す
るようにデザインされた医薬組成物も処方できる。

【００４８】 好ましくは、本発明の化合物は、全身的に、例えば注射により投与される。使
用に際して、注射は任意の公知の経路によることができ、好ましくは、静脈内、
皮下、筋肉内、頭蓋内、または腹膜組織内である。注射可能な製剤は、溶液また
は懸濁液のいずれか、注射前に液体中溶解または懸濁するのに適した固体形態、
またはエマルジョンなどの公知形態に調製することができる。

【００４９】 固体担体は、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白陶土、シュ
ークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグ
ネシウムおよびステアリン酸を包含する。液体担体は、シロップ、ピーナッツ油
、オリーブ油、食塩水、水、デキストロース、グリセロール等を包含する。同様
に、担体または希釈剤は任意の長期放出性物質、例えばグリセリルモノステアレ
ートまたはグリセリルジステアレートを単独またはワックスと共に含むことがで
きる。液体担体を用いる場合、製剤は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、
ソフトゼラチンカプセル、液体を含むカプセル、滅菌注射液（例えば溶液）、例
えばアンプル、あるいは水性または非水性液状懸濁液の形態にすることができる
。このような医薬組成物の要約は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ 、Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｔｏｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ
第１８版、１９９０年）に記載されている。

【００５０】 医薬製剤は、錠剤形態について必要ならば、混合、造粒および圧縮などの工程
、または適当ならば成分の混合、充填および溶解を含む薬化学の慣用技術にした
がって調製され、経口あるいは、局所、経皮、膣内、鼻内、気管支内、頭蓋内、
眼内、耳内および直腸投与をはじめとする非経口について望ましい製品が得られ
る。医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性補助物
質も含むことができる。 好ましい投与経路は全身投与であるが、医薬組成物は、局所的または経皮（例
えば、軟膏、クリームまたはゲル等として）、経口、直腸（例えば、座剤として
）、非経口、注射または注入により連続的に、膣内、鼻内、気管支内、頭蓋内、
耳内、または眼内投与することもできる。

【００５１】 局所投与に関して、組成物はロウ膏または軟膏などの局所塗布されるビヒクル
中に組み込むことができる。活性成分の担体は、噴霧可能または非噴霧形態のい
ずれかである。非噴霧形態は、局所投与に固有の担体を含み、好ましくは水より
も大きな動的粘度を有する半固体または固体形態である。適当な処方としては、
これに限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、
リニメント、ロウ膏などが挙げられる。所望により、これらは滅菌したり、助剤
、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響する塩などと
混合することができる。非噴霧局所製剤の好ましいビヒクルは、軟膏基剤、例え
ばポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、通常のクリーム、
たとえばＨＥＢクリーム、ゲル、ならびに石油ジェリーなどを含む。

【００５２】 化合物が、好ましくは化合物が固体または液状不活性担体物質と組み合わせて
圧搾ボトル中にパッケージされているか、または圧縮された揮発性物質、通常は
気体噴射剤との混合物である、噴霧可能なエアゾル製剤も局所塗布に適している
。エアゾル製剤は、本発明の化合物に加えて、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、香料
、および／または酸化防止剤を含むことができる。

【００５３】 好ましい局所適用について、特にヒトについては、有効量の化合物を標的領域
、例えば皮膚表面、粘膜、目などに投与するのが好ましい。この量は、治療され
る領域、症候群または疾患の重さ、および用いられる局所ビヒクルの性質によっ
て、一般に１回の投与あたり約０．００１ｍｇないし約１ｇである。 本発明の組成物は、疾患または症状を治療するために用いられる１またはそれ
以上のさらなる化合物と組み合わせて投与することもできる。癌を治療するため
には、ポリアミドおよび誘導体を抗腫瘍剤、たとえば分裂阻害剤、たとえばビン
ブラスチン；アルキル化剤、たとえばシクロホスファミド；葉酸阻害剤、例えば
メトトレキサート、プリトレキシムまたはトリメトレキサート；代謝拮抗剤、例
えば５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド；挿入抗生物質、例えば
アドリアマイシンおよびブレオマイシン；酵素または酵素阻害剤、例えばアスパ
ラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばエトポシド、または生物反応改良
剤、例えばインターフェロンと組み合わせて投与される。実際、任意の公知の癌
治療薬を本発明において開示するポリアミン類似体および誘導体と組み合わせて
なる医薬組成物は本発明に含まれる。

【００５４】 本発明の化合物の典型的な単一用量は、体重１ｋｇあたり約１ｎｇと約１０ｇ
の間である。用量は好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇと約１ｇの間で
あり、最も好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと約１００ｍｇの間である
。局所投与に関して、約０．０１−２０％の化合物濃度、好ましくは１−５％の
範囲の用量が示唆されている。約１−５００ｍｇの範囲の合計一日量が経口投与
について好ましい。しかしながら、前記範囲は示唆的であって、個々の治療計画
に関する変数の数は多く、これらの推奨される値から相当逸脱することが予想さ
れ、当業者により慣例的に行われている。

【００５５】 疾患または症状を治療するための化合物の有効な量は、特定の疾患または症状
についての認識されたインビトロ系またはインビボ動物モデルを用いて決定する
ことができる。癌の場合、多くの当業界で認知されたモデルが公知であり、広範
囲におよぶヒト腫瘍の代表例である。多くのヒトまたはヒト以外の動物起源の腫
瘍細胞系のいずれかを用いた標準的検定を用いて、培地中の腫瘍細胞増殖の阻害
に関して組成物を試験することができる。動物モデルを用いるこれらの方法の多
くは、Ｇｅｒａｎ、Ｒ．Ｉ．ら、“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎ
ｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｎｉｍａｌ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第３版）”、Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、第３部、３：１−１１２に詳細に記載されている。

【００５６】 （投与方法） 前記のように、本発明の治療法は、ポリアミド含有組成物の投与を意図する。
本発明のポリアミド含有製剤は全身的または局所的に投与することができ、単独
または成分の混合物として用いることができる。投与経路は、局所、静脈内、経
口、またはインプラントを用いることによる。例えば、ポリアミドは、これに限
定されないが、局所製剤、静脈内注射または注入、経口摂取、または皮内注射ま
たはインプラントの形態の局所投与をはじめとする手段により投与することがで
きる。さらなる投与経路は、本発明のポリアミドの慣用的または都合のよい形態
における皮下、筋肉内、または腹膜組織内注射である。リポソームまたは親油性
処方も所望により用いることができる。局所投与について、ポリアミドを、ロー
ション、懸濁液またはペーストをはじめとする標準的局所処方および組成物にす
ることができる。ポリアミドが経口経路により容易に標的細胞または組織に適用
できる場合には、適当な処方を経口投与することも適切である。

【００５７】 ポリアミドの用量は、これに限定されないが、選択したポリアミド、これが運
ばれる物理的デリバリーシステム、患者、および熟練した医師の判断などの要因
により、当業者により最適化することができる。 本発明を一般的に記載したが、本発明は以下の例示的で、特記しない限り本発
明の範囲を限定しない、実験セクションを参照してさらに容易に理解できるであ
ろう。

【００５８】 （ＤＮＡ結合研究） ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターを含有するプラスミドＤＮＡ、これからＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）によりＥＳＸ結合部位を含む５’−^３２Ｐ末端標識１
８８塩基対ＤＮＡフラグメントを調製した。 定量的ＤＮアーゼＩフットプリント滴定（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０
ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．０
、２２−２４Ｃ）を行い、各ポリアミド（１−８）のそれぞれのマッチ配列に対
する平衡会合定数（Ｋａ）を求めた。ポリアミド１の滴定のオートラジオグラム
を図５Ａに代表例として示す。

【００５９】 （定量的ＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果） ポリアミド１ないし８についてのＤＮアーゼＩフットプリンティング実験から
決定される平衡結合定数を図６に要約する。 部位１における、マッチおよびミスマッチ部位でのポリアミド１の「フットプ
リント」は図５Ａのオートラジオグラムにおいて見ることができる。化合物１は
１ナノモル以下の親和性（Ｋａ＝１．８×１０^１０Ｍ^−１）でそのマッチ部位（
５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’）と結合していた。しかしながら、ポリアミド１は
形式的な１塩基対ミスマッチ部位（５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’）と約３倍少な
い親和性で結合するのであまり選択的なリガンドではない。１のこのミスマッチ
部位との結合は、ＥＴＳ蛋白の結合の減少につながることに注意しなければなら
ない。β−アラニン単位を含まないポリアミド４は、マッチおよびミスマッチ部
位のいずれに対してもわずかな結合しか示さず、いずれの場合においても［５］
が約５ｎＭであった。

【００６０】 部位３において、ポリアミド７は会合定数Ｋａが約１０^９Ｍ^−１で１塩基対ミ
スマッチ部位（ＡＴＧＡＡＧＴ）と結合していた。ポリアミド７とマッチ部位（
５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’）の結合は観察されなかった（［７］が＜１０ｎＭ
）。ポリアミド８はそのマッチ部位と弱く結合していた（Ｋａ約５ｎＭ）。しか
しながら、ＤＮＡフラグメントとあまり選択的に結合せず、他の部位の中で、形
式的な１塩基対ミスマッチ部位５’−ＡＴＧＡＡＧＴ−３’と会合定数Ｋａ約１
０^９Ｍ^−１で結合していた。

【００６１】 部位４において、ポリアミド２および３はいずれも同様に良好な会合定数（Ｋ
ａ（２）＝９．５×１０^９Ｍ^−１；Ｋａ（３）＝１．５×１０^１０Ｍ^−１でその
マッチ部位（５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’）と選択的に結合していた。それぞれ
プロモーターの部位２および３と結合するようにデザインされたポリアミド５な
いし８の不十分な結合はその領域のＢ−形態からのＤＮＡ構造の逸脱のためであ
る。

【００６２】 （ＡＰ−２結合部位） 転写因子ＡＰ−２は低ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現表現型の細胞においてほとんど検
出できないが、その濃度はＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現細胞において明らかに高い
。これらの知見により、ヒト乳癌においてこの転写因子は重要な役割を果たすこ
とがわかる。

【００６３】 （ポリアミドのデザイン） ＡＰ−２結合部位のＤＮＡ配列および隣接する領域を図７Ａに示す。ＥＳＸ結
合部位の研究においてと同様に、この領域をそれぞれが６ないし８塩基対からな
る３つの標的部位に分割した。これらの部位のそれぞれについて、Ｎ−メチルイ
ミダゾールカルボキサミド残基、Ｎ−メチルピロールカルボキサミド残基、およ
び０、１または２のβ−アラニンアミノ酸残基からなる２つのポリアミドを調製
した（図７Ｂ）。Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド残基、Ｎ−メチルピロ
ールカルボキサミド残基、およびβ−アラニンアミノ酸残基の配列は、前記の対
合則にしたがって選択した。ポリアミド９は、ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−２，４
ＤＡ−ＰｙＰｙＩｍＩｍＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド１０は
ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−２，４ＤＡ−Ｐｙ−β−ＩｍＩｍＰｙ−β−Ｄｐの構
造を有していた。ポリアミド１１は、ＩｍＰｙＰｙ−β−ＩｍＰｙ−２，４ＤＡ
−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＩｍＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド１２
は、ＩｍＰｙ−β−ＩｍＩｍＰｙ−２，４ＤＡ−ＩｍＰｙＰｙ−β−ＩｍＰｙ−
β−Ｄｐの構造を有していた。ポリアミド１３は、ＩｍＩｍＰｙＰｙ−２，４Ｄ
Ａ−ＰｙＩｍＰｙＰｙ−β−Ｄｐの構造を有していた。

【００６４】 （ポリアミドの合成） 固相合成によりポリアミドを合成した。その純度を、分析的ＨＰＬＣにより確
認し、その構造を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより確認した。構造を図８に示す。 （ＤＮＡ結合研究） ＰＣＲにより前記のＨＥＲ２／ｎｅｕプラスミドからＡＰ−２結合部位を含む
５’−^３２Ｐ末端標識した１８９塩基対ＤＮＡフラグメントを得た。定量的ＤＮ
アーゼＩフットプリント滴定（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ
，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．０、２２−２４
℃）を行い、各ポリアミド（９−１３）のそれぞれのマッチ配列に対する平衡会
合定数（Ｋａ）を求めた。図９ないし１１において、ポリアミド９、１０、およ
び１３の滴定のオートラジオグラムを代表例として示す。結果を図１２にまとめ
る。

【００６５】 ポリアミド９は部位１と全く結合しないが、ポリアミド１０は２β−アラニン
単位を含有し、非常に高い親和性（Ｋａ＝８．７×１０^１０Ｍ^−１）と選択性で
この部位と結合していた。部位３と結合するようにデザインしたポリアミド１１
と１２はいずれもあまり高い選択性は示さなかった。８リングポリアミド１３は
ナノモル濃度で、選択的にそのそれぞれのマッチ部位と結合していた。 ポリアミド１、２および３をさらに詳細に研究し、公知の化合物ジスタマイシ
ンと比較した。

【００６６】 （細胞培養） ＳＫＢＲ−３細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。細
胞を１０％ウシ胎仔血清を含むマッコイ５ａ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。 （核抽出物調製） 準集密状態まで増殖させたＳＫＢＲ−３細胞をリン酸緩衝塩溶液で２回リンス
し、掻き取り、１２００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ
６０００、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）することにより集めた。以下の工程を４℃で
行った。細胞ペレットをパックされた細胞体積の５倍の緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ−ＫＯＨ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．７５ｍＭ スペルミジン、０．１５ｍＭ スペルミ
ジン、および１ｍＭ ジチオトレイトールを含有）中に懸濁させ、続いて１２０
０ｒｐｍで５分遠心分離した。ペレットをペレット体積の５倍の緩衝液Ａ中に再
懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅ’ｓホモジナイザー（乳棒）を用いて１０ストロークで均
質化した。ホモジネート（約９５％溶解細胞）を１５０００ｒｐｍで約１分間遠
心分離した（ＪＡ−１７ローター、ＪＡ−２１遠心分離器；Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。ペレットを緩衝液Ｂおよび２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−
ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ
ＥＧＴＡ、０．７５ｍＭ スペルミジン、０．１５ｍＭ スペルミジン、２ｍ
Ｍ ジチオトレイトール、および１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド
中に再懸濁し、続いて０．７５Ｍ ＮａＣｌを含む等体積の緩衝液Ｂを滴下した
。２０分間揺動した後、４７５００ｒｐｍで４５分間遠心分離（ＳＷ−５５ロー
ター、Ｂｅｃｋｍａｎ）することにより上清を集め、＞１００倍緩衝液Ｃ（２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ［ｐＨ７．９］、２０％グリセロール、１００ｍＭ
ＫＣＩ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１２．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、２ｍＭ ジチオトレイトール、および１ｍＭ フェニルメチルスルホニル
フルオリド）に対して３時間透析した。沈殿した残骸を１５０００ｒｐｍで遠心
分離（ＪＡ−２１遠心分離器、ＪＡ−１７ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ）すること
により除去し、核抽出物の蛋白含量をＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白検定を用いて定量した
。

【００６７】 （蛋白および抗体） 細菌発現されたＥＳＸ蛋白を記載されたようにして調製した［Ｃｈａｎｇら、
１９９７］。簡単に言えば、完全長ＥＳＸｃＤＮＡをｐＲＳＥＴ ｈｉｓ−ｔａ
ｇ発現プラスミド（Ｎｈｅｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にク
ローンした。ＥＳＸ蛋白の発現を細菌細胞（ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ感応
細菌細胞；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））の形質転換によ
り処理し、ＩＰＴＧの添加により誘発させた。Ｈｉｓ−標識されたＥＳＸ蛋白を
、製造業者（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）により
推奨されるようにニッケルキレート親和性クロマトグラフィーを用いて精製した
。ＡＰ−２蛋白をＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し
た。ＡＰ−２に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃｏ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ）から購入し、ＥＳＸに対する抗体を前記のようにして調製した。

【００６８】 （オリゴヌクレオチド） ＥＳＸ蛋白結合部位（ＨＥＲ２遺伝子プロモーター由来；ＴＡ５−オリゴ）を
含む３４−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（オリゴ）およびその相補鎖をＢｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＲＰＣＩ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）（配列
を図１Ａに示す）から合成した。オリゴをゲル精製し、アニールし、Ｔ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）を用いて前記のようにして末端をγ−^３２Ｐ−［ＡＴＰ］で標識し
た（１０）。^３２Ｐで標識された５’−末端重複二本鎖オリゴをゲル移動度変位
分析においてプローブとして用いた。

【００６９】 （移動度変位分析） そのコンセンサス結合配列と結合する蛋白の現出をゲル移動度変位分析により
行った。一般に、表示された濃度で蛋白および１ｎＭの^３２Ｐ標識オリゴを、２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＫＣＩ、５％グリセロール、０．
１％ ＮＰ−４０、ウシ血清アルブミン（１００μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭ
ジチオトレイトールを含む反応緩衝液中でインキュベートした。室温で３０分間
インキュベートした後、サンプルをＴＢＥ緩衝液（４４．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩
基、４４．５ｍＭ ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）を用いて操作する
５％ネイティブポリアクリルアミドゲル上にかけた。次に、ゲルを乾燥させ、Ｋ
ｏｄａｋフィルムに暴露した。蛋白−ＤＮＡ複合体をコンピューティングレーザ
ーデンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａ
ｌｅ、ＣＡ）を用いて定量した。＞９０％の^３２Ｐ標識オリゴと複合体形成でき
る量の蛋白をほとんどの実験に用いた。反応物に蛋白に対して特異性の抗体を添
加することにより蛋白−ＤＮＡ複合体の同定を確認した。

【００７０】 （薬剤検定） ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の形成を妨害するポリアミドの能力をゲル移動度変位分
析により調べた。分析は、平衡条件下でポリアミドがＥＳＸ−ＤＮＡ複合体を阻
害する能力を定量するために行った。実験をセットアップしてポリアミドを^３２ Ｐ標識オリゴと共に室温で３０分間インキュベートした後にＥＳＸ−ＤＮＡ蛋白
を添加するか、あるいはＥＳＸ蛋白をプローブと複合体形成させた後にポリアミ
ドを添加した。ポリアミドによるＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成の阻害を、薬剤処理
したサンプルを薬剤処理されていないサンプルと比較することにより測定した。
ポリアミドのＡＰ−２−ＤＮＡ複合体を阻害する能力の調査を同様にして行った
。ＩＣ_５０（蛋白−ＤＮＡ複合体形成を５０％阻害するのに必要な薬剤濃度）を
用いてポリアミドの活性を表した。ＩＣ_５０の薬剤濃度をｒ値（薬剤のＤＮＡ塩
基対に対するモル比）としても表した。

【００７１】 （インビトロ転写） １２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、６０ｍＭ ＫＣＩ、７．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２、１２％グリセロール、０．１２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１２ｍＭ
ＥＧＴＡ、１．２ｍＭ ＤＴＴ、および０．６ｍＭ ＰＭＳＲを含む緩衝液中
でインビトロ転写を行った。ベクターｐＣＤＮＡ３−Ｌｅｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中ＨＥＲ２プロモーターからの挿入ＤＮＡフラ
グメントからなるＣｓＣｌ−精製プラスミドＤＮＡ（ＲＯ６）を制限酵素Ｓｐｈ
ｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で直線
状とし、ＤＮＡ鋳型として用いた。２５μｌ反応液中に、１μｇのＳｐｈｌで消
化したＤＮＡ、核抽出物、０．５μｌの各ヌクレオチド（２０ｍＭのＡＴＰ、Ｇ
ＴＰ、ＵＴＰ、および１００μＭ ＣＴＰ）、１０μＣｉのα−^３２Ｐ−［ＣＴ
Ｐ］（８００Ｃｉ／ミリモル；ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、ＲＮＡｓｉｎ（
４０Ｕ／μＬ；Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ、ＩＮ）、および１．４μＬのＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を３０℃で６０分
間インキュベートした。３２５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩基（ｐＨ８．０）
、７Ｍ 尿素、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、および１００μｇ ｔＲ
ＮＡを添加することにより反応を停止させ、続いてフェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール抽出とエタノール沈降を行った。サンプルをホルムアミド
−ローディングダイ中に再び懸濁させ、９０〜９５℃で１分間以上加熱した後、
４％７Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルに付した。乾燥ゲルから得た^３２Ｐシグ
ナルをＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンを用いて可視化し、コンピュー
ティングレーザーデンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、
Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて定量化した。核抽出物を１μｇのＤＮＡ鋳
型に対して滴定することにより反応を最適化し、飽和状態を薬剤研究に用いた。

【００７２】 （インビトロ転写に対するポリアミドの効果） ポリアミドのインビトロ転写を阻害する能力を２通りで分析した。（ｉ）ＤＮ
Ａ鋳型をポリアミドとともに表示された濃度で、総体積１０μＬ中３０分間イン
キュベートした後、核抽出物およびヌクレオチドを添加した。（ｉｉ）核抽出物
およびＤＮＡ鋳型を１５分間プレインキュベートし、続いてポリアミドをさらに
３０分間総体積１０μＬになるよう添加し、次にヌクレオチドを添加した。すべ
ての実験を３０℃で行い、転写反応を６０分間進行させた。ポリアミドで処理し
たサンプルを未処理の対照と比較することにより転写阻害率（％）を測定した。
ＩＣ_５０およびｒ値を用いてポリアミドの活性を表した。Ｔ３転写物（２５０塩
基；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を内部対照として用いた
。

【００７３】 （薬剤の存在下での転写の時間経過） ＰＡ−２Ｅおよびジスタマイシンの存在下でのＨＥＲ２プロモーターからの転
写のパターンを前記のように経時分析を用いて調べた。実験的に、ＤＮＡ鋳型を
ＳＫＢＲ−３核抽出物と１５分間３０℃でインキュベートした後、薬剤（転写の
約３０〜５０％を阻害するために用いられる濃度）およびヌクレオチド（ＡＴＰ
、ＣＴＰ，ＧＴＰ、ＵＴＰ）を添加し、反応を異なる時間（すなわち、５、１０
、３０および６０分）で停止させた。各サンプルからの転写物を内部対照に対し
て標準化し、未処理対照の相対転写率（％）で表した。

【００７４】 （ゲル変位実験） 図１３は、種々の濃度のポリアミド２（「ＰＡ−２Ｅ」）の存在下でのＨＥＲ
２／ｎｅｕプロモーターのＥＳＸ結合部位を含むオリゴヌクレオチドとＥＳＸ蛋
白との結合を示すゲル実験結果を示す。ポリアミド２、ＩｍＰｙＰｙＰｙＰｙ−
Ｒ２，４Ｄ−ＰｙＰｙＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは、約１ｎＭないし約１００ｎＭ
の濃度範囲においてＥＳＸ蛋白のＤＮＡとの結合をブロックした。対照的に、ジ
スタマイシンは約１μＭないし約１０μＭの濃度範囲においてＥＳＸ蛋白のＤＮ
Ａとの結合をブロックした。

【００７５】 ＰＡ−２ＥおよびジスタマイシンはＥＳＸ ＤＮＡ結合領域の類似した部分（
部位２）を標的とする。ゲル移動度変位分析を用いて薬剤のＥＳＸ−ＤＮＡ複合
体に関する活性を調べた。ＰＡ−２ＥとＤＮＡをインキュベートし、続いてＥＳ
Ｘを添加すると、ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の形成が濃度に依存して阻害された。１
０ｎＭのＰＡ−２Ｅは９５％まで複合体の形成を阻害したが、１ｎＭでは複合体
について検出可能な減少があった（図１３Ａ、レーン２−４）。

【００７６】 ジスタマイシンによるＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成の阻害パターンはＰＡ−２Ｅ
によるものと類似しているが、非常に高い薬剤濃度が必要とされる。２００ｎＭ
のジスタマイシンは複合体を約９５％減少させた（図１３Ｂ、レーン４）。１０
０ｎＭでのＰＡ−２ＥはＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成をほとんど完全に阻害し、１
００ｎＭのジスタマイシンは複合体形成に影響しなかった（図３Ａ、レーン２お
よび図３Ｂ、レーン６）。図１６におけるデータの定量から、複合体形成を５０
％阻害するのに（ＩＣ_５０）２．２ｎＭのＰＡ−２Ｅと５００ｎＭのジスタマイ
シンが必要であることがわかる（表１）。各薬剤の転写因子−ＤＮＡ複合体を阻
害する活性もｒ値（薬剤のＤＮＡ塩基対に対するモル比）として表す（表１）。

【００７７】 表１ 転写因子／ＤＮＡ複合体形成に対する薬剤の影響 薬剤 転写因子 ［ｎＭ］ ｒ値 ＰＡ−１Ｅ ＥＳＸ ５ ０.１６ ＡＰ−２ ４８ １.５５ ＰＡ−２Ｅ ＥＳＸ ２.２ ０.０７ ＡＰ−２ ＞１００ ＮＤ^２ ＰＡ−３Ｅ ＥＳＸ １８ ０.５８ ＡＰ−２ ＮＤ ＮＤ ジスタマイシン ＥＳＸ ５００ １６.１ ＡＰ−２ ６０００ １９３.５^１ ｒ値＝薬剤のＤＮＡ塩基対に対するモル比^２ ＮＤ＝行わなかった

【００７８】 ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成の阻害の定量的比較を図１４に示す。 ポリアミド１（ＩｍＰｙ−β−ＰｙＩｍ−Ｒ２，４Ｄ−ＰｙＰｙ−β−ＩｍＰ
ｙ−β−Ｄｐ、「ＰＡ−１Ｅ」）およびポリアミド２（「ＰＡ−２Ｅ」）による
ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の阻害パターンを、ＥＳＸに暴露する前（「前」）または
ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成後（「後」）のいずれかで表した。ポリアミド１に関
して５０％阻害を生じる濃度にはほとんど差が見られないが、ポリアミド１がＥ
ＳＸ−ＤＮＡ複合体形成の前に現出した場合、より低い濃度で幾分多くの阻害が
観察された（図１４Ａ）。対照的に、ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の形成前に現出した
場合、約２ｎＭの濃度のポリアミド２により５０％阻害が得られたが、ＥＳＸ−
ＤＮＡ複合体の形成後に適用した場合に、同じ阻害を得るためには約８ｎＭの濃
度が必要であった（図１４Ｂ）。

【００７９】 ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターにより得られるインビトロ転写の阻害に対する
同様の相対的効果が観察された：前に適用したポリアミド２（図１５Ｂ）はポリ
アミド１（前後いずれか、図１５Ａ）または後に適用されたポリアミド２よりも
有効であった。 ポリアミドのＥＳＸ−ＤＮＡ複合体形成を阻害する能力を平衡条件下で測定し
た。しかしながら、薬剤と転写因子のある組み合わせに対して、薬剤を転写因子
の前でなくあらかじめ形成された複合体に投与した場合に平衡はより高い薬剤濃
度を必要とする。このような場合、薬剤が転写因子ＤＮＡ結合領域に競合する程
度は複合体阻害に関して平衡を確立するのに必要な時間または濃度に関連する。

【００８０】 データから薬剤を転写複合体が形成される前または後のどちらに添加しても、
複合体形成を阻害する同様の条件下で等しい濃度のＰＡ−１Ｅが平衡を確立した
ことがわかる（図１４Ａ）。たとえば、１０ｎＭの薬剤濃度で、いずれの反応に
おいても３０分以内にほとんど同量の複合体が形成された（図１４Ａ）。比較と
して、薬剤を複合体形成後に添加した場合、複合体形成前に添加した場合に比べ
て平衡条件下で複合体形成を阻害するのにＰＡ−２Ｅは１９倍多い薬剤を必要と
した（図１４Ｂ）。ＰＡ−１Ｅと比較してＰＡ−２Ｅが平衡に達するのにより長
いインキュベーション時間が必要であることを証明するために、１０ｎＭのＰＡ
−２Ｅについての経時分析を転写因子／ＤＮＡ複合体状態の形成後に薬剤を添加
することにより行った。結果から、ＰＡ−２ＥによるＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の阻
害率（％）はインキュベーション時間が長いと増加し、平衡状態に達するために
４時間以上必要であった（図１４Ｃ）。

【００８１】 ＡＰ−２とＴＡ５−オリゴ中のＧＣ−に富む配列の結合は抗体の不在または存
在下でのゲル移動度変位分析を用いて確認した。ＡＰ−２はＴＡ５−オリゴと結
合し、ＡＰ−２に対する特異的抗体は蛋白−ＤＮＡ複合体を除去し、非特異性抗
体または通常のイムノグロブリンは複合体形成に対して影響しなかった。

【００８２】 ＡＰ−２は、ＥＳＸ結合部位の２ないし３の塩基対上流にあるＧＣに富む配列
と相互作用するので、ＥＳＸ結合部位を標的とするようにデザインされたポリア
ミドがＡＰ−２のＤＮＡ結合に影響するかどうかを知ることは重要であった。ゲ
ル移動度変位分析を用い、図１７Ａは、濃度に依存した方法で、ＰＡ−１ＥがＡ
Ｐ−２のＤＮＡ結合を阻害でき、ＩＣ_５０が約４８ｎＭであることを示す（図１
７Ａ、表１）。対照的に、ＰＡ−２Ｅは試験した最高の薬剤濃度（１００ｎＭ）
でも複合体形成をブロックできなかった（図１７Ｂ−本発明者らの条件下では１
００ｎＭを越える薬剤濃度でＤＮＡのスメアリングが起こった）。ジスタマイシ
ンによるＡＰ−２／ＤＮＡ複合体の阻害パターンは、ＡＰ−２／ＤＮＡ複合体形
成を実質的に阻害するためにいずれの薬剤においてもマイクロモルの薬剤濃度が
必要である点でＰＡ−２Ｅのものと類似していた（図１７Ｃ；表１）。すべての
薬剤はＡＰ−２よりもＥＳＸの複合体形成の阻害に有効であった。ＰＡ−２Ｅは
ＥＳＸの最も特異的な阻害物質である。

【００８３】 転写因子−ＤＮＡ複合体形成に対するポリアミドの影響の結果、生物的機能に
影響する能力が得られるかどうかを確認するために、インビトロ転写検定を行っ
た。ＳｐｈＩで直線化したプラスミドＤＮＡ（ＲＯ６）を、鋳型として用い、Ｓ
ＫＰＢＲ−３核抽出物を転写機構として用いて、〜７６０塩基の転写物が得られ
た。薬剤をＤＮＡ鋳型と共にインキュベートした後、核抽出物とヌクレオチドを
添加した。代表的なゲルは、ＰＡ−２Ｅが濃度に依存して７６０塩基の転写物の
合成をブロックすることを示した。５μＭのＰＡ−２Ｅは転写合成を９５％阻害
し、１μＭでは未処理の対照と比較して転写を５０％未満でブロックした。より
高い薬剤濃度を用いた場合に部分転写物の産生の証拠が見られた。ＰＡ−１Ｅ、
ＰＡ−２Ｅ、ＰＡ−３Ｅおよびジスタマイシンによるインビトロ転写の阻害を図
１９に示す。ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターからの転写の阻害の効力の順序は、
転写因子ＤＮＡ複合体形成を阻害する効力と異なっていた：ＰＡ−２Ｅ＞ＰＡ−
３Ｅ＞ＰＡ−１Ｅ＞ジスタマイシン。各薬剤についてのＩＣ_５０を表２に列挙す
る。転写を５０％阻害するために、ＰＡ−２Ｅについて１．４μＭ、ＰＡ−３Ｅ
について２．４μＭ、ＰＡ−１Ｅについて３．２μＭ、ジスタマイシンについて
７．４μＭの薬剤濃度が必要であった。データはｒ値としても表し、各薬剤の転
写を阻害する能力についての活性を転写因子−ＤＮＡ複合体の阻害と比較するこ
とができる。

【００８４】 表２ インビトロ転写に対する薬剤の影響 ＩＣ_５０ 薬剤 ［μＭ］ ｒ値 ＰＡ−１Ｅ ３.２ ０.０２ ＰＡ−２Ｅ １.４ ０.００９ ＰＡ−３Ｅ ２.４ ０.０１５ ジスタマイシン ７.４ ０.０５

【００８５】 図１８において、ポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）、ポリアミド２（「ＰＡ−
２Ｅ」）またはポリアミド３（ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−Ｒ２，４Ｄ−ＰｙＰｙ
−β−ＰｙＰｙ−Ｄｐ、「ＰＡ−３Ｅ」）によるＥＳＸ／ＤＮＡ複合体の形成の
阻害を比較した。ゲル移動度変位分析を用いてポリアミドの活性を試験した。Ｐ
Ａ−１ＥとＰＡ−２Ｅは、複合体形成を阻害するその能力において類似していた
（図１８Ａ）。ＰＡ−１ＥについてのＩＣ_５０は５ｎＭであり、ＰＡ−２Ｅにつ
いては２．２ｎＭであった。比較として、ＰＡ−３Ｅは比較的弱いＥＳＸ−ＤＮ
Ａ複合体の阻害物質であり、ＰＡ−２Ｅと比較して５０％複合体形成を阻害する
ために９倍高い薬剤濃度（１８ｎＭ）を必要とした。（図１８Ａ、表１）。

【００８６】 ＥＳＸ−ＤＮＡ複合体の形成の阻害における相対的有効性は、ＨＥＲ２／ｎｅ
ｕプロモーターにより起こるインビトロ転写の阻害における相対的有効性と一致
する。図１９は、ポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）、ポリアミド２（「ＰＡ−２
Ｅ、ポリアミド３（「ＰＡ−３Ｅ」）またはジスタマイシン（「Ｄｉｓｔ」）の
各ポリアミドがＥＳＸに暴露される前に現出した場合の、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロ
モーターにより起こるインビトロ転写を阻害する能力の定量的比較を表したグラ
フである。最大阻害の半分を生じる濃度はそれぞれ約３μＭ、約１μＭ、約２．
３μＭおよび約７．３μＭであった。

【００８７】 本明細書において記載したすべての文献はその内容を出典明示により本発明の
一部とする。 前記載事項は本発明を例示するためであって、限定するものではない。本発明
の種々の変更および修正を本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うこと
ができる。本発明をその特定の具体例に関連して記載したが、さらに変更できる
と考えられる。本出願は、一般に本発明の原則に従った、当業界の公知または通
例的で、前記および添付の請求の範囲に記載されているような基本的特徴を適用
できる本発明からの逸脱を包含する本発明の任意の変更、使用、または適用を網
羅する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｈｅｒ２／ｎｅｕプロモーターを表す図であり、Ａにおいては、
ＥＳＸ、ＡＰ−２、ＯＢ２−１、およびＴＢＰ（「ＴＡＴＡ」）転写因子の結合
部位を含むヌクレオチド配列を示し、Ｂの概略図（一定比率でない）において、
ＥＳＸ、ＴＢＰ、ＯＢ２−１結合部位を示す。

【図２】 Ａにおいて、４つの重複ポリアミド標的部位を表示したＥＳＸ結
合部位のヌクレオチド配列を示す図であり、Ｂにおいて、これらの標的部位１−
４のヌクレオチド配列と結合するようにデザインされた８つのポリアミド（１−
８）の構造概略図を示す図であり、図中、Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミ
ドは●、Ｎ−メチルピロールカルボキサミドは○、β−アラニンアミノ酸は◇、
２，４−ジアミノ酪酸はアミノ基を有する曲線、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピ
ル置換基（およびＣ−末端）は正に荷電した半円により表す。

【図３】 一例としてポリアミド１を用いた典型的な固相合成スキームを表
す。

【図４】 ＥＳＸ結合部位と結合するようにデザインされた８のポリアミド
の構造式、ならびに各化合物を特徴づけるＭＡＬＤＩ−ＭＳデータを示す。

【図５】 １８８の塩基対５’−末端標識ＤＮＡフラグメント上のポリアミ
ド１のＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果を表すグラフであり、Ａはオート
ラジオグラムであり；レーン１、反応；レーン２ないし１２ ２０ｐＭ、４０ｐ
Ｍ、８０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、４００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、２ｎＭ
、４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭポリアミド１を表し、すべての反応は１５ｋｃｐ
ｍＤＮＡフラグメント、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含み、マッチおよび１
塩基対ミスマッチ部位をオートラジオグラムの右側に示し、Ｂはポリアミド１の
構造概略図を示す。

【図６】 ＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果をまとめた図であり、Ａ
はＥＳＸ結合部位を含むＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのヌクレオチド配列の部
分を示す図（ポリアミド結合部位１−４を表示）であり、Ｂは、ポリアミド１−
８の概略図に対応する４つのポリアミド標的部位を示す図である。

【図７】 Ａは、ＡＰ−２結合部位のヌクレオチド配列を示す図（３つの重
複ポリアミド標的部位を表示）であり、Ｂは、これらの標的部位１−３のヌクレ
オチド配列と結合するようにデザインされた５つのポリアミド（９−１３）の構
造図である。

【図８】 ＡＰ−２結合部位のヌクレオチド配列と結合するようにデザイン
された５つのポリアミド化合物の構造式、ならびに各化合物を特徴づけるＭＡＬ
ＤＩ−ＭＳデータを示す。

【図９】 １８８塩基対の５’−末端標識ＤＮＡフラグメントに関するポリ
アミド９のＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果のグラフであり、Ａにおいて
、オートラジオグラムを表し：レーン１、反応；レーン２ないし１２、２０ｐＭ
、４０ｐＭ、８０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、４００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ
、４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭポリアミド９であり、すべての反応は１５ｋｃｐ
ｍのＤＮＡフラグメント、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含み、Ｂにお
いて、ポリアミド９の構造図を示す。

【図１０】 １８８塩基対の５’−末端標識ＤＮＡフラグメントに関するポ
リアミド１０のＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果のグラフであり、Ａにお
いて、オートラジオグラムを表し：レーン１、反応；レーン２ないし１２、２０
ｐＭ、４０ｐＭ、８０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、４００ｐＭ、１ｎＭ、２
ｎＭ、４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭポリアミド１０であり、すべての反応は１５
ｋｃｐｍのＤＮＡフラグメント、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、
１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含み、
Ｂにおいて、ポリアミド１０の構造図を示す。

【図１１】 １８８塩基対の５’−末端標識ＤＮＡフラグメントに関するポ
リアミド１３のＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果のグラフであり、Ａにお
いて、オートラジオグラムを表し：レーン１、反応；レーン２ないし１２、２０
ｐＭ、４０ｐＭ、８０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、４００ｐＭ、１ｎＭ、２
ｎＭ、４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭポリアミド１３であり、すべての反応は１５
ｋｃｐｍのＤＮＡフラグメント、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、
１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含み、
Ｂにおいて、ポリアミド１３の構造図を示す。

【図１２】 ＤＮアーゼＩフットプリント滴定の結果を要約し、Ａにおいて
ＡＰ−２結合部位を含むＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのヌクレオチド配列の部
分（ポリアミド結合部位１−３を表示）を示し、Ｂにおいて、３つの結合部位と
対応するポリアミド９−１３の概略図を示す。

【図１３】 ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのＥＳＸ結合部位を含むオリゴ
ヌクレオチドとＥＳＸ蛋白の種々の濃度のポリアミド２（「ＰＡ−２Ｅ」）また
はジスタマイシンの存在下での結合を示すゲルシフト実験の結果を表すグラフで
ある。

【図１４】 ＥＳＸ暴露前（「前」）またはＥＳＸ／ＤＮＡ複合体の形成後
（「後」）に現出するポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）およびポリアミド２（「
ＰＡ−２Ｅ」）によるＥＳＸ／ＤＮＡ複合体の阻害の定量的比較を表すグラフ。

【図１５】 それぞれのポリアミドがＥＳＸ暴露前（「前」）またはＥＳＸ
／ＤＮＡ複合体の形成後（「後」）に現出する場合のＨＥＲ２／ｎｅｕプロモー
ターにより行われるインビトロ転写を阻害するポリアミド１（Ａ）および２（Ｂ
）の能力の定量的な比較を表すグラフ。

【図１６】ポリアミド２（「ＰＡ−２Ｅ」）またはジスタマイシン（「Ｄｉ
ｓｔ」）によるＥＳＸ／ＤＮＡ複合体の阻害の定量的比較を表すグラフである。

【図１７】 ポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）、ポリアミド２（「ＰＡ−２
Ｅ」）またはジスタマイシンによるＥＳＸ／ＤＮＡ複合体またはＡＰ−２／ＤＮ
Ａ複合体の形成の阻害の定量的比較を表すグラフである。

【図１８】 ポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）、ポリアミド２（「ＰＡ−２
Ｅ」）またはポリアミド３（「ＰＡ−３Ｅ」）によるＥＳＸ／ＤＮＡ複合体の形
成の阻害の定量的比較を表すグラフである。

【図１９】 ポリアミド１（「ＰＡ−１Ｅ」）、ポリアミド２（「ＰＡ−２
Ｅ」）、ポリアミド３（「ＰＡ−３Ｅ」）またはジスタマイシン（「Ｄｉｓｔ」
）がそれぞれＥＳＸへの暴露前に現出する場合の、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモータ
ーにより起こるインビトロ転写を阻害する能力の定量的比較を表すグラフである
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピーター・ビー・ダーバン アメリカ合衆国91125カリフォルニア州パ サディナ、メール・ステーション16−30、 イースト・カリフォルニア・ブールバード 1200番、カリフォルニア・インスティテュ ート・オブ・テクノロジー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4C084 AA01 AA02 AA03 AA07 BA01 BA10 BA13 CA59 MA01 MA17 MA23 MA28 MA31 MA35 MA37 MA52 MA55 MA56 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 ZB262 ZC412 4J001 DA01 DB10 GE02 JB50

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３の相補対であって
   、 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するように選択された芳
   香族カルボキサミド残基の相補対； グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ２，４−ジアミノ酪酸、および
   ５−アミノ吉草酸からなる群から選択される少なくとも２の脂肪族アミノ酸残基
   ；および 少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基 を含む遺伝子の転写の阻害に適したポリアミド。
2. 【請求項２】 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するよ
   うに選択される芳香族カルボキサミド残基の相補対が ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｃ／Ｇに対応するＰｙ／Ｉｍ、 ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ／Ｐｙ、および ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐ （ここで、ＩｍはＮ−メチルイミダゾールであり、ＰｙはＮ−メチルピロールで
   あり、Ｈｐは３−ヒドロキシＮ−メチルピロールである）からなる群から選択さ
   れる、請求項１記載のポリアミド。
3. 【請求項３】 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列が、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＴＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、および ５’−ＡＧＧＣＡＡ−３’ からなる群から選択される、請求項１記載のポリアミド。
4. 【請求項４】 ＥＳＸ、ＥＴＳ、ＡＰ−２、およびＴＢＰからなる群から選
   択される蛋白ファクターのｄｓＤＮＡに対する結合を調節することにより遺伝子
   の転写が阻害される、請求項１記載のポリアミド。
5. 【請求項５】 少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基がβ−アラニンである
   、請求項１記載のポリアミド。
6. 【請求項６】 末端アルキルアミノ残基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル
   残基である、請求項１記載のポリアミド。
7. 【請求項７】 ２つのβ−アラニン残基が、Ａ／ＴおよびＴ／Ａの群から選
   択されるヌクレオチド対に対応する相補対残基を形成する、請求項５記載のポリ
   アミド。
8. 【請求項８】 １つの脂肪族アミノ酸残基がＲ２，４−ジアミノ酪酸である
   、請求項１記載のポリアミド。
9. 【請求項９】 標的ｄｓＤＮＡ配列に対して少なくとも１０^９Ｍ^−１の結合
   親和性および少なくとも約２の選択性を有するポリアミドであり、選択性が同定
   された標的ｄｓＤＮＡ配列についての結合親和性の１塩基対ミスマッチｄｓＤＮ
   Ａ配列についての結合親和性に対する比と定義される、請求項１記載のポリアミ
   ド。
10. 【請求項１０】 芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３の相補対であり
    、同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するように選択された芳
    香族カルボキサミド残基の相補対；グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、
    Ｒ２，４−ジアミノ酪酸、および５−アミノ吉草酸からなる群から選択される少
    なくとも２の脂肪族アミノ酸残基；および少なくとも１つの末端アルキルアミノ
    残基を含む、癌遺伝子の転写の阻害に適したポリアミドであって、標的ｄｓＤＮ
    Ａ配列に対して少なくとも１０^９Ｍ^−１の結合親和性および少なくとも約２の選
    択性を有し、選択性が、同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対する
    結合親和性と１塩基対ミスマッチ配列ｄｓＤＮＡに対する結合親和性の比と定義
    されるポリアミド。
11. 【請求項１１】 同定されたｄｓＤＮＡのヌクレオチド配列に対応するよう
    に選択される芳香族カルボキサミド残基の相補対が、 ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｃ／Ｇに対応するＰｙ／Ｉｍ、 ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ／Ｐｙ、および ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐ （ここで、ＩｍはＮ−メチルイミダゾールであり、ＰｙはＮ−メチルピロールで
    あり、Ｈｐは３−ヒドロキシＮ−メチルピロールである）からなる群から選択さ
    れる、請求項１０記載のポリアミド。
12. 【請求項１２】 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列が、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＴＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、および ５’−ＡＧＧＣＡＡ−３’ からなる群から選択される、請求項１０記載のポリアミド。
13. 【請求項１３】 遺伝子の転写が、ＥＳＸ、ＥＴＳ、ＡＰ−２、およびＴＢ
    Ｐからなる群から選択される蛋白ファクターのｄｓＤＮＡに対する結合を調節す
    ることにより阻害される、請求項１０記載のポリアミド。
14. 【請求項１４】 少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基がβ−アラニンであ
    る、請求項１０記載のポリアミド。
15. 【請求項１５】 ２つのβ−アラニン残基がＡ／ＴおよびＴ／Ａの群から選
    択されるヌクレオチド対に対応する相補対残基を形成する、請求項１４記載のポ
    リアミド。
16. 【請求項１６】 １つの脂肪族アミノ酸残基がＲ２，４−ジアミノ酪酸であ
    る、請求項１０記載のポリアミド。
17. 【請求項１７】 末端アルキルアミノ残基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピ
    ル残基である、請求項１０記載のポリアミド。
18. 【請求項１８】 カルボキサミド対の少なくとも１つのＰｙがβ−アラニン
    で置換されている、請求項１０記載のポリアミド。
19. 【請求項１９】 医薬上許容される賦形剤と転写阻害量の少なくとも１つの
    ポリアミドを含んでなる組成物であって、各ポリアミドが、 芳香族カルボキサミド残基の少なくとも３の相補対であり、芳香族カルボキサ
    ミド残基の相補対が同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応するよ
    うに選択され；および グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｒ２，４−ジアミノ酪酸、および
    ５−アミノ吉草酸からなる群から選択される少なくとも２つの脂肪族アミノ酸残
    基、および少なくとも１つの末端アルキルアミノ残基を含み、ポリアミドが標的
    ｄｓＤＮＡ配列に対して少なくとも１０^９Ｍ^−１の結合親和性および少なくとも
    約２の選択性を有し、選択性が同定された標的ｄｓＤＮＡ配列についての結合親
    和性の１塩基対ミスマッチｄｓＤＮＡ配列についての結合親和性に対する比と定
    義される組成物。
20. 【請求項２０】 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列に対応する
    ように選択される芳香族カルボキサミド残基の相補対が、 ヌクレオチド対Ｇ／Ｃに対応するＩｍ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｃ／Ｇに対応するＰｙ／Ｉｍ、 ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＰｙ／Ｐｙ、 ヌクレオチド対Ｔ／Ａに対応するＨｐ／Ｐｙ、および ヌクレオチド対Ａ／Ｔに対応するＰｙ／Ｈｐ （ここで、ＩｍはＮ−メチルイミダゾールであり、ＰｙはＮ−メチルピロールで
    あり、Ｈｐは３−ヒドロキシＮ−メチルピロールである）からなる群から選択さ
    れる、請求項１９記載の組成物。
21. 【請求項２１】 同定されたｄｓＤＮＡ標的のヌクレオチド配列が、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＡＧＡＡＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＴＧＣＴＴＧＡ−３’、 ５’−ＴＧＡＧＧＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＴＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＧＡＡＧＴ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＧＴＡＴＡＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、 ５’−ＡＡＣＧＧＣＴ−３’、 ５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’、および ５’−ＡＧＧＣＡＡ−３’ からなる群から選択される、請求項１９記載の組成物。
22. 【請求項２２】 少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基がβ−アラニンであ
    る、請求項１９記載の組成物。
23. 【請求項２３】 末端アルキルアミノ残基がＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピ
    ル残基である、請求項１９記載の組成物。
24. 【請求項２４】 ２つのβ−アラニン残基がＡ／ＴおよびＴ／Ａの群から選
    択されるヌクレオチド対に対応する相補対残基を形成する、請求項２３記載の組
    成物。
25. 【請求項２５】 １つの脂肪族アミノ酸残基がＲ２，４−ジアミノ酪酸であ
    る、請求項１９記載の組成物。