TW202400788A - 用於靶向遞送治療劑的雙環雜環及其配體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了新的雙環雜環化合物及其靶向配體，其可以與治療劑綴合，用作藥物。揭露了其製備方法，包含該治療性化合物的醫藥組成物和藥物用途。
Description
本發明屬醫藥領域，關於雙環雜環、GalNAc-綴合物、寡核苷酸治療劑、其製備方法，包含該化合物的醫藥組成物及其醫藥用途。
使用與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)綴合的N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)綴合物將寡核苷酸靶向遞送至肝的肝細胞，已成為治療性寡核苷酸領域的突破性方法。ASGPR是將治療性寡核苷酸遞送至肝臟的理想靶標，因為其同時具有組織特異性、高表達水平(500,000拷貝/細胞)和快速內化和更新(15分鐘)。GalNAC-綴合物導致了針對肝細胞中多種靶標的幾種FDA批准的siRNA藥物和許多的臨床候選物。除了寡核苷酸，GalNAc還與小分子、肽、蛋白質和LNP綴合，用於靶向肝細胞。還充分記錄了不同價的寡糖在抑制標記配體與哺乳動物肝細胞上肝凝集素結合的抑制能力上的巨大層次結構如下：四觸角>三觸角>>雙觸角>>單觸角。憑藉GalNAc-綴合物作為強大遞送平臺的優勢，多樣化的GalNAc-綴合物結構對於提高不同模式的性能非常重要。
之前已經揭露了其他GalNAc綴合物部分。GalNAc藉由不同的接頭與寡核苷酸連接。其中，三觸角GalNAc是利用四官能團和三官能團形成的。
四官能團藉由不同的長接頭連接三個GalNAc。三官能團連接GalNAc、寡核苷酸和固體支持物(在合成過程中)。三、三酸、羥基脯胺酸、甘油和其他衍生物廣泛用作四官能團和三官能團。儘管在寡核苷酸和寡核苷酸類似物作為治療劑的應用方面取得了進展，但仍需要具有改進的藥理學特性的寡核苷酸。
本發明揭露了一系列包括雙環雜環和多環己烷結構的四官能團和三官能團，其可以將GalNAc與寡核苷酸和其他具有獨特形狀和性質的治療劑連接起來。一方面，提供了一種具有式(I-a)所示結構的靶向配體：
其中，
X1和X2各自獨立地選自NRa(CH2)r-、-O(CH2)r-和-S(CH2)r-，R1和R2連接至N、O或S；
M1為C、CH或N；
M2為不存在O、C(O)或CH2；
M3為不存在CH、C、N、O、S；
M4和M6各自獨立地選自C(O)和CH2；
M5為CH、CH2或NH；
Ra選自氫、氘、鹵素、胺基、氰基、羥基、烷基、烷氧基、烷硫基和鹵烷基；
R1為氫或保護基團；
R2為氫或固體支持物，其視需要藉由接頭基團、或亞磷醯胺連接；
R3獨立地選自氫、胺基、-(CH2)rCOOH、烷基胺基或羥基烷基；
或者，R3中的兩個與它們所連接的C原子形成含有N原子的雜環基；含N原子的雜環基具有式(II)所示結構：
R是藉由接頭基團連接的具有羥基保護基團的碳水化合物或其衍生物；
Rb獨立地選自氫、側氧基和烷基；
m是0、1、2、3、4、5或6；
n是0、1、2、3、4、5或6；
x是1、2、3或4；
y是1、2、3或4；和
r各自獨立地選自0、1、2和3。
本發明揭露了一系列包括雙環雜環和多環己烷結構的四官能團和三官能團，其可以將GalNAc與寡核苷酸和其他具有獨特形狀和性質的治療劑連接起來。一方面，提供了一種具有式(I)所示結構的靶向配體：
其中，
X1和X2各自獨立地選自NRa(CH2)r-、-O(CH2)r-和-S(CH2)r-，R1和R2連接至N、O或S；
M1為C、CH或N；
M2為不存在O、C(O)或CH2；
M3為不存在CH、C、N、O、S；
M4和M6各自獨立地選自C(O)和CH2；
M5為CH、CH2或NH；
Ra選自氫、氘、鹵素、胺基、氰基、羥基、烷基、烷氧基、烷硫基和鹵烷基的基團；
R1為氫或保護基團；
R2為氫或固體支持物，其視需要藉由連接子基團、或亞磷醯胺連接；
R3獨立地選自氫、胺基、-(CH2)rCOOH、烷基胺基或羥基烷基；
或者，R3中的兩個與它們所連接的C原子一起形成含有N原子的雜環基；該含有N原子的雜環基具有式(II)所示結構：
R為藉由接頭基團連接的，具有羥基保護基團的碳水化合物或其衍生物；
Rb獨立地選自氫、側氧基和烷基；
m為0、1、2、3、4、5或6；
n為0、1、2、3、4、5或6；
x為1、2、3或4；
y為1、2、3或4；且
r各自獨立地選自0、1、2和3。
在一個實施方案中，靶向配體具有式(III)或(III-a)所示的結構：
Rb獨立地選自氫和側氧基；
m和n各自獨立地選自1、2、3、4和5
m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。
在一個實施方案中，靶向配體具有式(III-b)、(III-c)或(III-d)所示的結構：
m獨立地選自0、1、2、3、4和5；
n獨立地選自1、2、3、4和5；
r、s和t各自獨立地選自0、1和2；
m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。
在一個較佳的實施方案中，R經由接頭基團連接，其具有結構：
- 接頭-R9，其中R9是碳水化合物。
在一個更佳的實施方案中，R9選自半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、D-半乳糖胺醇、甘露糖、甘露糖胺、甘露糖-6-磷酸、葡萄糖、葡糖胺、N-乙醯-葡糖胺(GluNAc)、葡萄糖-6-磷酸、葡糖胺醇、葡萄糖甘油醛、岩藻糖、岩藻糖胺、墨角藻糖、乳糖、阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、克拉定糖、赤蘚糖、赤蘚酮糖、果糖、D-岩藻糖醇、L-岩藻糖醇、L-甘油-D-甘露糖-庚糖、甘油、甘油酮、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、阿洛酮糖、奎諾糖、喹諾酮胺、鼠李糖、鼠李糖醇、鼠李糖胺、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔羅糖、酒石酸、蘇糖、木糖和木酮糖。
在一些實施方案中，R9是N-乙醯半乳糖胺。
在一個實施方案中，R藉由接頭基團連接，具有式(IV)、(IV-a)、(IV-b)或(IV-c)所示的結構：
A為C3-10環烷基或4-12員雜環基；
L1、L2、L3、L4和L5各自獨立地選自不存在O、S、S-S、NH、CO、CONH、NHCO和4-10員雜環基的取代基；
R4、R6、R7和R8各自獨立地選自CH2、OCH2CH2和CH2CH2O的取代基；
R5獨立地選自不存在、CH2、OCH2、CH2O、OCH2CH2、CH2CH2O、NHCH2、CH2NH、NHCH2CH2、CH2CH2NH、C0-6烷基(C3-8環烷基)和C0-6烷基(4-10員雜環基)的取代基；
R9為碳水化合物；
t1、t2、t3、t4和t5各自獨立地選自0、1、2、3、4、5和6。
在一個實施方案中，R具有式(IV-1)、(IV-a-1)、(IV-b-1)或(IV-c-1)所示的結構：
其中，A為
、
、
、
、
或
L1、L3、L4和L5各自獨立地選自不存在、O、S、S-S、NH、CO、CONH和NHCO的取代基；
L2為不存在、O、S、S-S、NH、CO、CONH、NHCO和
；
R5獨立地選自不存在、CH2、CH2O、CH2NH、C3-6環烷基、C3-6環烷基C1-3烷基、含有1、2或3個選自N或O的環雜原子的4-8員雜環基和含有1、2或3個選自N或O的雜原子的4-8員雜環基。
在一些實施方案中，R具有式(IV-d)、(IV-e)、(IV-f)、(IV-d-a)、(IV-e-a)或(IV-f-a)所示的結構：
其中，
R5獨立地選自OCH2、NHCH2和含有1或2個選自N或O的雜原子的4-6員雜環基的取代基；
m獨立地選自0、1、2、3、4、5和6；
n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和
r為0、1、2、3、4或5。
在一些實施方案中，R9是N-乙醯半乳糖胺。
在一些實施方案中，R5獨立地選自-OCH2-、-NHCH2-
和
在一些實施方案中，R為：
或
s獨立地選自0、1、2和3；
r獨立地選自0、1、2、3、4和5；
n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些實施方案中，R為：
r獨立地選自0、1、2、3、4和5；
n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些實施方案中，n為7或8。
在一些實施方案中，R為：
在一些實施方案中，該靶向配體是：
或
Rp為H或羥基保護基，較佳地，羥基保護基為乙醯基；
X為O或S；
m和n各自獨立地選自1或2；
m1和n1各自獨立地選自1、2或3。
在一些實施方案中，R1為氫。
在一些實施方案中，R1為取代的或未取代的三苯基甲基羥基保護基。
在一些實施方案中，R1為
、
或
在一些實施方案中，R1為
、
、
在一些實施方案中，R2為氫。
在一些實施方案中，R2為
，
為固體支持物。
在一些實施方案中，R2為
。
本發明的靶向配體可以與治療劑連接，用作藥物。該治療劑選自小分子藥物和大分子藥物。
在一個較佳的實施方案中，該治療劑是siRNA。
在另一方面，本發明還提供式(V)和(VI)的螺環和稠合雙環雜環。雙環化合物是包含兩個連接在一起的環的分子。環可以藉由三種不同的方式連接，包括(1)稠合雙環-兩個原子和它們之間共享的鍵；(2)橋接雙環-共享超過兩個原子；(3)螺環-兩個環連接在一個原子上。雙環化合物可以是完全碳環(全碳)或雜環(具有一個或多個非碳原子)。雙環雜環是藥物合成中的關鍵中間體，可以分為含氮、含硫和含氧化合物。雙環雜環由於其有趣的構象特徵及其對生物系統的結構意義而最近受到關注。剛性的雙環化合物是重要的目標，因為它們以獨特的形狀和特性顯示出多種新的生物活性。此外，除了潛在的調節結合效力和特異性外，雙環骨架還可以提高生物利用度和代謝穩定性，這是開發新藥物實體時的關鍵問題。該專利設計了一系列具有多個官能團的新型螺環和稠合雙環雜環，如下所示。這些螺環和稠合雙環化合物可以用於連接不同的部分，如GalNAc、寡核苷酸和固體支持物。
Rb獨立地選自氫和側氧基；
m和n各自獨立地選自1、2、3、4和5
m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。
在另一方面，本發明還提供式(VI-a)、(VI-b)或(VI-c)的雙環雜環，或其互變異構體、藥學上可接受的鹽：
m獨立地選自0、1、2、3、4和5；
n獨立地選自1、2、3、4和5；
r、s和t各自獨立地選自0、1和2；
m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。
在一個較佳實施方案中，化合物選自以下結構：
GalNAc-螺環/稠合雙環綴合
GalNAc可以藉由不同的接頭和連接基團(tethering group)與不同的模式(modalities)綴合。螺環/雙環化合物可以為整個綴合提供獨特的構象。為了將GalNAc引入寡核苷酸，可以首先將GalNAc配體組裝成單片所謂的三觸角配體，然後與固體支持物綴合或轉換為其亞磷醯胺形式。然而，還描述了使用單價GalNAc支持物和兩次添加單價GalNAc亞磷醯胺的替代方法，並產生如下所示的結構。這種(1+1+1)三價GalNAc結構導致GalNAc修飾的siRNA寡核苷酸在體外和體內的效力等同於具有三觸角GalNAc配體的等價siRNA。
本發明提供了一系列新的GalNAc-雙環化合物，其可以藉由醯胺化物化學與寡核苷酸綴合，或上樣至固相支持物上用於固相寡核苷酸合成，例如：
四官能團選自：
在另一方面，本發明提供了一種治療性化合物，其包含至少一種治療性寡核苷酸以及與靶向配體綴合的寡核苷酸。
在一些實施方案中，靶向配體綴合至寡核苷酸的3'端或5'端；更佳地，寡核苷酸是siRNA；更佳地，siRNA是C3、C5、CFB、PCSK9、TTR、AGT、LPA、Agtr1、ALK、VEGF、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA、APOC3、ASGR1、CIDEB、COL1A1、COL3A1、CTGF、DGAT2、DMPK、DNAJC15/MCJ、DPP4、因子VIII、因子X、因子IX、因子XI、因子XII、GPR146、GPR75、GRB10/14、TLR7/8/RIG-1、HSD17B13、INHBE、ITGV6、KHK、KLK1、MASP2、MTARC1、MUC5B、NPC1L1、PNPLA3、ASGR1、SCAP、SERPINA1、SERPINF2、SREBF2、HMGCR、TGFB1、COX-2、TP53、CD4、CD8、CD40、CD71、DUX4、XDH、LDHA、ALDH2、DMD、EPHA2、KIF11、BCL2L12、APOA1、TRPV1、CASP2、KRAS、TMPRSS6、STAT3、PRDM14、PTGS2、CTGF、DDIT4、siRNA。
與現有的GalNAc綴合物相比，本發明的新型GalNAc綴合物在體外和體內具有更好的活性。
本發明還提供了一種醫藥組成物，其包含治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在另一個方面，本發明涉及一種治療疾病或病症的方法，其包括向需要其的受試者施用有效量的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物。
在一些實施方案中，該疾病或病症是肝病、遺傳病、出血性疾病(例如，血友病)、罕見病(例如，肢端肥大症)、代謝疾病(例如，高膽固醇血症、血脂異常、高甘油三酯血症)、心血管疾病、肥胖症、血色素沉著症、酒精依賴和貧血(例如，慢性病性貧血、地中海貧血)。
在一些實施方案中，肝病是肝損傷、肝纖維化、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或病毒性肝炎。
在另一方面，本發明涉及合成治療性化合物的方法，包括：提供式(I)的靶向配體，以及將靶向配體綴合至寡核苷酸。
在一個較佳的實施方案中，靶向配體綴合至寡核苷酸的3'端或5'端。
在一個較佳的實施方案中，靶向配體可以綴合至寡核苷酸的3'端和5'端。
如前該，GalNAc可以作為單個片段或逐步(1+1+1)綴合至寡核苷酸。
要實現1+1+1組裝，應當合成單-GalNAc醯胺化物和單-GalNAc固體支持物。
Rb、m、n、m1和n1如式(V-a)和(V-b)所定義。
具體方法如下，
圖1闡明siRNA-24和siRNA-25在體內研究中對血清mC3蛋白的影響。
圖2闡明siRNA-24和siRNA-25在體內研究中對肝臟mC3 mRNA水平的影響。
下面給出的是本申請中使用的術語的定義。本文未定義的任何術語均採用所屬技術領域具有通常知識者理解該術語的通常含義。
“烷基”是指飽和脂肪烴基團，包括C1-C20直鏈和支鏈基團。較佳地，烷基為具有1至12個，有時較佳1至6個，有時更佳1至4個碳原子的烷基。代表性示例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基以及其支鏈異構體。更佳地，烷基為具有1至6個碳原子的低級烷基。代表性示例包括，但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以為取代的或未取代的。當被取代時，取代基可以在任何可用的連接點取代，較佳地取代基為一個或多個
獨立地選自烷基、鹵素、烷氧基、烯基、炔基、烷硫基、烷胺基、巰基、羥基、硝基、氰基、胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基的取代基。
“烷氧基”是指-O-(烷基)和-O-(未取代的環烷基)基團，其中烷基如上面所定義。代表性示例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基等。烷氧基可以為被取代的或未被取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個，有時較佳為一個至五個，有時更佳為一個至三個取代基，該取代基獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。
“烷硫基”是指-S-(烷基)和-S-(未取代的環烷基)基團，其中烷基如上面所定義。
“鹵烷基”是指被鹵素基團取代的烷基基團，其中烷基如上面所定義。
“鹵素”是指氟、氯、溴或碘原子。
“環烷基”是指飽和和/或部分不飽和的單環或多環烴基，其具有3至20個碳原子，較佳3至12個碳原子，更佳3至10個碳原子，最佳3至8個碳原子或3至6個碳原子。單環環烷基的代表性示例包括，但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等。多環環烷基包括具有螺環、稠環或橋環的環烷基。
“螺環烷基”是指5至20員多環基團，環藉由一個共同的碳原子(稱為螺原子)連接，其中一個或多個環可以包含一個或多個雙鍵，但沒有一個環
具有完全共軛的π電子系統。較佳地，螺環烷基為6至14員，更佳7至10員。根據共同的螺原子數，將螺環烷基分為單螺環烷基、雙螺環烷基或多螺環烷基，較佳單螺環烷基或雙螺環烷基，更佳4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺環烷基。螺環烷基的代表性示例包括，但不限於以下取代基：
“稠環烷基”是指5至20員多環烴基，其中系統中的每個環與另一個環共享一對相鄰的碳原子，其中一個或多個環可以包含一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳地，稠環烷基為6至14員，更佳7至10員。根據組成環的數目，將稠環烷基分為雙環、三環、四環或多環稠環烷基，較佳雙環或三環稠環烷基，更佳5員/5員或5員/6員雙環稠環烷基。稠環烷基的代表性示例包括但不限於以下取代基：
“橋環烷基”是指5至20員多環烴基，其中系統中每兩個環共享兩個不相連的碳原子。這些環可以具有一個或多個雙鍵，但沒有完全共軛的π電子系統。較佳地，橋環烷基為6至14員，更佳7至10員。根據組成環的數目，將橋環烷基分為雙環、三環、四環或多環橋環烷基，較佳雙環、三環或四環橋環烷基，更佳雙環或三環橋環烷基。橋環烷基的代表性示例包括但不限於以下取代基：
環烷基可以與芳基、雜芳基或雜環烷基的環稠合，其中與母體結構連接的環為環烷基。代表性示例包括但不限於茚滿基乙酸、四氫萘、苯并環庚基等。環烷基為視需要被取代的或未被取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個，有時較佳為一個至五個，有時更佳為一個至三個取代基，該取代基獨立地選自烷基、鹵素、烷氧基、烯基、炔基、烷硫基、烷胺基、巰基、羥基、硝基、氰基、胺基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。
“雜環基”是指3至20員飽和的和/或部分不飽和的單環或多環烴基，其具有一個或多個，有時較佳一個至五個，有時更佳一個至三個選自N、O和S(O)m(其中m為0、1或2)的雜原子作為環原子，但環中不包含-O-O-、-O-S-或-S-S-，其餘環原子為C。較佳地，雜環基為具有1至4個雜原子的3至12員雜環基，更佳具有1至3個雜原子的3至10員雜環基，最佳具有1至2個雜原子的5至6員雜環基。單環雜環基的代表性示例包括但不限於吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括具有螺環、稠環或橋環的雜環基。
“螺雜環基”是指5至20員多環雜環基，環藉由一個共同的碳原子(稱為螺原子)連接，其中該環具有一個或多個，有時較佳一個至五個，有時更佳
一個至三個選自N、O和S(O)m(其中m為0、1或2)的雜原子作為環原子，其餘環原子為C，其中一個或多個環可以包含一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳地，螺雜環基為6至14員，更佳7至10員。根據共同的螺原子數，將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳單螺雜環基或雙螺雜環基，更佳4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。螺雜環基的代表性示例包括，但不限於以下取代基：
“稠雜環基”是指5至20員多環雜環基，其中系統中的每個環與其他環共享相鄰的一對碳原子，其中一個或多個環可以包含一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中該環具有一或多個，有時較佳一至五個，有時更佳一至三個選自N、O和S(O)p(其中p為0、1或2)的雜原子作為環原子，其餘環原子為C。較佳地，稠雜環基為6至14員，更佳7至10員。根據環數目，將稠雜環基分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳雙環或三環稠雜環基，更佳5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的代表性示例包括但不限於以下取代基：
“橋雜環基”是指5至14員多環雜環烷基，其中體系中每兩個環共享兩個不相連的原子，該環可以具有一個或多個雙鍵，但沒有完全共軛的π電子系統，該環具有一或多個選自N、O和S(O)m(其中，m為0、1或2)的雜原子作為環原子，其餘環原子為C。較佳地，橋雜環基為6至14員，更佳7至10員。根據組成環的數目，將橋雜環基分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳雙環、三環或四環橋雜環基，更佳雙環或三環橋雜環基。橋雜環基的代表性示例包括，但不限於以下取代基：
該雜環基的環可以與芳基、雜芳基或環烷基的環稠合，其中與母體結構結合的環為雜環基。代表性示例包括，但不限於以下取代基：
雜環基為視需要被取代的或未被取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個，有時較佳為一個至五個，有時更佳為一個至三個，該基團獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。
使用“雜環”，旨在包括雜芳基。
“醫藥組成物”是指一種或多種本發明所述的化合物或其生理學上/藥學上可接受的鹽或前藥，與其他化學組分如生理學上/藥學上可接受的載體和賦形劑的混合物。醫藥組成物的目的在於促進化合物對生物體的施用，有利於活性成分的吸收，從而發揮生物活性。
“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的鹽，該鹽在哺乳動物中使用時是安全有效的，並具有相應的生物學活性。
“視需要的”或“視需要地”是指隨後描述的事件或情況可以，但不必須發生，並且該描述包括事件或情況可以發生或可以不發生的狀況。例如，“視需要被烷基取代的雜環基”是指烷基可以但不是必須存在，該描述包括雜環基被烷基取代和雜環基未被烷基取代的情況。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳至多5個，更佳1至3個氫原子，獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅存在於它們可能的化學位置上。所屬技術領域具有通常知識者藉由實驗或理論無需付出
過多的努力就能夠確定取代是否可能。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和鍵的碳原子(如烯屬)的組合可能是不穩定的。
如本文所用，“綴合物”是指與非核苷酸部分共價連接的生物分子。本發明的特定綴合物是核酸綴合物，其中核酸分子(例如，寡核苷酸或siRNA)共價連接至非核苷酸部分，如本發明的GalNAc綴合物部分。
如本文所用的“寡核苷酸”被定義為所屬技術領域具有通常知識者通常理解為包含兩個或更多個共價連接的核苷的分子。這種共價結合的核苷也可稱為核酸分子或寡聚體。
寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成然後純化進行製備。當提及寡核苷酸的序列時，提及共價連接的核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明的寡核苷酸是人造的，是化學合成的，通常是純化或分離的。本發明的寡核苷酸可以包含一種或多種修飾的核苷或核苷酸。
“siRNA”可能由兩條退火的多核苷酸或形成髮夾結構的單條多核苷酸組成。本發明的siRNA分子包含有義區和反義區。反義區具有的核苷酸序列與靶核酸相同(完全互補)或幾乎相同(部分互補)。
RNAi分子本質上是一種合成的人造分子，在RNA干擾(RNAi)途徑中運作，在該途徑中，它藉由在轉錄後降解mRNA來干擾具有互補核苷酸序列的靶核酸，從而導致不進行翻譯。siRNA藉由稱為Dicer的蛋白質複合物相互作用，Dicer將siRNA切成更小的片段。這些片段中的一條鏈，在大多數情況下是反義鏈，被加載到另一種稱為RNA誘導沉默複合物(RISC)的蛋白質複合物中。然後，RISC結合的鏈藉由鹼基配對將複合物連接到靶核酸。靶核酸被切割和破壞，因此無法合成蛋白質。
“抑制表達”是指表達或活性的降低或阻斷，並不一定表示表達或活性的完全消除。
實施例
以下實施例用於闡明本發明，但不應認為這些實施例用於限制本發明的範圍。本發明實施例對實驗方法的具體條件如無特別說明，則一般按照原料和產品生產廠家的常規條件或推薦條件。未標明具體來源的試劑均為市售常規試劑。
藉由核磁共振(NMR)和/或質譜(MS)鑑定每種化合物的結構。NMR化學位移(δ)以10-6(ppm)給出。NMR由Varian Mercury 300MHz Bruker Avance III 400MHz儀器測定。所使用的溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d 6 )、氘代氯仿(CDCl3)和氘代甲醇(CD3OD)。
高效液相色譜法(HPLC)在Agilent 1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜管柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜管柱)上測定。在Agilent 1200高壓液相色譜儀&質譜儀(Sunfire C18 4.6*50mm 3.5um色譜管柱)和Agilent 19091S-433 HP-5高壓液相色譜儀&質譜儀(XBridge C18 4.6*50mm 3.5um色譜管柱)上測定液相色譜質譜(LCMS)。
手性高效液相色譜(HPLC)在SFC Thar 80 & 150 & 200(Waters)上測定。
薄層色譜法所使用的薄層矽膠板為Yantai Xinnuo矽膠板。TLC中使用的板的尺寸為0.15至0.2mm，用於產品純化的薄層色譜法中使用的板的尺寸為0.4至0.5mm。
管柱層析法一般使用Qingdao Haiyang 200至300目矽膠作為載體。
本發明已知的原料可以藉由現有技術中常規的合成方法製備，或者可以購買自ABCR GmbH & Co.KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChermBio Inc或Dari chemical Company等。
除非在實施例中另有說明，以下反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
術語“氬氣氛”或“氮氣氛”是指反應燒瓶配備有具有1L氬氣或氮氣的氣球。
術語“氫氣氛”是指反應燒瓶配備有具有1L氫氣的氣球。
MS為質譜法，其中(+)是指正模式，通常給出M+1(或M+H)吸收，其中M=分子質量。
實施例1
化合物1-2：
在0℃攪拌化合物1-1(5g，12.84mmol)的無水1,2-二氯乙烷(30mL)溶液，在持續攪拌下經10分鐘滴加TMSOTf(3.43g，15.41mmol，2.78mL)，在室溫中繼續攪拌過夜。將反應混合物用冷的飽和NaHCO3溶液(200mL)淬滅，分離有機層。產物用二氯甲烷(60mL×2)萃取；合併的有機層用水和鹽水洗滌，經無水
Na2SO4乾燥，減壓蒸發至乾燥以獲得呈黃色油狀的化合物1-2(4.23g，99%產率)，其不經進一步純化即使用。
C14H19NO8質量計算為：329.1；實測為：330.1[M+H]+，ESI。
化合物1-3：
將化合物1-2(4.23g，12.85mmol)的無水1,2-二氯乙烷(20mL)溶液與4Å分子篩(4.7g)在室溫中攪拌5分鐘。添加5-己烯-1-醇(1.42g，14.13mmol)，繼續攪拌30分鐘。在0℃滴加TMSOTf(1.43g，6.42mmol，1.16mL)，在室溫中繼續攪拌2小時。將反應混合物用冷的飽和NaHCO3溶液(100mL)淬滅，分離有機層。產物用二氯甲烷(60mL×2)萃取；合併的有機層用水洗滌，經無水Na2SO4乾燥，減壓蒸發至乾燥以獲得呈黃色油狀的化合物1-3(5.5g，99%產率)，其不經進一步純化即使用。
C20H31NO9質量計算為：429.2；實測為：430.2[M+H]+，ESI。
化合物1-4：
向化合物1-3(5.5g，12.81mmol)的DCM(35mL)和MeCN(35mL)溶液中加入4.0mol當量的(偏)高碘酸鈉(10.96g，51.24mmol)的水(45.5mL)溶液。將混合物在冰浴中冷卻至0℃，攪拌15分鐘。將氯化釕三水合物(110.5mg，423μmol)添加到冷的反應混合物中。將反應混合物在室溫攪拌4小時。反應混合物用水(90mL)稀釋，藉由添加固體NaHCO3，將pH調節至7.5。除去DCM層，水層用DCM(30mL×2)洗滌，棄去有機萃取物。藉由加入檸檬酸將水層的pH調節至3，將羧酸1-4萃取到DCM(50mL×3)中。將有機層與飽和鹽水(50mL×1)一起攪拌，然後滴加Na2S2O3溶液(50mL×1)直至深綠色有機相變成淡黃色。分離各層，
有機層經無水Na2SO4乾燥並減壓蒸發，得到呈白色固體的化合物1-4(2.3g，40%產率)。無需進一步純化即可使用。
C19H29NO11質量計算為：447.2；實測448.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.81(d,J=9.2Hz,1H),5.84-5.73(m,1H),5.21(d,J=3.3Hz,1H),4.98-4.93(m,3H),4.48(d,J=8.5Hz,1H),4.04-4.00(m,3H),3.88-3.83(m,1H),3.73-3.68(m,1H),3.40-3.36(m,1H),2.10(s,3H),2.03-2.02(m,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.76(s,3H),1.43-1.32(m,4H)。
化合物1-6：
向化合物1-5(1.16g，6.17mmol)和酸1-4(2.3g，5.14mmol)的DMF(30mL)溶液中加入HBTU(2.92g，7.71mmol)和DIPEA(1.99g，15.42mmol，2.69mL)。將反應在室溫中攪拌43小時，用水(150mL)稀釋。將混合物用乙酸乙酯(60mL×3)萃取。用水(100mL×3)和鹽水(100mL)連續洗滌合併的有機層。經無水Na2SO4乾燥後，將溶劑在減壓下蒸發，以獲得呈黃色油狀的化合物1-6(4.3g，粗產物)，無需進一步純化即可使用。
質量計算為：C29H48N2O12：616.3；實測為：617.4[M+H]+，ESI。
化合物1-7：
將化合物1-6(4.23g，假定為6.86mmol)加入到甲酸(30mL)中，將混合物在室溫攪拌過夜。藉由LC-MS完整地測定反應。然後，將混合物減壓蒸發，藉由矽膠色譜法純化(DCM：MeOH=10：1)得到呈黃色油狀的化合物1-7(2.88g，經過兩個步驟，75%產率)。
C25H40N2O12質量計算為：560.3；實測為：561.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.02(s,1H),7.83(d,J=9.2Hz,1H),7.25(t,J=5.6Hz,1H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),4.96(dd,J=11.2,3.6Hz,1H),4.47(d,J=8.4Hz,1H),4.04-4.00(m,3H),3.90-3.83(m,1H),3.73-3.68(m,1H),3.42-3.36(m,1H),3.02-2.97(m,1H),2.18(t,J=7.2Hz,2H),2.10(s,3H),2.02(t,J=7.2Hz,2H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.54-1.41(m,7H),1.27-1.21(m,3H)。
實施例2
方法1：
化合物2-1：
2,2-雙(溴甲基)丙烷-1,3-二醇(270g，1.03mol)、苯甲醛(114.86g，1.08mol)、TsOH(17.74g，340.55mmol)在甲苯(1L)中的混合物回流6小時。將混合物冷卻，用EA(1L)萃取，用NaHCO3溶液洗滌，然後用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥。減壓除去溶劑，殘餘物用MeOH再結晶得到所需產物2-1(247g，68%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.47-7.41(m,2H),7.40-7.36(m,3H),5.48(s,1H),4.09-3.93(m,6H),3.46(s,2H)。
化合物2-2：
向t-BuOK(137.27g，1.43mol)在無水DMF(700mL)中的懸浮液中滴加丙二酸二異丙酯(268.85g，1.43mol)(溫度保持在70℃以下)，然後添加化合物2-1(250g，714.19mmol)。將所得反應混合物在140℃加熱6小時。冷卻後，加入飽和NH4Cl溶液(1.5L)，混合物用己烷(500mL3)萃取。將合併的有機萃取物經硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮。藉由過濾將固體產物與液體殘餘物分離，用己烷(100mL×2)洗滌並乾燥以產生呈白色固體的純產物2-2(194g，68%產率)。
C21H28O6質量計算為：376.2；實測為：377.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.45-7.31(m,5H),5.45(s,1H),5.02-4.93(m,2H),3.96(d,J=11.2Hz,2H),3.77(d,J=11.1Hz,2H),2.55(s,2H),2.13(s,2H),1.23-1.15(m,12H)。
化合物2-3：
向化合物2-2(155g，411.7mmol)在MeOH(750mL)的溶液中加入10% Pd/C(31g)，將所得懸浮液在5atm H2中在環境溫度中在攪拌下氫化48小時。過濾催化劑，在真空中除去溶劑以產生呈無色油狀的化合物2-3(118g，99%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C21H28O6質量計算為：288.2；實測：289.4[M+H]+，ESI。
化合物2-4：
向化合物2-3(140g，485.5mmol)在二氯甲烷(840mL)中的溶液中加入甲磺醯氯(155.7g，1.36mol)。將所得混合物冷卻至-30℃，然後滴加三乙胺(323.9g，3.2mol)。添加完成後，將反應混合物溫熱至環境溫度，攪拌12小時，然後用水
(1000mL)、10%檸檬酸水溶液(1000mL)和鹽水(1000mL)洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥，減壓蒸發以得到化合物2-4(125g，58%產率)。
質量計算為：C21H28O6：444.1；實測為：445.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 5.02-4.93(m,2H),4.20(s,4H),3.23(s,6H),2.45(s,4H),1.22-1.14(m,12H)。
化合物2-5：
將化合物2-4(63g，141.73mmol)、碳酸鉀(100.88g，729.89mmol)和對甲苯磺醯胺(25.48g，148.81mmol)在DMSO(300mL)中的溶液在85℃中加熱12小時。冷卻後，加入水(300mL)，將混合物用EtOAc(600mL)萃取。合併的有機相用10%檸檬酸水溶液(600mL)和鹽水(600mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並真空蒸發，然後用異丙醚再結晶得到化合物2-5(48g，80%產率)。
C21H28O6質量計算為：423.2；實測為：424.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.67(d,J=8.2Hz,2H),7.45(d,J=8.0Hz,2H),4.45(t,J=5.4Hz,2H),3.60(s,4H),3.14(d,J=5.7Hz,4H),2.43(s,3H),1.67(s,4H)。
化合物2-6：
在-20℃中，向化合物2-5(58.7g，138.60mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入硼氫化鋰(2M)在THF(263.82mL)中的溶液。將所得的混合物在室溫攪拌16小時。將混合物緩慢加入冰水(1L)中。用檸檬酸水溶液將pH調節至7。將混合物用EA(500mL)萃取，經無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸發以得到化合物2-6(40g，93%產率)。
C21H28O6質量計算為：311.1；實測：312.1[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ 7.67(d,J=8.2Hz,2H),7.45(d,J=8.0Hz,2H),4.45(t,J=5.4Hz,2H),3.60(s,4H),3.14(d,J=5.7Hz,4H),2.43(s,3H),1.67(s,4H)。
化合物2-7：
將化合物2-6(5g，16.1mmol)和Mg(粉末，3.47g，144.6mmol)在MeOH(無水，60mL)中混合，在室溫中攪拌過夜。LC-MS表明完全轉化，加入水(30mL)。形成白色沉澱。過濾混合物，濾液用HCl調節至pH 6(水溶液，4M)，濃縮至乾燥，得到呈黃色固體的化合物2-7(2.55g粗產物)。粗產物無需進一步純化即可使用。
C8H15NO2質量計算為：157.1；實測：158.1[M+H]+，ESI。
化合物2-8：
將化合物2-7(2.55g，假定為16.2mmol)溶解在二噁烷(20mL)中，在0℃緩慢加入FmocCl(4.60g，17.8mmol)，然後加入Na2CO3(飽和，20mL)。將反應在30℃攪拌3小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物藉由EA(20mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=97：3)得到白色固體2-8(2.75g，經兩步為44.7%產率)。
C23H25NO4質量計算為：379.2；實測：380.2[M+H]+，ESI。
化合物2-9：
將化合物2-8(2.7g，7.1mmol)和吡啶(20mL)在燒瓶中混合，分批加入DMTr-Cl(2.4g，7.1mmol)。將反應在室溫中攪拌4小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物藉由EA(20mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=97：3)得到黃色固體2-9(2.8g，58%產率)。
C44H43NO6質量計算為：681.3；實測：682.3[M+H]+，ESI。
化合物2-10：
將化合物2-9(2.3g，6.8mmol)、哌啶(5mL)和MeOH(無水，45mL)在燒瓶中混合，在30℃攪拌3小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=95：5)，得到黃色固體2-10(0.5g，33%產率)。
C29H33NO4：459.2；實測：460.2[M+H]+，ESI。
化合物2-11：
將化合物1-7(325mg，0.58mmol)、HOBT(105mg，0.77mmol)和EDCI(150mg，0.78mmol)溶解在DCM(6mL)中，在室溫攪拌15分鐘，然後冷卻至0℃。添加DIPEA(211mg，1.6mmol)，然後添加化合物2-9(300mg，0.65mmol)，在室溫中攪拌4小時。LC-MS表明完全轉化。加入NaHCO3(飽和，10mL)。將反應混合物藉由DCM(5mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=95：5)得到呈白色固體的粗化合物2-11(350mg，210nm下純度88%，46%產率)。藉由製備型HPLC純化：藉由製備型HPLC(C-18管柱，水/ACN，10%-80% ACN)純化粗化合物2-7(1.8g，210nm下純度88%)，得到化合物2-11(650mg，42%的回收產率)。C54H71N3O15質量計算為：1001.5；實測：1024.5[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.82(d,J=9.2Hz,1H),7.75-7.69(br,1H),7.40-7.35(m,2H),7.37-7.21(m,7H),6.95-6.88(m,4H),5.21(d,J=3.3Hz,1H),5.00-4.90(m,1H),4.66-4.63(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.08-4.00(br,4H),3.91-3.83(m,1H),
3.73(s,6H),3.72-3.66(m,3H),3.51(s,1H),3.43-3.37(m,3H),3.03-2.96(m,2H),2.91(s,2H),2.10(s,3H),2.00-1.76(m,17H),1.49-1.30(m,8H),1.23-1.19(m,2H)。
化合物2-12：
向化合物2-11(300.0mg，0.30mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(32.0mg，0.27mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(108mg，0.36mmol)，在室溫攪拌1小時。LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱：C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器：UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的化合物2-12(177mg，49%產率)。
C63H88N5O16P質量計算為：1201.60；實測：1202.6[M+H]+，ESI。
1HNMR(600MHz,CD3CN)δ 7.37-7.34(m,2H),7.24-7.20(m,6H),7.14-7.12(m,1H),6.79-6.77(m,4H),6.57-6.54(m,1H),6.44-6.43(m,1H),5.20(d,J=6.0Hz,1H),4.93-4.91(m,1H),4.44(d,J=6.0Hz,1H),4.04-3.83(m,5H),3.73-3.39(m,16H),3.04-2.91(m,4H),2.52-2.50(m,2H),2.03-1.75(m,24H),1.53-1.33(m,9H),1.21-1.04(m,15H)。
31PNMR(242MHz,CD3CN)δ 147.37,147.30。
化合物2-13：
向化合物2-11(80mg，0.080mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(5mg，0.04mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)。將反應混合物在室溫攪拌3小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。將反應混合物用DCM(10mL)稀釋，用H2O(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物2-13(85mg，97%產率)。
C58H75N3O18質量計算為：1101.50；實測：1100.4[M+H]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ 12.22(s,1H),7.84-7.81(m,1H),7.71-7.69(m,1H),7.37-7.16(m,9H),6.92-6.89(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.97-4.95(m,1H),4.48(d,J=12.0Hz,1H),4.07-4.01(m,6H),3.89-3.84(m,1H),3.73-3.65(m,9H),3.49(s,1H),3.41-3.38(m,1H),3.01-2.95(m,4H),2.45-2.44(m,4H),2.09-1.76(m,20H),1.48-1.19(m,10H)。
固體支持物2-14：
天然胺基-LCAA-CPG(上樣值：75umol/g，1000Å)用ACN(100mL×2)、DMF(100mL×2)和DCM(100mL×2)洗滌，然後在高真空中乾燥過夜。
向琥珀酸酯2-13(85mg，0.077mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)，將反應混合物在室溫中震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(250mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(260mg)。在室溫，藉由用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將固體支持物上未反應的胺
封端，用DMF(20mL×5)、CAN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空下乾燥15小時以得到固體支持物2-14(260mg)。對於上樣計算，取6.5mg的乾的上樣的CPG，添加25mL的3% DCA的DCM溶液。震盪溶液，測量500nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(500nm處的Abs值)*1000)/(76*(使用的CPG的mg))
以mL添加的DCA總體積=25mL
500nm處的Abs值=0.7721
使用的CPG的mg=6.5mg
以μmol/g上樣=((25)*(0.7721)*1000)/(76*(6.5))=39μmol/g。
方法2：
化合物2-2：
在250mL燒瓶中，將化合物2-1(11g，26.0mmol)溶解在THF(無水，100mL)中。在0℃用15分鐘分批加入LiAlH4(1.97g，52mmol)。然後，將反應在室溫攪拌4小時。LC-MS表明完全轉化。將反應冷卻至0℃，緩慢加入水(2mL)，然後加入NaOH(10%，2mL)，然後加入水(6mL)。將混合物過濾，將過濾物濃縮至乾，得到呈白色固體的化合物2-2(6.5g，80%產率)。粗產物無需進一步純化即可使用。
C15H21NO4S質量計算為：311.1；實測：312.1[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.67(d,J=8.0Hz,2H),7.48(d,J=8.0Hz,2H),4.46(t,J=5.4Hz,2H),3.60(s,4H),3.31(d,J=5.6Hz,4H),2.43(s,3H),1.67(s,4H)。
化合物2-3：
將化合物2-2(5g，16.1mmol)和Mg(粉末，3.47g，144.6mmol)在MeOH(無水，60mL)中混合，在室溫中攪拌過夜。LC-MS表明完全轉化，加入水(30mL)。形成白色沉澱。過濾混合物，濾液用HCl調節至pH 6(水溶液，4M)，濃縮至乾，得到呈黃色固體的化合物2-3(2.55g粗產物)。粗產物無需進一步純化即可使用。
C8H15NO2質量計算為：157.1；實測：158.1[M+H]+，ESI。
化合物2-4：
將化合物2-3(2.55g，假定為16.2mmol)溶解在二噁烷(20mL)中，在0℃中緩慢加入FmocCl(4.60g，17.8mmol)，然後加入Na2CO3(飽和，20mL)。將反應在30℃攪拌3小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物藉由EA(20mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=97：3)，得到白色固體2-4(2.75g，經兩步為44.7%產率)。
C23H25NO4質量計算為：379.2；實測：380.2[M+H]+，ESI。
化合物2-5：
將化合物2-4(2.7g，7.1mmol)和吡啶(20mL)在燒瓶中混合，分批加入DMTr-Cl(2.4g，7.1mmol)。將反應在室溫攪拌4小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物藉由EA(20mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=97：3)，得到黃色固體2-5(2.8g，58%產率)。
C44H43NO6質量計算為：681.3；實測：682.3[M+H]+，ESI。
化合物2-6：
將化合物2-5(2.3g，6.8mmol)、哌啶(5mL)和MeOH(無水，45mL)在燒瓶中混合，在30℃攪拌3小時。LC-MS表明完全轉化。將反應混合物濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=95：5)，得到黃色固體2-6(0.5g，33%產率)。
C29H33NO4質量計算為：459.2；實測：460.2[M+H]+，ESI。
化合物2-7：
將化合物1-7(325mg，0.58mmol)、HOBT(105mg，0.77mmol)和EDCI(150mg，0.78mmol)溶解在DCM(6mL)中，在室溫攪拌15分鐘，然後冷卻至0℃。添加DIPEA(211mg，1.6mmol)，然後添加化合物2-6(300mg，0.65mmol)，在室溫攪拌4小時。LC-MS表明完全轉化。加入NaHCO3(飽和，10mL)。將反應混合物藉由DCM(5mL×3)萃取。將有機相濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化(DCM：MeOH=95：5)，得到呈白色固體的粗化合物2-7(350mg，210nm下純度88%，產率46%)。藉由製備型HPLC純化(C-18管柱，水/ACN，10%-80% ACN)純化粗化合物2-7(1.8g，210nm下純度88%)，得到化合物2-7(650mg，210nm下純度96%，42%的回收產率)。
C54H71N3O15質量計算為：1001.5；實測：1024.5[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.82(d,J=9.2Hz,1H),7.75-7.69(br,1H),7.40-7.35(m,2H),7.37-7.21(m,7H),6.95-6.88(m,4H),5.21(d,J=3.3Hz,1H),5.00-4.90(m,1H),4.66-4.63(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.08-4.00(br,4H),3.91-3.83(m,1H),3.73(s,6H),3.72-3.66(m,3H),3.51(s,1H),3.43-3.37(m,3H),3.03-2.96(m,2H),2.91(s,2H),2.10(s,3H),2.00-1.76(m,17H),1.49-1.30(m,8H),1.23-1.19(m,2H)。
化合物2-8：
向化合物2-7(300.0mg，0.30mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入DCI(32.0mg，0.27mmol)和CEP[N(iPr)2]2(108mg，0.36mmol)，在室溫攪拌1小時，LCMS顯示SM被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由MPLC純化殘餘物(管柱：C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；CH3CN/H2O=3/2時收集沖提產物；檢測器：UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的化合物2-8(177mg，0.15mmol，97.0%純度，49%產率)。
C63H88N5O16P質量計算為：1201.60；實測：1202.6[M+H]+，ESI。
1H-NMR(600MHz,CD3CN)：δ=7.37-7.34(m,2H),7.24-7.20(m,6H),7.14-7.12(m,1H),6.79-6.77(m,4H),6.57-6.54(m,1H),6.44-6.43(m,1H),5.20-5.19(d,J=6.0Hz,1H),4.93-4.91(m,1H),4.44-4.43(d,J=6.0Hz,1H),4.04-3.83(m,5H),3.73-3.39(m,16H),3.04-2.91(m,4H),2.52-2.50(m,2H),2.03-1.75(m,24H),1.53-1.33(m,9H),1.21-1.04(m,15H)；31PNMR(242MHz,CD3CN)δ 147.37,147.29。
化合物2-9：
向化合物2-7(80mg，0.080mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(5mg，0.04mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)。將反應混合物在室溫中攪拌3小時，LCMS顯示SM被完全消耗。將反應混合物用DCM(10mL)稀釋，用H2O(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物2-9(85mg，0.077mmol，97%純度，97%產率)。C58H75N3O18質量計算為：1101.50；實測：1100.4[M+H]-，ESI。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)：δ=12.22(s,1H),7.84-7.81(m,1H),7.71-7.69(m,1H),7.37-7.16(m,9H),6.92-6.89(m,4H),5.21-5.20(d,J=6.0Hz,1H),4.97-4.95(m,1H),4.49-4.47(d,J=12.0Hz,1H),4.07-4.01(m,6H),3.89-3.84(m,1H),3.73-3.65(m,9H),3.49(s,1H),3.41-3.38(m,1H),3.01-2.95(m,4H),2.45-2.44(m,4H),2.09-1.76(m,20H),1.48-1.19(m,10H)。
固體支持物2-10：
天然胺基-LCAA-CPG(上樣值：75umol/g，1000Å)用ACN(100mL×2)、DMF(100mL×2)和DCM(100mL×2)洗滌，然後在高真空中乾燥過夜。
向琥珀酸酯2-9(85mg，0.077mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)，將反應混合物在室溫震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(250mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(260mg)。在室溫，藉由用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將固體支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯
示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時以得到固體支持物2-10(260mg)。對於上樣計算，取6.5mg的乾的上樣的CPG，添加25mL的3% DCA的DCM溶液。震盪溶液，測量500nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(500nm處的Abs值)*1000)/(76*(使用的CPG的mg))
以mL添加的DCA總體積=25mL
500nm處的Abs值=0.7721
使用的CPG的mg=6.5mg
以μmol/g上樣=((25)*(0.7721)*1000)/(76*(6.5))=39μmol/g。
實施例3
化合物3-2：
向化合物3-1(40g，211.36mmol)在NH3/MeOH(7M，192mL)中的溶液中滴加2-氰基乙酸乙酯(47.82g，422.71mmol)，將混合物攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化，過濾反應。濾餅在PE(100mL)中研磨，過濾。將濾餅乾燥以提供作為固體的化合物3-2(41g，44%產率)。
C18H18N4O2質量計算為：322.1；實測：323.1[M+H]+，ESI。
化合物3-3：
將化合物3-2(80g，248.17mmol)溶解在硫酸溶液(濃H2SO4/水=1：1，v/v，160mL)中，在120℃中攪拌5小時。LC-MS顯示完全轉化，藉由添加NaOH(30%水溶液)將反應混合物調節至pH 9-10，藉由添加1M HCl溶液重新調節至pH 4-5。然後，將反應過濾，將濾液濃縮至乾以提供粗化合物3-3(72g，95%產率)。粗產物無需進一步純化即可直接使用。
C16H21NO4質量計算為：291.2；實測：292.3[M+H]+，ESI。
化合物3-4：
將化合物3-3(72.3g，粗產物)在MeOH(1600mL)和H2SO4(160mL，濃H2SO4/水=1：1，v/v)中的溶液在85℃攪拌4小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物過濾並濃縮至乾，藉由矽膠管柱(PE中的0-25% EA)純化，以提供化合物3-4(62.5g，78%產率超過2個步驟)。
C18H25NO4質量計算為：319.2；實測：320.3[M+H]+，ESI。
化合物3-5：
在0℃中向化合物3-4(40g，125.2mmol)在THF(295mL)中的溶液中分批加入LiAlH4(14.3g，375.1mmol)，攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化，向反應混合物中加入乙酸乙酯(100mL)，並藉由加入10%NaOH(aq)調節至pH 9-10。然
後，將混合物過濾，用乙酸乙酯(50mLX2)洗滌。將合併的濾液濃縮至乾，得到粗化合物3-5(23g，83%產率)。粗產物不經進一步純化即用於下一步驟。
C16H25NO2質量計算為：263.2；實測：264.3[M+H]+，ESI。
化合物3-6：
化合物3-5(20g，75.94mmol)、Boc2O(16.57g，75.94mmol)和Pd/C(10%鈀碳，潮濕的，~55%水)在MeOH(150mL)的溶液中，在1atm的H2下，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化，將反應混合物過濾和濃縮以提供油狀的化合物3-6(20g，96%產率)，無需進一步純化即可使用。
C14H27NO4質量計算為：273.2；實測：274.1[M+H]+，ESI。
化合物3-7：
向化合物3-6(58g，212.17mmol)在三乙胺(85.88g，848.67mmol，118.37mL)和DCM(1.16L)中的溶液中加入MsCl(72.91g，636.51mmol)。將反應在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化(藉由EtOH淬滅，藉由二醚檢測)。反應混合物用DCM(1L)稀釋，用10%檸檬酸洗滌，然後用NaHCO3(飽和水溶液)洗滌，乾燥得到油狀化合物3-7(87g，95%產率)，其不經進一步純化即直接用於下一步驟。
C16H31NO8S2質量計算為：429.2；實測：430.3[M+H]+，ESI。
化合物3-8：
在氮氣下，將NaH(60%在礦物油中，3.72g，93.12mmol)懸浮於無水DMF(60mL)中，加入丙二酸二異丙酯(8.76g，46.56mmol)。將反應混合物在室溫攪拌30分鐘，形成澄清溶液。添加KI(1.55g，9.31mmol)，然後添加化合物3-7(20g，46.56mmol)。將反應混合物在70℃攪拌30分鐘，在140℃再攪拌30分鐘。LC-MS顯示完全轉化。將反應冷卻至室溫，用乙酸乙酯(300mL)稀釋，用檸檬酸(10
%水溶液，200mL×2)和NaHCO3(飽和水溶液，200mL)洗滌。將有機相濃縮並藉由矽膠管柱(PE中的0-10% EA)純化，得到呈無色油狀的化合物3-8(3.55g，18%產率)。
C23H39NO6質量計算為：425.3；實測：426.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.96-4.90(m,2H),3.27(br,4H),1.86(t,J=10.8Hz,4H),1.38(br,13H),1.28(s,4H),1.17-1.16(m,12H)。
化合物3-9：
在0℃向化合物3-8(7.5g，17.62mmol)中加入LiBH4(172mL，1M，在THF中)，將混合物攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。向反應混合物中加入乙酸乙酯(10mL)，然後加入NaOH(10%水溶液，20mL)並過濾。濾液用水(200mL)稀釋，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，濃縮得到呈無色油狀的化合物3-9(6.35g，98%產率)，其不經進一步純化即直接用於下一步驟。
C17H31NO4質量計算為：313.2；實測：314.2[M+H]+，ESI。
化合物3-10：
將化合物3-9(6.35g，20.26mmol)與HCl(63.5mL，4M在二噁烷中)混合，將混合物在室溫攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮至乾，與甲苯共沸乾燥(azeotropically dired)以得到化合物3-10(7g，99%產率)，其不經進一步純化即直接用於下一步驟。
C12H23NO2(游離鹼基)質量計算為：213.2；實測：214.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,D2O)δ 3.39(br,4H),3.18(t,J=11.6Hz,4H),1.59(t,J=12.0Hz,4H),1.36-1.33(m,4H),1.25(t,J=12.4Hz,4H)。
化合物3-11：
化合物3-10(5g，20.02mmol)、DIEA(6.47g，50.04mmol，8.72mL)、HOBT(3.25g，24.02mmol)、EDCI(4.60g，24.02mmol)在DCM(150mL)中的溶液在0℃中攪拌30分鐘，然後加入Fmoc-6-胺基己酸(5.66g，16.01mmol)，將混合物在室溫攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用額外的DCM(100mL)稀釋，用檸檬酸(10%水溶液，200mL)、NaHCO3(飽和水溶液，200mL)和水(200mL)洗滌，用Na2SO4乾燥，和濃縮得到粗產物，將其藉由矽膠管柱(PE中的0-10%EA)純化，得到膠狀化合物3-11(3.65g，LC-MS純度92%，產率33%)。
C33H44N2O5質量計算為：548.3；實測：549.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.88(d,J=7.5Hz,2H),7.84(d,J=7.5Hz,2H),7.41(t,J=7.3Hz,2H),7.34(t,J=7.3Hz,2H),6.65(t,J=5.3Hz,1H),6.28(s,2H),4.36-4.18(m,3H),3.36(dt,J=19.9,5.2Hz,4H),3.24(s,4H),2.92-2.87(m,2H),2.24(t,J=7.4Hz,2H),1.49-1.26(m,18H)。
化合物3-12：
化合物3-11(2.55g，4.65mmol)、4,4'-(氯(苯基)亞甲基)雙(甲氧基苯)(1.57g，4.65mmol)、DIEA(600.6mg，4.65mmol)、DMAP(56.8mg，0.47mmol)在DCM(51mL)中的溶液在室溫中攪拌過夜。LC-MS顯示部分轉化。然後將反應混合物濃縮，藉由矽膠管柱純化(10-40% EA在PE中)以沖提雜質，然後含有0.1% NH3‧H2O的5-10% MeOH的DCM溶液)，得到化合物3-12(2.75g，69%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.88-7.87(m,2H),7.69-7.68(m,2H),7.41-7.37(m,4H),7.33-7.25(m,9H),6.89-6.80(m,5H),4.41(t,J=5.0Hz,1H),4.28(d,J=6.8Hz,2H),4.20(t,J=6.8Hz,1H),3.72(s,8H),3.40-3.39(m,2H),3.32-3.27(m,4H),2.96(q,J=6.3Hz,2H),2.22(t,J=7.9Hz,2H),1.48-0.86(m,18H)。
化合物3-13：
向化合物3-12(1.7g，2.00mmol)在MeOH(51mL)中的溶液中加入哌啶(5.1mL)，將混合物在室溫攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。濃縮反應混合物，用二甲苯共沸乾燥。藉由矽膠管柱(含有0.1% NH3‧H2O的0-10% MeOH的DCM溶液)純化殘餘物，得到膠狀化合物3-13(1.1g，87%產率)。
C39H52N2O5質量計算為：628.4；實測：629.4[M+H]+，ESI。
化合物3-14：
化合物3-13(0.94g，1.49mmol)、DIEA(482.98mg，3.74mmol)、HOBT(242.38mg，1.79mmol)、EDCI(343.87mg，1.79mmol)在DCM(29mL)中的溶液在0℃攪拌，然後加入化合物1-4(936.36mg，2.09mmol)，將混合物在室溫攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。反應混合物藉由另外的DCM(20mL)稀釋，藉由NaHCO3(飽和水溶液，50mL)和水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物3-14(700mg，44%產率)。
C58H79N3O15質量計算為：1057.6；實測：1080.5[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.82(d,J=9.2Hz,1H),7.69(t,J=5.5Hz,1H),7.40-7.38(m,2H),7.32-7.19(m,7H),6.89-6.87(m,4H),5.21(d,J=3.3Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,3.4Hz,1H),4.48(d,J=8.5Hz,1H),4.40(t,J=5.0Hz,1H),4.02(s,3H),3.91-3.83(m,1H),3.73-3.68(m,7 H),3.43-3.39(m,3H),3.32-3.27(m,2H),2.99(q,J=6.6Hz,2H),2.87(s,2H),2.22(t,J=7.3Hz,2H),2.10(s,3H),2.03(t,J=7.0Hz,2H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.53-1.03(m,20H),0.90-0.83(m,2H)。
化合物3-15：
在室溫，向化合物3-14(670.0mg，0.61mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(96.0mg，0.81mmol)和2-氰乙基N,N,N',N'-四異丙基亞磷二胺(324mg，1.08mmol)，攪拌1小時。LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱：C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器：UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的化合物3-15(600mg，83%產率)。
C67H96N5O16P質量計算為：1257.66；實測：1204.5[M-CH2CH2CN]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.81-7.67(m,2H),7.40-7.19(m,9H),6.88-6.86(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.94(m,1H),4.49(d,J=6.0Hz,1H),4.04-3.83(m,4H),3.73-3.32(m,15H),3.01-2.89(m,4H),2.73-2.70(m,2H),2.24-2.20(m,2H),2.11-1.76(m,15H),1.49-0.91(m,34H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.21,146.19。
實施例4
化合物4-2：
在0℃，將碳酸鉀(8.10g，58.61mmol)加入到MeOH(80mL)、H2O(60mL)、甲醛(3.52g，117.22mmol)和化合物4-1(25g，117.22mmol)的溶液中。將反應混合物在0℃攪拌過夜。將反應混合物濃縮至其體積的70%，將殘餘物用乙酸乙酯萃取3次。有機相用水、鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，然後濃縮得到粗產物4-2(27g，95%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C12H21NO4質量計算為：243.2；實測：244.1[M+H]+，ESI。
化合物4-3：
在0℃，用約五分鐘的時間向化合物4-2(35g，143.86mmol)在甲醇(28ml)中的溶液中加入硼氫化鈉(11.97g，316.48mmol)。將反應混合物在0℃攪拌，然後升至室溫並攪拌5小時。將反應用飽和氯化銨溶液淬滅，然後濃縮，用乙酸乙酯(EA)萃取3次，用鹽水洗滌，然後用EA：PE=1：3再結晶得到化合物4-3(19.6g，54%產率)。
C12H23NO4質量計算為：245.2；實測：146.1[M+H-Boc]+，ESI。
化合物4-4：
將化合物4-3(30g，122.29mmol)、三乙胺(30.94g，305.73mmol，42.64mL)和DCM(300mL)混合，然後將混合物冷卻至-30℃，然後緩慢加入MsCl(35.02g，305.73mmol)。室溫攪拌1.5小時後，反應混合物用400mL水萃取，用100mL的10%檸檬酸水溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥。濃縮後，殘餘物經矽膠管柱純化，得到呈淡黃色油狀液體的化合物4-4(40g，81%產率)。
C14H27NO8S2質量計算為：401.1；實測：302.1[M+H-Boc]+，ESI。
化合物4-5：
在氮氣中，向t-BuONa(9.57g，99.63mmol)的DMA(50mL)混合物中緩慢加入丙二酸二異丙酯(14.06g，74.72mmol)。攪拌20分鐘後，加入化合物4-4(20g，49.81mmol)、KI(4.13g，24.91mmol)。將反應混合物升至140℃，攪拌過夜。將反應藉由加入飽和氯化銨淬滅，用乙酸乙酯萃取。濃縮後，藉由矽膠管柱(PE：EA)純化殘餘物以提供化合物4-5(6g，30%產率)。
C21H35NO6質量計算為：397.3；實測：398.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 4.98-4.90(m,2H),3.22-3.20(m,4H),2.25(s,4H),1.42(t,J=5.6Hz,4H),1.38(s,9H),1.17(d,J=6.0Hz,12H)。
化合物4-6：
在0℃，向化合物4-5(9.75g，24.53mmol)的無水THF(200mL)溶液中加入硼氫化鋰(10.69g，490.56mmol)。將反應混合物緩慢升至室溫並攪拌過夜。然後向反應混合物中加入乙酸乙酯(200mL)，用水(150mL×3)萃取，然後用飽和氯化鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗產物4-6(6.52g，93%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C15H27NO4質量計算為：285.2；實測：186.2[M+H-Boc]+，ESI。
化合物4-7：
在0℃，在15分鐘內，向產物4-6(7.52g，26.35mmol)在DCM(100mL)中的溶液中添加HCl(4M在1,4-二噁烷中，21.52mL)。將反應混合物溫熱至室溫並攪拌3小時。過濾反應混合物，用二氯甲烷(×3)洗滌濾餅得到粗產物4-7(3.7g，76%產率)。
C10H19NO2(游離鹼基)質量計算為：185.1m/z；實測：186.2[M+H]+，ESI。
化合物4-8：
Fmoc-6-胺基己酸(1.91g，5.41mmol)、1-羥基苯并三唑(HOBT，609.41mg，4.51mmol)、EDCI(864.59mg，4.51mmol)、DIEA(582.89mg，4.51mmol，785.56μL)在DCM(10mL)中的混合物在室溫攪拌30分鐘，然後將其加入到化合物4-7(1g，4.51mmol)在DCM中的溶液中，將混合物攪拌4小時。將反應混合物用飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水洗滌並用無水硫酸鈉乾燥。濃縮後，藉由矽膠管柱純化殘餘物以提供化合物4-8(1.35g，58%產率)。
C31H40N2O5質量計算為：520.3；實測：521.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.88(d,J=7.5Hz,2H),7.68(d,J=7.4Hz,2H),7.39(d,J=7.5Hz,4H),7.34-7.18(m,10H),6.89(d,J=8.8Hz,4H),4.64(t,J=4.7Hz,1H),4.28(d,J=6.8Hz,2H),4.20(t,J=6.8Hz,1H),3.73(s,6H),3.44(d,J=5.0Hz,2H),3.30-3.10(m,4H),3.01(s,2H),3.00-2.90(m,2H),2.21(t,J=7.2Hz,2H),1.56(d,J=11.9Hz,2H),1.46-1.30(m,8H),1.21-1.00(m,4H)。
化合物4-9：
將DMTr-Cl(488.07mg，1.44mmol)和化合物4-8(0.75g，1.44mmol)在吡啶(6ml)中的混合物在室溫中攪拌過夜。將反應混合物在真空中濃縮。將殘餘物重新溶解在含有1%吡啶的乙酸乙酯中，與氧化鋁一起乾燥，在氧化鋁上進行管柱層析純化(0-10% MeOH，0.1% TEA的DCM溶液)，得到化合物4-9(0.39g，32.9%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.39(d,J=7.3Hz,2H),7.34-7.18(m,7H),6.89(d,J=8.8Hz,4H),4.63(s,1H),3.73(s,6H),3.43(s,2H),3.30-3.18(m,6H),3.05(s,2H),2.22(t,J=7.4Hz,2H),1.57(d,J=12.1Hz,2H),1.47-1.08(m,12H)。
化合物4-10：
將化合物4-9(1.4g，1.70mmol)溶解在MeOH(40mL)中，然後加入哌啶(4ml)。將混合物在室溫攪拌3小時。將反應混合物在真空中濃縮。藉由與二甲苯共沸乾燥進一步除去哌啶殘餘物。然後，殘餘物藉由矽膠管柱進行純化(DCM：MeOH=10：1，甲醇含10%氨)，得到化合物4-10(1g，產率97%)。
C37H48N2O5質量計算為：600.4；實測：601.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.40-7.39(m,2H),7.33-7.21(m,7H),6.89(d,J=8.8Hz,4H),4.63(s,1H),3.73(s,6H),3.44-3.16(m,8H),3.01-3.00(m,2H),2.24-2.21(m,2H),1.57(d,J=12.2Hz,2H),1.45-1.33(m,7H),1.27-1.21(m,4H),1.09(s,1H)。
化合物4-11：
化合物1-4(959.23mg，2.14mmol)、HOBt(289.68mg，2.14mmol)、EDCI(410.98mg，2.14mmol)、DIEA(395.82mg，3.06mmol，533.45μL)在DCM(10mL)中的混合物攪拌20分鐘，然後將其加入到化合物4-10(920mg，1.53mmol)在DCM(5mL)中的溶液中並在室溫中攪拌過夜。加入水以淬滅反應，分離有機層並濃縮。將殘餘物藉由製備型HPLC純化，得到化合物4-11(1g，63%產率)。
C56H75N3O15質量計算為：1029.5；實測：1052.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.82(d,J=9.2Hz,1H),7.79(t,J=5.0Hz,1H),7.40-7.19(m,9H),6.90-6.88(m,2H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,3.3Hz,1H),4.62(t,J=4.9Hz,1H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.02(s,3H),3.87(dd,J=20.4,9.6Hz,1H),3.97-3.67(m,7H),3.45-3.38(m,3H),3.30-3.13(m,4H),3.05-2.96(m,4H),2.22(t,J=7.3Hz,2H),2.10(s,3H),2.04-1.99(m,5H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.59-1.21(m,18H)。
化合物4-12：
在室溫，向化合物4-11(750.0mg，0.75mmol)在無水DCM(7.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(80.0mg，0.67mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(270mg，0.90mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱，C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1，在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器，UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的4-12(500mg，53%產率)。
C65H92N5O16P質量計算為：1229.63；實測：1129.0[M-N(CH(CH3)2)2]+，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)：δ 7.44-7.18(m,9H),6.85-6.83(m,4H),6.52-6.44(m,2H),5.26(d,J=6.0Hz,1H),4.99-4.96(m,1H),4.49(d,J=6.0Hz,1H),4.13-3.89(m,4H),3.79-3.55(m,13H),3.44-3.48(m,1H),3.35-3.07(m,8H),2.58-2.56(m,2H),2.24-1.89(m,16H),1.62-1.11(m,31H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 147.17,147.16。
化合物4-13：
向化合物4-11(80mg，0.080mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(5mg，0.04mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，
0.2mmol)，將反應混合物在室溫攪拌3小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗，然後，將反應混合物用DCM稀釋，用水(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物4-13(85mg，97%產率)。
C60H79N3O18質量計算為：1129.54；實測：1128.6[M+H]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 12.22(s,1H),7.84-7.81(m,1H),7.71-7.69(m,1H),7.37-7.16(m,9H),6.92-6.89(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.97-4.95(m,1H),4.48(d,J=12.0Hz,1H),4.12-4.01(m,3H),3.89-3.84(m,1H),3.73-3.65(m,7H),3.41-3.38(m,2H),3.28-3.15(m,4H),3.15-2.98(m,4H),2.46-2.44(m,4H),2.22-2.20(m,2H),2.09-1.76(m,14H),1.65-1.60(m,2H),1.48-1.06(m,19H)。
化合物4-14：
向化合物4-13(85mg，0.077mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)。將反應混合物在室溫震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(250mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(260mg)。藉由在室溫中，用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)和DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時，得到固體支持物4-14(260mg)。對於上樣計算，取5.97mg的乾的上樣的CPG，在DCM中添加25mL的3% DCA。震盪溶液，測量500nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：
以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(500nm處的Abs值)*1000)/76*(使用的CPG的mg)
以mL添加的DCA總體積=25mL
500nm處的Abs值=0.6689
使用的CPG的Mg=5.97mg
以μmol/g上樣=((25)*(0.6689)*1000)/76*(5.97)=36.85umol/g。
實施例5
化合物5-2：
在氮氣下，於0℃，向甲氧基甲基(三苯基)氯化磷(12.89g，37.61mmol)、KOtBu(4.69g，41.79mmol)在THF(150mL)中的溶液中加入化合物5-1(10g，41.78mmol)。將反應混合物在25℃攪拌過夜。TLC顯示完全轉化。然後，藉由添加檸檬酸(10%水溶液)將反應調節至pH 6，用乙酸乙酯(EA)萃取。將有機相濃
縮，藉由快速管柱色譜法純化(PE中的0-10% EA)純化，得到呈油狀的化合物5-2(2.92g，37%產率)。
C15H25NO3質量計算為：267.2；實測：268.2[M+H]+，ESI。
化合物5-3：
向化合物5-2(8.2g，30.67mmol)在MeCN(220mL)中的混合物中加入2,2,2-三氯乙酸(6.31g，38.64mmol)的水溶液(70mL)，將混合物攪拌過夜。TLC顯示完全轉化。然後，藉由用NaHCO3(飽和水溶液)將pH調節至7-8來淬滅反應，用乙酸乙酯萃取。將有機相濃縮以提供呈油狀的化合物5-3(7.8g)。粗產物不經純化直接用於下一步。
C14H23NO3質量計算為：253.2；實測：154.2[M+H-Boc]+，ESI。
化合物5-4：
向化合物5-3(1.35g，5.33mmol)和NaOH(21.32mg，532.89μmol，29.38μL)在MeOH(30mL)中的混合物中加入甲醛溶液(454.47mg，15.13mmol，37%水溶液，0.91g)。將反應混合物在25℃攪拌36小時。將反應混合物濃縮以除去大部分甲醇，用乙酸乙酯萃取。將有機相濃縮，藉由管柱純化(0-5% MeOH的DCM溶液)，得到作為固體的化合物5-4(1.5g，2個步驟的產率為96%)。
C15H25NO4質量計算為：283.2；實測：184.2[M+H-Boc]+，ESI。
化合物5-5：
向化合物5-4(2.95g，10.41mmol)的MeOH(90mL)溶液中加入硼氫化鈉(866.50mg，22.90mmol)。攪拌反應混合物1小時。LC-MS顯示完全轉化。用檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，然後將其濃縮至乾，殘餘物用DCM
萃取並過濾。濃縮濾液得到化合物5-5(2.95g，73%產率)，其不經純化直接用於下一步。
C15H27NO4質量計算為：285.2；實測：271.2[M+ACN+H-tBu]+，ESI。
化合物5-6：
向化合物5-5(4g，14.02mmol)添加HCl(4M在二噁烷中，63.5mL)。攪拌反應混合物3小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮得到化合物5-6(3.5g)，其不經純化直接用於下一步。
C10H19NO2(游離鹼基)質量計算為：185.1；實測：186.1[M+H]+，ESI。
化合物5-7：
在0℃，將Fmoc-6-胺基己酸(3.19g，9.02mmol)、DIEA(2.91g，22.55mmol，3.93mL)、HOBT(1.46g，10.82mmol)、EDCI(2.08g，10.82mmol)在DCM(12mL)中的溶液攪拌30分鐘，然後加入化合物5-6(2g，9.02mmol)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用DCM(12mL)稀釋，用檸檬酸(10%水溶液，20mL)和水洗滌。將有機相濃縮並藉由矽膠管柱(0-5% MeOH的DCM溶液)純化，得到化合物5-7(3.5g，34%產率)。
C31H40N2O5質量計算為：520.3；實測：521.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.91-7.68(m,4H),7.44-7.28(m,5H),4.32-4.28(m,4H),4.20(t,J=6.6Hz,1H),3.69(s,2H),3.43(s,2H),3.22(t,J=5.6Hz,4H),2.02-1.98(m,3H),1.55-1.52(t,J=6.6Hz,4H),2.26-2.23(m,4H),1.24-1.16(m,8H)。
化合物5-8：
向化合物5-7(2.2g，4.23mmol)、DMAP(51.6mg，0.423mmol)和DIEA(1.09g，8.46mmol)在DCM(66mL)中的溶液中加入DMTrCl(1.43g，4.23mmol)。將反應
混合物在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示部分轉化。藉由氧化鋁墊過濾反應混合物，用DCM(50mL)洗滌。將濾液濃縮並藉由矽膠管柱純化(在PE中含0.1%氨的10-40% EA，然後在DCM中含0.1%氨的0-10wMeOH)，得到化合物5-8(3.0g，86%產率)。
C52H58N2O7質量計算為：822.4；實測：845.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.67(m,4H),7.42-7.39(m,4H),7.41-7.24(m,14H),6.89-6.87(m,4H),4.44(t,J=7.6Hz,1H),4.24-4.19(m,1H),4.06-4.01(m,1H),3.74-3.73(m,6H),3.65-3.59(m,2H),3.42-3.39(m,3H),3.32(br,1H),3.00-2.83(m,4H),1.99-1.96(m,4H),1.45-1.16(m,16H)。
化合物5-9：
向化合物5-8(3g，3.65mmol)在MeOH(90mL)中的溶液中加入哌啶(9mL)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。濃縮反應混合物，然後進一步用二甲苯共沸乾燥。藉由矽膠管柱色譜法(在DCM中含1% TEA的0-10% MeOH)純化殘餘物，得到化合物5-9(1.1g，91%產率)。
C37H48N2O5質量計算為：600.4；實測：601.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.40-7.21(m,9H),6.89(d,J=7.2Hz,4H),3.74(s,6H),3.67-3.61(m,2H),3.39-3.33(m,2H),2.86-2.62(m,4H),1.99(t,J=7.4Hz,2H),1.51-1.21(m,16H)。
化合物5-10：
在0℃，將化合物1-4(2.09g，4.66mmol)、DIEA(1.08g，8.32mmol，1.45mL)、HOBT(539.77mg，3.99mmol)、EDCI(765.80mg，3.99mmol)在DCM(60mL)中的溶液攪拌30分鐘，然後加入化合物5-9(2g，3.33mmol)。將反應混合物
攪拌過夜。將反應混合物濃縮，將殘餘物藉由製備型HPLC(C18，水/ACN)純化以提供化合物5-10(1.0g，15%產率)。
C56H75N3O15質量計算為：1029.5；實測：1052.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,1H),7.71(t,J=5.2Hz,1H),7.40-7.38(m,2H),7.32-7.19(m,5H),6.90-9.87(m,2H),5.22(d,J=3.4Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,3.4Hz,1H),4.49(d,J=8.5Hz,1H),4.42(t,J=5.0Hz,1H),4.03(s,2H),3.91-3.84(m,2H),3.74(s,6H),3.67-3.61(m,1H),3.44-3.37(m,4H),3.00(dd,J=12.7,6.6Hz,2H),2.85(d,J=9.6Hz,2H),2.11(s,3H),2.05-1.96(m,7H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.52-1.18(m,18H)。
化合物5-11：
在室溫，向化合物5-10(690.0mg，0.66mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(96.0mg，0.81mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(324mg，1.08mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱：C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1，在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器，UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的5-11(460mg，56%產率)。
C65H92N5O16P質量計算為：1229.63；實測：1230.3[M+H]+，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.81-7.67(m,2H),7.40-7.19(m,9H),6.88-6.86(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.94(m,1H),4.49(d,J=6.0Hz,1H),4.04-3.83(m,4H),3.73-3.32(m,18H),3.01-2.83(m,4H),2.72-2.69(m,2H),2.10-1.76(m,16H),1.52-1.04(m,30H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.33,146.26。
實施例6
化合物6-2：
在0℃，將化合物6-1(20g，99.88mmol)溶解在THF(200mL)中。將NaH(4.79g，119.86mmol，60%純度)添加到反應混合物中，攪拌30分鐘。將2,3-二溴丙烯(20.96g，104.88mmol)緩慢加入到反應混合物中。將反應在室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NH4Cl溶液(100mL)淬滅，用EA(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化，得到呈無色油狀的化合物6-2(31g，97%產率)。
C13H19BrO4質量計算為：318.0；實測：319.0[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 5.71-5.58(m,3H),5.14-5.10(m,2H),4.25-4.13(m,4H),3.14(s,2H),2.7(d,J=7.2Hz,2H),1.26(t,J=6.8Hz,6H)。
化合物6-3：
將化合物6-2(31g，97.12mmol)、Pd(OAc)2(2.18g，9.71mmol)、PPh3(5.09g，19.42mmol)和AgOAc(19.45g，116.54mmol)溶解在CAN(600mL)中。在N2氣氛下，於85℃，將反應混合物攪拌3小時。將反應冷卻至室溫並過濾，在真空中濃縮並藉由快速矽膠管柱色譜法純化，得到呈無色油狀的化合物6-3(21g，91%產率)。
C13H18O4質量計算為：238.1；實測：239.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 5.39(t,J=2Hz,2H),4.95(t,J=1.6Hz,2H),4.18(q,J=7.2Hz,4H),3.03(t,J=7.2Hz,4H),1.24(t,J=7.2Hz,6H)。
化合物6-4：
將化合物6-3(21g，88.13mmol)溶解在DCM(300mL)中並冷卻至-78℃。將Br2(14.08g，88.13mmol，4.51mL)溶解在DCM(100mL)中，在1小時內添加到反應混合物中。將混合物於-78℃攪拌1小時。將反應混合物用飽和Na2SO3溶液(100mL)淬滅，用DCM(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮並藉由快速矽膠管柱色譜法純化，得到呈淡黃色油狀的化合物6-4(28g，80%產率)。
C13H18Br2O4質量計算為：396.0；實測：397.0[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：4.21(q,J=7.2Hz,4H),4.00(s,4H),3.19(s,4H),1.26(t,J=7.2Hz,6H)。
化合物6-5：
將4-甲苯磺醯胺(12.05g，70.35mmol)溶解在DMF(260mL)中。在0℃，將NaH(6.19g，154.77mmol)加入到反應混合物中。並將反應混合物在0℃攪拌30分鐘。將化合物6-4(28g，70.35mmol)在DMF(50mL)中的溶液緩慢添加到反應混合物中。將混合物於室溫攪拌1小時。將反應混合物用飽和NH4Cl溶液(500mL)淬滅，用EA(200mL×3)萃取，用水(500mL×3)、鹽水(300mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化，得到呈無色固體的化合物6-5(22g，76%產率)。
C20H25NO6S質量計算為：407.1；實測：408.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.70-7.68(m,2H),7.32-7.30(m,2H),4.17(q,J=7.2Hz,4H),3.96(s,4H),2.89(s,4H),2.42(s,3H),1.22(t,J=7.2Hz,6H)。
化合物6-6：
將化合物6-5(22g，54.05mmol)溶解在THF(300mL)中。在0℃，將LiBH4(11.8g，540.5mmol)加入到反應混合物中。將反應於室溫攪拌1小時。將反應混合物用水(100mL)淬滅，用EA(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速矽膠管柱色譜法純化，得到呈白色固體的化合物6-6(14.8g，89%產率)。
C16H21NO4S質量計算為：323.1；實測：324.1[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.70-7.68(m,2H),7.43-7.41(m,2H),4.56(t,J=5.2Hz,2H),3.26(d,J=4.8Hz,4H),2.84(s,4H),2.39(s,3H),1.95(s,4H)。
化合物6-7：
將化合物6-6(4.1g，12.68mmol)和DIEA(4.92g，3.83mmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DMTrCl(4.30g，12.68mmol)在DCM(80mL)中的溶液緩慢添加到反應混合物中。將反應於室溫攪拌1小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(20mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-3% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物6-7(6.39g，80%產率)。
C37H39NO6S質量計算為：625.25；實測：648.25[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.68(d,J=8.0Hz,2H),7.41(d,J=8.0Hz,2H),7.33(d,J=4.0Hz,2H),7.31-7.18(m,7H),6.85(d,J=8.0Hz,4H),4.68(t,J=4.8Hz,1H),3.83(s,4H),3.72(s,6H),3.37(d,J=2.0Hz,2H),2.94(s,2H),2.39(s,3H),2.07-2.03(m,2H),1.92-1.89(m,2H)。
化合物6-8：
將化合物6-7(6.0g，9.59mmol)溶解在MeOH(300mL)中，然後在0℃將Mg(18g)添加到反應混合物中。將混合物在室溫攪拌過夜。將反應混合物用水淬滅，用H2O萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-15% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物6-8(1.2g，26.6%產率)。
C30H33NO4質量計算為：471.24；實測：472.20[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.37(d,J=8.0Hz,2H),7.32-7.28(m,2H),7.25-7.19(m,5H),6.89-6.87(m,4H),4.76(s,1H),3.83(s,1H),3.73(s,6H),3.47(s,3H),3.45(s,3H),3.00(s,2H),2.13-2.09(m,2H),1.97-1.93(m,2H)。
化合物6-9：
將化合物6-8(2.4g，5.09mmol)和Fmoc-6-胺基己酸(1.80g，5.09mmol)溶解在DCM(60mL)中，然後將DIEA(1.97g，15.27mmol)、EDCI(1.95g，10.18mmol)和HOBT(1.38g，10.18mmol)加入到混合物中。將反應於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(200mL)淬滅，用DCM(60mL×3)萃取，用鹽水(60mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物6-9(3.1g，75%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.88(d,J=7.4Hz,2H),7.68(d,J=7.4Hz,2H),7.43-7.37(m,4H),7.34-7.28(m,5H),7.26-7.21(m,5H),6.88(d,J=8.9Hz,4H),4.75(t,J=4.8Hz,1H),4.30-4.28(m,2H),4.22-4.19(m,1H),4.11-3.91(m,2H),3.91-3.85(m,2H),3.73(s,6H),3.49-3.48(d,J=4.6Hz,2H),3.02-2.95(m,4H),2.20-2.14(m,4H),2.00-1.97(m,2H),1.52-1.46(m,2H),1.44-1.36(m,2H),1.24-1.29(m,2H)。
化合物6-10：
將化合物6-9(3.1g，3.84mmol)溶解在MeOH(60mL)中，然後將哌啶(6mL)添加到混合物中。將反應於室溫攪拌8小時。將反應混合物用水淬滅，用DCM(100mL×3)萃取，用鹽水(60mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-20% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物6-10(1.45g，64%產率)。
C36H44N2O5質量計算為：584.33；實測：585.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.39-7.39(m,2H),7.37-7.28(m,2H),7.25-7.19(m,5H),6.88(d,J=8.8Hz,2H),4.76(s,1H),4.04(m,2H),3.86(m,2H),3.78(s,6H),3.49(s,2H),3.02(s,2H),2.55(m,2H),2.22-2.14(m,4H),2.01-1.97(m,2H),1.53-1.46(m,2H),1.37-1.25(m,5H)。
化合物6-11：
將化合物6-10(1.5g，2.57mmol)和化合物1-4(1.15g，2.57mmol)溶解在DCM(60mL)中，然後將DIEA(1.66g，12.83mmol)、EDCI(1.10g，6.41mmol)和HOBT(519.92mg，3.85mmol)加入到混合物中。將反應於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(200mL)淬滅，用DCM(60mL×3)萃取，用鹽水(60mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物6-11(2g，76%產率)。
C55H71N3O15質量計算為：1013.49；實測：1014.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.82(d,J=9.2Hz,1H),7.72(t,J=5.6Hz,1H),7.39-7.37(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.26-7.19(m,5H),6.90-6.87(m,4H),5.22(d,J=3.4Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,3.4Hz,1H),4.50-4.48(m,1H),4.03-4.00(m,5H),3.91-3.84(m,3H),3.74(s,7H),3.49(d,J=4.6Hz,1H),3.43-3.38(m,1H),3.02-2.98(m,4H),2.21-2.15(m,4H),2.10-2.08(m,3H),2.05-2.00(m,7H),1.89(s,3H),1.78(s,3H),1.52-1.35(m,9H),1.27-1.24(m,3H)。
化合物6-12：
在室溫，向化合物6-11(790.0mg，0.78mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(96.0mg，0.81mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(324mg，1.08mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮該溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱，C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1，在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器，UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的6-12(680mg，71%產率)。
C64H88N5O16P質量計算為：1213.60；實測：1159.5[M-CH2CH2CN]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.82-7.68(m,2H),7.38-7.19(m,9H),6.90-6.86(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.94(m,1H),4.48(d,J=12.0Hz,1H),4.04-3.99(m,4H),3.90-3.37(m,16H),3.09-2.87(m,4H),2.71-2.68(m,2H),2.19-1.76(m,20H),1.52-1.05(m,22H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.51,146.47。
實施例7
化合物7-2：
在0℃，向甲氧基甲基(三苯基)氯化磷(54.78g，159.80mmol)在THF(600mL)中的溶液中加入KOtBu(19.92g，177.55mmol)，攪拌0.5小時。然後，在0℃加入化合物7-1(20g，88.78mmol)，攪拌過夜，使反應溫熱至室溫。LC-MS顯示完全轉化。用檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，過濾並濃縮至乾。藉由矽膠管柱(0-5% EA在PE中)純化殘餘物，得到呈油狀的化合物7-2(15.5g，68%產率)。
C14H23NO3質量計算為：253.2；實測：239.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 5.99(pent,J=2.1Hz,1H),3.48(s,3H),3.44-3.36(m,2H),2.99-2.91(m,2H),2.59(br,2H),2.44-2.36(m,2H),2.04-1.97(m,2H),1.38(s,9H)。
化合物7-3：
向化合物7-2(5g，19.74mmol)在MeCN(150mL)中的溶液中加入2,2,2-三氯乙酸(4.06g，24.87mmol，在50mL水中)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。TLC顯示完全轉化。藉由NaHCO3(飽和水溶液)將反應混合物調節至pH7，藉由EA萃取。濃縮有機相，得到油狀的粗化合物7-3(4.7g，99%產率)，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
C13H21NO3質量計算為：239.2；實測：225.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
化合物7-4：
向化合物7-3(4.7g，19.64mmol)和K2CO3(542.87mg，3.93mmol)在MeOH(150mL)中的混合物中加入福爾馬林(15.9g，37%甲醛水溶液，55.78mmol)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。TLC顯示完全轉化。用檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，藉由EA萃取。將有機相濃縮並藉由矽膠管柱(0-3% MeOH在DCM中)純化，得到呈油狀的化合物7-4(5.2g，98%產率)。
C14H23NO4質量計算為：269.2；實測：170.1[M-Boc+H]+，ESI。
化合物7-5：
向化合物7-4(17g，63.12mmol)在MeOH(190mL)的溶液中加入NaBH4(5.25g，138.86mmol)。將反應混合物於室溫攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。用檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，過濾，藉由DCM萃取。將有機
相濃縮並藉由矽膠管柱(0-5% MeOH在DCM中)純化，得到化合物7-5(14.5g，84%產率)。
C14H25NO4質量計算為：271.2；實測：172.1[M-Boc+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.53(t,J=5.3Hz),3.37-3.32(m,2H),3.27(d,J=5.3Hz,2H),3.19(d,J=5.3Hz,2H),3.07(dd,J=10.78,3.5Hz,2H),1.60(dd,J=13.4,7.9Hz,2H)1.39(s,9H),1.27(dd,J=13.5,6.3Hz,2H)。
化合物7-6：
向裝有化合物7-5(14.5g，53.44mmol)的反應小瓶中加入HCl在二噁烷中的溶液(4M，140mL)。將反應混合物於室溫攪拌1.5小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮得到粗化合物7-6(11g)，其不經進一步純化直接用於下一步。C9H17NO2(游離鹼基)質量計算為：171.1；實測：172.1[M-Boc+H]+，ESI。
化合物7-7：
在0℃，將Fmoc-6-胺基己酸(18.38g，52.00mmol)、DIEA(16.80g，130.00mmol，22.64mL)、HOBT(8.43g，62.40mmol)、EDCI(11.96g，62.40mmol)在DCM(300mL)中的溶液攪拌30分鐘，然後加入化合物7-6(10.8g，52.00mmol)。將反應混合物攪拌過夜，使其升至室溫。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用DCM(300mL)稀釋，用NaHCO3(飽和水溶液)和水洗滌。將有機相濃縮並藉由矽膠管柱(0-10% MeOH在DCM中)純化，得到呈膠狀的化合物7-7(19.6g，74%產率)。
C30H38N2O5質量計算為：506.3；實測：507.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.68(m,4H),7.44-7.33(m,5H),4.55(s,2H),4.29(d,J=6.8Hz,2H),4.23-4.18(m,1H),3.28-3.21(m,6H),2.97-2.96(m,2H),2.61-2.53(m,2H),2.17(t,J=7.6Hz,2H),1.63-1.23(m,12H)。
化合物7-8：
在0℃，向化合物7-7(19g，37.50mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(458.17mg，3.75mmol)和DIEA(7.27g，56.25mmol，9.80mL)在DCM(590mL)中的溶液分批加入DMTrCl(13.98g，41.25mmol)。將反應混合物攪拌過夜。LC-MS顯示部分轉化，形成2種異構體和二-DMTr副產物。將反應混合物濃縮，藉由矽膠管柱純化(在PE中含0.2%TEA的20-100% EA)，得到化合物7-8a和7-8b，為內型和外型異構體的混合物(17.9g，47%產率)。
藉由製備型HPLC(C18管柱，水/ACN)分離異構體，得到化合物7-8a(外型，7.5g)和化合物7-8b(內型，5.7g)。
7-8a：
C51H56N2O7質量計算為：808.4；實測：832.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.88(m,2H),7.69-7.67(m,2H),7.43-8.18(m,13H),6.88-6.85(m,4H),4.62(br,1H),4.37-4.28(m,2H),4.20(t,J=6.7Hz,1H),3.73(s,6H),3.47(dd,J=9.9,8.2Hz,1H),3.28(br,2H),3.11(td,J=12.0,4.3Hz,2H),2.99-2.91(m,4H),2.66-2.54(m,2H),2.19-2.06(m,2H),1.67(pent,J=6.8Hz,2H),1.51-1.17(m,10H)。
7-8b：
C51H56N2O7質量計算為：808.4；實測：832.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.84(m,4H),7.44-7.20(m,13H),6.91-6.89(m,4H),6.66(br,1H),6.29(s,2H),3.74(s,6H),3.36-3.31(m,3H),3.22-3.12(m,3H),2.90(dd,J=12.7,6.5Hz,2 H),2.86(s,2H),2.44-2.29(m,2H),2.15(t,J=7.1Hz,2H),1.64-1.18(m,12H)。
化合物7-9a：
在室溫，將化合物7-8a(6.5g，8.03mmol)在MeOH(200mL)和哌啶(20mL)中的溶液攪拌過夜，LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮，將殘餘物藉由矽膠管柱(在DCM中含1% TEA的20-30% MeOH)純化，得到化合物7-9a(4.4g，94%產率)。
C36H46N2O5質量計算為：586.3；實測：587.3[M+H]+，ESI。
化合物7-10a：
在0℃，將化合物1-4(4.70g，10.50mmol)、DIEA(2.42g，18.75mmol，3.27mL)、HOBT(1.22g，9.00mmol)和EDCI(1.73g，9.00mmol)在DCM(132mL)中的溶液攪拌30分鐘，然後加入化合物7-9a(4.4g，7.50mmol)。將反應混合物攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用DCM(150mL)稀釋，用水洗滌。將有機相濃縮，藉由矽膠管柱純化(在DCM中含1% TEA的0-10% MeOH)，得到化合物7-10a(3.8g，51%產率)。
C55H73N3O15質量計算為：1015.5；實測：1039.1[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85(d,J=9.2Hz,1H),7.74(t,J=5.3Hz,1H),7.38-7.36(m,2H),7.31-7.27(m,2H),7.24-7.19(m,5H),6.88-6.86(m,4H),5.22(d,J=2.8Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,2.8Hz,1H),4.65(t,J=4.8Hz,1H),4.49(d,J=8.4Hz,1H),4.03(s,3H),3.88(dd,J=19.5,9.1Hz,1H),3.73-3.70(m,7H),3.50-3.39(m,2H),3.34-3.31(m,1H),3.27(d,J=4.5Hz,2H),3.17(d,J=5.2Hz,1H),3.15-3.09(m,2H),3.00(dd,J=12.4,6.3Hz,2H),2.94(br,1H),2.67-2.53(m,2H),2.19-2.08(m,5H),2.04(t,J=6.9Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.78(s,3H),1.70-1.63(m,2H),1.53-1.16(m,14H)。
化合物7-11a：
在室溫，向化合物7-10a(680.0mg，0.67mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(96.0mg，0.81mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(324mg，1.08mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱，C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1，在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器，UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的7-11a(390mg，47%產率)。
C64H90N5O16P質量計算為：1215.61；實測：1161.3[M-CH2CH2CN]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.81-7.69(m,2H),7.40-7.19(m,9H),6.88-6.86(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.94(m,1H),4.49(d,J=6.0Hz,1H),4.02-3.83(m,4H),3.73-3.32(m,18H),3.01-2.97(m,6H),2.71-2.68(m,4H),2.12-1.99(m,18H),1.49-1.04(m,24H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.70。
化合物7-9b：
在室溫，將化合物7-8b(5.70g，7.05mmol)在MeOH(200mL)和哌啶(20mL)中的溶液攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮，藉由矽膠管柱純化(在DCM中含1% TEA的10-20% MeOH)，得到化合物7-9b(4.1g，99%產率)。
C36H46N2O5質量計算為：586.3；實測：587.3[M+H]+，ESI。
化合物7-10b：
在0℃，將化合物1-4(4.38g，9.78mmol)、DIEA(2.26g，17.47mmol，3.04mL)、HOBT(1.13g，8.39mmol)、EDCI(1.61g，8.39mmol)在DCM(120ml)中的溶液攪拌30分鐘，然後加入化合物7-9b(4.10g，6.99mmol)。將反應混合物攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用DCM(150mL)稀釋，用水洗滌。將有機相濃縮，藉由矽膠管柱純化(在DCM中含1% TEA的0-10% MeOH)，得到粗產物4.4g，其藉由製備型HPLC(C18，水/ACN)進一步純化，得到化合物7-10b(2.0g，28%產率)。
C55H73N3O15質量計算為：1015.5；實測：1039.1[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84(d,J=9.2Hz,1H),7.72(t,J=5.5Hz,1H),7.40-7.38(m,2H),7.33-7.29(m,2H),7.28-7.20(m,5H),6.91-6.88(m,4H),5.22(d,J
=3.3Hz,1H),4.97(dd,J=11.2,3.3Hz,1H),4.66(t,J=4.9Hz,1H),4.49(d,J=8.5Hz,1H),4.03(s,3H),3.88(dd,J=20.2,8.8Hz,1H),3.74-3.69(m,7H),3.48-3.38(m,4H),3.34-3.31(m,1H),3.21(dd,J=10.4,4.2Hz,1H),3.14(dd,J=12.0,4.6Hz,1H),3.00(dd,J=12.7,6.6Hz,2H),2.86(s,2H),2.46-2.27(m,2H),2.16(t,J=6.7Hz,2H),2.11(s,3H),2.04(t,J=7.0Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.78(s,3H),1.63-1.12(m,14H)。
化合物7-11b：
在室溫，向化合物7-10b(680.0mg，0.67mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(96.0mg，0.81mmol)和2-氰乙基N,N,N′,N′-四異丙基亞磷二胺(324mg，1.08mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱，C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器：UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的7-11b(390mg，47%產率)。
C64H90N5O16P質量計算為：1215.61；實測：1161.6[M-CH2CH2CN]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.81-7.69(m,2H),7.40-7.19(m,9H),6.88-6.86(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.94(m,1H),4.49(d,J=6.0Hz,1H),4.02-3.83(m,4H),3.73-3.32(m,18H),3.01-2.97(m,6H),2.71-2.68(m,4H),2.12-1.99(m,18H),1.49-1.04(m,24H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.22。
實施例8
化合物8-2：
在0℃，向甲氧基甲基(三苯基)氯化磷(17.71g，51.67mmol)在THF(120mL)中的溶液中加入KOtBu(9.66g，86.12mmol)，攪拌0.5小時。然後在0℃加入化合物8-1(9.7g，43.06mmol)，攪拌過夜，使反應升至室溫。LC-MS顯示完全轉化。加入檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，過濾並濃縮至乾。藉由矽膠管柱(0-5% EA在PE中)純化殘餘物，得到呈油狀的化合物8-2(6.0g，55%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 6.01(s,1H),3.48(s,3H),3.43-3.33(m,2H),2.82-2.74(m,2H),2.35-2.26(m,2H),1.90-1.79(m,4H),1.38(s,9H)。
化合物8-3：
向化合物8-2(5.85g，23.09mmol)在THF(50mL)中的溶液加入鹽酸(3.28g，90.00mmol，2N，45mL)。將反應混合物於室溫攪拌3小時。TLC顯示完全轉化。藉由加入NaHCO3(飽和水溶液)將反應混合物調節至pH7，藉由EA萃取。濃縮有機相，得到呈油狀的粗化合物8-3(5.5g)，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.62(pent,J=1.2Hz,1H),3.42-3.33(m,3H),2.82-2.72(m,2H),2.03-1.93(m,1H),1.92-1.87(m,2H),1.75-1.62(m,1H),1.51-1.44(m,1H),1.38(s,9H)。
化合物8-4：
向化合物8-3(5.25g，21.94mmol)和K2CO3(660.39mg，4.39mmol)在MeOH(30mL)中的混合物中加入福爾馬林(6.59g，37%水溶液，219.38mmol)。將反應混合物在室溫攪拌過夜。TLC顯示完全轉化。藉由加入檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，藉由EA萃取。濃縮有機相，得到化合物8-4(6.7g)，其不經進一步純化直接用於下一步驟。
化合物8-5：
向化合物8-4(6.3g，23.39mmol)在MeOH(50mL)中的溶液中加入NaBH4(2.65g，70.17mmol)。將反應混合物於室溫攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。藉由加入檸檬酸(10%水溶液)將反應混合物調節至pH6，過濾，藉由DCM萃取。將有機相濃縮並藉由矽膠管柱(0-5% MeOH在DCM中)純化，得到化合物8-5(1.4g，22%產率)。
C14H25NO4質量計算為：271.18；實測：257.24[M-tBu+CH3CN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.16-7.55(m,1H),4.52-4.48(m,2H),3.36-3.27(m,5H),2.74-2.50(m,2H),1.98-1.84(m 2H),1.54-1.50(m 2H),1.49(s,9H),1.05-0.97(m,2H)。
化合物8-6：
將化合物8-5(1.35g，4.97mmol)溶解在DCM(5mL)中，在室溫將HCl/二噁烷(4M，10mL)添加到混合物中，然後在室溫攪拌2小時。將反應混合物在真空中濃縮得到呈油狀的粗產物8-6(1.3g)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C9H17NO2質量計算為：171.1；實測：172.2[M+H]+，ESI。
化合物8-7：
將Z-6-胺基己酸(1.99g，7.51mmol)、HATU(4.72g，12.52mmol)和DIPEA(2.43g，18.78mmol，3.27mL)溶解在DCM(20mL)中。將反應攪拌20分鐘，然後加入化合物8-6(1.3g，6.26mmol)並再攪拌2小時。將反應混合物用H2O(20mL)淬滅，用飽和的NaHCO3水溶液(30mL)洗滌，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4乾燥，在真空中濃縮並藉由快速管柱色譜法(DCM：MeOH=20：1)在矽膠上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物8-7(1.5g，3.58mmol，57%產率)。C23H34N2O5質量計算為：418.3；實測：419.3[M+H]+，ESI。
化合物8-8：
將化合物8-7(1.2g，2.87mmol)溶解在DCM(20mL)中。添加DMTrCl(971.49mg，2.87mmol)和DIPEA(741.12mg，5.73mmol，998.81μL)。將反應混合物在室溫中攪拌2小時。然後將反應用水淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌。收集有機相，乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(DCM：MeOH：TEA=20：1：0.5%)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物8-8(850mg，41%產率)。
C44H52N2O7質量計算為：720.4；實測：721.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.41-7.36(m,3H),7.35-7.29(m,6H),7.27-7.20(m,5H),6.89(d,J=8.9Hz,4H),5.00(s,2H),4.67(t,J=4.9Hz,1H),3.75(s,6H),3.55-
3.47(m,2H),3.39(d,J=4.5Hz,2H),3.00-2.95(m,4H),2.92-2.84(m,1H),2.62(q,J=11Hz,1H),2.16-2.10(m,2H),1.95-1.70(m,2H),1.62-1.58(m,1H),1.51-1.35(m,5H),1.27-1.23(m,3H),1.12-1.00(m,2H)。
化合物8-9：
將化合物8-8(0.8g，1.11mmol)溶解在MeOH(10mL)中。添加Pd/C(80mg)。在氫氣氣氛下，在室溫中攪拌反應混合物3小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗產物8-9(550mg，84%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C36H46N2O5質量計算為：586.3；實測：587.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.40-7.38(m,2H),7.31(t,J=7.7Hz,2H),7.29-7.18(m,5H),6.89(d,J=8.9Hz,4H),3.74(s,6H),3.54-3.43(m,2H),3.34-3.21(m,2H),2.96(s,2H),2.94-2.85(m,2H),2.67-2.55(m,1H),2.17-2.10(m,2H),1.99-1.74(m,2H),1.63-1.58(m,1H),1.53-1.42(m,3H),1.36-1.24(m,5H),1.16-1.10(m,1H),1.05-0.98(m,1H)。
實施例9
化合物9-2：
將甲氧基甲基(三苯基)氯化磷(116.8g，340.72mmol)溶解在THF(1200mL)中。在0℃中將KOtBu(46.74g，416.56mmol)添加到混合物中。將反應混合物在0℃再攪拌30分鐘。將化合物9-1(40g，189.34mmol)加入到混合物中。將混合物升至室溫，在室溫攪拌過夜。用飽和檸檬酸淬滅反應，將pH調節至6-7。將反應混合物用EA(500mL×3)萃取，用鹽水(200mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(在PE中10-30% EA)在矽膠上純化，得到呈油狀的化合物9-2(24g，52%產率)。
C13H21NO3質量計算為：239.3；實測：225.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 5.88(t,J=2.4Hz,1H),3.83(s,4H),3.47(s,3H),2.79-2.74(m,4H),1.41(s,9H)。
化合物9-3：
將化合物9-2(15g，62.68mmol)溶解在ACN(450mL)中。將2,2,2-三氯乙酸(12.90g，78.98mmol)的水溶液(150mL)添加到反應混合物中。將反應在室溫攪拌過夜，然後用飽和NaHCO3淬滅，將PH調節至7-8。將混合物用EA(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮得到呈油狀的粗產物9-3(13g，92%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C12H19NO3質量計算為：225.3；實測：211.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
化合物9-4：
將化合物9-3(13g，57.71mmol)溶解在MeOH(400mL)中。向混合物中加入K2CO3(1.60g，11.54mmol)和甲醛(4.92g，163.88mmol，在水中)。將反應在室溫攪拌過夜，然後用飽和檸檬酸淬滅，將PH調節至6-7。在真空中濃縮混合物
以除去MeOH。將殘餘物用EA(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，得到粗產物9-4(14g，95%產率)。
C13H21NO4質量計算為：255.3；實測：241.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
化合物9-5：
將化合物9-4(14g，54.84mmol)溶解在MeOH(420mL)中。分批加入NaBH4(4.56g，120.64mmol)。將反應在室溫攪拌1小時，然後用水淬滅。用飽和檸檬酸將PH調至6-7。將混合物在真空中濃縮以除去MeOH，然後將殘餘物用DCM(200mL×3)萃取，用鹽水(100mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-5% MeOH)在矽膠上純化，得到化合物9-5(7.05g，50%產率)。
C13H23NO4質量計算為：257.3；實測：243.1[M-tBu+ACN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.51-4.11(m,2H),3.83-3.75(m,4H),3.25-3.17(m,4H),2.01-1.91(m,4H),1.36(s,9H)。
化合物9-6：
將化合物9-5(13.1g，50.91mmol)溶解在HCl的1,4-二噁烷溶液(4M，131mL)中。將反應混合物於室溫攪拌1小時，然後將其在真空中濃縮，得到粗產物9-6(9.8g)，其無需進一步純化即可用於下一步。
C8H13NO2Cl質量計算為：157.2；實測：158.2[M+H]+，ESI。
化合物9-7：
將化合物9-6(9.8g，50.60mmol)溶解在DCM(300mL)中。將DIEA(22.89g，177.10mmol，30.85mL)、HOBT(8.20g，60.72mmol)、EDCI(11.64g，60.72mmol)和Fmoc-6-己酸(17.88g，50.60mmol)添加到反應混合物中。將反應在室溫攪拌
過夜，然後用水淬滅，用10%檸檬酸(50mL)、飽和NaHCO3溶液(50mL)、鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在矽膠上純化，得到化合物9-7(6.7g，經兩步為25%產率)。
C30H36N2O5質量計算為：492.3；實測：493.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.91-7.68(m,4H),7.44-7.28(m,4H),6.76(s,1H),6.68-6.66(m,1H),6.29(s,2H),4.01(s,2H),3.74(s,2H),3.69(s,2H),3.27(s,4H),2.92-2.87(m,2H),1.98-1.91(m,4H),1.46-1.18(m,6H)。
化合物9-8：
將化合物9-7(6.7g，13.60mmol)、DMAP(166.15mg，1.36mmol)和DIEA(2.64g，20.40mmol，3.18mL)溶解在DCM(180mL)中。在0℃，將DMTrCl(5.52g，14.96mmol)分批加入到反應混合物中。將反應在室溫攪拌過夜，然後用水淬滅。將混合物用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(50-100%EA)在Al2O3上純化，得到化合物9-8(4.3g，40%產率)。
C51H56N2O8質量計算為：824.4；實測：848.3[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.91-7.68(m,4H),7.44-7.28(m,4H),7.75-7.71(m,6H),6.90-6.88(m,6H),6.67-6.65(m,1H),6.29(s,2H),3.96(s,1H),3.74(s,9H),3.69-3.67(m,2H),3.53(s,1H),3.39-3.37(m,2H),2.92-2.89(m,4H),2.03-1.79(m,8H),1.46-1.18(m,6H)。
化合物9-9：
將化合物9-8(4.2g，5.09mmol)溶解在MeOH(126mL)中，然後將哌啶(12.6mL)添加到混合物中。將反應混合物在室溫攪拌過夜，然後將其在真空中濃縮，
藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫的化合物9-9(3g，97%產率)。
C36H46N2O6質量計算為：602.3；實測：603.4[M+H]+，ESI。
化合物9-10：
將化合物1-4(3.2g，7.16mmol)和化合物9-9(3g，5.11mmol)溶解在DCM(130mL)中。將DIEA(1.65g，12.78mmol，2.17mL)、HOBT(807.01mg，6.13mmol)和EDCI(1.18g，6.13mmol)加入到混合物中。將反應在室溫攪拌過夜，然後用水(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由HPLC純化，得到化合物9-10(610mg，12%產率)。
C55H73N3O16質量計算為：1031.5；實測：1054.5[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.82-7.73(m,2H),7.24-6.88(m,12H),5.22(s,1H),4.97(d,J=10.8Hz,1H),4.64-4.48(m,2H),4.05-3.85(m,4H),3.71-3.69(m,12H),3.52(s,1H),3.39-3.38(m,1H),3.04-2.91(m,4H),2.11-1.78(m,19H),1.46-1.18(m,14H)。
化合物9-11：
向化合物9-10(1.0g，0.97mmol)在無水DCM(3.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(32.0mg，0.27mmol)和2-氰乙基N,N,N’,N’-四異丙基亞磷二胺(108
mg，0.36mmol)，在室溫中攪拌1小時。LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱：C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器：UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的化合物9-11(680mg，56%產率)。
C64H90N5O17P質量計算為：1231.61；實測：1177.1[M-CH2CH2CN]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.81-7.67(m,2H),7.26-7.23(m,6H),6.88-6.86(m,6H),5.22(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.95(m,1H),4.48(d,J=12.0Hz,1H),4.04-3.96(m,4H),3.89-3.84(m,1H),3.73-3.38(m,20H),3.01-2.93(m,4H),2.73-2.71(m,2H),2.10-1.75(m,20H),1.51-1.07(m,22H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.82,146.70。
化合物9-12：
向化合物9-10(100mg，0.097mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(5mg，0.04mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)。將反應混合物在室溫攪拌3小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。將反應混合物用DCM(10mL)稀釋，用H2O(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物9-12(85mg，90%產率)。
C59H77N3O19質量計算為：1131.52；實測：1130.2[M+H]-，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.87-7.72(m,2H),7.24-7.21(m,6H),6.90-6.87(m,6H),5.21(d,J=6.0Hz,1H),4.98-4.95(m,1H),4.49(d,J=12.0Hz,1H),4.06-3.98(m,6H),3.90-3.83(m,1H),3.73-3.50(m,13H),3.02-2.94(m,4H),2.45-2.44(m,4H),2.11-1.76(m,20H),1.48-1.18(m,12H)。
固體支持物9-13：
天然胺基-LCAA-CPG(上樣值：75umol/g，1000Å)用ACN(100mL×2)、DMF(100mL×2)和DCM(100mL×2)洗滌，然後在高真空中乾燥過夜。
向琥珀酸酯9-12(85mg，0.075mmol)和HBTU(53mg,0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)，將反應混合物於室溫震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(300mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(300mg)。藉由在室溫，用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將固體支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時以得到固體支持物9-13(300mg)。對於上樣計算，取5.00mg的乾的上樣的CPG，在DCM中添加25mL的3% DCA。震盪溶液，測量482nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：
以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(482nm處的Abs值)*1000)/78.3*(使用的CPG的mg)
以mL添加的DCA總體積=25mL
482nm處的Abs值=0.577
使用的CPG的Mg=5.00mg
以μmol/g上樣=((25)*(0.577)*1000)/78.3*(5.00)=36.8umol/g。
實施例10
化合物10-2：
在室溫，將化合物10-1(0.6g，0.299mmol)、DIEA(96.63mg，0.748mmol，130.23μL)、HOBT(48.49mg，0.359mmol)和EDCI(68.80mg，0.359mmol)在
DCM(18mL)中混合，攪拌30分鐘，然後加入化合物2-10(412.34mg，0.897mmol)，在室溫中攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃縮，藉由製備型HPLC(C18管柱，沖提液A：水，沖提液B：ACN)純化，得到呈白色固體的化合物10-2(580mg，79%產率)。
C120H179N11O42質量計算為：2446.22；實測：1247.61[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.86-7.82(m,6H),7.75(t,J=5.5Hz,3H),7.39-7.29(m,4H),7.26-7.19(m,5H),7.00(br,1H),6.89(dd,J=8.9,3.7Hz,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.2,3.4Hz,3H),4.66-4.64(m,1H),4.78(d,J=8.4Hz,3H),4.04-3.96(m,10H),3.90-3.83(m,3H),3.73-3.67(m,11H),3.55-3.50(m,13H),3.43-3.37(m,5H),3.02(pent,J=5.8Hz,12H),2.90(s,2H),2.27(t,J=6.2Hz,6H),2.10(s,9H)2.07-2.00(m,10H),1.99(s,9H),1.96-1.92(m,2H),1.89(s,9H),1.85-1.80(m,2H),1.77(s,9H),1.54-1.37(m,22H),1.22-1.20(m,12H)。
化合物10-3：
向化合物10-2(150mg，0.06mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(14mg，0.12mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)，將反應混合物在室溫攪拌3小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗，將反應混合物用DCM稀釋，用水(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物10-3(130mg，97%產率)。
C124H183N11O45質量計算為：2546.24；實測：1273.5[M+2H]2+，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)：7.84-7.73(m,9H),7.37-7.21(m,9H),6.98-6.89(m,5H),5.21(d,J=6.0Hz,3H),4.97-4.94(m,3H),4.48(d,J=12.0Hz,3H),4.07-3.66
(m,26H),3.55-3.37(m,17H),3.04-2.95(m,14H),2.45(d,J=6.0Hz,4H),2.29-2.25(m,6H),2.11-1.72(m,50H),1.51-1.12(m,38H)。
化合物10-4：
向化合物10-3(130mg，0.05mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)。將反應混合物於室溫震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(300mg，上樣75μmol/g)，將懸浮液在室溫中震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(300mg)。藉由在室溫，用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時，得到固體支持物10-4(300mg)。對於上樣計算，取5.19mg的乾的上樣的CPG，在DCM中添加20mL的3% DCA。震盪溶液，測量500nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：
以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(500nm處的Abs值)*1000)/76*(使用的CPG的mg)
以mL添加的DCA總體積=20mL
500nm處的Abs值=0.335
使用的CPG的Mg=5.19mg
以μmol/g上樣=((20)*(0.335)*1000)/76*(5.19)=17μmol/g。
實施例11
化合物11-1：
向化合物2-10(1.27g，3.59mmol)在DCM(15mL)中的溶液中加入TEA(495.41mg，4.90mmol)和HATU(1.35g，3.59mmol)。攪拌15分鐘後，將Fmoc-6-己酸(1.5g，3.26mmol)加入到反應混合物中並繼續攪拌4小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，DCM萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=20/1沖提，得到600mg化合物11-1，產率23.2%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.87(d,J=7.6Hz,2H),7.68(d,J=7.4Hz,2H),7.44-7.35(m,4H),7.35-7.28(m,4H),7.27-7.17(m,6H),6.88(d,J=7.6Hz,4H),4.64(td,J=5.04,1.6Hz,1H),4.28(d,J=6.9Hz,2H),4.20(t,J=6.8Hz,1H),3.96(s,
1H),3.73(d,J=3.8Hz,6H),3.66(d,J=10.4Hz,2H),3.50(s,1H),3.39(t,J=5.9Hz,2H),2.96(t,J=6.6Hz,2H),2.91(s,2H),2.06-1.74(m,6H),1.47-1.31(m,4H),1.26-1.13(m,2H)。
化合物11-2：
將哌啶(0.4mL)添加到化合物11-1(600mg，0.75mmol)在MeOH(4mL)中的溶液中。攪拌過夜後，將混合物在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH/NH3OH=100/10/1沖提，得到360mg的化合物11-2，產率82%。
C35H44N2O5質量計算為：572.3；實測：573.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.27-7.21(m,4H),6.91-6.85(m,9H),3.97(s,1H),3.73(s,6H),3.68(s,2H),3.47(d,J=6.5Hz,2H),3.16(s,2H),2.90(s,2H),2.66-2.62(m,2H),2.54-2.51(m,2H),1.49-1.17(m,12H)。
化合物11-4：
藉由用氮氣吹掃，將化合物11-3(10g，84.65mmol)、4-溴吡啶(14.71g，93.11mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(4g，5.70mmol)和t-BuOK(19.00g，169.30mmol)在1,4-二噁烷(200mL)中的混合物脫氣。然後將混合物在60℃加熱6小時。濃縮混合物。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH/NH4OH=95/5/1沖提，得到8g呈黃色固體的化合物11-4，48%產率。
C12H9N3質量計算為：195.1；實測：196.2[M+H]+，ESI。
化合物11-5：
將化合物11-4(10g，51.22mmol)溶解在第三丁醇中，升溫至50℃，然後加入KOH(574.84mg，10.24mmol)和MeOH(5mL)。然後將丙烯酸第三丁酯(7.22g，56.35mmol)緩慢添加到反應混合物中，攪拌5小時。將混合物在真空中濃縮。
將殘餘物在乙酸乙酯(250mL)和水(150mL)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用PE/EA=1/2沖提，得到11g的化合物11-5，產率66%。
C19H21N3O2質量計算為：323.2；實測：324.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.65(d,J=5.6Hz,4H),7.50(d,J=6.0Hz,4H),2.82(t,J=7.8Hz,2H),2.23(t,J=7.8Hz,2H),1.35(s,9H)。
化合物11-6：
將氯化鈷六水合物(1.47g，6.18mmol)添加到化合物11-5(1g，3.09mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中。然後在-6℃將硼氫化鈉(1.17g，30.92mmol)緩慢加入到反應混合物中。將混合物升至室溫，攪拌5小時。將混合物在真空中濃縮。將殘餘物溶解在EA中，藉由矽藻土床過濾並用MeOH洗滌。濃縮濾液，得到0.7g化合物11-6，產率為69%。
C19H25N3O2質量計算為：327.2；實測：328.3[M+H]+，ESI。
化合物11-7：
將化合物11-6(2.12g，9.16mmol)溶解在DCM(40mL)中。然後將TEA(925.42mg，9.16mmol)和HATU(3.46g，9.16mmol)添加到該溶液中。攪拌20分鐘後，向反應混合物中加入Boc-6-胺基己酸(3g，9.16mmol)，將混合物攪拌5小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，DCM萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=9/1沖提，得到2.5g呈黃色油狀的化合物11-7，產率71%。
C30H44N4O5質量計算為：540.3；實測：541.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.48(d,J=5.9Hz,4H),7.45(t,J=6.6Hz,1H),7.14(d,J=6.1Hz,4H),6.73(t,J=5.4Hz,1H),3.88(d,J=6.1Hz,2H),2.85(q,J=6.6Hz,2H),2.31(t,J=8.0Hz,2H),1.94(q,J=8.0Hz,4H),1.36(s,9H),1.32(s,9H),1.31-1.23(m,4H),1.1-0.9(m,2H)。
化合物11-8：
將氧化鉑(2.2g，9.69mmol)添加到化合物11-7(4.5g，8.32mmol)在AcOH(15ml)中的溶液中。將混合物在~0.4MPa下氫化56小時。藉由矽藻土床過濾催化劑並用MeOH洗滌。將混合物在真空中濃縮。藉由添加濃的NaHCO3水溶液將pH調節至7，然後真空乾燥。將殘餘物溶解於THF中，然後將混合物過濾，減壓蒸發濾液，得到4g的呈無色油狀的化合物11-8，產率87%。
C30H56N4O5質量計算為：552.4；實測：553.4[M+H]+，ESI。
化合物11-9：
將TEA(402.72mg，3.98mmol)和HATU(1.50g，3.98mmol)添加到Boc-6-胺基己酸(920.49mg，3.98mmol)在DCM(10mL)中的溶液中。將溶液攪拌20分鐘後，將化合物11-8(1g，1.18mmol)添加到反應混合物中，繼續攪拌5小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，DCM萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析純化，用DCM/MeOH=15/1沖提，得到0.4g呈白色固體的化合物11-9，產率22%。
C52H94N6O11質量計算為：978.7；實測：979.8[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.41(t,J=6.0Hz,1H),6.78-6.70(m,3H),3.88(d,J=11.4Hz,2H),3.02(d,J=6.5Hz,6H),2.92-2.82(m,8H),2.25(t,J=7.4Hz,4H),
2.15(t,J=8.1Hz,2H),2.16(t,J=7.2Hz,2H),1.70-1.50(m,6H),1.49-1.38(m,10H),1.38(s,9H),1.36(s,27H),1.34-1.15(m,14H)。
化合物11-10：
將TFA(2mL)添加到化合物11-9(1.4g，1.43mmol)在DCM(6mL)中的溶液中，然後將混合物在室溫中攪拌4小時。在真空中濃縮混合物，得到850mg的呈無色油狀的化合物11-10，產率為95%。
C33H62N6O5質量計算為：622.5；實測：623.6[M+H]+，ESI。
化合物11-11：
將TEA(584.84mg，5.78mmol)和HATU(1.64g，4.33mmol)添加到化合物1-4(2.13g，4.77mmol)在DMF(10mL)中的溶液中。攪拌20分鐘後，將化合物11-10(0.9g，1.44mmol)添加到反應混合物中，繼續攪拌5小時。藉由反相管柱(C18管柱)純化混合物，以提供1.3g的呈白色固體的化合物11-11，產率為47%。
C90H143N9O35質量計算為：1909.9；實測：956.0[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 12.0(br,1H),7.83(d,J=9.2Hz,3H),7.70(t,J=5.5Hz,3H),7.50-7.40(m,1H),5.20(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.24,3.4Hz,3H),4.50-4.40(m,5H),4.08-3.96(m,9H),3.92-3.82(m,5H),3.76-3.66(m,3H),3.46-3.36(m,4H),3.15-2.75(m,11H),2.40-2.30(m,2H),2.25(t,J=7.3Hz,4H),2.10(s,9H),2.08-2.00(m,8H),1.99(s,9H),1.98(s,9H),1.77(s,9H),1.60-1.08(m,42H)。
化合物11-12：
將化合物11-11(1.4g，0.73mmol)溶解在DCM(15mL)中，然後向該溶液中加入HOBT(148.47mg，1.10mmol)、EDCI(210.10mg，1.10mmol)和DIEA(236.69mg，1.83mmol)。攪拌15分鐘後，將化合物11-2(503.47mg，0.88mmol)添加到
反應混合物中，繼續攪拌4小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，DCM萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。藉由反相管柱(C18管柱)純化殘餘物，以提供0.8g的呈白色粉末的化合物11-12，產率為44%。
C125H185N11O39質量計算為：2464.3；實測：1255.6[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.86-7.76(m,4H),7.71(t,J=5.3Hz,3H),7.45(s,1H),7.41-7.35(m,2H),7.34-7.28(m,2H),7.27-7.18(m,5H),6.93-6.86(m,4H),5.27-5.15(d,J=3.3Hz,3H),5.02-4.90(dd,J=11.2,3.4Hz,3H),4.69-4.60(m,1H),4.57-4.33(m,5H),4.11-3.98(m,9H),3.97(s,1H),3.93-3.81(m,5H),3.73(s,6H),3.72-3.62(m,5H),3.51(s,1H),3.46-3.36(m,5H),3.14-2.73(m,14H),2.43-2.29(m,2H),2.29-2.19(m,4H),2.01(s,9H),2.06-1.97(m,19H),1.96-1.91(m,3H),1.87(s,9H),1.86-1.80(m,2H),1.77(s,9H),1.70-1.55(m,5H),1.54-1.13(m,44H)。
化合物11-13：
在室溫，向化合物11-12(2.0g，0.8mmol)在無水DCM(7.0mL)中的溶液中加入4,5-二氰基咪唑(80.0mg，0.67mmol)和2-氰乙基N,N,N’,N’-四異丙基亞磷二胺(270mg，0.90mmol)，攪拌1小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗。用水(100mL)淬滅溶液，用鹽水(300mL×3)洗滌，用Na2SO4乾燥。然後，在減壓下濃縮溶液，並在以下條件下藉由快速製備型HPLC純化殘餘物(管柱，C18矽膠；流動相：CH3CN/H2O=1/1，在20分鐘內增加到CH3CN/H2O=1/0；檢測器，UV 254nm)。這導致得到呈白色固體的化合物11-13(1.0g，45%產率)。
C134H202N13O40P質量計算為：2664.39；實測：1132.5[M-DMTr-N(CH(CH3)2)2+4H]2+，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d 6)δ 7.82-7.69(m,6H),7.44-7.19(m,9H),6.90-6.87(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,3H),4.98-4.94(m,3H),4.49-4.44(m,5H),4.04-3.37(m,35H),3.02-2.71(m,15H),2.33-1.75(m,56H),1.64-1.07(m,57H)。
31PNMR(242MHz,DMSO-d 6)δ 146.79,146.67。
化合物11-14：
向化合物11-12(150mg，0.06mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(5mg，0.04mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)，將反應混合物在室溫中攪拌3小時，LCMS顯示起始材料被完全消耗，將反應混合物用DCM稀釋，用水(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，將有機層濃縮得到呈白色固體的化合物11-14(135mg，97%產率)。
C129H189N11O42質量計算為：2564.30；實測：1132.5[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(600MHz,DMSO-d 6)：7.84-7.71(m,6H),7.45-7.21(m,10H),6.92-6.89(m,4H),5.21(d,J=6.0Hz,3H),4.98-4.94(m,3H),4.49-4.44(m,5H),4.07-3.37(m,36H),3.16-2.84(m,14H),2.44-1.77(m,62H),1.45-1.21(m,50H)。
化合物11-15：
向化合物11-14(135mg，0.05mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)。將反應混合物在室溫中震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(300mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(300mg)。藉由在室溫中，用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時，得到固體支持物11-15(300mg)。對於上樣計算，取5.00mg的乾的上樣的CPG，在DCM中添加20mL的3% DCA。震盪溶液，測量500nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：
以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(500nm處的Abs值)*1000)/76*(使用的CPG的mg)
以mL添加的DCA總體積=20mL
500nm處的Abs值=0.464
使用的CPG的Mg=5.0mg
以μmol/g上樣=((20)*(0.464)*1000)/76*(5.0)=24umol/g。
實施例12
化合物12-1：
將化合物3-4(1.1g，5.16mmol)溶解在H2O(10mL)和THF(20mL)中。添加K2CO3(1.43g，10.31mmol)和氯甲酸苄酯(967mg，5.67mmol)。將反應混合物在室溫中攪拌3小時。然後將其在真空中濃縮並藉由快速管柱色譜法(PE/EA=5/1)在矽膠上純化，得到作為白色泡沫固體的化合物12-1(1.5g，84%產率)。
C20H29NO4質量計算為：347.2；實測：348.3[M+H]+，ESI。
化合物12-2：
將化合物12-1(1.52g，4.37mmol)、DMAP(147.10mg，1.20mmol)和DIEA(3.11g，24.08mmol，4.19mL)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DMTrCl(1.48g，4.37mmol)在DCM(20mL)中的溶液緩慢添加到反應混合物中。將反應於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-3% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物12-4(1.9g，67%產率)。
C41H47NO6質量計算為：649.34；實測：650.34[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.41-7.19(m,15H),6.90-6.87(m,3H),5.06-5.05(m,2H),4.42-4.40(m,1H),3.76(s,6H),3.40-3.38(m,6H),2.88(s,2H),1.39-1.11(m,12H)。
化合物12-3：
將化合物12-2(0.7g，1.08mmol)溶解在MeOH(30mL)中，然後將Pd/C(140mg)添加到溶液中。在氫氣氣氛下，在室溫中攪拌反應混合物3小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗化合物12-3(520mg)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C33H41NO4質量計算為：515.30；實測：516.30[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.38(d,J=8.8Hz,2H),7.32-7.20(m,7H),6.89-6.87(m,4H),4.51-4.49(m,1H),3.73(s,6H),2.89-2.86(m,8H),1.52-1.51(m,2H),1.19-1.12(m,7H),0.91-0.88(m,2H)。
化合物12-4：
化合物10-1(1.56g，0.756mmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(300.74mg，2.33mmol)、EDCI(297.39mg，1.55mmol)和HOBT(209.62mg，1.55mmol)加入混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物12-3(400mg，0.756mmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-8% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物12-4(1g，51%產率)。
C124H187N11O42質量計算為：2503.28；實測：1101.6[M-DMTr+2H+]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85-7.81(m,6H),7.73(t,J=5.6Hz,3H),7.39(d,J=7.32Hz,2H),7.32-7.19(m,8H),6.99(s,1H),6.88(d,J=8.9Hz,4H),5.21-5.20(m,3H),4.98-4.94(m,3H),4.48(d,J=8.44Hz,3H),4.42(t,J=5.0Hz,1H),4.05-4.00(m,9H),3.90-3.83(m,3H),3.73-3.67(m,9H),3.55-3.52(m,11H),3.43-3.38(m,
6H),3.22-3.21(m,6H),3.06-3.00(m,11H),2.29-2.24(m,5H),2.22(t,J=7.4Hz,2H),2.10(s,8H),2.05(t,J=6.96Hz,8H),1.99-1.98(m,9H),1.89(s,8H),1.77(s,8H),1.52-1.44(m,22H),1.30-1.22(m,24H)。
實施例13
化合物13-1：
將化合物4-7(1.3g，7.01mmol)溶解在THF(30mL)和H2O(15mL)中。將K2CO3(2.91g，21.05mmol)加入到溶液中。在0℃將氯甲酸苄酯(1.32g，7.72mmol)添加到反應混合物中。將混合物於室溫攪拌3小時。將反應混合物用EA(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-5% MeOH)在矽膠上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物13-1(1.95g，87%產率)。
C18H25NO4質量計算為：319.2；實測：320.2[M+H]+，ESI。
化合物13-2：
將化合物13-1(2g，6.26mmol)和DIEA(2.43g，18.79mmol，4.19mL)溶解在DCM(60mL)中。在0℃，將DMTrCl(2.02g，5.95mmol)加入到反應混合物中。將反應於0℃攪拌1小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，
藉由快速管柱色譜法(PE/EA=0-40%)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物13-2(2.6g，66%產率)。
化合物13-3：
將化合物13-2(600mg，0.96mmol)溶解在MeOH(20mL)中，然後將Pd/C添加到反應混合物中。在氫氣氣氛下，在室溫中攪拌反應混合物3小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗產物13-3(470mg，粗產物)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C31H37NO4質量計算為：487.3；實測：488.3[M+H]+，ESI。
化合物13-4：
將化合物10-1(1.23g，0.61mmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(239mg，1.85mmol，0.32mL)、EDCI(236mg，1.23mmol)和HOBT(166mg，1.23mmol)加入到混合物。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物13-3(300mg，0.61mmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-8% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物13-4(1g，66%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85-7.82(m,6H),7.75-7.73(m,3H),7.40-7.38(m,2H),733-7.29(m,2H),7.27-7.25(m,4H),7.23-7.19(m,1H),6.98(s,1H),6.90-6.88(m,4H),5.21(d,J=3.2Hz,3H),4.97(dd,J=3.2,11.2Hz,3H),4.63-4.61(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.04-4.00(m,9H),3.91-3.83(m,3H),3.73(s,6H),3.71-3.67(m,3H),3.55-3.52(m,12H),3.44-3.37(m,5H),3.27-3.15(m,5H),3.06-3.01(m,14H),2.27(t,J=12.8Hz,6H),2.21(d,J=14.8Hz,2H),2.10(s,9H),2.04(t,J=6.8
Hz,8H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.58-1.33(m,30H),1.29-1.23(m,12H)。
實施例14
化合物14-1：
將化合物5-6(3.6g，19.27mmol)溶解在THF(30mL)和H2O(15mL)中。將K2CO3(5.33g，38.54mmol)加入到溶液中。在0℃將氯甲酸苄酯(3.62g，21.20mmol)添加到反應混合物中。將混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用EA(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-2% MeOH)在矽膠上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物14-1(5g，81%產率)。
C18H25NO4質量計算為：319.2；實測：320.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.39-7.28(m,5H),5.01(s,2H),4.27(t,J=5.4Hz,2H),3.61-3.50(m,4H),3.22(d,J=5.3Hz,4H),1.55(t,J=6.1Hz,4H),1.25-1.22(m,8H)。
化合物14-2：
將化合物14-1(3.5g，10.96mmol)和DIEA(2.12g，16.44mmol)溶解在DCM(60mL)中。在0℃，將DMTrCl(3.34g，9.86mmol)加入到反應混合物中。
將反應於0℃攪拌3小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(PE/EA=0-60%)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物14-2(5.5g，81%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.39-7.18(m,14H),6.88(d,J=8.8Hz,4H),5.00(s,2H),4.39(t,J=4.9Hz,1H),3.73(s,6H),3.58-3.35(m,6H),2.83(s,2H),1.29-1.15(m,8H)。
化合物14-3：
將化合物14-2(254mg，408.52μmol)溶解在MeOH(10mL)中，然後將Pd/C添加到反應混合物中。在氫氣氣氛下，在室溫攪拌反應混合物2小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗產物14-3(199mg，粗產物)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C31H37NO4質量計算為質量計算為：487.3；實測：488.3[M+H]+，ESI。
化合物14-4：
將化合物10-1(820mg，408.51μmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(158mg，1.23mmol)、EDCI(157mg，817μmol)和HOBT(110mg，817μmol)添加到混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物14-3(199mg，408.51μmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-6% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物14-4(540mg，53%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.89-7.80(m,6H),7.75(t,J=5.5Hz,3H),7.37(d,J=7.3Hz,2H),7.30(t,J=7.7Hz,2H),7.23-7.17(m,5H),6.99(s,1H),6.87(d,J=8.4Hz,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=10.8,3.4Hz,3H),4.47(d,J=8.5Hz,3H),4.41(t,J=4.9Hz,1H),4.04-3.98(m,9H),3.91-3.82(m,3H),3.74-3.48(m,23H),3.43-3.36(m,6H),3.06-2.98(m,12H),2.83(d,J=9.4Hz,2H),2.27(t,J=6.3Hz,6H),2.09(s,9H),2.03(t,J=7.0Hz,8H),2.00-1.95(m,12H),2.01(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.54-1.37(m,22H),1.31-1.14(m,20H)。
實施例15
化合物15-1：
將化合物7-6(3.8g，18.30mmol)溶解在THF(30mL)和H2O(15mL)中。將K2CO3(5.06g，36.59mmol)加入到反應混合物中。在0℃將氯甲酸苄酯(3.43g，20.13mmol)添加到反應混合物中。將混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用EA(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫的粗產物15-1(3.46g，粗產物)。
C17H23NO4質量計算為：305.2；實測：306.2[M+H]+，ESI。
化合物15-2：
將化合物15-1(3.07g，10.06mmol)和DIEA(1.95g，15.09mmol)溶解在DCM(60mL)中。在0℃，將DMTrCl(3.41g，10.06mmol)加入到反應混合物中。將反應於0℃攪拌3小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(PE/EA=0-60%)在Al2O3上和藉由製備型HPLC純化，得到呈白色泡沫固體的化合物15-2a和化合物15-2b(1.78g，58%產率)。
15-2a：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.38-7.36(m,1H),7.36-7.31(m,5H),7.31-7.20(m,7H),7.20-7.15(m,1H),6.85(d,J=8.9Hz,4H),5.02(d,J=6.1Hz,2H),6.98(s,1H),4.61(t,J=5.0Hz,1H),3.71(s,6H),3.46-3.35(m,2H),3.27(d,J=5.0Hz,2H),3.13-3.05(m,2H),2.93(s,2H),2.64-2.55(m,2H),1.72-1.62(m,2H),1.30-1.21(m,2H)。
15-2b：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.40-7.27(m,9H),7.27-7.22(m,4H),7.22-7.16(m,1H),6.89(d,J=8.9Hz,4H),5.03(s,2H),6.98(s,1H),4.64(t,J=5.1Hz,1H),3.73(s,6H),3.43-3.34(m,4H),3.19-3.09(m,2H),3.13-3.05(m,2H),2.84(s,2H),2.41-2.31(m,2H),1.62-1.54(m,2H),1.38-1.30(m,2H)。
化合物15-3：
將化合物15-2a(210mg，350.48μmol)溶解在MeOH(10mL)中，然後將Pd/C添加到溶液中。在氫氣氣氛下，在室溫攪拌反應混合物2小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗產物15-3a(166mg，粗產物)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
C30H35NO4質量計算為：473.3；實測：474.3[M+H]+，ESI。
將化合物15-2b(610mg，1.00mmol)溶解在MeOH(10mL)中，然後將Pd/C(140mg)添加到溶液中。在氫氣氣氛下，在室溫攪拌反應混合物2小時。將反應混合物過濾，在真空中濃縮，得到呈白色泡沫固體的粗產物15-3b(475mg，粗產物)，其不經進一步純化即用於下一步驟。
化合物15-4：
將化合物10-1(700mg，348.92μmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(135mg，1.05mmol)、EDCI(134mg，698μmol)和HOBT(94mg，698μmol)添加到混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物15-3a(199mg，408.51μmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-6% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物15-4a(550mg，64%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.88-7.80(m,6H),7.75(t,J=5.4Hz,3H),7.38-7.34(m,2H),7.28(t,J=7.6Hz,2H),7.24-7.17(m,5H),7.00(s,1H),6.87(d,J=8.9Hz,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.3,3.4Hz,3H),4.64-4.60(m,1H),4.47(d,J=8.5Hz,3H),4.05-3.98(m,9H),3.92-3.83(m,3H),3.76-3.65(m,9H),3.62-3.45(m,13H),3.45-3.37(m,6H),3.28-3.23(m,2H),3.17-3.09(m,2H),3.07-2.98(m,12H),2.97-2.89(m,2H),2.69-2.53(m,2H),2.27(t,J=6.2Hz,6H),2.16-2.07(m,11H),2.06-1.96(m,17H),1.88(s,9H),1.78(s,9H),1.57-1.36(m,22H),1.26-1.15(m,14H)。
將化合物10-1(1g，500.29μmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(194mg，1.50mmol)、EDCI(192mg，1.00mmol)和HOBT(135mg，1.00
mmol)加入混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物15-3b(238mg，502.53μmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-6% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物15-4b(550mg，44%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.87-7.80(m,4H),7.74(t,J=5.6Hz,3H),7.40-7.36(m,2H),7.31(t,J=7.7Hz,2H),7.27-7.18(m,5H),6.99(s,1H),6.91-6.87(m,4H),5.22(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.3,3.4Hz,3H),4.66-4.62(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.05-3.98(m,9H),3.92-3.83(m,3H),3.75-3.67(m,9H),3.57-3.47(m,11H),3.46-3.36(m,6H),3.34-3.27(m,4H),3.23-3.09(m,2H),3.07-2.98(m,12H),2.85(s,2H),2.46-2.31(m,2H),2.30-2.24(m,6H),2.18-2.12(m,2H),2.09(s,9H),2.06-2.01(m,8H),1.99(s,9H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.55-1.37(m,22H),1.33-1.14(m,14H)。
實施例16
化合物16-1：
將化合物6-8(190mg，0.403mmol)和化合物10-1(809mg，0.403mmol)溶解在DCM(10mL)中，然後將DIEA(156.35mg，1.21mmol)、EDCI(154.61mg，0.81mmol)和HOBT(108.97mg，0.81mmol)加入到混合物中。將反應於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，
用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物16-1(772mg，77%產率)。
C121H179N11O42質量計算為：2458.22；實測：1079.2[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.85-7.82(m,6H),7.75-7.72(m,3H),7.38-7.36(m,2H),7.29-7.27(m,2H),7.25-7.22(m,5H),6.98(s,1H),6.87(d,J=8.0Hz,4H),5.21(d,J=4.0Hz,3H),4.97(dd,J=3.2,8.0Hz,3H),4.80-4.70(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.02-4.01(m,11H),3.88-3.86(m,5H),3.73-3.69(m,9H),3.55-3.52(m,12H),3.46-3.36(m,5H),3.17(d,J=5.2Hz,1H),3.04-3.00(m,14H),2.29-2.26(m,10H),2.10-2.07(m,8H),2.06-2.02(m,19H),1.99(s,9H),1.77(s,9H),1.52-1.46(m,22H),1.45-1.22(m,12H)。
實施例17
化合物17-1：
在0℃，將化合物11-11(1.5g，0.78mmol)、DIEA(302.32mg，2.35mmol)、HOBT(212.11mg，1.57mmol)和EDCI(300.92mg，1.57mmol)溶解在DCM(15
mL)中，然後加入化合物3-12(493.56mg，0.78mmol)，將混合物在室溫攪拌1小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物藉由加入DCM(20mL)稀釋，藉由NaHCO3(飽和水溶液，50mL)和水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物17-1(1.14g，58%產率)。
C129H193N11O39質量計算為2520.35，實測為1109.35(M-DMTr+2H)2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,4H),7.73(t,J=9.2Hz,3H),7.47-7.39(m,3H),7.33-7.19(m,7H),6.88(d,J=8.92Hz,4H),5.21(d,J=3.3Hz,3H),4.98-4.94(m,3H),4.49-4.42(m,5H),4.02(s,9H),3.91-3.86(m,5H),3.73-3.68(m,9H),3.43-3.39(m,5H),3.34-3.30(m,3H),3.02-2.99(m,10H),2.87(s,4H),2.34-2.33(m,2H),2.25-2.21(m,6H),2.10(s,9H),2.10-2.08(m,8H),2.0(s,9H),1.99(s,3H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.45-1.24(m,64H)。
實施例18
化合物18-1：
在0℃，向化合物11-11(1.01g，0.45mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入DIEA(193.61mg，1.85mmol，0.32mL)、EDCI(191.45mg，0.99mmol)和HOBT
(134.95mg，0.99mmol)。於0℃將反應攪拌30分鐘。將化合物4-10(300mg，0.49mmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-8% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物18-1(500mg，46%產率)。
C127H189N11O39質量計算為：2493.31；實測：1096.7[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84-7.78(m,2H),7.72(t,J=5.4Hz,3H),7.45(br,1H),7.40-7.39(m,2H),7.33-7.30(m,2H),7.28-7.20(m,5H),5.22(d,J=3.4Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.64-4.62(m,3H),4.49(d,J=8.4Hz,2H),4.03(s,9H),3.91-3.84(m,5H),3.74(s,6H),3.72-3.68(m,3H),3.45-3.41(m,2H),3.40-3.34(m,4H),3.28-3.16(m,4H),3.01-2.99(m,11H),2.85-2.67(m,4H),2.34-2.32(m,2H),2.27-2.22(m,6H),2.07-2.00(m,17H),1.89(s,9H),1.78(s,9H),1.64-1.56(m,4H),1.55-1.34(m,36H),1.28-1.21(m,16H)。
實施例19
化合物19-1：
將化合物11-11(1.59g，832.24μmol)(3.2g，7.16mmol)和化合物5-9(500mg，832.24μmol)溶解在DCM(50mL)中。將DIEA(215.12mg，1.66mmol，289.92μL)、EDCI(239.31mg，1.25mmol)和HOBT(112.45mg，832.24μmol)添加到混合物中。將反應在室溫攪拌過夜。將反應混合物用水(40mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由HPLC純化，得到化合物19-1(840mg，36%產率)。
C127H189N11O39質量計算為：2492.3；實測：1258.4[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85-7.71(m,7H),7.49(s,1H),7.37-7.20(m,9H),6.82-6.87(m,J=8.8Hz,4H),5.22(d,J=3.2Hz,3H),4.97(d,J=11.6Hz,3H),4.49-4.46(m,6H),4.05(s,9H),3.91-3.85(m,5H),3.77-3.62(m,11H),3.41(s,6H),3.01-2.71(m,14H),2.32-2.25(m,6H),2.11-1.78(m,48H),1.62-1.34(m,37H),1.26-1.21(m,20H)。
實施例20
化合物20-1a：
將化合物11-11(554mg，289.73μmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(112mg，869.18)、EDCI(222mg，1.16mmol)和HOBT(157mg，1.16mmol)加入混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物7-9a(170mg，289.73μmol)
加入到反應混合物中，並將混合物在室溫攪拌2小時。將反應用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到呈白色泡沫固體的化合物20-1a(640mg，89%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.86-7.76(m,4H),7.72(t,J=5.4Hz,3H),7.49-7.42(m,1H),7.38(d,J=8.6Hz,2H),7.31(t,J=7.7Hz,2H),7.27-7.19(m,5H),6.88(d,J=8.9Hz,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.2,3.4Hz,3H),4.65(t,J=5.0Hz,1H),4.50-4.41(m,5H),4.05-3.99(m,9H),3.91-3.82(m,5H),3.76-3.66(m,9H),3.49-3.36(m,6H),3.32-3.28(m,1H),3.23-3.09(m,2H),3.08-2.91(m,10H),2.84(s,2H),2.44-2.21(m,8H),2.20-1.92(m,30H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.70-1.08(m,54H)。
化合物20-1b：
將化合物11-11(1.3g，681.71μmol)溶解在DCM(20mL)中。在0℃，將DIEA(176mg，1.36mmol)、EDCI(261mg，1.36mmol)和HOBT(138mg，1.02mmol)加入混合物中。於0℃將反應攪拌30分鐘。將化合物7-9b(400mg，681.71μmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。
將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到呈白色泡沫固體的化合物20-1b(610mg，36%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.87-7.76(m,4H),7.72(t,J=5.3Hz,3H),7.46(s,1H),7.35(d,J=7.4Hz,2H),7.28(t,J=7.6Hz,2H),7.25-7.18(m,5H),6.86(d,J=8.9Hz,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.96(dd,J=11.2,3.4Hz,3H),4.62(t,J=5.0
Hz,1H),4.50-4.38(m,5H),4.07-3.98(m,9H),3.92-3.82(m,5H),3.75-3.66(m,9H),3.51-3.36(m,6H),3.29-3.23(m,2H),3.15-3.07(m,2H),3.01-2.94(m,10H),2.93-2.88(m,2H),2.87-2.78(m,2H),2.68-2.60(m,1H),2.37-2.23(m,2H),2.29-2.19(m,4H),2.13-2.08(m,10H),2.07-1.98(m,18H),1.88(s,9H),1.77(s,9H),1.71-1.58(m,6H),1.53-1.13(m,48H)。
實施例21
化合物21-1：
將化合物11-11(1.76g，920.31μmol)、HOBt(248.70mg，1.84mmol)、EDCI(529.27mg，2.76mmol)溶解在DCM(20mL)中。將混合物攪拌30分鐘，然後加入化合物8-9(540mg，920.31μmol)。將反應混合物再攪拌2小時，然後將其濃縮並藉由製備型HPLC純化，得到化合物21-1(1.2g，53%產率)。
C126H187N11O39質量計算為：2478.3；實測：1089.6[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84-7.80(m,4H),7.72(t,J=5.4Hz,3H),7.39(s,1H),7.40-7.37(m,2H),7.31(t,J=7.7Hz,2H),7.27-7.20(m,5H),6.98(d,J=8.9Hz,4H),5.22(d,J=3.4Hz,3H),4.97(dd,J=3.4,7.8Hz,3H),4.67(t,J=4.8Hz,
1H),4.48(d,J=8.5Hz,3H),4.47-4.42(m,2H),4.05-3.98(m,9H),3.92-3.83(m,5H),3.73(s,6H),3.72-3.67(m,3H),3.55-3.45(m,2H),3.44-3.35(m,5H),3.05-2.93(m,11H),2.91-2.80(m,3H),2.65-2.55(m,2H),2.38-2.20(m,9H),2.10(s,9H),2.08-2.01(m,9H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.78(s,9H),1.69-1.52(m,6H),1.47-0.98(m,48H)。
實施例22
化合物22-1：
將化合物6-10(410mg，0.71mmol)和化合物11-11(1.34g，0.71mmol)溶解在DCM(60mL)中，然後將DIEA(453.09mg，3.51mmol)、EDCI(299.57mg，1.75mmol)和HOBT(236.85mg，1.75mmol)加入到溶液中。於室溫將反應混合物攪拌2小時。將反應用飽和NaHCO3溶液(100mL)淬滅，用DCM(60mL×3)萃取，用鹽水(60mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-20% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物22-1(1.2g，69%產率)。
C126H185N11O39質量計算為：2476.28；實測：1088.2[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.85-7.81(m,3H),7.75-7.72(m,3H),7.47(s,H),7.39-7.37(m,2H),7.32-7.25(m,2H),7.24-7.19(m,5H),6.88(d,J=8.84Hz,4H),5.22(d,J=3.4Hz,2H),4.97(d,J=11.2Hz,3H),4.75(t,J=4.4Hz,1H),4.50-4.48(m,5H),4.03(s,11H),3.94-3.80(m,7H),3.77-3.66(m,9H),3.50-3.41(m,6H),3.02-3.00(m,12H),2.92-2.79(m,2H),2.43-2.30(m,2H),2.29-2.22(m,2H),2.21-2.19(m,3H),2.11-2.08(m,11H),2.05-2.02(m,8H),2.00(s,9H),1.90(s,9H),1.78(s,9H),1.62-1.23(m,48H)。
實施例23
化合物23-1：
在110℃，將N-Boc-4-哌啶酮(5g，25.09mmol)、丙二腈(2.49g，37.64mmol)、AcNH2(3.87g，50.19mmol)和AcOH(4.52g，75.28mmol)在甲苯(50mL)中的溶液攪拌2小時。LC-MS顯示完全轉化。用水(50mL)洗滌反應混合物，經Na2SO4
乾燥，濃縮並藉由矽膠管柱(0-10% EA在PE中)純化，得到呈膠狀的化合物23-1(6.18g，98%產率)。
C13H17O2質量計算為：247.1；實測：246.2[M+H]-，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.53(t,J=11.6Hz,4H),2.69(d,J=11.6Hz,4H),7.41(t,J=7.3Hz,2H),1.427(s,9H)。
化合物23-2：
將化合物23-1(7.6g，30.73mmol)在MeOH(76mL)中的溶液在0℃攪拌。將NaBH4(1.16g，30.73mmol)分批加入到攪拌的溶液中並攪拌20分鐘。將混合物在真空中濃縮。將殘餘物在乙酸乙酯(250mL)和水(150mL)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用PE/EA=1/5沖提，得到呈膠狀的化合物23-2(4.6g，60%產率)。
C13H19O2質量計算為：249.2；實測：248.3[M+H]-，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.04-4.01(m,2H),2.75(s,2H),2.31-2.27(m,1H),1.82-1.78(m,2H),1.04(s,9H),1.27-1.16(m,3H)。
化合物23-3：
在60℃，將化合物23-2(25g，100.28mmol)、3-溴丙酸第三丁酯(41.93g，200.56mmol)、t-BuOK(22.50g，200.56mmol)和KI(33.29g，200.56mmol)在DMSO中的混合物(250mL)攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將混合物在真空中濃縮。將殘餘物在乙酸乙酯(100mL×3)和水(150mL×3)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用PE/EA=10/1沖提，得到呈膠狀的化合物23-3(32.87g，87%產率)。
C20H31O4質量計算為：377.2；實測：319.4[M-Boc+MeCN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.06(d,J=11.2Hz,2H),2.75(s,2H),2.55-2.53(m,1H),2.35-2.31(m,3H),1.89(d,J=12.4Hz,2H),1.43(s,9H),1.41(s,9H),1.27-1.19(m,3H)。
化合物23-4：
將氯化鈷六水合物(40.34g，169.55mmol)添加到化合物23-3(16g，42.39mmol)在MeOH(400mL)中的溶液中，然後在-20℃，將硼氫化鈉(32.07g，847.73mmol)緩慢添加到反應混合物中，攪拌1小時。然後，將混合物在室溫攪拌1小時。將反應混合物濃縮至乾並與DMF共沸，得到粗化合物23-4，其不經進一步純化直接用於下一步。
C20H39O4質量計算為：385.5；實測：386.5[M+H]+，ESI。
化合物23-5：
在室溫，將Z-6-胺基己酸(27.53g，103.75mmol)、TEA(12.6g，124.50mmol)、HATU(46.97g，124.50mmol)在DMF(240mL)中的溶液攪拌30分鐘，添加化合物23-4(16g，41.50mmol)，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。向反應混合物中加入水(50mL)和EA(50mL)。過濾混合物，將濾液在乙酸乙酯(100mL×3)和水(150mL×3)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮。藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化殘餘物，得到呈膠狀的化合物23-5(8.3g，23%產率)。
C48H72O11N4質量計算為：879.5；實測：880.1[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.73(t,J=12.4Hz,2H),7.38-7.30(m,10H),7.23(t,J=10.8Hz,2H),5.00(s,4H),4.06-3.60(m,4H),3.00-2.97(m,8H),2.23-2.19(m,4H),1.99(s,2H),1.58-1.48(m,6H),1.42-1.38(m,25H),1.25-1.23(m,4H)。
化合物23-6：
在氫氣氣氛下，在室溫，將化合物23-5(3.8g，4.31mmol)、NH3.H2O(3.5mL)和Pd/C(760mg)在MeOH(38mL)中的混合物攪拌2小時。LC-MS顯示完全轉化。將混合物過濾，將濾液在真空中濃縮，得到粗化合物23-6，其不經進一步純化直接用於下一步。
C32H60N4O7質量計算為：611.8；實測：612.8[M+H]+，ESI。
化合物23-7：
在室溫，將化合物1-4(2.46g，5.49mmol)、TEA(757.89mg，7.49mmol)和HATU(2.35mg，6.24mmol)在DCM(15mL)中的混合物攪拌30分鐘。添加化合物23-6(1.53g，2.5mmol)，在室溫將混合物攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，然後用水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物23-7(3.14g，85%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.82(d,J=9.2Hz,2H),7.71(s,4H),5.52(d,J=0.4Hz,2H),4.99-4.95(m,2H),4.48(d,J=8.8Hz,2H),4.03(s,8H),3.95-3.84(m,2H),3.72-3.70(m,2H),3.44-3.38(m,2H),3.01-2.99(m,8H),2.23-2.19(m,2H),2.11-2.07(m,10H),2.05-2.00(m,10H),1.90(s,6H),1.78(s,6H),1.58-1.49(m,14H),1.39-1.38(m,25H),1.24-1.23(m,8H)。
化合物23-8：
將化合物23-7(3.0g，2.04mmol)和TFA(12mL)在DCM(30mL)中的溶液在室溫攪拌4小時。LC-MS顯示完全轉化。將溶液在真空中濃縮，然後加入TEA進行鹼化。化合物23-8不經進一步純化即直接用於下一步。
C61H99O24N7質量計算為：1313.4；實測：1314.4[M+H]+，ESI。
化合物23-9：
在室溫，將化合物1-7(2.68g，2.04mmol)、TEA(412.62.89mg，4.08mmol)和HATU(769.19mg，2.04mmol)在DCM(30mL)中的溶液攪拌4小時。然後，將溶液加入到化合物23-8(2.68g，2.04mmol)中，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物23-9(1.76g，47%產率)。
C86H137O35N9質量計算為：1857.0；實測：929.0[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.94(d,J=9.2Hz,2H),7.88-7.79(m,6H),5.21(d,J=3.2Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.51-4.48(m,4H),4.05-4.00(m,9H),3.92-3.84(m,4H),3.73-3.37(m,3H),2.99(s,10H),2.81(t,J=23.2Hz,1H),2.48-2.44(m,2H),2.34-2.16(m,6H),2.11-2.09(m,13H),2.05-2.00(m,16H),1.89(s,9H),1.78(s,9H),1.49-1.35(m,31H),1.24-1.23(m,6H)。
化合物23-10：
在0℃，將化合物23-9(1.76g，0.94mmol)、DIEA(367.47mg，2.84mmol)、HOBT(256.12mg，1.90mmol)和EDCI(363.37mg，1.90mmol)在DCM(20mL)中的混合物攪拌1小時，然後加入化合物11-2(542.80mg，0.94mmol)。將混合物在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合
物，用NaHCO3(飽和水溶液，50mL)和水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物23-10(1.07g，47%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,3H),7.76-7.65(m,6H),7.40-7.30(m,4H),7.26-7.22(m,5H),6.92-6.89(m,4H),5.22(d,J=0.8Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.65(d,J=10.4Hz,1H),4.49(d,J=8.4Hz,4H),4.03-3.98(m,10H),3.91-3.89(m,4H),3.74-3.67(m,11H),3.51(s,1H),3.41-3.39(m,5H),3.01-2.92(m,14H),2.27-2.25(m,14H),2.05-2.02(m,7H),2.00-1.94(m,12H),1.78(s,9H),1.49-1.37(m,33H),1.24-1.22(m,11H)。
實施例24
化合物24-1：
將4-吡啶基乙腈(5g，42.32mmol)、N-Cbz-4-碘哌啶(21.91g，63.49mmol)和KOH(4.75g，84.64mmol)溶解在DMF(50mL)中。將反應混合物在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將殘餘物在乙酸乙酯(100mL×2)和水(80mL×3)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。
殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=20/1沖提，得到呈淺棕色油狀的化合物24-1(11.3g，80%產率)。
C20H21N3O2質量計算為：335.4；實測：336.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.62-8.61(m,2H),7.40-7.31(m,7H),5.06(s,2H),4.35(d,J=7.2Hz,1H),4.34-4.00(m,2H),2.75(s,2H),2.12-2.06(m,1H),1.64-1.53(m,2H),1.24-1.14(m,2H)。
化合物24-2：
在N2氣氛下，在0℃，將KI(2.97g，17.89mmol)和NaH(858.6mg，35.78mmol)在無水THF(10mL)中的溶液冷卻10分鐘。添加化合物24-1(3g，8.94mmol)在無水THF(15mL)中的溶液。然後，將混合物攪拌30分鐘。然後，加入N-(氯甲基)胺基甲酸苄酯(2.14g，10.73mmol)在無水THF(5mL)中的溶液，在N2氣氛下在室溫攪拌過夜。將混合物用水淬滅，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。將合併的有機層用鹽水(60mL)洗滌，經無水MgSO4乾燥，在真空中濃縮。將殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用二氯甲烷/甲醇4：1沖提，得到呈黃色油狀的化合物24-2(1.8g，40%產率)。
C29H30N4O4質量計算為：498.2；實測：499.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 8.61(d,J=5.2Hz,2H),7.52-7.57(m,1H),7.44-7.22(m,12H),5.06(s,2H),5.03-4.91(m,2H),4.14(d,J=13.6Hz,1H),3.97-3.89(m,2H),3.73-3.68(m,1H),2.89-2.68(m,2H),2.39-2.34(t,J=11.6Hz,1H),2.07(d,J=11.8Hz,2H),1.31-1.21(m,1H),1.18-1.12(m,1H),1.04-0.94(m,1H)。
化合物24-3：
在N2氣氛下，將CoCl2.6H2O(2.97g，17.89mmol)和化合物24-2(5g，10.03mmol)在無水MeOH(50mL)中的溶液在-50℃冷卻20分鐘。在-50℃，逐滴加入LiBH4(50mmol，2M，25mL)在THF中的溶液，攪拌3小時，然後在-50℃逐滴加入無水MeOH(50mL)。使混合物升至室溫，在N2氣氛下攪拌過夜。將混合物在真空中濃縮。將殘餘物在二氯甲烷(250mL)和水(150mL)之間分配，將二氯甲烷萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。將殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=15/1沖提，得到呈淡黃色固體的化合物24-3(1.8g，40%產率)。
C29H34N4O4質量計算為：502.2；實測：503.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.48(d,J=5.2Hz,2H),7.50-7.47(m,1H),7.37-7.25(m,12H),5.02(s,2H),4.99(s,2H),3.96(d,J=12.4Hz,2H),3.69-3.58(m,2H),3.16(d,J=14Hz,1H),2.94(d,J=13.2Hz,1H),2.63(s,2H),1.93(s,2H),1.77-1.68(m,2H),1.26(d,J=8.8Hz,1H),0.86-0.77(m,2H)。
化合物24-4：
化合物24-3(2.1g，4.18mmol)、5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(943.7mg，5.01mmol)、HATU(3.15g，8.36mmol)和Et3N(1.27g，12.53mmol)溶於DCM(20mL)。將反應混合物於室溫攪拌2小時。然後，將反應混合物用CH2Cl2(50mL)稀釋。將有機層用水(50mL×2)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。將殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=20/1沖提，得到呈淡黃色固體的化合物24-4(2.23g，81%產率)。
C38H48N4O7質量計算為：672.3；實測：673.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.48(d,J=5.2Hz,2H),7.83-7.79(m,1H),7.36-7.21(m,13H),5.01(s,2H),4.98(s,2H),3.96(d,J=12.4Hz,2H),3.65-3.52(m,4H),2.68-2.62(m,2H),2.12-2.09(m,4H),1.77-1.69(m,5H),1.35(s,9H),0.76-0.64(m,2H)。
化合物24-5：
在H2氣氛下，在室溫，將PtO2(1.21g，5.36mmol)和化合物24-4(1.8g，2.67mmol)在HOAc(10mL)中的溶液攪拌過夜。然後，將混合物過濾，將溶劑在真空中蒸發，得到粗產物24-5，其直接用於下一步。
C22H42N4O3質量計算為：410.3；實測：411.3[M+H]+，ESI。
化合物24-6：
將化合物1-7(4.76g，8.52mmol)、TEA(1.48g，14.6mmol)、HATU(2.94g，7.8mmol)在DCM(15mL)中的混合物在室溫攪拌30分鐘，然後加入化合物24-5(1g，2.44mmol)，在室溫攪拌2小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用另外的DCM(20mL)稀釋，用水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到呈白色固體的化合物24-6(1g，20%產率)。
C97H156N10O36質量計算為：2037.07；實測：1019.1[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.80(d,J=9.2Hz,3H),7.73-7.63(m,6H),5.22(d,J=3.2Hz,3H),4.97(dd,J=11.2,3.2Hz,3H),4.50-4.47(m,5H),4.08-4.01(m,9H),3.91-3.86(m,5H),3.84-3.70(m,3H),3.43-3.40(m,3H),3.07-3.05(m,3H),2.81(d,J=9.2Hz,2H),2.68-2.67(m,1H),2.34-2.23(m,12H),2.18(s,9H),2.16-2.11(m,5H),2.03(s,9H),1.90(s,9H),1.78(s,9H),1.72-1.67(m,14H),1.54-1.48(m,18H),1.43-1.37(m,13H),1.28-1.18(m,12H)。
化合物24-7：
將化合物24-6(1.0g，0.49mmol)和TFA(12mL)在DCM(30mL)中的溶液在室溫中攪拌4小時。LC-MS顯示完全轉化。將溶液在真空中濃縮，然後加入TEA進行鹼化。粗化合物24-7不經進一步純化直接用於下一步。
C93H148N10O36質量計算為：1981.0；實測：991.4[M+2H]2+，ESI。
化合物24-8：
在室溫，將化合物24-7(400mg，0.21mmol)、TEA(61.26mg，0.61mmol)、HATU(252.26mg，0.40mmol)在DCM(5mL)中的混合物攪拌1小時，然後添加化合物11-2(115.16mg，0.20mmol)，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物用另外的DCM(5mL)稀釋，用水(20mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到呈白色固體的化合物24-8(200mg，39%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,3H),7.76-7.66(m,5H),7.40-7.30(m,4H),7.26-7.22(m,5H),6.92-6.88(m,4H),5.22(d,J=3.2Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.66(t,J=5.6Hz,1H),4.48(d,J=8.4Hz,4H),4.43-4.42(m,1H),4.05-3.97(m,9H),3.91-3.86(m,5H),3.74-3.62(m,11H),3.51(s,1H),3.43-3.38(m,5H),3.06-2.92(m,13H),2.86-2.82(m,2H),2.34-2.22(m,6H),2.11(s,9H),2.08-2.06(m,3H),2.05-2.02(m,8H),2.00(s,9H),1.96-1.94(m,3H),1.89(s,9H),1.85-1.82(m,3H),1.78(s,9H),1.72-1.62(m,5H),1.52-1.42(m,18H),1.39-1.33(m,8H),1.28-1.22(m,9H),0.95(t,J=8.4Hz,1H)。
實施例25
化合物25-1：
在室溫，將N-Boc-哌啶-4-甲醛(50g，234.44mmol)、丙二腈(18.59g，281.33mmol)和二異丙胺(11.86g，117.21mmol)在H2O(200mL)和EtOH(800mL)中的溶液攪拌2小時。LC-MS顯示完全轉化。用水(50mL)洗滌反應混合物，經Na2SO4乾燥，濃縮並藉由矽膠管柱(0-50% EA在PE中)純化，得到化合物25-1(30.00g，46%產率)。
C14H19N3O2質量計算為：261.1；實測：260.2[M+H]-，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84(d,J=10.2Hz,1H),3.97-3.89(m,2H),2.94-2.72(m,3H),1.69-1.59(m,2H),1.45-1.34(m,13H)。
化合物25-2：
在-5℃，將化合物25-1(30g，114.80mmol)在MeOH(450mL)中的溶液攪拌。將NaBH4(4.34g，114.80mmol)分批加入到溶液中，攪拌3小時。將混合物在真空中濃縮。將殘餘物在乙酸乙酯(250mL)和水(150mL)之間分配，將乙酸乙酯萃
取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用PE/EA=3/1沖提，得到化合物25-2(19.4g，64%產率)。
C14H21N3O2質量計算為：263.2；實測：262.3[M+H]-，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 4.87(t,J=7.6Hz,1H),3.95-3.87(m,2H),2.82-2.61(m,2H),1.98(t,J=7.2Hz,2H),1.70-1.56(m,3H),1.42-1.35(m,9H),1.11-0.98(m,2H)。
化合物25-3：
在室溫，將化合物25-2(15g，56.96mmol)、3-溴丙酸第三丁酯(17.86g，85.44mmol)、t-BuOK(8.31g，74.05mmol)和KI(9.46g，56.96mmol)在DMSO中的混合物(250mL)攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。將混合物在乙酸乙酯(100mL×3)和水(150mL×3)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。殘餘物藉由管柱層析色譜法純化，用PE/EA=7/1沖提，得到化合物25-3(17.4g，94%產率)。
C21H33N3O4質量計算為：391.2；實測：333.3[M-Boc+MeCN+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 3.96-3.87(m,2H),2.76(s,2H),2.55-2.50(m,2H),2.36-2.31(m,2H),2.05(d,J=6.2Hz,2H),1.85-1.74(m,3H),1.42(s,9H),1.39(s,9H),1.21-1.08(m,2H)。
化合物25-4：
將氯化鈷六水合物(29.17g，122.60mmol)添加到化合物25-3(12g，30.65mmol)在MeOH(350mL)中的溶液中，然後在-20℃，將硼氫化鈉(23.19g，613.02mmol)緩慢添加到反應混合物中，攪拌1小時。然後，將混合物在室溫攪拌1小
時。濃縮反應混合物，用DMF共沸乾燥。粗化合物25-4不經進一步純化直接用於下一步。
C21H41N3O4質量計算為：399.3；實測：400.4[M+H]+，ESI。
化合物25-5：
在室溫，將Z-6-胺基己酸(17.52g，66.04mmol)、TEA(9.10g，90.05mmol)和HATU(28.31g，75.04mmol)在DMF(240mL)中的溶液攪拌30分鐘，添加化合物25-4(12g，30.03mmol)，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。向反應混合物中加入水(50mL)和EA(50mL)。過濾混合物，將濾液在乙酸乙酯(100mL×3)和水(150mL×3)之間分配，將乙酸乙酯萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮。藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化殘餘物，得到化合物25-5(4.08g，14%產率)。
C49H75N5O10質量計算為：893.6；實測：894.7[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.68(t,J=6.1Hz,2H),7.38-7.27(m,10H),7.22(t,J=5.5Hz,2H),4.99(s,4H),3.89-3.79(m,2H),3.00-2.93(m,4H),2.92-2.85(m,3H),2.73-2.56(m,2H),2.23-2.16(m,2H),2.13-2.06(m,4H),1.61-1.42(m,9H),1.42-1.34(m,24H),1.28-1.18(m,4H),1.05-0.99(m,2H)。
化合物25-6：
在室溫，在氫氣氣氛下，將化合物25-5(3.0g，3.36mmol)、NH3.H2O(15mL)和Pd/C(1.20g)在MeOH(60mL)中的混合物攪拌4小時。LC-MS顯示完全轉化。過濾混合物，將濾液在真空中濃縮。粗化合物25-6不經進一步純化直接用於下一步。
C33H63N5O6質量計算為：625.5；實測：626.5[M+H]+，ESI。
化合物25-7：
將化合物1-4(3.30g，7.38mmol)、TEA(1.02g，10.07mmol)和HATU(3.04g，8.05mmol)在DCM(15mL)中的混合物在室溫攪拌30分鐘。添加化合物25-6(2.10g，3.36mmol)，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物25-7(3.14g，86%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.82(d,J=9.3Hz,2H),7.74-7.65(m,4H),5.21(d,J=3.4Hz,2H),4.99-4.93(m,2H),4.48(d,J=8.5Hz,2H),4.05-3.98(m,6H),3.91-3.80(m,4H),3.74-3.67(m,2H),3.44-3.36(m,2H),3.03-2.95(m,4H),2.91-2.86(m,3H),2.73-2.60(m,2H),2.24-2.17(m,2H),2.13-2.07(m,10H),2.05-1.98(m,10H),1.89(s,6H),1.71(s,6H),1.61-1.32(m,41H),1.27-1.19(m,4H),1.04-0.99(m,2H)。
化合物25-8：
在室溫，將化合物25-7(1.0g,673.53μmol)和TFA(10mL)在DCM(20mL)中的溶液攪拌4小時。LC-MS顯示完全轉化。將溶液在真空中濃縮，然後加入TEA進行鹼化。粗化合物25-8不經進一步純化直接用於下一步。
C62H101N7O24質量計算為：1327.7；實測：665.0[M+2H]2+，ESI。
化合物25-9：
將化合物1-7(1.43g，2.56mmol)、TEA(777mg，7.68mmol)和HATU(1.06g，2.82mmol)在DCM(30mL)中的混合物在室溫攪拌30分鐘。然後，將溶液加入到化合物22-8(3.4g，2.56mmol)中，在室溫攪拌過夜。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用水(50mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物25-9(2.5g，49%產率)。
C87H139N9O35質量計算為：1869.9；實測：936.3[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.96-7.90(m,2H),7.87-7.75(m,5H),7.71(s,1H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.99-4.94(m,3H),4.52-4.47(m,3H),4.32-4.25(m,1H),4.05-3.98(m,9H),3.92-3.82(m,3H),3.80-3.67(m,5H),3.52-3.42(m,4H),3.03-2.91(m,10H),2.89-2.80(m,2H),2.24(t,J=7.5Hz,2H),2.20-2.13(m,2H),2.13-2.07(m,13H),2.05-1.96(m,15H),1.89(s,9H),1.77(s,9H),1.68-1.55(m,4H),1.54-1.32(m,26H),1.28-1.18(m,6H),1.04-0.98(m,2H)。
化合物25-10：
將化合物25-9(750mg，400.84μmol)、DIEA(155mg，1.20mmol)、HOBT(217.12mg，1.60mmol)和EDCI(307.36mg，1.o6mmmol)在DCM(20mL)中的混合物攪拌30分鐘，加入化合物11-2(229.57mg，400.84μmol)，在室溫中攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用NaHCO3(飽和水溶液，30mL)和水(30mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物25-10(500mg，51%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83(d,J=9.2Hz,3H),7.75-7.65(m,6H),7.41-7.34(m,2H),7.31(t,J=7.1Hz,2H),7.27-7.18(m,5H),6.93-6.84(m,4H),5.22(d,J=3.0Hz,3H),5.00-4.90(m,3H),4.71-4.56(m,1H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.28(d,J=10.7Hz,1H),4.11-3.93(m,10H),3.92-3.82(m,3H),3.77-3.63(m,12H),3.51(s,1H),3.45-3.36(m,6H),3.05-2.79(m,15H),2.28-2.19(m,2H),2.12-2.08(m,12H),2.06-1.98(m,17H),1.96-1.92(m,3H),1.89(s,9H),1.85-1.80(m,2H),1.77(s,9H),1.60-1.00(m,47H)。
實施例26
化合物26-1：
將5-(苄氧基)-5-側氧基戊酸(0.3g，1.35mmol)、化合物11-2(773.14mg，1.35mmol)、DIEA(523.40mg，4.05mmol)、EDC(517.56mg，2.70mmol)、HOBT(364.81mg，2.70mmol)在DCM(20mL)中的混合物在室溫攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用NaHCO3(飽和水溶液，150mL)和水(150mL)洗滌，濃縮並藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=20：1沖提，得到化合物26-1(480mg，45%產率)。
C47H56N2O8質量計算為：776.4；實測：799.3[M+Na]+，ESI。
化合物26-2：
在室溫，在H2下，將化合物26-1(0.48g，0.629mmol)和Pd/C(48mg)在MeOH(20mL)中的混合物攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。將反應混合物濃
縮並藉由管柱層析色譜法純化，用DCM/MeOH=10：1沖提，得到化合物26-2(280mg，65%產率)。
C47H56N2O8質量計算為：686.3；實測：725.3[M+K]+，ESI
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.79-7.75(m,1H),7.40-7.35(m,2H),7.34-7.30(m,2H),7.27-7.20(m,5H),6.92-6.89(m,4H),3.98(s,1H),3.68(d,J=6.4Hz,2H),3.51(s,1H),3.40-3.38(m,2H),3.00(t,J=6.4Hz,2H),2.93-2.92(m,2H),2.19(t,J=7.4Hz,2H),2.09-2.05(m,2H),2.03-1.88(m,4H),1.85-1.80(m,2H),1.71-1.68(m,2H),1.42-1.33(m,4H),1.24-1.18(m,4H)。
化合物26-3：
在室溫，在H2下，將化合物26-2(3.1g，6.17mmol)和Pd/C(2.97g)在無水MeOH(40mL)中的混合物攪拌過夜。過濾混合物，在減壓下濃縮濾液得到呈白色固體的粗化合物26-3(1.4g，97%產率)，無需純化即可使用。
化合物26-4：
在室溫，在N2氣氛下，將化合物26-3(1.50g，6.40mm01)、化合物1-7(11.12g，19.84mmol)、EDCI(7.34g，38.41mmol)、HOBT(5.19g，38.41mmol)、DIEA(7.45g，57.61mmol)在無水DCM(50mL)中的混合物攪拌3小時。將混合物在真空中濃縮，然後用二氯甲烷(100mL×3)萃取並用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥並在真空中濃縮。藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體的化合物26-4(6g，50%產率)。
C88H136N10O33質量計算為：1860.9；實測：931.5[M+2H]2+，ESI。
化合物26-5：
在H2下，將化合物26-4(1.01g，0.53mmol)和PtO2(0.243g，1.07mmol)在AcOH(20mL)中的混合物攪拌過夜。將反應混合物過濾並在真空中濃縮。然後藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化殘餘物，得到呈白色固體的化合物26-5(640mg，64%產率)。
C88H142N10O33質量計算為：1867.0；實測：934.5[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.86-7.84(m,3H),7.75-7.73(m,3H),7.68-7.61(m,2H),5.22(d,J=3.3Hz,3H),4.97(q,J=3.3Hz,3H),4.50-4.43(m,4H),4.03(s,9H),3.91-3.84(m,4H),3.75-3.70(m,3H),3.43-3.38(m,11H),3.06-2.99(m,12H),2.83-2.77(m,1H),2.46-2.42(m,2H),2.27-2.23(m,4H),2.11-2.09(m,13H),2.07-2.00(m,16H),1.90(s,9H),1.78(s,9H),1.68-1.62(m,5H),1.49-1.46(m,22H),1.39-1.36(m,9H),1.25-1.20(m,9H)。
化合物26-6：
在室溫，將化合物26-5(0.543g，0.29mmol)、化合物26-2(200mg，2.12mmol)、DIEA(112mg，0.87mmol)、EDC(111mg，0.58mmol)和HOBT(80mg，0.58mmol)在DCM(20mL)中的混合物攪拌3小時。LC-MS顯示完全轉化。藉由添加DCM(20mL)稀釋反應混合物，用NaHCO3(飽和水溶液，150mL)和水(150mL)洗滌，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到化合物26-6(0.15g，20%產率)。
C121H179O39N11質量計算為：3411.7；實測：1117.2[M-DMTr+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84(d,J=9.3Hz,3H),7.78-7.72(m,5H),7.65(s,2H),7.40-7.37(m,2H),7.32(t,J=7.1Hz,2H),7.26-7.20(m,6H),6.92-6.89(m,4H),5.22(d,J=3.4Hz,2H),4.98-4.95(m,2H),4.65(t,J=5.0Hz,1H),4.48(d,J=
8.4Hz,2H),4.45-4.42(m,2H),4.05-4.03(m,9H),3.98(s,2H),3.91-3.84(m,5H),3.74(s,7H),3.71-3.67(m,5H),3.51(s,1H),3.43-3.39(m,6H),3.07-2.97(m,13H),2.92(s,2H),2.81-2.78(m,2H),2.34-2.22(m,8H),2.13-2.07(m,16H),2.05-1.96(m,20H),1.89(s,11H),1.79-1.77(m,10H),1.70-1.62(m,7H),1.47-1.41(m,23H),1.40-1.35(m,14H),1.24-1.22(m,14H)。
實施例27
化合物27-1：
在室溫，將化合物11-6(15g，45.81mmol)、Boc-8-胺基辛酸(13.07g，50.39mmol)、Et3N(6.95g，68.72mmol)和HATU(19.01g，50.39mmol)的混合物攪拌1小時。將矽藻土(15g)、水(300mL)和EA(400mL)添加到混合物中。攪拌30分鐘後過濾反應。濾液用EA(400mL)萃取。用水(500mL×2)和鹽水(300mL)洗滌有機相。經Na2SO4乾燥，在真空下濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在矽膠上純化，得到化合物27-1(15g，57%產率)。
C32H48N4O5質量計算為：568.3；實測：569.4[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.49-8.48(m,4H),7.46-6.77(m,6H),3.89(t,J=6.4Hz,2H),2.91-2.86(m,2H),2.33-2.29(m,2H),1.98-1.92(m,4H),1.38(s,22H),1.32-1.24(m,6H)。
化合物27-2：
向化合物27-1(14.5g，25.49mmol)在AcOH(120mL)中的溶液添加PtO 2(8g，35.23mmol)。將反應在0.4MPa的氫氣氛下攪拌88小時，然後，倒出反應混合物的澄清液體，在真空中濃縮。用飽和NaHCO3將其pH調節至7-8。將水相在真空中濃縮。將THF(300mL)加入到殘餘物中並攪拌30分鐘。將混合物過濾，在真空中濃縮以得到粗化合物27-2(15.32g)。C32H60N4O5質量計算為：580.5；實測：581.6[M+H]+，ESI。
化合物27-3：
將Boc-6-胺基己酸(12.80g，55.38mmol)、HATU(23.87g，63.29mmol)和TEA(8.0g，79.11mmol)在DCM(60mL)中的混合物在室溫攪拌1小時。將化合物27-2(15.32g，26.37mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加到反應混合物中，在室溫攪拌1.5小時。將反應用水(200mL)淬滅，用DCM(200mL×3)萃取。將合併的有機相用鹽水(200mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，過濾，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在矽膠上純化，得到化合物27-3(23g，75%產率)。
C54H98N6O11質量計算為：1006.7；實測：907.7[M+H-Boc]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.44-6.76(m,4H),4.46(d,J=11.6Hz,2H),3.89(d,J=12.0Hz,2H),3.06-2.86(m,10H),2.40-2.23(m,12H),1.70-1.16(m,68H)。
化合物27-4：
將化合物27-3(10g，9.93mmol)溶解在DCM(54mL)中，然後將TFA(59mL)添加到混合物中。在30℃將反應攪拌3小時。將反應在真空中濃縮，不經進一步純化得到化合物27-4(6.64g)。
C35H66N6O5質量計算為：650.5；實測：651.6[M+H]+，ESI。
化合物27-5：
將化合物1-4(13.32g，29.77mmol)、HATU(13.10g，34.73mmol)和TEA(5.02g，49.62mmol，6.92mL)在DCM(50mL)中的混合物在室溫攪拌2小時。將化合物27-4加入到混合物中。將反應在室溫再攪拌4小時。將反應在真空中濃縮，藉由製備型HPLC純化得到化合物27-5(13g，67%產率)。
C92H147N9O35質量計算為：1938.0；實測：970.1[M+2H]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 12.01(s,1H),7.86-7.50(m,7H),5.22-4.96(m,6H),4.50-4.48(m,4H),4.03-3.69(m,17H),3.41-3.32(m,6H),3.01-2.60(m,8H),2.46-2.21(m,4H),2.15-1.78(m,42H),1.68-1.23(m,46H),0.95(t,J=7.6Hz,6H)。
.化合物27-6：
化合物27-5(2.75g，1.42mmol)、DIEA(383.61mg，2.97mmol，517.00μL)、EDCI(426.76mg，2.23mmol)和HOBT(200.53mg，1.48mmol)在DCM(30mL)中的混合物在室溫攪拌30分鐘。將化合物11-2(0.85g，1.48mmol)加入到反應混合物中。將反應於室溫攪拌2小時。將反應用水(50mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取。將合併的有機相在真空中濃縮並藉由製備純化。HPLC得到化合物27-6(1.2g，32%產率)。
C127H189O39N11質量計算為：2493.9；實測：1270.0[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.84-7.72(m,7H),7.44-7.23(m,10H),6.92-6.88(m,4H),5.22(d,J=3.6Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.66-4.45(m,6H),4.03-3.69(m,26H),3.41-3.36(m,6H),3.01-2.86(m,14H),2.46-2.21(m,6H),2.15-1.78(m,52H),1.68-1.23(m,52H)。
實施例28
化合物28-1：
將8-(Fmoc-胺基)辛酸(1.27g，3.59mmol)、TEA(495.41mg，4.90mmol)和HATU(1.35g，3.59mmol)在DCM(15mL)中的混合物攪拌20分鐘，然後，將化合物2-10(1.5g，3.26mmol)加入到反應混合物中，並繼續攪拌4小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，將DCM萃取物用鹽水(100mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(DCM/MeOH=0-6%)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物28-1(600mg，23%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.87(d,J=7.6Hz,2H),7.68(d,J=7.4Hz,2H),7.44-7.35(m,4H),7.34-7.28(m,4H),7.27-7.17(m,6H),6.89(d,J=7.6Hz,4H),4.64(td,J=5.0,1.6Hz,1H),4.28(d,J=6.9Hz,2H),4.20(t,J=6.8Hz,1H),3.96(s,1H),3.73(d,J=3.8Hz,6H),3.67(d,J=10.4Hz,2H),3.50(s,1H),3.39(t,J=5.9Hz,2H),2.96(t,J=6.6Hz,2H),2.91(s,2H),2.06-1.74(m,6H),1.47-1.31(m,4H),1.26-1.13(m,6H)。
化合物28-2：
將哌啶(0.4mL)添加到化合物28-1(600mg，0.75mmol)在MeOH(4mL)中的溶液中。攪拌過夜後，將混合物在真空中濃縮，得到呈白色固體的粗化合物28-2(600mg)，無需進一步純化即可使用。
C35H44N2O5質量計算為：600.4；實測：601.4[M+H]+，ESI。
化合物28-3：
將化合物11-11(1.75g，915.47μmol)溶解在DCM(30mL)中。在0℃，將DIEA(355mg，2.75mmol)、EDCI(351mg，1.83mmol)和HOBT(247mg，1.83mmol)加入混合物中。將反應於0℃攪拌30分鐘。將化合物28-2(550mg，915.47μmol)加入到反應混合物中。將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混合物用飽和NaHCO3溶液(40mL)淬滅，用DCM(30mL×2)萃取，用鹽水(30mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，濃縮並藉由製備型HPLC(C18管柱，ACN/水)純化，得到呈白色泡沫固體的化合物28-3(1.1g，48%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.86-7.76(m,4H),7.73(t,J=5.4Hz,3H),7.46(s,1H),7.40-7.35(m,2H),7.31(t,J=7.6Hz,2H),7.27-7.18(m,5H),6.93-6.85(m,4H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.95(dd,J=11.2,3.4Hz,3H),4.65(t,J=5.1Hz,1H),4.50-
4.40(m,5H),4.10-3.94(m,10H),3.93-3.80(m,5H),3.70-3.64(m,11H),3.50(s,1H),3.45-3.36(m,5H),3.08-3.75(m,14H),2.39-2.20(m,6H),2.15-1.92(m,31H),1.92-1.73(m,21H),1.67-1.13(m,52H)。
實施例29
化合物29-1：
化合物27-5(2.74g，1.41mmol)、DIEA(365.70mg，2.83mmol，492.86μL)、EDCI(406.83mg，2.12mmol)和HOBT(191.17mg，1.41mmol)在DCM(30mL)中的混合物在室溫中攪拌30分鐘。將化合物28-2(0.85g，1.41mmol)加入到混合物中。將反應在室溫繼續攪拌2小時。將反應用水(50mL)淬滅，用DCM(50mL×2)萃取。將合併的有機相在真空中濃縮並藉由製備HPLC純化，得到化合物29-1(1.1g，29%產率)。
C129H193O39N11質量計算為：2520.4；實測：1284.0[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.84-7.72(m,7H),7.44-7.23(m,10H),6.92-6.88(m,4H),5.22(d,J=3.6Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.66-4.45(m,6H),4.03-3.69(m,26H),3.41-3.36(m,6H),3.01-2.86(m,14H),2.46-2.21(m,6H),2.15-1.78(m,52H),1.68-1.23(m,56H)。
實施例30
化合物30-1：
將苄胺(25g，233.31mmol)、聚甲醛(42.03g，1.40mol)和K2CO3(32.24g，233.31mmol)在MeOH(30mL)中的混合物在室溫中攪拌過夜。
過濾反應混合物，在真空中濃縮。向殘餘物中加入PE：EA=1：1(100mL)，然後將混合物過濾並在真空中濃縮得到呈無色油狀的粗化合物30-1(45.56g)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.33-7.27(m，5H)，4.27(s，4H)，4.04(s，2H)，3.30(s，6H)。
化合物30-2：
在40℃，攪拌下，混合滴加在滴液漏斗中的3-((苄氧基)甲基)環丁酮(23.38g，122.92mmol)、化合物30-1(24g，122.92mmol)在MeCN(200mL)中的溶液，和在另一個滴液漏斗中的氯三甲基矽烷(26.70g，245.84mmol)在MeCN(200mL)中的溶液，到乙腈(200mL)中，持續3小時。將反應在20℃攪拌過夜。藉由飽和NaHCO3將pH調節至7-8，在真空下除去ACN。水層用EA(200mL×3)萃取。在真空中濃縮合併的有機相。將殘餘物藉由C18反相管柱和快速管柱層析色譜法純化得到30-2(1.5g，4%產率)。
C21H23O2N為質量計算為：321.2；實測：322.1[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.35-7.24(m,10H),4.48(s,2H),3.61(s,2H),3.40(d,J=6.8Hz,2H),3.33-3.08(m,4H),2.88(d,J=2.0Hz,2H),2.24(t,J=6.8Hz,1H)。
化合物30-3：
將甲氧基甲基(三苯基)氯化磷(2.88g，8.40mmol)溶解在THF(30mL)中。在0℃，將KOtBu(1.05g，9.33mmol)添加到混合物中。將反應混合物在0℃再攪拌30分鐘。將化合物30-2(1.5g，4.67mmol)加入到混合物中。將混合物升至室溫，
在室溫攪拌過夜。用飽和檸檬酸淬滅反應混合物，將PH調節至6-7。將反應混合物用EA(50mL×3)萃取，用鹽水(20mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(10-30% MeOH在DCM中)在矽膠上純化，得到呈油狀的化合物30-3(1.5g，92%產率)。
C23H27O2N質量計算為：349.20；實測：350.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.37-7.26(m,10H),6.02(s,1H),4.47(s,2H),3.85(s,2H),3.54(d,J=7.6Hz,2H),3.46(s,3H),3.13-3.09(m,4H),2.88(d,J=2Hz,2H),2.24(t,J=6.8Hz,1H)。
化合物30-4：
將2,2,2-三氯乙酸(883.64mg，5.41mmol)在水(15mL)中的溶液添加至化合物30-3(1.5g，4.29mmol)在ACN(45mL)中的溶液中。將反應在室溫攪拌過夜。用飽和NaHCO3淬滅反應，將pH調節至7-8。將反應混合物用EA(20mL×3)萃取，用鹽水(10mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(10-30% EA在PE中)在矽膠上純化，得到呈油狀的化合物30-4(600mg，42%產率)。
C22H25O2N質量計算為：335.25；實測：336.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.90(s,1H),7.37-7.26(m,10H),4.41(s,2H),3.85(s,2H),3.44(d,J=7.6Hz,2H),3.03-2.89(m,4H),2.86(d,J=4Hz,1H),2.69(s,2H),2.04(t,J=6.8Hz,1H)。
化合物30-5：
將化合物30-4(600mg，1.79mmol)溶解在MeOH(18mL)中，然後分幾份緩慢加入NaBH4(148.88mg，3.94mmol)。將反應在室溫攪拌1小時。將反應用水
淬滅。用飽和檸檬酸將PH調至6-7。在真空下濃縮反應以除去MeOH。將殘餘物用DCM(20mL×3)萃取，用鹽水(10mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮得到化合物30-5(600mg)。
C22H27NO2質量計算為：337.15；實測：338.2[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.37-7.26(m,10H),4.47(s,2H),3.90(s,2H),3.69(d,J=7.6Hz,2H),3.62-3.59(m,4H),3.11(d,J=10.8Hz,2H),2.61-2.56(m,2H),2.19-2.04(m,2H)。
化合物30-6：
在0.4MPa H2下，將化合物30-5(200mg，592.67μmol)、Pd/C(100.00mg，823.38μmol)在MeOH(6mL)中的混合物攪拌88小時。將混合物過濾並在真空中濃縮，藉由製備純化。HPLC得到化合物30-6(70mg，46%產率)。
C13H23NO2質量計算為：257.2；實測：158.2[M-Boc+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.96(d,J=8.0Hz,4H),3.70-3.68(m,4H),3.25-3.17(m,4H),2.36-2.30(m,2H),2.00-1.95(m,2H),1.49(s,9H)。
化合物30-7：
將化合物30-6(1g，3.89mmol)溶解在HCl/1,4-二噁烷(4M，10mL)中。將反應混合物於室溫攪拌3小時。將反應混合物在真空中濃縮，得到粗產物30-7(610mg)，其無需進一步純化即可用於下一步。
C8H15NO2質量計算為：157.2；實測：158.1[M+H]+，ESI。
化合物30-8：
在0℃，將DIEA(1.25g，9.70mmol，1.69mL)、HOBT(629.15mg，4.66mmol)、EDCI(892.59mg，4.66mmol)、Fmoc-6-胺基己酸(1.37g，3.88mmol)在
DCM(30mL)中的混合物攪拌30分鐘。將化合物30-7(610mg，3.88mmol)加入到反應混合物中，在室溫攪拌過夜。用水淬滅反應，用10%檸檬酸(10mL)和飽和NaHCO3溶液(10mL)和鹽水(10mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在矽膠上純化，得到化合物30-8(1.55g，81%產率)。
C29H36N2O5質量計算為：492.3；實測：493.3[M+H]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.68(m,4H),7.44-7.25(m,5H),4.56(t,J=5.2Hz,2H),4.31-4.20(m,3H),3.70-3.67(m,4H),3.55(s,2H),3.31(s,4H),2.99-2.95(m,2H),2.29-2.21(m,2H),1.71(t,J=6.0Hz,2H),1.53-1.24(m,6H)。
化合物30-9：
將化合物30-8(1.55g，3.15mmol)、DMAP(38.44mg，314.65μmol)、DIEA(610.00mg，4.72mmol，822.10μL)溶解在DCM(50mL)中。在0℃，將DMTrCl(1.17g，3.46mmol)分批添加到反應混合物中。將反應在室溫攪拌過夜。將反應混合物在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(20-50% EA在PE中)在Al2O3上純化，得到化合物30-9(1g，40%產率)。
C50H54N2O7質量計算為：794.4；實測：817.4[M+Na]+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.90-7.68(m,4H),7.44-7.25(m,14H),6.90(d,J=8.8Hz,4H),4.56(t,J=5.2Hz,1H),4.31-4.20(m,3H),3.74(s,6H),3.70-3.67(m,4H),3.55(s,2H),3.31(s,4H),2.99-2.95(m,2H),2.29-2.21(m,2H),1.89-1.67(m,2H),1.53-1.24(m,6H)。
化合物30-10：
將化合物30-9(700mg，880.54μmol)溶解在MeOH(14mL)中，然後將哌啶(1.4mL)添加到混合物中。將反應混合物在室溫攪拌過夜。將反應混合物在真空中濃縮，藉由快速管柱色譜法(0-10% MeOH)在Al2O3上純化，得到呈白色泡沫固體的化合物30-10(300mg，59%產率)。
C35H44N2O5質量計算為：572.3；實測：595.3[M+Na]+，ESI。
化合物30-11：
在0℃，將化合物11-11(1.00g，523.80μmol)、DIEA(169.25mg，1.31mmol，228.09μL)、HOBT(84.93mg，628.57μmol)和EDCI(120.50mg，628.57μmol)在DCM(50mL)中的混合物攪拌30分鐘。將化合物30-10(300mg，523.80μmol)加入到混合物中。將反應在室溫攪拌過夜。將反應混合物用水(20mL)淬滅，用DCM(25mL×2)萃取，用鹽水(50mL)洗滌，經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮，藉由HPLC純化得到化合物30-11(595mg，46%產率)。
C125H185N11O39質量計算為：2464.3；實測：1255.2[M+2Na]2+，ESI。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.83-7.69(m,7H),7.43(s,1H),7.37-7.20(m,9H),6.91-6.89(m,J=8.8Hz,4H),5.22(d,J=3.2Hz,3H),4.99-4.95(m,3H),4.49-4.46(m,6H),4.03(s,9H),3.91-3.85(m,5H),3.74(s,6H),3.74-3.26(m,9H),3.01-2.99(m,10H),2.90-2.87(m,2H),2.27-2.20(m,9H),2.12(s,11H),2.06-2.02(m,8H),2.02(s,11H),1.89(s,11H),1.78(s,9H),1.62-1.21(m,52H)。
實施例31
化合物31-1：
將化合物11-11(3.17g，1.66mmol)、HOBT(448.34mg，3.32mmol)、EDCI(954.11mg，4.98mmol)和DIEA(857.66mg，6.64mmol)在DCM(20mL)中的混合物攪拌15分鐘，然後，將化合物9-9(1.00g，1.66mmol)加入到反應混合物中，並繼續攪拌4小時。將混合物在DCM(50mL)和水(35mL)之間分配，DCM
萃取物用鹽水(100ml)洗滌，經硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮。藉由反相管柱(C18管柱)純化殘餘物以提供化合物31-1(2.25g，54%產率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.85-7.78(m,4H),7.72(t,J=5.4Hz,3H),7.45(s,1H),7.27-7.20(m,6H),6.91-6.85(m,6H),5.21(d,J=3.4Hz,3H),4.99-4.94(m,3H),4.64(t,J=5.1Hz,1H),4.50-4.41(m,5H),4.05-3.95(m,10H),3.91-3.83(m,5H),3.75-3.65(m,14H),3.51(s,1H),3.44-3.31(m,5H),3.06-2.94(m,10H),2.90(s,2H),2.89-2.78(m,2H),2.41-2.30(m,2H),2.28-2.21(m,4H),2.10(s,9H),2.08-2.00(m,10H),1.99(s,11H),1.96-1.92(m,2H),1.89(s,9H),1.86-1.80(m,2H),1.77(s,9H),1.66-1.31(m,35H),1.30-1.13(m,13H)。
化合物31-2：
向化合物31-1(150mg，0.06mmol)在無水DCM(1.0mL)中的溶液中加入DMAP(14mg，0.12mmol)和TEA(24mg，0.24mmol)，然後加入琥珀酸酐(20mg，0.2mmol)。將反應混合物在室溫攪拌3小時，LCMS顯示起始材料完全消耗。將反應混合物用DCM(10mL)稀釋，用H2O(3mL×4)洗滌，然後用鹽水(3mL×4)洗滌，濃縮有機層得到呈白色固體的化合物31-2(130mg，97%產率)。
C130H191N11O43質量計算為：2594.31；實測：1297.4[M+2H]2+，ESI。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ 7.92-7.69(m,7H),7.50-7.41(m,1H),7.31-7.12(m,9H),6.92-6.89(m,6H),5.21(d,J=6.0Hz,3H),4.98-4.95(m,3H),4.52-4.41(m,5H),4.07-4.01(m,12H),3.90-3.83(m,5H),3.80-3.64(m,14H),3.49-3.25(m,17H),3.05-2.84(m,14H),2.47-2.23(m,8H),2.12-1.77(m,52H)1.61-1.21(m,46H)。
固體支持物31-3：
天然胺基-LCAA-CPG(上樣值：75umol/g，1000Å)用ACN(100mL×2)、DMF(100mL×2)和DCM(100mL×2)洗滌，然後在高真空中乾燥過夜。
向琥珀酸酯31-2(130mg，0.05mmol)和HBTU(53mg，0.14mmol)在無水DMF(1.5mL)中的溶液中加入DIPEA(30mg，0.23mmol)，將反應混合物於室溫震盪10分鐘，然後加入天然胺基-LCAA-CPG(300mg，上樣75umol/g)，將懸浮液在室溫中震盪20小時，然後過濾，用DMF(20mL×5)、ACN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥2小時以得到固體支持物(300mg)。藉由在室溫，用Ac2O/吡啶/N-甲基咪唑(90μL/1.0mL/80μL)攪拌1小時，將固體支持物上未反應的胺封端，用DMF(20mL×5)、CAN(20mL×5)、DCM(20mL×5)洗滌，直到TLC顯示在沖提液中在254nm處沒有斑點。將固體支持物在真空中乾燥15小時以得到固體支持物31-3(300mg)。對於上樣計算，取5.3mg的乾的上樣的CPG，在DCM中添加20mL的3% DCA。震盪溶液，測量482nm處的紫外吸光度。確保吸光度值低於1.0單位，以確保沒有信號飽和。然後應用以下等式：
以μmol/g上樣=(以mL添加的DCA總體積)*(482nm處的Abs值)*1000)/78.3*(使用的CPG的mg)
以mL添加的DCA總體積=20mL
482nm處的Abs值=0.681
使用的CPG的Mg=5.3mg
以μmol/g上樣=((20)*(0.681)*1000)/78.3*(5.3)=32.82umol/g。
實施例32
GalNAc綴合和未綴合的寡核苷酸和siRNA的合成
GalNAc綴合的亞磷醯胺：
所有其他GalNAc綴合的亞磷醯胺的合成遵循在實施例2-7、9和11中描述的方法。
GalNAc綴合的琥珀酸酯和上樣到固體支持物：
所有其他GalNAc綴合的琥珀酸酯的合成和上樣至固體支持物遵循在實施例2、4、9-11和31中描述的方法。
用於靶向人蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型(hPCSK9)的siRNA序列和化學修飾：
有義鏈(5'至3')：
(1)CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm-GalNAc：
(2)GalNAc-CmUmAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmsGmsUm
(3)GalNAc-CmUmAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm-GalNAc
反義鏈(5'至3')：
AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAfCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm
靶向小鼠補體成分3(mC3)的siRNA序列和化學修飾：
有義鏈(5'至3')：
(1)UmsGmsGmUmCmAmAfGfGfUmCmUmUmCmUmCmUmCmUm-GalNAc
(2)GalNAc-UmGmGmUmCmAmAfGfGfUmCmUmUmCmUmCmUmsCmsUm
反義鏈(5'至3')：
(E)VP-UmGfAmGfAmGfAmAfGmAfCmCfUmUfGmAfCmsCfsAm
用於靶向小鼠轉甲狀腺素蛋白(mTTR)的siRNA序列和化學修飾：
有義鏈(5'至3')：
(1)AfsAmsCfAmGfUmGfUmUfCfUfUmGfCmUfCmUfAmUfAmAf-GalNAc
(2)GalNAc-AfAmCfAmGfUmGfUmUfCfUfUmGfCmUfCmUfAmUfsAmsAf
反義鏈(5'至3')：
UmsUfAmUfAmGfAmGfCmAfAmGmAmAfCmAfCmUfGmUfUmsUmsUm
s：硫代磷酸酯，或磷酸二酯，
m：2’-OMe；
f：2’-F；
(E)-VP：(E)-乙烯基膦酸酯。
製備的一般方法
1.上樣：在5mL注射器中預裝GalNAc或核苷的CPG(0.19g，500A，~10μmol)。
2.洗滌：乙腈(2.0mL，0.3分鐘，重複兩次，室溫)。
3.去三苯甲基：3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液(2.0mL，0.7分鐘，重複四次，室溫)。
4.洗滌：乙腈(2.0mL，0.3分鐘，重複兩次，室溫)。
5.偶聯：0.067M的反應單體在乙腈(1.0mL)中的溶液和0.30M 5-(苄基硫基)-1H-四唑(BTT)在乙腈(1.0mL)中的溶液作為活化劑(7.0分鐘，重複三次，室溫)
6.硫化或氧化：N,N-二甲基-N'-(3-硫基-3H-1,2,4-二唑-5-基)甲醯胺二醯胺(DDTT，4.80M，在吡啶/乙腈=2/1，2.0mL，1分鐘，兩次，室溫)或0.05M I2在吡啶/H2O=80/20(v/v)中的溶液(2.0mL，1分鐘，兩次，室溫)。
7.封端：1-甲基咪唑(NMI)/乙腈=15/85(v/v)(2.0mL)和乙酸酐/乙腈=20/80(v/v)(0.9mL，1分鐘，一次，在室溫中)。
8.洗滌：乙腈(2.6mL，0.3分鐘，重複兩次，室溫)。
9.合成程序自動循環19次。
10.將固體支持物浸入10% DEA中20分鐘。將固體支持物懸浮在NH3．H2O(5mL)中，在48mL密封管中在40℃攪拌16小時。使反應混合物冷卻至25℃。然後過濾固體支持物，將水相在真空中濃縮得到黃色溶液。
11.向濾液(10mL)中加入40mL乙醇，然後接著加入0.3mL NaCl(3M)。離心管在-20℃靜置20分鐘。然後將管離心。棄去上清液並收集剩餘的固體。
12.白色固體藉由製備型HPLC純化(管柱：O-C18 150*40mm*10μm；流動相：[0.1M TEAB-ACN]；B%：14%-24%，30分鐘)。
13.凍乾後得到期望的呈白色固體的化合物。
退火步驟：
1.計算雙鏈體的莫耳值(例如，2mg的雙鏈體，莫耳值=2mg/雙鏈體M.W.，游離酸)，這是單鏈莫耳值。
2.在25℃中，分別將有義鏈和反義鏈溶解在超純水(無DNase/RNase，無菌)中。寡聚物(oligos)的濃度藉由紫外-可見光(UV-vis)定量。
3.以1：1的莫耳比混合兩種溶液。
4.將混合樣品在室溫放置10分鐘以上。藉由HPLC測試以監測配比是否合適。
5.將溶液分裝到試管中並凍乾得到siRNA樣品。
表1.siRNA ID及其GalNAc類型和在有義鏈上的位置
生物測定
針對本發明中人蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型(hPCSK9)、小鼠補體成分3(mC3)或小鼠轉甲狀腺素蛋白(mTTR)基因的GalNAc綴合的siRNA在原代人肝細胞(PHH)中，在原代小鼠肝細胞(PMH)和野生型小鼠中進行了游離攝取測試。使用實時定量RT-PCR測定，藉由hPCSK9、mC3或mTTR mRNA水平的降低來確定療效。
還檢查了本發明中針對hPCSK9基因的GalNAc綴合的siRNA與報告子siRNA-8(用Cy3染料標記的GalNAc-1綴合的siRNA)在結合人肝癌細胞系HepG2中的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的競爭活性。藉由流式細胞術測量的細胞中平均螢光強度的降低來確定競爭活性。
1.細胞培養
人HepG2細胞購自ATCC，在培養基中以70%匯合度傳代，DMEM(Invitrogen)補充了10%胎牛血清(FBS，Invitrogen)。
從Invitrogen購買的冷凍小瓶的原代人肝細胞(PHH)在冷凍保存的肝細胞恢復介質(Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium，CHRM，Gibco)中解凍，並在膠原蛋白I包被的96孔板(Gibco，A1142803)中，以約1.0×105個
細胞/100ul介質/孔的密度，用鋪板介質(補充有肝細胞鋪板補充包(Gibco，CM3000)的William Medium E(Gibco，A1217601))鋪板，4-6小時。然後，將鋪板介質改為孵育介質(補充有肝細胞維持補充包(Gibco，CM4000)的Williams Medium E(Gibco，A1217601))，用GalNAc綴合的siRNA處理以進行游離攝取。
從Xenotech以冷凍小瓶形式購買的PMH在OptiThaw肝細胞介質中解凍，在I型膠原蛋白包被的96孔板(Gibco，A1142803)中，以約1.0×105細胞/100ul介質/孔的密度，用鋪板介質(OptiPlate肝細胞介質)鋪板達4-6小時。然後，將鋪板介質改為孵育介質(OptiCulture介質)，用GalNAc綴合的siRNA處理以進行游離攝取。
2. hPCSK9、mC3和mTTR的siRNA(實施例32)
hPCSK9的siRNA是根據以下公開序列藉由固相寡核苷酸合成進行合成的：
有義鏈5'-3'：CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU
反義鏈3'-5'：AAGAUCUGGACAAAACGAAAACA
mC3的siRNA是根據以下公開序列藉由固相寡核苷酸合成進行合成的：
有義鏈5'-3'：UGGUCAAGGUCUUCUCUCU
反義鏈3'-5'：ACCAGUUCCAGAAGAGAGU
mTTR的siRNA是根據以下公開序列藉由固相寡核苷酸合成進行合成的：
有義鏈5'-3'：AACAGUGUUCUUGCUCUAUAA
反義鏈3'-5'：UUUUGUCACAAGAACGAGAUAUU
3.游離攝取
將所示的PHH或PMH細胞的鋪板介質改為預溫的孵育介質，其中siRNA的多個終濃度為100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、0.000256nM。孵育48小時後，提取mRNA用於RT-qPCR。
4. mRNA分離
PHH或PMH的mRNA藉由使用DynabeadsTM mRNA DIRECTTM純化試劑盒(Invitrogen，目錄號61012)分離。棄去孵育介質，將試劑盒中提供的100ul裂解/結合緩衝液添加到細胞中。在室溫孵育15-30分鐘後收集細胞裂解物，然後與磁性Dynabeads混合。孵育5分鐘後，用試劑盒中提供的緩衝液清洗Dynabeads，風乾，然後進行cDNA合成。
5. cDNA合成
分離mRNA後，立即藉由SuperScript VILO cDNA合成試劑盒(Invitrogen life technology)進行逆轉錄。
6.基因表達分析(RT-qPCR)。
所有用於RNA定量的探針都是從Life Technologies獲得的，利用他們的TaqMan基因表達系統和雙標記探針。靶基因表達相對TATA盒結合蛋白(TBP)進行歸一化，作為每個孔中的對照。使用Quantstudio 5實時PCR系統(Invitrogenlife technology)測量Ct值。為了計算相對倍數變化，使用比較CT方法分析實時數據，並將其歸一化為未處理細胞中的相對靶mRNA水平。TaqMan探針目錄號如下所示：
靶基因：
人PCSK9-FAM(測定ID：Hs00545399_m1)
小鼠C3-FAM(測定ID：Mm01232779_m1)
小鼠TTR-FAM(測定ID：Mm00443267_m1)
持家基因：
人TBP-VIC(測定ID：Hs00427620_m1)
小鼠TBP-VIC(測定ID：Mm01277042_m1)
實施例1在PHH中的三觸角GalNAc-siRNA游離攝取測定
測定靶向hPCSK9 mRNA的三觸角GalNAc綴合的siRNA對於在PHH中的靶mRNA的減弱活性。可接種的人冷凍保存的原代肝細胞購自Gibco(目錄號：HMCPU，批號：Hu8115)。將細胞從液氮中取出後立即在37℃中解凍，然後在完全融化前轉移到預溫的解凍介質(Gibco，CM7000)中。將細胞在室溫以100g離心10分鐘，去除解凍的介質，添加鋪板介質，即補充有肝細胞鋪板補充包(Hepatocyte Plating Supplement Pack，Gibco，CM3000)的William Medium E(Gibco，A1217601)，以約1.0×105個細胞/100ul介質/孔的密度在I型膠原蛋白包被的96孔板(Gibco，A1142803)中將細胞鋪板。在37℃孵育4小時後，將鋪板介質更換為孵育介質(補充有肝細胞維持補充包(Gibco，CM4000)的Williams Medium E(Gibco，A1217601))，其中含有新型GalNAc綴合的siRNA藉由5倍稀釋從100nM降到0.000256nM，siRNA-14、-16除外，其藉由3倍稀釋從100nM降到0.01nM。對數據進行了兩次生物重複。添加siRNA後48小時收集細胞，然後根據製造商的說明，藉由DynabeadsTM mRNA DIRECTTM純化試劑盒(Invitrogen，目錄號61012)分離mRNA和RNA，藉由SuperScript VILO cDNA合成試劑盒(Invitrogen life technology)合成cDNA。使用TaqMan基因表達測定(TaqMan Gene Expression Assay，ThermoFisher)測量每個孔中的hPCSK9 mRNA水平，將其相對hTBP mRNA進行歸一化，一式兩份在Quantstudio 5實時PCR
系統(Invitrogen life technology)上進行實時qPCR。藉由使用δ-δ Ct方法計算數據，並將其歸一化為在未處理細胞中的相對靶mRNA的水平。用GraphPad Prism 9.3.1版，使用四參數邏輯模型製作劑量-反應曲線。
數據顯示新型GalNAc綴合物對hPCSK9 mRNA水平的最大效應。
GalNAc部分L96(siRNA-1)在測定中用作陽性對照。如果在GalNAc綴合物處理中的剩餘的hPCSK9 mRNA水平低於L96，我們認為新型GacNAc優於siRNA-1。否則，它們較siRNA-1差。表2中顯示的所有三觸角GalNAc的排序是以在兩個生物重複中在100nM的平均最大效應所確定的。最大效應的倍數是根據來自用siRNA-1處理的細胞的剩餘mRNA除以其他GalNAc-siRNA處理的百分比的比率來計算。在PHH中的游離攝取測定的結果表明，設計的三觸角GalNAc具有最大效應，與siRNA-1相比，剩餘的靶mRNA約為35%。
表2.基於PHH游離攝取測定中的最大效應的三觸角GalNAc的排序。
實施例2.在PHH中的(1+1+1)三價GalNAc-siRNAs游離攝取測定
測定(1+1+1)三價GalNAc綴合的靶向hPCSK9 mRNA的siRNA對於在PHH中的靶mRNA的減弱活性。在PHH中游離攝取、mRNA分離和RT-qPCR的方法和過程(procedure)與上述三觸角GalNAc綴合的siRNA完全相同。(1+1+1)三價GalNAc綴合物的排序如表3所示。排序基於對剩餘的靶mRNA百分比的最大效應。siRNA處理的細胞在100nM的數據顯示新型GalNAc綴合物對hPCSK9 mRNA水平的最大效應。陽性對照是siRNA-2和siRNA-29。
表3.基於PHH游離攝取測定中的最大效應的(1+1+1)三價GalNAc的排序。
在PHH中的游離攝取測定結果表明，設計的(1+1+1)三價GalNAc綴合物具有最大效應，在減弱後的剩餘靶mRNA小於50%，與siRNA-2和siRNA-29(對照)相比更加有效。儘管siRNA-5和siRNA-3與其他具有相同的siRNA序列和化學修飾，但抑制靶mRNA低至低於30%。
實施例3.競爭測定檢測GalNAc在HepG2細胞中的攝取活性。
GalNAc是ASGPR的高親和力配體。為了進一步比較不同GalNAc綴合的siRNA的由ASGPR介導的攝取和效力，我們使用Cy3標記的GalNAc-siRNA(siRNA-8)作為報告子，與不同濃度的GalNAc-siRNA混合，藉由流式細胞術測量siRNA-8在肝細胞中的內化。隨著GalNAc-siRNA量的增加，報告子的內化減少。對於競爭測定，相比於在PHH中游離攝取測定中的陽性對照，我們選擇了具有或多或少有效GalNAc的siRNA。將HepG2細胞接種在384孔板(1×104個細胞/孔)中，在37℃中貼壁並平衡至少16小時。Cy3標記的GalNAc-siRNA(siRNA-8)在培養介質中與8點3倍稀釋的設計的GalNAc-siRNA混合。將HepG2細胞置於冰上進行siRNA處理。將HepG2細胞的舊介質更換為含有
siRNA的介質，將細胞在37℃中連續培養2小時。孵育後，將週期細胞置於冰上並用冰冷的PBS(pH=7.4，ThermoFisher)洗滌3次，在37℃用胰蛋白酶解除(lift)10分鐘，然後用冰冷的介質停止胰蛋白酶處理。然後，將細胞轉移到新的96孔板中，將介質更換為冰上的EasySepTM緩衝液(Stemcell Technologies)。然後，使用BD LSRFortessaTM X-20(BD Biosciences)藉由流式細胞術分析細胞的平均螢光強度。將內化的siRNA表示為平均螢光強度(MFI)。用GraphPad Prism 9.3.1版使用四參數邏輯模型製作劑量反應曲線。
表4.基於競爭測定中的最大效應的三觸角GalNAc的排序。
表5.基於在競爭測定中的最大效應的(1+1+1)三價GalNAc的排序。
平行地，藉由表面電漿共振(SPR)測定法在配備有NiHC200M芯片的Biacore 8K機器(Biacore AB)上測試GalNAc-siRNA與ASGPR的結合親和力。在這裡，具有細胞內製造的his標簽的H1亞基(aa 154-281)的人ASPGR1 CRD結構域被固定到芯片上。結合親和力的結果還顯示在表4和表5中。
競爭測定結果表明，所有三觸角GalNAc綴合物都可以將siRNA-8在6uM處的內化抑制36%至47%，並且藉由SPR測試對於ASGPR具有相似的結合親和力。
競爭測定結果表明，siRNA-2在6uM時不能抑制Cy3標記的GalNAc-siRNA(siRNA-8)的內化，而其他具有不同(1+1+1)三價GalNAc的siRNAs可以抑制，並且藉由SPR測試對於ASGPR具有相似的結合親和力。
實施例4.三觸角的和(1+1+1)三價GalNAc-siRNA在PMH中的自由攝取測定
我們選擇了兩個三觸角的GalNAc(在有義鏈3'端的GalNAc-6和在有義鏈3'端的GalNAc-7)用於進一步分析在PMH中的游離攝取測定。siRNA-24和siRNA-27(與在有義鏈的3'端與GalNAc-6綴合)分別靶向mC3和mTTR。siRNA-25和siRNA-28(與在有義鏈的3'端與GalNAc-7綴合)分別靶向mC3和mTTR mRNA。
我們還選擇了三個(1+1+1)三價GalNAc(在有義鏈5'端的GalNAc-3和在有義鏈5'端的GalNAc-5)用於進一步分析在PMH中的游離攝取測定。三
個(1+1+1)三價GalNAc分別與靶向mTTR m RNA的siRNA-37和siRNA-38綴合。
測定三觸角的或(1+1+1)三價GalNAc綴合的靶向mC3 mRNA或mTTR的siRNA對於在PMH中的靶mRNA的減弱活性。將細胞從液氮中取出後立即在37℃中解凍，然後在完全融化前轉移到預溫的OptiThaw肝細胞介質中。將細胞在室溫中以100g離心10分鐘，去除解凍的介質，添加OptiPlate肝細胞介質，以約1.0×105個細胞/100ul介質/孔的密度在I型膠原蛋白包被的96孔板(Gibco，A1142803)中將細胞鋪板。在37℃孵育4小時後，將鋪板介質更換為OptiCulture介質，其中含有新型GalNAc綴合的siRNA，藉由5倍稀釋從100nM降到0.000256nM。添加siRNA後48小時收集細胞，然後根據製造商的說明，藉由DynabeadsTM mRNA DIRECTTM純化試劑盒(Invitrogen，目錄號61012)分離mRNA和RNA，藉由SuperScript VILO cDNA合成試劑盒(Invitrogen life technology)合成cDNA。使用TaqMan基因表達測定(ThermoFisher)測量每個孔中的mC3 mRNA水平，將其相對mTBP mRNA進行歸一化，一式兩份在Quantstudio 5實時PCR系統(Invitrogen life technology)上進行實時qPCR。藉由使用δ-δ Ct方法計算數據，並將其歸一化為在未處理細胞中的相對靶mRNA的水平。用GraphPad Prism 9.3.1版使用四參數邏輯模型製作劑量反應曲線。
表6.基於PMH游離攝取測定中的最大效應的三觸角GalNAc的排序(靶向mC3 mRNA)。
表7.基於PMH游離攝取測定中的最大效應的三觸角GalNAc的排序(靶向mTTR mRNA)。
表8.基於在PMH中游離攝取測定中的最大效應的1+1+1 GalNAc的排序(靶向mTTR mRNA)。
表6和7中的結果顯示設計的三觸角GalNAc比對照(siRNA-23和siRNA-26)更有效，表8中的結果顯示設計的(1+1+1)三價GalNAc比對照(siRNA-40)更有效。
實施例5.在體內研究的三觸角和(1+1+1)三價GalNAc-siRNA
體內研究方法
雄性C57BL/6小鼠獲自Jackson Laboratories，大約6-8週齡。將動物稱重然後分配到每組，以確保每組的平均體重和體重變化相似。在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以1mg/mL製備測試物品(GalNAc綴合的siRNA)。使用QIAxpert(Qiagen)測量siRNA濃度和質量。用siRNA或PBS對照(載體)以5mL/kg皮下給藥小鼠。使用眼眶後採血方法收集血液，然後進行血清製備。取血清後，將其轉移至1.5mL試管中，-80℃保存。注射前2天收集基線血樣。然後，在施用後第7天再次收集血液。在第14天處死動物，隨後進行血液採集和肝臟採集。肝臟的一個葉被儲存在2.5mL的RNAlater(Thermo Fisher Scientific)中，保存在4℃中用於以後的RNA提取。另一個肝葉被快速冷凍並保存在-80℃。
對於血清蛋白，藉由LS Bio(目錄號LS-F7530)的ELISA試劑盒測量mTTR水平，並且藉由Abcam的ELISA試劑盒(目錄號ab263884)測量mC3水平。
對於肝臟基因表達，將RNAlater中的肝臟組織均質化，然後使用Dynabeads® mRNA DIRECTTM純化試劑盒(Thermo Fisher Scientific)分離mRNA。使用SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(Thermo Fisher Scientific)進行cDNA生產。使用基因特異性TaqMan測定(Thermo Fisher Scientific)完成實時PCR反應。
體內結果總結
施用後，siRNA-23、siRNA-24和siRNA-25顯示可持續的血清mC3蛋白降低，直至最後一個檢查時間點(第14天)。在siRNA-24或siRNA-25處理組中，在第7天和第14天，mC3蛋白水平在統計學上顯著低於載劑處理組。相較於siRNA-23，siRNA-24和siRNA-25顯示出更好的mC3減弱趨勢(圖1)。此外，與
載劑組相比，siRNA-24和siRNA-25在第14天顯著降低了肝臟中的mC3 mRNA水平(圖2)。
類似地，觀察到siRNA-37、siRNA-38、siRNA-39和siRNA-40對mTTR蛋白的連續減弱，直至給藥後第14天。與載劑處理組相比，所有siRNA在第7天和第14天顯著降低mTTR蛋白水平，在第14天顯著降低mTTR mRNA水平。
我們的數據表明設計的GalNAc綴合物具有良好的表達減弱作用。
Claims (22)
- 一種靶向配體，其具有式(III-b)、(III-c)或(III-d)所示的結構：
R1為氫或保護基團；R2為氫或固體支持物，其視需要藉由接頭基團、或亞磷醯胺連接；R為藉由接頭基團連接的，具有羥基保護基團的碳水化合物或其衍生物；m獨立地選自0、1、2、3、4和5；n獨立地選自1、2、3、4和5；r、s和t各自獨立地選自0、1和2；m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。 - 一種靶向配體，其具有式(III)或(III-a)所示的結構：
是單鍵或雙鍵；
R1為氫或保護基團；R2為氫或固體支持物，其視需要藉由接頭基團、或亞磷醯胺連接；R為藉由接頭基團連接的，具有羥基保護基團的碳水化合物或其衍生物；Rb獨立地選自氫和側氧基；m和n各自獨立地選自1、2、3、4和5；m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。 - 如請求項1或2所述的靶向配體，其中該R具有式(IV)、(IV-a)、(IV-b)或(IV-c)所示的結構：
A為C3-10環烷基或4-12員雜環基；L1、L2、L3、L4和L5各自獨立地選自不存在、O、S、S-S、NH、CO、CONH、NHCO和4-10員雜環基的取代基；R4、R6、R7和R8各自獨立地選自CH2、OCH2CH2和CH2CH2O的取代基；R5獨立地選自不存在、CH2、OCH2、CH2O、OCH2CH2、CH2CH2O、NHCH2、CH2NH、NHCH2CH2、CH2CH2NH、C0-6烷基(C3-8環烷基)和C0-6烷基(4-10員雜環基)的取代基；R9是碳水化合物；t1、t2、t3、t4和t5各自獨立地選自0、1、2、3、4、5和6。 - 如請求項3所述的靶向配體，其中R具有式(IV-1)、(IV-a-1)、(IV-b-1)或(IV-c-1)所示的結構：
其中，A是、
、
、
、
或
；
L1、L3、L4和L5各自獨立地選自不存在、O、S、S-S、NH、CO、CONH和NHCO的取代基；L2為不存在、O、S、S-S、NH、CO、CONH、NHCO和；
R5獨立地選自不存在、CH2、CH2O、CH2NH、C3-6環烷基、C3-6環烷基C1-3烷基、含有1、2或3個選自N或O的雜原子的4-8員雜環基和含有1、2或3個選自N或O的環雜原子的4-8員雜環基C1-3烷基。 - 如請求項3所述的靶向配體，其中R5獨立地選自-OCH2-、-NHCH2-、和
。
- 如請求項3所述的靶向配體，其中R9選自半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、D-半乳糖胺醇、甘露糖、甘露糖胺、甘露糖-6-磷酸、葡萄糖、葡糖胺、N-乙醯-葡糖胺(GluNAc)、葡萄糖-6-磷酸、葡糖胺醇、葡萄糖甘油醛、岩藻糖、岩藻糖胺、墨角藻糖、乳糖、阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、克拉定糖、赤蘚糖、赤蘚酮糖、果糖、D-岩藻糖醇、L-岩藻糖醇、L-甘油-D-甘露 糖-庚糖、甘油、甘油酮、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、阿洛酮糖、奎諾糖、喹諾酮胺、鼠李糖、鼠李糖醇、鼠李糖胺、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔羅糖、酒石酸、蘇糖、木糖和木酮糖；較佳地，R9是N-乙醯半乳糖胺。
- 如請求項3所述的靶向配體，其中R具有式(IV-d)、(Iv-e)、(IV-f)、(IV-d-a)、(IV-e-a)或(IV-f-a)所示的結構：
其中，R5獨立地選自OCH2、NHCH2和含有1或2個選自N或O的雜原子的4-6員雜環基的取代基；m獨立地選自0、1、2、3、4、5和6；n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；以及r獨立地選自0、1、2、3、4和5。 - 如請求項3所述的靶向配體，其中R是：
或
s獨立地選自0、1、2和3；r獨立地選自0、1、2、3、4和5；n獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。 - 如請求項3所述的靶向配體，其中該靶向配體是：
或
Rp為H或羥基保護基，較佳地，羥基保護基為乙醯基；X是O或S；m和n各自獨立地選自1或2；m1和n1各自獨立地選自1、2或3。 - 如請求項3或9所述的靶向配體，其中R1為氫或取代或未取代的三苯甲基羥基保護基；較佳地，R1是、
、
- 如請求項3或9所述的靶向配體，其中R2是氫、或
，
是固體支持物。
- 如請求項3所述的靶向配體，其中該靶向配體是：
X是O或S。 - 如請求項1至12中任一項所述的靶向配體，其與治療劑連接用作藥物。
- 一種治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，其包含至少一種治療性寡核苷酸，且該寡核苷酸與如請求項1至12中任一項所述的靶向配體綴合。
- 如請求項14所述的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該治療性化合物是：
NA是寡核苷酸；X是O或S。 - 如請求項14所述的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，其中該寡核苷酸是反義寡核苷酸；較佳地，該寡核苷酸是siRNA。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項14所述的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種治療疾病或病症的方法，其將受益於施用如請求項14所述的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽，或者如請求項17所述的醫藥組成物。
- 一種合成如請求項14所述的治療性化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的鹽的方法，包括：提供如請求項1至12中任一項所述的靶向配體，將該靶向配體綴合至寡核苷酸；較佳地，將該靶向配體綴合至該寡核苷酸的3'端或5'端；更佳地，該寡核苷酸是siRNA。
- 一種式(V-a)、(V-b)或(V-c)的化合物、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽，
是單鍵或雙鍵；
Rb獨立地選自氫和側氧基；m和n各自獨立地選自1、2、3、4和5m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。 - 一種式(VI-a)、(VI-b)或(VI-c)的化合物、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽，
m獨立地選自0、1、2、3、4和5；n獨立地選自1、2、3、4和5；r、s和t各自獨立地選自0、1和2；m1和n1各自獨立地選自0、1、2、3和4。 - 一種具有以下結構的化合物，
或，其互變異構體或其藥學上可接受的鹽。
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