KR20170026485A - 암 표적화 치료를 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 소단위-계 치료제를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

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로우 웡 빙
펑 맨 와이 놀먼
이 ? 수이
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치어 글로벌 리미티드
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Abstract

본 발명은 조직 산화 및 암을 치료하기 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 또한 암을 치료하는데 효과적이다. 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 이의 소단위는 암 세포를 표적화할 수 있고 치료학적 잔기(즉, 활성제/치료학적 약물)은 암 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인두암, 식도암, 전립샘암, 위암 및 뇌암과 같은 다양한 암의 치료에 사용될 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 화학치료제, 방사선치료제, 항-암 단백질 약물과 함께 사용되어 암 치료, 전이 억제 및/또는 재발 감소에 있어서 상승 효과를 제공할 수 있다.

Description

암 표적화 치료를 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 소단위-계 치료제를 포함하는 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT HEMOGLOBIN PROTEIN OR SUB-UNIT-BASED THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER TARGETING TREATMENT}
저작권 공고/승인
본 서류의 개시내용의 일부는 저작권 보호에 속한 자료를 포함한다. 저작권 소유자는 특허 서류 또는 특허 개시내용이 특허상표청 특허 파일 또는 기록에 나타나 있으나, 또한 무엇이든 모든 저작권 권리를 보존하므로, 특허 서류의 누구 또는 특허 개시내용에 의해서 팩스 재생에 반대하지 않는다. 다음의 주의사항은 하기 기술된 공정, 실험, 및 데이타 및 이에 첨부된 도면에 적용된다. Copyrightⓒ2014-15，보존된 모든 권리.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 7월 2일자로 출원된 미국 가특허원 일련 번호 제62/019,925호 및 2015년 6월 28일자로 출원된, 미국 비-가특허원 일련 번호 제14/752,999호로부터의 우선권을 청구한다.
기술 분야
본 발명은 산소 운반 능력을 지녀서 천연의 헤모글로빈 단백질을 대체(replacing)하는 헴(heme) 분자가 있거나 없는 α, β, γ1, γ2 단량체를 제공한다. 본 발명은 또한 생체내(in vivo) 및 생체외(ex vivo) 조직의 산화시 사용하기 위한 재조합 헤모글로빈 단백질(recombinant hemoglobin protein), 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체, 또는 소단위(subunit)를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 헤모글로빈 소단위가 화학적으로 변형되어 암 세포를 표적화(targetting)하고/하거나 사멸하는 능력을 지닌 물질을 생성하는 재조합 헤모글로빈 단백질-, 재조합 헤모글로빈 사량체-, 이량체-, 또는 소단위-계 치료제를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 헴 분자가 있거나 없는 α, β, γ1, γ2 단량체를 포함하는 상이한 재조합 헤모글로빈 소단위, 및 이의 이량체 및 사량체의 작제 및 발현 및 이의 화학적 변형 또는 가공을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제를 생성하기 위한 화학적 가공을 위한 설계를 기술한다. 본 발명은 또한 사람 및 다른 동물에서 암 표적 치료, 특히 간암, 유방암, 췌장암, 및 각각의 선조 세포(progenitor)로 유도되거나 이와 연관된 종양에 대한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제에 관한 것이다.
헤모글로빈-계 산소 담체(HBOC)는 초기에 혈액 대체물로서 개발되었다. 사람 태반 헤모글로빈은 특히 촉망되는 HBOC이다. 이는 이의 보다 높은 산소 친화성, 보다 낮은 점도, 및 사람 적혈구 세포보다 더 작은 직경으로 인하여 저산소 조직으로 보다 많은 산소를 수송하도록 한다. 그러나, 거대 규모에서 태반 헤모글로빈의 사용에 의해 제기된 주요 문제는 이것이 태반으로부터 추출되어 정제되는 조건에 의해 유발된다. 태반은 동결된 저장 상태로 유지되고 이들이 해동 전에 파쇄되어야만 하는 헤모글로빈을 추출하여야 한다. 이후에, 조직 및 피브리노겐이 여과에 및 수회의 크로마토그래피 단계에 의해 제거되며, 침전 및 디아필트레이션(diafiltration)는 수득되는 여액에서 수행된다. 또한, 사람 태반 헤모글로빈 및 사람 혈액의 공급원은 제한되어 있다. 따라서, 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위의 작제 및 발현은 이러한 문제를 해결하기 위해 중요하다.
저산소증은 암에서 일반적이다. 저산소증 및 빈혈(이는 종양 저산소증에 기여한다)은 이들 제제의 세포독성 활성에 필수적인 산소를 종양 세포로부터 고갈시킴으로써 이온화 방사선 및 화학치료요법 내성을 생성시킬 수 있다. 저산소증은 또한 단백체 또는 게놈 변화를 포함하는 하나 이상의 간접적인 메카니즘을 통해 방사선 치료요법 및 화학치료요법에 대한 종양 민감성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 개선된 암-치료 조성물, 특히 암 세포를 표적화시키는 것을 촉진하고 세포독성제의 효능을 향상시키는 개선된 암-치료 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명에서，재조합 헤모글로빈 단백질, 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체, 및/또는 소단위가 산소 운반 능력을 지니도록 작제된다. 본 발명은 산소 운반 능력을 지녀서 천연의 헤모글로빈 단백질을 대체하는 헴 분자가 있거나 없는 α, β, γ1, γ2 단량체를 포함하는 재조합 헤모글로빈 단백질, 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 및 소단위를 제공한다. 또한, 접합된 치료학적 약물(예를 들면, 화학치료제, 방사선치료제, 항암 단백질 약물)에 의해 암 세포를 효율적으로 사멸시키기 위해 암 세포를 표적화할 수 있는 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질, 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체, 및/또는 소단위 중의 어느 것을 기본으로 하는 치료제가 제공된다. 상이한 환자에서 광범위하게 사용되지만, 많은 부작용을 가진 일반적인 화학치료제, 방사선치료제 및 항암 단백질 약물이 발견되어 있다. 이들 문제는 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체，또는 소단위(들) 중의 어느 것도 화학적으로 변형시키고 이를 하나 이상의 치료 약물에 연결시킴으로써 극복될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 화학적으로 변형되어 암 세포를 표적화하고/하거나 사멸시키는 능력을 지니는 재조합 헤모글로빈 단백질-，재조합 헤모글로빈 사량체-, 이량체-，또는 소단위-계 치료제를 제공한다. 본 발명은 또한 헴 분자가 있거나 없는 α, β, γ1, γ2 단량체, 및 이의 이량체 및 사량체를 포함하는 상이한 재조합 헤모글로빈 소단위의 작제 및 발현, 및 이의 화학적 변형 또는 가공을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체，이량체 또는 소단위-계 치료제를 생성하기 위한 화학적 가공을 위한 설계를 기술한다. 본 발명은 또한 사람 및 다른 동물에서, 특히 간암, 유방암, 췌장암, 및 각각의 선조 세포로 유도되거나 연관된 종양에 대한 암 표적화 치료를 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제-함유 약제학적 조성물에 관한 것이다. 암을 치료하기 위한 통상의 치료학적 약물(예를 들면, 5-플루오로우라실, 테모졸로마이드, 시스플라틴을 포함하는 화학치료 약물)과 비교하는 경우, 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질-, 사량체-, 이량체- 또는 소단위-계 치료제는 암 세포를 표적화할 수 있을 뿐 아니라，암 세포/종양에 있어서의 사멸 효과도 추가로 향상되므로 암 및/또는 종양의 치료에 훨씬 더 효과적이다. 또한, 암-표적화 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 다른 공지된 헤모글로빈-계 산소 담체보다 비교적 더 적은 투여량으로 사용될 수 있으므로, 암에 대한 통상의 치료학적 약물로부터의 부작용이 크게 약화된다.
가장 통상적인 치료학적 약물은 매우 고가이다. 치료학적 유효 투여량이 감소되는 경우 각각의 환자에 대해 치료 비용이 유의적으로 감소될 수 있다. 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 소단위는 암 세포를 표적화할 수 있으므로, 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 소단위-계 치료제는 치료학적 유효 투여량을 저하시키기 위한 우수한 후보물질이다. 일 구현예에서, 사람에서 암을 치료하기 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제의 치료학적 유효 투여량은 대상체의 체중 kg당 0.0024 mg(단일 투여량의 경우 이하일 수 있다. 이는 다수의 투여량(주당 1회)으로 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 생체내 및 생체외 조직의 산화시 사용하기 위해 재조합 헤모글로빈 단백질，재조합 헤모글로빈 사량체，이량체 또는 소단위를 사용하는 방법을 제공한다.
임의로，현재 특허청구된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 또한 살아있는 세포 영상을 촉진시키기 위해 형광성 프로브(들)과 연결될 수 있다. 플루오레세인과 접합된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 간암 세포에 의해 취해질 수 있다. 세포에 의한 새로이 플루오레세인 접합된 재조합 헤모글로빈 단백질- 또는 사량체- 또는 이량체- 또는 소단위-계 치료제의 흡수는 이후 기술되는 바와 같은 일련의 살아있는 세포 흡수 연구에서 세포에 대해 이를 즉시 사용함으로써 입증된다. 하나의 예에서, 플루오레세인 접합된 재조합 헤모글로빈 단백질- 또는 사량체- 또는 이량체- 또는 소단위-계 치료제는 간암 세포(예를 들면, HepG2 세포주)에 의해 흡수되는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제1 국면에서, 상이한 재조합 헤모글로빈 단백질, 재조합 사량체, 재조합 이량체, 및/또는 재조합 헤모글로빈 소단위(예를 들면, α, β, γ1, γ2； 헴 분자가 있거나 없는 것), 및 이의 형성된 이량체 및 사량체가 제공되며, 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체，및 소단위는 또한 추가의 화학적 가공 또는 변형을 위해 제공된다. 숙주내에서 상기 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 소단위(들), 및 이의 이량체 및 사량체를 작제하고 발현시키기 위한 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 제2 국면은 암 세포를 표적화하기 위한 적어도 하나의 유형의 치료학적 약물에 대한 연결 또는 링커(linker)(절단가능하거나 절단가능하지 않음)로서 사용될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹을 지닌 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위를 작제하는 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체，이량체 또는 소단위를 화학적으로 변형시키는데 포함된 화학 반응은 아민 반응, 티올 반응, 카복실레이트 반응, 하이드록실 반응, 티오에스테르를 사용한 고유한 화학적 연결, 생물직교 작용성, 광화학 반응, 및 금속-매개된 반응의 혼입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 재조합 헤모글로빈 단백질의 하나 이상의 헤모글로빈 소단위는 화학적으로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 제3 국면은 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체，이량체 또는 소단위를 상기 절단가능하거나 절단가능하지 않는 연결 또는 링커(linker)를 통해 적어도 하나의 유형의 치료학적 약물(활성제)를 화학적으로 연결시켜 암 세포를 사멸시키는 것이다. 본 발명의 제2 국면에서 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위에 연결될 수 있는 치료학적 약물 또는 활성제는 화학치료 약물(예를 들면, 5-플루오로우라실, 테모졸로마이드, 시스플라틴), 방사선치료 약물(예를 들면, 로듐-105 복합체, 사마륨-153 복합체 및 다른 관련 복합체), 항암 단백질 약물(예를 들면, 아르기나제, 아르기닌 데이미나제), 암을 치료하고/하거나 완화시키는데 효과적인 것으로 입증되고 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위 또는 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위에 대해 절단가능하거나 절단가능하지 않은 연결 또는 링커를 통해 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체，이량체 또는 소단위에 용이하게 연결될 수 있는 어떠한 다른 치료 약물 및/또는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 사람 및 다른 동물에서 암 표적화 치료를 위한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제-함유 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 암을 표적화하고 치료하기 위한 치료학적 유효량의 상기 치료제 및 이의 약제학적으로 허용되는 담체, 염, 완충제, 물, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은, pH가 5.5 내지 9.5의 범위이다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은, pH가 7.2 내지 8.0의 범위이다.
본 발명의 제4의 국면에서，치료학적 유효량의 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제를 포함하는 약제학적 조성물을 다양한 종양 및/또는 암으로 고생하는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 암을 표적화하고/하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 조성물은 대상체에게 정맥내 주사, 복강내 주사, 및 피하 주사를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 화학치료제(예를 들면, 5-플루오로우라실, 5FU)와 같은 활성제를 함유하는 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제의 절단가능한 및 절단가능하지 않은 형태는 본 발명에서 암 표적화 치료를 위해 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제는 또한 화학적으로 변형되어 치료제를 암 세포에 대한 표적화를 촉진시킴으로써 암 세포를 사멸시키는데 더 효율적이다. 상기 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위는 화학적으로 변형되어 상이한 치료제(예를 들면, 5FU, 테모졸로마이드, 시스플라틴 등)에 연결될 수 있다. 상기 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위는 암 세포를 표적화할 수 있다. 이러한 표적화 특성은 이들 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도시킴을 통해 암성 세포, 암 줄기 세포 및/또는 암 후대 세포를 효율적으로 사멸시키는 것을 촉진한다. 자체로서, 상기 치료제의 유효량은 감소될 수 있다.
본 발명에서 제공된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제는 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인두암, 식도암 및 뇌암과 같은 다양한 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제，암을 치료하는 방법, 및 간암을 포함하나, 이에 한정되지 않는 암성 조직의 전이 및 암성 조직의 재발을 치료하고/하거나 억제하는 방법에 관한 것이다.
종양내 세포는 천연적으로 이종(heterogeneous)이다. 종양은 일반적으로 (1) 분할하는데 제한된 능력을 가진 대부부의 암 세포, 및 (2) 새로운 종양 세포를 형성할 수 있으며 천연적으로 매우 전이성인, 또한 후대 세포로 알려진 암 줄기-유사 세포(CSC)의 드믄 집단으로 구성되는 것으로 고려된다. 이들의 내화학성 및 전이성의 고유 특성으로 인하여, CSC는 암 환자에서 재발에 관여하는 것으로 추정되어 왔다.
본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위 잔기는 산소를 CSC 또는 후대 세포로 이동시켜 암 줄기 세포 또는 후대 세로의 사멸을 촉진시키면서 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 소단위-계 치료제의 활성제 잔기는 암 세포를 사멸시킬 수 있으므로，본 발명의 본 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제는 암 치료시 상승 효과를 갖는다.
도 1은 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제를 작제하기 위한 설계 시도를 나타낸다. 하나 이상의 치료학적 약물을 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위(예를 들면 α, β, γ1, γ2)에 연결시켜 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제를 형성시킬 수 있다. 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위는 절단가능한(A) 또는 절단가능하지 않은 링커/연결(B)에 화학적으로 연결될 수 있다. 절단가능한 링커는 카르비놀아민, 디설파이드, 카르바미드, 아미날, 카보네이트, 에스테르, 카바메이트, 포스페이트, 아미드, 아세탈, 이민, 에테르, 및 설폰아미드 그룹을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 절단가능하지 않은 링커는 알킬 및 아릴 그룹일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
도 2는 사람 기원(호모 사피엔스)의 상이한 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)의 아미노산 서열 및 재조합 헤모글로빈 단량체(즉, 단량체 α, 단량체 β, 단량체 γ1, 및 단량체 γ2)，이량체(즉, 이량체 αβ, 이량체 αγ1, 이량체 αγ2, 이량체 βγ1，및 이량체 βγ2) 및 사량체(즉, 사량체 2αβ2, 사량체 2αγ12, 사량체 2αγ22, 사량체 2βγ12, 사량체 2βγ22)에 대한 설계를 나타낸다.
도 3은 본원에 기술된 아미노산 서열을 지닌 상이한 헤모글로빈 사량체, 이량체 또는 소단위의 단백질을 발현하는 상이한 작제물로 형질전환된 세포로부터 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위를 제조하는 방법의 개관을 도시하는 흐름도이다.
도 4는 재조합 헤모글로빈 소단위 감마-1(γ1)의 발현을 위한 이. 콜라이(E. coli) 세포 JM109(DE3)의 성장 곡선을 나타낸다.
도 5는 SDS-PAGE에서 (A) 정제된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2) 및 (B) 정제된 재조합 헤모글로빈 이량체 및 사량체의 분자 크기를 나타낸다.
도 6은 형광성 염료로 표지된, 헴이 있거나 없는 정제된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 (A) 하나의 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2) 및 다른 하나의 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)의 산소 평형 곡선을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 재조합 헤모글로빈 이량체들 중 하나(αβ)의 전자분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS) 분석을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 재조합 헤모글로빈 사량체 중의 하나(2αβ2)의 전자 분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS) 분석을 나타낸다.
도 10은 헴이 있거나(+) 헴이 없는(-) 형광성 표지된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)가 간암 세포(HepG2)내로 성공적으로 도입할 수 있음을 나타낸다.
도 11은 (A) 5FU-연결된 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2) 및 (B) 5FU-연결된 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)에 대한 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(LC-MS) 결과를 나타낸다.
도 12는 (A) 환원 조건(즉, GSH (0.4-1,000 당량)； PBS (pH 7.4)； 37℃, 0-2 시간) 하에 이황화물 결합을 지닌 N-(2-머캅토에틸)벤즈아미드(모델 화합물)의 절단 및 (B) 상이한 GSH 수준: GSH(1 당량)에서 모델 화합물의 전환률은 혈류 속에서의 전환율과 유사하지만 GSH(1,000 당량)은 세포질에서의 전환률과 유사함을 나타낸다.
도 13은 GEM 만； 그룹 1: PBS 완충제(대조군)； 그룹 2: 겜시타빈(GEM), 100 mg/kg； 그룹 3: 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈(Hb) 사량체, 30mg/kg； 그룹 4: 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈 사량체 + 겜시타빈(Hb + GEM)； 그룹 5: 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2), 30 mg/kg； 그룹 6: 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2) + 겜시타빈으로 치료한 대조군 및 동물 모델의 그룹과 비교한 것으로서 췌장암 카판-1(Cpan-1) 동물 모델의 종양 중량(g)의 측면에서 종양 크기를 감소시키는데 있어서 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈(Hb) 사량체 및 본 발명의 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2)의 효능을 나타낸다.
도 14는 GEM 만； 그룹 1: PBS 완충제(대조군)； 그룹 2: 겜시타빈(GEM), 100 mg/kg； 그룹 3: 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈(Hb) 사량체, 30 mg/kg； 그룹 4: 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈 사량체 + 겜시타빈(Hb + GEM)； 그룹 5: 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12), 30 mg/kg； 그룹 6: 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12) + 겜시타빈으로 치료한 대조군 및 동물 모델의 그룹과 비교하여 췌장암 카판-1 동물 모델에서 종양 중량(g)의 측면에서 종양 크기를 감소시키는데 있어서 천연의 소 가교결합된 헤모글로빈(Hb) 사량체 및 겜시타빈(GEM)이 있거나 없는 본 발명의 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)의 효능을 나타낸다.
정의
용어 “암 줄기 세포”는 생체내에서 종양 성장을 개시하고 지속시킬 수 있는 신생물 클론(neoplastic clone)내 생물학적으로 명확한 세포(즉, 암-개시 세포)를 말한다.
용어 "절단가능한 접합체"는 가수분해 또는 산화환원 반응(redox reaction)에 의해 연결된 치료학적 약물/활성제를 용이하게 방출할 수 있는 적어도 하나의 절단가능한 링커 또는 연결을 지닌 접합체를 말한다.
용어 "절단가능하지 않은 접합체"는 적어도 하나의 절단가능하지 않은 링커 및 연결을 지닌 접합체를 말하며 이는 가수분해 또는 산화환원 반응에 의해 연결된 치료학적 약물/활성제를 용이하게 방출할 수 없다.
용어“재조합 헤모글로빈 단백질/단백질”은, 분자 크기가 적어도 대략 65 KDa이고 어떠한 표준 분자 화학 기술에 의해 합성되며 어떠한 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제될 수 없는 헤모글로빈 분자를 말한다. 본 발명에서, 재조합 헤모글로빈 단백질/단백질들은 본 발명의 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체, 및 소단위(단량체)(헴이 있거나 없음)를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않거나 재조합 헤모글로빈 사량체와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 “재조합 헤모글로빈 사량체”는, 분자 크기가 적어도 대략 64KDa이고 어떠한 표준 분자 화학 기술에 의해 합성되며 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제되지 않는 헤모글로빈 분자를 말한다. 본 발명에서, 재조합 헤모글로빈 사량체는 본원에 기술된 어떠한 4개의 재조합 헤모글로빈 소단위(헴이 있거나 없음) 또는 어떠한 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제되지 않은 어떠한 표준 분자 화학 기술에 의해 합성된 어떠한 4개의 헤모글로빈 소단위를 포함할 수 있다.
용어 “재조합 헤모글로빈 이량체”는, 분자 크기가 적어도 대략 32KDa이고 어떠한 표준 분자 화학 기술에 의해 합성되고 어떠한 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제되지 않는 헤모글로빈 분자를 말한다. 본 발명에서, 재조합 헤모글로빈 이량체는 본원에 기술된 재조합 헤모글로빈 소단위 중 어느 2개 또는 어떠한 표준 분자 화학 기술에 의해 합성되고 어떠한 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제되지 않는 재조합 헤모글로빈 소단위 중의 어느 2개를 포함할 수 있다.
용어 “재조합 헤모글로빈 소단위/소단위들”은, 분자 크기가 대략 16KDa 이하이고 표준 분자 화학 기술에 의해 합성되며 헴 그룹이 있거나 없이 변형될 수 있는, 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되거나 정제되지 않는 헤모글로빈 소단위 또는 이의 단편을 말한다.
발명의 상세한 설명
암성 종양과 같은 대부분의 암성 조직은 저산소성이므로, 이들은 통상의 화학치료제/방사선치료제에 대해 내성이 될 수 있다. 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 이러한 저산소성 상태를 완화시키는데 사용될 수 있다. 이는 보다 많은 산소를 이들의 보다 높은 산소 친화성, 저 점도, 및 사람 적혈구 세포보다 더 작은 평균 직경으로 인하여 저산소성 조직으로 수송하여, 암 세포내에서 화학치료제/방사선치료제/다른 항암 약물-내성의 감소를 유도한다.
본 발명의 일 구현에에서, 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위가 생산된다. 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 산소 수송 특징을 지니며 사람 또는 동물 체내에서 암성 세포 또는 조직을 표적화할 수 있다. 산소 담체로서 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 화학적으로 개질되어 수용체-매개된 메카니즘을 개시(triggering)하여 조합된/접합된 화학치료제가 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위와 함께 암성 세포의 적어도 세포질내로 국재화되도록 함으로써 암의 치료를 이끄는 종양 크기를 감소시키는데 있어서 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위 및 화학치료제 둘 다의 효능을 증가시킨다. 바람직하게는, 상기 암은 단독으로 투여되는 경우 화학치료제 및/또는 방사선치료제와 같은 통상의 치료학적 약물에 대해 내성이다.
재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료학적 약물을 작제하기 위한 설계는 도 l의 (A) 및 도 1의 (B)에 나타나 있다. 하나 이상의 활성제(또는 "치료학적 약물"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다)는 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위에 연결되어 현재 특허청구된 재조합 헤모글로빈 단백질- 또는 소단위-계 치료제를 형성한다. 하나 이상의 특수한 활성제(들)의 선택은 표적화될 암 조직의 유형 및 생성되는 화학적으로 변형된 물질의 바람직한 분자 크기에 따라 이루어질 수 있다. 또한, 선택된 활성제는 하나 이상의 활성제의 경우에 동일하거나 상이할 수 있다. 즉, 활성제(또는 "치료학적 약물”) 등은, 가능한 수득되는 분자가 효능을 보유하는 한 또한 암세포를 표적화하기 위해 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위에 연결될 수 있다. 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 치료학적 약물/활성제에 절단가능한(도 l의 (A)) 또는 절단가능하지 않은 연결 또는 링크를 통해 화학적으로 연결될 수 있거나(도 l의 (B)) 달리는, 상기 연결 또는 링크의 부재하에서 활성제에 직접 접합될 수 있다. 상이한 화학 그룹을 본 발명에서 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위의 화학적 변형에 사용할 수 있으며 상기 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 이들 화학 그룹을 통해 치료학적 약물/활성제에 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 절단가능한 링커는 카비놀라민, 디설파이드, 카바미드, 아미날, 카보네이트, 에스테르, 카바메이트, 포스페이트, 아미드, 아세탈, 이민, 옥심, 에테르, 및 설폰아미드 그룹일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며; 절단가능하지 않은 링커는 알킬 및 아릴 그룹일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
도 2는 상이한 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)의 아미노산 서열 정렬 및 재조합 헤모글로빈 단량체, 이량체 및 사량체의 설계를 나타낸다. 재조합 헤모글로빈은 사람, 소, 돼지, 말, 및 개과 헤모글로빈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 종으로부터의 서열을 사용하여 생산할 수 있다. 당해 예에서, 약 141 내지 146개의 아미노산, 즉 알파, 베타, 감마 1, 및 감마 2(서열 번호: 1 내지 4)를 가진 상이한 호모 사피엔스 헤모글로빈 소단위 아미노산 서열을 발현 벡터내로 삽입될 DNA 작제물의 설계를 위해 선택하고, 임의로 상응하는 DNA 작제물을 수반하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주(예를 들면, 세균)내에서 발현된 후 분리 및 정제를 위한 His-sumo/Poly-His 서열로 태그(tag)한다. 상기 재조합 헤모글로빈 단백질/소단위를 생산하기 위한 공정은 도 3의 흐름도에 요약되어 있다. 상기 소단위 중 어떠한 2개의 소단위, 예를 들면, 알파 및 베타 소단위 또는 알파 및 감마 1 소단위를 알파 및 베타 소단위 또는 알파 및 감마 1 소단위를 발현하는 상응하는 DNA 서열을 수반하는 다른 발현 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다. 도 3의 흐름도에 나열한 공정에 따른 정제 후, 이량체 αβ, αγ1, αγ2, βγ1, 및 βγ2가 각각 형성될 수 있다. 사량체, 즉, 2 αβ2, 2αγ12, 2αγ22, 2βγ12, 2βγ22 각각을 형성하기 위한 2개 이상의 소단위, 예를 들면, 2개의 알파 소단위 및 2개의 베타 소단위, 또는 2개의 알파 소단위 및 2개의 감마-1 소단위, 또는 2개의 알파 소단위 및 2개의 감마-2 소단위의 추가의 재조합을 또한 유사한 시도를 사용하여 형성시킬 수 있다. 사량체내 2개의 헤모글로빈 소단위 사이의 가교-결합과 같은 추가의 변형을 수행할 수 있다. 재조합 헤모글로빈 소단위, 이량체, 및 사량체의 아미노산 서열(들)의 설계의 개략적인 도해는 도 2의 (A), (B), (C)에 각각 나타낸다.
도 3에 나타낸 공정은 본 발명의 상응하는 헤모글로빈 소단위, 이량체, 또는 사량체를 발현시키기 위하여 상응하는 DNA 작제물을 운반하기 위한 발현 벡터 설계로 형질전환된 숙주 시스템내에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 표준 분자 화학 기술을 기준으로 한다. 상기 재조합 단백질을 발현할 수 있는 다른 가능한 방법은 또한 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위를 발현시키는데 사용될 수 있다. 초기에, 상응하는 헤모글로빈 소단위를 발현시키기 위한 DNA 작제물을 운반하는 형질전환된 숙주 세포를 사용한 씨드 배양물(seed culture)을 발효(302)를 위해 제조한다(301). 세포를 원심분리에 의해 수거한다(302). 수거된 세포는 이후에 분해하여 조 단백질을 분리한다(303). 이후에, 조 단백질을 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제한다(304). 친화성 크로마토그래피로부터의 용출물 속의 염을 탈염 컬럼(desalting column) 및/또는 한외여과로 정제한다(305). 반-정제된 단백질을 이온-교환 컬럼 크로마토그래피로 정제하여(306) 단백질 불순물 및 내독소를 제거한다(307). 본 발명의 공정은 재조합 단량체성, 이량체성 및 사량체성 헤모글로빈의 대규모 산업적 생산에 적용가능하다. 또한 약제학적 담체(예를 들면, 캅셀내 물, 생리학적 완충제)와 함께 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위는 포유동물 용도로 적합하다.
상이한 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 소단위의 작제 및 발현은 이. 콜라이(E. coli)내에서 수행한다. 예를 들면, 감마-1(γ1) 소단위의 발현을 위한 DNA 작제물을 운반하는 발현 벡터로 형질전환된 이. 콜라이 JM109(DE3)을 씨딩하고 약 16시간 동안 배양하여 세포 분해 및 단백질 추출을 위해 세포를 수거한다. 치.감마-1(γ1) 소단위를 발현시키기 위한 이. 콜라이 JM109(DE3)의 성장 곡선은 도 4에 나타낸다. 이후에, 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위는 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제한다. 본 발명에 따라 발현되고 정제된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)는 도 5의 (A)에 나타나 있으며 본 발명의 공정에 따라 발현되고 정제된 재조합 헤모글로빈 이량체 및 사량체는 도 5의 (B)에 나타나 있다. 도 6은 헴이 있거나 없는 정제되지 않았지만 형광성 표지된 소단위를 나타낸다.
본 발명에서 헤모글로빈의 50 퍼센트 포화를 생산하는데 필수적인 산소 분압을 의미하는, 시험 화합물의 p50 값을 측정하여 그 결과를 도 7에 나타낸다. 천연의 사람 헤모글로빈은 대략 23 내지 30mm Hg의 순서로 p50 값을 갖는다. 도 7은 (A) 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2) 및 (B) 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)에 대한 산소 평형 곡선을 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 재조합 헤모글로빈 사량체 2αβ2는 ~15mmHg의 순서로 p50 값을 가지며 재조합 헤모글로빈 사량체 2αγ12는 ~21mmHg의 순서로 p50 값을 갖는다. 23 내지 30mmHg의 순서의 p50 값을 갖는 천연의 사람 헤모글로빈과 비교하여, 비교적 보다 높은 산소 친화성을 지니고 대략 23mmHg 미만의 보다 낮은 p50 값을 갖는 재조합 헤모글로빈이 형성된다. 보다 낮은 산소 친화성을 지닌 헤모글로빈-계 산소 담체를 함유하는 조성물은, 신속한 산화가 심한 혈액 손실(예를 들면, 출혈성 쇼크)로부터 생성되는 조직 저산소증의 경우에 요구되는 경우에 사용된다. 보다 낮은 산소 친화성은, 물질이 산소를 보다 높은 산소 친화성을 지닌 물질보다 더 용이하게 표적으로 "오프로드(offolad)" 시킬 수 있음을 의미한다. 보다 높은 산소 친화성을 지닌 조성물은 암 치료시 산화 보조 치료제로서 유용하며, 여기서 산소의 보다 낮은 전달 속도가 이러한 경우에 요구된다.
산소-고갈 장애의 치료에 및 심장 보호를 위해 사용하기 위해, 본 발명의 보다 낮은 산소 친화성을 지닌 헤모글로빈-계 산소 담체-함유 약제학적 조성물은 산소를 표적 기관 또는 대상체에게 제공한다. 보다 낮는 산소 친화성을 지닌 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 신속한 조직 산화(예를 들면, 출혈성 쇼크 및 생체외 기관 보호)를 필요로 하는 적용에 유용하다.
암 치료시 적용을 위해, 본 발명의 보다 높은 산소 친화성을 지닌 헤모글로빈-계 산소 담체-함유 약제학적 조성물은 조직 산화제로서 제공되어 종양 조직내에서 산화를 증진시킴으로써 화학- 및 방사선 민감성을 향상시킨다. 비교적 높은 산소 친화성을 지닌 본 발명의 재조합 헤모글로빈은 보다 낮은 산화율을 필요로 하는 적용(예를 들면, 암 보조 치료요법)에 유용하다.
ESI-MS는 매우 큰 분자의 분석을 허용한다. 이는 단백질을 이온화하여, 질량/전하 비를 기준으로 하여 이온화된 단백질을 분리함으로써 고 분자량 화합물을 분석하는 이온화 기술이다. 따라서, 분자량 및 단백질 상호작용은 정밀하게 측정될 수 있다. 전자분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS)을 사용하여 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단량체, 이량체 및 사량체를 분석하고 특성화한다. 도 8은 재조합 헤모글로빈 이량체 (αβ)에 대한 전자분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS) 분석을 나타낸다. α 소단위의 크기는 15,189 Da이고 β 소단위의 크기는 15,899 Da이다. 도 9는 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2)에 대한 전자분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS) 분석을 나타낸다. β 소단위의 크기는 15,899 Da이고 2α의 크기는 30,356 Da이다. 이러한 분석으로부터, 2αβ2의 추정된 총 분자 크기는 약 46 KDa이다. ESI-MS는 또한 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12), 다른 재조합 헤모글로빈 이량체 및 단량체에 대해 수행한다.
본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위를 사용하여 암 치료, 출혈성 쇼크와 같은 산소-고갈 장애, 및 저 산소 함량 환경(예를 들면, 심장 이식) 하에서 심장 보호를 위해 조직 산화용 의약을 생산한다. 본 발명의 재조합 헤모글로빈 사량체의 용량은 대략 0.03g/kg 이하의 동물의 체중 또는 0.0024g/kg 이하의 사람의 체중(사람 투여량은 산업 및 검토자를 위한 FDA 안내에 따라 마우스에 대한 투여량을 12.3의 계수로 나누어 측정한다: Estimating the Safety Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, November 18, 2002).
암 치료에 유용한 의약의 경우, 본 발명의 헤모글로빈-계 산소-담체-함유 약제학적 조성물은 종양 조직에서 산화를 증진시키기 위한 조직 산화제로서 제공되어 화학-민감성(예를 들면, 화학치료요법에 대한 민감성) 및 방사선 민감성을 향상시킨다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암 세포를 표적화하고 사멸할 수 있는 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제를 포함한다. 도 6은 형광성 염료로 표지된, 헴이 있거나 없는 정제된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)를 나타낸다. 형광성 표지된 재조합 헤모글로빈 소단위는 또한 암 세포(예를 들면, 간암 세포, HepG2)내로 도입되어 거기에 국재화되며, 그 결과는 도 10에 나타낸다. 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 또한 암 세포 및 후대 세포/암 줄기 세포를 효과적을 사멸시킬 수 있는 것으로 예측된다.
일부 통상의 치료학적 약물(예를 들면, 화학치료학적 약물, 5FU)은 높은 독성으로 인하여 고 투여량으로 사용될 수 없다. 본 발명에서, 화학치료제, 예를 들어, 5FU는 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 이의 어떠한 소단위 또는 재조합 헤모글로빈 소단위 자체에 화학적으로 연결된다. 현재 특허청구된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 이의 소단위에 연결된 화학치료제는, 현재 특허청구된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위가 암성 세포의 세포질내에서 화학치료제의 국재화를 촉진시켜 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위 및 화학치료제 둘 다의 효능을 증가시키기 때문에, 단독으로 투여되는 암에 대한 다른 통상의 방법/제제보다 투여량에 있어 보다 적을 수 있다. 본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 또한 암 또는 종양, 특히 암 치료용의 이들 통상의 치료학적 약물에 대해 보다 내성인 저산소성인 것들에 있어서 방사선치료제 및/또는 다른 항암 약물의 효능을 증진시킬 수 있다. 도 11은 (A) 5FU-연결된 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2) 및 (B) 5FU-연결된 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)에 대한 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS) 결과를 나타낸다. 5FU는 재조합 헤모글로빈 사량체에 성공적으로 화학적 연결된다. 이는 또한 다른 화학적으로 연결된 재조합 헤모글로빈 이량체 및 재조합 헤모글로빈 소단위(또는 단량체)에 적용된다.
재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 이의 소단위는 치료학적 약물에 연결되기 전에 상이한 작용성 그룹에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체 또는 이량체 또는 이의 소단위는 하나 이상의 다음의 화합물(들) 또는 반응(들)에 의해 변형될 수 있다: (1) 아민 반응의 경우: 알데하이드, 케톤, NHS 에스테르, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 플루오로페닐 에스테르 및 카보닐 아지드를 포함하는 활성화된 에스테르, 설포닐 클로라이드, 카보닐에 이은 환원적 아민화, 에폭사이드, 카보네이트, 플루오로벤젠, 이미도에스테르, 하이드록시메틸 포스핀 유도체, 만니히 응축(mannich condensation), 디아조늄 유도체, 4-설포-2, 3, 5, 6-테트라플루오로페놀, 카보닐 디이미다졸, 설포-NHS, 및 피리독살-5-포스페이트-계 생체모방의 탈아민화에 의한 N-말단 변형; (2) 티올 반응의 경우: 말레이미드, 알킬 할라이드, 할로아세트아미드, 디설파이드, 티오설페이트, 아지리딘-함유 시약, 아크릴로일 유도체, 아릴화제, 및 비닐설폰 유도체; (3) 카복실레이트 반응의 경우: 디아조알칸 및 디아조아세틸 화합물, 카보닐디이미다졸, 및 카보디이미드; (4) 하이드록실 반응의 경우: 에폭사이드 및 옥시란, 카보닐디이미다졸, 카보네이트, 클로로포르메이트, 화학적 및 효소적 산화, 알킬 할로겐, 및 이소시아네이트; (5) 티오에스테르를 사용한 천연의 화학적 연결; (6) 하이드록실아민, 하이드라진, 또는 하이드라지드, 카보디이미드와의 커플링을 위해 알데하이드를 생성시키기 위한 N-말단 세린 또는 트레오닌의 퍼요오데이트 산화(periodate oxidation)를 사용한 N-말단 변형; (7) 생물직교 작용성의 혼입의 경우: 알킨 및 아지드와 알킨 및 아지드의 쌍극 첨가 휴이스겐(Huisgen) 1,3-쌍극 첨가를 포함하는 후속적인 생물직교 접합 반응, 아지드와 트리아릴포스핀의 스타우딩거 연결(Staudinger ligation), 알켄과 테트라진의 디엘스-알더 반응(Diels-alder reaction), 및 알켄과 테트라졸의 커플링; (8) 광화학적 반응의 경우: 광친화성 표지화제, 디아지린 유도체, 벤조페논 및 안트라퀴논; (9) 금속-매개된 반응의 경우: 금속 카르베노이드 및 백금-활성화된 알킬 시약.
글루타티온(GSH) 수준은 혈류(~1 당량)와 비교하는 경우 암 세포의 세포질(~1000 당량)에서 훨씬 더 높다. 디설파이드 결합을 지닌 치료학적 약물은 GSH의 농도가 높은 암 세포의 세포질내에서 훨씬 더 용이하게 절단될 수 있다. 이황화물 결합을 지닌 치료학적 약물은 GSH 농도가 높은 암 세포의 세포질내에서 보다 더 용이하게 절단될 수 있다. 환원 조건 하에서 이황화물 결합을 지닌 모델 화합물(N-(2-머캅토에틸)벤즈아미드)의 절단을 위한 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석은 도 12에 나타낸다. 모델 화합물의 절단은 37℃에서 글루타티온(GSH)의 농도가 상이한(0.4 내지 1000 당량) PBS 완충제 (pH 7.4) 속에서 관찰된다. 모델 화합물의 절단은 GSH의 높은 농도(＞50 당량)에서 더 우수하다. 본 발명에서, 이황화물 결합에 의해 치료학적 약물(예를 들면, 화학치료제, 방사선치료제, 항암 단백질 약물)에 연결된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위는 암 치료를 위해 제조된다.
재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 시장에서 이용가능하지 않다. 본 발명에서 제공된 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제-함유 약제학적 조성물은 치료학적 효과를 지닌 암 세포를 표적화할 수 있다. 암 치료에서 사용하기 위해, 본 발명의 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제-함유 약제학적 조성물은 항암제로서 제공되어 암 세포를 사멸한다. 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 재조합 헤모글로빈 사량체 또는 이량체 또는 소단위-계 치료제는 보다 낮은 투여량으로 사용될 우수한 후보물질이며 다른 분자 표적화 또는 세포독성제와 함께 조합될 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 영역을 어떠한 방식으로도 한정하는 것을 의도하지 않으면서 본 발명의 구체적인 구현예를 설명하는 방식으로 제공된다.
실시예 1
(a) 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 이의 소단위를 지닌 발현 벡터의 작제
사람 기원의 α/β/γ1/γ2 쇄의 DNA 서열을 합성하여 PUC 57 벡터내로 클로닝한다. α/β/γ1/γ2 쇄를 PCR 방법으로 증폭시킨다. PCR에 사용된 프라이머를 α/β/γ1/γ2 쇄를 기준으로 설계한다. PCR을 구배 열 순환기(Gradient Thermal Cycler)(Life sci) 속에서 수행한다. 반응을 Taq 완충제, 10mM dNTP, 25mM MgCl2, 10μM의 프라이머, 2.5U의 Taq DNA 폴리머라제 및 100ng의 주형 DNA를 함유하는 25μl의 반응 혼합물 속에서 수행한다. 구배 PCR 조건은 95℃에서 3분의 초기 변성 단계에 이어 95℃에서 30초 동안의 변성, 50 내지 55℃에서 30초 동안의 프라이머 어닐링(primer annealing) 및 72℃에서 45초 동안의 연장에 이어 72℃에서 5분의 최종 연장으로 이루어진다. PCR 생성물은 표준 마커와 함께 1.5％ 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리되고 적색 겔로 염색된다. 예측된 크기의 생성물 밴드를 절개하고 DNA 단편을 제조업자의 지시에 따라 PCR 클린-업 겔 추출 키트(PCR clean-up Gel extraction kit)로 추출한다. 정제된 DNA 단편을 pSumo 벡터 또는 PUC 19 벡터 내로 클로닝한다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 DH5a 균주내로 형질전환하고, 형질전환체를 100ng/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 아가(agar)상에서 선택한다. 추정된 클론은 뉴클레오타이드 서열분석으로 입증한다. cDNA 서열의 분석은 BLAST 알고리즘 프로그램을 사용하여 수행한다.
(b) 상이한 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위
7개의 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위를 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이 생성시킨다. α/β/γ1/γ2 쇄의 단백질 서열은 도 2에 나타낸다. 재조합 헤모글로빈 단량체의 경우, α/β/γ1/γ2 쇄는 pSumo 벡터 내로 클로닝하고 융합 단백질 발현은 T7 프로모터로 조절한다. 재조합 헤모글로빈 이종이량체의 경우, α 쇄 및 β/γ1 쇄는 pUC 19 벡터 내에서 및 pTac 프로모터의 조절하에 동시-발현된다. 재조합 헤모글로빈 사량체의 경우, 2개의 α쇄는 글리신 링커로 연결하고 pUC19에서 및 pTac 프로모터의 조절하에서 β/γ1 쇄로 동시 발현시킨다.
상이한 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위
도 2에서의 번호매김 재조합체 발현된 헤모글로빈 소단위/쇄/이량체/사량체
#1

단량체
 α(141개 아미노산)
#2 β(146개 아미노산)
#3 γ1(146개 아미노산)
#4 γ2(146개 아미노산)
#5

이량체

 αβ(287개 아미노산)
#6 αγ1(287개 아미노산)
#7 αγ2(287개 아미노산)
#8 βγ1(292개 아미노산)
#9 βγ2(292개 아미노산)
#10

사량체

 2αβ2(575개 아미노산)
#11 2αγ12(575개 아미노산)
#12 2αγ22(575개 아미노산)
#13 2βγ12(585개 아미노산)
#14 2βγ22(585개 아미노산)
실시예 2
재조합 단백질 발현
재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위의 발현을 위한 플라스미드를 이. 콜라이 JM109(DE3) 또는 이. 콜라이 BL21(DE3)내로 형질전환시킨다. 이. 콜라이 세포를 37℃에서 앰피실린(100mg/ml)이 보충된 LB 배지 속에서 성장시킨다. 진탕 플라스크 발현을 위해, 밤샘 배양물을 100mg/ml 앰피실린이 함유된 LB 배지내로 1:100 첨가한다. 세포를 진탕 플라스크 속에서 37℃에서 600nm에서의 광학 밀도가 0.6에 이를 때까지 성장시킨다. 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위의 발현은 이소프로필 b-티오갈락토피라노시드를 0.4mM에 가함으로써 유도한다. 이후에, 배양물을 헤민(20mg/L)으로 보충하고 성장을 적어도 16시간 동안 28℃에서 지속한다. 발효기 배양을 위해, 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위의 발현을 위해 사용된 배지는 1.28％ 박토트립톤, 0.8％ 박토효모 추출물, 1％ 글리세롤, 25mM KH2PO4, 25mM Na2HPO4, 45mM NH4Cl, 5mM(NH4)2SO4 및 100mg/L 앰피실린을 함유하였다. 세포를 2L 들이 발효기(Sartorius，B) 속에서 30℃에서 600nm에서의 광학 밀도가 8에 이를 때까지 성장시킨다. 재조합 헤모글로빈 단백질/사량체/이량체/소단위의 발현은 이소프로필 b-티오갈락토피라노시드(Sigma)를 mM로 첨가함으로써 유도시킨다. 이후에, 배양물에 헤민(50mg/L)을 보충하고 성장을 적어도 16시간 동안 25℃에서 지속한다. 세포를 원심분리로 수거하고 정제가 요구될 때까지 -80℃ 에서 동결 저장하였다.
실시예 3
진탕 플라스크 및 발효기 속에서 재조합 헤모글로빈을 위한 단백질 수율
재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위의 단백질 수율은 표 2에 요약한다. 발효 방법으로부터의 단백질 수율은 훨씬 더 높으며, 180mg/L에 이를 수 있다.
진탕 플라스크 및 발효에 의한 재조합 사람 헤모글로빈의 단백질 수율
단백질 배양 방법 단백질 수율
단량체-α 플라스크 진탕 20-40 mg/L
단량체-β 플라스크 진탕 20-40 mg/L
단량체-γ1 플라스크 진탕 20-40 mg/L
단량체-γ2 플라스크 진탕 20-40 mg/L
이량체-αβ 플라스크 진탕 5-10 mg/L
이량체-αγ1 플라스크 진탕 5-10 mg/L
사량체-2αβ2 플라스크 진탕 5-10 mg/L
단량체-γ1 발효 180 mg/L
사량체-2αβ2 발효 30-40mg/L
실시예 4
암 세포주를 위한 배양 및 시약
암 세포(HepG2)를 10％ 태아 소 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 들어있는 DMEM(Invitrogen) 속에서 37℃에서 배양하였다. 정상 산소성 조건을 위해, 세포를 주위 O2 농도 및 5％ CO2와 함께 항온처리하고; 저산소성 조건을 위해서, 세포를 0.1 내지 0.5％ O2(Quorum FC-7 자동 CO2/O2/N2 가스 혼합기) 및 5％ CO2와 함께 항온처리한다.
실시예 5
암 세포에서 생 세포 시간경과 현미경(time-lapse microscopy)
암 세포(예를 들면, HepG2 간암 세포)를 유리 바닥 마이크로웰 디쉬(MatTek Corporation)위에 씨딩(seeding)한다. 규정된 줌(zoom)(63x, 20x)에서 생 세포를 대기/온도-조절된 체임버(chamber) 및 다-위치 획득(multi-positional acquisition)을 위해 동력이 달린 스테이지(stage)가 장착된 Zeiss Observer Z1 widefield 현미경을 사용하여 획득한다. 항온처리는 0.1％ O2 및 5％CO2(예비혼합됨)로 퍼징된(purged) 밀폐된 생세포 영상 시스템 속에서 수행한다. 세포를 형광성 표지된 재조합 헤모글로빈 소단위(α, β, γ1, γ2)에 2시간 동안 매 3분마다 영상을 획득하기 전에 15분 동안 노출시킨다. 영상은 풀어서 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 사용하여 시간 경과 영화(time-lapse movie)로 압축시킨다. 영상은 도 10에 나타낸다.
실시예 6
(a) 암 세포 이종이식체에서 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2)의 생체내 효능
누드(nude) balb/c 마우스(5 내지 7주령)를 당해 실시예에서 사용하며 이를 실험 전 1주 동안 적응하도록 한다. 마우스에게 100μl의 신선한 배양 배지 속의 2xl06개 암 세포를 피하 접종한다. 10일 후, 마우스를 대조군 및 치료 그룹으로 무작위로 분리한다. 대조군 그룹에게 100μl의 PBS를 제공하고 치료 그룹(그룹 2 내지 6)에게 약물을 매주(주당 2회, 4주 동안) 복강내 제공한다. 겜시타빈은 항암제("항신생물성" 또는 "세포독성") 화학치료요법 약물이며, 이는 그룹 2, 그룹 4 및 그룹 6에서 사용된다. 종양 크기를 캘리퍼(caliper)로 측정하고 종양 용적은 식: (길이 x 너비2)/2를 사용하여 계산한다. 결과는 도 13에 나타낸다. 결과는, 재조합 헤모글로빈 사량체(2αβ2)가 종양 세포의 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다.
(b) 암 세포 이종이식체에서 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)의 생체내 효능
누드 balb/c 마우스(5 내지 7주 령)를 당해 실시예에서 사용하여 이를 실험 전 1주 동안 적응하도록 한다. 마우스에게 100μl의 신선한 배양 배지 속의 2xl06개 암 세포로 피하 접종한다. 10일 후, 마우스를 대조군 및 치료 그룹으로 무작위로 분리한다. 대조군 그룹에게 100μl의 PBS를 제공하고 치료 그룹(그룹 2 내지 6)에게 약물을 매주(주당 2회, 4주 동안) 복강내 제공한다. 겜시타빈은 항암제("항신생물성" 또는 "세포독성") 화학치료요법 약물이며, 이는 그룹 2, 그룹 4 및 그룹 6에서 사용된다. 종양 크기를 캘리퍼로 측정하고 종양 용적은 식: (길이 x 너비2)/2를 사용하여 계산한다. 결과는 도 14에 나타낸다. 결과는 재조합 헤모글로빈 사량체(2αγ12)가 종양 세포의 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 다른 화학치료요법 약물(겜시타빈)과 조합하는 경우 보다 우수한 결과를 제공한다. 암 치료, 전이 억제 및/또는 재발 감소에 있어 상승 효과가 관찰된다.
산업적 이용가능성
본 발명의 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위는 암에 대한 통상의 치료학적 약물에 대해 내성일 수 있는 암 세포 또는 조직 또는 종양을 표적화함에 있어서 산화에 유용하다. 본 발명의 화학적으로 변형된 재조합 헤모글로빈 단백질 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위는 또한 생체내에서 절단되거나 분해될 수 있으므로 세포 독성 효과가 투여되는 대상체에 대해 생성되지 않는다. 하나 이상의 통상의 치료학적 약물과 연결되도록 배열된 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위는 환자내 일부 유형의 암 또는 특정 단계의 암에서 내성 문제를 극복할 수 있다. 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위는 약제학적 조성물로 제형화되기 위해 용이하게 사용되며 하나 이상의 치료학적 약물에 연결되거나 연결되지 않은 치료학적 유효량의 재조합 헤모글로빈 단백질 및/또는 사량체 및/또는 이량체 및/또는 소단위를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 조직의 산화, 출혈성 쇼크 및 산소-고갈된 질병의 치료, 및/또는 약물-내성 암 세포/조직을 표적화하는 것을 포함하는 다양한 적용에서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Wong, Bing Lou <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT HEMOGLOBIN PROTEIN OR SUBUNIT-BASED THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER TARGETING TREATMENT <130> P7797US01 <150> US 62/019,925 <151> 2014-07-02 <150> US 14752999 <151> 2015-06-28 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys 1 5 10 15 Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met 20 25 30 Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 35 40 45 Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala Asp 50 55 60 Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu 65 70 75 80 Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val 85 90 95 Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His 100 105 110 Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu 20 25 30 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu 35 40 45 Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly 50 55 60 Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn 65 70 75 80 Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu 85 90 95 His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys 100 105 110 Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala 115 120 125 Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys 130 135 140 Tyr His 145 <210> 3 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu Leu 20 25 30 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn Leu 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly 50 55 60 Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Thr Lys His Leu Asp Asp 65 70 75 80 Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu 85 90 95 His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Thr 100 105 110 Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln Ala 115 120 125 Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser Arg 130 135 140 Tyr His 145 <210> 4 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu Leu 20 25 30 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn Leu 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly 50 55 60 Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp Asp 65 70 75 80 Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu 85 90 95 His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Thr 100 105 110 Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln Ala 115 120 125 Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Gly Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser Arg 130 135 140 Tyr His 145

Claims (51)

  1. 산소 담체로서 재조합 헤모글로빈 사량체, 이량체, 및/또는 소단위를 포함하고, 동물 또는 사람 공급원으로부터 분리되고/되거나 정제된 천연의 또는 본래의 헤모글로빈 분자를 공급 대체하는, 헴(heme)이 있거나 없는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위가 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 기원한 141 내지 146개 아미노산의 서열을 기준으로 하여 작제되고 발현된 재조합 헤모글로빈 단량체인 재조합 헤모글로빈 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 이량체가 어떠한 2개의 재조합 헤모글로빈 소단위를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 재조합 헤모글로빈 단량체이고 호모 사피엔스로부터 기원한 141 내지 146개의 아미노산의 서열을 갖는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 사량체가 어떠한 4개의 재조합 헤모글로빈 소단위를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 재조합 헤모글로빈 단량체이며 호모 사피엔스로부터 기원한 141 내지 146개의 아미노산 서열을 갖는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위가 각각 서열 번호: 1 내지 4의 알파 소단위, 베타 소단위, 감마-1 소단위, 및 감마-2 소단위를 포함하는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 이량체가 알파-베타 이종이량체, 알파-감마-1 이종이량체, 알파-감마-2 이종이량체, 베타-감마-1 이종이량체, 및 베타-감마-2 이종이량체를 포함하며, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각이 서열 번호: 1 내지 4 중의 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 사량체가 2αβ2, 2αγ12, 2αγ22, 2βγ12, 및 2βγ22 사량체를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각이 서열 번호: 1 내지 4 중의 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위가 적어도 하나의 폴리-N 또는 His 태그를 포함하거나 이를 포함하지 않는 재조합 헤모글로빈 단백질.
  9. 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 및/또는 소단위를 암호화하는 융합 유전자를 작제하는 단계, 상기 융합 유전자를 벡터내로 삽입하는 단계, 상기 벡터를 숙주 유기체내로 삽입하는 단계 및 청구항 1에 따른 상기 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위를 발현시키는 단계를 포함하여, 청구항 1의 재조합 헤모글로빈 분자를 제조하는 방법.
  10. 약제학적으로 허용되는 담체 속에 청구항 1에 따른 재조합 헤모글로빈 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 청구항 1에 따른 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체, 및/또는 소단위 및 하나 이상의 화학치료제, 방사선치료제, 세포 표지화제, 또는 형광성 표지제 로부터 선택된 활성제를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 및/또는 소단위는 활성제에 직접적으로 접합되거나 절단가능한 또는 절단가능하지 않은 링커를 통해 상기 활성제에 간접적으로 접합된 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위가 호모 사피엔스로부터 기원한 141 내지 146개 아미노산의 서열을 기준으로 하여 작제되고 발현된 재조합 헤모글로빈 단량체인 치료제.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 이량체가 재조합 헤모글로빈 소단위 중의 어떠한 2개를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 재조합 헤모글로빈 단량체이며 호모 사피엔스로부터 기원한 141 내지 146개의 아미노산을 갖는 치료제.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 사량체가 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 중의 어떠한 4개를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 재조합 헤모글로빈 단량체이며 호모 사피엔스로부터 기원한 141 내지 146개의 아미노산을 갖는 치료제.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 단백질이 상기 재조합 헤모글로빈 단백질의 하나 이상의 소단위에서 상기 링커 분자(들) 중의 하나 이상과 연결되는 치료제.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 단백질이 폴리-N 또는 His 태그 중의 적어도 하나를 포함하거나 이를 포함하지 않는 치료제.
  17. 청구항 12에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위가 각각 서열 번호: 1 내지 4의 알파 소단위, 베타 소단위, 감마-1 소단위, 및 감마-2 소단위를 갖는 치료제.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 이량체가 알파-베타 이종이량체, 알파-감마-1 이종이량체, 알파-감마-2 이종이량체, 베타-감마-1 이종이량체, 및 베타-감마-2 이종이량체를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 서열 번호: 1 내지 4 중의 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 사량체가 2αβ2, 2αγ12, 2αγ22, 2βγ12, 및 2βγ22 사량체를 포함하고, 상기 재조합 헤모글로빈 소단위 각각은 서열 번호: 1 내지 4 중의 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 치료제.
  20. 청구항 11에 있어서, 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체, 또는 소단위가 상기 활성제에 접합되기 전에 하나 이상의 작용성 그룹에 의해 화학적으로 변형되며, 상기 화학적 변형은 상기 재조합 헤모글로빈 분자를 상기 화학적 변형에 대한 상이한 화학 반응과 관련하여 다음의 화합물(들) 중의 하나 이상과 반응시킴을 포함하는 치료제:
    a) 아민 반응의 경우, 알데하이드, 케톤, NHS 에스테르, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 플루오로페닐 에스테르 및 카보닐 아지드를 포함하는 활성화된 에스테르, 설포닐 클로라이드, 카보닐에 이은 환원적 아민화, 에폭사이드, 카보네이트, 플루오로벤젠, 이미도에스테르, 하이드록시메틸 포스핀 유도체, 만니히 축합(mannich condensation), 디아조늄 유도체, 4-설포-2, 3, 5, 6-테트라플루오로페놀, 카보닐 디이미다졸, 설포-NHS, 및 피리독살-5-포스페이트-계 생체모방의 탈아민화에 의한 N-말단 변형;
    b) 티올 반응의 경우, 말레이미드, 알킬 할라이드, 할로아세트아미드, 디설파이드, 티오설페이트, 아지리딘-함유 시약, 아크릴로일 유도체, 아릴화제, 및 비닐설폰 유도체;
    c) 카복실레이트 반응의 경우, 디아조알칸 및 디아조아세틸 화합물, 카보닐디이미다졸, 및 카보디이미드를 포함하는 관련된 화합물;
    d) 하이드록실 반응의 경우, 에폭사이드 및 옥시란, 카보닐디이미다졸, 카보네이트, 클로로포르메이트, 화학적 및 효소적 산화, 알킬 할로겐, 및 이소시아네이트를 포함하는 관련된 화합물;
    e) 천연의 화학적 연결의 경우, 티오에스테르를 포함하는 관련된 화합물;
    f) N-말단 변형의 경우, 하이드록실아민, 하이드라진, 또는 하이드라지드, 카보디이미드와의 커플링을 위해 알데하이드를 생성시키기 위한 N-말단 세린 또는 이의 퍼요오데이트 산화를 사용한 트레오닌을 포함하는 관련된 화합물;
    g) 생물직교 작용성의 혼입의 경우, 쌍극 첨가 휴이겐(Huisgen) 1,3-쌍극 첨가를 포함하는 후속적인 생물직교 접합 반응, 아지드와 트리아릴포스핀의 스타우딩거 연결(Staudinger ligation), 알켄과 테트라진의 디엘스-알더 반응(Diels-alder reaction), 및 알켄과 테트라졸의 커플링을 갖는 알킨 및 아지드를 포함하는 관련된 화합물;
    h) 광화학적 반응의 경우, 광친화성 표지화제, 디아지린 유도체, 벤조페논 및 안트라퀴논을 포함하는 관련된 화합물;
    i) 금속-매개된 반응의 경우, 금속 카르베노이드 및 백금-활성화된 알킬 시약을 포함하는 관련된 화합물.
  21. 청구항 11에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 카르비놀아민, 디설파이드, 카르바미드, 아미날, 카보네이트, 에스테르, 카바메이트, 포스페이트, 아미드, 아세탈, 이민, 옥심, 에테르, 및 설폰아미드 그룹 링커를 포함하는 치료제.
  22. 청구항 11에 있어서, 상기 절단가능하지 않은 링커가 알킬 및 아릴 그룹 링커인 치료제.
  23. 청구항 11에 있어서, 상기 화학치료제가 5-플루오로우라실, 테모졸로마이드, 시스플라틴 및 다른 항암 약물인 치료제.
  24. 청구항 11에 있어서, 상기 방사선치료제가 로듐-105 복합체, 사마륨-153 복합체 및 다른 관련 복합체인 치료제.
  25. 청구항 11에 있어서, 상기 세포 또는 형광성 표지화제가 하나 이상의 형광성 단백질, 비-단백질 유기 형광단, 형광성 나노입자 및 금속-계 발광성 염료를 포함하는 치료제.
  26. 청구항 11에 있어서, 상기 암이 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인두암, 식도암, 전립샘 암, 위암 및 뇌암을 포함하는 치료제.
  27. 치료학적 유효량의 청구항 11에 따른 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위-계 치료제를 포함하고, 암으로 고생하는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 약제학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 치료제의 치료학적 유효량이 상기 대상체의 kg당 0.0024g 이하이고 상기 대상체가 사람인 조성물.
  29. 청구항 27에 있어서, 상기 치료제의 치료학적 유효량이 상기 대상체의 kg당 0.03g 이하이고 상기 대상체가 사람인 조성물.
  30. 청구항 27에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체, 염, 완충제, 물, 또는 이의 조합물을 추가로 포함하는 조성물.
  31. 청구항 27에 있어서, 상기 투여 경로가 정맥내 주사, 복강내 주사, 및 피하 주사이고, 상기 조성물의 투여가 단일 투여량 또는 주당 1회의 다중 투여량일 수 있는 조성물.
  32. 청구항 27에 있어서, 상기 암이 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인두암, 식도암 및 뇌암을 포함하는 조성물.
  33. 청구항 27에 있어서, 상기 암이 간세포 암종, 간암 선조세포-유도된 종양, 교아종, 또는 삼중 음성 선조세포-유도된 종양을 포함하는 종양인 조성물.
  34. 청구항 27에 있어서, 조성물이 5.5 내지 9.5 범위의 pH를 갖는 약제학적 조성물.
  35. 청구항 27에 있어서, 조성물이 7.2 내지 8.0의 pH를 갖는 약제학적 조성물.
  36. a) 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위를 제공하는 단계;
    b) 상이한 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위를 정제하는 단계;
    c) 가교-결합제에 의해 상기 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체를 안정화시켜 가교-결합된 재조합 헤모글로빈 단백질 또는 사량체를 형성시키는 단계;
    d) 하나 이상의 작용성 그룹과 반응시킨 후 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위를 활성제와 접합시키거나, 활성제를 절단가능하거나 절단가능하지 않은 링커와 접합시켜 상기 접합체를 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위에 연결시키기 전에 링커-활성제 접합체를 형성시킴을 포함하여 상기 재조합 헤모글로빈 단백질, 사량체, 이량체 또는 소단위를 화학적으로 변형시키는 단계를 포함하여, 청구항 11에 따른 치료제를 제조하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 화학적으로 변형시키는 단계가 다음의 반응 또는 변형 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    a) 아민 반응(여기서, 관련된 화합물은 알데하이드, 케톤, NHS 에스테르, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 플루오로페닐 에스테르 및 카보닐 아지드를 포함하는 활성화된 에스테르, 설포닐 클로라이드, 카보닐에 이은 환원적 아민화, 에폭사이드, 카보네이트, 플루오로벤젠, 이미도에스테르, 하이드록시메틸 포스핀 유도체, 만니히 축합, 디아조늄 유도체, 4-설포-2, 3, 5, 6-테트라플루오로페놀, 카보닐 디이미다졸, 설포-NHS, 및 피리독살-5-포스페이트-계 생체모방의 탈아민화에 의한 N-말단 변형을 포함한다);
    b) 티올 반응(여기서, 관련된 화합물은 말레이미드, 알킬 할라이드, 할로아세트아미드, 디설파이드, 티오설페이트, 아지리딘-함유 시약, 아크릴로일 유도체, 아릴화제, 및 비닐설폰 유도체를 포함한다);
    c) 카복실레이트 반응(여기서, 관련된 화합물은 디아조알칸 및 디아조아세틸 화합물, 카보닐디이미다졸, 및 카보디이미드를 포함한다);
    d) 하이드록실 반응(여기서, 관련된 화합물은 에폭사이드 및 옥시란, 카보닐디이미다졸, 카보네이트, 클로로포르메이트, 화학적 및 효소적 산화, 알킬 할로겐, 및 이소시아네이트를 포함한다);
    e) 천연의 화학적 연결(여기서, 관련된 화합물은 티오에스테르를 포함한다);
    f) N-말단 변형(여기서, 관련된 화합물은 하이드록실아민, 하이드라진, 또는 하이드라지드, 카보디이미드와의 커플링을 위해 알데하이드를 생성시키기 위한 N-말단 세린 또는 이의 퍼요오데이트 산화를 생성하는 트레오닌을 포함한다);
    g) 생물직교 작용성의 혼입(여기서, 관련된 화합물은 알킨 및 아지드의 쌍극 첨가 휴이겐 1,3-쌍극 첨가를 포함하는 후속적인 생물직교 접합 반응, 아지드와 트리아릴포스핀의 스타우딩거 연결, 알켄과 테트라진의 디엘스-알더 반응, 및 알켄과 테트라졸의 커플링을 갖는 알킨 및 아지드를 포함한다);
    h) 광화학적 반응(여기서, 관련된 화합물은 광친화성 표지화제, 디아지린 유도체, 벤조페논 및 안트라퀴논을 포함한다);
    i) 금속-매개된 반응(여기서, 관련된 화합물은 금속 카르베노이드 및 백금-활성화된 알킬 시약을 포함한다).
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 카비놀라민, 디설파이드, 카바미드, 아미날, 카보네이트, 에스테르, 카바메이트, 포스페이트, 아미드, 아세탈, 이민, 옥심, 에테르 또는 설폰아미드 그룹 링커를 포함하는 방법.
  39. 청구항 36에 있어서, 상기 비-절단가능한 링커가 알킬 또는 아릴 그룹 링커를 포함하는 방법.
  40. 청구항 36에 있어서, 상기 활성제가 5-플루오로우라실, 테모졸로마이드, 시스플라틴 및 다른 항암 약물을 포함하는 화학치료제인 방법.
  41. 청구항 36에 있어서, 상기 활성제가 하나 이상의 형광성 단백질, 비-단백질 유기 형광단, 형광성 나노입자 및 금속-계 발광성 염료를 포함하는 세포-형광성 표지제인 방법.
  42. 동물 또는 사람 대상체로부터 또는 이들내에서 조직을 국소적으로 산화시키기 위한 청구항 10에 따르는 조성물의 용도.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 조직이 암성 종양 조직인 용도.
  44. 청구항 42에 있어서, 상기 조직이 저산소성인 용도.
  45. 청구항 42에 있어서, 상기 조직이 생체외(ex vivo)인 용도.
  46. 청구항 42에 있어서, 상기 조직이 정상의 유기 조직인 용도.
  47. 이를 필요로 하는 동물 또는 사람 대상체에서 산소-고갈 장애를 치료하기 위한 의약의 제조시 청구항 10에 따르는 조성물의 용도.
  48. 이를 필요로 하는 동물 또는 사람 대상체에서 출혈성 쇼크를 치료하기 위한 의약의 제조시 청구항 10에 따르는 조성물의 용도.
  49. 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포의 세포자멸사를 표적화하고 유도하기 위한, 치료학적 유효량의 청구항 11에 따르는 치료제를 포함하는 의약을 제조하는데 있어서 청구항 11에 따르는 치료제의 용도.
  50. 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 전이를 억제하고 재발을 감소시키기 위한, 치료학적 유효량의 청구항 11에 따르는 치료제를 포함하는 의약을 제조하는데 있어서 청구항 11에 따르는 치료제의 용도.
  51. 암 세포 또는 종양 세포 또는 선조 세포 또는 암 줄기 세포의 생-세포 영상화 및 진단적 영상화를 위한 청구항 11에 따르는 치료제의 용도.
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