JPWO2016171107A1 - Fgfr2の検出 - Google Patents
Fgfr2の検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2016171107A1 JPWO2016171107A1 JP2017514116A JP2017514116A JPWO2016171107A1 JP WO2016171107 A1 JPWO2016171107 A1 JP WO2016171107A1 JP 2017514116 A JP2017514116 A JP 2017514116A JP 2017514116 A JP2017514116 A JP 2017514116A JP WO2016171107 A1 JPWO2016171107 A1 JP WO2016171107A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- antibody
- acid sequence
- hfgfr2iiic
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
- G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
Abstract
Description
本発明は、
(1)
以下の性質(i)乃至(iii)を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIcに特異的に結合する;
(ii)非変性型のヒト1型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR1)、非変性型のヒト3型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR3)、及び、非変性型のヒト4型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR4)には特異的に結合しない;
(iii)ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIcに特異的に結合する、
(2)
非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIb、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIbに特異的に結合する、(1)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
(3)
配列番号30(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号31(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号32(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号33(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号34(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号35(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(4)
配列番号30(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号31(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号32(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号33(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号34(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号35(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、(3)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(5)
下記(i)乃至(iv)のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列;
(ii)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列;
(iv)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、
配列番号21(図18B)に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号23(図18D)に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(7)
(3)乃至(6)に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するhFGFR2IIIc及び/又はhFGFR2IIIb上の部位に結合するか、又は、hFGFR2IIIc及び/又はhFGFR2IIIbへの結合において、(3)乃至(6)に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(8)
非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIb、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIbには結合しない、(1)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(9)
配列番号24(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号26(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号27(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号28(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号29(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、(1)又は(8)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(10)
配列番号24(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号26(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号27(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号28(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号29(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、(9)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
下記(i)乃至(iv)のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、(1)又は(8)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列;
(ii)配列番号3(14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列;
(iv)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、
(12)
配列番号15(図17B)に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号19(図17D)に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、(1)、 (8)乃至(11)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(13)
(9)乃至(12)に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するhFGFR2IIIc上の部位に結合するか、又は、hFGFR2IIIcへの結合において、(9)乃至(12)に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、(1)又は(8)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(14)
(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、
(15)
(14)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(14)に記載のポリヌクレオチド又は(15)に記載のベクターを含む細胞、
(17)
下記の工程(i)及び(ii)を含む、(1)、(2)又は(8)に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(i)(16)に記載の細胞を培養する工程;
(ii)工程(i)の培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収する工程、
(18)
(17)に記載の方法により得られるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
(19)
(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、
(20)
(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法に使用される、(19)に記載の組成物、
該標本が、脱パラフィン処理された後に、加熱処理により賦活化処理される、(20)に記載の組成物、
(22)
加熱処理が、90乃至100℃、pH8乃至10で行われることを特徴とする、(21)に記載の組成物、
(23)
(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は(19)に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法に使用される、(19)乃至(22)のいずれか一つに記載の組成物、
(24)
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法が、被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、(23)に記載の組成物、
(25)
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、(19)乃至(24)に記載の組成物、
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査又は診断方法が、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、(25)に記載の組成物、
(27)
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患がhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性癌である、(25)又は(26)に記載の組成物、
(28)
下記(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物:
(i)(19)乃至(23)又は(25)のいずれか一つに記載の組成物を用いてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出又は測定された被検標本の由来する被験者;
(ii)(24)に記載の組成物を用いたhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(iii)(26)又は(27)に記載の組成物を用いて、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者、
(29)
下記の工程(i)、又は(i)及び(ii)を含む、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出または測定方法:
(i)(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合断片又は(19)乃至(22)に記載の組成物と被検標本を接触させる工程、
(ii)該被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されたか、または該被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、該被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されなかったか、また該被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程、
(30)
下記の工程(i)、又は(i)及び(ii)を含む、hFGFR2に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する個体の同定方法:
(i)(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片又は(19)乃至(22)に記載の組成物と個体由来のサンプルを接触させる工程、
(ii)該個体由来のサンプルにおいてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されたか、または該個体由来のサンプルにおけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該個体を陽性と判定し、該個体由来のサンプルにおいてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されなかったか、また該個体由来のサンプルにおけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該個体を陰性と判定する工程、
下記の工程(i)乃至(iii)を含むことからなる、hFGFR2IIIcを検出または測定する方法:
(i)(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のhFGFR2IIIbとhFGFR2IIIcを検出または測定する工程;
(ii)hFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のhFGFR2IIIbを検出または測定する工程;
(iii)(i)の検出または測定の結果と(ii)の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは(i)の検出または測定の結果から(ii)の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のhFGFR2IIIcを検出または測定の結果または値を得る工程、
(32)
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査または診断方法に使用される、(29)乃至(31)に記載の方法、
(33)
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患を罹患しているもしくはそのリスクがある個体の同定方法に使用される、(30)に記載の方法、
(34)
(28)の(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に対し、hFGFR2に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療方法、
(35)
(1)乃至(7)および(18)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含有する、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患を検査又は診断するためのキット、
hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患がhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性癌である、(32)乃至(34)に記載の方法又は(35)に記載のキット、
(37)
(1)、(8)乃至(13)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、
(38)
(1)、(8)乃至(13)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のhFGFR2IIIcの検出又は測定方法に使用される、(37)に記載の組成物、
(39)
該標本が、脱パラフィン処理された後に、酵素処理により賦活化される、(38)に記載の組成物、
(40)
酵素処理が、20乃至38℃での蛋白質分解酵素の反応であることを特徴とする、(39)に記載の組成物、
(1)、(8)乃至(13)および(18)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は(37)に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のhFGFR2IIIcの検出又は測定方法に使用される、(37)乃至(40)に記載の組成物、
(42)
hFGFR2IIIcの検出又は測定方法が、被検標本においてhFGFR2IIIcが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIcの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてhFGFR2IIIcが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIcの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、(41)に記載の組成物、
(43)
hFGFR2IIIc陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、(37)乃至(42)のいずれか一つに記載の組成物、
(44)
hFGFR2IIIc陽性疾患の検査又は診断方法が、hFGFR2IIIcの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、(43)に記載の組成物、
(45)
hFGFR2IIIc陽性疾患がhFGFR2IIIc陽性癌である、(43)又は(44)に記載の組成物、
下記(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物:
(i)(37)乃至(40)及び(43)のいずれか一つに記載の組成物を用いてhFGFR2IIIcが検出又は測定された被検標本の由来する被験者;
(ii)(42)に記載の組成物を用いたhFGFR2IIIcの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(iii)(44)又は(45)に記載の組成物を用いて、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者、及び、
(47)
hFGFR2IIIc陽性疾患がhFGFR2IIIc陽性癌である、(46)に記載の医薬組成物、等に関する。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド(RNA)とデオキシリボヌクレオチド(DNA)が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「FGFR2遺伝子」としては、例えば、FGFR2蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等をあげることができる。
2.抗原蛋白質
(2−1)特性
FGFRsは線維芽細胞増殖因子(FGF)に結合する受容体蛋白質である。本発明において、FGFRsは脊椎動物由来、好適には哺乳動物由来であり、より好適にはヒト由来である。ヒトFGF及びFGFRsは、22のFGF(FGF1乃至14、および、FGF16乃至23)、ならびにチロシンキナーゼドメインを有する4つのFGFR(FGFR1乃至4)にそれぞれ分類される。FGFRsは、2つあるいは3つの免疫グロブリン様ドメイン(IgD1乃至3)から成るリガンド結合部位を含む細胞外領域、1回膜貫通領域、およびチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成されている。このうち、FGFR1、FGFR2およびFGFR3には、IIIbおよびIIIcと呼ばれる各2つのスプライシングバリアントが存在する。これらのアイソフォームはIgD3の後半において約50のアミノ酸配列が異なっており、異なる組織分布およびリガンド特異性を示す。FGFRsは次のような活性を有する:(1)FGFに結合する;(2)かかる結合によりFGFRsは二量体化する;(3)かかる二量体化によりFGFRsの特定のチロシン残基がリン酸化される;(4)かかるリン酸化によりFGFR基質2α(FRS2α)等のアダプター蛋白質のリクルートが促進される;(5)該FGFRsを発現している細胞又は組織にFGF刺激によるシグナルを伝達するか又はシグナル伝達を活性化する。
本発明においてFGFR2蛋白質は以下の性質を有する。
(i)FGFに結合する。
FGFR2IIIb蛋白質は、通常、FGF1、FGF3、FGF7(KGF)、FGF10,FGF22及びFGF23からなる群より選択される1又は2以上に結合するが、他のFGFに結合してもよく、変異型の場合は前記群に含まれるFGFであっても結合しないことがある。
(ii)FGFR2発現細胞又は組織内にFGF刺激により生じるシグナルを伝達する。
(iii)本発明においてFGFR2IIIb蛋白質は、次の(a)乃至(d)のいずれか一つに記載のアミノ酸配列(以下、「FGR2IIIbアミノ酸配列」という)を含んでなるか、FGFR2IIIbアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはFGFR2IIIbアミノ酸配列からなる:
(a)データベース上で公表されているNP_075259のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列;
(b)NP_075259のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列と80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上又は99%以上の配列同一性を示し且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(c)NP_075259のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至35個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列;及び、
(d)NP_075259のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、FGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
(a)データベース上で公表されているNP_000132に示されるアミノ酸配列;
(b)NP_000132に示されるアミノ酸配列と80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上又は99%以上の配列同一性を示し且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
(c)NP_000132に示されるアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至35個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列;及び、
(d)NP_000132に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、FGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
(iv)本発明のFGFR2蛋白質は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはマウス、ラット等のげっ歯類及びヒト、より一層好適にはヒト、ラット又はマウスの、FGFR2を発現している細胞、組織又は癌組織、かかる組織由来の細胞、かかる細胞の培養物等より得ることができる。
FGFR2を高発現している正常組織には、脳、大腸、甲状腺、子宮、胆嚢、皮膚等を例示することができる。FGFR2を高発現している癌には、胃癌、乳癌など遺伝子増幅が見られるもの、および、膵臓癌、卵巣癌など過剰発現がみられるものがある。FGFR2IIIbを高発現している培養細胞株としては、胃癌細胞株、乳癌細胞株等を例示することができる。FGFR2IIIcを高発現している培養細胞株としては、大腸(盲腸)細胞癌を例示することができる。FGFR2IIIcを発現している癌組織としては、子宮頚癌、非小細胞肺癌等を例示することができ、このうち子宮頚癌では高発現している。
(2−2)抗原遺伝子
本発明においてFGFR2IIIb遺伝子は、次の(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列(以下、「FGFR2遺伝子配列」という)を含んでなるか、FGFR2遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはFGFR2遺伝子配列からなる:
(a)NP_075259に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b)NP_075259に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び
(c)NP_075259に示されるアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
(a)NP_000132に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b)NP_000132に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び
(c)NP_000132に示されるアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つFGF結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
FGFR2遺伝子の発現及び発現量の測定は、FGFR2遺伝子の転写産物及びFGFR2蛋白質のいずれを指標としてもよく、前者はRT−PCR法、ノーザンブロット・ハイブリダーゼーション法等により、後者はEnzyme−linked immuno−sorbent assay:以下、「ELISA」という)、ウエスタンブロッティング法、免疫組織染色法等の免疫アッセイ法等により、それぞれ測定することができる。
(2−3)抗原蛋白質の調製
本発明のFGFR2蛋白質は、動物組織(体液を含む)、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
(2−3−1)非組換型FGFR2の精製、単離
非組換型FGFR2蛋白質は、FGFR2を発現している細胞、正常組織もしく癌組織またはそれらに由来する細胞より精製、単離することができる。FGFR2を発現している正常組織、癌組織、癌細胞としては(2−1)の(iv)記載のものを例示することができるが、非組換型FGFR2蛋白質の由来はそれらに限定されるものではない。
(2−3−2)組換型FGFR2蛋白質の調製
本発明のFGFR2蛋白質は、組換型としても調製することができる。すなわち、FGFR2蛋白質又はFGFR2蛋白質断片のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、かかる細胞の培養物からFGFR2蛋白質を回収することができる。例えば、FGFR2遺伝子又はその断片を発現ベクターに挿入し、次いで、原核又は真核の宿主細胞に該組換えベクターを導入して得られる組換え細胞を保温すれば、該細胞にFGFR2蛋白質を発現させることができる。発現形態としては、分泌発現、細胞内可溶発現、インクルージョンボディー法など公知の形態を用いることができる。また、アミノ末端(N末)及び/又はカルボキシ末端(C末)が天然型と同一の分子のみならず、分泌シグナル、細胞内局在化シグナル、アフィニティー精製用タグ、パートナーペプチドとの融合蛋白質として発現させることもできる。かかる組換え細胞培養物からのFGFR2蛋白質の精製、単離は、(2−3−1)記載の非組換型FGFR2蛋白質の精製、単離に記載の分画、クロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせることにより行うことができる。
(2−3−3)インビトロ翻訳
本発明のFGFR2蛋白質はインビトロ翻訳によっても調製することができる。かかる翻訳法としては、転写及び翻訳に必要な酵素、基質並びにエネルギー物質を含む無細胞翻訳系を利用した方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム(RTS)を利用する方法をあげることができる。
(2−3−4)化学合成
本発明のFGFR2蛋白質は化学合成によっても調製することができる。化学合成法としては、例えば、Fmoc合成法、Boc合成法などのペプチド固相合成法をあげることができる。
(3−1)抗体の分類
本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体(非ヒト動物抗体)、ヒト由来の抗体(ヒト抗体)、キメラ化抗体(「キメラ抗体」ともいう)、ヒト化抗体等をあげることができる。
(3−2)抗体の結合特異性
本発明の抗体はFGFR2蛋白質を認識する。言い換えれば、本発明の抗体はFGFR2蛋白質に結合する。かかる抗体は「抗FGFR2抗体」と表記される。また、本発明の好適な抗体はFGFR2蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明の好適な抗体はFGFR2蛋白質に特異的に結合する。さらに、本発明の、より好適な抗体はFGFR2IIIb蛋白質及び/又はFGFR2IIIc蛋白質に特異的に結合し、より一層好適な抗体はFGFR2IIIb蛋白質及び/又はFGFR2IIIc蛋白質の有する免疫グロブリン様ドメイン(以下、「Ig様ドメイン」という)に特異的に結合する。かかるIg様ドメインとしては、Ig様ドメイン2、Ig様ドメイン3等を例示することができる。
(A)非変性型及び変性型のヒトFGFR2IIIc並びにヒトFGFR2IIIbに特異的に結合するが、非変性型及び変性型のヒトFGFR1、ヒトFGFR3及びヒトFGFR4には特異的に結合しない抗体;
(B)非変性型及び変性型のヒトFGFR2IIIcに特異的に結合するが、非変性型及び変性型のヒトFGFR2IIIbには特異的に結合せず、且つ、非変性型及び変性型のヒトFGFR1、ヒトFGFR3及びヒトFGFR4には特異的に結合しない抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
(3−3)モノクローナル抗体
本発明はモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの機能断片、それらの修飾体等が含まれる。このうち、ラットモノクローナル抗体の例としては、FR2−2nd_#023、FR2−2nd_#028等をあげることができる。
FR2−2nd_#028は実施例1に記載の方法により得られた抗ヒトFGFR2ラットモノクローナル抗体である。その重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号2(図14A)に、アミノ酸配列は配列番号3(図14B)に記載されている。その軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号5(図14C)に、アミノ酸配列は配列番号6(図14D)に記載されている。そのCDRH1のアミノ酸配列は配列番号24(図19)に、CDRH2のアミノ酸配列は配列番号25(図19)に、CDRH3のアミノ酸配列は配列番号26(図19)に、CDRL1のアミノ酸配列は配列番号27(図19)に、CDRL2のアミノ酸配列は配列番号28(図19)に、CDRL3のアミノ酸配列は配列番号29(図19)にそれぞれ記載されている。
また、複数の抗体に由来するCDRH1乃至CDRH3およびCDRL1乃至CDRL3を有する抗体も、抗体変異体に含まれる。そのような変異体の例として、CDRH3のみある抗体に由来し、CDRH1及びCDRH2ならびにCDRL1乃至CDRL3は別の抗体に由来する抗体変異体をあげることができる。
本発明においては抗体変異体も「抗体」に包含される。
本発明の抗体の定常領域としては、とくに限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療または予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等をあげることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Cκ、Cλ等をあげることができる。
(3−4)抗体の機能断片
本発明は一つの態様として、本発明の抗FGFR2抗体の機能断片を提供する。抗体の機能断片とは、該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持する断片を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性をあげることができる。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列と80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上又は99%以上同一なアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を含み、且つhFGFR2に結合する抗体又はその機能断片も、本発明に包含される。かかる配列同一性は、好適には94%以上、より好適には96%以上、より一層好適には98%以上、最適には99%以上である。
二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、Blast algorithm version 2.2.2(Altschul, Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Blast algorithmは、例えば、インターネットでhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/にアクセスすることによっても使用することができる。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至35個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を含み、且つhFGFR2に結合する抗体又はその機能断片も、本発明に包含される。かかるアミノ酸変異は好適には置換であり、変異されるアミノ酸の個数は好適には1乃至5個、より好適には1乃至4個、より一層好適には1乃至3個、さらにより一層好適には1乃至2個、最適には1個である。
(3−5)エピトープに結合する抗体
本発明の提供する抗体と「同一の部位に結合する抗体」も本発明の抗体に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体が抗腫瘍活性など本発明の抗体の一つの態様に特徴的な効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。従って、第一の抗FGFR2抗体の結合する部位に第二の抗FGFR2抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体がFGFR2蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一の抗FGFR2抗体のFGFR2蛋白質への結合に対して第二の抗FGFR2抗体が競合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がFGFR2蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。
(3−6)抗体の修飾体
本発明は、抗体又はその機能断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその機能断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその機能断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、N−結合またはO−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾(例えば、N−結合またはO−結合への糖鎖付加、N末またはC末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化)されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりN末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体または抗原の検出または単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその機能断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその機能断片の安定性および血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
本発明においては抗体の修飾体、その機能断片の修飾体を、単に「抗体」、「抗体の機能断片」と呼ぶことがある。
4.抗体の製造方法
(4−1)ハイブリドーマを用いる方法
本発明の抗FGFR2抗体は、コーラーとミルスタインの方法(Kohler and Milstein,Nature (1975)256,p.495−497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibody,p.365−367,Prenum Press,N.Y.(1980))に従って、FGFR2蛋白質又はその可溶型フォームで免疫した動物の脾臓より抗FGFR2抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。
(4−1−1)抗原の調製
抗FGFR2抗体を作製するための抗原は、本発明の他の部分に記載された天然型または組換え型のFGFR2蛋白質の調製法等に従って、取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、FGFR2蛋白質若しくはその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列を含むことからなるFGFR2蛋白質断片、またはそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等(以下、まとめて「FGFR2抗原」とよぶ)を挙げることができる。
(4−1−2)抗FGFR2モノクローナル抗体の製造
(a)抗原の精製
前記(2−3)記載のFGFR2蛋白質の調製法に準ずる。
(b)抗体産生細胞を調製する工程
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
(c)ミエローマを調製する工程
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hipoxanthine−guanine phosphoribosyl transferase)欠損株、すなわちマウス由来のX63−Ag8(X63)、NS1−ANS/1(NS1)、P3X63−Ag8.Ul(P3Ul)、X63−Ag8.653(X63.653)、SP2/0−Ag14(SP2/0)、MPC11−45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SKO−007)、GM1500・GTG−A12(GM1500)、UC729−6、LICR−LOW−HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4−1(NP41)等を用いるのが好ましい。これらのHGPRT欠損株は例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
(d)抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合させる工程
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
(e)目的とする抗体を産生するハイブロドーマ群を選別する工程
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法(Kohler et al., Nature(1975)256,p.495;Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
(f)単一細胞クローンを得る工程(クローニング)
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが(例えば、Barbara, B.M. and Stanley, M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology,W.H. Freeman and Company,San Francisco(1980)参照)、好適には限界希釈法である。
(g)ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
(h)モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
(4−2)細胞免疫法
天然型のFGFR2蛋白質を発現する細胞、組換え型FGFR2蛋白質またはその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗FGFR2抗体を調製することができる。
FGFR2を発現している細胞は、1×105乃至1×109個、好適には1×106乃至1×108個、より好適には0.5乃至2×107個、より一層好適には1×107個を1回の免疫に用いるが、FGFR2蛋白質の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。ハイブリドーマの作製手法としては(4−1−2)記載の方法を適用することができる。
(4−3)遺伝子組換え
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(重鎖ヌクレオチド)及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(軽鎖ヌクレオチド)、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
(4−4)ヒト化抗体のデザイン法および調製法
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のCDRのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体(Nature(1986)321,p.522−525参照)、CDR移植法によりCDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(WO90/07861号、US6972323号公報参照)、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の1つまたは2つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
(4−5)ヒト抗体の調製法
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗FGFR2ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗FGFR2抗体を意味する。抗FGFR2ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムDNA断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133−143,; Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722−727等を参照。)によって取得することができる。
(4−6)抗体の機能断片の調製法
一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号等を参照)。このscFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879−5883)。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
(4−7)抗体の精製
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
(4−8)抗体をコードするヌクレオチド・組換ベクター・組換細胞
本発明は、本発明の抗体もしくはその機能断片またはその修飾体をコードするヌクレオチド(「抗体遺伝子」という)、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入された細胞(「抗体遺伝子導入細胞」という)、その他本発明の抗体もしくは機能断片またはその修飾体を産生する細胞(「抗体産生細胞」という)をも提供する。
(a)ラットFR2−2nd_#023抗体若しくはそのマウスキメラ化抗体又はラットFR2−2nd_#028抗体若しくはそのマウスキメラ化抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ;
(b)上記(a)に記載のいずれかの抗体のCDRH1乃至CDRH3を含む重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とCDRL1乃至CDRL3を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ;
(c)上記(a)に記載のいずれかの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列コードするヌクレオチド配列の組合せ;
(d)(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つFGFR2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;および、
(e)(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において1乃至50個、1乃至45個、1乃至40個、1乃至30個、1乃至25個、1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つFGFR2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
5.診断用組成物
本発明の抗FGFR2抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む検査用または診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)を提供する。
一次抗体の反応条件は特に限定されないが、温度20乃至50℃、好適には25乃至42℃、より好適には37℃である。反応時間は5分乃至一昼夜、好適には10分乃至6時間、より好適には30分乃至2時間である。
一次抗体の検出には、好適には、可視化することができ且つ一次抗体に結合する抗体(二次抗体)を用いることができる。二次抗体の可視化法としては、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を二次抗体に結合させるか、または二次抗体にビオチン等を付加して前記酵素を結合させたストレプトアビジン等と結合させ、それらの酵素に対応する発色基質を反応させる方法を好適に使用することができる。酵素を二次抗体に結合させる方法としては、デキストリンポリマーやアミノ酸ポリマーに前記酵素と二次抗体を多数結合させた試薬を用いる方法(ポリマー法)を例示することができる。ビオチン化二次抗体およびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを反応させる方法(LSAB法)では、発色基質としてDAB等を用いることができる。また、蛍光色素などで標識された二次抗体を使用することもできる。蛍光標識二次抗体で処理した場合、処理後に蛍光顕微鏡を用いて陽性細胞を検出する。
ヒトFGFR2IIIbおよびヒトFGFR2IIIcの両方に選択性を有する抗体としては、ラットFR2−2nd_#023抗体の重鎖のCDRH1乃至CDRH3を含む重鎖、ならびに、軽鎖のCDRL1乃至CDRL3を含む軽鎖を含んでなる抗体、ラットFR2−2nd_#023抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなる抗体、ラットFR2−2nd_#023抗体の重鎖および軽鎖を含んでなる抗体等を例示することができる。かかる抗体としては、ラットFR2−2nd_#023抗体、マウスキメラ化FR2−2nd_#023抗体等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
また、(i)被検サンプル中のヒトFGFR2IIIbとヒトFGFR2IIIcを検出または測定し、(ii)該サンプル中のヒトFGFR2IIIbを検出または測定し、(iii)(i)の検出または測定の結果と(ii)の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは(i)の検出または測定の結果から(ii)の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のヒトFGFR2IIIcを検出または測定することができる。かかるヒトFGFR2IIIcの検出または測定方法も本発明に包含される。
上記(i)に使用されるヒトFGFR2IIIbとヒトFGFR2IIIcを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットFR2−2nd_#023抗体もしくはマウスキメラ化FR2−2nd_#023抗体、又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。該組成物は他の抗体を含んでいても良い。
上記(ii)に使用されるヒトFGFR2IIIbを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ヒトFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片(例えば、ラットFR2−10抗体もしくはそのキメラ化抗体(WO2013/154206))又はそれらを含む組成物が挙げられる。
また、(i)被検サンプル中のヒトFGFR2IIIbとヒトFGFR2IIIcを検出または測定し、(ii)該サンプル中のヒトFGFR2IIIc検出または測定し、(iii)(i)の検出または測定の結果と(ii)の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは(i)の検出または測定の結果から(ii)の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のヒトFGFR2IIIbを検出または測定することができる。かかるヒトFGFR2IIIbの検出または測定方法も本発明に包含される。
上記(i)に使用されるヒトFGFR2IIIbとヒトFGFR2IIIcを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットFR2−2nd_#023抗体もしくはマウスキメラ化FR2−2nd_#023抗体、又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。該組成物は他の抗体を含んでいても良い。
上記(ii)に使用されるヒトFGFR2IIIcを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットFR2−2nd_#028抗体もしくはマウスキメラ化FR2−2nd_#028抗体又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
これらの検出または測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。かかる測定方法および診断用組成物は、ヒトFGFR2陽性癌、好適にはヒトFGFR2IIIb及び/又はヒトFGFR2IIIc陽性癌、より好適にはヒトFGFR2IIIcあるいはヒトFGFR2IIIbおよびヒトFGFR2IIIc陽性癌の診断用または検査用としても本発明に含まれる。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体は癌に罹患しているかまたはそのリスクがある。
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
6.医薬組成物
本発明は抗FGFR2抗体もしくはその機能断片またはその修飾体(WO2013/154206、WO2015/053407等)を含む医薬組成物を提供する。
かかる癌種としては、例えば、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、非小細胞肺癌などの肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、悪性黒色腫等をあげることができ、好適にはFGFR2蛋白質を発現しているそれらの癌をあげることができる。
7.試薬・キット
本発明の抗体もしくはその機能断片またはその修飾体は、試薬及びキットとしても有用である。かかる試薬及びキットは、上述の検査又は診断用、研究用およびその他の用途で使用される。
実施例1.ラット抗ヒトFGFR2抗体の作製
1)−1 免疫
免疫にはWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)を使用した。Recombinant Human FGFR2β(IIIc)/Fc Chimera(R&D SYSTEM社製)抗原蛋白とFreund‘s Complete Adjuvant (和光純薬社製)を混合したものを尾根部に投与したラットのリンパ節および脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
1)−2 ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマSP2/0−Ag14細胞(ATCC:CRL−1581)とをLF301−Cell Fusion Unit(BEX社製)を用いて電気細胞融合し、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社製)に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗FGFR2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
1)−3 抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
1)−3−1 ヒトFGFR2IIIbおよびFGFR2IIIc発現ベクター(pcDNA−DEST40―FGFR2IIIbおよびpcDNA−DEST40―FGFR2IIIc)の構築
ヒトFGFR2IIIbバリアント蛋白質(アイソフォーム2:NP_075259:1〜822番目のアミノ酸)およびヒトFGFR2IIIcバリアント蛋白質(アイソフォーム1:NP_000132:1〜821番目のアミノ酸)をコードするcDNAをpcDNA−DEST40ベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターpcDNA−DEST40―FGFR2IIIbおよびpcDNA−DEST40―FGFR2IIIcを構築した。
1)−3−2 ヒトFGFR1IIIc、ヒトFGFR3IIIb、ヒトFGFR3IIIc、およびヒトFGFR4発現ベクターの構築
ヒトFGFR1IIIcバリアント蛋白質(アイソフォーム1:NP_075598:1〜822番目のアミノ酸)、ヒトFGFR3IIIbバリアント蛋白質(アイソフォーム3:NP_001156685:1〜808番目のアミノ酸)、ヒトFGFR3IIIcバリアント蛋白質(アイソフォーム1:NP_000133:1〜806番目のアミノ酸)、およびヒトFGFR4蛋白質(アイソフォーム1:NP_002002:1〜802番目のアミノ酸)をコードするcDNAをpcDNA−DEST40ベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターpcDNA−DEST40―FGFR1IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIc、およびpcDNA−DEST40―FGFR4を構築した。
1)−3−3 ヒトFGFR1IIIb発現ベクター(pcDNA−DEST40―FGFR1IIIb)の構築
ヒトFGFR1IIIbバリアント蛋白質(アイソフォーム2:NP_056934の1〜310番目のアミノ酸、および359〜820番目のアミノ酸の間に、FGFR1のIIIbドメイン:AAB19502のアミノ酸配列を挿入したもの)をコードするcDNAをpcDNA−DEST40ベクターにクローニングし、pcDNA−DEST40―FGFR1IIIbを構築した。
1)−4 Cell−ELISA法による抗体スクリーニング
1)−4−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293細胞を10% FBS含有DMEM培地中7.5×105細胞/mlになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000(Life Technologies社製)を用いて、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIcもしくはコントロールとしてpcDNA−DEST40を導入し、96−wellハーフエリア plate(Corning社製)に50μlずつ分注し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
1)−4−2 Cell−ELISA
実施例1)−4−1で調製した発現ベクター導入HEK293細胞の培養上清を除去後、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIcまたはpcDNA−DEST40導入HEK293細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社製)を加えて、4℃で1時間静置した。ウェル中の細胞を5% FBS含有PBSで6回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社製)、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6%(v/v)になるように溶解)を25μl/ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを25μl/ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するFGFR2に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA−DEST40導入HEK293細胞と比較し、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIc発現ベクター導入HEK293細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗FGFR2抗体産生陽性として選択した。
1)−5 フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング
1)−5−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225平方cmフラスコ(住友ベークライト社製)に播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIcおよびpcDNA−DEST40―FGFR2IIIbとコントロールとしてpcDNA−DEST40をそれぞれHEK293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−5−2 フローサイトメトリー解析
実施例1)−4のCell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のpcDNA−DEST40―FGFR2IIIcおよびpcDNA−DEST40―FGFR2IIIbに対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−5−1で調製したHEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIc導入HEK293T細胞、pcDNA−DEST40―FGFR2IIIb導入HEK293T細胞およびpcDNA−DEST40導入HEK293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社製)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社製)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社製)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社製)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA−DEST40導入HEK293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA−DEST40−FGFR2IIIcまたはpcDNA−DEST40―FGFR2IIIb導入HEK293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマ、ラットFR2−2nd_♯028をFGFR2IIIc特異的結合抗体産生ハイブリドーマとして、ラットFR2−2nd_♯023をFGFR2IIIb、FGFR2IIIcの両方に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−6 抗体のアイソタイプ決定
抗FGFR2抗体産生ハイブリドーマが産生するラットFR2−2nd_♯028、FR2−2nd_♯023のアイソタイプは、Rat monoclonal isotyping test kit(serotec社製)により決定された。その結果、ラットFR2−2nd_♯028のアイソタイプはIgG2b、κ鎖、ラットFR2−2nd_♯023のアイソタイプはIgG1、κ鎖であることが確認された。
1)−7 モノクローナル抗体の調製
ラット抗ヒトFGFR2モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。
抗体はHitrap protein G HP(GE Healthcare Bio−Sciences社製)を用いて、添付マニュアルの記載に従って精製した。回収した培養上清をカラムに添加し、結合バッファー(0.02M リン酸ナトリウム pH7.0)で洗浄後、0.1Mグリシン pH2.7で溶出した。溶出された抗体溶液を中和後、PD−10 SX G−25(M) 30STカラム(GE Healthcare Bio−Sciences社製)でPBSにバッファー置換し、Amicon−Ultra4 centrfugal filter (Millipore社、)で濃縮した。
抗体の濃度は、GeneSpecI (日立社製)で、吸光度(O.D.280nm)を測定することにより求めた。具体的には、抗体液の吸光度(O.D.280nm)のピーク面積を測定し、次式で濃度を算出した。抗体サンプル濃度(mg/ml)=(抗体サンプルのピーク面積)/(標準品(ヒトIgG1)のピーク面積)×標準品の濃度(mg/ml)×サンプルの希釈倍率。また、得られた抗体に含まれるエンドトキシン濃度をThe Endosafe−PTS Portable Test System (日本チャールス・リバー株式会社)を使用して測定し、1EU/mg以下であることを確認して以下の実験に使用した。
実施例2.ラット抗体FR2−2nd_♯028及びラット抗体FR2−2nd_♯023のクローニング
2)−1 ラット抗体FR2−2nd_♯028のクローニング
2)−1−1 ラット抗体FR2−2nd_#028産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
ラット抗体FR2−2nd_#028の可変領域を含むcDNAを増幅するため、ラット抗体2nd_#28産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent(Ambion社)を用いてtotal RNAを調製した。
2)−1−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成は実施例2)−1−1で調製したtotal RNAの1μgを用い、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)を用いて実施した。
2)−1−3 5’−RACE PCRによるラット抗体FR2−2nd_#028の重鎖可変領域を含むcDNAの増幅と配列の決定
ラット抗体FR2−2nd_#028の重鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び、
5’−CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC−3’(RG2AR3 :配列番号1)の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。UPMはSMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)に付属のものを使用し、RG2AR3はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、実施例2)−1−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型とした5’−RACE PCRによりラット抗体FR2−2nd_#028の重鎖の可変領域を含むcDNAを増幅した。PCRは、PolymeraseとしてKOD−Plus−(TOYOBO社)を用い、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)のマニュアルに従い、タッチダウンPCRプログラムで実施した。
シークエンスプライマーは、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
5’−CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC−3’(RG2AR3:配列番号1)の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びNUP (Nested Universal Primer A:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて実施し、シークエンス反応は、GeneAmp 9700(Applied Biosystems社)を用いた。
決定されたラット抗体FR2−2nd_#028の重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号2(図14A)に示し、アミノ酸配列を配列番号3(図14B)に示した。
2)−1−4 5’−RACE PCRによるラット抗体FR2−2nd_#028の軽鎖可変領域を含むcDNAの増幅と配列の決定
ラット抗体FR2−2nd_#028の軽鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)及び、
5’−TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC−3’(RKR5:配列番号4)の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。UPMはSMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)に付属のものを使用し、RKR5はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
5’−RACE PCRで増幅した軽鎖の可変領域を含むcDNAをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN社)を用いて精製後、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社)を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むcDNAのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーは、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
5’−TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC−3’(RKR5:配列番号4)の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びNUP (Nested Universal Primer A:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて実施し、シークエンス反応は、GeneAmp 9700(Applied Biosystems社)を用いた。
2)−2 ラット抗体FR2−2nd_♯023のクローニング
2)−2−1 ラット抗体FR2−2nd_#023産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
ラット抗体FR2−2nd_#023の可変領域を含むcDNAを増幅するため、ラット抗体2nd_#23産生ハイブリドーマより実施例2)−1−1と同様の方法でtotal RNAを調製した。
2)−2−2 cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成
cDNA(5’−RACE−Ready cDNA)の合成は実施例2)−2−1で調製したtotal RNAの1μgを用い、実施例2)−1−2と同様の方法で実施した。
2)−2−3 5’−RACE PCRによるラット抗体FR2−2nd_#023の重鎖可変領域を含むcDNAの増幅と配列の決定
実施例2)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例2)−1−3と同様の方法でラット抗体FR2−2nd_#023の重鎖可変領域を含むcDNAを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定されたラット抗体FR2−2nd_#023の重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号7(図15A)に示し、アミノ酸配列を配列番号8(図15B)に示した。
2)−2−4 5’−RACE PCRによるラット抗体FR2−2nd_#023の軽鎖可変領域を含むcDNAの増幅と配列の決定
実施例2)−2−2で合成したcDNA(5’−RACE−Ready cDNA)を鋳型として用いて、実施例2)−1−4と同様の方法でラット抗体FR2−2nd_#023の軽鎖可変領域を含むcDNAを増幅して配列を決定した。
実施例3.マウスIgG1キメラ化FR2−2nd_♯028及びマウスIgG1キメラ化FR2−2nd_♯023の作製
3)−1 発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Invitrogen社)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号11(図16)に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
pcDNA3.3/LKを鋳型として、下記プライマーセットでPCRを行い、得られた約3.8kbのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりCMVプロモーターの下流にシグナル配列、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、発現ベクターpCMA−LKを構築した。
プライマーセット
5’−TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC−3’(3.3−F1:配列番号12)
5’−GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG−3’(3.3−R1:配列番号13)
3)−2 マウスキメラ化FR2−2nd_♯028重鎖発現ベクターの構築
配列番号14に示すマウスキメラ化FR2−2nd_#028重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEScript社 遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD−Plus−(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでマウスキメラ化FR2−2nd_#028重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を増幅し、発現ベクターpCMA−LKを制限酵素XbaIおよびPmeIで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にIn−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて挿入することによりキメラ2nd_#28重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /2nd_#28H」と命名した。
プライマーセット
5’− CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC−3’(CM−inf−F:配列番号16)
5’− AGTTAGCCTCCCCCGTTTAAACTC −3’(CM−inf−R:配列番号17)
マウスキメラ化FR2−2nd_#028重鎖のアミノ酸配列を配列番号15に示した。
3)−3 マウスキメラ化2nd_#028軽鎖発現ベクターの構築
配列番号18に示すマウスキメラ化FR2−2nd_#028軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEScript社 人工遺伝子合成サービス)。実施例3)−2と同様の方法によりキメラ2nd_#28軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /2nd_#28L」と命名した。
3)−4 マウスキメラ化2nd_#023重鎖発現ベクターの構築
配列番号20に示すマウスキメラ化FR2−2nd_#023重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を合成した(GENEScript社 人工遺伝子合成サービス)。実施例3)−2と同様の方法によりマウスキメラ化2nd_#23重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /2nd_#23H」と命名した。
3)−5 マウスキメラ化2nd_#023軽鎖発現ベクターの構築
配列番号22に示すマウスキメラ化FR2−2nd_#023軽鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した(GENEScript社 人工遺伝子合成サービス)。実施例3)−2と同様の方法によりマウスキメラ化2nd_#023軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA /2nd_#23L」と命名した。
3)−6 マウスキメラ化FR2−2nd_#028及びマウスキメラ化FR2−2nd_#023の生産
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社)で希釈して2.0×106細胞/mlに調製したのちに、37℃、8%CO2インキュベーター内で90rpmで1時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765)1.8mgをOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社)20mlに溶解し、次にNucleoBond Xtra(TaKaRa社)を用いて調製したH鎖発現ベクター(0.24mg)及びL鎖発現ベクター(0.36mg)を20mlのOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社)に添加した。Polyethyleneimine/Opti−Pro SFM混合液20mlに、発現ベクター/Opti−Pro SFM混合液20mlを加え穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8%CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mlのEX−CELL VPRO培地(SAFC Biosciences社)、18mlのGlutaMAX I(GIBCO社)、及び30mlのYeastolate Ultrafiltrate(GIBCO社)を添加し、37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (Advantec #CCS−045−E1H)でろ過した。
pCMA /2nd_#28HとpCMA /2nd_#28Lとの組合せによって取得されたラット抗体FR2−2nd_#028のキメラ化抗体を「マウスキメラ化FR2−2nd_#028」と命名し、pCMA /2nd_#23HとpCMA /2nd_#23Lとの組合せによって取得されたラット抗体FR2−2nd_#023のキメラ化抗体を「マウスキメラ化FR2−2nd_#023」と命名した。
3)−7 マウスキメラ化FR2−2nd_#028及びマウスキメラ化FR2−2nd_#028の精製
実施例3)−6で得られた培養上清を、rProtein Aアフィニティークロマトグラフィー(4−6℃下)1段階工程で精製した。rProtein Aアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は4−6℃下で実施した。最初に、培養上清を、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社)が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社,4℃下)にて濃縮し、IgG濃度を5mg/mlに調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
3)−8 マウスキメラ化FR2−2nd_#028及びマウスキメラ化FR2−2nd_#028のフローサイトメトリー解析によるFGFRファミリー分子への結合解析
3)−8−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293T細胞を10% FBS含有DMEM培地中7.5x105細胞/mlになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000(Life Technologies社製)を用いて、実施例1)−3−1、1)−3−2、および1)−3−3で構築したFGFR1IIIb、FGFR1IIIc、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc、FGFR3IIIb、FGFR3IIIc、およびFGFR4の発現ベクター、または空ベクター、すなわち、pcDNA−DEST40―FGFR1IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR1IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR2IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR2IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR4、およびpcDNA−DEST40を導入し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
3)−8−2
実施例3)−7で調製したマウスキメラ化FR2−2nd_#028及びマウスキメラ化FR2−2nd_#023の非変性型FGFRファミリー分子に対する結合特異性をフローサイトメトリー法により確認した。実施例3)−8−1で調製したHEK293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、pcDNA−DEST40−FGFR1IIIb、pcDNA−DEST40−FGFR1IIIc、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIb、pcDNA−DEST40−FGFR2IIIc、pcDNA−DEST40−FGFR3IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR4、またはpcDNA−DEST40導入HEK293T細胞のそれぞれに対し、5μg/mlに調製した陰性コントロールマウスIgG1(R&D社製)、またはマウスキメラ化FR2−2nd_#028、マウスキメラ化FR2−2nd_#023を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したFluorescein-Conjugated Goat IgG Fraction to Mouse IgG (MP Biomedicals社製)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社製)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社製)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社製)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITCの平均蛍光強度(MFI)を算出した(図1)。コントロールであるpcDNA−DEST40導入HEK293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対し、マウスキメラ化FR2−2nd_#028は、FGFR2IIIc発現HEK293T細胞特異的に結合を示し、FGFR2IIIbまたは他のFGFRファミリー発現HEK293T細胞への結合は認められなかった。また、FR2−2nd_♯023は、FGFR2IIIbまたはFGFR2IIIc発現HEK293T細胞特異的に結合を示し、他のFGFRファミリー発現HEK293T細胞への結合は認められなかった。
実施例4.免疫染色
4)−1 免疫染色用サンプルの調製
4)−1−1 FGFRファミリー分子発現細胞株の調製
インテグリンαvおよびインテグリンβ3発現ベクターをHEK293細胞内に安定形質移入した細胞株293α細胞を10% FBS含有DMEM培地中6×106細胞/225cm2フラスコ(住友ベークライト社製)となるように調製し、37℃、5% CO2で一晩培養した。実施例1)−3−1、1)−3−2、および1)−3−3で構築したFGFR1IIIb、FGFR1IIIc、FGFR2IIIb、FGFR2IIIc、FGFR3IIIb、FGFR3IIIc、およびFGFR4の発現ベクター、または空ベクター、すなわち、pcDNA−DEST40―FGFR1IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR1IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR2IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR2IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIb、pcDNA−DEST40―FGFR3IIIc、pcDNA−DEST40―FGFR4、およびpcDNA−DEST40をFuGENE6(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下で二晩培養した。得られた細胞をTrypLExpress(Life Technology社製)を用いて回収し、遠心してペレットにした後、PBSで1回洗浄し、遠心して得られたペレットを20%中性緩衝ホルマリンで固定した。
4)−1−2 FGFR2発現癌細胞株の調製
10%FBS/RPMIで培養したヒト胃癌株SNU−16およびヒト大腸癌株NCI−H716(ATCCより購入)をそれぞれ回収し、遠心してペレットにした後、20%中性緩衝ホルマリンで固定した。10%FBS/DMEMで培養したヒト胃癌株KATOIII(ATCCより購入)を回収し、遠心してペレットにした後、20%中性緩衝ホルマリンで固定した。
4)−1−3 FGFR2発現癌細胞株ゼノグラフトモデル腫瘍サンプルの作製
5×106細胞のSNU−16を50%マトリゲル(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)で懸濁し、ヌードマウス(CAnN.Cg−Foxnlnu/CrlCrlj、日本チャールス・リバーより購入)の腋窩部皮下に移植した。移植20日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム(和光純薬工業株式会社製)で固定した。
3×105細胞のKATOIIIを100%マトリゲル(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製)で懸濁し、SCIDマウス(CB17/lcr−Prkdcscid/CrlCrlj、日本チャールス・リバーより購入)の腋窩部皮下に移植した。移植30日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム(和光純薬工業株式会社製)で固定した。
2.5×106細胞のNCI−H716を100%マトリゲル(日本BDより購入)で懸濁し、ヌードマウス(CAnN.Cg−Foxnlnu/CrlCrlj、日本チャールス・リバーより購入)の腋窩部皮下に移植した。移植21日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム(和光純薬工業株式会社製)で固定した。
4)−2 パラフィン包埋、薄切
パラフィン包埋、薄切は一般的な手法であり、用いる器具や機器は特に制限はない。
自動固定包埋装置(ティシュー・テックVIP5ジュニア:サクラファインテックジャパン株式会社製)を用いて脱水、脱脂、パラフィン浸透させた。自動固定包埋装置よりカセットを取り出し、パラフィン包埋ブロック作製装置(ティシュー・テックTECプラス:サクラファインテックジャパン株式会社製)のパラフィン槽に移した。同装置にセットした包埋皿に融解したパラフィンを少量流し込み、この包埋皿のパラフィン内に、パラフィン槽から出したカセット容器内、あるいはナイロンメッシュ内の細胞ペレットあるいは組織をピンセットで取り出してセットした。次いで包埋皿の上に包埋枠としてカセットを乗せて、上から融解パラフィンを流し込み、細胞あるいは組織と一体となった包埋枠を含む包埋皿を冷却部上に置いて冷却した。パラフィンが固まったら包埋皿より取り出し、包埋ブロックとして薄切に供した。薄切は、上記で作製した包埋ブロックを、ミクロトーム(IVS−410:サクラファインテックジャパン株式会社製)で厚さ3μmに薄切した。薄切した切片を剥離防止スライドグラス(プラチナ:松浪硝子工業株式会社製)に貼った。50℃のパラフィン伸展器(サクラファインテックジャパン株式会社製)上で一晩乾燥させ、スライドケースに収容し、デシケータ内で保管した。
4)−3 染色
4)−3−1 市販抗体18601(Anti-Human K-sam Rabbit IgG Affinity Purify、株式会社免疫生物研究所製)を用いた染色
染色作業は、自動染色装置(ディスカバリー Ultra:Ventana Medical Systems社製)を用いて実施した。染色過程の反応温度は37℃で、それ以外の場合のみ記載した。脱パラフィンはEZバッファー(Ventana Medical Systems社製)、68℃で4分間のインキュベートを3回液を換えて実施し、その後EZバッファーで洗浄した。CC1バッファー(Ventana Medical Systems社製)、95℃で4回液を換えて計52分間実施した。リアクションバッファー(Ventana Medical Systems社製)で4回洗浄した。Protein Block serum free(DAKO社製)を加え、16分間インキュベートし、リアクションバッファーで3回洗浄した。18601をディスカバリー専用抗体希釈液(Ventana Medical Systems社製)で5μg/mLに希釈し、1時間反応させた。リアクションバッファーで3回洗浄後、インヒビターCM(クロモマップキット:Ventana Medical Systems社製)を8分間反応させた後、リアクションバッファーで2回洗浄した。UMap anti−Rb HRP(Ventana Medical Systems社製)を32分間反応させ、リアクションバッファーで4回洗浄した。DAB CM(クロモマップキット:Ventana Medical Systems社製)を4分反応させた後H2O2CM(クロモマップキット:Ventana Medical Systems社製)を添加し、8分間反応させ、リアクションバッファーで1回洗浄した。Copper−CM(クロモマップキット:Ventana Medical Systems社製)を4分間反応させ、リアクションバッファーで1回洗浄した。ヘマトキシリン核染色試薬II(Ventana Medical Systems社製)を4分間反応させ、リアクションバッファーで2回洗浄した。Bluing Reagent(炭酸リチウム試薬,Ventana Medical Systems社製)を4分間反応させ、リアクションバッファーで1回洗浄した。
4)−3−2 ラットFR2−2nd_♯028抗体を用いた染色
脱パラフィンは定法に従い、100%キシレンを4槽、100%エタノールを3槽それぞれ5分間ずつ通した後、イオン交換水で洗浄した。その後の染色作業は自動染色装置(ダコ Autostainer Link48:DAKO社製)を用いて実施した。EnVision FLEX WASH BUFFER(DAKO社製)で1回洗浄した後、DAKO Proteinase K RTU(DAKO社製)で室温にて6分間インキュベートし、EnVision FLEX WASH BUFFERで3回洗浄した。Peroxidase Block 3% H2O2(DAKO社製)を加え5分間インキュベートし、EnVision FLEX WASH BUFFERで2回洗浄した。Protein Block serum free(DAKO社製)を加え、30分間インキュベートし、EnVision FLEX WASH BUFFERで1回洗浄した。ラットFR2−2nd_♯028をDAKO REAL Antibody Diluentで15μg/mLに希釈し、1時間反応させた。EnVision FLEX WASH BUFFERで3回洗浄後、Histofine simplestain mouse MAX−PRO(Rat)#414311(ニチレイバイオサイエンス社製)を加え30分インキュベートした後、EnVision FLEX WASH BUFFERで2回洗浄した。
4)−3−3 マウスキメラ化FR2−2nd_#028抗体を用いた染色
染色作業は自動染色装置(LEICA BOND−III:Leica Biosystems社製)を用いて実施した。脱パラフィンは72℃に加熱した後、Bond Dewax Solution(Leica Biosystems社製)を加え30秒インキュベートし、エタノールを加え、Bond Wash Solution(Leica Biosystems社製)で4回洗浄した。200倍希釈したEnzyme Proteinase K(IHC)(Leica Biosystems社製)を加え、37℃で5分インキュベートした。Bond Wash Solutionで7回洗浄し、マウスキメラ化FR2−2nd_#028を15μg/mLに希釈し、30分反応させた。
Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Primary試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え8分間インキュベートした。Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Peroxyide Block試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした。Bond Wash Solution及びイオン交換水で計4回洗浄し、DAB試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え10分間インキュベートした。イオン交換水で4回洗浄し、Hematoxylin(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした後、イオン交換水及びBond Wash Solutionで計4回洗浄した。
4)−3−4 ラットFR2−2nd_♯023及びマウスキメラ化FR2−2nd_#023抗体を用いた染色
染色作業は自動染色装置(LEICA BOND−III:Leica Biosystems社製)を用いて実施した。脱パラフィンは72℃に加熱した後、Bond Dewax Solution(Leica Biosystems社製)を加え30秒インキュベートし、エタノールを加え、Bond Wash Solution(Leica Biosystems社製)で4回洗浄した。Bond Epitope Retrieval Solution 2(Leica Biosystems社製)を加え、100℃で20分(ラットFR2−2nd_♯023)または40分(マウスキメラ化FR2−2nd_#023)インキュベートした。Bond Wash Solutionで7回洗浄し、抗体を15μg/mLに希釈し、30分反応させた。
Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Primary試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え8分間インキュベートした。Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Peroxyide Block試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした。Bond Wash Solution及びイオン交換水で計4回洗浄し、DAB試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え10分間インキュベートした。イオン交換水で4回洗浄し、Hematoxylin(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした後、イオン交換水及びBond Wash Solutionで計4回洗浄した。
4)−3−5 ab58201抗体(Anti−FGFR2抗体、アブカム株式会社)を用いた染色
染色作業は自動染色装置(LEICA BOND−III:Leica Biosystems社製)を用いて実施した。脱パラフィンは72℃に加熱した後、Bond Dewax Solution(Leica Biosystems社製)を加え30秒インキュベートし、エタノールを加え、Bond Wash Solution(Leica Biosystems社製)で4回洗浄した。Bond Epitope Retrieval Solution 2(Leica Biosystems社製)を加え、100℃で20分インキュベートした。Bond Wash Solutionで7回洗浄し、ab58201を2μg/mLに希釈し、30分反応させた。
Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Primary試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え8分間インキュベートした。Bond Wash Solutionで4回洗浄し、Peroxyide Block試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした。Bond Wash Solution及びイオン交換水で計4回洗浄し、DAB試薬(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え10分間インキュベートした。イオン交換水で4回洗浄し、Hematoxylin(Bondポリマーシステム/ライカIHC Refineキット、Leica Biosystems社製)を加え5分間インキュベートした後、イオン交換水及びBond Wash Solutionで計4回洗浄した。
4)−4 染色標本の評価:変性型FGFRファミリー分子に対する結合特異性
4)−3で染色完了した標本はエタノール系列で脱水、キシレン系列で透徹後、封入剤とともにカバーグラスで封入した。光学顕微鏡で観察し、陽性反応産物である褐色の染色を評価した。
配列番号2:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列(図14A)。
配列番号3:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(図14B)。
配列番号4:プライマーRKR5のヌクレオチド配列
配列番号5:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列(図14C)。
配列番号6:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(図14D)。
配列番号7:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列(図15A)。
配列番号8:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(図15B)。
配列番号9:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列(図15C)。
配列番号10:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(図15D)。
配列番号11:ヒトκ鎖分泌シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片(図35)。
配列番号12:プライマー3.3−F1のヌクレオチド配列
配列番号13:プライマー3.3−R1のヌクレオチド配列
配列番号14:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖をコードするヌクレオチド配列(ヌクレオチド番号26乃至1141)を含むヌクレオチド配列(図17A)。
配列番号15:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖のアミノ酸配列(図17B)。
配列番号16:プライマーCM−inf−Fのヌクレオチド配列
配列番号17:プライマーCM−inf−Rのヌクレオチド配列
配列番号18:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖をコードするヌクレオチド配列(ヌクレオチド番号26乃至724)を含むヌクレオチド配列(図17C)。
配列番号19:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖のアミノ酸配列(図17D)。
配列番号20:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖をコードするヌクレオチド配列(ヌクレオチド番号26乃至1423)を含むヌクレオチド配列(図18A)。
配列番号21:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖のアミノ酸配列(図18B)。
配列番号22:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖をコードするヌクレオチド配列(ヌクレオチド番号26乃至724)を含むヌクレオチド配列(図18C)。
配列番号23:マウスキメラ化抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖のアミノ酸配列(図18D)。
配列番号24:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖CDR1のアミノ酸配列(図19)
配列番号25:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖CDR2のアミノ酸配列(図19)
配列番号26:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の重鎖CDR3のアミノ酸配列(図19)
配列番号27:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖CDR1のアミノ酸配列(図19)
配列番号28:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖CDR2のアミノ酸配列(図19)
配列番号29:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#028の軽鎖CDR3のアミノ酸配列(図19)
配列番号30:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖CDR1のアミノ酸配列(図20)
配列番号31:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖CDR2のアミノ酸配列(図20)
配列番号32:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の重鎖CDR3のアミノ酸配列(図20)
配列番号33:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖CDR1のアミノ酸配列(図20)
配列番号34:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖CDR2のアミノ酸配列(図20)
配列番号35:ラット抗FGFR2抗体FR2−2nd_#023の軽鎖CDR3のアミノ酸配列(図20)
Claims (47)
- 以下の性質(i)乃至(iii)を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIcに特異的に結合する;
(ii)非変性型のヒト1型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR1)、非変性型のヒト3型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR3)、及び、非変性型のヒト4型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR4)には特異的に結合しない;
(iii)ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIcに特異的に結合する。 - 非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIb、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIbに特異的に結合する、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号30(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号31(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号32(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号33(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号34(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号35(図20)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号30(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号31(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号32(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号33(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号34(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号35(図20)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、請求項3に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 下記(i)乃至(iv)のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列;
(ii)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列;
(iv)配列番号8(図15B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号10(図15D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列。 - 配列番号21(図18B)に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号23(図18D)に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項1乃至5のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項3乃至6に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するhFGFR2IIIc及び/又はhFGFR2IIIb上の部位に結合するか、又は、hFGFR2IIIc及び/又はhFGFR2IIIbへの結合において、請求項3乃至6に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 非変性型のヒト2型線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor:hFGFR2)IIIb、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型hFGFR2IIIbには結合しない、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号24(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号26(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号27(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号28(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号29(図19)に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において1個又は2個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、請求項1又は8に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号24(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号26(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号27(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号28(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号29(図19)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を含むことからなる軽鎖からなる、請求項9に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 下記(i)乃至(iv)のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項1又は8に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片:
(i)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列;
(ii)配列番号3(14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と95%以上同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列;
(iv)配列番号3(図14B)に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号6(図14D)に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列。 - 配列番号15(図17B)に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号19(図17D)に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項1、8乃至11のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項9乃至12に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するhFGFR2IIIc上の部位に結合するか、又は、hFGFR2IIIcへの結合において、請求項9乃至12に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、請求項1又は8に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1乃至13のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチド又は請求項15に記載のベクターを含む細胞。
- 下記の工程(i)及び(ii)を含む、請求項1、2又は8に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(i)請求項16に記載の細胞を培養する工程;
(ii)工程(i)の培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収する工程。 - 請求項17に記載の方法により得られるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物。
- 請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法に使用される、請求項19に記載の組成物。
- 該標本が、脱パラフィン処理された後に、加熱処理により賦活化処理される、請求項20に記載の組成物。
- 加熱処理が、90乃至100℃、pH8乃至10で行われることを特徴とする、請求項21に記載の組成物。
- 請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項19に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法に使用される、請求項19乃至22のいずれか一つに記載の組成物。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定方法が、被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項23に記載の組成物。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、請求項19乃至24に記載の組成物。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査又は診断方法が、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、請求項25に記載の組成物。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患がhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性癌である、請求項25又は26に記載の組成物。
- 下記(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物:
(i)請求項19乃至23又は請求項25のいずれか一つに記載の組成物を用いてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出又は測定された被検標本の由来する被験者;
(ii)請求項24に記載の組成物を用いたhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(iii)請求項26又は27に記載の組成物を用いて、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者。 - 下記の工程(i)、又は(i)及び(ii)を含む、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの検出または測定方法:
(i)請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合断片又は請求項19に記載の組成物と被検標本を接触させる工程、
(ii)該被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されたか、または該被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されなかったか、また被検標本におけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程。 - 下記の工程(i)、又は(i)及び(ii)を含む、hFGFR2に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する個体の同定方法:
(i)請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片又は請求項19に記載の組成物と個体由来のサンプルを接触させる工程、
(ii)該個体由来のサンプルにおいてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されたか、または該個体由来のサンプルにおけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該個体を陽性と判定し、該個体由来のサンプルにおいてhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbが検出もしくは測定されなかったか、または該個体由来のサンプルにおけるhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIbの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該個体を陰性と判定する工程。 - 下記の工程(i)乃至(iii)を含むことからなる、hFGFR2IIIcを検出または測定する方法:
(i)請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のhFGFR2IIIbとhFGFR2IIIcを検出または測定する工程;
(ii)hFGFR2IIIbに特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のhFGFR2IIIbを検出または測定する工程;
(iii)(i)の検出または測定の結果と(ii)の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは(i)の検出または測定の結果から(ii)の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のhFGFR2IIIcを検出または測定の結果または値を得る工程。 - hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の検査または診断方法に使用される、請求項29乃至31に記載の方法。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患を罹患しているもしくはそのリスクがある個体の同定方法に使用される、請求項30に記載の方法。
- 請求項28の(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に対し、hFGFR2に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患の治療方法。
- 請求項1乃至7および18のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含有する、hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患を検査又は診断するためのキット。
- hFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性疾患がhFGFR2IIIc及びhFGFR2IIIb陽性癌である、請求項32乃至34に記載の方法又は請求項35に記載のキット。
- 請求項1、8乃至13および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物。
- 請求項1、8乃至13および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のhFGFR2IIIcの検出又は測定方法に使用される、請求項37に記載の組成物。
- 該標本が、脱パラフィン処理された後に、酵素処理により賦活化される、請求項38に記載の組成物。
- 酵素処理が、20乃至38℃での蛋白質分解酵素の反応であることを特徴とする、請求項39に記載の組成物。
- 請求項1、8乃至13および18のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項37に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のhFGFR2IIIcの検出又は測定方法に使用される、請求項37乃至40に記載の組成物。
- hFGFR2IIIcの検出又は測定方法が、被検標本においてhFGFR2IIIcが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIcの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてhFGFR2IIIcが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるhFGFR2IIIcの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項41に記載の組成物。
- hFGFR2IIIc陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、請求項37乃至42のいずれか一つに記載の組成物。
- hFGFR2IIIc陽性疾患の検査又は診断方法が、hFGFR2IIIcの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、請求項43に記載の組成物。
- hFGFR2IIIc陽性疾患がhFGFR2IIIc陽性癌である、請求項43又は44に記載の組成物。
- 下記(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物:
(i)請求項37乃至41及び43のいずれか一つに記載の組成物を用いてhFGFR2IIIcが検出又は測定された被検標本の由来する被験者;
(ii)請求項42に記載の組成物を用いたhFGFR2IIIcの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(iii)請求項44又は45に記載の組成物を用いて、hFGFR2IIIcに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むhFGFR2IIIc陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者。 - hFGFR2IIIc陽性疾患がhFGFR2IIIc陽性癌である、請求項46に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015085942 | 2015-04-20 | ||
JP2015085942 | 2015-04-20 | ||
PCT/JP2016/062297 WO2016171107A1 (ja) | 2015-04-20 | 2016-04-19 | Fgfr2の検出 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016171107A1 true JPWO2016171107A1 (ja) | 2018-03-22 |
Family
ID=57142992
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017514116A Pending JPWO2016171107A1 (ja) | 2015-04-20 | 2016-04-19 | Fgfr2の検出 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10881734B2 (ja) |
EP (1) | EP3287522A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2016171107A1 (ja) |
WO (1) | WO2016171107A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101917854B1 (ko) * | 2017-08-24 | 2018-11-12 | 한국콜마주식회사 | 세포 수용체 결합능이 있는 펩티드를 포함하는 마이크로 캡슐 및 이를 포함하는 화장료 조성물 |
WO2023185778A1 (en) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | Genor Biopharma Co., Ltd. | Novel anti-fgfr2 antibodies |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020009755A1 (en) * | 1998-12-17 | 2002-01-24 | Garcia-Blanco Mariano A. | Alternative splicing of fibroblast growth factor receptor 2 mrna in prostate cancer |
WO2012021841A2 (en) * | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Attogen Inc. | Antibody molecules to oncogenic isoforms of fibroblast growth factor receptor-2 and uses thereof |
WO2013154206A1 (ja) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | 第一三共株式会社 | 抗fgfr2抗体 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9260525B2 (en) | 2008-02-04 | 2016-02-16 | Xiao-Jia Chang | Antibody molecules to oncogenic isoforms of fibroblast growth factor receptor-2 and uses thereof |
PT2365828E (pt) * | 2008-11-07 | 2014-12-12 | Galaxy Biotech Llc | Anticorpos monoclonais para o receptor 2 do factor de crescimento de fibroblastos |
AR088941A1 (es) | 2011-11-23 | 2014-07-16 | Bayer Ip Gmbh | Anticuerpos anti-fgfr2 y sus usos |
WO2014089193A1 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-fgfr2 antibodies |
US9498532B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-22 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
TWI679021B (zh) * | 2013-08-01 | 2019-12-11 | 美商戊瑞治療有限公司 | 無海藻糖基化抗fgfr2iiib抗體 |
-
2016
- 2016-04-19 WO PCT/JP2016/062297 patent/WO2016171107A1/ja active Application Filing
- 2016-04-19 JP JP2017514116A patent/JPWO2016171107A1/ja active Pending
- 2016-04-19 EP EP16783128.8A patent/EP3287522A4/en not_active Withdrawn
- 2016-04-19 US US15/567,936 patent/US10881734B2/en active Active
-
2019
- 2019-11-19 US US16/688,963 patent/US20200085946A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020009755A1 (en) * | 1998-12-17 | 2002-01-24 | Garcia-Blanco Mariano A. | Alternative splicing of fibroblast growth factor receptor 2 mrna in prostate cancer |
WO2012021841A2 (en) * | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Attogen Inc. | Antibody molecules to oncogenic isoforms of fibroblast growth factor receptor-2 and uses thereof |
WO2013154206A1 (ja) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | 第一三共株式会社 | 抗fgfr2抗体 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ISHIWATA, T., ET AL.: "Enhanced expression of fibroblast growth factor receptor 2 IIIc promotes human pancreatic cancer cel", AM. J. PATHOL., vol. 180, no. 5, JPN6016028187, 2012, pages 1928 - 1941, ISSN: 0004334520 * |
ZHAO, WM., ET AL.: "Monoclonal antibodies to fibroblast growth factor receptor 2 effectively inhibit growth of gastric t", CLIN. CANCER RES., vol. 26, no. 23, JPN6016028185, 2010, pages 5750 - 5758, XP002673994, ISSN: 0004458288, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0531 * |
山下修二: "抗原の賦活化", 組織細胞化学2007, JPN6016028189, 2007, pages 45 - 53, ISSN: 0004458290 * |
藤田浩司: "免疫組織化学染色における抗原賦活の原理について考える", 免疫染色玉手箱, JPN6016028188, November 2007 (2007-11-01), ISSN: 0004458289 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3287522A1 (en) | 2018-02-28 |
WO2016171107A1 (ja) | 2016-10-27 |
EP3287522A4 (en) | 2019-03-27 |
US20180133314A1 (en) | 2018-05-17 |
US20200085946A1 (en) | 2020-03-19 |
US10881734B2 (en) | 2021-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6188681B2 (ja) | 抗fgfr2抗体 | |
US20160368990A1 (en) | Anti b7-h3 antibody | |
EP2199390B1 (en) | Anti-epha2 antibody | |
WO2016171242A1 (ja) | Epha2の検出 | |
JP2019151635A (ja) | 抗fgfr2抗体と他剤の組合せ | |
JP6267733B2 (ja) | 抗robo4抗体 | |
US20200085946A1 (en) | Monoclonal antibodies to human fibroblast growth factor receptor 2 (hfgfr2) and methods of use thereof | |
US11261249B2 (en) | Anti-GPR20 antibody | |
JP2013230115A (ja) | 抗robo4抗体 | |
JP2014141434A (ja) | 抗robo4抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190311 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200114 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200423 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200828 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201016 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210312 |