ES2771252T3 - Anticuerpos monoclonales anti-GP73 y métodos para obtener los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado del mismo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales anti-GP73 y métodos para obtener los mismos
Campo técnico
La presente invención se refiere a GP73, en particular, a anticuerpos monoclonales anti-GP73, a un ensayo que implica el uso de al menos un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal), tal como un inmunoensayo y a secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico relacionadas y a vectores y células hospedadoras que comprenden las mismas.
Antecedentes
La proteína de Golgi 73 ("GP73") es una proteína de la membrana residente en el Golgi de 73 kd. GP73 es una proteína transmembrana de tipo II con un solo dominio transmembrana N-terminal y un dominio de hélice superenrollada C-terminal ubicada en la superficie luminal del aparato de Golgi. Se ha demostrado que GP73 está regulada positivamente en los hepatocitos en la enfermedad hepática crónica vírica y no vírica, lo que sugiere que la proteína podría estar implicada en la respuesta a la enfermedad celular de los hepatocitos. Además, los niveles de GP73 son mayores en pacientes con cáncer hepático que en individuos sanos. Se ha hallado glucosilación fucosilada en tres cuartas partes de GP73 secretada de pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC). Estudios anteriores sugieren que GP73 y GP73 fucosilada pueden ser biomarcadores más fiables para el diagnóstico temprano de la enfermedad hepática que los marcadores actuales, tales como alfa-fetoproteína (AFP), que tiene la desventaja de producir resultados falsos positivos ya que la AFP se produce en muchas circunstancias, incluyendo otras enfermedades hepáticas. Además, AFP no está presente en todos los pacientes con HCC. Asimismo, un anticuerpo anti-GP73 conocido con anterioridad, el anticuerpo monoclonal 14H4-23 (proporcionado por el Dr. Anand Mehta, Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel), es insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73. El documento CN101988926 A 20110323 (GUANGZHOU BIOLOGICAL MEDICINE & HEALTH) describe dos anticuerpos monoclonales anti-GP73.
El documento WO2012112798 describe anticuerpos inhibidores anti-GP73.
ZHANG F. ET AL, "Up-regulated Golgi phosphoprotein 2 (GOLPH2) expression in lung adenocarcinoma tissue", CLINICAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER INC, EE. UU., CA, vol. 43, n.° 12, ISSN 0009-9120, (20100801), páginas 983 - 991, (20100524) describe ciertos mAb de ratón anti-GOLPH-2.
GU YANLI ET AL, "Quantitative analysis of elevated serum Golgi protein-73 expression in patients with liver diseases", ANNALS OF CLINICAL BIOCHEMISTRY, BRITISH MEDICAL ASSOCIATION, LONDRES, R. U., (20090101), vol. 46, n.° 1, ISSN 0004-5632, páginas 38 - 43, describe la generación de anticuerpos monoclonales anti-GP-73.
CHEN W ET AL, "Value of Golgi protein 73 monoclonal antibody in diagnosis of hepatocellular carcinoma", ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE 20110228 CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES CHN, (20110228), vol. 33, n.° 1, ISSN 1000-503X, páginas 39 - 44 describe un anticuerpo monoclonal anti-GP-73.
MOROTA KAORI ET AL, "A comparative evaluation of Golgi protein-73, fucosylated hemopexin, alpha-fetoprotein, and PIVKA-II in the serum of patients with chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma", CLINICAL CHEMISTRY AND LABORATORY MEDICINE, WALTER DE GRUYTER & CO, BERLÍN, NUEVA YORK, (20110401), vol. 49, n.°4, ISSN 1434-6621, páginas 711 - 718 describe un anticuerpo monoclonal de ratón anti-GP-73. FENG LI ET AL, "Construction and development of a mammalian cell-based full-length antibody display library for targeting hepatocellular carcinoma", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER, BERLÍN, AL, (20120707), vol. 96, n.° 5, doi:10.1007/S00253-012-4243-5, ISSN 1432-0614, páginas 1233 - 1241 describe la identificación de un clon celular que presentó anticuerpos anti-GOLPH2.
AIXIA ZHANG, "Generation and characterization of an anti-GP73 monoclonal antibody for immunoblotting and sandwich ELISA", JOURNAL OF BIOMEDICAL RESEARCH, (20121130), vol. 26, n.°6, doi: 10.7555/JBR.26.20120057, ISSN 1674-8301, páginas 467 -473 describe un anticuerpo monoclonal anti-GP73. El documento WO2006121892 describe la cuantificación de proteínas fucosiladas, por ejemplo, GP73.
El documento CN101328214 describe un anticuerpo monoclonal anti-GP73 usado para detectar GP73.
El documento CN101555282 describe una línea celular de hibridoma que reconoce a GP73 fucosilada.
El documento CN101735319 describe un anticuerpo monoclonal anti-GP73 usado en un ELISA.
El documento CN101407544 describe un anticuerpo monoclonal anti-GP73.
En vista de lo anterior, es un objeto de la presente divulgación proporcionar anticuerpos monoclonales anti-GP73 que pueden ser sensibles a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73 y que se unen a la forma fucosilada de GP73 o como alternativa, son insensibles a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73 pero que tienen afinidades de unión suficientes para su uso en inmunoensayos para detectar GP73 y/o GP73 fucosilada. Este y otros objetos y ventajas, así como las características inventivas, se harán evidentes a partir de la descripción detallada que se proporciona en el presente documento.
Sumario de la presente invención
De acuerdo con su primera realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de anticuerpo del mismo como se expone en la reivindicación independiente 1. De acuerdo con su segunda realización, que se expone en la reivindicación independiente 6, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización. De acuerdo con su tercera realización, la presente invención se refiere a una célula hospedadora como se expone en la reivindicación independiente 7. De acuerdo con su cuarta realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se expone en la reivindicación independiente 8. De acuerdo con su quinta realización, la presente invención se refiere a un método para determinar la concentración de GP73 en una muestra de ensayo, como se expone en la reivindicación independiente 9. De acuerdo con su sexta realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización, como se expone en la reivindicación independiente 12. De acuerdo con su séptima realización, esta invención se refiere a un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada, como se expone en la reivindicación independiente 13.
Sumario de la presente divulgación
En su primera realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la presente invención es preferentemente un Fv unido por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 o un Fv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la presente invención es además preferentemente capaz de unirse a un epítopo en la secuencia de aminoácidos de VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGR (hGP73 307­ 339) (SEQ ID NO:101).
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo aislado capaz de unirse a un epítopo en la secuencia de aminoácidos de: Eq VVEDRPVGGR (hGP73276-287) (SEQ ID NO: 102). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo con CDR injertadas, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo aislado o el anticuerpo es humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana. La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo aislado capaz de unirse a un epítopo en la secuencia de aminoácidos de: LRGEDDYNMDENEAESETDK (hGP73 344-363) (SEQ ID NO: 103). El anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo con CDR injertadas, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo aislado capaz de unirse a un epítopo en la secuencia de aminoácidos de: ElKKNEFQGELEKQREQlDk IQSSHNFQLESVNK (hGP73 63-96) (SEQ ID NO:104). El anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo con CDR injertadas, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo aislado que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), en donde la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a GP73 es sensible a la fucosilación de GP73. El anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo con CDR injertadas, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la primera realización de la presente invención, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), se caracteriza por el hecho de que la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a GP73 se produce con alta afinidad.
La presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado del mismo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), en donde el anticuerpo comprende un dominio o región seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (b) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, (c) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (d) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (e) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (f) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (g) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (h) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (i) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (j) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (k) una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (l) una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (m) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, (n) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (que es el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado del mismo abarcado por la presente invención), (o) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (p) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (q) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (r) un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (s) una cadena pesada variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (t) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, (u) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, (w) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (x) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, (y) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (z) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, (aa) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (bb) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, (cc) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; (dd) una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (ee) una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, (ff) una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, (gg) una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, (hh) una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, (ii) una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y (jj) una cadena de dominio variable pesado que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena de dominio variable ligero que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Un anticuerpo de la presente divulgación se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, una molécula de inmunoglobulina, un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, uno madurado por afinidad, un scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo con CDR injertadas, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 y un Fv. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgE humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana y un dominio constante de IgA humana. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable pesada que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 41. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable ligera que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, Se Q ID NO: 29, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 45. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR): SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36; o SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR): SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40; o SEQ ID NO:46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (c Dr ) de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40. De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable pesado que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:44 y un dominio variable ligero que comprende los restos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la primera realización de la presente invención indicada anteriormente comprende además un agente seleccionado entre el grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de obtención de imágenes y un agente terapéutico. El agente de obtención de imágenes se selecciona entre el grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina. El radiomarcador se selecciona entre el grupo que consiste en 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención se une al epítopo de GP73, preferentemente en la secuencia de aminoácidos de: VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGR (hGP73307-339) (SEQ ID NO: 101). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9- y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Más en particular, una realización del anticuerpo de acuerdo con la presente invención se refiere a lo siguiente: una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación se une al epítopo de GP73 en la secuencia de aminoácidos de: EQVVEDRPVGGR (hGP73276-287) (SEQ ID NO: 102). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo mencionado de acuerdo con la presente divulgación comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo adicional de acuerdo con la presente divulgación se une al epítopo de GP73 en la secuencia de aminoácidos de: LRGEDDYNMDENEAESETDK (hGP73 344-363) (SEQ ID NO: 103). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo mencionado de acuerdo con la presente divulgación comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una cadena pesada variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo adicional de acuerdo con la presente divulgación se une al epítopo de GP73 en la secuencia de aminoácidos de: ELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQLESVNK (hGP7363-96) (SEQ ID NO:104). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo mencionado de acuerdo con la presente divulgación comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. La unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo a GP73 de acuerdo con la presente divulgación es sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en GP73. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo mencionado de la presente divulgación comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 33; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 37; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. La unión de otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente divulgación a GP73 es insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre GP73. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende: una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 41; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado que se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-H1 que tiene la fórmula: X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID n O: 108) una CDR-H2 que tiene la fórmula: X10-I-X11 -X12-X13-X14-X15-X16X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27 (SEQ ID NO: 109), una CDR-H3 que tiene la fórmula: X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO: 110), una CDR-L1 que tiene la fórmula: X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50-X51-X52-X53-X54 (SEQ ID NO: 111), una CDR-L2 que tiene la fórmula: X55-X56-S-X57-X58-X59-X60 (SEQ ID NO: 112) y una CDR-L3 que tiene la fórmula: X61-Q-X62-X63-X64-X65-P-X66-T (SEQ ID NO: 113), en donde: X5 es S, N o T; X6 es Y o N; X7 es W, V, G, A o T; X8 es I, V o M; X9 es E, H, S o N; X10 es E, Y, V, T o R; X11 es L, W, S o R; X12 es P, S, R o T; X13 está ausente o es K; X14 está ausente o es R; X15 es G, T o Y; X16 es S, G o N; X17 es G, D, S, T o Y; X18 es N, S, Y, G o T; X19 es T o I; X20 es N, K, Y o F; X21 es Y o F; X22 es N, P o A; X23 es E, S o D; X24 es K, A o S; X25 es F, L o V; X26 es K o M; X27 es G, S o D; X28 es G, Q, D, E o N; X29 es R, Q, P, Y, W o G; X30 es G, L, F, D o T; X31 es S, T, S o G; X32 es Y, D, G, E o T; X33 es R, Y, D, L o F; X34 es Y, F, T o H; X35 es H o Y; X36 es W, D o Y; X37 es F, Y o A; X38 está ausente o es F o M; X39 es A o D; X40 es K, T, R o S; X41 es A o S; X42 es Q, S o K; X43 es S o G; X44 es V o L; X45 es D o L; X46 es Y, D o H; X47 está ausente o es S; X48 es D, V, N o I; X49 es G, V o S; X50 es D, K, S o I; X51 es S, T, I o N; X52 es Y o D; X53 es M, L o V; X54 es N, I, S, H o Y; X55 es A, L, S, Q o R; X56 es A, V, T o M; X57 es N, K, Y o S; X58 es L o R; X59 es E, D, Y o A; X60 es S o I; X61 es Q, W, H o A; X62 es S, G, H, Y o N; X63 es N, T, F, H o L; X64 es E, H, T, R o S; X65 es D, F, T, S, L o I; y Xa6 es Y o L.
La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la primera realización descrita anteriormente, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), en donde dicho anticuerpo tiene una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre 4,0 x 10-9 a 1,8 x 10-12.
La presente invención se refiere además a un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la primera realización descrita anteriormente, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), en donde dicho anticuerpo tiene una constante de disociación (koff) de entre 1,5 x 10-3 a 8,0 x 10-6. La presente invención se refiere además a un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la primera realización descrita anteriormente, que se une inmunoespecíficamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73"), en donde dicho anticuerpo tiene una constante de asociación (kon) de entre 1,0 x 105 a 4,1 x 106 La presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica las SEQ ID NO:9 y 13. La presente divulgación se refiere además a un ácido nucleico aislado que codifica una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-8, 10-12 y 14-48.
De acuerdo con su segunda realización, que se expone en la reivindicación 6, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
La presente divulgación se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 49-96.
La presente invención se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 13, opcionalmente como parte de un vector. La presente divulgación se refiere, en cambio, a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica: la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 1, (ii) SEQ ID NO: 5 o (iii) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 17, (ii) SEQ ID NO: 21 o (iii) SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 21, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 25, (ii) SEQ ID NO: 29 o (iii) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 29, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) SeQ ID NO: 33, (ii) Se Q ID NO: 37 o (iii) SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 37, opcionalmente como parte de un vector; o la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 41, (ii) SEQ ID NO: 45 o (iii) SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 45, opcionalmente como parte de un vector. La presente divulgación se refiere además a un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico comprende: la secuencia de nucleótidos de (i) SEQ ID NO: 49, (ii) SEQ ID NO: 53 o (iii) SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 53, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de nucleótidos de (i) Se Q ID NO: 57, (ii) Se Q ID NO: 61 o (iii) SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 61, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de nucleótidos de (i) SEQ ID NO: 65, (ii) SEQ ID NO: 69 o (iii) SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 69, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de nucleótidos de (i) SEQ ID NO: 73, (ii) SEQ ID NO: 77 o (iii) SEQ ID NO: 73 y Se Q ID NO: 77, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de nucleótidos de (i) Se Q ID NO: 81, (ii) Se Q ID NO: 85 o (iii) SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 85, opcionalmente como parte de un vector; o la secuencia de nucleótidos de (i) SEQ ID NO: 89, (ii) SEQ ID NO: 93 o (iii) SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 93, opcionalmente como parte de un vector.
De acuerdo con su tercera realización, expuesta en la reivindicación 7, la presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende y expresa un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 13, opcionalmente como parte de un vector. La presente divulgación se refiere además a una célula hospedadora que comprende y expresa un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica: la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 1, (ii) SEQ ID n O: 5 o (iii) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) Se Q ID NO: 17, (ii) SEQ ID NO: 21 o (iii) SEQ ID NO: 17 y s Eq ID NO: 21, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) SeQ ID NO: 25, (ii) Se Q ID NO: 29 o (iii) SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 29, opcionalmente como parte de un vector; la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 33, (ii) SEQ ID NO: 37 o (iii) SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 37, opcionalmente como parte de un vector; o la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 41, (ii) SEQ ID NO: 45 o (iii) SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 45, opcionalmente como parte de un vector.
De acuerdo con su cuarta realización, expuesta en la reivindicación 8, la presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo del mismo, que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con su quinta realización, expuesta en la reivindicación 9, la presente invención se refiere además a un método para determinar la concentración de GP73 en una muestra de ensayo, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73 para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73; poner en contacto el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73 con al menos un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura y forma un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección; y determinar la concentración de GP73 en la muestra de ensayo basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección formado en la etapa anterior; en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de la primera realización de la presente invención y el al menos un anticuerpo de detección es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección. El método comprende además comparar la señal generada por el marcador detectable como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en la muestra de ensayo con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en un control o calibrador. La concentración de GP73 en la muestra de ensayo se usa para determinar o evaluar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedad hepática. Una concentración de GP73 aumentada en comparación con la concentración de GP73 en un control o calibrador indica que el sujeto tiene enfermedad hepática. La enfermedad hepática es cirrosis hepática o cáncer de hígado.
La presente divulgación se refiere además a un método para determinar la concentración de GP73 en una muestra de ensayo, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73 para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73; poner en contacto el complejo de anticuerpo de capturaantígeno de GP73 con al menos un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura y forma un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección; y determinar la concentración de GP73 en la muestra de ensayo basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección formado en (b); en donde el al menos un anticuerpo de captura comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; una cadena pesada variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; en donde el al menos un anticuerpo de detección comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
La proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre GP73 comprende: lectina de Aleuria aurantia (AAL) o un fragmento de la misma; una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 33; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 37; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. El método reivindicado en el presente documento comprende además comparar la señal generada por el marcador detectable como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en la muestra de ensayo con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en un control o calibrador. La concentración de GP73 en la muestra de ensayo se usa para determinar o evaluar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedad hepática. Una concentración de GP73 aumentada en comparación con la concentración de GP73 en un control o calibrador indica que el sujeto tiene enfermedad hepática. La enfermedad hepática es cirrosis hepática o cáncer de hígado.
La presente divulgación se refiere además a un método para diagnosticar y tratar la enfermedad hepática en un sujeto, comprendiendo el método: obtener una muestra biológica que comprende sangre del sujeto; determinar la concentración de GP73 en la muestra biológica del sujeto usando el método descrito anteriormente: comparar la concentración de GP73 en la muestra biológica con la concentración de GP73 en un control normal o calibrador; diagnosticar que el sujeto tiene enfermedad hepática en caso de que la concentración de GP73 en la muestra biológica sea mayor que la concentración de GP73 en el control normal o el calibrador; y administrar un régimen de tratamiento para la enfermedad hepática al sujeto al que se diagnostica que tiene enfermedad hepática. La muestra biológica de un sujeto se selecciona entre una muestra de tejido, fluido corporal, sangre completa, plasma, suero, orina, fluido de lavado broncoalveolar y una suspensión de cultivo celular o una fracción de la misma. La muestra biológica de un sujeto es plasma sanguíneo o suero sanguíneo. La enfermedad hepática es cirrosis hepática o cáncer de hígado. El método comprende además determinar el nivel de al menos un biomarcador de enfermedad hepática adicional en la muestra biológica y comparar el nivel del al menos un biomarcador adicional de enfermedad hepática con un valor de concentración de referencia para el al menos un biomarcador de enfermedad hepática. El biomarcador adicional de enfermedad hepática se selecciona entre el grupo que consiste en PIVKA-II, AFP, AFP-L3, Fuc-HPX, Fc-Kin y F-AT.
La presente divulgación se refiere además a un método para determinar si un sujeto está respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas, comprendiendo el método: medir la concentración de GP73 en una muestra del sujeto usando el método descrito anteriormente; comparar la concentración de GP73 en la muestra con la concentración de GP73 en un control normal o calibrador, en donde una concentración de GP73 alterada indica que el sujeto no está respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas; y ajustar el tratamiento del sujeto en caso de que el sujeto no esté respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas.
La presente divulgación se refiere además a un método para diagnosticar y tratar la enfermedad hepática en un sujeto, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73 para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73; poner en contacto el complejo de anticuerpo de capturaantígeno de GP73 con al menos un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura y forma un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección; determinar la concentración de GP73 en la muestra de ensayo basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección formado en (b); comparar la concentración de GP73 en la muestra con la concentración de GP73 en un control normal o calibrador; diagnosticar que el sujeto tiene enfermedad hepática en caso de que la concentración de GP73 en la muestra biológica sea mayor que la concentración de GP73 en el control normal o el calibrador; y administrar un régimen de tratamiento para la enfermedad hepática al sujeto al que se diagnostica que tiene enfermedad hepática; en donde el al menos un anticuerpo de captura comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 l; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; una cadena pesada variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; en donde el al menos un anticuerpo de detección comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. La enfermedad hepática es cirrosis hepática o cáncer de hígado.
De acuerdo con su sexta realización, expuesta en la reivindicación 12, la presente invención se refiere además a un kit que comprende el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o mezcla que comprende un anticuerpo aislado o a un fragmento de anticuerpo del mismo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
La presente invención se refiere además a un kit que comprende un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
De acuerdo con su séptima realización, expuesta en la reivindicación 13, la presente invención se refiere a un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73, al menos un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura e instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73, en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección. Preferentemente, el kit comprende además un patrón de referencia que indica una concentración de GP73 en un control o calibrador.
La presente divulgación se refiere además a un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73, al menos un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura e instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73, en donde el al menos un anticuerpo de captura comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; una cadena pesada variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; en donde el al menos un anticuerpo de detección comprende: un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y un dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, en donde el al menos un anticuerpo de detección está opcionalmente marcado de manera detectable.
La presente divulgación se refiere además a un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 fucosilada, comprendiendo dicho kit al menos una proteína de unión de captura, en donde la proteína de unión de captura se une a GP73 o a un fragmento de GP73, al menos una proteína de unión de detección, en donde la proteína de unión de detección se une a GP73 a la que no se une la proteína de unión de captura e instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73, en donde la al menos una proteína de unión de captura comprende una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre GP73 y la al menos una proteína de unión de detección comprende una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es sensible a la fucosilación de GP73.
La presente divulgación se refiere además a un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 fucosilada, comprendiendo dicho kit al menos una proteína de unión de captura, en donde la proteína de unión de captura se une a GP73 o a un fragmento de GP73, al menos una proteína de unión de detección, en donde la proteína de unión de detección se une a GP73 a la que no se une la proteína de unión de captura e instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73, en donde la al menos una proteína de unión de captura comprende una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es sensible a la fucosilación de
GP73 y la al menos una proteína de unión de detección comprende una proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es insensible a la fucosilación de GP73. La proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es sensible a la fucosilación de GP73 comprende: lectina de Aleuria aurantia (AAL) o un fragmento de la misma; una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 33; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 37; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 32; una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; una cadena pesada variable que comprende una c Dr
1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. La proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 es insensible a la fucosilación de GP73 comprende una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 41; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO:41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45;
una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. El kit comprende además un patrón de referencia que indica una concentración de GP73 en un control o calibrador.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la construcción de GP73 de E. coli.
La figura 2 muestra la construcción de GP73-hFc de CHO y HEK.
La figura 3 muestra un ensayo de inhibición competitiva del mAb anti-GP73 marcado con biotina con AAL libre. La figura 4 muestra la reactividad del mAb anti-GP73 con IgG quimérica de ratón-humano, GP73 expresada en E. coli, y antígeno GP73-hFc recombinante expresado en células HEK.
La figura 5 muestra un ensayo de inhibición competitiva del mAb anti-GP73 marcado con biotina con fucosa libre. La figura 6 muestra la reactividad del mAb 1A-3187 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1A-3187 no está abarcado por la presente invención.
La figura 7 muestra la reactividad del mAb 1A-4246 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1A-4246 no está abarcado por la presente invención.
La figura 8 muestra la reactividad del mAb 1B-3246 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1-B-3246 no está abarcado por la presente invención.
La figura 9 muestra la reactividad del mAb 1B-3440 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1B-3440 no está abarcado por la presente invención.
La figura 10 muestra la reactividad del mAb 1B-4863 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1B-4836 no está abarcado por la presente invención.
La figura 11 muestra la reactividad del mAb 1B-4971 con GP73 peryodada. El anticuerpo mAb 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
La figura 12 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 12A) y ligera (figura 12B) para el mAb 1A-3187 (no abarcado por la presente invención). La figura 13 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 13A) y ligera (figura 13B) para el mAb 1A-4246 (no abarcado por la presente invención). La figura 14 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 14A) y ligera (figura 14B) para el mAb 1B-3246 (no abarcado por la presente invención). La figura 15 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 15A) y ligera (figura 15B) para el mAb 1B-3440 (no abarcado por la presente invención). La figura 16 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 16A) y ligera (figura 16B) para el mAb 1B-4863 (no abarcado por la presente invención). La figura 17 muestra un diagrama y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las secuencias variables de cadena pesada (figura 17A) y ligera (figura 17B) para el mAb 1B-4971 (abarcado por la presente invención).
La figura 18 muestra el mapa de péptidos del epítopo de los mAb anti-GP73 para GP73-hFc.
La figura 19 muestra un ejemplo del principio de inmunoensayo en sándwich ARCHITECT®.
La figura 20 muestra el ensayo ARCHITeCt® para GP73 usando el mAb 14H4-23 o 1A-4246 como el anticuerpo de captura (0,1 mg/ml) y 1B-4863 como el anticuerpo de detección (0,5 nM).
La figura 21 muestra el ensayo ARCHITECT® para GP73 usando el mAb 1A-4246 (0,2 mg/ml) como el anticuerpo de captura y 1B-4863 como el anticuerpo de detección (0,5 o 2 nM).
Descripción detallada
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-proteína del Golgi 73 (GP73) y al uso de dichos anticuerpos en inmunoensayos para analizar los niveles de GP73 y de GP73 fucosilada para identificar, diagnosticar y tratar enfermedades en sujetos que lo necesiten. Los anticuerpos anti-GP73 de la presente divulgación tienen mayores afinidades de unión que los anticuerpos anteriormente disponibles. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden usarse en inmunoensayos para detectar GP73 y/o GP73 fucosilada, proporcionando de este modo una combinación única de anticuerpos para detectar GP73 y/o GP73 fucosilada en una muestra frente a un amplio intervalo de concentraciones. El uso de estos anticuerpos en dichos inmunoensayos proporciona un ensayo más versátil y sensible. También se ha descubierto que los anticuerpos de la presente divulgación superaron en rendimiento en tres veces a un anticuerpo anti-GP73 conocido en inmunoensayos.
El intervalo de concentración detectable aumentado de los inmunoensayos divulgados proporciona un ensayo más preciso y sensible para diagnosticar y distinguir la enfermedad hepática y el cáncer en un paciente. Por consiguiente, los inmunoensayos divulgados pueden usarse para detectar concentraciones de GP73 aumentadas o reducidas en una muestra en comparación con una muestra de control o calibrador y por lo tanto, usarse para identificar diversas enfermedades en un paciente, tales como enfermedades hepáticas y cánceres. El uso del inmunoensayo de GP73 puede proporcionar un diagnóstico preciso y el posterior tratamiento de pacientes con enfermedades, tales como enfermedad hepática o cáncer.
Los encabezados de sección como se usan en esta sección y la divulgación completa tienen un fin sencillamente organizativo y no pretenden ser limitantes.
1. Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluyendo las definiciones. Los métodos y materiales preferidos se describen más adelante, aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención. Los materiales, métodos y ejemplos divulgados en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Las expresiones "que comprende/n", "que incluye/n", "que tiene", "tiene", "puede", "contiene/n", y las variantes de las mismas, como se usan en el presente documento, pretenden ser fases, términos o palabras transicionales con extremos abiertos, que no anulan la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas en singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en", las realizaciones o elementos presentados en el presente documento, ya se expongan o no explícitamente.
"14H4-23", "anticuerpo monoclonal 14H4-23" y "anticuerpo monoclonal 14H4-23", como se usan en el presente documento, se refieren indistintamente a un anticuerpo monoclonal de ratón que se une a GP73. El anticuerpo monoclonal 14H4-23 procedía del laboratorio de los Dres. Anand Mehta y Tim Block en la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. La unión del anticuerpo monoclonal 14H4-23 no es sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre GP73.
"Anticuerpo madurado por afinidad" se usa en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDR, que dan como resultado una mejora en la afinidad (es decir, Kd, kd o ka) del anticuerpo por un antígeno diana en comparación con un anticuerpo precursor, que no posee la o las alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Se conoce en la técnica una variedad de procedimientos para producir anticuerpos madurados por afinidad, incluyendo la exploración de una biblioteca combinatoria de anticuerpos que se ha preparado usando biopresentación. Por ejemplo, Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad mediante reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los restos de la CDR y/o marco se describe por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectivas y en posiciones de contacto o hipermutación con un resto de aminoácido potenciador de la actividad se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.914.128 B1.
"Lectina de Aleuria aurantia" y "AAL", como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a una proteína fúngica compuesta por dos subunidades idénticas de 312 aminoácidos que reconoce específicamente a glucanos fucosilados y se usa ampliamente como sonda específica para fucosa. AAL se une preferencialmente a estructuras relacionadas con fucosa unida (a-1,6) a N-acetilglucosamina o a fucosa unida (a-1,3) a N-acetillactosamina.
"Anticuerpo" y "anticuerpos", como se usan en el presente documento, se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), anticuerpos animales, tales como, pero sin limitación, un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, una ballena y un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata, un ratón, etc.) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, un chimpancé, etc.), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, Fvs monocatenarios ("scFv"), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, Fv unidos por disulfuro ("dsFv") y anticuerpos antiidiotipo ("anti-Id"), anticuerpos de dominio dual, anticuerpos de dominio variable dual (DVD) o de dominio variable triple (TVD) (las inmunoglobulinas de dominio variable dual y los métodos para producirlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007) y la Solicitud Internacional PCT WO 2001/058956) y fragmentos de unión a epítopo funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, concretamente, moléculas que contienen un sitio de unión a analito. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. En favor de la simplicidad, un anticuerpo contra un analito se cita frecuentemente en el presente documento como un "anticuerpo anti-analito" o simplemente un "anticuerpo para analito" (por ejemplo, un anticuerpo anti-GP73 o un anticuerpo para GP73).
"Fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable. La porción no incluye los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo de anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de Fv monocatenario (scFv), polipéptidos monocatenarios que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, polipéptidos monocatenarios que contienen tres c Dr del dominio variable de cadena ligera, polipéptidos monocatenarios que contienen solo una región variable de cadena pesada y polipéptidos monocatenarios que contienen las tres CDR de la región variable de cadena pesada.
El "área bajo la curva" o "ABC" se refiere al área bajo una curva ROC. La ABC bajo una curva ROC es una medida de la precisión. Un área de 1 representa un ensayo perfecto, mientras que un área de 0,5 representa un ensayo insignificante. Una ABC preferida puede ser de al menos 0,700, al menos 0,750, al menos 0,800, al menos 0,850, al menos 0,900, al menos 0,910, al menos 0,920, al menos 0,930, al menos 0,940, al menos 0,950, al menos 0,960, al menos 0,970, al menos 0,980, al menos 0,990 o al menos 0,995.
En el presente documento se describen "constantes de unión". La expresión "constante de velocidad de asociación", "kon" o "ka" como se usa en el presente documento, se refiere al valor que indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno diana o la velocidad de formación de complejos entre un anticuerpo y antígeno, como se muestra mediante la ecuación a continuación:
Anticuerpo (Ab) Antígeno (Ag) ^ Ab-Ag.
La expresión "constante de velocidad de disociación", "koff" o "kd" como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere al valor que indica la constante de disociación de un anticuerpo de su antígeno diana o la separación del complejo de Ab-Ag con el paso del tiempo en anticuerpo y antígeno libre como se muestra mediante la ecuación a continuación:
Anticuerpo (Ab) Antígeno (Ag) ^ Ab-Ag.
Se conocen bien en la técnica métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación. El uso de técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad para examinar muestras en tampones fisiológicos en equilibrio. Pueden usarse otras estrategias e instrumentos experimentales, tales como un ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) (por ejemplo, el instrumento disponible de BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, también puede usarse un ensayo KinExA® (ensayo de exclusión cinética), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
La expresión "constante de disociación en equilibrio", "Kd", "Kd" o "Kd" como se usan indistintamente, en el presente documento, se refiere al valor obtenido dividiendo la constante de disociación (koff) entre la constante de asociación (kon). La constante de asociación, la constante de disociación y la constante de disociación en equilibrio se usan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno.
"Proteína de unión" se usa en el presente documento para hacer referencia a una proteína monomérica o multimérica que se une a y forma un complejo con un compañero de unión, tal como, por ejemplo, un polipéptido, un antígeno, un compuesto químico u otra molécula o un sustrato de cualquier tipo. Una proteína de unión se une específicamente a un compañero de unión. Las proteínas de unión incluyen anticuerpos, así como fragmentos de unión a antígeno de los mismos y otras formas diversas y derivados de los mismos, como se conocen en la técnica y se describen más adelante en el presente documento y otras moléculas que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno que se unen a una molécula de antígeno o un sitio particular (epítopo) sobre la molécula de antígeno. Consiguientemente, una proteína de unión incluye, pero sin limitación, un anticuerpo, una inmunoglobulina tetramérica, una molécula de IgG, una molécula de IgG1, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con CDR injertadas, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo madurado por afinidad y fragmentos de cualquier anticuerpo similar que conserve la capacidad de unirse a un antígeno.
"Anticuerpo biespecífico" se usa en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo de longitud completa que se genera mediante la tecnología de cuadroma (véase Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), mediante conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase, Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)) o mediante botón en ojal o enfoques similares, que introducen mutaciones en la región Fc (véase Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 90(14): 6444-6448 (1993)), dando como resultado múltiples especies diferentes de inmunoglobulina de las cuales solo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítopo) en uno de sus brazos de unión (un par de HC/LC) y se une a un antígeno (o epítopo) diferente en su segundo brazo (un par diferente de HC/lC). Según esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión a antígeno distintos (tanto en especificidad como en secuencias de CDR) y es monovalente para cada antígeno al que se une.
Para la cita de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9 y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
"Cáncer" como se usa en el presente documento, se refiere al crecimiento no controlado y no regulado de células anormales en el organismo. Las células cancerosas también se denominan células malignas. El cáncer puede invadir partes cercanas del organismo y también puede diseminarse a partes más distantes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo. Los cánceres incluyen carcinoma adrenocortical, cáncer de ano, cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma de sitio primario desconocido, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer del conducto biliar extrahepático, familia de tumores de Ewing (PNET), tumor de células germinales extracraneal, melanoma intraocular, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor de células germinales extragonadales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de células de islote, cáncer renal (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia, mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, tricoleucemia, cáncer de labio y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, linfoma relacionado con SIDA, linfoma (primario) del sistema nervioso central, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mesotelioma maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovarios epitelial, tumor de células germinales ováricas, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas exocrino, carcinoma de células de islote, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de la hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer de recto, cáncer de células renales (cáncer de riñón), de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de las glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de testículos, timoma maligno, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, Cáncer inusual infantil, cáncer de vagina, cáncer de vulva y tumor de Wilms.
En el presente documento, "CDR" se usa para hacer referencia a la "región determinante de la complementariedad" en una secuencia variable de anticuerpo. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", por cada una de las regiones variables. La expresión "conjunto de CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de tres CDR que se produce en una sola región variable que se une al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de manera diferente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de restos unívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites precisos de restos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden citarse como "CDR de Kabat". Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); y Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)) descubrieron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de la cadena principal peptídica prácticamente idénticas, a pesar de tener una gran diversidad de secuencia a nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se denominaron "L1", "L2" y "L3" o "H1", "H2" y "H3", donde la "L" y la "H" indican las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden citarse como "CDR de Chothia", que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. Se han descrito otros límites que definen las CDR que se solapan con las CDR de Kabat por Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995) y MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996). Otras definiciones más de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas del presente documento, pero sin embargo se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas en vista de la predicción o de hallazgos experimentales de que restos o grupos de restos particulares o incluso CDR enteras no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Los métodos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas realizaciones usan CDR definidas por Kabat o Chothia.
"Componente", "componentes", o "al menos un componente", se refieren generalmente a un anticuerpo de captura, un conjugado de detección, un calibrador, un control, un panel de sensibilidad, un recipiente, un tampón, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un sustrato (por ejemplo, en forma de una solución), una solución de parada y similares que pueden incluirse en un kit para el ensayo de una muestra de ensayo, tal como una muestra de orina, suero o plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento y otros métodos conocidos en la técnica. Algunos componentes pueden encontrarse en solución o liofilizados para su reconstitución para usarse en un ensayo.
"Derivado" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, puede referirse a un anticuerpo que tiene una o más modificaciones en su secuencia de aminoácidos cuando se compara con un anticuerpo genuino o precursor y muestra una estructura de dominio modificada. El derivado puede seguir siendo capaz de adoptar la configuración de dominio típica hallada en los anticuerpos nativos, así como una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unirse a dianas (antígenos) con especificidad. Los ejemplos típicos de derivados de anticuerpos son anticuerpos acoplados a otros polipéptidos, dominios de anticuerpo reorganizados o fragmentos de anticuerpos. El derivado también puede comprender al menos un compuesto adicional, por ejemplo, un dominio de proteína, estando dicho dominio de proteína unido mediante enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede estar basado en fusión genética, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo empleado de acuerdo con la invención puede estar unido preferencialmente mediante un enlazador flexible, ventajosamente un enlazador peptídico, en donde dicho enlazador peptídico comprende una pluralidad de aminoácidos hidrófilos enlazados peptídicamente de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal del dominio de proteína adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo o viceversa. El anticuerpo puede estar unido a una molécula efectora que tiene una conformación adecuada para la actividad biológica o unión selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa (por ejemplo, una citocina u hormona del crecimiento), un agente químico, un péptido, una proteína o un fármaco, por ejemplo.
"Anticuerpo específico dual" se usa en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo de longitud completa que puede unirse a dos antígenos diferentes (o epítopos) en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la Publicación PCT WO 02/02773). Consiguientemente, una proteína de unión específica dual tiene dos brazos de unión a antígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas y es bivalente para cada antígeno al que se une.
"Dominio variable dual" se usa en el presente documento para hacer referencia a dos o más sitios de unión a antígeno en una proteína de unión, que pueden ser divalentes (dos sitios de unión a antígeno), tetravalentes (cuatro sitios de unión a antígeno) o proteínas de unión multivalentes. Los DVD pueden ser monoespecíficos, es decir, capaces de unirse a un antígeno (o un epítopo específico) o multiespecíficos, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos (es decir, dos o más epítopos de la misma molécula de antígeno diana o dos o más epítopos de antígenos diana diferentes). Una proteína de unión DVD preferida comprende dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera y se cita como una "inmunoglobulina DVD" o "DVD-Ig". Dicha proteína de unión DVD-Ig es por lo tanto tetramérica y reminiscente de una molécula de IgG, pero proporciona más sitios de unión a antígeno que una molécula de IgG. Por consiguiente, cada mitad de una molécula de DVD-Ig tetramérica es reminiscente de una mitad de una molécula de IgG y comprende un polipéptido de DVD de cadena pesada y un polipéptido de DVD de cadena ligera, pero a diferencia de un par de cadenas pesada y ligera de una molécula de IgG que proporciona un solo dominio de unión a antígeno, un par de cadenas pesada y ligera de una DVD-Ig proporciona dos o más sitios de unión a antígeno.
Cada sitio de unión a antígeno de una proteína de unión DVD-Ig puede proceder de un anticuerpo monoclonal donante ("precursor") y por lo tanto, comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) con un total de seis CDR implicadas en la unión al antígeno por sitio de unión a antígeno. Consiguientemente, una proteína de unión DVD-Ig que se une a dos epítopos diferentes (es decir, dos epítopos diferentes de dos moléculas de antígeno diferentes o dos epítopos diferentes de la misma molécula de antígeno) comprende un sitio de unión a antígeno procedente de un primer anticuerpo monoclonal precursor y un sitio de unión a antígeno de un segundo anticuerpo monoclonal precursor.
Una descripción del diseño, la expresión y la caracterización de las moléculas de unión DVD-Ig se proporciona en la Publicación PCT n.° WO 2007/024715, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.612.181 y Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007). Un ejemplo preferido de dichas moléculas de DVD-Ig comprende una cadena pesada que comprende la fórmula estructural VD1-(X-i)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador, a condición de que no sea CH1, X2 es una región Fc y n es 0 o 1, pero preferentemente 1; y una cadena ligera que comprende la fórmula estructural VD1-(X-i)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador, a condición de que no sea CH1 y X2 no comprende una región Fc; y n es 0 o 1, pero preferentemente 1. Dicha DVD-Ig puede comprender dos cadenas pesadas de este tipo y dos cadenas ligeras de este tipo, en donde cada cadena comprende dominios variables unidos en tándem sin una región constante intermedia entre las regiones variables, en donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios de unión a antígeno en tándem funcionales y un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de unión tetramérica con cuatro sitios de unión a antígeno funcionales. En otro ejemplo, una molécula de DVD-Ig puede comprender cadenas pesadas y ligeras que comprenden cada una tres dominios variables (VD1, VD2, VD3) unidas en tándem sin una región constante intermedia entre dominios variables, en donde un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse para formar tres sitios de unión a antígeno y en donde un par de cadenas pesada y ligera puede asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de unión tetramérica con seis sitios de unión a antígeno.
En una realización preferida, una proteína de unión DVD-Ig de acuerdo con la invención no solo se une a las mismas moléculas diana a las que se unen sus anticuerpos monoclonales precursores, pero también posee una o más propiedades deseables de uno o más de sus anticuerpos monoclonales precursores. Preferentemente, dicha propiedad adicional es un parámetro de anticuerpo de uno o más de los anticuerpos monoclonales precursores. Los parámetros de anticuerpo que pueden aportarse a una proteína de unión DVD-Ig a partir de uno o más de sus anticuerpos monoclonales precursores incluyen, pero sin limitación, especificidad de antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad de proteína, solubilidad de proteína, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada con tejido y unión a antígeno ortóloga.
Una proteína de unión DVD-Ig se une a al menos un epítopo de una GP73. Los ejemplos no limitantes de una proteína de unión DVD-Ig incluyen una proteína de unión DVD-Ig que se une a uno o más epítopos de GP73, una proteína de unión DVD-Ig que se une a un epítopo de una GP73 humana y a un epítopo de una GP73 de otra especie (por ejemplo, ratón) y una proteína de unión DVD-Ig que se une a un epítopo de una GP73 humana y un epítopo de otra molécula diana.
"Epítopo" o "epítopos" o "epítopos de interés" se refiere a un sitio (o sitios) en cualquier molécula que se reconoce(n) y puede(n) unirse a un sitio (o sitios) complementario(s) sobre su compañero de unión específico. La molécula y el compañero de unión específico forman parte de un par de unión específica. Por ejemplo, un epítopo puede encontrarse en un polipéptido, una proteína, un hapteno, un antígeno de carbohidrato (tal como, pero sin limitación, glucolípidos, glucoproteínas o lipopolisacáridos) o un polisacárido. Su compañero de unión específica puede ser, pero sin limitación, un anticuerpo.
"Fragmento F(ab')2", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos generados mediante digestión con pepsina de anticuerpos IgG completos para retirar la mayor parte de la región Fc mientras que se deja intacta parte de la región bisagra. Los fragmentos F(ab')2 tienen dos porciones F(ab) de unión a antígeno unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y por lo tanto, son divalentes con un peso molecular de 110 kDa. Los fragmentos de anticuerpo divalentes (fragmentos F(ab')2) son más pequeños que las moléculas de IgG completas y permiten una mejor penetración en tejidos, facilitando de este modo un mejor reconocimiento de antígenos en inmunohistoquímica. El uso de fragmentos F(ab')2 también previene la unión no específica al receptor de Fc sobre células vivas o a proteína A/G. Los fragmentos F(ab')2 pueden tanto unirse a como precipitar antígenos.
"Marco" (FR) o "secuencia marco", como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse mediante diferentes sistemas (por ejemplo, véase lo anterior), el significado de una secuencia marco está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR-L1, -L2 y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2 y -H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones marco en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1 , FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las que la CDR1 está posicionada entre la FR1 y la FR2, la CDR2 entre la FR2 y la FR3 y la CDR3 entre la FR3 y la FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región marco, como se cita por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina de origen natural. Como se usa en el presente documento, una Fr representa una de las cuatro subregiones y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.
Las secuencias de FR de cadena pesada y cadena ligera humanas se conocen en la técnica y pueden usarse como secuencias marco "aceptoras" de cadena pesada y cadena ligera (o simplemente, secuencias "aceptoras") para humanizar un anticuerpo no humano usando técnicas conocidas en la materia. En una realización, las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas se seleccionan entre las secuencias marco listadas en bases de datos públicamente disponibles, tales como V-base (protocolo de transferencia de hipertexto://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) o en el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (IMGt®) (protocolo de transferencia de hipertexto://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/locusGenes/).
"GP73 fucosilada" se usa en el presente documento para describir una proteína de membrana del Golgi 73 que tiene un resto de azúcar de fucosa unido a esta.
"Sitio de unión a antígeno funcional" como se usa en el presente documento, puede significar un sitio en una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) que es capaz de unirse a un antígeno diana. La afinidad de unión a antígeno del sitio de unión a antígeno puede no ser tan fuerte como la proteína de unión precursora, por ejemplo, anticuerpo precursor, del que procede el sitio de unión a antígeno, pero la capacidad para unirse al antígeno ha de ser medible usando uno cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de proteínas, por ejemplo, anticuerpo, a un antígeno. Por otra parte, la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de una proteína multivalente, por ejemplo, anticuerpo multivalente, no es en este caso necesariamente cuantitativamente la misma.
"GP73" se usa en el presente documento para describir la proteína del Golgi 73, también conocida como proteína de membrana del Golgi 1 (GOLM1) y fosfoproteína del Golgi 2 (GOLPH2). GP73 es una proteína que está codificada por el gen GOLM1. Este procesa una proteína sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso y ayuda en el transporte de la carga de proteína a través del aparato de Golgi. GP73 se expresa ampliamente en células epiteliales normales de varios tejidos. La expresión intracelular regulada positivamente de GP73 potencia su tráfico intracelular a través de la vía endosómica, que brinda la oportunidad de la escisión endoproteolítica de GP73, dando como resultado la secreción de GP73 truncada. La expresión de GP73 está regulada positivamente en respuesta a la infección vírica, pero también se ha descubierto que está regulada positivamente en hepatocitos de pacientes con enfermedad hepática vírica y no vírica. GP73 se sobreexpresa en tejido de cáncer de próstata y de adenocarcinoma de pulmón. La glucosilación fucosilada se ha observado en tres cuartos de GP73 secretada de pacientes con carcinoma hepatocelular.
"Anticuerpo humanizado" se usa en el presente documento para describir un anticuerpo que comprende secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las que se ha alterado al menos una porción de la secuencia de VH y/o VL para que sea más "similar a la humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humana. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En una realización, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente, la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene únicamente una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.
Un anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Un anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la materia.
Las regiones marco y las CDR de un anticuerpo humanizado no corresponden precisamente a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o el marco consenso pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o eliminación de al menos un resto de aminoácido, de tal forma que el resto de la CDR o el marco en el sitio no corresponde con el anticuerpo donante o el marco consenso. En una realización preferida, dichas mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Normalmente, al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95 % de los restos de anticuerpo humanizados corresponderán a los de las secuencias de FR y CDR precursoras. Como se usa en el presente documento, la expresión "marco consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina consenso. Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de inmunoglobulina consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) de aparición más frecuente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Por lo tanto, una "secuencia de inmunoglobulina consenso" puede comprender "regiones marco consenso" y/o "CDR consenso". En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se da con más frecuencia en esa posición en la familia. En caso de que dos aminoácidos se den con la misma frecuencia por igual, se puede incluir cualquiera de ellos en la secuencia consenso.
"Idéntico" o "identidad", como se usa en el presente documento en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o polinucleótido, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de restos que son iguales a lo largo de una región especificada. El porcentaje puede calcularse alineando óptimamente las dos secuencias, comparando las dos secuencias a lo largo de la región especificada, determinando el número de posiciones en las que aparece el resto idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la región especificada y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos donde las dos secuencias tienen longitudes diferentes o el alineamiento produce uno o más extremos escalonados y la región de comparación especificada incluye únicamente una sola secuencia, los restos de la secuencia individual se incluyen en el denominador pero no el numerador del cálculo.
"Polinucleótido aislado", como se usa en el presente documento, puede significar un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, ADNc o sintético o una combinación de los mismos) que, debido a su origen, el polinucleótido aislado no se asocia con la totalidad o una parte de un polinucleótido con el que se encuentra el "polinucleótido aislado" en la naturaleza; está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza; o no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
"Marcador" y "marcador detectable", como se usan en el presente documento, se refieren a un resto unido a un anticuerpo o un analito para hacer que la reacción entre el anticuerpo y el analito sea detectable y el anticuerpo o analito marcado de este modo se cita como "marcado de manera detectable". Un marcador puede producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varios marcadores incluyen sustancias productoras de señales, tales como cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos radiactivos y similares. Los ejemplos representativos de marcadores incluyen restos que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio y restos que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En el presente documento se describen otros marcadores. A este respecto, el resto, en sí mismo, puede no ser detectable pero puede volverse detectable al reaccionar con otro resto. El uso de la expresión "marcado de manera detectable" pretende abarcar dicho marcado.
Puede usarse cualquier marcador detectable adecuado como se conoce en la técnica. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador radiactivo (tal como 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm), un marcador enzimático (tal como peroxidasa de rábano picante, peroxidasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y similares), un marcador quimioluminiscente (tal como ésteres de acridinio, tioésteres o sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio y similares), un marcador fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, seleniuro de cadmio con cubierta de sulfuro de zinc), un marcador termométrico o un marcador de reacción en cadena de inmuno-polimerasa. Una introducción a los marcadores, los procedimientos de marcaje y la detección de marcadores se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2.a ed., Springer Verlag, N.Y. (1997) y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es un manual combinado y un catálogo publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón. Puede usarse un marcador fluorescente en FPIA (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.593.896, 5.573.904, 5.496.925, 5.359.093 y 5.352.803, que se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad). Puede usarse un compuesto de acridinio como marcador detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo (véanse, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)).
En un aspecto, el compuesto de acridinio es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio 9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Quemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., En Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, págs. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.468.646, 5.543.524 y 5.783.699.
Otro ejemplo de un compuesto de acridinio es un aril éster de acridinio-9-carboxilato. Un ejemplo de un aril éster de acridinio-9-carboxilato de fórmula II es el fluorofosfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres de arilo de 9-carboxilato de acridinio se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.241.070. Dichos aril ésteres de acridinio-9-carboxilato son indicadores quimioluminiscentes eficientes para el peróxido de hidrógeno producido en la oxidación de un analito por al menos una oxidasa en términos de la intensidad de la señal y/o la rapidez de la señal. El transcurso de la emisión quimioluminiscente para el aril éster de acridinio-9-carboxilato se completa rápidamente, es decir, en menos de 1 segundo, mientras que la emisión quimioluminiscente de la acridinio-9-carboxamida se extiende a lo largo de 2 segundos. El aril éster de acridinio-9-carboxilato, sin embargo, pierde sus propiedades quimioluminiscentes en presencia de proteínas. Por tanto, su uso requiere la ausencia de proteínas durante la generación y detección de señales. Los expertos en la materia conocen bien métodos para separar o retirar proteínas en la muestra e incluyen, pero sin limitación, ultrafiltración, extracción, precipitación, diálisis, cromatografía y/o digestión (véase, por ejemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). La cantidad de proteína retirada o separada de la muestra de ensayo puede ser del 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %. Se exponen detalles adicionales referentes al aril éster de acridinio-9-carboxilato y su uso en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 11/697.835, presentada el 9 de abril de 2007 y publicada como el documento US2008/0248493. Los aril ésteres de acridinio-9-carboxilato pueden disolverse en cualquier disolvente adecuado, tales como N,N-dimetilformamida anhidra desgasificada (DMF) o colato de sodio acuoso.
"Secuencia enlazadora" o "secuencia peptídica enlazadora" se refiere a una secuencia de polipéptido natural o artificial que está conectada a una o más secuencias de polipéptido de interés (por ejemplo, de longitud completa, fragmentos, etc.). El término "conectado" se refiere a la unión de la secuencia enlazadora a la secuencia polipeptídica de interés. Dichas secuencias polipeptídicas están unidas preferentemente por uno o más enlaces peptídicos. Las secuencias enlazadoras pueden tener una longitud de 4 a 50 aminoácidos. Preferentemente, la longitud de la secuencia enlazadora es de 6 a 30 aminoácidos. Las secuencias enlazadoras naturales pueden modificarse mediante sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos para crear secuencias enlazadoras artificiales. Las secuencias enlazadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación: (i) marcadores de histidina (His), tales como un marcador de 6X His, que tiene una secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 105) y son útiles como secuencias enlazadoras para facilitar el aislamiento y purificación de polipéptidos y anticuerpos de interés; (ii) sitios de escisión de enterocinasa, como marcadores de His, se usan en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. A menudo, se usan sitios de escisión de enterocinasa junto con marcadores de His en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Se conocen en la materia diversos sitios de escisión de enterocinasa. Los ejemplos de sitios de escisión de enterocinasa incluyen, pero sin limitación, la secuencia de aminoácidos de DDd Dk (SEQ ID NO: 106) y derivados de la misma (por ejemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 107), etc.); (iii) pueden usarse secuencias misceláneas para enlazar o conectar las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de fragmentos de región variable monocatenarios. Pueden encontrarse ejemplos de otras secuencias enlazadoras en Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Las secuencias enlazadoras también pueden modificarse respecto de funciones adicionales, tales como el acoplamiento de fármacos o el acoplamiento a soportes sólidos. En el contexto de la presente divulgación, el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede contener una secuencia enlazadora, tal como un marcador de His, un sitio de escisión de enterocinasa o ambas.
"Cáncer de hígado", como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer que se origina en el hígado. El cáncer de hígado incluye carcinoma hepatocelular (HCC) y carcinoma fibrolamelar. En la mayor parte de casos, la causa del cáncer de hígado es normalmente la formación de cicatrices en el hígado (es decir, cirrosis).
"Cirrosis hepática", como se usa en el presente documento, se refiere a la consecuencia de la enfermedad hepática crónica, caracterizada por el reemplazo del tejido hepático por fibrosis, tejido cicatricial y nódulos regenerativos (bultos que se producen debido a un proceso en el que se regenera el tejido dañado, lo que da lugar a la pérdida de función hepática). La organización arquitectónica de las unidades funcionales del hígado queda tan alterada que el flujo sanguíneo a través del hígado y la función hepática quedan alterados. La cirrosis está causada más comúnmente por el alcoholismo, la hepatitis B y C y la enfermedad del hígado graso, pero tiene otras muchas causas distintas posibles. Algunos casos son idiopáticos (es decir, de causa desconocida). Una vez que se ha desarrollado la cirrosis, pueden producirse las graves complicaciones de la enfermedad hepática, incluyendo hipertensión portal, insuficiencia hepática y cáncer de hígado. El riesgo de cáncer de hígado aumenta en gran medida una vez que se desarrolla la cirrosis y ha de considerarse una afección premaligna. La cirrosis puede estar causada por el abuso de alcohol, enfermedades autoinmunitarias del hígado, infección por el virus de la hepatitis B o C, inflamación del hígado que es a largo plazo (crónica) y sobrecarga de hierro en el organismo (hemocromatosis). Los pacientes con hepatitis B o C tienen riesgo de cáncer de hígado, incluso si no han desarrollado cirrosis.
"Enfermedad hepática", como se usa en el presente documento, se refiere al daño o la enfermedad del hígado. Los síntomas de la disfunción hepática incluyen tanto signos físicos como una variedad de síntomas relacionados con problemas digestivos, problemas de glucemia en sangre, trastornos inmunitarios, absorción anormal de grasas y problemas metabólicos. Le enfermedad hepática incluye fibrosis hepática, cirrosis hepática y cáncer de hígado. Todas las enfermedades hepáticas crónicas pueden ocasionar fibrosis hepática. La enfermedad hepática crónica puede estar causada por la hepatitis B vírica crónica y por la enfermedad hepática alcohólica.
"Fibrosis hepática", como se usa en el presente documento, se refiere a una acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular, incluyendo colágeno, que se produce en la mayoría de tipos de enfermedades hepáticas crónicas. La fibrosis hepática es el proceso de cicatrización que representa la respuesta del hígado a la lesión o enfermedad. La fibrosis hepática puede estar causada por infecciones debido a la hepatitis B y C, parásitos, uso excesivo de alcohol y exposición a agentes químicos tóxicos, incluyendo fármacos y conductos biliares bloqueados. La fibrosis hepática avanzada da como resultado cirrosis, insuficiencia hepática e hipertensión portal y normalmente requiere un trasplante de hígado.
"Anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones que tienen lugar de manera natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo antígeno. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de las cadenas es idéntico a u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que muestren la función biológica deseada.
"Proteína de unión multivalente" se usa en el presente documento para hacer referencia a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno (también citados en el presente documento como "dominios de unión a antígeno"). Una proteína de unión multivalente se modifica preferentemente para que tenga tres o más sitios de unión a antígeno y normalmente no es un anticuerpo de origen natural. La expresión "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión que puede unirse a dos o más dianas relacionadas o no relacionadas, incluyendo una proteína de unión capaz de unirse a dos o más epítopos diferentes de la misma molécula diana.
"Valor de corte predeterminado" y "nivel predeterminado", como se usa en el presente documento, se refieren a un valor de corte de ensayo que se usa para evaluar resultados de eficacia diagnóstica, pronóstica o terapéutica comparando los resultados del ensayo frente al valor de corte/nivel predeterminado, donde el valor de corte/nivel predeterminado ya se ha relacionado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, presencia de la enfermedad, estadio de la enfermedad, gravedad de la enfermedad, progresión, no progresión o mejora de la enfermedad, etc.). La divulgación proporciona niveles predeterminados ejemplares. Sin embargo, es de sobra conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, anticuerpos empleados, condiciones de reacción, pureza de la muestra, etc.). Además, se encuentra dentro de las capacidades de la técnica la adaptación de la divulgación del presente documento para otros inmunoensayos a fin de obtener valores de corte específicos de inmunoensayo para estos otros inmunoensayos basándose en la descripción proporcionada por la presente divulgación. Aunque el valor preciso del valor de corte/nivel predeterminado puede variar entre ensayos, han de ser aplicables generalmente las correlaciones como se describen en el presente documento.
"Reactivo de pretratamiento", por ejemplo, reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, como se usa en un ensayo diagnóstico como se describe en el presente documento, es uno que lisa cualquier célula y/o solubiliza cualquier analito que esté presente en una muestra de ensayo. No es necesario el pretratamiento para todas las muestras, como se describe con más detalle en el presente documento. Entre otras cosas, la solubilización del analito (es decir, GP73, fragmentos de GP73, variantes de GP73 o cualquier combinación de los mismos) implica la liberación del analito de cualquier proteína de unión endógena presente en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (sin requerir una etapa de separación) o heterogéneo (requiriendo una etapa de separación). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, se produce la retirada de cualquier proteína de unión a analito precipitada de la muestra de ensayo antes de proceder a la siguiente etapa del ensayo. El reactivo de pretratamiento puede comprender opcionalmente: (a) uno o más disolventes y sal, (b) uno o más disolventes, sal y detergente, (c) detergente, (d) detergente y sal o (e) cualquier reactivo o combinación de reactivos adecuada para la lisis celular y/o la solubilización del analito.
"Reactivos de control de calidad", en el contexto de los inmunoensayos y kits descritos en el presente documento, incluyen, pero sin limitación, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "patrón" se usa típicamente (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) a fin de establecer curvas de calibración (patrón) para la interpretación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Como alternativa, puede usarse un solo calibrador, que se encuentra próximo a un valor de corte positivo/negativo predeterminado. Pueden usarse múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variante de calibradores) de manera conjunta para que comprenda un "panel de sensibilidad".
Una curva de "característica operativa de receptor" o curva "ROC" se refiere a una representación gráfica que ilustra el rendimiento de un sistema de clasificación binario a medida que varía su umbral de discriminación. Se crea representando la fracción de auténticos positivos de entre los positivos (TPR = frecuencia de auténtico positivo) frente a la fracción de falsos positivos de entre los negativos (FPR = frecuencia de falso positivo), en varias configuraciones de umbral. La TPR también se conoce como sensibilidad y la FPR es uno menos la especificidad de la frecuencia de auténtico negativo.
"Anticuerpo recombinante" y "anticuerpos recombinantes" se refieren a anticuerpos preparados mediante una o más etapas, incluyendo clonando secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o una parte de uno o más anticuerpos monoclonales en un vector de expresión mediante técnicas recombinantes y posteriormente, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora adecuada. Los términos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales producidos de manera recombinante, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpo, anticuerpos bifuncionales, Ab heteroconjugados, DVD-Ig® y otros anticuerpos como se describen en (i) en el presente documento. (Las inmunoglobulinas de dominio variable dual y los métodos para producirlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)). La expresión "anticuerpo bifuncional", como se usan en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que comprende un primer brazo que tiene una especificidad por un sitio antigénico y un segundo brazo que tiene una especificidad por un sitio antigénico diferente, es decir, los anticuerpos bifuncionales tienen una especificidad dual.
"Evaluación de riesgo", "clasificación de riesgo", "identificación de riesgo" o "estratificación de riesgo" de sujetos (por ejemplo, pacientes), como se usa en el presente documento, se refiere a la evaluación de factores que incluyen biomarcadores, para predecir el riesgo de aparición de eventos futuros, incluyendo aparición de enfermedad o progresión de enfermedad, de tal forma que pueden efectuarse decisiones de tratamiento referentes al sujeto de una manera más informada.
"Muestra", "muestra de ensayo", "espécimen", "muestra de un sujeto" y "muestra de paciente", como se usa en el presente documento, pueden usarse indistintamente y pueden ser una muestra de sangre, tejido, orina, suero, plasma, fluido amniótico, líquido cefalorraquídeo, células o tejido placentario, células endoteliales, leucocitos o monocitos. La muestra puede usarse directamente como se obtiene de un paciente o puede pretratarse, tal como mediante filtración, destilación, extracción, concentración, centrifugación, inactivación de componentes interferentes, adición de reactivos y similares, para modificar de algún modo el carácter de la muestra como se analiza en el presente documento o de otro modo como se conoce en la técnica.
Puede utilizarse cualquier tipo celular, tejido o fluido corporal para obtener una muestra. Dichos tipos celulares, tejidos y fluidos pueden incluir secciones de tejidos, tales como muestras de biopsia y autopsia, secciones congeladas tomadas con fines histológicos, sangre (tal como sangre completa), plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, moco, saliva, fluido de lavado broncoalveolar (BAL), cabello, piel, glóbulos rojos, plaquetas, fluido intersticial, fluido de la lente ocular, líquido cefalorraquídeo, sudor, fluido nasal, fluido sinovial, menstruo, fluido amniótico, semen, etc. Los tipos celulares y tejidos también pueden incluir fluido linfático, fluido ascítico, fluido ginecológico, orina, fluido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, un fluido recogido mediante aclarado vaginal o un fluido recogido mediante enjuague vaginal. Puede proporcionarse un tejido o tipo celular retirando una muestra de células de un animal, pero también puede lograrse usando células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o con otro fin). También pueden usarse tejidos archivados, tales como aquellos que tienen un historial de tratamiento o de resultado. Pueden no ser necesarios el aislamiento y/o la purificación de proteínas o nucleótidos.
"Serie de composiciones de calibración" se refiere a una pluralidad de composiciones que comprende una concentración conocida de GP73, en donde cada una de las composiciones difiere de las otras composiciones en la serie por la concentración de GP73.
"Fase sólida" se refiere a cualquier material que sea insoluble o que puede hacerse insoluble mediante una reacción posterior. La fase sólida puede seleccionarse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un agente de captura. Como alternativa, la fase sólida puede tener unida sobre la misma un agente de unión que tiene la capacidad de atraer e inmovilizar el agente de captura. Por ejemplo, el agente enlazador puede incluir una sustancia cargada que tiene una carga opuesta con respecto al agente de captura en sí o con respeto a una sustancia cargada conjugada al agente de captura. En general, el agente enlazador puede ser cualquier compañero de unión (preferentemente específico) que se inmoviliza sobre (une a) la fase sólida y que tiene la capacidad de inmovilizar el agente de captura a través de una reacción de unión. El agente enlazador permite la unión indirecta del agente de captura a un material de fase sólida antes de llevar a cabo el ensayo o durante la ejecución del ensayo. Por ejemplo, la fase sólida puede ser plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, vidrio o silicio, incluyendo, por ejemplo, un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, lámina, perla, micropartícula, microplaca y otras configuraciones conocidas por los expertos habituales en la materia.
"Unión específica" o "uniéndose específicamente", como se usan en el presente documento, puede referirse a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, en donde la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas en general. En caso de que un anticuerpo sea específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contiene "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
"Compañero de unión específica" es un miembro de un par de unión específica. Un par de unión específica comprende dos moléculas diferentes, que se unen específicamente entre sí por medios químicos o físicos. Por tanto, además de los pares de unión específica de antígeno y anticuerpo de los inmunoensayos comunes, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, enzimas e inhibidores enzimáticos y similares. Asimismo, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específica originales, por ejemplo, un analito-análogo. Los miembros de unión específica inmunorreactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos y fragmentos de los mismos, ya se encuentren aislados o se produzcan de manera recombinante.
"Sujeto" y "paciente", como se usan en el presente documento, se refieren indistintamente a cualquier vertebrado, incluyendo, pero sin limitación, un mamífero (por ejemplo, vaca, cerdo, camello, llama, caballo, cabra, conejo, oveja, hámsteres, cobaya, gato, perro, rata y ratón, un primate no humano (por ejemplo, un mono, tal como un mono cinomolgo o rhesus, chimpancé, etc.) y un ser humano). En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano. El sujeto o paciente puede estar sometiéndose a otras formas de tratamiento.
"Tratar", "tratando" o "tratamiento" se usan cada uno indistintamente en el presente documento para describir la reversión, el alivio o la inhibición del progreso de una enfermedad o uno o más síntomas de dicha enfermedad, a la que se aplica dicho término. Dependiendo del estado del sujeto, el término también se refiere a prevenir una enfermedad e incluye prevenir la aparición de una enfermedad o prevenir los síntomas asociados con una enfermedad. Un tratamiento puede llevarse a cabo de una manera aguda o crónica. El término también se aplica a reducir la gravedad de una enfermedad o de los síntomas asociados con dicha enfermedad antes de estar afectado por la enfermedad. Dicha prevención o reducción de la gravedad de una enfermedad antes de estar afectado se refiere a la administración de un anticuerpo o una composición farmacéutica de la presente divulgación a un sujeto que en el momento de la administración no está afectado por la enfermedad. "Prevención" también se refiere a prevenir la reaparición de una enfermedad o de uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad. "Tratamiento" y "terapéuticamente" se refieren al acto de tratar, en el sentido en que se definió "tratar" anteriormente.
"Variante" se usa en el presente documento para describir un péptido o polipéptido que difiere en su secuencia de aminoácidos por la inserción, eliminación o sustitución conservativa de aminoácidos, pero conserva al menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse mediante un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. Variante también se usa en el presente documento para describir una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína citada con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como una implicación de un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, tomando en consideración el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol.
157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobia y carga. Se sabe en la técnica que pueden sustituirse aminoácidos con índices hidropáticos similares y seguir conservando la función de la proteína. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. También puede usarse la hidrofilia de los aminoácidos para revelar sustituciones que podrían dar como resultado proteínas que conservan la función biológica. La toma en consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la máxima hidrofilia media local de ese péptido, una medida útil que se ha informado que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. Patente de los Estados Unidos n.° 4.554.101. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo, la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Pueden llevarse a cabo sustituciones con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofilia como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de dicho aminoácido. De manera coherente con esta observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son comparables con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y en particular, las cadenas laterales de estos aminoácidos, como se revela por la hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades. "Variante" también puede usarse para hacer referencia a un fragmento antigénicamente reactivo de un anticuerpo anti-GP73 que difiere del fragmento correspondiente del anticuerpo anti-GP73 en la secuencia de aminoácidos pero que es antigénicamente reactivo y puede competir con el fragmento correspondiente del anticuerpo anti-GP73 por la unión con GP73. "Variante" también puede usarse para describir un polipéptido o un fragmento del mismo que se ha procesado de manera diferencial, tal como mediante proteólisis, fosforilación u otra modificación post-traduccional, pero sigue conservando su reactividad antigénica.
"Vector" se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran normalmente en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse de manera indistinta, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, pueden usarse otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos para la replicación) que tienen funciones equivalentes. A este respecto, las versiones en ARN de los vectores (incluyendo vectores víricos de ARN) también pueden resultar útiles en el contexto de la presente divulgación.
Salvo que se defina de otra forma en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación han de tener los significados que se entienden comúnmente por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, cualquier nomenclatura usada en conexión con,
y las técnicas de, cultivo celular y cultivo de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y de ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas que son bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. El significado y alcance de los términos ha de ser claro; sin embargo, en caso de haber cualquier ambigüedad latente, prevalecen las definiciones proporcionadas en el presente documento frente a cualquier definición en un diccionario o extrínseca. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
2. Anticuerpos para GP73
En el presente documento se proporcionan anticuerpos para su uso en métodos para detectar y tratar enfermedades, tales como enfermedad hepática y/o cáncer. En el presente documento se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína del Golgi 73 ("GP73") (o fragmentos del mismo) y se cita como "anticuerpo para GP73".
a. Proteína del Golgi 73 (GP73)
La proteína del Golgi 73 (GP73), también conocida como "proteína de membrana del Golgi 1", "fosfoproteína del Golgi 2" y "proteína de membrana del Golgi GP73", es una proteína que procesa proteínas sintetizadas en el retículo endoplasmático rugoso y ayuda en el transporte de la carga de proteínas a través del aparato de Golgi. GP73 humana es una proteína de 400 aminoácidos codificada por el gen GOLM1. GP73 se expresa ampliamente en células epiteliales normales de varios tejidos. La expresión intracelular regulada positivamente de GP73 potencia su tráfico intracelular a través de la vía endosómica, que brinda la oportunidad de la escisión endoproteolítica de GP73, dando como resultado la secreción de GP73 truncada. La expresión de GP73 está regulada positivamente en respuesta a la infección vírica, pero también se ha descubierto que está regulada positivamente en hepatocitos de pacientes con enfermedad hepática vírica y no vírica. GP73 se sobreexpresa en tejido de cáncer de próstata y de adenocarcinoma de pulmón. GP73 humana puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:
MGLGNGRRSMKSPPLVLAALVACIIVLGFNYWIASSRSVDLQTRIMELEGRVR RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITT GERLIRVLQDQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCINQMKEVKEQC EERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVL
GNS KSQTP APS SE V VLDS KRQ VEKEETNEIQ V VNEEPQRDRLPQEPGREQ V VEDRP VGG RGFGGAGELGQTPQV QAALS VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKL RGEDDYNMDENEAESETDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL
(SEQ ID NO: 97; n.° de referencia de GenBank: AAF44663).
La GP73 humana puede ser un fragmento o una variante de la SEQ ID NO: 97. El fragmento de GP73 puede tener entre 5 y 400 aminoácidos, entre 10 y 400 aminoácidos, entre 50 y 400 aminoácidos, entre 60 y 400 aminoácidos, entre 65 y 400 aminoácidos, entre 100 y 400 aminoácidos, entre 150 y 400 aminoácidos, entre 100 y 300 aminoácidos o entre 200 y 300 aminoácidos de longitud. El fragmento puede comprender un número contiguo de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97.
El fragmento de GP73 humana puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:
ELKKNEELKKNEFQGELEKQREQLDKIQS SHNFQLES VNKLY QDEKA VLVNNI
TTGERLIRVLQDQLKTLQRNY GRLQQD VLQFQKNQTNLERKFS YDLSQCIN QMKEVKE
QCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGN
VLGNSKSQTPAPSSEVVLDSKRQVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVEDRPV
GGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQ
KLRGEDDYNMDENEAESETDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL
(SEQ ID NO: 100), que corresponde a los aminoácidos 63-400 de la SEQ ID NO: 97.
b. Anticuerpo que reconoce a GP73
El anticuerpo es un anticuerpo que se une a GP73, un fragmento de la misma, un epítopo de GP73 o una variante de la misma. El anticuerpo puede ser un fragmento del anticuerpo anti-GP73 o una variante o derivado del mismo. El anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab o una mezcla de los mismos. Los fragmentos o derivados de anticuerpo pueden comprender fragmentos F(ab')2, Fv o scFv. Los derivados de anticuerpo pueden producirse mediante peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios para producir anticuerpos monocatenarios.
Los anticuerpos anti-GP73 de la presente divulgación pueden ser un anticuerpo quimérico anti-GP73 o anti-GP73 humanizado. En un aspecto, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes. En un aspecto, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una sola región Fab ligada a una región Fc.
Los anticuerpos humanos de acuerdo con la presente divulgación pueden derivarse de tecnología de presentación en fagos o de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humanos. El anticuerpo humano puede generarse como resultado de una respuesta inmunitaria in vivo y aislarse. Véase, por ejemplo, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8):85. Por tanto, el anticuerpo puede ser un producto del repertorio humano y no animal. Debido a su origen humano, pueden minimizarse los riesgos de reactividad contra autoantígenos. Como alternativa, pueden usarse bibliotecas de presentación en levadura convencionales y tecnologías de presentación para seleccionar y aislar anticuerpos humanos anti-GP73. Por ejemplo, pueden usarse bibliotecas de fragmentos variables monocatenarios (scFv) vírgenes para seleccionar anticuerpos humanos anti-GP73. Pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanos.
Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la presente divulgación pueden ser moléculas de anticuerpo procedentes de anticuerpos no humanos que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (c Dr ) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo puede distinguirse de los anticuerpos conocidos en que posee diferentes funciones biológicas a las de los conocidos en la técnica.
(1) Epítopo
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse inmunoespecíficamente a GP73 (SEQ ID NO: 97), SEQ ID NO: 100, un fragmento de la misma o una variante de la misma. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención reconoce inmunoespecíficamente y se une a un epítopo peptídico de SEQ ID NO: 101 (aminoácidos 307-339 de SEQ ID NO: 97), mientras que los anticuerpos adicionales de acuerdo con la presente divulgación pueden reconocer inmunoespecíficamente y unirse a un epítopo peptídico de SEQ ID NO: 102 (aminoácidos 276-287 de SEQ ID NO: 97), SEQ ID NO: 103 (aminoácidos 344-363 de SEQ ID NO: 97) o SEQ ID NO: 104 (aminoácidos 63-96 de SEQ ID NO: 97). Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden reconocer inmunoespecíficamente y unirse a al menos tres aminoácidos, al menos cuatro aminoácidos, al menos cinco aminoácidos, al menos seis aminoácidos, al menos siete aminoácidos, al menos ocho aminoácidos, al menos nueve aminoácidos o al menos diez aminoácidos dentro de los epítopos peptídicos de la SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104, respectivamente. Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden reconocer inmunoespecíficamente y unirse a un epítopo que tiene al menos tres aminoácidos contiguos, al menos cuatro aminoácidos contiguos, al menos cinco aminoácidos contiguos, al menos seis aminoácidos contiguos, al menos siete aminoácidos contiguos, al menos ocho aminoácidos contiguos, al menos nueve aminoácidos contiguos o al menos diez aminoácidos contiguos de los epítopos peptídicos de SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104, respectivamente.
(2) Características de unión del anticuerpo
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse inmunoespecíficamente a GP73 (SEQ ID NO: 97), SEQ ID NO: 100, un fragmento de la misma o una variante de la misma y tiene una K T9 19 J 19 d de al menos 1,5 x 10-12 M, de al 19menos 16 x 10- M, de al menos 1,7 x 10- M, de al menos 18 x 10- M, de al menos 1,9 x 10- M, de al menos 2,0 x 10-12 M, de al menos 2,1 x 10-12 M, de al menos 2,2 x 10-12 M, de al menos 2,3 x 10-12 M, de al menos 2,4 x 10­ 12 M, de al menos 2,5 x 10-12 M, de al menos 5,0 x 10-12 M, de al menos 10,0 x 10-12 M, de al menos 15 x 10-12 M, de al menos 50 x 1012 M, de al menos 100 x 1012 M, de al menos 500 x 1012 M, de al menos 1000 x 1012 M, de al menos 2000 x 10-12 M, de al menos 3000 x 10-12 M, de al menos 3500 x 10-12 M o tiene una Kd en el intervalo de 1,5 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 10,0 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 25,0 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 50,0 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 100,0 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M; de 150,0 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 200 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 500 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 1000 x 10-12 M a 3500 x 10-12 M, de 1,5 x 10-12 M a 3000 x 10-12 M, de 10,0 x 10-12 M a 3000 x 10-12 M, de 25,0 x 10-12 M a 3000 x 10-12 M, de 50,0 x 10-12 M a 3000 x 10-12 M, de 1,5 x 10-12 M a 1000 x 10-12 M, de 25,0 x 10-12 M a 1000 x 10-12 M de 50,0 x 10-12 M a 1000 x 10-12 M, de 100,0 x 10-12 M a 1000 x 10-12 M, de 1,5 x 10-12 M a 500 x 10-12 M, de 50 x 10-12 M a 500 x 10-12 M, de 100 x 10-12 M a 500 x 10-12 M, de 1,5 x 10-12 M a 100 x 10-12 M de 25,0 x 10-12 M a 100 x 10-12 M, de 50,0 x 10-12 M a 100 x 10-12 M, de 1,5 x 10-12 M a 50 x 10-12 M, de 10,0 x 10-12 M a 50.0 x 10-12 M o de 25,0 x 10-12 M a 50 x 10-12 M. El fragmento puede ser la SEQ ID NO: 97 o la SEQ ID NO: 100.
De acuerdo con la presente divulgación, la unión del anticuerpo a GP73 puede ser sensible o insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre la molécula de GP73. Un anticuerpo que es sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73 significa que la afinidad de unión del anticuerpo a GP73 cambia dependiendo de si está presente o ausente un resto de azúcar de fucosa sobre la molécula de GP73. Por ejemplo, un anticuerpo cuya unión sea sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73 puede tener una menor afinidad de unión a GP73 si está presente un resto de azúcar de fucosa. Como alternativa, un anticuerpo cuya unión sea sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en la molécula de GP73 puede tener menor afinidad de unión a GP73 si está ausente un resto de azúcar de fucosa. Un anticuerpo que es insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa sobre la molécula de GP73 significa que la afinidad de unión del anticuerpo a GP73 no cambia si está presente o ausente un resto de azúcar de fucosa sobre la molécula de GP73.
(3) Estructura del anticuerpo
(a) CDR de cadena pesada y de cadena ligera
De acuerdo con la presente divulgación, el anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a GP73 (SEQ ID NO: 97), SEQ ID NO: 100, un fragmento de la misma o una variante de la misma y comprende una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) mostrada en la tabla 1. El anticuerpo puede unirse inmunoespecíficamente a GP73, un fragmento de la misma o una variante de la misma y comprende una o más de las secuencias de CDR de cadena pesada o cadena ligera también mostradas en la tabla 1. La cadena ligera del anticuerpo puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. Por ejemplo, véase la tabla 1.
Tabla 1
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(continuación)
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(continuación)
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El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede contener una o más secuencias de aminoácidos que son más de un 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % idénticas a una o más de las SEQ ID NO: 1­ 48. El anticuerpo o variante o derivado del mismo puede estar codificado por una o más secuencias de ácido nucleico que son más de un 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % idénticas a una o más de las SEQ ID NO: 49-96. Pueden determinarse la identidad y homología de polipéptidos, por ejemplo, mediante el algoritmo descrito en el informe: Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 80, 726-730 (1983). El anticuerpo descrito ene l presente documento, la variante o el derivado del mismo puede estar codificado por un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de una o más de las SEQ ID NO: 17-32. El anticuerpo descrito ene l presente documento, variante o derivado del mismo puede estar codificado por un ácido nucleico que hibrida, en condiciones altamente rigurosas, con el complemento de uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más de las SEQ ID NO: 1-48.
En un aspecto, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-H1 que tiene la fórmula: CDR-H1, X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 108), en donde: X5 es S, N o T; X6 es Y o N; X7 es W, V, G, A o T; Xa es I, V o M; y X9 es E, H, S o N.
En otro aspecto, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-H2 que tiene la fórmula: CDR-H2, X10-I-Xn-X12-X18-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27 (SEQ ID NO: 109), en donde: X10 es E, Y, V, T o R; X11 es L, W, S o R; X12 es P, S, R o T; X13 está ausente o es K; X14 está ausente o es R; X15 es G, T o Y; X16 es S, G o N; X17 es G, D, S, T o Y; X18 es N, S, Y, G o T; X19 es T o I; X20 es N, K, Y o F; X21 es Y o F; X22 es N, P o A; X23 es E, S o D; X24 es K, A o S; X25 es F, L o V; X26 es K o M; y X27 es G, S o D.
En otro aspecto más, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-H3 que tiene la fórmula: CDR-H3, X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO: 110), en donde: X28 es G, Q, D, E o N; X29 es R, Q, P, Y, W o G; X30 es G, L, F, D o T; X31 es S, T, S o G; X32 es Y, D, G, E o T; X33 es R, Y, D, L o F; X34 es Y, F, T o H; X35 es H o Y; X36 es W, D o Y; X37 es F, Y o A; X38 está ausente o es F o M; y X39 es A o D.
En otro aspecto más, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-L1 que tiene la fórmula: CDR-L1, X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46X47-X48-X49-X50-X51-X52-X58-X54 (SEQ ID NO: 111), en donde: X40 es K, T, R o S; X41 es A o S; X42 es Q, S o K; X43 es S o G; X44 es V o L; X45 es D o L; X46 es Y, D o H; X47 está ausente o es S; X48 es D, V, N o I; X49 es G, V o S; X50 es D, K, S o I; X51 es S, T, I o N; X52 es Y o D; X53 es M, L o V; y X54 es N, I, S, H o Y.
En otro aspecto adicional más, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-L2 que tiene la fórmula: CDR-L2, X55-X56-S-X57-X58-X59-X60 (SEQ ID NO: 112), en donde: X55 es A, L, S, Q o R; X56 es A, V, T o M; X57 es N, K, Y o S; X58 es L o R; X59 es E, D, Y o A; y X60 es S o I.
En otro aspecto más, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-L3 que tiene la fórmula: CDR-L3, X61-Q-X62-X63-Xg4-X65-P-X62-T (SEQ ID NO: 113), en donde: X61 es Q, W, H o A; X62 es S, G, H, Y o N; X63 es N, T, F, H o L; X64 es E, H, T, R o S; X65 es D, F, T, S, L o I; y Xaa es Y o L.
En otro aspecto adicional más, el anticuerpo aislado de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente a GP-73 y tiene una CDR-H1 que tiene la fórmula: X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 108) una CDR-H2 que tiene la fórmula: X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X20-X27 (SEQ ID NO: 109), una CDR-H3 que tiene la fórmula: X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO: 110), una CDR-L1 que tiene la fórmula: X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46X47-X48-X49-X50-X51-X52-X53-X54 (SEQ ID NO: 111) un CDR-L2 que tiene la fórmula: X55-X56-S-X57-X58-X59-X60 (SEQ ID NO: 112) y una CDR-L3 que tiene la fórmula: X61-Q-X62-X63-X64-X6S-P-X62-T (SEQ ID NO: 113), en donde: X5 es S, N o T; Xa es Y o N; X7 es W, V, G, A o T; X8 es I, V o M; X9 es E, H, S o N; X10 es E, Y, V, T o R; X11 es L, W, S o R; X12 es P, S, R o T; X13 está ausente o es K; X14 está ausente o es R; X15 es G, T o Y; X16 es S, G o N; X17 es G, D, S, T o Y; X18 es N, S, Y, G o T; X19 es T o I; X20 es N, K, Y o F; X21 es Y o F; X22 es N, P o A; X23 es E, S o D; X24 es K, A o S; X25 es F, L o V; X26 es K o M; X27 es G, S o D; X28 es G, Q, D, E o N; X29 es R, Q, P, Y, W o G; X30 es G, L, F, D o T; X31 es S, T, S o G; X32 es Y, D, G, E o T; X33 es R, Y, D, L o F; X34 es Y, F, T o H; X35 es H o Y; X36 es W, D o Y; X37 es F, Y o A; X38 está ausente o es F o M; X39 es A o D; X40 es K, T, R o S; X41 es A o S; X42 es Q, S o K; X43 es S o G; X44 es V o L; X45 es D o L; X46 es Y, D o H; X47 está ausente o es S; X48 es D, V, N o I; X49 es G, V o S; X50 es D, K, S o I; X51 es S, T, I o N; X52 es Y o D; X53 es M, L o V; X54 es N, I, S, H o Y; X55 es A, L, S, Q o R; X56 es A, V, T o M; X57 es N, K, Y o S; X58 es L o R; X59 es E, D, Y o A; Xa0 es S o I; Xa1 es Q, W, H o A; Xa2 es S, G, H, Y o N; Xa3 es N, T, F, H o L; Xa4 es E, H, T, R o S; Xa5 es D, F, T, S, L o I; y Xaa es Y o L.
El anticuerpo puede ser una molécula de clase IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
(b) Secuencia de nucleótidos
En el presente documento se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a GP73, un fragmento de la misma o una variante de la misma. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos que hibrida, en condiciones rigurosas, con la molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada o cadena ligera mostradas en la tabla 1. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleótidos mostrada en la tabla 2.
Tabla 2
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(continuación)
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c. Preparación/producción de anticuerpos
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden prepararse mediante cualquiera de diversas técnicas. En general, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales o mediante transfección de genes de anticuerpo, cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en hospedadores celulares bacterianas o de mamífero adecuadas, a fin de posibilitar la producción de anticuerpos, en donde los anticuerpos pueden ser recombinantes. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas y lo más preferible, en células hospedadoras de mamífero, debido a que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamífero) tienen mayores probabilidades que las células procariotas de ensamblarse y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo.
Las células hospedadoras de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)), usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células NS0 de mieloma, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.
Las células hospedadoras también pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas de scFv. Ha de entenderse que se encuentran dentro del alcance de la presente invención variaciones de los procedimientos anteriores. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar a una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. También puede usarse tecnología de ADN recombinante para retirar la totalidad o parte, del ADN que codifica una o las dos cadenas pesada y ligera que no es necesario para la unión a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están abarcadas por los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención (es decir, se une a GP73 humano) y la otra cadena pesada y ligera son específicas para otra GP73 humana reticulando un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química convencionales.
En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células dhfr-CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio. En el vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. De forma adicional, la invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Dichas líneas celulares pueden producirse a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado. El animal puede inmunizarse con GP73 o un fragmento y/o variante de la misma. Por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, un fragmento de SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104 o una variante de SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104 puede usarse para inmunizar al animal. El péptido usado para inmunizar al animal puede comprender aminoácidos que codifican Fc humano, por ejemplo, la región de fragmento cristalizable o la región de cola del anticuerpo humano. Posteriormente, pueden inmortalizarse las células de bazo mediante, por ejemplo, fusión con un compañero de fusión de célula de mieloma. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, pueden combinarse las células de bazo y las células de mieloma con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y después, se siembran a baja densidad en un medio selectivo que soporta dicho crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de este tipo usa selección con hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Otra técnica incluye electrofusión. Transcurrido un tiempo suficiente, normalmente de 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y se ensayan sus sobrenadantes de cultivo respecto de su actividad de unión contra el polipéptido. Pueden usarse hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.
Pueden aislarse anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de las colonias de hibridoma en crecimiento. Además, pueden emplearse diversas técnicas para potenciar el crecimiento, tal como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado adecuado, tal como un ratón. Después, pueden recogerse anticuerpos monoclonales del fluido de ascitis o la sangre. Los contaminantes pueden retirarse de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. La cromatografía de afinidad es un ejemplo de un método que puede usarse en un proceso para purificar los anticuerpos.
La enzima proteolítica papaína escinde preferencialmente moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento F(ab')2, que comprende ambos sitios de unión a antígeno.
El fragmento Fv puede producirse mediante escisión proteolítica preferencial de una IgM y en raras ocasiones, moléculas de inmunoglobulina de IgG e IgA. El fragmento Fv puede obtenerse usando técnicas recombinantes. El fragmento Fv incluye un heterodímero de VH:VL no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que conserva gran parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de antígeno nativa.
El anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado puede comprender un conjunto de región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y de cadena ligera, interpuesta, respectivamente, entre un conjunto de región marco ("FR") de cadena pesada y de cadena ligera que proporciona soporte a las CDR y define las relaciones espaciales de las CDR unas respecto de otras. El conjunto de las CDR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Desde el extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se anotan como "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por tanto, puede incluir seis CDR, comprendiendo el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una sola CDR, (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) puede citarse como una "unidad de reconocimiento molecular". Los análisis cristalográficos de los complejos de antígeno-anticuerpo han demostrado que los restos de aminoácido de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en donde el contacto de antígeno más extenso es con la CDR3 de cadena pesada. Por consiguiente, las unidades de reconocimiento molecular pueden ser responsables principalmente de la especificidad de un sitio de unión a antígeno. En general, los restos de la CDR están implicados directa y más sustancialmente en influenciar la unión al antígeno.
Se pueden usar otros métodos adecuados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida, incluyendo, pero sin limitación, métodos que seleccionan el anticuerpo recombinante a partir de una biblioteca de péptido o proteína (por ejemplo, pero sin limitación, un bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN, ADNc, levadura o similar, biblioteca de presentación); por ejemplo, según se encuentre disponible de varios proveedores comerciales, tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, R. U.), MorphoSys (Martinsreied/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escocia, R. U.) BioInvent (Lund, Suecia), usando métodos conocidos en la técnica. Véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Los métodos alternativos se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev.
Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la técnica y/o como se describe en el presente documento. Dichas técnicas, incluyen, pero sin limitación, presentación en ribosomas (Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135); tecnologías de producción de anticuerpos en células individuales (por ejemplo, el método de anticuerpo de linfocito seleccionado ("SLAM") (Patente de los Estados Unidos n.° 5.627.052, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790); selección en linfocitos B (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994) ).
Puede producirse un anticuerpo madurado por afinidad mediante uno cualquiera de los procedimientos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, véase Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad mediante reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los restos de la CDR y/o marco se describe por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995) ; Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectivas y en posiciones de contacto o hipermutación con un resto de aminoácido potenciador de la actividad se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.914.128 B1.
También pueden prepararse variantes de anticuerpo usando el suministro de un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención a un hospedador adecuado, a fin de proporcionar animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Estos métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; y 5.304.489.
También pueden prepararse variantes de anticuerpo suministrando un polinucleótido de la presente invención para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, pero sin limitación, tabaco, maíz y lenteja de agua) que producen dichos anticuerpos, porciones especificadas o variantes en las partes de plantas o en células cultivadas a partir de las mismas. Por ejemplo, Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 y referencias citadas en el mismo, describe la producción de hojas de tabaco transgénicas que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. Se ha usado maíz transgénico para expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comerciales, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificados a partir de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147 y las referencias citadas en el mismo. También se han producido variantes de anticuerpo en grandes cantidades a partir de semillas vegetales transgénicas, incluyendo fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos monocatenarios (scFv), incluyendo semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 y las referencias citadas en el mismo. Por consiguiente, también pueden producirse anticuerpos de la presente invención usando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos.
Pueden producirse derivados de anticuerpos, por ejemplo, añadiendo secuencias exógenas para modificar la inmunogenicidad o reducir, potenciar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, semivida o cualquier otra característica adecuada. En general, una parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen, mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se reemplazan con aminoácidos humanos u otros.
Los fragmentos de anticuerpo pequeños pueden ser diacuerpos que tienen dos sitios de unión a antígeno, en donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH VL). Véanse por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Usando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Véase también, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.632.926 concedida a Chen et al. que divulga variantes de anticuerpo que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo precursor y una afinidad de unión por un antígeno diana que es al menos dos veces más fuerte que la afinidad de unión del anticuerpo precursor por el antígeno.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo lineal. Se conoce en la técnica el procedimiento para producir un anticuerpo lineal y se describe en Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Los anticuerpos pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos conocidos que incluyen, pero sin limitación, purificación con proteína A, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. También puede usarse para la purificación cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC").
Esta puede ser útil para marcar detectable o terapéuticamente el anticuerpo. Los métodos para conjugar anticuerpos a estos agentes se conocen en la técnica. Con una finalidad únicamente ilustrativa, los anticuerpos pueden marcarse con un resto detectable, tal como un átomo radiactivo, un cromóforo, un cromóforo o similares. Dichos anticuerpos marcados pueden usarse para técnicas diagnósticas, ya sea in vivo o en una muestra de ensayo aislada. Los anticuerpos también pueden conjugarse, por ejemplo, a un agente farmacéutico, tal como un fármaco quimioterapéutico o una toxina. Pueden unirse a una citocina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para el acoplamiento a anticuerpos para lograr un efecto antitumoral incluyen citocinas, tales como interleucina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para su uso en terapia fotodinámica, incluyendo tetrasulfonato de aluminio (III) ftalocianina, hematoporfirina y ftalocianina; radionúclidos, tales como yodo-131 (131I), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re) y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarcinostatina y caboplatino; toxinas bacterianas, vegetales y otras, tales como toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas, enterotoxina A estafilocócica, abrina-toxina A, ricina A (ricina A desglucosilada y ricina A nativa), TGF-alfa toxina, citotoxina de cobra china (naja naja atra) y gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivantes de ribosomas de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína inactivante de ribosomas producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína inactivante de ribosomas de Saponaria officinalis) y RNasa; inhibidores de tirosina cinasa; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes antiquísticos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, tales como F(ab).
Los anticuerpos pueden secuenciarse y replicarse por medios recombinantes o sintéticos. También pueden secuenciarse adicionalmente hasta la secuencia lineal de los nucleótidos que los codifican. Consiguientemente, la presente invención proporciona estos polinucleótidos, solos o en combinación con un portador, vector o célula hospedadora, como se ha descrito anteriormente, que codifica una secuencia de un anticuerpo de la presente invención.
La producción de anticuerpos mediante el uso de tecnología de hibridoma, el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), los animales transgénicos y las bibliotecas de anticuerpos recombinantes se describen con más detalle más adelante.
(1) Anticuerpos monoclonales anti-GP73 usando tecnología de hibridoma
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una gran variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso de hibridoma, tecnologías recombinantes y de presentación en fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., En Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). Obsérvese también que la expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago y no el método mediante el que se produce.
En una realización, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales, así como anticuerpos producidos mediante el método. El método puede comprender cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención, en donde, preferentemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un animal, por ejemplo, una rata o un ratón, inmunizado con GP73 con células de mieloma y después, seleccionar los hibridomas resultantes de la fusión respecto de clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención. En resumen, se puede inmunizar a ratas con un antígeno de GP73. En una realización preferida, el antígeno de GP73 se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido frente a una rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador para secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, en caso de que se esté administrando un polipéptido, la pauta de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, dispersadas a lo largo de varias semanas; sin embargo, también puede usarse una sola administración del polipéptido.
Después de la inmunización de un animal con un antígeno de GP73, los anticuerpos y/o las células productoras de anticuerpo pueden obtenerse del animal. Se obtiene un suero que contiene el anticuerpo anti-GP73 del animal extrayendo sangre o sacrificando al animal. El suero puede usarse tal cual se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse del suero los anticuerpos anti-GP73. El suero o las inmunoglobulinas obtenidas de este modo son policlonales, teniendo de este modo una serie heterogénea de propiedades.
Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno GP73 en el suero de rata, se recoge el bazo de rata y se aíslan los esplenocitos. Después, se fusionan los esplenocitos mediante técnicas bien conocidas a cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20, disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, Va., EE. UU.). Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitante. Después, se ensayan los clones de hibridoma mediante métodos conocidos en la materia para células que secretan anticuerpos capaces de unirse a GP73. El fluido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratas con clones de hibridoma positivos.
En otra realización, pueden prepararse hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, se sacrifica al animal y se fusionan los linfocitos B esplénicos a células de mieloma inmortalizadas, como se sabe bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, anteriormente citado. En una realización preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y la selección con antibiótico, se exploran los hibridomas usando GP73 o una porción de la misma o una célula que expresa GP73. En una realización preferida, la exploración inicial se lleva a cabo usando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferentemente un ELISA. Se proporciona un ejemplo de exploración por ELISA en la Publicación PCT n.° WO 00/37504.
Los hibridomas productores de anticuerpo anti-GP73 se seleccionan, clonan y exploran adicionalmente respecto de características deseables, incluyendo un robusto crecimiento de hibridoma, alta producción de anticuerpo y características de anticuerpo deseables. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmunitario, por ejemplo, ratones desnudos o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por los expertos habituales en la materia.
En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de rata. En otra realización, los hibridomas se producen en una especie no humana distinta de ratas, tales como ratones, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos. En otra realización preferida más, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que se fusiona un mieloma humano no secretor con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-GP73.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden producirse los fragmentos Fab y F(ab')2 mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir dos fragmentos Fab idénticos) o pepsina (para producir un fragmento F(ab')2). Un fragmento F(ab')2 de una molécula de IgG conserva los dos sitios de unión a antígeno de la molécula de IgG mayor ("precursora"), incluyendo tanto cadenas ligeras (que contienen la cadena ligera variable y las regiones constantes de cadena ligera), los dominios CH1 de las cadenas pesadas y una región bisagra formadora de disulfuro de la molécula de IgG precursora. Consiguientemente, un fragmento F(ab')2 sigue siendo capaz de reticular moléculas de antígeno como la molécula de IgG precursora.
(2) Anticuerpos monoclonales anti-GP73 usando SLAM
En otro aspecto de la presente divulgación, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos aislados individuales usando un procedimiento citado en la técnica como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.627.052; publicación PCT n.° WO 92/02551; y Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). En este método, las células individuales que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos procedentes de uno cualquiera de los animales inmunizados se exploran usando un ensayo hemolítico en placa específico de antígeno, en donde el antígeno GP73, una subunidad de GP73 o un fragmento de la misma, se acopla a glóbulos rojos de oveja usando un enlazador, tal como biotina y se usa para identificar células individuales que secretan anticuerpos con especificidad por GP73. Después de la identificación de células secretoras de anticuerpos de interés, se rescatan los ADNc de la región variable de cadena pesada y ligera de las células mediante PCR de retrotranscriptasa (RT-PCR) y después pueden expresarse estas regiones variables, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina adecuadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospedadoras de mamífero, tales como células COS o CHO. Las células hospedadoras transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, procedentes de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse posteriormente a análisis y selección in vitro, por ejemplo, mediante paneo de las células transfectadas para aislar células que expresan anticuerpos para GP73. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas además pueden manipularse in vitro, tal como mediante un método de maduración de la afinidad in vitro. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT n.° WO 97/29131 y la Publicación PCT n.° WO 00/56772. (3) Anticuerpos monoclonales anti-GP73 usando animales transgénicos
En otro aspecto de la presente divulgación, se producen anticuerpos inmunizando un animal no humano que comprende algunos o todos, los loci de inmunoglobulina humana con un antígeno de GP73. En una realización, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE®, una estirpe de ratón modificada que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humanos y es defectuoso en la producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) y las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.916.771; 5.939.598; 5.985.615; 5.998.209; 6.075.181; 6.091.001; 6.114.598; y 6.130.364. Véanse también las Publicaciones PCT n.° WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; y WO 00/37504. El ratón transgénico XENOMOUSE® produce un repertorio humano similar al adulto de anticuerpos completamente humanos y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE® contiene un 80 % del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos de YAC con configuración de línea germinal con un tamaño de megabase de los loci de cadena pesada y loci de cadena ligera humana. Véase Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998).
(4) Anticuerpos monoclonales anti-GP73 usando bibliotecas de anticuerpo recombinantes
Pueden usarse métodos in vitro para producir los anticuerpos de la invención, en donde se explora una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión a GP73 deseada. Los métodos para dicha exploración de bibliotecas de anticuerpo recombinantes se conocen bien en la técnica e incluyen métodos descritos en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.223.409 (Ladner et al.); la Publicación PCT n.° WO 92/18619 (Kang et al.); la Publicación PCT n.° WO 91/17271 (Dower et al.); la Publicación PCT n.° WO 92/20791 (Winter et al.); la Publicación PCT n.° WO 92/15679 (Markland et al.); la Publicación PCT n.° WO 93/01288 (Breitling et al.); la Publicación PCT n.° WO 92/01047 (McCafferty et al.); la Publicación PCT n.° WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978­ 7982 (1991); Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2003/0186374; y Publicación PCT n.° WO 97/29131.
La biblioteca de anticuerpo recombinante puede proceder de un sujeto inmunizado con GP73 o una porción de GP73. Como alternativa, la biblioteca de anticuerpo recombinante puede proceder de un sujeto no expuesto previamente, es decir, uno que no ha sido inmunizado con GP73, tal como una biblioteca de anticuerpos humanos procedente de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con GP73. Los anticuerpos de la invención se seleccionan explorando la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende GP73 humana para seleccionar de este modo aquellos anticuerpos que reconocen a GP73. Los métodos para llevar a cabo dicha exploración y selección se conocen bien en la técnica, tales como los descritos en las referencias en el párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tienen afinidades de unión particulares por GP73, tales como aquellos que se disocian de GP73 con una constante de velocidad Koff particular, puede usarse el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de velocidad Koff deseada. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tienen una actividad neutralizante particular por hGP73, tales como aquellos con una CI50 particular, pueden usarse métodos convencionales conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad de GP73.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o a una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a GP73 humana. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpo funcionales sobre la superficie de partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótido que los codifican. Dicho fago puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpo combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado sobre una superficie sólida o una perla. Los fagos usados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos, incluyendo dominios de unión a fd y M13 expresados a partir de fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado por disulfuro fusionados recombinantemente con la proteína del gen III o el gen VIII de fago. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); publicación PCT n.° WO 92/01047; publicaciones PCT n.° WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los Estados Unidos n.° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección en fagos, pueden aislarse las regiones codificantes de anticuerpo del fago y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle más adelante. Por ejemplo, las técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también pueden emplearse usando métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos divulgados en la Publicación PcT n.° WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv monocatenarios y anticuerpos e incluyen aquellas descritas en las patentes de los Estados Unidos n.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).
Como alternativa a la exploración de bibliotecas de anticuerpo recombinantes mediante presentación en fagos, pueden aplicarse otras metodologías conocidas en la técnica para explorar grandes bibliotecas combinatorias para la identificación de anticuerpos de la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el que se expresa la biblioteca de anticuerpos recombinantes en forma de fusiones de ARN-proteína, como se describe en la Publicación PCT n.° WO 98/31700 (Szostak y Roberts) y en Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica mediante traducción in vitro de ARNm sintéticos que portan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. Por consiguiente, puede enriquecerse un ARNm específico a partir de una mezcla compleja de ARNm (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) basándose en las propiedades del péptido o la proteína codificados, por ejemplo, anticuerpo o porción del mismo, tal como unión del anticuerpo o la porción del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos o porciones de los mismos, recuperadas de la exploración de dichas bibliotecas pueden expresarse por medios recombinantes, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, en células hospedadoras de mamífero) y, por otra parte, pueden someterse a maduración de la afinidad adicional mediante o bien rondas adicionales de exploración de fusiones de ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en las secuencias originalmente seleccionadas o mediante otros métodos para maduración de la afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, tal como se describió anteriormente. Un ejemplo preferido de esta metodología, es la tecnología de presentación PROfusion.
En otro enfoque, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando métodos de presentación en levaduras conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en levaduras, se usan métodos genéticos para anclar dominios de anticuerpo a la pared celular de las levaduras y presentarlos sobre la superficie de la levadura. En particular, dichas levaduras pueden utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humanos o murinos). Los ejemplos de métodos de presentación en levaduras que pueden usarse para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos divulgados en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.699.658 (Wittrup et al.).
d. Producción de anticuerpos recombinantes para GP73
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden producirse mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, expresión a partir de células hospedadoras, en donde los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección por DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas y lo más preferible, en células hospedadoras de mamífero, debido a que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamífero) tienen mayores probabilidades que las células procariotas de ensamblarse y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo.
Las células hospedadoras de mamífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células NS0 de mieloma, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.
Las células hospedadoras también pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas de scFv. Ha de entenderse que se encuentran dentro del alcance de la presente invención variaciones de los procedimientos anteriores. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar a una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. También puede usarse tecnología de ADN recombinante para retirar la totalidad o parte, del ADN que codifica una o las dos cadenas pesada y ligera que no es necesario para la unión a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están abarcadas por los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención (es decir, se une a GP73 humano) y la otra cadena pesada y ligera son específicas para otra GP73 humana reticulando un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química convencionales.
En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células dhfr-CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio. En el vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. De forma adicional, la invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
(1) Anticuerpo humanizado
El anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente divulgación puede ser un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o porción del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El anticuerpo humanizado puede proceder de un anticuerpo de una especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de la especie no humana y regiones marco procedentes de una molécula de inmunoglobulina humana.
Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De acuerdo con un aspecto, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente, la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene únicamente una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o de una cadena pesada.
El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la materia.
Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder exactamente a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o el marco consenso pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o eliminación de al menos un resto de aminoácido, de tal forma que el resto de la CDR o el marco en el sitio no corresponde con el anticuerpo donante o el marco consenso. En una realización, dichas mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Normalmente, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de los restos de anticuerpo humanizados corresponderán con aquellos de las secuencias de FR y CDR precursoras. Como se usa en el presente documento, la expresión "marco consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina consenso. Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de inmunoglobulina consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) de aparición más frecuente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se da con más frecuencia en esa posición en la familia. En caso de que dos aminoácidos se den con la misma frecuencia por igual, se puede incluir cualquiera de ellos en la secuencia consenso.
El anticuerpo humanizado puede diseñarse para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia anticuerpos de roedor anti-humano, lo que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de estos restos en receptores humanos. El anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos restos no humanos se citan normalmente como restos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable. La humanización puede llevarse a cabo sustituyendo secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Consiguientemente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos, en donde se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Por ejemplo, véase la Patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567, cuyo contenido se incorpora al presente documento por referencia. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo humano en el que se sustituyen algunos restos de la región hipervariable y posiblemente algunos restos de FR por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La humanización o modificación por ingeniería genética de anticuerpos de la presente invención puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido, tal como, pero sin limitación, los descritos en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567.
El anticuerpo humanizado puede conservar alta afinidad por GP73 y otras propiedades biológicas favorables. El anticuerpo humanizado puede prepararse mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Se encuentran comúnmente disponibles modelos tridimensionales de inmunoglobulina. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite un análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor e importar secuencias, de tal forma que se logran las características de anticuerpo deseadas, tales como afinidad aumentada por GP73. En general, los restos de la región hipervariable pueden estar implicados directa y más sustancialmente en la influenciación de la unión al antígeno.
Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos (también citados en el presente documento como "anticuerpos completamente humanos") de acuerdo con la presente divulgación. Por ejemplo, es posible aislar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas mediante las tecnologías PROfusion y/o relacionadas con levaduras. También es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, la eliminación homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (Jh) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes en la línea germinal tendrá como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Los anticuerpos humanizados o completamente humanos pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.770.429; 5.833.985; 5.837.243; 5.922.845; 6.017.517; 6.096.311; 6.111.166; 6.270.765; 6.303.755; 6.365.116; 6.410.690; 6.682.928; y 6.984.720.
e. Anticuerpos anti-GP73
Pueden generarse anticuerpos anti-GP73 usando las técnicas descritas anteriormente. El anticuerpo anti-GP73 puede ser un anticuerpo monoclonal IB-3440 (no abarcado por la presente invención), un anticuerpo monoclonal IB-4971 (que está abarcado por la presente invención), un anticuerpo monoclonal 1B-3246 (no abarcado por la presente invención), un anticuerpo monoclonal 1B-4863 (no abarcado por la presente invención), un anticuerpo monoclonal 1A-3187 (no abarcado por la presente invención), un anticuerpo monoclonal 1A-4246 (no abarcado por la presente invención) o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
(1) 1B-3440 (no abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1B-3440" o "mAb 1B-3440" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones RBF/DnJ que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma NS/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
1B-3440 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen 1B-4971, 1B-3246, 1B-4863, 1A-3187 y 1A-4246. 1B-3440 reconoce el epítopo peptídico de la SEQ ID No : 103.1B-3440 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 9,1 x 10-11 M. 1B-3440 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 5, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 53. 1B 3440 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 2), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 3) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 4) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 50-52 y 54-56, respectivamente.
(2) 1B-4971 (abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1B-4971" o "mAb 1B-4971" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones RBF/DnJ que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma NS/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
1B-4971 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen 1B-3440, 1B-3246, 1B-4863, 1A-3187 y 1A-4246. 1B-4971 reconoce el epítopo peptídico de la SEQ ID No : 101.1B-4971 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 2,0 x 10-12 M. 1B-4971 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 9, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 57 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 13, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 61. 1B-4971 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 10), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 11) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 12) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 14), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 15) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 16), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 58-60 y 62-64, respectivamente.
(3) 1B-3246 (no abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1B-3246" o "mAb 1B-3246" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones RBF/DnJ que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma Ns/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
1B-3246 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen 1B-3440, 1B-4971, 1B-4863, 1A-3187 y 1A-4246. 1B-3246 reconoce el epítopo peptídico de la SEQ ID No : 102.1B-3246 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 7,9 x 10-11 M. 1B-3246 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 17, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 21, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 69. 1B-3246 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 18), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 19) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 20) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 22), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 23) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 24), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 66-68 y 70-72, respectivamente.
(4) 1B-4863 (no abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1B-4863" o "mAb 1B-4863" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones RBF/DnJ que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma Ns/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
IB-4863 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen IB-3440, 1B-4971, 1B-3246, 1A-3187 y 1A-4246. 1B-4863 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 1,2 x 10'1° M. 1B-4863 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 25, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 73 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 29, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 77. 1B-4863 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 26), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 27) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 28) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 30), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 31) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 32), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SeQ ID NO: 74-76 y 78-80, respectivamente.
(5) 1A-3187 (no abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1A-3187" o "mAb 1A-3187" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones CAF1/J que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma Ns/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
1A-3187 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen 1B-3440, 1B-4971, 1B-3246, 1B-4863 y 1A-4246. 1A-3187 reconoce el epítopo peptídico de la SEQ ID No : 104.1A-3187 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 2,0 x 10-9 M. 1A-3187 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 33, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 81 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 37, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 85. 1A-3187 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 34), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 35) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 36) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 38), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 39) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 40), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 82-84 y 86-88, respectivamente.
(6) 1A-4246 (no abarcado por la presente invención)
Como se usa en el presente documento, "1A-4246" o "mAb 1A-4246" se refiere a un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que se produjo usando la estirpe de ratones CAF1/J que se inmunizó con GP73 recombinante. Las células de bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma Ns/0 de la línea celular de mieloma de ratón.
1A-4246 se une a un epítopo en GP73 que es diferente de los epítopos a los que se unen 1B-3440, 1B-4971, 1B-3246, 1B-4863 y 1A-3187. 1A-4246 tiene una afinidad de unión (Kd) por GP73 de 3,8 x 10-9 M. 1A-4246 tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 41, que está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 45, que está codificada por una secuenciad e nucleótidos de SEQ ID NO: 93. 1A-4246 incluye la CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), la CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) y la CDR-H3 (SEQ ID NO: 44) y la CDR-L1 (SEQ ID NO: 46), la CDR-L2 (SEQ ID NO: 47) y la CDR-L3 (SEQ ID NO: 48), que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de las SeQ ID NO: 90-92 y 94-96, respectivamente.
3. Composiciones farmacéuticas
El anticuerpo de la presente invención puede ser un componente en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de la invención son para su uso en, pero sin limitación, diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno, en prevenir, tratar, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo y/o en investigación. En una realización específica, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En otra realización, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la invención y uno o más agentes terapéuticos profilácticos distintos de anticuerpos de la invención para tratar un trastorno en el que la actividad de una GP73 diana es perjudicial. En una realización adicional, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para o se han usado o se usan en la actualidad en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estas realizaciones, la composición puede comprender además un portador, diluyente o excipiente.
Los anticuerpos de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, suero salino tamponado con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo.
Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden proporcionarse para administrar uno o más anticuerpos de la invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico o de otro tipo, etc. Un agente profiláctico o terapéutico de la invención se proporciona para su uso en métodos de administración que incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). Además, los anticuerpos de la presente invención pueden proporcionarse para administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y formulación con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las Publicaciones PCT n.° WO 92/19244; WO97/32572; WO97/44013; WO98/31346; y WO99/66903.
En una realización, un anticuerpo de la invención o una composición de la invención se proporciona para su administraciónusando la tecnología de suministro de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En una realización específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se proporcionan para administración intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos se proporcionan para su administración por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección embolada, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se proporcionan para su administración eventual junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una realización específica, puede ser deseable proporcionar los anticuerpos de la invención para su uso en la administración local al área que necesita tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo y sin limitación, infusión local, mediante inyección o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. En una realización, una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención se proporciona para su uso en la administración local al área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo.
En otra realización, el anticuerpo puede proporcionarse para su suministro en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. En una realización, una bomba puede proporcionarse para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, anteriormente mencionado; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, los materiales poliméricos pueden proporcionarse para su uso para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente de los Estados Unidos n.° 5.679.377; Patente de los Estados Unidos n.° 5.916.597; Patente de los Estados Unidos n.° 5.912.015; Patente de los Estados Unidos n.° 5.989.463; Patente de los Estados Unidos n.° 5.128.326; la Publicación PCT n.° WO99/15154; y la Publicación PCT n.° WO99/20253. Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero sin limitación, poli(2-hidroxietil metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol de vinilo), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y poliortoésteres. En una realización particular, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable durante el almacenamiento, estéril y biodegradable. En otra realización más, puede emplearse un sistema de liberación controlada o sostenida en proximidad de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo de este modo solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente citado, vol. 2, págs. 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.526.938, la Publicación PCT WO91/05548, la Publicación PCT WO96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy &Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application" Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.
24:853-854; y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
En una realización específica, en los casos donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, el ácido nucleico puede proporcionarse para su uso in vivo para promover la expresión de su anticuerpo codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y para su administración de tal forma que se vuelve intracelular, por ejemplo, para su administración mediante el uso de un vector retrovírico (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 4.980.286) o para su administración mediante inyección directa o para su administración mediante el uso de bombardeo con micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección o para su administración en unión con un péptido similar a caja homeostática que se sabe que entre en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Como alternativa, un ácido nucleico puede proporcionarse para introducción intracelular e incorporarse en el ADN de la célula hospedadora para su expresión mediante recombinación de homólogos.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración prevista. Los ejemplos de rutas de administración incluyen, pero sin limitación, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. En una realización específica, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios en forma de una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
En caso de que las composiciones de la invención se vayan a administrar por vía tópica, las composiciones pueden formularse en forma de una pomada, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, pulverización, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19.a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas farmacéuticas tópicas no pulverizables, se emplean típicamente formas semisólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos, salvas y similares, que, si se desea, se esterilizan o mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales) para influenciar diversas propiedades, tal como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas farmacéuticas tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables, en donde el principio activo, por ejemplo, en combinación con un portador sólido o líquido inerte, se envasa en una mezcla con un volátil a presión (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como freón) o en una botella flexible. Los agentes hidratantes o humectantes también pueden añadirse, si se desea, a las composiciones farmacéuticas y las formas farmacéuticas. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales se conocen bien en la técnica.
En caso de que los anticuerpos de la invención se proporcionen para administración intranasal en una composición, la composición puede formularse en forma de aerosol, pulverización, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para su uso de acuerdo con la presente invención pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula la cual administra una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (compuestos de, por ejemplo, gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
En caso de que los anticuerpos de la invención se proporcionen para administración oral, las composiciones pueden formularse para vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, sellos, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones y similares. Los comprimidos o cápsulas pueden prepararse por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero sin limitación, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, y agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes, según sea adecuado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse de manera adecuada para liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de agentes profilácticos o terapéuticos.
Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse para administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las Publicaciones PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903. En una realización específica, un anticuerpo de la invención y/o composición de la invención se proporciona para su uso con la tecnología de suministro de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse para su administración a través de una composición formulada para administración parenteral por inyección (por ejemplo, mediante inyección embolada o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria (por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden comprender agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua despirogenada estéril) antes de su uso. Los anticuerpos de la invención pueden además proporcionarse para la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de larga duración pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por consiguiente, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o en forma de derivados poco solubles (por ejemplo, en forma de una sal poco soluble).
Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse para administración mediante composiciones formuladas en formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones, tales como aquellos derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellas formadas con cationes, tales como aquellos derivados de los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
En general, los ingredientes de las composiciones se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad de principio activo. Cuando el modo de administración es infusión, la composición puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua o suero salino de grado farmacéutico. Cuando el modo de administración es mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
En particular, la invención también proporciona uno o más de los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la invención envasados en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad del anticuerpo. En una realización, se suministran uno o más de los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la invención en forma de un polvo liofilizado esterilizado o un concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente y puede reconstituirse (por ejemplo, con agua o suero salino) hasta la concentración adecuada para su administración a un sujeto. En una realización, se suministran uno o más de los anticuerpos o de las composiciones farmacéuticas de la invención en forma de un polvo liofilizado seco estéril en un recipiente sellado herméticamente en una dosis unitaria de al menos 5 mg, por ejemplo, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg o al menos 100 mg. Los anticuerpos liofilizados o las composiciones farmacéuticas de la invención han de almacenarse a entre 2 °C y 8 °C en sus recipientes originales y los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan para su administración en menos de 1 semana, por ejemplo, en menos de 5 días, en menos de 72 horas,, en menos de 48 horas,, en menos de 24 horas,, en menos de 12 horas,, en menos de 6 horas,, en menos de 5 horas,, en menos de 3 horas o en menos de 1 hora después de reconstituirse. En una realización alternativa, se suministran uno o más de los anticuerpos o de las composiciones farmacéuticas de la invención en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y la concentración del anticuerpo. En una realización adicional, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente sellado herméticamente al menos a 0,25 mg/ml, por ejemplo, al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida ha de almacenarse a entre 2 °C y 8 °C en su recipiente original.
Los anticuerpos de la invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. En un aspecto, los anticuerpos se prepararán como una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta por una forma farmacéutica líquida o liofilizada en un vial de pedernal o ámbar, ampolla o jeringuilla precargada. El tampón puede ser L-histidina (1­ 50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen, pero sin limitación, succinato de sodio, citrato sódico, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Puede usarse cloruro de sodio para modificar la tonicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente, 150 mM para una forma farmacéutica líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma farmacéutica liofilizada, principalmente, sacarosa al 0-10% (óptimamente, al 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes de volumen para una forma farmacéutica liofilizada, principalmente, manitol al 1-10% (óptimamente al 2-4 %). Pueden usarse estabilizantes en formas farmacéuticas líquidas y liofilizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM (opcionalmente, 5-10 mM). Otros agentes de volumen incluyen glicina, arginina, que pueden incluirse en polisorbato-80 al 0-0,05 % (óptimamente, al 0,005-0,01 %). Los tensioactivos adicionales incluyen, pero sin limitación, polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la invención preparados en forma de una solución inyectable para administración parenteral, puede comprender además un agente útil como adyuvante, tal como aquellos usados para aumentar la absorción o dispersión del anticuerpo. Un adyuvante particularmente útil es la hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad en humanos después de la administración parenteral, en particular, la administración subcutánea. También permite mayores volúmenes en el sitio de inyección (es decir, mayores de 1 ml) con menos dolor y malestar y una incidencia mínima de reacciones en el sitio de inyección. (Véase la Publicación de Solicitud Internacional n.° WO 04/078140 y la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos US2006104968).
Las composiciones de la presente invención pueden encontrarse en diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferente depende del modo previsto de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. En una realización, el anticuerpo se proporciona para su administración mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización, el anticuerpo se proporciona para su administración mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas han de ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, un anticuerpo de la presente invención) en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtrado. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación comprenden secado al vacío y secado por pulverización, que proporciona un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado procedente de una solución anteriormente esterilizada por filtrado del mismo. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede propiciarse la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo, en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos de la presente invención pueden proporcionarse para su administración mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración puede ser inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En determinadas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un portador que protegerá al compuesto frente a su rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede proporcionarse para administración oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un transportador comestible asimilable. El anticuerpo (y otros ingredientes, en caso de que se desee) también pueden atraparse en una cápsula de gelatina de vaina dura o blanda, prensarse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, el anticuerpo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para hacer que un anticuerpo de la invención sea adecuado para su administración por una vía distinta de administración parenteral, puede ser necesario recubrir el anticuerpo con o coadministrar el anticuerpo con, un material para prevenir su inactivación.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención se liga a un vehículo que extienda la semivida conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero sin limitación, el dominio Fc, polietilenglicol y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de los Estados Unidos con n.° de serie 09/428.082 y publicada como la Solicitud PCT n.°WO 99/25044.
En una realización específica, se proporcionan para su administración secuencias de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención para tratar, prevenir, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos se proporcionan para producir su anticuerpo de la invención codificado que media un efecto profiláctico o terapéutico.
Puede usarse cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica para la administración de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Se divulga una descripción detallada de diversos métodos de terapia génica en el documento US20050042664.
Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse para su uso solos o en combinación para tratar enfermedades o afecciones asociadas con la enfermedad hepática y/o cáncer o cualquier otra enfermedad o afección asociada con GP73. Además, ha de entenderse que las combinaciones son aquellas combinaciones útiles para su fin previsto.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo puede determinarse por un experto en la materia y puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo para generar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que los efectos tóxicos o perjudiciales, en caso de haberlos, del anticuerpo se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma farmacéutica unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosis unitaria está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo es una dosis de entre 0,1 y 200 mg/kg, por ejemplo, entre 0,1 y 10 mg/kg. La cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo puede ser de entre 1 y 200 mg/kg, 10 y 200 mg/kg, 20 y 200 mg/kg, 50 y 200 mg/kg, 75 y 200 mg/kg, 100 y 200 mg/kg, 150 y 200 mg/kg, 50 y 100 mg/kg, 5 y 10 mg/kg o 1 y 10 mg/kg. Cabe destacar que los valores de dosificación pueden variar dependiendo del tipo y la gravedad de la afección que se vaya a aliviar. Además, puede determinarse la dosis de anticuerpo por un experto en la materia y puede variar de acuerdo con factores, tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo para generar una respuesta deseada en el individuo. La dosis también es una en la que los efectos tóxicos o perjudiciales, en caso de haberlos, del anticuerpo se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Además, ha de entenderse que para cualquier sujeto particular, deben ajustarse las pautas posológicas específicas con el paso del tiempo según las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.
4. Detección de GP73
La presente invención también se refiere a un método para detectar y medir GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de un sujeto usando los anticuerpos para GP73 descritos anteriormente para que se unan a diferentes GP73 o a GP73 fucosilada. El método incluye (a) poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo sobre GP73 (o fragmento de GP73) o a GP73 fucosilada (o un fragmento de GP73 fucosilada) para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73, (b) poner en contacto el complejo de anticuerpo de captura-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada con un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo sobre GP73 o GP73 fucosilada al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo de anticuerpo de captura-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-anticuerpo de detección y (c) determinar la presencia, cantidad o concentración de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-anticuerpo de detección, en donde: el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección.
La presente invención se refiere además a un método para diagnosticar una enfermedad basándose en los niveles de GP73 (o de fragmento de GP73) o de GP73 fucosilada (o fragmento de GP73 fucosilada) en una muestra del sujeto. El método incluye las etapas de (a) determinar el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en una muestra biológica, (b) comparar el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada, (c) identificar que el sujeto tiene una enfermedad en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada, en donde el método emplea al menos un anticuerpo que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la primera realización de la presente invención.
Los niveles de al menos 0,05 ng/ml, 0,06 ng/ml, 0,07 ng/ml, 0,08 ng/ml, 0,09 ng/ml, 0,10 ng/ml, 0,11 ng/ml, 0,12 ng/ml, 0,13 ng/ml, 0,14 ng/ml, 0,15 ng/ml, 0,16 ng/ml, 0,17 ng/ml, 0,18 ng/ml, 0,19 ng/ml, 0,20 ng/ml, 0,25 ng/ml, 0,30 ng/ml, 0,35 ng/ml, 0,40 ng/ml, 0,45 ng/ml, 0,50 ng/ml, 0,55 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 21 ng/ml, 22 ng/ml, 23 ng/ml, 24 ng/ml, 25 ng/ml, 26 ng/ml, 27 ng/ml, 28 ng/ml, 29 ng/ml o 30 ng/ml de GP73 (o fragmento de GP73) o GP73 fucosilada (o fragmento de GP73 fucosilada) en una muestra biológica pueden ser detectados.
Los intervalos de detección de GP73 y GP73 fucosilada tienen al menos un 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 210 %, 220 %, 230 %, 240 %, 250 %, 260 %, 270 %, 280 %, 290 %, 300 %, 400 % o 500 % de mejora del intervalo de tamaño en comparación con otros inmunoensayos disponibles comercialmente para GP73 o GP73 fucosilada.
Los intervalos de 0 ng/ml a 30 ng/ml, 0,05 ng/ml a 30 ng/ml, 0,06 ng/ml a 30 ng/ml, 0,07 ng/ml a 30 ng/ml, 0,08 ng/ml a 30 ng/ml, 0,09 ng/ml a 30 ng/ml, 0,095 ng/ml a 30 ng/ml, 0,10 ng/ml a 30 ng/ml, 0,105 ng/ml a 30 ng/ml, 0,11 ng/ml a 30 ng/ml, 0,12 ng/ml a 30 ng/ml, 0,13 ng/ml a 30 ng/ml, 0,14 ng/ml a 30 ng/ml, 0,15 ng/ml a 30 ng/ml, 0,20 ng/ml a 30 ng/ml, 1,00 ng/ml a 30, 0 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,05 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,06 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,07 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,08 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,09 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,095 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,10 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,105 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,11 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,12 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,13 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,14 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,15 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0,20 ng/ml a 27,5 ng/ml, 1,00 ng/ml a 27,5 ng/ml, 0 ng/ml a 26 ng/ml, 0,05 ng/ml a 26 ng/ml, 0,06 ng/ml a 26 ng/ml, 0,07 ng/ml a 26 ng/ml, 0,08 ng/ml a 26 ng/ml, 0,09 ng/ml a 26 ng/ml, 0,095 ng/ml a 26 ng/ml, 0,10 ng/ml a 26 ng/ml, 0,105 ng/ml a 26 ng/ml, 0,11 ng/ml a 26 ng/ml, 0,12 ng/ml a 26 ng/ml, 0,13 ng/ml a 26 ng/ml, 0,14 ng/ml a 26 ng/ml, 0,15 ng/ml a 26 ng/ml, 0,20 ng/ml a 26 ng/ml, 1,00 ng/ml a 26 ng/ml, 0 ng/ml a 25 ng/ml, 0,05 ng/ml a 25 ng/ml, 0,06 ng/ml a 25 ng/ml, 0,07 ng/ml a 25 ng/ml, 0,08 ng/ml a 25 ng/ml, 0,09 ng/ml a 25 ng/ml, 0,095 ng/ml a 25 ng/ml, 0,10 ng/ml a 25 ng/ml, 0,105 ng/ml a 25 ng/ml, 0,11 ng/ml a 25 ng/ml, 0,12 ng/ml a 25 ng/ml, 0,13 ng/ml a 25 ng/ml, 0,14 ng/ml a 25 ng/ml, 0,15 ng/ml a 25 ng/ml, 0,20 ng/ml a 25 ng/ml, 1,00 ng/ml a 25 ng/ml, 0 ng/ml a 24 ng/ml, 0,05 ng/ml a 24 ng/ml, 0,06 ng/ml a 24 ng/ml, 0,07 ng/ml a 24 ng/ml, 0,08 ng/ml a 24 ng/ml, 0,09 ng/ml a 24 ng/ml, 0,095 ng/ml a 24 ng/ml, 0,10 ng/ml a 24 ng/ml, 0,105 ng/ml a 24 ng/ml, 0,11 ng/ml a 24 ng/ml, 0,12 ng/ml a 24 ng/ml, 0,13 ng/ml a 24 ng/ml, 0,14 ng/ml a 24 ng/ml, 0,15 ng/ml a 24 ng/ml, 0,20 ng/ml a 24 ng/ml, 1,00 ng/ml a 24 ng/ml, 0 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,05 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,06 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,07 ng/ml a 22.5 ng/ml, 0,08 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,09 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,0950 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,10 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,105 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,11 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,12 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,13 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,14 ng/ml a 22.5 ng/ml, 0,15 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0,20 ng/ml a 22,5 ng/ml, 1,00 ng/ml a 22,5 ng/ml, 0 ng/ml a 20 ng/ml, 0,05 ng/ml a 20 ng/ml, 0,06 ng/ml a 20 ng/ml, 0,07 ng/ml a 20 ng/ml, 0,08 ng/ml a 20 ng/ml, 0,09 ng/ml a 20 ng/ml, 0,095 ng/ml a 20 ng/ml, 0,10 ng/ml a 20 ng/ml, 0,105 ng/ml a 20 ng/ml, 0,11 ng/ml a 20 ng/ml, 0,12 ng/ml a 20 ng/ml, 0,13 ng/ml a 20 ng/ml, 0,14 ng/ml a 20 ng/ml, 0,15 ng/ml a 20 ng/ml, 0,20 ng/ml a 20 ng/ml, 1,00 ng/ml a 20 ng/ml, 0 ng/ml a 15 ng/ml, 0,05 ng/ml a 15 ng/ml, 0,06 ng/ml a 15 ng/ml, 0,07 ng/ml a 15 ng/ml, 0,08 ng/ml a 15 ng/ml, 0,09 ng/ml a 15 ng/ml, 0,095 ng/ml a 15 ng/ml, 0,10 ng/ml a 15 ng/ml, 0,105 ng/ml a 15 ng/ml, 0,11 ng/ml a 15 ng/ml, 0,12 ng/ml a 15 ng/ml, 0,13 ng/ml a 15 ng/ml, 0,14 ng/ml a 15 ng/ml, 0,15 ng/ml a 15 ng/ml, 0,20 ng/ml a 15 ng/ml o 1,00 ng/ml a 15 ng/ml de GP73 o GP73 fucosilada pueden detectarse.
a. Inmunoensayo
GP73 y GP73 fucosilada y/o péptidos o fragmentos de la misma, es decir, fragmentos de GP73 y GP73 fucosilada, pueden analizarse usando los anticuerpos descritos anteriormente en un inmunoensayo. La presencia o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada puede determinarse usando anticuerpos y detectando la unión específica a GP73 o a GP73 fucosilada. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención se une específicamente a GP73 o a GP73 fucosilada. Si se desea, pueden usarse uno o más de los anticuerpos en combinación con uno o más de los anticuerpos monoclonales/policlonales comercialmente disponibles. Dichos anticuerpos se encuentran disponibles de compañías tales como R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) y Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA).
Puede determinarse fácilmente la presencia o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada en una muestra corporal usando un inmunoensayo, tal como un inmunoensayo en sándwich (por ejemplo, inmunoensayos en sándwich monoclonalpoliclonal, incluyendo la detección de radioisótopos (radioinmunoensayo (RIA)) y la detección de enzimas (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA) (por ejemplo, Ensayos de ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN)). Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, en particular uno que emplea el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmunoensayo preferido. Otros métodos incluyen, por ejemplo, espectrometría de masas e inmunohistoquímica (por ejemplo, con secciones de biopsias de tejidos) usando anticuerpos para GP73 (monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados, humanos, etc.) o fragmentos de anticuerpo de los mismos contra GP73. Otros métodos de detección incluyen los descritos en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.143.576; 6.113.855; 6.019.944; 5.985.579; 5.947.124; 5.939.272; 5.922.615; 5.885.527; 5.851.776; 5.824.799; 5.679.526; 5.525.524; y 5.480.792. La unión inmunológica específica del anticuerpo a la GP73 puede detectarse mediante marcadores directos, tales como marcadores fluorescentes o luminiscentes, metales y radionúclidos unidos al anticuerpo o mediante marcadores indirectos, tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
Puede incorporarse en el inmunoensayo el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo inmovilizados. Los anticuerpos pueden inmovilizarse sobre una variedad de soportes, tales como partículas magnéticas o cromatográficas, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microtitulación), trozos de un material de sustrato sólido y similares. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. Después, puede empaparse esta tira en la muestra biológica de ensayo y procesarse rápidamente mediante lavados y etapas de detección para generar una señal medible, tal como un punto coloreado.
Puede usarse un formato heterogéneo. Por ejemplo, después de obtenerse la muestra de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de ensayo que se está ensayando respecto de GP73 o de GP73 fucosilada y un primer compañero de unión específico, en donde el primer compañero de unión específico y cualquier GP73 o GP73 fucosilada contenida en la muestra de ensayo forma un primer complejo de compañero de unión específico-GP73 o GP73 fucosilada. De acuerdo con la presente divulgación, el primer compañero de unión específica puede ser un anticuerpo anti-GP73 que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 97. El orden en el que se añaden la muestra de ensayo y el primer compañero de unión específica para formar la mezcla no es crítico. El primer compañero de unión específica puede inmovilizarse sobre una fase sólida. La fase sólida usada en el inmunoensayo (para el primer compañero de unión específica y, opcionalmente, el segundo compañero de unión específica) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, pero sin limitación, una partícula magnética, una perla, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una cubeta, una membrana, una molécula de andamio, una película, un papel de filtro, un disco y un chip.
Después de que se forme la mezcla que contiene el primer complejo de compañero de unión específica-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada, se retira cualquier GP73 o GP73 fucosilada no unida del complejo usando cualquier técnica conocida en la materia. Por ejemplo, la GP73 o GP73 fucosilada no unida puede retirarse mediante lavado. Deseablemente, sin embargo, el primer compañero de unión específica está presente en exceso de cualquier GP73 o GP73 fucosilada presente en la muestra de ensayo, de tal forma que toda la GP73 o GP73 fucosilada que está presente en la muestra de ensayo se une al primer compañero de unión específica.
Después de retirar cualquier GP73 o GP73 fucosilada no unida, se añade un segundo compañero de unión específica a la mezcla para formar un primer complejo de compañero de unión específica-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo compañero de unión específica. De acuerdo con la presente divulgación, el segundo compañero de unión específica puede ser un anticuerpo anti-GP73 o GP73 fucosilada que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos tres (3) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 33. Por otra parte, el segundo compañero de unión específica está marcado con o contiene un marcador detectable, como se ha descrito anteriormente.
Puede incorporarse en el inmunoensayo el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo inmovilizados. Los anticuerpos pueden inmovilizarse sobre una variedad de soportes, tales como partículas magnéticas o cromatográficas, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microtitulación), trozos de un material de sustrato sólido y similares. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. Después, puede empaparse esta tira en la muestra biológica de ensayo y procesarse rápidamente mediante lavados y etapas de detección para generar una señal medible, tal como un punto coloreado.
(1) ELISA en sándwich
El ELISA en sándwich mide la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpo (es decir, al menos un anticuerpo de captura) y un anticuerpo de detección (es decir, al menos un anticuerpo de detección. El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección se unen a diferentes epítopos sobre el antígeno, por ejemplo, GP73 o GP73 fucosilada. Deseablemente, la unión del anticuerpo de captura a un epítopo no interfiere con la unión del anticuerpo de detección a un epítopo. Pueden usarse anticuerpos monoclonales o policlonales como anticuerpos de captura y detección en el e LisA en sándwich.
En general, se emplean al menos dos anticuerpos para separar y cuantificar GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de ensayo. Más específicamente, los al menos dos anticuerpos se unen a ciertos epítopos de GP73 o GP73 fucosilada, formando un complejo inmunitario que se denomina un "sándwich". Pueden usarse uno o más anticuerpos para capturar la GP73 o GP73 fucosilada en la muestra de ensayo (estos anticuerpos se citan frecuentemente como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y se usan uno o más anticuerpos para unir a un marcador detectable (a saber, cuantificable) al sándwich (estos anticuerpos se citan frecuentemente como el anticuerpo de "detección" o anticuerpos de "detección). En un ensayo tipo sándwich, la unión de un anticuerpo a su epítopo, deseablemente, no se reduce por la unión de cualquier otro anticuerpo en el ensayo a su epítopo respectivo. Los anticuerpos se seleccionan de tal forma que los uno o más anticuerpos puestos en contacto con una muestra de ensayo que se sospecha que contiene GP73 o GP73 fucosilada no se unen a la totalidad o parte de un epítopo reconocido por los anticuerpos segundo o posteriores, interfiriendo de este modo con la capacidad de los uno o más segundos anticuerpos de detección para unirse a la GP73 o GP73 fucosilada.
Los anticuerpos pueden usarse como un primer anticuerpo en dicho inmunoensayo. El anticuerpo se une inmunoespecíficamente a epítopos sobre GP73 o GP73 fucosilada. Además de los anticuerpos de la presente invención, dicho inmunoensayo puede comprender un segundo anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a epítopos que no son reconocidos o a los que no se une el primer anticuerpo.
Puede ponerse en contacto una muestra de ensayo que se sospecha que contiene GP73 o GP73 fucosilada con al menos un primer anticuerpo de captura (o anticuerpos) y al menos un segundo anticuerpo de detección, ya sea de manera simultánea o secuencialmente. En el formato de ensayo de tipo sándwich, se pone en contacto en primer lugar una muestra de ensayo que se sospecha que contiene GP73 o GP73 fucosilada con el al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo particular, en condiciones que permiten la formación de un primer complejo de anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada. Si se usa más de un anticuerpo de captura, se forma un primer complejo múltiple de anticuerpo de captura-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada. En un ensayo tipo sándwich, los anticuerpos, preferentemente, el al menos un anticuerpo de captura, se usan en cantidades de exceso molar de la máxima cantidad de GP73 o GP73 fucosilada esperada en la muestra de ensayo. Por ejemplo, pueden usarse de 5 pg/ml a 1 mg/ml de anticuerpo por ml de tampón de recubrimiento de micropartículas.
(a) Anticuerpo de captura anti-GP73
Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de ensayo con el al menos un primer anticuerpo de captura, el al menos un primer anticuerpo de captura puede unirse a un soporte sólido, lo que facilita la separación del primer complejo de anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada de la muestra de ensayo. Puede usarse cualquier soporte sólido conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, soportes sólidos hechos de materiales poliméricos en forma de pocillos, tubos o perlas. El anticuerpo (o los anticuerpos) pueden unirse al soporte sólido mediante adsorción, mediante unión covalente usando un agente de acoplamiento químico o mediante otros medios conocidos en la técnica, a condición de que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse a GP73 o GP73 fucosilada. Por otra parte, si fuera necesario, el soporte sólido puede derivatizarse para permitir la reactividad con diversos grupos funcionales en el anticuerpo. Dicha derivatización requiere del uso de ciertos agentes de acoplamiento, tales como, pero sin limitación, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
Posteriormente, se incuba la muestra de ensayo que se sospecha que contiene GP73, GP73 o GP73 fucosilada para permitir la formación de un primer complejo de anticuerpo de captura (o múltiples anticuerpos)-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada. La incubación puede llevarse a cabo a un pH de 4,5 a 10,0, a una temperatura de 2 °C a 45 °C y durante un periodo de al menos un (1) minuto a dieciocho (18) horas, de 2-6 minutos o de 3-4 minutos.
(b) Anticuerpo de detección
Después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo de captura-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada, después, se pone en contacto el complejo con al menos un segundo anticuerpo de detección (en condiciones que permiten la formación de un complejo de primer/múltiple anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo anticuerpo). En caso de que el complejo de primer anticuerpo-GP73 o GP73 fucosilada o antígeno de GP73 fucosilada-segundo anticuerpo se ponga en contacto con más de un anticuerpo de detección, se forma un complejo de primer/múltiple anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo anticuerpo. Como con el primer anticuerpo, cuando se pone en contacto el al menos segundo (y posterior) anticuerpo con el complejo de primer anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada, se necesita un periodo de incubación en condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo/múltiple anticuerpo. Preferentemente, al menos un segundo anticuerpo contiene un marcador detectable. El marcador detectable puede unirse al al menos un segundo anticuerpos antes de, simultáneamente cono después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo/múltiple anticuerpo. Puede usarse cualquier marcador detectable conocido en la técnica. Pueden llevarse a cabo ensayos quimioluminiscentes de acuerdo con los métodos descritos en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Si bien puede usarse cualquier formato de ensayo adecuado, un quimioluminómetro de microplaca (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN) permite el análisis de múltiples muestras de pequeños volúmenes rápidamente. El quimioluminómetro puede equiparse con inyectores de reactivos múltiples utilizando microplacas de poliestireno negro de 96 pocillos (Costar n.° 3792). Cada muestra puede añadirse a un pocillo separado, seguido de la adición simultánea/secuencial de otros reactivos según lo determinado por el tipo de ensayo empleado. Deseablemente, se evita la formación de pseudobases en soluciones neutras o básicas que emplean un éster de aril acridinio, tal como por acidificación. La respuesta quimioluminiscente se registra después pocillo a pocillo. A este respecto, el tiempo para registrar la respuesta quimioluminiscente dependerá, en parte, del retraso entre la adición de los reactivos y el acridinio particular empleado.
No resulta crítico el orden en el que se añaden la muestra de ensayo y los compañeros de unión específica para formar la mezcla para el ensayo quimioluminiscente. En caso de que el primer compañero de unión específica esté marcado de manera detectable con un compuesto de acridinio, se forman complejos marcados de manera detectable de primer compañero de unión específica-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada. Como alternativa, en caso de que se use un segundo compañero de unión específica y el segundo compañero de unión específica se marque detectablemente con un compuesto de acridinio, se forman complejos marcados de manera detectable de primer compañero de unión específica-GP73 o antígeno de GP73 fucosilada-segundo compañero de unión específica. Cualquier compañero de unión específica no unido, ya esté marcado o sin marcar, puede retirarse de la mezcla usando cualquier técnica conocida en la materia, tal como lavado.
Puede generarse peróxido de hidrógeno in situ en la mezcla o proporcionarse o suministrarse a la mezcla antes, simultáneamente con o después de la adición de un compuesto de acridinio anteriormente descrito. Puede generarse peróxido de hidrógeno in situ de varias maneras, como será evidente para un experto en la materia. Como alternativa, puede añadirse simplemente una fuente de peróxido de hidrógeno a la mezcla. Por ejemplo, la fuente del peróxido de hidrógeno puede ser uno o más tampones u otras soluciones que se sabe que contienen peróxido de hidrógeno. A este respecto, puede simplemente añadirse una solución de peróxido de hidrógeno.
Tras la adición simultánea o posterior de al menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, a saber, una señal quimioluminiscente, que indica la presencia de GP73 o GP73 fucosilada. La solución básica contiene al menos una base y tiene un pH mayor o igual a 10, preferentemente, mayor o igual a 12. Los ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero sin limitación, hidróxido sódico, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido amónico, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica añadida a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Basándose en la concentración de la solución básica usada, un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica para añadir a la muestra.
La señal quimioluminiscente que se genera puede detectarse usando técnicas de rutina conocidas por los expertos en la materia. Basándose en la intensidad de la señal generada, puede cuantificarse la cantidad de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra. Específicamente, la cantidad de GP73 en la muestra es proporcionar a la intensidad de la señal generada. Puede cuantificarse la cantidad de GP73 o GP73 fucosilada presente comparando la cantidad de luz generada con una curva patrón para GP73 o GP73 fucosilada o mediante comparación con un patrón de referencia. La curva patrón puede generarse usando diluciones seriadas o soluciones de concentraciones conocidas de GP73 o GP73 fucosilada mediante espectroscopía de masas, métodos gravimétricos y otras técnicas conocidas en la materia.
En un ensayo de micropartículas quimioluminiscentes que emplea el analizador ARCHITECT@ (o su sucesor),, el pH del diluyente conjugado ha de ser de 6,0 /- 0,2, el tampón de recubrimiento de micropartículas debe mantenerse a temperatura ambiente (es decir, a de 17 a 27 °C), el pH del tampón de recubrimiento de micropartículas ha de ser de 6,5 /- 0,2 y el pH del diluyente de micropartículas ha de ser de 7,8 /- 0,2. Los sólidos son menores de un 0,2 %, tal como menos de un 0,15%, menos de un 0,14%, menos de un 0,13%, menos de un 0,12% o menos de un 0,11 %, tal como un 0,10 %.
(2) Métodos para usar anticuerpos anti-GP73
La presente invención se refiere a un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de GP73 o un fragmento de GP73 en una muestra de ensayo usando los anticuerpos anti-GP73 de acuerdo con la invención o fragmentos de anticuerpo de los mismos. El método incluye las etapas de (a) poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73, a fin de formar un complejo de anticuerpo de captura-GP73 o fragmento de antígeno de GP73; (b) poner en contacto el complejo de anticuerpo de captura-GP73 o fragmento de antígeno de GP73 con al menos un anticuerpo de detección, que comprende un marcador detectable y se une a un epítopo sobre GP73 o el fragmento de GP73 al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo de anticuerpo de captura-GP73 o fragmento de antígeno de GP73-anticuerpo de detección; y (c) determinar la presencia, cantidad o concentración de GP73 o fragmento de GP73 en la muestra de ensayo basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-GP73 o fragmento de antígeno de GP73-anticuerpo de detección, en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección, tras lo que se determina la presencia, cantidad o concentración de GP73 o fragmento de GP73 en la muestra de ensayo.
La proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 o fragmento de GP73 fucosilada es sensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en GP73 fucosilada o fragmento de GP73 fucosilada puede incluir lectina de Aleurina aurantia (AAL) o un fragmento de la misma; una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 33; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 37; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; o una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
La proteína, anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión a GP73 o fragmento de GP73 fucosilada es insensible a la presencia o ausencia de un resto de azúcar de fucosa en GP73 fucosilada o fragmento de GP73 fucosilada puede incluir una región de dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 41; una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 45; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; un dominio variable pesado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una región de dominio variable ligero que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; una cadena pesada variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; una cadena pesada variable que comprende una CDR 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera variable que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que comprende una c Dr 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende una c DR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección pueden ser un anticuerpo anti-GP73 descrito anteriormente. b. Controles
Puede ser deseable incluir una muestra de control. La muestra de control puede analizarse concurrentemente con la muestra del sujeto, como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos de la muestra del sujeto pueden compararse con los resultados obtenidos de la muestra de control. Pueden proporcionarse curvas patrón, con las que pueden compararse los resultados del ensayo para la muestra biológica. Dichas curvas patrón presentan niveles de marcador en función de las unidades del ensayo, es decir, intensidad de señal fluorescente, en caso de que se use un marcador fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donantes, pueden proporcionarse curvas patrón para niveles de control de la GP73 o la GP73 fucosilada en el tejido sano normal, así como para niveles "en riesgo" de la GP73 o la GP73 fucosilada en tejido tomado de donantes, que pueden tener una o más de las características expuestas anteriormente.
Por consiguiente, en vista de lo anterior, se proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de ensayo por la presente invención. El método comprende ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada mediante un inmunoensayo, por ejemplo, empleando al menos un anticuerpo de captura que se une a un epítopo sobre GP73 o GP73 fucosilada o a GP73 fucosilada y al menos un anticuerpo de detección que se une a un epítopo en GP73 o GP73 fucosilada que es diferente al epítopo para el anticuerpo de captura y opcionalmente incluye un marcador detectable y que comprende comparar una señal generada por el marcador detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra de ensayo con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de GP73 o GP73 fucosilada en un calibrador en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección. El calibrador es opcionalmente y preferentemente, parte de una serie de calibradores en la que cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores en la serie por la concentración de GP73 o GP73 fucosilada.
5. Métodos para diagnosticar, pronosticar o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico El método puede proporcionarse además para diagnosticar, pronosticar o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente del que se obtuvo la muestra de ensayo. Mediante la medición y detección de GP73 y GP73 fucosilada, el método permite que las enfermedades se diagnostiquen con mayor precisión y posteriormente se traten con mayor éxito, en comparación con otros inmunoensayos de GP73 disponibles comercialmente. El método puede adaptarse para su uso en un sistema automatizado o un sistema semiautomatizado.
En general, puede emplearse un nivel predeterminado como valor de referencia frente al que se evalúan los resultados obtenidos tras ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada. En general, al hacer dicha comparación, se obtiene el nivel predeterminado ejecutando un ensayo particular un número suficiente de veces y en condiciones adecuadas, de tal forma que puede efectuarse un vínculo o asociación de la presencia, cantidad o concentración del analito con una etapa o criterio de valoración particular de una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, enfermedad o cáncer hepático) o con indicios particulares. Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos). La GP73 medida puede incluir fragmentos de GP73 de la misma, productos de degradación de la misma y/o productos de escisión enzimática de la misma. La GP73 fucosilada puede incluir fragmentos de GP73 fucosilada de la misma, productos de degradación de la misma y/o productos de escisión enzimática de la misma.
En particular, con respecto a un nivel predeterminado como se emplea para controlar la progresión y/o tratamiento de la enfermedad, la cantidad o concentración de GP73 o fragmento de GP73 o de GP73 fucosilada o de fragmento de GP73 fucosilada puede estar "sin cambiar", "favorable" (o "alterada favorablemente") o "desfavorable" (o "alterada desfavorablemente"). "Elevada" o "aumentada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de ensayo que es mayor que un intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o es mayor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal). El término "disminuida" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de ensayo que es menor o inferior a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o es menor o inferior que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal). El término "alterada" se refiere a una cantidad o a una concentración en una muestra que está alterada (aumentada o reducida) frente a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o frente a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal).
El nivel o intervalo típico o normal para GP73 o GP73 fucosilada se define de acuerdo con la práctica convencional. Puede considerarse que un nivel denominado alterado o la alteración se ha producido cuando hay un cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal o un nivel o intervalo de referencia que no puede explicarse por el error experimental o la variación de la muestra. Por consiguiente, se comparará el nivel medido en una muestra particular con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares en un sujeto denominado normal. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo sin enfermedad o trastorno detectable y un paciente o población "normal" (en ocasiones citado de "control") es uno que no muestra enfermedad o trastorno detectable, respectivamente, por ejemplo. Un "sujeto aparentemente normal" es uno en el que no se ha evaluado o se está evaluando GP73 o GP73 fucosilada o GP73 fucosilada. Se dice que el nivel de un analito está "elevado" cuando el analito es normalmente indetectable (por ejemplo, el nivel normal se cero o se encuentra dentro de un intervalo de 25 a 75 percentiles de poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de ensayo, así como cuando el analito está presente en la muestra de ensayo a un nivel mayor que el nivel normal. Por consiguiente, entre otras cosas, la divulgación proporciona un método para explorar a un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de tener, enfermedad o cáncer hepático.
a. Métodos para proporcionar un diagnóstico de un sujeto que tiene una enfermedad
El método descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar un diagnóstico de que un sujeto tiene una enfermedad determinando los niveles de GP73 o de GP73 fucosilada en un sujeto. El método puede usarse para detectar la enfermedad en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. Un método contemplado por la presente divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando anticuerpos anti-GP73 o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, (d) identificar que el sujeto tiene la enfermedad en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada y (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto en el que se identifica que tiene la enfermedad. Los anticuerpos anti-GP73 usados en el método pueden ser el anticuerpo 1A-4246 y el anticuerpo 1B-4863 o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
(1) Enfermedad hepática
El método descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar un diagnóstico de que un sujeto tiene una enfermedad hepática determinando los niveles de GP73 o de GP73 fucosilada en un sujeto. El método puede usarse para detectar la enfermedad hepática en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. Un método contemplado por la presente divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando anticuerpos anti-GP73 o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, (d) identificar que el sujeto tiene la enfermedad hepática en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada y (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto en el que se identifica que tiene la enfermedad hepática. Los anticuerpos anti-GP73 usados en el método contemplado por la presente divulgación pueden ser el anticuerpo 1A-4246 y el anticuerpo 1B-4863 o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
El en este método puede ser el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en un paciente que tiene enfermedad hepática. Los niveles mayores o iguales a 0,30 ng/ml, 0,31 ng/ml, 0,32 ng/ml, 0,33 ng/ml, 0,34 ng/ml, 0,35 ng/ml, 0,36 ng/ml, 0,37 ng/ml, 0,38 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,40 ng/ml, 0,41 ng/ml, 0,42 ng/ml, 0,43 ng/ml, 0,44 ng/ml, 0,45 ng/ml, 0,46 ng/ml, 0,47 ng/ml, 0,48 ng/ml, 0,49 ng/ml, 0,50 ng/ml, 0,51 ng/ml, 0,52 ng/ml, 0,53 ng/ml, 0,54 ng/ml, 0,55 ng/ml, 0,56 ng/ml, 0,57 ng/ml, 0,58 ng/ml, 0,59 ng/ml, 0,60 ng/ml, 0,61 ng/ml, 0,62 ng/ml, 0,63 ng/ml, 0,64 ng/ml, 0,65 ng/ml, 0,66 ng/ml, 0,67 ng/ml, 0,68 ng/ml, 0,69 ng/ml, 0,70 ng/ml, 0,71 ng/ml, 0,72 ng/ml, 0,73 ng/ml, 0,74 ng/ml, 0,75 ng/ml, 0,76 ng/ml, 0,77 ng/ml, 0,78 ng/ml, 0,79 ng/ml, 0,80 ng/ml, 0,81 ng/ml, 0,82 ng/ml, 0,83 ng/ml, 0,84 ng/ml, 0,85 ng/ml, 0,86 ng/ml, 0,87 ng/ml, 0,88 ng/ml, 0,89 ng/ml, 0,90 ng/ml, 0,91 ng/ml o 0,92 ng/ml en suero de GP73 o GP73 fucosilada identifican que el sujeto tiene enfermedad hepática.
(a) Cirrosis hepática
El método descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar un diagnóstico de que un sujeto tiene cirrosis hepática determinando los niveles de GP73 o de GP73 fucosilada en un sujeto. El método puede usarse para detectar la cirrosis hepática en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. El método contemplado por la presente divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando anticuerpos anti-GP73 o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, (d) identificar que el sujeto tiene cirrosis hepática en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada y (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto en el que se identifica que tiene cirrosis hepática. Los anticuerpos anti-GP73 usados en el método contemplado por la presente divulgación pueden ser el anticuerpo 1A-4246 y el anticuerpo 1B-4863 o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
El en este método puede ser el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en un paciente que tiene cirrosis hepática. Los niveles mayores o iguales a 0,68 ng/ml, 0,69 ng/ml, 0,70 ng/ml, 0,71 ng/ml, 0,72 ng/ml, 0,73 ng/ml, 0,74 ng/ml, 0,75 ng/ml, 0,76 ng/ml, 0,77 ng/ml, 0,78 ng/ml, 0,79 ng/ml, 0,80 ng/ml, 0,81 ng/ml, 0,82 ng/ml, 0,83 ng/ml, 0,84 ng/ml, 0,85 ng/ml, 0,86 ng/ml, 0,87 ng/ml, 0,88 ng/ml, 0,89 ng/ml, 0,90 ng/ml, 0,91 ng/ml o 0,92 ng/ml en suero de GP73 o GP73 fucosilada identifican que el sujeto tiene cirrosis hepática.
(b) Cáncer de hígado
El método descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar un diagnóstico de que un sujeto tiene cáncer de hígado determinando los niveles de GP73 o de GP73 fucosilada en un sujeto. El método puede usarse para detectar el cáncer de hígado en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. El método contemplado por la presente divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, (d) identificar que el sujeto tiene cáncer de hígado en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada y (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto en el que se identifica que tiene cáncer de hígado. Los anticuerpos anti-GP73 usados en el método contemplado por la presente divulgación pueden ser el anticuerpo 1A-4246 y el anticuerpo 1B-4863 o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
El en este método puede ser el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en un paciente que tiene cáncer de hígado. Los niveles mayores o iguales a 0,30 ng/ml, 0,31 ng/ml, 0,32 ng/ml, 0,33 ng/ml, 0,34 ng/ml, 0,35 ng/ml, 0,36 ng/ml, 0,37 ng/ml, 0,38 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,40 ng/ml, 0,45 ng/ml, 0,50 ng/ml, 0,55 ng/ml, 0,58 ng/ml, 0,59 ng/ml, 0,60 ng/ml, 0,61 ng/ml, 0,62 ng/ml, 0,63 ng/ml, 0,64 ng/ml, 0,65 ng/ml, 0,66 ng/ml, 0,67 ng/ml o 0,68 ng/ml en suero de GP73 o GP73 fucosilada identifican que el sujeto tiene cáncer de hígado.
(2) Cáncer
El método descrito en el presente documento puede usarse para proporcionar un diagnóstico de que un sujeto tiene cáncer determinando los niveles de GP73 o de GP73 fucosilada en un sujeto. El método puede usarse para detectar el cáncer en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. El método contemplado por la presente divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando anticuerpos anti-GP73 o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, (d) identificar que el sujeto tiene cáncer en caso de que el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en la muestra biológica sea mayor que el nivel de referencia de GP73 o de GP73 fucosilada y (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto en el que se identifica que tiene cáncer. Los anticuerpos anti-GP73 usados en el método contemplado por la presente divulgación pueden ser el anticuerpo 1A-4246 y el anticuerpo 1B-4863 o fragmentos de anticuerpo de los mismos.
El en este método puede ser el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada en un paciente que tiene cáncer. Los niveles mayores o iguales a 0,29 ng/ml, 0,30 ng/ml, 0,31 ng/ml, 0,32 ng/ml, 0,33 ng/ml, 0,34 ng/ml, 0,35 ng/ml, 0,36 ng/ml, 0,37 ng/ml, 0,38 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,40 ng/ml, 0,41 ng/ml, 0,42 ng/ml, 0,43 ng/ml, 0,44 ng/ml, 0,45 ng/ml, 0,46 ng/ml, 0,47 ng/ml, 0,48 ng/ml, 0,49 ng/ml, 0,50 ng/ml, 0,51 ng/ml, 0,52 ng/ml, 0,53 ng/ml, 0,54 ng/ml, 0,55 ng/ml, 0,56 ng/ml, 0,57 ng/ml, 0,58 ng/ml, 0,59 ng/ml, 0,60 ng/ml, 0,61 ng/ml, 0,62 ng/ml, 0,63 ng/ml, 0,64 ng/ml, 0,65 ng/ml, 0,66 ng/ml, 0,67 ng/ml, 0,68 ng/ml, 0,69 ng/ml, 0,70 ng/ml, 0,71 ng/ml, 0,72 ng/ml, 0,73 ng/ml, 0,74 ng/ml, 0,75 ng/ml, 0,76 ng/ml, 0,77 ng/ml, 0,78 ng/ml, 0,79 ng/ml, 0,80 ng/ml, 0,81 ng/ml, 0,82 ng/ml, 0,83 ng/ml, 0,84 ng/ml, 0,85 ng/ml, 0,86 ng/ml, 0,87 ng/ml, 0,88 ng/ml, 0,89 ng/ml, 0,90 ng/ml, 0,91 ng/ml, 0,92 ng/ml, 0,93 ng/ml, 0,94 ng/ml, 0,95 ng/ml, 0,96 ng/ml, 0,97 ng/ml, 0,98 ng/ml, 0,99 ng/ml, 1,00 ng/ml, 1,01 ng/ml, 1,02 ng/ml, 1,03 ng/ml, 1,04 ng/ml, 1,05 ng/ml, 1,06 ng/ml, 1,07 ng/ml, 1,08 ng/ml, 1,09 ng/ml o 1,10 ng/ml en suero de GP73 o GP73 fucosilada identifican que el sujeto tiene cáncer.
b. Métodos para determinar el riesgo de que un sujeto desarrolle enfermedad hepática
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar o no enfermedad hepática determinando los niveles de GP73 o GP73 fucosilada en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. Por consiguiente, en realizaciones particulares, la divulgación también proporciona un método para determinar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de tener, enfermedades hepáticas, analizado en el presente documento y conocido en la técnica, es un candidato para la terapia o el tratamiento. En general, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de la enfermedad o que ha sido diagnosticado actualmente con, o que está en riesgo de, dicha enfermedad y/o que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de GP73 o fragmento de GP73, como se describe en el presente documento.
Específicamente, dicho método puede comprender las etapas de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de ensayo de un sujeto de GP73 o GP73 fucosilada usando los métodos descritos en el presente documento o métodos conocidos en la técnica; y (b) comparar la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) con un nivel predeterminado, en donde, en caso de que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) sea favorable con respecto a un nivel predeterminado, se determina que el sujeto no tiene o no se encuentra en riesgo de enfermedad hepática, como se analiza en el presente documento y se conoce en la técnica. Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) sea desfavorable con respecto al nivel predeterminado, se determina que el sujeto tiene o se encuentra en riesgo de enfermedad hepática, como se analiza en el presente documento y se conoce en la técnica. La enfermedad hepática puede ser cirrosis hepática o cáncer de hígado.
c. Métodos para determinar el riesgo de que un sujeto desarrolle cáncer
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si un sujeto se tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar o no cáncer, determinando los niveles de GP73 o GP73 fucosilada en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. Por consiguiente, en realizaciones particulares, la divulgación también proporciona un método para determinar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de tener, cáncer, como se ha analizado en el presente documento y se conoce en la técnica, es un candidato para la terapia o el tratamiento. En general, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de la enfermedad o que ha sido diagnosticado actualmente con, o que está en riesgo de, dicha enfermedad y/o que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de GP73 o GP73 fucosilada, como se describe en el presente documento.
Específicamente, dicho método puede comprender las etapas de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de ensayo de un sujeto de GP73 o GP73 fucosilada usando los métodos descritos en el presente documento o métodos conocidos en la técnica y (b) comparar la concentración o cantidad de Gp73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) con un nivel predeterminado, en donde, en caso de que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) sea favorable con respecto a un nivel predeterminado, se determina que el sujeto no tiene o no se encuentra en riesgo tener cáncer, como se analiza en el presente documento y se conoce en la técnica. Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad de GP73 determinada en la etapa (a) sea desfavorable con respecto al nivel predeterminado, se determina que el sujeto tiene o se encuentra en riesgo de tener cáncer, como se analiza en el presente documento y se conoce en la técnica. El cáncer puede ser cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de próstata o cáncer de hígado. d. Métodos para monitorizar el progreso de la enfermedad en un sujeto
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para monitorizar la progresión de una enfermedad, tal como enfermedad o cáncer hepático, en un sujeto determinando los niveles de GP73 o GP73 fucosilada en un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. De manera óptima, el método incluye las etapas de (a) determinar la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de ensayo de un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (b) determinar la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de ensayo posterior de un sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos y (c) comparar la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (b) con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a), en donde en caso de que la concentración o cantidad determinada en la etapa (b) no haya cambiado o sea desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a), se determina que la enfermedad en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado. Por comparación, en caso de que la concentración o cantidad de GP73 o de GP73 fucosilada determinada en la etapa (b) sea favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a) , se determina que la enfermedad en el sujeto se ha interrumpido, remitido o mejorado.
Opcionalmente, el método comprende además comparar la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, el método comprende opcionalmente tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo en caso de que la comparación muestre que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (b) , por ejemplo, se altere desfavorablemente con respecto al nivel predeterminado.
De forma adicional, los métodos pueden usarse para monitorizar el tratamiento en un sujeto que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, dichos métodos implican proporcionar una primera muestra de ensayo de un sujeto antes de que se le haya administrado al sujeto una o más composiciones farmacéuticas. A continuación, se determina la concentración o cantidad en una primera muestra de ensayo de un sujeto de GP73 o GP73 fucosilada (por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento o como se conoce en la técnica). Después de que se determine la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada, opcionalmente se compara la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada con un nivel predeterminado. En caso de que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la primera muestra de ensayo sea menor que el nivel predeterminado, no se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas o como alternativa, puede tratarse al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas. En caso de que la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la primera muestra de ensayo sea mayor que el nivel predeterminado, se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo o como alternativa, no se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas. El periodo de tiempo durante el que se trata al sujeto con las una o más composiciones farmacéuticas puede determinarse por un experto en la materia (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de siete (7) días a dos años, preferentemente, de catorce (14) días a un (1) año).
Durante el transcurso del tratamiento con las una o más composiciones farmacéuticas, se obtienen las muestras de ensayo segunda y posteriores del sujeto. El número de muestras de ensayo y el tiempo en que se obtienen dichas muestras de ensayo del sujeto no son críticos. Por ejemplo, se puede obtener una segunda muestra de ensayo siete (7) días después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de ensayo puede obtenerse dos (2) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, se puede obtener una cuarta muestra de ensayo tres (3) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, se puede obtener una quinta muestra de ensayo cuatro (4) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, etc.
Después de obtener cada segunda o posterior muestra de ensayo del sujeto, se determina la concentración o cantidad de GP73 o de GP73 fucosilada en la segunda o posterior muestra de ensayo (por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento o como se conoce en la técnica). Después, se compara la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada en cada una de las segundas y posteriores muestras de ensayo con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la primera muestra de ensayo (por ejemplo, la muestra de ensayo que se comparó opcionalmente de manera original con el nivel predeterminado). En caso de que la concentración o cantidad de GP73 o de GP73 fucosilada determinada en la etapa (c) sea favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a), se determina que la enfermedad en el sujeto se ha interrumpido, remitido o mejorado y el sujeto debe continuar con la administración de las una o más composiciones farmacéuticas de la etapa (b). Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad determinada en la etapa (c) no haya cambiado o sea desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de GP73 o GP73 fucosilada determinada en la etapa (a), se determina que la enfermedad en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado y el sujeto debe tratarse con una mayor concentración de las una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b) o se debe tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de las una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b). Específicamente, puede tratarse al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de las una o más composiciones farmacéuticas que ha recibido el sujeto anteriormente para reducir o aminorar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada del sujeto.
En general, para los ensayos en los que pueden efectuarse ensayos repetidos (por ejemplo, monitorización de la progresión de la enfermedad y/o de la respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o posterior muestra en un periodo en el tiempo después de que se haya obtenido la primera muestra de ensayo del sujeto. Específicamente, puede obtenerse una segunda muestra de ensayo del sujeto minutos, horas, días, semanas o años después de que se haya obtenido la primera muestra de ensayo del sujeto. Por ejemplo, puede obtenerse la segunda muestra de ensayo del sujeto en un periodo de tiempo de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 1,5 años, 2 años, 2,5 años, 3,0 años, 3,5 años, 4,0 años, 4,5 años, 5,0 años, 5,5 años, 6,0 años, 6,5 años, 7,0 años, 7,5 años, 8,0 años, 8,5 años, 9,0 años, 9,5 años o 10,0 años después de que se obtenga la primera muestra de ensayo del sujeto. Cuando se usan para monitorizar la progresión de la enfermedad, puede usarse el ensayo anterior para monitorizar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones agudas. Las afecciones agudas, también conocidas como afecciones de cuidados críticos, se refieren a enfermedades agudas potencialmente letales o a otras afecciones médicas que implican, por ejemplo, el sistema cardiovascular o el sistema excretor. Típicamente, las afecciones de cuidados críticos se refieren a aquellas afecciones que requieren intervención médica aguda en un ambiente hospitalario (incluyendo, pero sin limitación, la sala de emergencias, unidad de cuidados intensivos, centro de traumatismos u otro ambiente de cuidado de emergencia) o la administración por un paramédico u otro personal médico basado en el campo. Para las afecciones de cuidado crítico, la monitorización repetida se efectúa generalmente en un espacio corto de tiempo, concretamente, minutos, horas o días (por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días) y el ensayo inicial igualmente se efectúa generalmente en un espacio de tiempo corto, por ejemplo, minutos, horas o días de la aparición de la enfermedad o afección.
Los ensayos también pueden usarse para monitorizar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones crónicas o no agudas. Afecciones de cuidados no críticos o afecciones no agudas, se refiere a afecciones que no son agudas, enfermedades potencialmente letales u otras afecciones médicas críticas que implican, por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o el sistema excretor. Típicamente, las afecciones no agudas incluyen aquellas de mayor duración o de duración crónica. Para las afecciones no agudas, la monitorización repetida se efectúa con un espacio de tiempo mayor, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 10 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 1,5 años, 2 años, 2,5 años, 3,0 años, 3,5 años, 4,0 años, 4,5 años, 5,0 años, 5,5 años, 6,0 años, 6,5 años, 7,0 años, 7,5 años, 8,0 años, 8,5 años, 9,0 años, 9,5 años o 10,0 años) y el ensayo inicial se efectúa igualmente en un espacio de tiempo más prolongado, por ejemplo, horas, días, meses o años de la aparición de la enfermedad o afección.
Asimismo, los ensayos anteriores pueden efectuarse usando una primera muestra de ensayo obtenida de un sujeto, donde la primera muestra de ensayo se obtiene de una fuente, tal como orina, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos anteriores pueden repetirse usando una segunda muestra de ensayo obtenida del sujeto, donde la segunda muestra de ensayo se obtiene de otra fuente. Por ejemplo, en caso de que la primera muestra de ensayo se obtuviese de orina, la segunda muestra de ensayo puede obtenerse de suero o plasma. Los resultados obtenidos de los ensayos usando la primera muestra de ensayo y la segunda muestra de ensayo pueden compararse. La comparación puede usarse para evaluar el estatus de una enfermedad o afección en el sujeto.
e. Métodos para determinar si un sujeto tiene predisposición a o padece una enfermedad
Por otra parte, los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si un sujeto predispuesto a o que padece una enfermedad (por ejemplo, enfermedad o cáncer hepático, como se analiza en el presente documento y se conoce en la técnica) se beneficiará del tratamiento. En particular, la divulgación se refiere a métodos y productos de diagnóstico de GP73 complementarios. Por consiguiente, el método para "monitorizar el tratamiento de la enfermedad en un sujeto", como se describe en el presente documento, puede abarcar óptimamente seleccionar o identificar candidatos para tratamientos de enfermedades hepáticas, tales como resección hepática y trasplante de hígado o para tratamientos contra el cáncer, tales como cirugía, radioterapia, terapia dirigida y quimioterapia.
f. Métodos para determinar si un sujeto responde a la administración de una composición farmacéutica
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si un sujeto está respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas determinando los niveles de GP73 o GP73 fucosilada en el sujeto usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos. El método comprende opcionalmente un ensayo como se describe en el presente documento, cuando se evalúa el nivel de GP73 o de GP73 fucosilada antes y después del tratamiento del sujeto con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, en particular, con un agente farmacéutico relacionado con un mecanismo de acción que implica a GP73 o GP73 fucosilada) o cuando el nivel de GP73 se evalúa después de dicho tratamiento y la concentración o el nivel de GP73 o GP73 fucosilada se compara frente a un nivel predeterminado. Una concentración o cantidad desfavorable de GP73 o GP73 fucosilada observada después del tratamiento confirma que el sujeto no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado, mientras que una concentración o cantidad favorable de GP73 o GP73 fucosilada observada después del tratamiento confirma que el sujeto se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado. Esta confirmación ayuda con la gestión de estudios clínicos y la provisión de una mejor atención del paciente.
El método contemplado por esta divulgación incluye las etapas de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica usando los anticuerpos anti-GP73 descritos anteriormente o fragmentos de anticuerpo de los mismos, (c) comparar el nivel de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra biológica con un nivel de referencia de GP73 o GP73 fucosilada, en donde una concentración alterada de GP73 o GP73 fucosilada indica que el sujeto no está respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas y (d) ajustar el tratamiento del sujeto en caso de que el sujeto no esté respondiendo a la administración de una o más composiciones farmacéuticas.
6. Combinaciones de biomarcadores
Los anticuerpos y métodos descritos anteriormente pueden usarse para detectar y medir niveles y concentraciones de GP73 o GP73 fucosilada en combinación con uno o más biomarcadores o inmunoensayos específicos para enfermedades. La combinación de GP73 o GP73 fucosilada con uno o más biomarcadores o inmunoensayos específicos para enfermedades puede proporcionar una mayor discriminación entre los controles sanos e individuos con la enfermedad, en comparación con la medición de GP73 o GP73 fucosilada sola. Por ejemplo, la medición de un panel de GP73 o GP73 fucosilada y de biomarcadores de enfermedad hepática adicionales puede proporcionar una mayor discriminación entre controles sanos e individuos con enfermedad en comparación con solo un panel de GP73 o GP73 fucosilada. La combinación de GP73 o GP73 fucosilada con al menos uno o más biomarcadores puede proporcionar mayor discriminación entre controles sanos e individuos que tienen enfermedad hepática y/o individuos que tienen cáncer.
Los ejemplos de los uno o más biomarcadores incluyen proteínas inducidas por la ausencia de vitamina K o antagonista-II (PIVKA-II), a-fetoproteína (AFP), AFP-L3, hemopexina (HPX), hemopexina fucosilada (Fuc-HPX), cininógeno fucosilado (Fc-Kin) y a-1-antitripsina fucosilada (F-AT).
a. PIVKA-II
La proteína inducida por la ausencia de vitamina K o antagonista-II (PIVKA-II), también conocida como des-g-carboxi protrombina (DCP), es una forma anormal de la proteína de coagulación, protrombina y se usa ampliamente con AFP en Japón durante y después del tratamiento de HCC para predecir resultados adversos y para detectar la recurrencia temprana y la malignidad potencial. PIVKA-II es la menos sensible a los factores de riesgo para HCC (tales como cirrosis) y por lo tanto, la más útil para predecir el HCC. Diferencia e1HCC de las enfermedades hepáticas no malignas, sin embargo, se observan falsos aumentos de concentraciones de PIVKA-II en pacientes con ictericia obstructivas graves debido a la colestasis intrahepática o en condiciones en las que se ve deteriorada la acción de la vitamina K en individuos con deficiencia de vitamina K da larga duración y en aquellos que han ingerido warfarina o antibióticos de amplio espectro.
b. AFP
La alfa-proteína fetal (AFP), también conocida como a-fetoproteína, alfa-1-fetoproteína y alfa-fetoglobulina, es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen AFP. La AFP se usa ampliamente en la práctica clínica en todo el mundo para explorar a pacientes en alto riesgo de HCC, para el diagnóstico o la monitorización de pacientes con HCC junto con ultrasonidos para detectar la recurrencia temprana, para monitorizar la respuesta a la terapia y para detectar la recaída temprana. Sin embargo, la AFP puede producirse en muchas circunstancias, incluyendo otras enfermedades hepáticas, que dan lugar a falsos positivos y no está presente en todos los pacientes con HCC. La fracción reactiva con hemaglutinina de Lens culinaris de AFP (AFP-L3) es una glucoforma fucosilada de AFP, que puede usarse como marcador para representar el grado de malignidad biológica de1HCC. También se ha aprobado un ensayo de AFP-L3 por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para el diagnóstico del HCC debido a su mayor especificidad que la AFP.
c. HPX
Hemopexina (HPX), también conocida como beta-lB-glucoproteína, está codificada por el gen HPX. HPX se expresa principalmente en el hígado y es una proteína abundante y de fase aguda en suero humano. HPX se une al grupo hemo con la mayor afinidad de cualquier proteína conocida. Su función es depurar el grupo hemo liberado o perdido por la renovación de las proteínas de hemo, tales como hemoglobina y por lo tanto, protege al organismo frente al daño oxidativo que puede causar el grupo hemo libre. Además, HPX libera su ligando unido para su internalización tras interactuar con un receptor específico situado sobre la superficie de células hepáticas. Esta función de HPX es para preservar el hierro del organismo. Esta proteína tiene cinco oligosacáridos de glucosamina que están unidos en N a la secuencia aceptora, Asn-X-Ser/Thr. HPX fucosilada (Fuc-HPX) tiene dos sitios de fucosilación centrales de HPX en suero humano, que se identificaron usando una estrategia de proteómica. La hemopexina fucosilada (Fuc-HPX) puede ser un biomarcador potencial para HCC ya que los niveles de Fuc-HPX en la fracción de suero unida a lectina de hemaglutinina de Lens culinaris mostró una buena precisión diagnóstica por HCC en un estudio usando un pequeño conjunto de muestra.
d. Glucoproteínas séricas
Los cambios en la glucosilación se han asociado con el desarrollo de cirrosis y se ha informado de HCC. La glucosilación alterada de glucoproteínas séricas, tales como cininógeno fucosilado (Fc-kin) y al-antitripsina fucosilada (F-AT), pueden ser biomarcadores potenciales cuando se usan independientemente o en combinación con otros marcadores de HCC.
7. Tratamiento de sujetos que padecen enfermedad hepática
El sujeto identificado en los métodos descritos anteriormente que tiene niveles de GP73 mayores que o iguales a los valores analizados anteriormente se identifica como un paciente que padece enfermedad hepática. Después, se trata al sujeto para la enfermedad hepática. El tratamiento de la enfermedad hepática puede incluir inhibidores de molécula pequeña de GP73 o GP73 fucosilada y anticuerpos neutralizantes anti-GP73.
a. Cirrosis hepática
El sujeto identificado en los métodos descritos anteriormente que tiene niveles de GP73 o GP73 fucosilada mayores que o iguales a los valores analizados anteriormente se identifica como un paciente que padece cirrosis hepática. Después, se trata al sujeto para la cirrosis hepática. El tratamiento puede incluir una dieta baja en sodio, medicaciones, cirugía, tales como trasplante de hígado, paracentesis con o sin una proteína (albúmina), infusión, bandeado varical endoscópico o escleroterapia, taponamiento con globo,, derivación portosistémica intrahepática transyugular (TIPS), evitar el alcohol, evitar los medicamentos sedantes, tales como pastillas para dormir, medicamentos contra la ansiedad y narcóticos y evitar los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como aspirina, ibuprofeno y naproxeno. Los ejemplos de medicaciones pueden incluir inhibidores de GP73, medicinas diuréticas, tales como espironolactona y furosemida, antibióticos, tales como ciprofloxacino, neomicina o metronidazol (Flagyl) y cefotaxima, medicinas betabloqueantes, tales como propanolol y nadolol, medicinas vasoconstrictoras, tales como octreotida, lactulosa, inmunosupresores, tales como prednisona y azatioprina, ácido ursodesoxicólico (UDCA; ursodiol (Actigall), colchicina, metotrexato, eritropoyetina y epoetina alfa (Epogen, Procrit). b. Cáncer hepático
El sujeto identificado en los métodos descritos anteriormente que tiene niveles de GP73 o GP73 fucosilada mayores que o iguales a los valores analizados anteriormente se identifica como un paciente que padece cáncer hepático. Después, se trata al sujeto para el cáncer hepático. El tratamiento puede incluir la extracción quirúrgica del cáncer (resección hepática) con o sin trasplante de hígado, quimioterapia, tal como doxorrubicina (Adriamicina), 5-fluorouracilo (5 FU), tamoxifeno (Nolvadex), Octreotida (Sandostatina), gemcitabina, cisplatino y oxaliplatino, bioterapia, tal como bevacizumab, quimioembolización (quimioembolización trans-arterial o TACE), radioembolización (radioterapia interna selectiva; "SIRT"), ablación, tal como terapia de ablación por radiofrecuencia (RFA), inyección percutánea de etanol (alcohol) y crioablación, radiocirugía estereotáctica y terapia de haz de protones. El tratamiento también puede incluir fármacos que bloquean componentes de la vía de la angiogénesis, tales como sorafenib (Nexavar). El tratamiento también puede incluir inhibidores de GP73. Los fármacos pueden suministrarse a través de la arteria hepática o la vena porta.
8. Tratamiento de sujetos que padecen cáncer
El sujeto identificado en los métodos descritos anteriormente que tiene niveles de GP73 o GP73 fucosilada mayores que o iguales a los valores analizados anteriormente se identifica como un paciente que padece cáncer. Después, se trata al sujeto para el cáncer. El tratamiento del cáncer puede incluir cirugía, quimioterapia, radioterapia, inhibidores de molécula pequeña de GP73 o GP73 fucosilada y/o inhibidores de GP73 o GP73 fucosilada.
9. Kit
En el presente documento se proporciona un kit, que puede usarse para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 o un fragmento de GP73 o de GP73 fucosilada o un fragmento de GP73 fucosilada. El kit de acuerdo con la invención comprende al menos un componente que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la primera realización de la presente invención para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada e instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada. Por ejemplo, el kit puede comprender instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada mediante inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes. Las instrucciones incluidas en los kits pueden fijarse al material de acondicionamiento o pueden incluirse como un prospecto. Aunque las instrucciones normalmente son materiales escritos o impresos, no se limitan a estos. La presente divulgación contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y de comunicárselas a un usuario final. Dichos medios incluyen, pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y simulares. Como se usa en el presente documento, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporciona las instrucciones.
El al menos un componente puede incluir al menos una composición que comprende uno o más anticuerpos aislados o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se unen específicamente a GP73 o a GP73 fucosilada. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de captura de GP73 o GP73 fucosilada y/o un anticuerpo de detección de GP73 o GP73 fucosilada en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la primera realización de la presente invención y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente respecto del al menos un anticuerpo de detección. El anticuerpo está opcionalmente marcado de manera detectable.
Como alternativa o adicionalmente, el kit puede contener un calibrador o control, por ejemplo, GP73 o GP73 fucosilada purificada y/u opcionalmente purificada y/o al menos un envase (por ejemplo, tubo, placas o tiras de microtitulación, que pueden estar ya recubiertos con un anticuerpo monoclonal anti-GP73) para llevar a cabo el ensayo y/o un tampón, tal como un tampón de ensayo o un tampón de lavado, cualquiera de los cuales puede proporcionarse como una solución concentrada, una solución de sustrato para el marcador detectable (por ejemplo, un marcador enzimático) o una solución de detención. Preferentemente, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, patrones, tampones, diluyentes, etc., que son necesarios para realizar el ensayo. Las instrucciones también pueden incluir instrucciones para generar una curva patrón.
El kit puede comprender además patrones de referencia para cuantificar GP73 o GP73 fucosilada. Los patrones de referencia pueden emplearse para establecer curvas patrón para la interpolación y/o extrapolación de concentraciones de GP73 o GP73 fucosilada. Los patrones de referencia pueden incluir un alto nivel de concentración de GP73 o GP73 fucosilada, por ejemplo, 100 ng/ml, 125 ng/ml, 150 ng/ml, 175 ng/ml, 200 ng/ml, 225 ng/ml, 250 ng/ml, 275 ng/ml o 300 ng/ml; un nivel de concentración medio de GP73, por ejemplo, 25 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 75 ng/ml o 100 ng/ml; y/o un nivel de concentración bajo de GP73, por ejemplo, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 12,5 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml o 25 ng/ml.
Cualquier anticuerpo que se proporcione en el kit, tal como anticuerpos recombinantes específicos para GP73, pueden incorporar un marcador detectable, tal como un fluoróforo, resto radiactivo, enzima, marcador de biotina/avidina, cromóforo, marcador quimioluminiscente o similares o el kit puede incluir reactivos para marcar los anticuerpos o reactivos para detectar los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de detección) y/o para marcar los analitos o reactivos para detectar el analito. Los anticuerpos, calibradores y/o controles pueden proporcionarse en envases separados o dispensados previamente en un formato de ensayo adecuado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
Opcionalmente, el kit incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en hojas de inserción para una diversidad de productos de inmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad se usan opcionalmente para establecer las características de rendimiento del ensayo, y además opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit de inmunoensayo y la normalización de los ensayos.
El kit también puede incluir opcionalmente otros reactivos necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico o facilitar evaluaciones de control de calidad, tales como tampones, sales, enzimas, cofactores enzimáticos, sustratos, reactivos de detección y similares. Otros componentes, tales como tampones y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento), también puede incluirse en el kit. El kit también puede incluir uno o más controles adicionales. Uno o más de los componentes del kit pueden liofilizarse, en cuyo caso el kit puede comprender además reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diversos componentes del kit se proporcionan opcionalmente en recipientes adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El kit puede incluir además recipientes para contener o almacenar una muestra (por ejemplo, un recipiente o cartucho para una muestra de orina, plasma o suero). Cuando sea apropiado, el kit opcionalmente también puede contener recipientes de reacción, recipientes de mezcla y otros componentes que facilitan la preparación de reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar a obtener una muestra de prueba, tales como una jeringuilla, pipeta, fórceps, cuchara con medida o similares.
Si el marcador detectable es al menos un compuesto de acridinio, el kit puede comprender al menos una acridinio-9-carboxamida, al menos un éster arílico de acridinio-9-carboxilato, o cualquier combinación de los mismos. Si el marcador detectable es al menos un compuesto de acridinio, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tales como un tampón, solución, y/o al menos una solución básica. Si se desea, el kit puede contener una fase sólida, tales como una partícula magnética, perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación, cubeta, membrana, molécula de andamio, película, papel de filtro, disco o chip.
Si se desea, el kit puede comprender además uno o más componentes, solos o en combinación adicional con instrucciones, para ensayar la muestra de ensayo para otro analito, que puede ser un biomarcador, tal como un biomarcador de enfermedad o trastorno hepático.
a. Adaptación del kit y el método
El kit (o los componentes del mismo), así como el método para determinar la concentración de GP73 o GP73 fucosilada en una muestra de ensayo mediante un inmunoensayo como se describe en el presente documento, puede adaptarse para su uso en una diversidad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en donde la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.089.424 y 5.006.309 y como se distribuye comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ArCHITECT®.
Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semiautomatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el sustrato al que se une el primer compañero de unión específica (por ejemplo, analito, anticuerpo o anticuerpo de captura) (que puede afectar a la formación del sándwich y la reactividad del analito) y la duración y el tiempo de la captura, la detección y/o cualquier etapa de lavado opcional. Aunque un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente más prolongado con la muestra y el reactivo de captura (por ejemplo, 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, 18 minutos para ARCHITECT®). De forma similar, aunque un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, 4 minutos para el ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero sin limitación, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.294.404), PRISM®, EIA (perla) y Quantum™ II, así como otras plataformas. Adicionalmente, los ensayos, Los kits y los componentes del kit pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas electroquímicos u otros sistemas de ensayo portátiles o de punto de atención. La presente divulgación es, por ejemplo, aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímico Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) que lleva a cabo inmunoensayos en sándwich. Se describen los inmunosensores y sus métodos de fabricación y operación en dispositivos de ensayo de un solo uso, por ejemplo en, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.063.081, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/0170881, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2004/0018577, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2005/0054078 y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2006/0160164.
En particular, con respecto a la adaptación de un ensayo al sistema I-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Un chip de silicio microfabricado se fabrica con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. En uno de los electrodos de trabajo, las perlas de poliestireno (0,2 mm de diámetro) con anticuerpo de captura inmovilizado se adhieren a un recubrimiento de polímero de alcohol polivinílico estampado sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho I-STAT® con un formato de fluidos adecuado para inmunoensayo. En una parte de la pared de la cámara de retención de muestras del cartucho hay una capa que comprende el anticuerpo de detección marcado con fosfatasa alcalina (u otro marcador). Dentro de la bolsa de fluido del cartucho hay un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
En la operación, se añade una muestra sospechosa de contener GP73 o GP73 fucosilada a la cámara de retención del cartucho de ensayo y se inserta el cartucho en el lector del I-STAT®. Después de haberse disuelto el segundo anticuerpo (anticuerpo de detección) en la muestra, un elemento de bomba en el cartucho fuerza a la muestra al interior del conducto que contiene el chip. Aquí se oscila para promover la formación del sándwich entre el primer anticuerpo de captura, GP73 o GP73 fucosilada y el segundo anticuerpo de detección marcado. En la penúltima etapa del ensayo, el fluido se expulsa de la bolsa y se introduce en el conducto para lavar la muestra del chip y colocarla en una cámara de desechos. En la etapa final del ensayo, el marcador fosfatasa alcalina reacciona con fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado se oxide electroquímicamente en el electrodo de trabajo. Basado en la corriente medida, el lector es capaz de calcular la cantidad de analito de GP73 o GP73 fucosilada en la muestra mediante un algoritmo incluido y una curva de calibración determinada de fábrica.
Los métodos y los kits como se describen en el presente documento abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para llevar a cabo el inmunoensayo. Por ejemplo, se incluyen diversos tampones tales como los conocidos en la técnica y/o que pueden prepararse u optimizarse fácilmente para ser empleados, por ejemplo, para lavar, como diluyente conjugado, y/o como diluyente calibrador. Un diluyente conjugado ejemplar es el diluyente conjugado ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y que contiene ácido 2-(N morfolino)etanosulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteínas, un agente antimicrobiano y un detergente. Un diluyente de calibrador ejemplar es el diluyente de calibrador humano ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que comprende un tampón que contiene MES, otra sal, un bloqueador de proteínas y un agente antimicrobiano. Adicionalmente, puede obtenerse una generación de señal mejorada, por ejemplo, en formato de cartucho I-STAT®, usando una secuencia de ácido nucleico unida al anticuerpo señal como un amplificador de señal.
Aunque ciertas realizaciones en el presente documento son ventajosas cuando se emplean para evaluar enfermedades, tal como enfermedad o cáncer hepático, los ensayos y kits también pueden emplearse opcionalmente para evaluar GP73 en otras enfermedades, trastornos y afecciones, según sea adecuado.
El método de ensayo también puede usarse para identificar un compuesto que mejora enfermedades, tales como enfermedad hepática o cáncer. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una célula que expresa GP73 con un compuesto candidato. El nivel de expresión de GP73 o GP73 fucosilada en la celda que se pone en contacto con el compuesto puede compararse con aquel en una celda de control usando el método de ensayo descrito en el presente documento.
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.
10. Ejemplos
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Expresión génica de GP73 humana
La proteína GP73 humana (también conocida como GOLM1, GOLPH2) es una proteína integral de 400 aminoácidos (45,2 kDa) de la membrana cis del Golgi. La GP73 humana (aminoácidos 63 a 400 basándose en la secuencia de GenBank AAF44663.1 (SEQ ID NO: 97) se sintetizó y clonó en un vector pET (Novagen) para su expresión. Se fusionó un marcador de 6xHis al extremo C-terminal para la purificación. El plásmido final pET-GP73 (SEQ ID NO: 98, véase la figura 1) se transformó en células BL21(DE3) y se indujo mediante IPTG 1 mM a 30 °C durante 4 horas. Las células de E. coli inducidas se centrifugaron durante 20 min a 3.900 rpm y se lavaron una vez con PBS. El sedimento celular lavado se resuspendió con 5 ml de reactivo de extracción de proteína BugBuster® (Novagen) por gramo de sedimento celular. Las suspensiones celulares se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se purificó usando cromatografía en columna de afinidad de níquel según las instrucciones del fabricante (Novagen).
Además, el sedimento celular lavado se disolvió en tampón de unión His-bind 1x (Novagen) con inhibidores de proteasa (Sigma) y se sonicaron en un baño de hielo durante 5x10 segundos de pulso con 30 segundos de reposo entre pulsos. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se purificó usando cromatografía en columna de afinidad de níquel según las instrucciones del fabricante (Novagen).
La GP73 humana (aminoácidos 63 a 400) también se clonó en el vector pFuse-hIgG1-Fc (InvivoGen). Se fusionó una región Fc humana al extremo C-terminal para generar GP73-hFc (GP73 ligada al fragmento de la región cristalina de IgG humana; SEQ ID NO: 99, véase la figura 2). El ADN plasmídico final pFuse-GP73-Fc se transfectó con polietilenimina lineal (PEI, PM 25 kDa) (Polysciences, Inc.) en células HEK293F, CHO o HepG2. Después de 5 días de cultivo, se recogió el sobrenadante por centrifugación a 1.000 rpm durante 20 min y fue seguido de filtración (filtro de 0,2 micrómetros). El sobrenadante recogido se purificó mediante cromatografía en columna de proteína G según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare).
Ejemplo 2
Inmunizaciones en animales
Se inmunizó dos veces a ratones CAF1/J y RBF/DnJ hembra (ambos de The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine), cada siete semanas, con 20 pg de GP73-hFc purificado (descrito en el ejemplo 1) emulsionado en adyuvante de Freund Adjulite completo o incompleto (Pacific Immunology, Ramona, CA). El adyuvante completo de Freund se usó para la inmunización primaria y para la segunda inmunización se usó adyuvante incompleto de Freund. Cada inóculo se preparó diluyendo en primer lugar GP73-hFc a la concentración adecuada en suero salino estéril (cloruro de sodio al 0,9 %, Abbott Laboratories), añadiendo un volumen igual de adyuvante y después, mezclando haciendo pasar a través de dos jeringas a través de una llave de cierre de 3 vías hasta que se formó una emulsión espesa y estable. Las muestras de suero se tomaron 10-14 días después de la segunda inmunización. En los días cuarto y tercero antes de la recogida de linfocitos B, se administraron a un ratón RBF/DnJ 35 pg de GP73-hFc diluido en suero salino estéril. Este inóculo se suministró en la cavidad corporal cerca del bazo. En el tercer día antes de la recogida de linfocitos B, se administraron a un ratón CAF1/J 50 pg de GP73-hFc diluido en suero salino estéril. Este inóculo también se suministró en la cavidad corporal cerca del bazo.
Ejemplo 3
Exploración de sueros de ratón respecto de su reactividad con el antígeno
Las muestras de suero se ensayaron en un inmunoensayo enzimático de microtitulación de 96 pocillos (EIA) respecto de la reactividad de GP73-hFc en fase de solución. Las placas de ensayo (NUNC Corporation, Naperville, IL) se recubrieron con 100 pl/pocillo de anticuerpo de oveja específico para Fc de IgG anti-ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido a 2 |jg/ml en suero salino tamponado con fosfato (PBS, Abbott Laboratories). Las placas se incubaron durante una noche, se retiró el anticuerpo de captura y se añadieron 200 jl/pocillo de solución de bloqueo (seroalbúmina bovina (BSA) al 3 % p/v [peso/volumen] y polisorbato-20 al 0,5 % v/v [volumen/volumen] diluido en PBS (todos de Abbott Laboratories)). Las placas se incubaron durante 30 min y después se lavaron con agua destilada (dH2O, Abbott Laboratories). Se añadieron diluciones seriadas (en solución de bloqueo) de los sueros de ratón o de un control positivo a las placas de ensayo (100 jl/pocillo), se incubaron durante 60 min y después se lavaron con dH2O. Se añadieron 100 jl/pocillo de solución en suero normal (NSS; solución de bloqueo que contiene suero de ratón normal al 2 % v/v) para el bloqueo adicional. Esta solución ayuda a prevenir la unión no específica en las placas de ensayo. Las placas se incubaron durante 30 min y después se lavaron con dH2O. Posteriormente, se añadieron 100 jl/pocillo de una solución de 500 ng/ml de GP73-hFc a los pocillos de ensayo para una incubación breve, tras lo cual se lavaron las placas con dH2O. Se añadió anticuerpo de conejo anti-GP73 (Universidad de Drexel) diluido a 500 ng/ml en NSS a todos los pocillos de ensayo (100 jl/pocillo), que se incubaron durante 30 min y después se lavaron con dH2O. A continuación, se añadieron 100 j l de anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) diluido a 200 ng/ml en NSS, se dejó incubar durante 30 min y después se lavaron las placas, como cromágeno se usó sustrato de ofenilendiamina (OPD) (Abbott Laboratories) para generar la señal y la reacción se inactivó usando ácido sulfúrico 1 N (Abbott Laboratories). La señal se leyó a una longitud de onda de 492 nm.
Ejemplo 4
Exploración de sueros de ratón respecto de su afinidad relativa
Se evaluó la reactividad de las muestras respecto de las concentraciones de antígeno para determinar la afinidad relativa de cada muestra de suero para el antígeno de GP73-hFc. El formato de ensayo fue idéntico al descrito anteriormente, excepto que en lugar de preparar diluciones seriadas de muestras de ensayo de suero de ratón, cada muestra se preparó a una sola dilución, en bloque. Adicionalmente, el antígeno GP73-hFc se ensayó a diversas concentraciones, comenzando con 2000 ng/ml en NSS, seguido de diez diluciones de log 3, también en NSS. Las curvas de unión se generaron y usaron para determinar la afinidad relativa. Basándose en estos resultados, se seleccionaron un ratón CAF1/J ("ratón n.° 458") y un ratón RBF/DnJ ("ratón n.° 501") para la fusión con linfocitos B.
Ejemplo 5
Fusión de esplenocitos de ratón
En el día de la fusión, se sacrificó a los ratones y se recogieron sus bazos que contenían esplenocitos anti-GP73 y se colocaron en medio libre de suero de hibridoma (HSFM) suplementado con Pen Strep (Invitrogen Corporation). Se llevó a cabo una fusión celular como se describe por Kohler y Milstein (Nature (1975) 256:495-7). Cada bazo de ratón se colocó en una placa de Petri separada que contenía HSFM. Los esplenocitos se perfundieron de cada bazo usando una jeringa que contenía HSFM y un raspador de células, y después se contaron usando un hemocitómetro. Se aislaron 3,9 x 107 esplenocitos del ratón n.° 458 en un tubo de centrifugadora de 50 ml para la fusión 1A y se aislaron 3,8 x 107 esplenocitos del ratón n.° 501 en un tubo de centrifugadora de 50 ml para la fusión IB. Los esplenocitos de cada ratón se lavaron mediante centrifugación en un sedimento celular y se resuspendieron en HSFM. Estos esplenocitos se mezclaron con un número igual de células de mieloma NS/0 (American Type Culture Collection) y se centrifugaron hasta dar un sedimento. La fusión se logró exponiendo los esplenocitos y las células NS/0 a polietilenglicol al 50 % (PEG) (PM 1300-1600) en HSFM. Se añadió un ml de la solución de PEG a cada sedimento celular durante 30 segundos, seguido de un minuto adicional de incubación. El PEG y el sedimento celular se diluyeron añadiendo lentamente 30 ml de HSFM durante 30 segundos. Las células fusionadas se retiraron posteriormente de la suspensión mediante centrifugado y decantado del sobrenadante. El sedimento celular de cada fusión se resuspendió en 300 ml de HSFM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Hyclone Laboratories), HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Sigma Laboratories), suplemento HT (Invitrogen Corporation), Condimento BM HI (Roche Applied Science), colesterol y L-glutamina (Invitrogen Corporation) para seleccionar los hibridomas. Las células fusionadas se sembraron en matraces de cultivo T162 a una densidad aproximada de 2,5 x 105 células/ml y se cultivaron en bruto durante 48 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de 48 horas de selección con HAT, se centrifugó el cultivo en bruto y se resuspendió el sedimento en medio de cultivo tisular semisólido. El medio de cultivo tisular semisólido consistía en una mezcla al 50 % de 2X IMDM (Invitrogen) con CloneMatrix (Molecular Devices) complementado con FBS al 10 %, suplemento HT, Penn/Strep, L-glutamina y una solución de 5 jg/ml de CloneDetect (Molecular Devices). Se dejaron incubar las placas de cultivo semisólidas para incubar durante 7-10 días antes de la selección de colonias en el ClonepixFL (Molecular Devices). Una colonia cultivada en el medio semisólido se consideró un clon debido a que no se permitió que la célula individual que lo inició se moviese y mezclase con otras células durante el crecimiento. Todas las líneas celulares de interés se subclonaron para asegurar la clonalidad. Una reacción de inmunoprecipitación se produce entre el anticuerpo que se está produciendo por la colonia y el anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de ratón-FITC que fluoresce. Cuanto más brillante sea la señal de fluorescencia observada, más cantidad de anticuerpo se producirá. Las colonias se analizaron respecto de su fluorescencia en el dispositivo ClonepixFL y aquellas con la señal fluorescente más brillante se seleccionaron para su transferencia automatizada a placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían HSFM con FBS al 10 % y L-glutamina. Las placas de cultivo tisular de 96 pocillos se dejaron crecer durante 3 a 5 días a 37 °C antes de la exploración de sobrenadantes para la producción de anticuerpos.
Ejemplo 6
Exploración y selección de hibridomas
Las muestras de sobrenadante celular se analizaron respecto de la producción de anticuerpos anti-GP73 mediante EIA. El anticuerpo de oveja anti-Fc de IgG de ratón (Jackson Immunoresearch) se recubrió sobre placas de EIA de microtitulación de 96 pocillos a razón de 1 pg/ml. Después de recubrir el anticuerpo de captura sobre la fase sólida, se retiró y se bloquearon las placas usando una solución de bloqueo de BSA/PBS. Los pocillos se lavaron con agua destilada y se añadieron los sobrenadantes celulares a las placas bloqueadas y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante al menos una hora. Como control positivo se usó un anticuerpo monoclonal de ratón, 14H4-23 (Universidad de Drexel). El anticuerpo anti-Fc de IgG de ratón capturó el anticuerpo de ratón anti-GP73 del sobrenadante. Después de la incubación, los sobrenadantes se lavaron usando agua destilada. Se añadió un anticuerpo quimérico de ratón-humano irrelevante a todos los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min para bloquear cualquier anticuerpo de ratón capturado que reaccionase con la proteína de fusión de Fc de IgG humana ligada al antígeno de GP73. Los pocillos se lavaron con agua destilada y se añadió GP73-hFc a las placas a 200 ng/ml y se incubaron durante 30 min. Después de esta incubación, se lavó el antígeno de las placas usando agua destilada. Se añadió anticuerpo de cabra anti-GP73 marcado con biotina a las placas a 200 ng/ml y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadió estreptavidina-HRPO (Jackson Immunoresearch) (diluido a 200 ng/ml) a las placas y se dejaron incubar durante 30 min. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato de OPD como cromágeno para generar la señal. Las placas se leyeron a 492 nm y se analizaron los resultados. Los híbridos se consideraron positivos en caso de que tuviesen una señal de EIA al menos 3 veces mayor que el fondo. Véase la tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000067_0002
Los clones positivos se expandieron a placas de 24 pocillos en IMDM suplementado con FBS al 10 % y suplemento HT. Después de 5-14 días de crecimiento, los cultivos de 24 pocillos se evaluaron mediante EIA del mismo modo descrito anteriormente, excepto por que las muestras de sobrenadante se titularon frente a GP73-hFc y BSA para eliminar las moléculas de unión a proteínas no específicas. Nuevamente, los clones que generaron una señal al menos 3 veces mayor que el fondo se consideraron positivos y se seleccionaron para su evaluación adicional. Véase la tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000067_0001
Después, se evaluaron los cultivos de 24 pocillos mediante EIA respecto de su capacidad para formar un sándwich con el anti-GP73 de conejo usado como reactivo de captura recubierto directamente sobre la fase sólida. Se usó el mismo protocolo de EIA descrito anteriormente, salvo por que el anticuerpo de conejo anti-GP73 se recubrió a 1 pg/ml, el GP73-hFc se ensayó a 200 ng/ml y se usó un anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de ratón marcado con HRP como reactivo conjugado para generar la señal. Véase la tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000068_0001
Los clones que se identificaron como positivos en el estadio de 24 pocilios se expandieron para criopreservación, seguido de generación de sobrenadante de alta densidad. Los sobrenadantes de estos clones se ensayaron respecto del isotipo de anticuerpo usando un kit de clonotipado de Southern Biotech en un formato de EIA. Véase la tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000068_0002
En las tablas 3-6 anteriores, solo el clon 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
Ejemplo 7
Aumento de la escala de hibridoma, purificación de anticuerpos y mareaje de anticuerpos
Las líneas celulares se expandieron en IMDM (Invitrogen Corporation) suplementado con L-glutamina y FBS ultra bajo en IgG al 10 % (Invitrogen Corporation) y se sembraron en botellas rotativas a razón de 0,5 x 105 células/ml. Los cultivos se incubaron a 37 °C mientras se rotaban a 1 revolución por minuto durante 10-14 días o hasta que se obtuvo un cultivo terminal final. El sobrenadante de la botella rotativa terminal se recogió y clarificó con un filtro de 0. 45 micrómetros. El sobrenadante clarificado se diluyó con un volumen igual de tampón de glicina 1,5 M/NaCl 3 N a pH 8,9 (Abbott Laboratories), después se cargó en una columna de proteína A de 5 ml usando el sistema de purificación automatizada AKTA (Amersham/Pharmacia/GE). Después, se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de unión y cuando se logró una línea de base estable, se eluyó el mAb con un tampón citrato a pH 3,0 (Abbott Laboratories). El mAb se transfirió posteriormente a una columna de desalado para un intercambio en PBS y después se dializó adicionalmente en PBS usando una membrana de diálisis con un corte de peso molecular de 10.000 (Pierce Chemical). Los anticuerpos purificados se marcaron con biotina para su uso como reactivos de exploración secundarios. Se añadió Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) al anticuerpo purificado en un exceso molar de 20 veces y se dejó incubar durante 30 min. La biotina no unida se retiró mediante diálisis en PBS y se ensayaron los mAb mediante EIA para confirmar que estaban marcados con éxito.
Ejemplo 8
Caracterización del anticuerpo purificado
1. Sensibilidad a fucosa - Ensayo de inhibición competitiva con lectina de Aleurina aurantia (AAL)
Los mAb anti-GP73 marcados con biotina se ensayaron para determinar si eran sensibles a la presencia de fucosa sobre el antígeno de GP73-hFc mediante EIA. La lectina de Aleuria aurantia (AAL) (Vector Laboratories) se une a fucosa con un alto grado de especificidad. El anticuerpo de burro anti-Fc de IgG humana (Jackson Immunoresearch) que se pretrató con peryodato para oxidar cualquier sitio de glucosilación/fucosilación se recubrió sobre placas de EIA de microtitulación de 96 pocillos a 1 pg/ml. El tratamiento con peryodato se efectuó para prevenir la unión no específica de AAL al reactivo de captura. Después de recubrir el anticuerpo de captura sobre la fase sólida, se retiró el reactivo de captura y se bloquearon las placas durante 30 min usando tampón de bloqueo Protein-Free T20 (TBS) (Thermo Scientific). Los pocillos se lavaron con agua destilada y se añadieron 200 ng/ml de solución de antígeno GP73-hFc a las placas bloqueadas y se dejó incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 min. El anticuerpo anti-Fc de IgG humana captura la proteína de fusión de IgG humana sobre el antígeno GP73. Los pocilios se lavaron con agua destilada y se añadió a Al a los pocillos en diluciones seriadas de 0-200 ng/ml y se incubaron durante al menos 30 min. Después de esta incubación, se lavó el antígeno de las placas usando agua destilada. Los mAb anti-GP73 marcados con biotina se añadieron a las placas a concentraciones predeterminadas para cada mAb en el intervalo de 50 a 2000 ng/ml y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Se usó AAL marcado con biotina como control positivo para el ensayo y se usó un mAb irrelevante marcado con biotina como control negativo. Las placas se lavaron y se añadió estreptavidina-HRPO (diluido a 200 ng/ml) a las placas y se dejaron incubar durante 30 min. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato de OPD como cromágeno para generar la señal. Las placas se leyeron a 492 nm y se analizaron los resultados. Véase la figura 3. Como se muestra en la figura 3, los mAb anti-GP73 1A-3187 y 1B-4863 demuestran cierta inhibición competitiva frente a AAL libre a las mayores concentraciones evaluadas en este ensayo. Todos los demás mAb marcados con biotina no muestran inhibición, incluso a 200 ng/ml.
2. Reactividad con IgG, GP73 y GP73-hFc
Los mAb anti-GP73 purificados se ensayaron respecto de su reactividad en EIA frente a IgG humana, GP73 producida en E. coli, y GP73-hFc producida en células HEK 293. Un anticuerpo quimérico de ratón-humano, GP73 producida en E. coli y GP73-hFc producida en células HEK 293 se recubrieron sobre placas de microtitulación a 1000 ng/ml y se dejaron incubar durante una noche a 4-8 °C. Después de recubrir el anticuerpo de captura sobre la fase sólida, se retiró y se bloqueó usando una solución de bloqueo de BSA/PBS. Los pocillos se lavaron con agua destilada. Los mAb anti-GP73 y de control negativo purificados se añadieron a las placas bloqueadas en diluciones seriadas que partieron a 1000 ng/ml y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Los pocillos se lavaron con agua destilada. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Jackson Immunoresearch) a los pocillos a 250 ng/ml y se dejó incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato OPD como cromágeno para generar la señal. Las placas se leyeron a 492 nm y se analizaron los resultados. Véase la figura 4. Como se muestra en la figura 4, ninguno de los mAb ensayados reaccionan con la IgGFc humana o el quimérico de ratón-humano y todos los mAb ensayados demuestran reactividad con GP73-hFc. Los anticuerpos 1A-3187 y 1A-4246 no muestran reactividad con la GP73 producida en E. coli sin la proteína de fusión de Fc de IgG, lo que sugiere que esta era estructuralmente diferente a la de GP73-hFc, posiblemente debido a la falta de glucosilación del organismo de producción, E. coli.
3. Sensibilidad a la fucosa - Inhibición de fucosa libre
Los mAb anti-GP73 marcados con biotina se ensayaron para determinar si eran sensibles a la presencia de fucosa sobre el antígeno de GP73-hFc mediante EIA. La lectina de Aleuria aurantia (AAL) (Vector Laboratories) se une a fucosa con un alto grado de especificidad. El anticuerpo de burro anti-Fc de IgG humana (Jackson Immunoresearch) se recubrió sobre placas de EIA de microtitulación de 96 pocillos a razón de 1 pg/ml. Después de recubrir el anticuerpo de captura sobre la fase sólida, se retiró el reactivo de captura y se bloquearon las placas durante 30 min usando tampón de bloqueo Protein-Free T20 (TBS) (Thermo Scientific). Los pocillos se lavaron con agua destilada. Se añadió una solución a 200 ng/ml de antígeno GP73-hFc a las placas bloqueadas y se dejó incubar a temperatura ambiente durante al menos 45 min y después se lavó con agua destilada. Se añadió fucosa a los pocillos de una placa de microtitulación no absorbente separada en diluciones seriadas partiendo de 1000 pg/ml. Los mAb anti-GP73 marcados con biotina se añadieron a las placas a concentraciones predeterminadas para cada mAb en el intervalo de 50 a 2000 ng/ml y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente. La mezcla se añadió a las placas de microtitulación con la GP73-hFc capturada y se dejó incubar durante 15-20 min a temperatura ambiente. Se usó AAL marcado con biotina como control positivo para el ensayo y se usó un mAb irrelevante marcado con biotina como control negativo. Se lavaron las placas. Se añadió estreptavidina-HRPO (diluido a 200 ng/ml) a las placas y se dejaron incubar durante 30 min. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato de OPD como cromágeno para generar la señal. Las placas se leyeron a 492 nm y se analizaron los resultados. Véase la figura 5. La figura 5 indica que la unión de AAL marcada con biotina se inhibió por fucosa libre, pero ninguno de los mAb anti-GP73 marcados con biotina demostró inhibición alguna de AAL libre. Estos resultados indican que ninguno de los mAb para GP73 se unen específicamente a fucosa sola en solución.
4. Reactividad con GP73-hFc tratada y no tratada con peryodato
Los mAb marcados con biotina se evaluaron adicionalmente para comparar su reactividad con el antígeno GP73-hFc tratado y no tratado con peryodato. El tratamiento con peryodato debería oxidar los sitios de glucosilación/fucosilación sobre el antígeno, de tal forma que un anticuerpo reactivo con fucosa no debe ser tan reactivo con el material tratado con peryodato. El anticuerpo de burro anti-Fc de IgG humana (Jackson Immunoresearch) que se pretrató con peryodato para oxidar cualquier sitio de glucosilación/fucosilación se recubrió sobre placas de EIA de microtitulación de 96 pocillos a 1 pg/ml. El tratamiento con peryodato se efectuó para prevenir la unión no específica de anticuerpos reactivos con fucosa con el reactivo de captura. Después de recubrir el anticuerpo de captura sobre la fase sólida, se retiró y se bloquearon las placas durante 30 min a temperatura ambiente usando tampón de bloqueo Protein-Free T20 (TBS) (Thermo Scientific). Los pocillos se lavaron con agua destilada. Se añadieron diluciones seriadas de antígeno GP73-hFc tratado con peryodato y no tratado con peryodato, partiendo a 100 ng/ml a las placas bloqueadas y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Se lavaron las placas. Se añadió estreptavidina-HRPO (diluido a 200 ng/ml) a las placas y se dejó incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato OPD como cromágeno para generar la señal. Como se muestra en las figuras 6-11, los anticuerpos 1A-3187, 1B-4863 y 1B-4971 mostraron unión reducida a GP73-hFc tratado con peryodato, en comparación con el material no tratado con peryodato.
5. Pares de unión
Los mAb anti-GP73 purificados se ensayaron respecto de su capacidad para formar pares de unión con el antígeno GP73-hFc mediante EIA. Los anticuerpos anti-GP73 producidos se recubrieron sobre placas de microtitulación a 1000 ng/ml y se dejaron incubar durante una noche a 4-8 °C. Después de recubrir el reactivo de captura sobre la fase sólida, se bloquearon las placas usando una solución de bloqueo de BSA/PBS. Los pocillos se lavaron con agua destilada y se añadió GP73-hFc purificado a las placas bloqueadas en diluciones seriadas de 0-100 ng/ml diluido en bloqueo de BSA y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Los pocillos se lavaron con agua destilada y se añadieron a las placas mAb anti-GP73 marcados con biotina a concentraciones predeterminadas para cada mAb en el intervalo de 50 a 5000 ng/ml y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron las placas. Se añadió estreptavidina-HRPO (diluido a 200 ng/ml) a las placas y se dejó incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con agua destilada y se usó sustrato OPD como cromágeno para generar la señal. Las placas se leyeron a 492 nm y se analizaron los resultados. La tabla 7 resume la señal del ensayo para cada combinación de par de anticuerpos, lo que indica si cada par de unión era capaz o no de formar un sándwich. Estos anticuerpos se agruparon en 6 epítopos diferentes, basándose en su patrón de formación de sándwiches. Los anticuerpos que no forman un sándwich o que formaron un sándwich débil, se asignaron al mismo grupo de epítopo. Se asumió que los anticuerpos que se unen al mismo epítopo o uno similar no podían formar un sándwich junto con GP73 debido a que competían por el mismo sitio de unión. Hubo excepciones a esto para casos como el anticuerpo 1B-4863, que fue capaz de formar un sándwich con todos los anticuerpos, incluyendo su propia versión marcada con biotina. Debido a que había dos moléculas de GP73 unidas a un Fc de IgG humana, fue posible que un anticuerpo formase un sándwich consigo mismo, pero para la mayoría de estos mAb, la unión del primer anticuerpo parecía bloquear el segundo epítopo presente en la misma molécula de GP73-hFc y prevenir la unión de otro anticuerpo dirigido contra el mismo epítopo.
Tabla 7
CD CD > CD > CD
dhOo do do -0k0
O) 40^ h4O
O^) C-vDi 0 z
-v0| O CO) 0 Recubierto CiD i C1D i CiD i CiD i CiD i C1D i C1D 1
1B-3246 0,47 3,20 2,52 3,04 3,06 2,94 0,06
1B-3440 3,12 0,42 3,10 3,45 3,47 3,09 0,07
1A-4246 3,32 3,68 0,10 4,65 4,08 3,50 0,08
1B-4971 1,78 1,62 1,18 0,63 1,57 1,42 0,06
1A-3187 1,03 0,85 0,52 0,86 0,29 1,08 0,06
1B-4863 2,61 2,85 2,52 3,27 2,90 2,41 0,06
NC
Figure imgf000070_0007
0,05
Figure imgf000070_0002
0,05
Figure imgf000070_0003
0,05
Figure imgf000070_0006
0,06
Figure imgf000070_0004
0,09
Figure imgf000070_0001
0,05
Figure imgf000070_0005
0,06
De los anticuerpos en la tabla 7 anterior, solo 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
6. Análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-GP73
GP73-hFc expresada en células de mamífero (HEK y CHO) o GP73 expresada en E. coli, como se describió anteriormente, se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 4-20 %. Las proteínas GP73 se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 100 voltios durante 1-2 horas en un tampón de transferencia convencional (Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20 %, pH 8,3). La membrana de nitrocelulosa se bloqueó con tampón de PBS que contenía leche deshidratada sin grasa al 5 % y Tween 20 al 0,05 % durante 1 h. La membrana de nitrocelulosa se incubó con una cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-GP73 en 10 ml de leche deshidratada sin grasa al 2,5 % y tampón de PBS con Tween 20 al 0,05 %, pH 7,2. Las membranas de nitrocelulosa se lavaron con Tween 20 al 0,05 %/PBS, pH 7,2, se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron con Tween 20 al 0,05 %/tampón de PBS. El anticuerpo unido a la proteína GP73 se visualizó mediante la adición de 3,3'-diaminobencidina potenciada con metal recién preparada en tampón de peróxido estable (Pierce, IL). Véase la tabla 8.
Tabla 8
Figure imgf000071_0001
De los anticuerpos en la tabla 8 anterior, solo 1B-4971 está abarcado por la presente invención
En las tablas 9 y 10 se muestra un resumen de la caracterización del anticuerpo.
Tabla 9
Figure imgf000071_0003
Tabla 10
Figure imgf000071_0002
De los anticuerpos en las tablas 9-10 anteriores, solo 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
Ejemplo 9
Secuenciación génica del anticuerpo monoclonal anti-GP73
El ARNm se extrajo de cultivos de células de hibridoma adecuados usando reactivos comercialmente disponibles (kit para ARNm directo Oligotex, Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se generó el ADNc de cadena pesada y cadena ligera kappa a partir del ARNm extraído usando Superscript II (Life Technologies) y cebadores oligo dT (Novagen) siguiendo protocolos convencionales. Los amplicones se clonaron en un vector disponible comercialmente (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y se transformaron en E. coli. El análisis de secuencia usando cebadores directos e inversos M13 se llevó a cabo usando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) en plásmidos aislados de múltiples colonias de E. coli transformadas para identificar las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera. Véanse las tablas 1 y 2. Las figuras 12-17 muestran un diagrama y la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de las regiones variables pesadas y ligeras con las secuencias de CDR identificadas.
La secuencia ligera variable (VL) de 1A-3187 usa un segmento V del subgrupo IGKV21. Las secuencias de VL de 1A-4246 y 1B-3440 usan un segmento V del subgrupo IGKV4/5. La secuencia VL de 1B-4863 usa un segmento V del subgrupo IGKV19/28. La secuencia VL de 1B-3246 usa un segmento V del subgrupo IGKV24/25. La secuencia VL de 1B-4971 usa un segmento V del subgrupo IGKV2.
La secuencia pesada variable (VH) de 1A-3187 usa un segmento V de la familia VH1 de Igh-VJ558. El primer aminoácido después de la CDR-H2 varía respecto de las secuencias típicas de anticuerpo cerca de las CDR que tienen una T en lugar de K/R. La secuencia de VH de IB-4971 también usa un segmento V de la familia VH1 de Igh-VJ558. La secuencia de VH de 1B-3440 usa un segmento V de la familia VH10 de IgH-V10. La secuencia VH de 1B-4863 usa un segmento V de la familia VH2 de Igh-VQ52. Las secuencias de VH de 1A-4246 y 1B-3246 usan un segmento V de la familia VH5 de Igh-V7183.
Ejemplo 10
Mapeo de epítopos de GP73 con mAb anti-GP73
El mapeo de epítopos de GP73 con el mAb anti-GP73 se completó usando escisión de epítopos seguida de un método de CL/Em /Em . Las muestras usadas fueron antígeno de GP73-hFc y mAb anti-GP73
1. Inmovilización de mAb anti-GP73 a la resina de sefarosa activada con CNBr: Se pesaron 20 mg de resina de sefarosa activada con CNBr en una columna de reacción compacta con frita. La resina se lavó tres veces con 200 |jl de HCl 1 mM. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 500 mM. Se añadió a la columna mAb anti-GP73. La columna de reacción se colocó en un rotador a temperatura ambiente durante 4 horas. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 500 mM. Se añadieron a la columna 200 j l de tampón de Tris-HCl 100 mM a pH 8/NaCl 500 mM y se rotó la columna a temperatura ambiente durante 1 hora. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de acetato de sodio 100 mM a pH 4/NaCl 500 mM y Tris-HCl 100 mM a pH 8/tampón de NaCl 500 mM. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 100 mM. Se añadieron 200 j l de tampón de NaHCO3100 mM a pH 8/NaCl 100 mM y se fijó la tapa superior sobre la columna.
2. Unión a antígeno: La columna de reacción se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3100 mM a pH 8/NaCl 500 mM. Se transfirieron 50 j l de resina de anticuerpo preparada en la etapa 1 a la nueva columna de reacción. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 100 mM. Se añadió a la columna muestra de antígeno GP73-hFc. La columna de reacción se colocó en un rotador a temperatura ambiente durante 4 horas. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3100 mM a pH 8/NaCl 100 mM.
3. Proteólisis: Se añadieron 200 j l de tampón de NaHCO3100 mM a pH 8/NaCl 100 mM a la columna. Se añadió tripsina a la columna y se colocó la columna de reacción sobre un rotador a temperatura ambiente durante una noche.
4. Elución: La solución se descargó y se recogió como una fracción de flujo pasante. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 100 mM dos veces. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 500 mM. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de NaHCO3 100 mM a pH 8/NaCl 100 mM. Se añadieron 200 j l de ácido fórmico al 2 % para la elución. La fracción eluida y otras fracciones se secaron con un dispositivo Vacufuge de Eppendorf.
5. Desalado con C18 ziptip de las muestras antes de la inyección en CL/EM/EM: Las fracciones eluidas se reconstituyeron en 10 j l de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. Se humedeció la C18 ziptip tres veces con ACN al 50 %/H2O. Se humedeció la C18 ziptip tres veces con TFA al 0,1 %. Las muestras se aspiraron y dispensaron 15 veces para su unión. La punta se lavó 7 veces con TFA al 0,1 %. Las muestras se eluyeron con 10 j l de ACN al 50%/H2O, TFA al 0,1 %.
6. La fracción eluida se analizó mediante CL/EM/EM usando el instrumento de EM AB Sciex Q-Star Elite acoplado a una HPLC Agilent 1200. Véanse la tabla 11 y la figura 18.
De los anticuerpos en la tabla 11 a continuación, solo 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
Tabla 11
Figure imgf000072_0001
continuación
Figure imgf000073_0001
Ejemplo 11
Cinética de unión del mAb para GP73
Las afinidades/cinéticas de los anticuerpos monoclonales anti-GP73 humana 1A-3187, 1A-4246, 1B-3246, 1B-3440, 1B-4863 y 1B-4971 por GP73-hFc recombinante expresada en HEK (Abbott, Illinois, EE. UU.) se determinaron usando un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). En primer lugar, se creó un biosensor de captura de conejo anti-IgG de ratón de 13.000 - 15.000 UR mediante acoplamiento con amina de anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón (GE Healthcare) sobre un chip sensor CM5 (GE Healthcare) mediante química de EDC/NHS/etanolamina proporcionado en un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare) después de pretratar el biosensor con inyecciones duplicadas de HCl 100 mM, NaOH 50 mM y SDS al 0,1 %. El anticuerpo y antígeno para GP73 purificado (GP73-hFc de HEK) se diluyeron en un tampón de ejecución (en lo sucesivo, "tampón de ejecución") compuesto por tampón de HBS-EP (GE Healthcare) suplementado con BSA al 0,1 % y CM-Dextrano al 0,1 %. Cada anticuerpo ara GP73 se diluyó a 1 pg/ml. El antígeno GP73-hFc se diluyó a concentraciones de 0,412 a 100 nM usando una dilución en serie de factor 3, asumiendo un peso molecular oligomérico de 490 kDa (Abbot Laboratories).
El programa para el antígeno GP73-hFc fue como sigue. Tras equilibrar el biosensor de captura de IgG de conejo anti-ratón durante 3 min a 5 pl/minuto con tampón de ejecución, se inyectó el anticuerpo para GP73 (7-14 pl) sobre celdas de flujo individuales dejándose en blanco una celda de flujo como una celda de flujo de referencia. Las celdas de flujo se lavaron con tampón de ejecución durante 3 min a un caudal de 60 pl/min. Se inyectaron 150 pl de antígeno GP73-hFc expresado en HEK293 a una concentración aleatoria a lo largo del biosensor. Posteriormente, se volvió a equilibrar el biosensor con tampón de ejecución durante 5 min a un caudal de 60 pl/minuto. Todas las superficies de biosensor se regeneraron con una inyección de 30 pl de glicina 10 mM, pH 1,7 (Ge Healthcare), a un caudal de 10 pl/minuto. Todas las concentraciones de antígeno expresado en HEK293 se ensayaron por duplicado. La cinética de unión (asociación y disociación) se monitorizaron mediante sensogramas durante la inyección del antígeno y reequilibrado del tampón de ejecución. Los sensogramas se referenciaron por partida doble y se ajustaron a un modelo de unión de 1:1 usando el programa informático Scrubber 2.0 (BioLogic Software Pty Ltd. Australia) para determinar las velocidades de asociación y disociación, así como la Kd general. Los resultados se muestran en la tabla 12. Los errores estándar de los valores determinados se comunican entre paréntesis con respecto al número de valor de posición más pequeño.
De los anticuerpos en la tabla 12 a continuación, solo 1B-4971 está abarcado por la presente invención.
Tabla 12
Figure imgf000073_0002
Ejemplo 12
Datos de GP73 de ARCHITECT®
El principio de inmunoensayo en sándwich ARCHITECT® se muestra en la figura 19. En resumen, un anticuerpo recubierto sobre una micropartícula captura el analito de interés, después, un segundo anticuerpo conjugado a acridinio se une a un segundo epítopo sobre el analito, después, se efectúa una separación de las partículas del marcador y la lectura para determinar las unidades de luz relativas (URL) de la reacción quimioluminiscente.
Los pares de anticuerpos monoclonales, tales como 1A-4246 como anticuerpo monoclonal de captura y 1B-4863 como anticuerpo monoclonal de detección, se ensayaron mediante ELISA para imitar los mismos epítopos de GP73 que se unen al anticuerpo monoclonal de ratón 14H4-23 de la universidad de Drexel usado como anticuerpo de captura y el anticuerpo policlonal de conejo usado como anticuerpo de detección. El experimento ARCHITECT® inicial comparó el anticuerpo de captura de Drexel, 14H4-23 con el anticuerpo de captura 1A-4246. Cada anticuerpo de captura se emparejó con el anticuerpo de detección 1-B4863, que se diluyó a 0,5 nM. La tasa de incorporación de acridinio al anticuerpo para 1B-4863 fue de 3.9. Como se muestra en la figura 20, el anticuerpo de captura 1A-4246 tuvo un rendimiento tres veces mayor que el anticuerpo de captura de Drexel 14H4-23, basándose en la curva patrón usando la proteína de fusión GP73-hFc recombinante producida en transfección transitoria de HEK293 con un intervalo de 0-14,4 ng/ml. Véase la tabla 13.
crD. O <" oÜJ X O O
< co - O
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En el experimento ARCHITECT® de seguimiento, se usó 1A-4246 como anticuerpo de captura a una concentración de 0,2 mg/ml, usándose 1B-4863 como anticuerpo de detección a una concentración de 0,5 nM o 2 nM. La tasa de incorporación de acridinio al anticuerpo para 1B-4863 fue de 6.18. La mayor concentración de conjugado de 2 nM produce una mayor señal que la esperada (véase la figura 21) pero hay un mayor fondo en Cal A (véase la tabla 14). Estos datos de GP73 de ARCHITECT® muestran una respuesta muy lineal al antígeno GP73-hFc recombinante para ambos pares de anticuerpos monoclonales.
Tabla 14 ARCHITECT® de GP73
1A424 P r i r 2 m ml n 1B4 ^ nM IR 1
Figure imgf000076_0001
1A4246 uP recubierto a 02 m /ml con 1B48632 nM IR 618
Figure imgf000076_0002
Ha de entenderse que la descripción detallada anterior y los ejemplos adjuntos son únicamente ilustrativos y no han de interpretarse como limitaciones en el alcance de la invención, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado del mismo que se une a la proteína del Golgi 73 ("GP73") y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que es un Fv ligado por disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un scFv, un anticuerpo quimérico, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un Fab, un anticuerpo dual específico, un DVD, un TVD, un Fab', un anticuerpo biespecífico, un F(ab')2 o un Fv.
3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende además un agente seleccionado entre el grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de obtención de imágenes y un agente terapéutico.
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al epítopo de GP73 en la secuencia de aminoácidos de: VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGR (hGP73307-339) (SEQ ID NO: 101).
5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo tiene:
i) una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 4,0 x 10"9 a 1,8 x 10"1213;
ii) una constante de disociación (koff) de 1,5 x 10"3 a 8,0 x 10"6; o
iii) una constante de asociación (kon) de 1,0 x 105 a 4,1 x 106
6. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
7. Una célula hospedadora que comprende y expresa un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 13, opcionalmente como parte de un vector.
8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
9. Un método para determinar la concentración de GP73 en una muestra de ensayo, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73 para formar un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73;
(b) poner en contacto el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73 con al menos un anticuerpo de detección que comprende un marcador detectable, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura y forma un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección; y
(c) determinar la concentración de GP73 en la muestra de ensayo basándose en la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GP73-anticuerpo de detección formado en (b);
en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y
en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente del al menos un anticuerpo de detección.
10. El método de la reivindicación 9, que además comprende comparar la señal generada por el marcador detectable como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en la muestra de ensayo con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la concentración de GP73 en un control o calibrador.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la concentración de GP73 en la muestra de ensayo se usa para determinar o evaluar si un sujeto tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedad hepática.
12. Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
13. Un kit para ensayar una muestra de ensayo respecto de GP73 o GP73 fucosilada, comprendiendo dicho kit (a) al menos un anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura se une a un epítopo sobre GP73 o un fragmento de GP73,
(b) al menos un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de detección se une a un epítopo sobre GP73 al que no se une el anticuerpo de captura y
(c) instrucciones para ensayar la muestra de ensayo respecto de GP73, en donde el al menos un anticuerpo de captura o el al menos un anticuerpo de detección comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 y en donde el al menos un anticuerpo de captura es diferente del al menos un anticuerpo de detección.
14. El kit de la reivindicación 12 o 13, que además comprende un patrón de referencia que indica una concentración de GP73 en un control o calibrador.
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