CN101555282A - 岩藻糖基化高尔基蛋白gp73抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体、一种用于制备所述抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体的方法、一种用于诊断肝癌的试剂、一种用于诊断肝癌的试剂盒、提供上述的试剂和/或试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病的产品中的应用以及一种用于制备纯化岩藻糖基化GP73蛋白的方法。可以通过对本发明所述的岩藻糖基化GP73蛋白或抗体的检测，对肝癌的发生、发展以及是否有转移进行诊断。更为广泛地，抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。

Description

岩藻糖基化高尔基蛋白GP73抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地，本发明涉及一种抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体、一种用于制备所述抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体的方法、一种用于诊断肝癌的试剂、一种用于诊断肝癌的试剂盒、提供上述的试剂和/或试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病的产品中的应用以及一种用于制备纯化岩藻糖基化GP73蛋白的方法。

背景技术

我国是乙型肝炎大国，由乙型肝炎发展所致的肝硬化和肝细胞肝癌已为我国医疗资源带来了很大的负担，据最近统计，世界上每新增的2例肝癌患者中就有1例发生在中国。对肝癌进行早期的诊断和治疗是我国肝脏学界面临的重要任务。

上世纪七十年代，以汤钊猷院士为代表的老一辈医学家以大规模临床测试甲胎蛋白(AFP)作为早期诊断肝癌的主要手段，继之以早期的手术切除，在国内以至世界上在小肝癌治疗领域里做出了卓越的贡献。目前AFP已成为临床上最常用的、几乎是唯一的肝细胞肝癌的血清标记物。

在此后的数十年的临床实践中，临床医师发现AFP还是存在敏感率不甚满意的缺憾，虽报道不一(33％-85％)，但平均在50％或稍高水平，使部分的早期肝癌患者事实上还是得不到早期的发现。

近年来，基因技术、蛋白质组学、肿瘤免疫等研究飞速发展，筛选出一些潜在的新的肿瘤标志物。其中，GP73被认为是最值得期待的血清标志物之一。GP73是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白，Kladney于2000年首先描述了在正常的人体肝组织中，GP73主要由胆管上皮细胞表达，而肝细胞表达很少甚至不表达。肝细胞受到病毒感染可引起GP73的高表达^[1]。Kladney继续深入研究，提出不管是由病毒(HBV及HCV)感染引起还是由非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者中，GP73水平均显著上调^[2]。

Iftikhar同样发现，在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和进行性肝硬化患者中，GP73体现出高表达。从而认为GP73的表达途径可能存在不同的机制，一种由急性肝细胞损伤触发，而另一种存在于慢性肝脏疾病进展过程中^[3]。

同时，Maitra提出，GP73在急性及慢性肝脏疾病中都可以体现出高表达，提示这种蛋白对肝脏疾病的病因诊断可能并无帮助，但可以作为肝脏疾病的血清标志物^[4]。

随后，Block于2005年首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平显著升高^[5]。在一项包括352名患者的研究中，相比较肝硬化患者，肝癌患者的血清GP73水平显著升高。如果取临界值为10个相对单位，GP73诊断肝癌的敏感性为69％，特异性为75％。对于早期肝癌(T1：单个结节，直径＜2cm及T2：单个结节，直径位于2cm～5cm之间或小于三个结节，每个直径＜3cm)的诊断，GP73的敏感性(62％)显著优于AFP(25％)。而且，AFP水平低于20ng/ml的肝癌患者中，有57％(32/56)的人群GP73水平显著升高。从而提示，肝癌患者血清中GP73水平显著升高，且对于早期肝癌的诊断，GP73优于AFP^[6]。在一项包括80名患者的研究中，GP73诊断肝癌的敏感性和特异性为65％和90％，而岩藻糖基化GP73的敏感性和特异性则高达90％和100％^[7]。因此，Cassandra提出，GP73及其异构体是肝癌可靠的肿瘤标志物^[8]。

美国专利申请文件US20050112711A1，发明名称为《Diagnosis andmonitoring of hepatocellular carcinoma》，其公开了一种以GP73作为肝细胞癌监测指标的诊断和监测方法，但未提及糖基化蛋白及其高度敏感和特异性。

中国专利申请文件CN 101062939A，发明名称为《检测肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的装置及试剂盒》，其公开了一种用于检测肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的装置和试剂盒方法，其抗体为一般性的抗GP73抗体，并非专门针对糖基化蛋白的特异性抗体，其方法需要首先分离出所有糖基化蛋白，然后用抗体检测GP73，操作复杂。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体。

本发明的另一个目的在于，提供一种所述抗体在制备用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂中的应用。

本发明的又一个目的在于，提供一种用于制备本发明的抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体的方法。

本发明还有一个目的在于，提供提供一种用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂。

本发明的又一个目的在于，提供一种用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂盒

本发明的又一个目的在于，提供上述的试剂和/或试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病的产品中的应用。

本发明的又一个目的在于，提供一种用于制备纯化岩藻糖基化GP73蛋白的方法。

本发明的又一个目的在于，提供一种能稳定分泌所述抗人岩藻糖基化GP73蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一个目的在于，提供抗GP73蛋白的抗体或抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体在制备用于诊断肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发的试剂中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体，所述抗体优选为单克隆抗体。

优选地，所述抗体是通过以下方法来制备的：

1)通过PCR获得人GP73cDNA；

2)将1)中获得的GP73基因亚克隆至pRevHyg载体或称作pIREShyg(Cancer Res.2004，64：3436-43)中；

3)转染PT67包装细胞；

4)产生重组病毒pRevHyg-GP73；

5)将4)中得到的重组病毒感染HepG2细胞系；

6)收获感染的HepG2细胞培养液并富集所述的糖基化蛋白亲和/离子层析纯化；

7)以6)中纯化得到的岩藻糖基化GP73蛋白作为抗原免疫小鼠，从而制备抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体。

另一方面，本发明提供所述抗体在制备用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂中的应用。

又一方面，本发明提供一种用于制备本发明的抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

1)通过PCR获得人GP73 cDNA；

2)将1)中获得的GP73 cDNA亚克隆至pRevHyg载体或称作pIREShyg(Cancer Res.2004，64：3436-43)中；

3)转染PT67包装细胞；

4)产生重组病毒pRevHyg-GP73；

5)将4)中得到的重组病毒毒感染HepG2细胞系；

6)收获感染的HepG2细胞培养液并富集所述的糖基化蛋白亲和/离子层析纯化；

7)以6)中纯化得到的岩藻糖基化GP73蛋白作为抗原免疫小鼠，从而制备抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体。

另一方面，本发明提供一种用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂，所述试剂包含本发明所述的抗体，优选地，所述试剂还包括药学上可接受的载体。

又一方面，本发明提供一种用于诊断肝癌(包括肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发)的试剂盒，所述试剂盒包含：本发明所述的抗体，优选地，所述抗体以鼠抗人岩藻糖基化GP73单抗包被板的形式存在。

另一方面，本发明提供上述的试剂和/或试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病的产品中的应用。

另一方面，本发明提供一种用于制备纯化岩藻糖基化GP73蛋白的方法，所述方法包括：将GP73基因亚克隆至表达载体中，转染包装细胞，产生重组病毒，将所述重组病毒转染GP73低表达细胞系，收获细胞并富集所述的糖基化蛋白，以亲和层析纯化得到所述蛋白。

又一方面，本发明提供一种能稳定分泌权利要求1或2的抗人岩藻糖基化GP73蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

又一方面，本发明提供抗GP73蛋白的抗体在制备用于诊断肝细胞癌、胆管细胞癌、肝转移癌，以及肝癌治疗后复发的试剂中的应用。

又一方面，本发明提供抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体在制备用于诊断乙型肝炎、肝内良性占位、肝细胞癌、原发肝内恶性肿瘤如胆管细胞癌、肝转移癌和/或肝癌治疗后复发的试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

首先，与现有技术CN 101062939A相比，本发明在国际上率先制备了糖基化GP73的单克隆抗体，可直接检测糖基化的GP73；而CN 101062939A的方法需要首先分离出所有糖基化蛋白，然后用抗体检测GP73，从而与本发明具有根本的区别。因此，本发明的检测方法快捷，具有检测成本低的等特点。

其次，本发明人研究的初步结果确立了我国正常人的GP73相对水平范围(2.06±0.10)；正常人群和非肝病患者的GP73水平相当(P＝0.2925)。肝癌组血清GP73水平与对照组及乙肝携带者组相比显著增高(37.94±4.16 vs.2.06±0.10和4.80±0.34，P＝0.0015和0.0058)(表1，图2、3、4)。GP73诊断HCC的敏感性达到76.9％，特异性达到92.8％，与本组病人AFP的敏感性(48.6％)相比，前者有显著增高^[9，10](图5)。这些研究首次在中国初步揭示了GP73在以乙肝为基础的HCC患者中的高敏感性，它有可能成为临床上一个新的更有效的肝癌标记物。

表1血清GP73水平

正常对照	842	2.06±0.10u
			HBV携带者	339	4.80±0.34u
肝细胞癌	617	37.94±4.16u
			胆管细胞癌	8	7.39±2.40u
肝转移癌	6	30.27±8.31u
			肝良性占位	23	3.69±0.82u
非肝病患者	37	2.47±0.47u

此外，根据本发明人的发现，有理由认为，GP73可能成为更好的诊断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物。我们研究的初步结果确立了我国正常人的GP73相对水平范围(2.06±0.10)；正常人群和非肝病患者的GP73水平相当(P＝0.2925)。肝癌组血清GP73水平与对照组及乙肝携带者组相比显著增高(37.94±4.16vs.2.06±0.10和4.80±0.34，P＝0.0015和0.0058)(表一，图2、3、4)。GP73诊断HCC的敏感性达到76.9％，特异性达到92.8％，与本组病人AFP的敏感性(48.6％)相比，前者有显著增高^[9，10](图5)。这些研究首次在中国初步揭示了GP73在以乙肝为基础的HCC患者中的高敏感性，它有可能成为临床上一个新的更有效的肝癌标记物。

我们进一步发现肝脏良性占位性疾病病变的GP73水平不高，而胆管细胞癌的水平升高(7.39±2.40u)，肝转移癌的GP73接近肝细胞癌的水平(30.27±8.31u)，肝癌手术后的GP73水平明显下降，复发后回升(表一，图6、7)，因此GP73也可用于诊断胆管细胞癌、肝转移癌，监测肝癌治疗后是否复发，评价治疗效果，并且可以作为鉴别肝脏良性或恶性肿瘤的一个指标。

可以通过对该岩藻糖基化GP73蛋白或抗体的检测，对肝癌的发生、发展以及是否有转移进行诊断。更为广泛地，抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为显示制备本发明的糖基化GP73抗体的流程示意图；

图2显示GP73在正常组、乙肝携带者组和肝癌组血清中的表达，其中，N为组间对照；

图3显示正常对照组、乙肝携带者组和肝癌组的血清GP73水平，其中，图3A为正常对照组的GP73水平分布图，图3B为正常对照组、乙肝病毒(HBV)携带组和肝细胞癌(HCC)组的GP73水平比较；

图4显示GP73诊断HCC的ROC曲线和敏感性、特异性；

图5显示GP73和AFP的敏感性和特异性对比结果；

图6显示GP73在其他疾病中表达水平的比较；

图7显示GP73在肝癌手术前、手术后及复发后水平的变化，其中，图7A为HCC患者术后复发与否与GP73水平的关系，图7B为HCC患者术前术后短期复发与GP73的水平变化；

图8显示GP73基因的PCR结果；

图9显示克隆酶切鉴定的阳性结果(+PCR结果)，其中，前6项是酶切，后6项是PCR结果，第1、4被鉴定为正确克隆；

图10显示感染后的HepG2能够分泌GP73蛋白；

图11显示用抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体特异性地识别糖基化的GP73蛋白；

图12显示用抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体检测凝集素(Lectin)来分离的正常组(1)、乙肝携带者组(2、3)和肝癌组(4为早期肝癌患者、5为中晚期肝癌患者)血清中的糖基化GP73的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1、构建pRevHyg-GP73载体：

设计GP73引物：

5′tatggatccatgatgggcttgggaaacg3′和

5′aggatcgattcagagtgtatgattccgcttttc3′；

通过PCR技术扩增人GP73cDNA，酶切位点分别为ClaI和NotI(购自Openbiosystems，美国)。使用PFU DNA聚合酶(购自Stratagene，美国)进行PCR反应，(95摄氏度1分钟、52摄氏度1分钟、72摄氏度1.2分钟，共30个循环)，扩增片断大小为1.2kb(图8)。将PCR产物和pRevHyg质粒(记载于Cancer Res.2004，64：3436-43)用ClaI和NotI(购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，随后用T4 DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，并将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司)。挑取单克隆于3ml的LB(Amp+)培养基中培养过夜，用Plasmid Mini kit(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司)小量制备pRevHyg-GP73重组质粒。经PCR和酶切鉴定正确后(图9)，再利用pRevHyg通用引物对插入片段进行测序分析，结果显示插入片段正确无误。

实施例2、细胞培养：

HepG2细胞系(ADCC，美国)用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(购自北京钮因应用技术发展有限公司)在CO₂培养箱(37度，5％CO₂)中培养，同时利用实施例1中构建的pRevHyg-GP73质粒转染病毒包装细胞PT67(购自Clontech，美国)，经用50ug/ml潮霉素(Hygromycin，购自Sigma，美国)筛选出转染了pRevHyg-GP73的PT67细胞，并产生pRevHyg-GP73病毒，将其感染HepG2细胞并用50ug/ml潮霉素(购自Sigma，美国)筛选出感染了pRevHyg-GP73病毒的HepG2细胞(HepG2-GP73)。

实施例3、Western-blot检测GP73在HepG2细胞培养液中的表达：

收集实施例2得到的HepG2-GP73细胞的DMEM培养液(购自北京钮因应用技术发展有限公司)，加入一倍量的蛋白变性液([60mM Tris-HCl(pH 6.8)，2％SDS，10％甘油和100mM DTT)，95摄氏度加热变性，进行4-12％SDS-PAGE电泳。将蛋白用半干转移法转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。膜用5％BSA(Sigma，美国)室温封闭1小时，依次与1∶1000稀释的GP73抗体(购自SCBT，美国)4度孵育过夜以及1∶2000稀释的以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG室温孵育1小时后，在暗室里进行化学发光(ECL)检测，结果显示感染后的HepG2能够分泌GP73蛋白(抗GP73抗体、购自SCBT，美国)(图10)。

实施例4、富集糖基化蛋白：

收集实施例3得到的HepG2-GP73细胞的DMEM培养液(购自北京钮因应用技术发展有限公司)，采用亲和层析法，富集糖基化蛋白。首先收集HepG2-GP73细胞的DMEM培养液，用0.05mol/L、pH7.0磷酸缓冲液(含0.2mol/LNaCl)透析后上层析柱Lentil lectin Sepharose 4B(购自GE，美国)，平衡后用相同的缓冲液洗涤，然后再用在该缓冲液中含有0.2mol/Lα-甲基D-葡萄糖苷的缓冲液来洗脱，得到含有糖基化蛋白峰，即所需的纯化岩藻糖基化蛋白。

实施例5、糖基化蛋白中的GP73蛋白纯化：

取实施例4中富集的糖基化蛋白，加入ANX离子层析柱(购自GE，美国)，加0.1-0.5M NaCl洗脱，收集洗脱峰，再浓缩，透析。蛋白定量，经SDS-PAGE检测纯化的GP73蛋白(Fuc-GP73)，经Western Blot确认。

实施例6、杂交瘤细胞株的建立及单克隆抗体的制备：

用实施例5中纯化的岩藻糖基化GP73作为免疫原，接种Balb/c小鼠(中国医学科学院基础所动物中心)，基础免疫共5次，间隔3周，每次抗原用量为50ug/只。初次用弗氏完全佐剂(购自Sigma，美国)混合乳化，皮下多点，以后用弗氏不完全佐剂(购自Sigma，美国)，腹腔注射。每次免疫后1周测效价，在融合前3天以尾静脉注射加强免疫，抗原用量为100ug/只。取免疫小鼠的脾细胞与NS-1细胞(购自上海中科院细胞库cellbank，P3/NSI/1-Ag4-1[NS-1](小鼠骨髓瘤细胞，细胞编号TCM25)按常规方法进行融合，经HAT选择性培养基(即含有黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)的20％小牛血清的培养基，购自Sigma，美国)培养，以ELISA法筛选出阳性克隆，再通过有限稀释法进行两次亚克隆筛选出能稳定分泌抗人岩藻糖基化的GP73蛋白(下称“Fuc-GP73”)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株，并制备mAb腹水，先用液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。以HItrap ProteinG柱(购自GE，美国)来纯化腹水即得所述单克隆抗体(mAb)。

所得单克隆抗体(mAb)经Ig亚类测定、效价测定、Western blot鉴定及单抗识别位点的鉴定，证实其能与实施例5中制得的岩藻糖基化的GP73抗原相结合(图11、12)而不识别大肠杆菌产生的非糖基化GP73(图11)。

本实施例中所述的非糖基化GP73是通过PCR技术使用如下引物和方法来制备的：

正向引物：ctcagatctgatgggcttgggaaacgggc和

反向引物：agtgcggccgctcagagtgtatgattccg

在PFU DNA聚合酶(购自Stratagene，美国)催化下扩增人GP73 cDNA，用NotI和BgIII(购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切后插入PET29a+(购自Novogen，美国)，在BL21菌株(购自Novogen，美国)表达，然后用镍离子琼脂糖凝胶柱(Ni-Agarose柱)(购自GE Healthcare，美国)来纯化非糖基化的GP73(购自Novogen，美国)。

实施例7、诊断肝脏疾病的岩藻糖基化GP73试剂盒：

该试剂盒包括：包被有实施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73单抗的ELISA板。包被缓冲液(35mMNaHCO₃，15mMNa₂CO₃，pH 9.6)，样品稀释液(1*PBS，1％BSA，0.05％NaN₃，PH7.2±0.2)(自配)，洗脱液(1*TBS，50mM Tris-HCl，pH7.6，150mM NaCl，5％脱脂奶，0.1％Tween 20)(自配)，HRP标记的羊抗鼠Ig以及Fuc-GP73标准品。

所述试剂盒的制备方法为：

在ELISA板的每孔中加入1.8-2.2ug/ml实施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73单抗50-100ul，4摄氏度过夜；取出，置于37摄氏度30分钟；甩去液体，以PBS缓冲液洗涤2-4次；控干，加入1*PBS稀释的3-5％BSA(小牛血清白蛋白)封闭，100ul/孔，37摄氏度，2小时；甩去液体，PBS洗涤2次；每孔加入1.8-2.2ug/ml实施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73单抗50-100ul，4摄氏度过夜；甩去液体，洗涤缓冲液洗1-3次；放于4摄氏度，备用。

使用时，将采自受试者的血清样本用样品稀释液以1∶100稀释，以50-100ul/孔的体积加样，37摄氏度60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次；控干，加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠Ig，50-100ul/孔，37摄氏度，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次；加入化学发光底物A和B(购自北京科跃中楷生物技术有限公司，HRP化学发光底物液，产品编号D2-0500，分为A、B液)，25-50ul/孔，室温避光孵育15-30分钟；在酶标仪上(450nm)测定OD值。

用标准品的OD值制作标准曲线，将检测所得的读值按标准品曲线计算即得被测血清样本中Fuc-GP73的含量，并根据被测血清样本中Fuc-GP73的含量对肝癌的发生、发展以及是否有转移来进行诊断。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>岩藻糖基化高尔基蛋白GP73抗体及其用途

<130>DIC08110037

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1206

<212>DNA

<213>人

<400>1

atgatgggct tgggaaacgg gcgtcgcagc atgaagtcgc cgcccctcgt gctggccgcc    60

ctggtggcct gcatcatcgt cttgggcttc aactactgga ttgcgagctc ccggagcgtg    120

gacctccaga cacggatcat ggagctggaa ggcagggtcc gcagggcggc tgcagagaga    180

ggcgccgtgg agctgaagaa gaacgagttc cagggagagc tggagaagca gcgggagcag    240

cttgacaaaa tccagtccag ccacaacttc cagctggaga gcgtcaacaa gctgtaccag    300

gacgaaaagg cggttttggt gaataacatc accacaggtg agaggctcat ccgagtgctg    360

caagaccagt taaagaccct gcagaggaat tacggcaggc tgcagcagga tgtcctccag    420

tttcagaaga accagaccaa cctggagagg aagttctcct acgacctgag ccagtgcatc    480

aatcagatga aggaggtgaa ggaacagtgt gaggagcgaa tagaagaggt caccaaaaag    540

gggaatgaag ctgtagcttc cagagacctg agtgaaaaca acgaccagag acagcagctc    600

caagccctca gtgagcctca gcccaggctg caggcagcag gcctgccaca cacagaggtg    660

ccacaaggga agggaaacgt gcttggtaac agcaagtccc agacaccagc ccccagttcc    720

gaagtggttt tggattcaaa gagacaagtt gagaaagagg aaaccaatga gatccaggtg    780

gtgaatgagg agcctcagag ggacaggctg ccgcaggagc caggccggga gcaggtggtg    840

gaagacagac ctgtaggtgg aagaggcttc gggggagccg gagaactggg ccagacccca    900

caggtgcagg ctgccctgtc agtgagccag gaaaatccag agatggaggg ccctgagcga    960

gaccagcttg tcatccccga cggacaggag gaggagcagg aagctgccgg ggaagggaga    1020

aaccagcaga aactgagagg agaagatgac tacaacatgg atgaaaatga agcagaatct    1080

gagacagaca agcaagcagc cctggcaggg aatgacagaa acatagatgt ttttaatgtt    1140

gaagatcaga aaagagacac cataaattta cttgatcagc gtgaaaagcg gaatcataca    1200

ctctga

1206

<210>2

<211>401

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu

1               5                   10                      15

Val Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Ile Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr

            20                  25                      30

Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu

        35                  40                      45

Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu

    50                  55                      60

Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln

65                  70                      75                  80

Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn

                85                      90                  95

Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr

            100                     105                 110

Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln

        115                     120                 125

Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn

    130                     135                 140

Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile

145                     150                 155                 160

Asn Gln Met Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu

                    165                 170                 175

Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu

                180                 185                 190

Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro

        195                 200                 205

Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys

    210                 215                 220

Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser

225                 230                 235                 240

Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn

                245                 250                 255

Glu Ile Gln Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln

            260                 265                 270

Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg

       275                 280                 285

Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala

    290                 295                 300

Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg

305                 310                 315                 320

Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala

                325                 330                 335

Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn

            340                 345                 350

Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu

        355                 360                 365

Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys

    370                 375                 380

Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr

385                 390                 395                 400

Leu

参考文献：

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[9]徐海峰、杨华瑜、毛一雷等，改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物，基础医学与临床，2008，28：104-108；

[10]毛一雷、杨华瑜、徐海峰等，新的肝癌血清标记物GP73在肝癌诊断中的初步研究，《中华医学杂志》，2008年4月8日

Claims (11)

1.一种抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体，所述抗体优选为单克隆抗体。

2.权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是通过包括如下步骤的方法来制备的：

1)通过PCR获得GP73cDNA；

2)将1)中获得的GP73cDNA亚克隆至pRevHyg载体中；

3)转染PT67包装细胞；

4)产生重组病毒pRevHyg-GP73；

5)将4)中得到的重组病毒感染HepG2细胞系；

6)收获HepG2-GP73细胞的培养液，并用亲和-离子层析纯化富集所述的糖基化蛋白，所述培养液优选为DMEM培养液；

7)以6)中纯化得到的岩藻糖基化GP73蛋白作为抗原免疫小鼠，从而制备所述的抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体。

3.权利要求1或2的抗体在制备用于诊断肝脏疾病的试剂中的应用，优选地，所述肝脏疾病为乙型肝炎、肝内良性占位、肝细胞癌、原发肝内恶性肿瘤如胆管细胞癌、肝转移癌和/或肝癌治疗(如手术治疗)后复发。

4.一种用于制备权利要求1或2的抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)通过PCR获得GP73cDNA；

2)将1)中获得的GP73cDNA亚克隆至pRevHyg载体中；

3)转染PT67包装细胞；

4)产生重组病毒pRevHyg-GP73；

5)将4)中得到的重组病毒感染HepG2细胞系；

6)收获HepG2-GP73细胞的培养液，富集所述的糖基化蛋白并以亲和-离子层析纯化所述蛋白，所述培养液优选为DMEM培养液；

7)以6)中纯化得到的岩藻糖基化GP73蛋白作为抗原免疫小鼠，从而制备所述的抗岩藻糖基化GP73蛋白的抗体。

5.一种用于诊断肝脏疾病(优选肝癌)的试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求1或2的抗体，优选地，所述试剂还包括药学上可接受的载体。

6.一种用于诊断肝脏疾病(优选肝癌)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求1或2的抗体，优选地，所述抗体以鼠抗人岩藻糖基化GP73单抗包被板的形式存在。

7.权利要求5的试剂和/或权利要求6的试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病的产品中的应用，优选地，所述肝脏疾病为乙型肝炎、肝内良性占位、肝细胞癌、原发肝内恶性肿瘤如胆管细胞癌、肝转移癌和/或肝癌治疗(如手术治疗)后复发。

8.一种用于制备纯化岩藻糖基化GP73蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：将GP73cDNA亚克隆至表达载体中，转染包装细胞，产生重组病毒，将所述重组病毒感染肝癌细胞并从细胞培养液富集所述的糖基化蛋白，以亲和-离子交换层析纯化得到所述蛋白。

9.一种能稳定分泌权利要求1或2的抗人岩藻糖基化GP73蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

10.抗GP73蛋白的抗体在制备用于诊断乙型肝炎、肝内良性占位、肝细胞癌、原发肝内恶性肿瘤如胆管细胞癌、肝转移癌和/或肝癌治疗(如手术治疗)后复发的试剂中的应用。

11.抗岩藻糖基化的GP73蛋白的抗体在制备用于诊断乙型肝炎、肝内良性占位、肝细胞癌、原发肝内恶性肿瘤如胆管细胞癌、肝转移癌和/或肝癌治疗(如手术治疗)后复发的试剂中的应用。

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