CN108948203B - 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗PD‑1单克隆抗体及其制备方法和应用，公开了抗PD‑1单克隆抗体、抗体的制备方法、抗体在制备用于多种疾病中药物的用途，还涉及本发明提供的抗体可配对使用检测抗原的用途。

Description

抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药和基因工程技术领域，具体涉及一种抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种抗人PD-1兔源单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)，也称为CD279，是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28家族成员，分子量在50～55kD的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞上(YasutoshiAgata等，Internationl Immunology 1996；8：675)。作为T细胞的负性调控因子，PD-1与其配体PD-L1/PD-L2一同参与T细胞免疫过程。已有大量研究证实，PD-1在体内炎症和肿瘤免疫过程中发挥重要作用。PD-1/PD-L1调节轴在人体T细胞活化控制与机体免疫耐受维持中发挥关键作用，因此也被肿瘤细胞以及慢性病毒感染中所利用。PD-1/PD-L1调节轴已被证实促进T细胞耗竭，肿瘤或病毒诱导的PD-1/PD-L1信号通路也可通过多种机制来实现宿主免疫监视的逃逸，包括促进T细胞失活、衰竭、反应迟钝和细胞凋亡，诱导Treg细胞扩增，以及增强肿瘤内在性抵抗杀伤和凋亡的能力。通过癌细胞介导的PD-1和PD-L1相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，T细胞增殖抑制，并增加免疫逃逸(Topalian SL等，Cancer Cell，2015)。在慢性乙肝病毒感染过程中，CD8+T细胞表面的PD-1表达与病毒载量相关，开始抗病毒治疗后病毒载量和PD-1表达均下降，且阻断PD-1通路有助于HBV相关CD8+T细胞的功能恢复(Hsiang-Yun Cheng等，PLoS ONE 2014；Na Li等，Oncotarget，2017)。因此，将PD-1为癌症、感染性疾病和炎性疾病免疫治疗靶点，已成为目前免疫治疗的一个研究热点。
除了表达于细胞表面的的膜结合型PD-1(membrane boundprogrammed death-1,mPD-1)之外，PD-1还有一种存在于血液中的由PD-1Deltaex3可变区编码的可溶性形式——可溶性程序性死亡分子-1(soluble programmed death-1,sPD-1)。sPD-1可以在功能上阻断mPD-1的调控作用，影响T细胞的增殖，并促进抗原特异性T细胞免疫及树突状细胞的成熟。动物实验显示sPD-1可以抑制肝癌细胞的生长，促进癌细胞溶解，最终提高患癌小鼠的总体生存率(Elhag OA等，Asian Pac J Cancer Prev.2012)。有研究发现，慢性HBV感染患者的血清sPD-1水平高于健康人及HBV清除者。对于CHB不同分期而言，免疫耐受期的sPD-1水平与非免疫耐受期存在明显的差别。高水平的sPD-1还与持续的高病毒载量及高肝癌风险有关(Na Li等，Oncotarget，2017；Hsiang-Yun Cheng等，PLoS ONE 2014)。已发生HCC患者的sPD-1水平显著高于未发展为肝癌者，sPD-1对于诊断肝癌有最高的灵敏度和特异度，提示sPD-1也可以应用于慢性HBV感染患者的病情评估及预后判断。因此，精准测量检测血清中sPD-1浓度将帮助临床医生判断患者的免疫状态，从而更好地做出治疗决策。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种抗人PD-1兔单克隆抗体及其制备方法和应用，所提供的PD-1单克隆抗体可配对使用，可通过双抗体夹心ELISA法实现对PD-1和sPD-1蛋白的精确检测。
为实现上述目的，本发明提供如下方案：
一方面，本发明提供一种抗PD-1单克隆抗体，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述抗PD-1单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述抗PD-1单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
另一方面，本发明提供一种上述抗PD-1单克隆抗体的编码DNA，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述抗PD-1单克隆抗体的编码DNA，其重链可变区的编码DNA序列如SEQID NO:2所示；其轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述抗PD-1单克隆抗体的编码DNA，其重链可变区的编码DNA序列如SEQID NO:6所示；其轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
又一方面，本发明提供一种上述抗PD-1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
1)用人PD-1胞外免疫兔，作出免疫反应后，杀死，取脾脏，分离获得脾脏细胞；
2)筛选获得能特异性结合人PD-1的B细胞；
3)将B细胞进行亚克隆，获得抗体重链和轻链的可变区编码序列；
4)获得的可变区编码序列进行重组、转染、纯化后获得抗PD-1单克隆抗体。
再又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括上述抗PD-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。
进一步地，还包括抗PD-1药物，所述抗PD-1药物包括干扰素、抗PD-1单克隆抗体、抗PD-1多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA药物或治疗性疫苗等。
一方面，本发明提供一种表达载体，包含上述编码DNA，用于表达抗PD-1单克隆抗体。
一方面，本发明提供一种原核或真核宿主细胞，包含上述表达载体。
一方面，本发明提供一种上述抗PD-1单克隆抗体在制备治疗或预防人病毒感染、肿瘤及炎性疾病药物中的用途。
一方面，本发明提供一种用于检测PD-1抗原或sPD-1抗原的试剂盒，其包括本发明所述的抗PD-1单克隆抗体。
一方面，本发明提供一种通过双抗体夹心ELISA法实现检测PD-1抗原或sPD-1抗原的方法，其中，所述方法中使用的本发明所述的任意两种抗PD-1单克隆抗体。
优选地，所述任意两种抗PD-1单克隆抗体选自：a)所述抗PD-1单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；b)所述抗PD-1单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；c)a)和b)的组合。
有益效果：
本发明提供一种抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用，其能特异性地与PD-1抗原或sPD-1抗原结合，为通过基因工程方法诊断或治疗或预防病毒感染、肿瘤或炎性疾病建立基础。
本发明提供的抗PD-1单克隆抗体可配对使用，可精准测量检测血清中的sPD-1浓度，可快速帮助医生判断患者的免疫状态。
本发明提供了抗PD-1单克隆抗体，丰富了抗体的类型，可用于阻断PD-1和PDL1的结合。
本发明所述的抗PD-1单克隆抗体具有特异性抗原结合结构域，既可靶向结合PD-1蛋白也能够用于免疫组化、ELISA等试验。
附图说明
图1：免疫后的新西兰白兔的血清效价检测结果图；
图2：纯化的单克隆抗体能特异性结合PD-1结果图。
图中，Ab concentration抗体浓度。
具体实施方式
本发明涉及抗PD-1单克隆抗体及其制备方法，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：PD-1特异性单克隆抗体的制备
1)用重组表达的人PD-1胞外区免疫新西兰大白兔，获得针对人PD-1的免疫反应；
抗原采用人PD-1胞外结构域的重组蛋白(PD-1)。第0天用含有400μg PD-1蛋白的400μl的弗式完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1：1乳液皮下免疫新西兰白兔。随后，第7、21和42天皮下注射含有200μg PD-1蛋白的弗式不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1：1乳液，从而对新西兰白兔(#R6586、6587)进行加强免疫。免疫后的新西兰白兔血清效价在三次免疫后达到104后以上。表现最高抗体滴度(如图1所示)的兔子(#R6586)接受了200μg PD-1(不含佐剂)静脉注射加强免疫。
2)筛选得特异性结合人PD-1的淋巴B细胞
使用Lighting-Link R-Phycoerythrin(R-PE)Conjugation Kit(InnovaBiosciences公司)标记PD-1。将PD-1浓度调整至不超过1mg/ml；加1ul的LL-modifier试剂至10μl PD-1中混匀；将混合物加入Lighting-Link mix中的干粉状物中，重悬粉状物；室温放置至少3小时或者过夜；向混合物中加入1μl的LL-quencher试剂，30分钟后R-PE标记的PD-1即可使用。
提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，并加入荧光标记抗体：①PE-Cy7标记抗兔IgG抗体5μl；②APC标记抗兔MHCII抗体5μl；③R-PE标记PD-12ul。振荡混匀；用流式细胞仪分选收集MHCII-IgG+细胞，即为分泌PD-1抗体的B细胞。
3)PD-1特异性B细胞亚克隆
使用RNA提取试剂盒Neasy mini Kit(Qiagen)提取分泌PD-1抗体的B细胞的RNA。采用SuperScriptⅢOne-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNAPolymerase(Invitrogen公司)进行RT-PCR反应。使用PrimerPremier5软件设计PCR引物，对特异性B细胞的RNA将其逆转录为cDNA，并分别扩增编码抗体重链和轻链的全长片段。其中在抗体重链可变区基因5’端及3’端分别引入BamHI和NheI酶切位点，正向和反向引物分别为：5’-CCGTCCAAGCTTATGGAGACTGGGCTGCGCTGGC-3’和5’-CAACAAGGATCCCTATTTACCCGGAGAGCGGGAG-3’，在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入BamHI和NheI酶切位点，正向和反向引物分别为：5’-CCGTCCAAGCTTATGGACACGAGGGCCCCCACTC-3’和5’-CAACAAGGATCCCTAACAGTCACCCCTATTGAAGC-3’。采用SuperScriptⅢOne-Step RT-PCR System with Platinum TaqDNAPolymerase(Invitrogen公司)进行RT-PCR反应，反应条件为：50℃30min,94℃2min,随后进行94℃30s,57℃30s,68℃1min 35次循环，68℃延伸5min,4℃5min。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。
实施例2：编码PD-1单克隆抗体重链和轻链全长基因测序及抗体重组生产(1)编码PD-1单克隆抗体重链和轻链全长基因测序
将克隆获得的编码全长重链与轻链基因的PCR产物连接到pcDNA3.1(ThermoFisher Scientific)表达载体上，并将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，随机挑取10个单菌落用引物(5’-CTAGAGAACCCACTGCTTAC-3’和5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’)进行PCR，反应条件为：94℃预变性30s,94℃变性30s,57℃退火30s,68℃延伸1min 30次循环，最后68℃延伸5min。取5ul PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出还有抗体重链和轻链的转化子。同时将阳性转化子送至南京擎科公司测序，最终获得NJDT003和NJDT004的独特核苷酸/蛋白序列。序列信息如下：
NJDT003重链氨基酸序列：SEQ ID NO.1
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNSYNMNWVRQAPGKGLEWIGTIGKSGTTYFASWARGRFTISRTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARDFAVDVGWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
NJDT003重链DNA序列：SEQ ID NO.2
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAGCTACAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATGGATCGGAACCATTGGTAAGAGTGGTACCACATACTTCGCGAGCTGGGCGAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATTTGAAAATGACCAGTCCGACGACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATTTTGCTGTTGATGTTGGTTGGGGCCCAGGCACGCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA
NJDT003轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.3
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADVVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSESVVDNDYLSWYQQKPGQPPKVLIYEISKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAGAYASNRRAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
NJDT003轻链DNA序列：SEQ ID NO.4
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGC CAGATGTGCCGACGTCGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTGAGAGTGTTGTTGATAACGACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGGTCCTGATCTACGAAATTTCTAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGCTTATGCTAGCAATAGAAGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGT
NJDT004重链氨基酸序列：SEQ ID NO.5
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNSYNMNWVRQAPGKGLEWIGTIGKSGTTYFASWARGRFTISRTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARDFAVDVGWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
NJDT004重链DNA序列：SEQ ID NO.6
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAGCTACAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATGGATCGGAACCATTGGTAAGAGTGGTACCACATACTTCGCGAGCTGGGCGAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATTTGAAAATGACCAGTCCGACGACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATTTTGCTGTTGATGTTGGTTGGGGCCCAGGCACGCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACC CTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA
NJDT004轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.7
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADVVMTQTPSPVSAAVGDTVTISCQSSESVVDNDYLSWYQQKPGQPPKVLIYEISKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAGAYASNRRAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
NJDT004轻链DNA序列：SEQ ID NO.8
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGACGTCGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAGTTGTCAGTCCAGTGAGAGTGTTGTTGATAACGACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGGTCCTGATCTACGAAATTTCTAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTATTACTGTGCAGGCGCTTATGCTAGCAATAGAAGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCT ACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGT
(2)生产和纯化PD-1抗体
将表达单克隆抗体重链和轻链的质粒共转染293F细胞，并在37℃摇瓶中培养4天，采用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体。
实施例3:ELISA检测单克隆抗体对PD-1蛋白的结合能力
在96孔板(Costar，42592)中包被100μl PD-1蛋白(1μg/mL)4℃冰箱过夜。次日用200μl 0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤5遍，在200μl含有5％奶粉的PBS-T(0.05％吐温)中室温封闭1小时，洗涤5遍，加入不同浓度PD-1抗体100μl室温孵育1小时，洗涤5遍，每孔中加入100μl耦合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG于室温孵育1小时。将板用0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤五次，然后每孔中依次加入TMB显色液，显色3分钟，加入25ul终止液使反应停止，轻轻振荡混匀。设定全自动多功能酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。结果如图2所示，纯化后的单克隆抗体能够特异性结合PD-1蛋白。随着抗体浓度的增加，OD450读数也呈显著增加的趋势。
实施例4:双抗体夹心法检测PD-1浓度
(1)生物素标记抗体的制备
利用EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒(Thermo Scientific)标记检测抗体NJDT004。具体方法如下：将sulfo-NHS-LC-biotin从冰箱中取出，并平衡至室温。每1mg IgG抗体加入26.6μl生物素标记试剂，置于冰上2小时。标记结束后，通过透析方法除去多余的未标记上的生物素试剂。
(2)双抗体夹心ELISA试验
在96孔板(Costar)中加入100μl用碳酸盐缓冲溶液(PH＝9.4)稀释后的捕获的抗体NJDT003(1μg/mL)铺板，在4℃孵育过夜。次日用200μl 0.1％Triton-X的PBS洗涤液洗涤5遍；并在200μl含有5％奶粉的PBS-T(0.05％吐温)中室温封闭1小时，洗涤5遍；加入100μl等比稀释的重组蛋白PD-1，室温孵育1小时；随后用洗涤液洗板5遍，每孔中加入在(1)中生物素标记的检测抗体NJDT004(1μg/mL)，室温孵育1小时；随后用洗涤液洗板5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶－链霉亲和素(HRP-streptavidin，Jackson Immuno Lab)，并在室温孵育1小时。将板用洗涤液清洗五次，然后每孔中依次加入TMB显色液，显色3分钟，加入25ul终止液使反应停止，轻轻振荡混匀。设定全自动多功能酶标仪双波长为450nm/610nm，用空白孔调零点后测定各孔OD值。结果如表2所示：
表2：利用双抗体夹心法检测重组蛋白PD-1的ELISA分析
PD-1(ng/mL) 500 250 125 62.5 31.25 0
OD450nm 1.56 0.863 0.617 0.411 0.217 0.13
从表2结果可知，本发明提供的可配对使用的抗PD-1单克隆抗体利用双抗体夹心法检测重组蛋白PD-1的浓度可低至31.25ng/ml，检测精度高。
以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用
<130> 2018
<141> 2018-08-07
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 454
<212> PRT
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 1
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn
35 40 45
Ser Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Thr Ile Gly Lys Ser Gly Thr Thr Tyr Phe Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Met Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Asp Phe Ala Val Asp Val Gly Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
165 170 175
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
195 200 205
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu
225 230 235 240
Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
275 280 285
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
340 345 350
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
355 360 365
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
435 440 445
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 2
<211> 1362
<212> DNA
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 2
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct caatagctac aacatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aagggactgg aatggatcgg aaccattggt aagagtggta ccacatactt cgcgagctgg 240
gcgagaggcc gattcaccat ctccagaacc tcgaccacgg tggatttgaa aatgaccagt 300
ccgacgaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag attttgctgt tgatgttggt 360
tggggcccag gcacgctggt caccgtctcc tcagggcaac ctaaggctcc atcagtcttc 420
ccactggccc cctgctgcgg ggacacaccc agctccacgg tgaccctggg ctgcctggtc 480
aaaggctacc tcccggagcc agtgaccgtg acctggaact cgggcaccct caccaatggg 540
gtacgcacct tcccgtccgt ccggcagtcc tcaggcctct actcgctgag cagcgtggtg 600
agcgtgacct caagcagcca gcccgtcacc tgcaacgtgg cccacccagc caccaacacc 660
aaagtggaca agaccgttgc gccctcgaca tgcagcaagc ccatgtgccc accccctgaa 720
ctcccggggg gaccgtctgt cttcatcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcacgcaccc ccgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccaggatga ccccgaggtg 840
cagttcacat ggtacataaa caacgagcag gtgcgcaccg cccggccgcc gctacgggag 900
cagcagttca acagcacgat ccgcgtggtc agcaccctcc ccatcgcgca ccaggactgg 960
ctgaggggca aggagttcaa gtgcaaagtc cacaacaagg cactcccggc ccccatcgag 1020
aaaaccatct ccaaagccag agggcagccc ctggagccga aggtctacac catgggccct 1080
ccccgggagg agctgagcag caggtcggtc agcctgacct gcatgatcaa cggcttctac 1140
ccttccgaca tctcggtgga gtgggagaag aacgggaagg cagaggacaa ctacaagacc 1200
acgccgaccg tgctggacag cgacggctcc tacttcctct acagcaagct ctcagtgccc 1260
acgagtgagt ggcagcgggg cgacgtcttc acctgctccg tgatgcacga ggccttgcac 1320
aaccactaca cgcagaagtc catctcccgc tctccgggta aa 1362
<210> 3
<211> 237
<212> PRT
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 3
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser
20 25 30
Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser
35 40 45
Ser Glu Ser Val Val Asp Asn Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Glu Ile Ser Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gly Ala Tyr Ala Ser Asn Arg Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys
145 150 155 160
Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp
165 170 175
Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn
180 185 190
Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser
195 200 205
Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly
210 215 220
Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 4
<211> 711
<212> DNA
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 4
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgccg acgtcgtgat gacccagact ccatctcccg tgtctgcagc tgtgggaggc 120
acagtcacca tcagttgcca gtccagtgag agtgttgttg ataacgacta tttatcctgg 180
tatcagcaga aaccagggca gcctcccaag gtcctgatct acgaaatttc taaactggca 240
tctggggtcc catcacggtt cagcggcagt ggatctggga cacagttcac tctcaccatc 300
agcggcgtgc agtgtgacga tgctgccact tactactgtg caggcgctta tgctagcaat 360
agaagggctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaag gtgatccagt tgcacctact 420
gtcctcatct tcccaccagc tgctgatcag gtggcaactg gaacagtcac catcgtgtgt 480
gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540
acaactggca tcgagaacag taaaacaccg cagaattctg cagattgtac ctacaacctc 600
agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660
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<210> 5
<211> 454
<212> PRT
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 5
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1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn
35 40 45
Ser Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Thr Ile Gly Lys Ser Gly Thr Thr Tyr Phe Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Met Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Asp Phe Ala Val Asp Val Gly Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
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Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
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Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
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Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
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<210> 6
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<210> 7
<211> 237
<212> PRT
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 7
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1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser
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<211> 711
<212> DNA
<213> 程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1)
<400> 8
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Claims (10)

1.一种抗PD-1单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种如权利要求1所述的抗PD-1单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种抗PD-1单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一种如权利要求3所述的抗PD-1单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
5.药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的抗PD-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包括抗PD-1药物。
7.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的编码DNA，用于表达如权利要求1所述的抗PD-1单克隆抗体；或包含如权利要求4所述的编码DNA，用于表达如权利要求3所述的抗PD-1单克隆抗体。
8.一种原核或真核宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的表达载体。
9.一种如权利要求1或3所述的抗PD-1单克隆抗体在制备治疗或预防人病毒感染、肿瘤及炎性疾病药物中的用途。
10.一种用于检测PD-1抗原或sPD-1抗原的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或3所述的抗PD-1单克隆抗体。
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