CN111217905A - 一种重组兔单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种重组兔单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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CN111217905A CN201911129257.6A CN201911129257A CN111217905A CN 111217905 A CN111217905 A CN 111217905A CN 201911129257 A CN201911129257 A CN 201911129257A CN 111217905 A CN111217905 A CN 111217905A
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Abstract

本发明公开了一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比，单克隆抗体制备效率更高，操作更便捷，实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性抗原的突出特点。

Description

一种重组兔单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明属于单克隆抗体制备领域，具体涉及一种重组兔单克隆抗体的制备方法。
背景技术
抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，它是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，抗体在疾病的诊断、免疫防治及基础研究中发挥作重要作用，抗体分为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景，被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病；
中国发明专利CN1763217A公开了一种单克隆抗体的制备方法及其应用，该发明用杀菌后的金色葡萄球菌免疫BALB/c小鼠，再提取免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体，该发明通过杂交瘤细胞进一步进行获得单克隆抗体的制备效率较低高，产量不高，同时通过小鼠免疫系筛选的单克隆抗体单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比单克隆抗体制备效率更高，操作便捷，同时用实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性的抗原。
本发明要解决的技术问题：
1、传统制备单克隆抗体，大多采用小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，进行融合培养杂交瘤细胞，进一步获得单克隆抗体，但得到的单克隆抗体的单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。
2、传统制备单克隆抗体的方法为通过免疫增强的小鼠的B细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行抗体检测后，进行克隆化，得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中，培养一周提取腹水中的单克隆抗体，该方法获得的单克隆抗体有被动物病毒污染的可能，同时单克隆抗体制备效率低，操作复杂。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种重组兔单克隆抗体的制备方法，包括以下方法：
(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；
(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；
(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；
(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；
(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。
进一步，步骤(1)所述的兔为3公斤健康新西兰大自兔，所述的重组蛋白的浓度为1mg/ml；所述的免疫增强的兔的培养过程如下：将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的兔。
进一步，步骤(2)所述的兔B细胞提取过程如下：对免疫增强的兔进行耳缘静脉采血10ml，使用兔淋巴细胞分离液进行处理，获得兔外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的兔CD19蛋白，得到高纯度的兔B细胞；所述的混合抗体基因片段的制取方法如下：通过Trizol法提取兔B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得混合抗体基因片段。
进一步，步骤(3)所述的噬菌体文库建立方法如下：用特异性引物分别扩增混合抗体基因片段抗体VH和VL，过胶回收330bp的片段，使用Over lapping PCR连接成ScFv，然后经Sfi1酶切后，连接pComb3xss载体，连接产物纯化以后电转XL1-Blue感受态细胞，形成噬菌体抗体文库；所述的包装方法如下：将抗体文库菌扩增至OD600＝0.5，然后加入野生型辅助噬菌体，感染宿主菌，过夜扩增宿主菌，用PEG-NaCl沉淀细菌得到上清液，即可得到抗体文库。
进一步，步骤(4)所述的抗体序列的测定方法如下：将目的抗原包被于固相表面加入抗体文库，用PH＝2.2盐酸洗脱结合的噬菌体，再将噬菌体感染宿主细菌，重复上述步骤三次得到目的抗体，挑取再感染后的单个细菌进行克隆，扩增培养以后加入辅助噬菌体，用Phage-ELISA鉴定与目的抗原结合的特异性，将Phage-ELISA阳性的抗体进行测序，获得抗体序列。
进一步，步骤(5)所述的分析具体为：抗体序列通过IMGT数据库进行分析，用NCBI中Ig-Blast分析抗体序列信息，比较个抗体差异及同源性分析。
进一步，步骤(5)所述的构建表达载体具体为：将抗体片段还原成IgG形式的全抗体，并使用EXPI293系统进行表达。
进一步，步骤(5)所述的鉴定分别为：1)单克隆抗体与抗原结合的特异性鉴定，通过ELISA,WB以及IFA进行鉴定；2)单克隆抗体生物学活性鉴定，为抗体的阻断，中和以及对目的抗原的功能的限制；3)单克隆抗体亲和力鉴定，是抗体结合抗原的动力学参数。
本发明的有益效果：
本发明通过利用实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与传统的利用实验小鼠的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体相比，具有更高的亲和力，识别的抗原表位丰富，可以识别小鼠体内没有免疫原性抗原，同时与传统制备单克隆抗体的方法不同，传统制备单克隆抗体的方法，先对小鼠进行免疫培养，提取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，通过细胞融合制得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞克隆化得到阳性杂交瘤细胞，选用BALB/c小鼠用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后将阳性杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠腹水，提取腹水中的单克隆抗体，而本发明利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比单克隆抗体制备效率更高，操作更便捷，不会被动物体内的病毒污染。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种重组兔单克隆抗体的制备方法,具体步骤如下：
步骤S1：将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的兔；
步骤S2：将步骤S1获得的免疫增强的兔进行耳缘静脉采血10ml，使用兔淋巴细胞分离液进行处理，获得兔外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的兔CD19蛋白，得到高纯度的兔B细胞，通过Trizol法提取兔B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得第一混合抗体基因片段；
步骤S3：将步骤S2获得第一混合抗体基因片段通过特异性引物对自身VH和VL进行扩增，过胶回收330bp的片段，得到第一片段，使用Over lapping PCR将第一片段连接成ScFv，然后经Sfi1酶切后，连接pComb3xss载体，得到第一连接产物，将第一连接产物纯化以后电转XL1-Blue感受态细胞，形成第一噬菌体抗体文库，将抗体文库菌扩增至OD600＝0.5，然后加入野生型辅助噬菌体，感染宿主菌，过夜扩增宿主菌，用PEG-NaCl沉淀细菌得到上清液，即可得到第二抗体文库；
步骤S4：将目的抗原包被于固相表面加入步骤S3形成的第二抗体文库，用PH＝2.2盐酸洗脱结合的噬菌体，再将噬菌体感染宿主细菌，重复上述步骤三次得到目的抗体，挑取再感染后的单个细菌进行克隆，扩增培养以后加入辅助噬菌体，用Phage-ELISA鉴定与目的抗原结合的特异性，将Phage-ELISA阳性的抗体进行测序，获得第一抗体序列；
步骤S5：将步骤S4获得的第一抗体序列通过IMGT数据库进行分析，用NCBI中Ig-Blast分析抗体序列信息，比较个抗体差异及同源性分析，去除重复序列，筛选不同序列抗体进行表达并进行鉴定。
对比例1
本对比例与实施列1相比未使用兔进行抗体培养，而是使用小鼠进行抗体培养具体步骤如下
步骤S1：将小鼠背部部分毛发剪下，用酒精擦拭小鼠的背部，将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至小鼠背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至小鼠背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的小鼠；
步骤S2：将步骤S1获得的免疫增强的小鼠进行耳缘静脉采血10ml，使用小鼠淋巴细胞分离液进行处理，获得小鼠外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的小鼠CD19蛋白，得到高纯度的小鼠B细胞，通过Trizol法提取小鼠B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得第二混合抗体基因片段；
步骤S3：将步骤S2获得第二混合抗体基因片段通过特异性引物对自身VH和VL进行扩增，过胶回收330bp的片段，得到第二片段，使用Over lapping PCR将第二片段连接成ScFv，然后经Sfi1酶切后，连接pComb3xss载体，得到第二连接产物，将第二连接产物纯化以后电转XL1-Blue感受态细胞，形成第三噬菌体抗体文库，将抗体文库菌扩增至OD600＝0.5，然后加入野生型辅助噬菌体，感染宿主菌，过夜扩增宿主菌，用PEG-NaCl沉淀细菌得到上清液，即可得到第四抗体文库；
步骤S4：将目的抗原包被于固相表面加入步骤S3形成的第四抗体文库，用PH＝2.2盐酸洗脱结合的噬菌体，再将噬菌体感染宿主细菌，重复上述步骤三次得到目的抗体，挑取再感染后的单个细菌进行克隆，扩增培养以后加入辅助噬菌体，用Phage-ELISA鉴定与目的抗原结合的特异性，将Phage-ELISA阳性的抗体进行测序，获得第二抗体序列；
步骤S5：将步骤S4获得的第二抗体序列通过IMGT数据库进行分析，用NCBI中Ig-Blast分析抗体序列信息，比较个抗体差异及同源性分析，去除重复序列，筛选不同序列抗体进行表达并进行鉴定。
对比例2
本对比例为常用的小鼠单克隆抗体的制备方法，具体方法如下：
步骤S1：将小鼠背部部分毛发剪下，用酒精擦拭小鼠的背部，将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至小鼠背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至小鼠背部皮下，进行免疫增强21天，提取小鼠脾细胞；
步骤S2：将小鼠骨髓瘤细胞和步骤S1获得的小鼠脾细胞按1:10的比例加入50ml的离心管中进行混合，加入无血清不完全培养液进行洗涤，将离心管放入离心机中，在转速为1200rpm的条件下，进行离心8min弃上清液，弹击离心管底部，使细胞沉淀物略松散，加入1ml45％PEG溶液，进行摇晃，并在37℃的水中进行水域保温90s，将离心管加入离心机中，在转速为800rpm的条件下，进行离心6min弃上清液，用含20％小鼠血清HAT选择培养液重悬，将重悬的细胞加入96孔板内，在温度为37℃，CO2含量为5％的条件下进行培养，取长至孔底面积十分之一的细胞上清液进行检测，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的阳性孔，再次进行培养，得到第一阳性杂交瘤细胞；
步骤S3：选用BALB/c小鼠用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后将步骤S2获得的第一阳性杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠腹水，提取腹水中的单克隆抗体。
对比例3
本对比例为常用的兔单克隆抗体的制备方法，具体方法如下：
步骤S1：将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，提取兔脾细胞；
步骤S2：将兔骨髓瘤细胞和步骤S1获得的兔脾细胞按1:10的比例加入50ml的离心管中进行混合，加入无血清不完全培养液进行洗涤，将离心管放入离心机中，在转速为1200rpm的条件下，进行离心8min弃上清液，弹击离心管底部，使细胞沉淀物略松散，加入1ml45％PEG溶液，进行摇晃，并在37℃的水中进行水域保温90s，将离心管加入离心机中，在转速为800rpm的条件下，进行离心6min弃上清液，用含20％兔血清HAT选择培养液重悬，将重悬的细胞加入96孔板内，在温度为37℃，CO2含量为5％的条件下进行培养，取长至孔底面积十分之一的细胞上清液进行检测，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的阳性孔，再次进行培养，得到第二阳性杂交瘤细胞；
步骤S3：将步骤S2获得的第二阳性杂交瘤细胞微囊化，将微囊置于培养液中进行悬浮培养，从培养液中分离微囊，冲洗后打开微囊，将微囊内的溶液加入离心管中，进行离心获得单克隆抗体。
对实施例1和对比例1-3进行单克隆抗体与抗原结合的特异性鉴定、生物学活性鉴定、亲和力鉴定、没有免疫原性抗原识别检测，检测结果如下表1所示；
与抗原结合的特异性:将多糖加入0.2mol/L,pH8.0的PB溶液中，调整多糖的浓度为120ug/ml，用100℃水域处理1h，停止加热，至温度降为37℃时与6％醛化含抗原的红细胞等量混合，在温度为37℃的条件下进行搅拌45min，在转速为2000rpm的条件下离心10min，以0.01mol/L，pH为7.2的PBS洗涤4次，配置成致敏血球，将实施例1和对比例1-3制备的单克隆抗体分别加入V型微量血凝管孔中，再加入致敏血球，在振荡器上均匀30s，在温度为37℃的条件下静置60min观察红细胞是否出现凝集现象。
生物学活性鉴定：将实施例1和对比例1-3制备的单克隆抗体与活的治病微生物混合，将混合物加入细胞组织中进行细胞培养，观察细胞是否发生病变。
亲和力鉴定：将实施例1和对比例1-3制备的单克隆抗体与单价抗原加入O.85％的氯化钠溶液中，在温度为37℃的条件下进行温育，反应达到平衡后用50％的饱和硫酸铵溶液进行Farr氏沉淀，将结合与游离抗原分离，分别测定后，再以与平衡透析时相同的方法计算亲和力常数。
没有免疫原性抗原识别检测：将实施例1和对比例1-3制备的单克隆抗体和没有免疫原性的抗原加入含有电解质的同一块琼脂糖凝胶板的对应孔中，将琼脂糖凝胶板放入浸有0.5％石炭酸纱布的湿盒内，置于37℃的温箱中24h，观察琼脂糖凝胶板内是否出现白色沉淀线。
表1
Figure BDA0002277827320000101
由上表1可以看出实施例1和对比例1-3制备的单克隆抗体均使红细胞出现凝集现象，但实施例1的凝集程度较大，对比例1-3的凝集程度较小，表明实施例1制备的单克隆抗体与抗原结合的特异性最好；实施例1制备的单克隆抗体中的细胞未发生病变，而对比例1-3制备的单克隆抗体中的少量细胞发生病变，表明实施例1制备的单克隆抗体很好的抑制了抗原，保证了细胞正常生长；实施例1的亲和数值远远大于对比例1-3，表明实施例1制备的单克隆抗体的亲和力最好，且当亲和数值大于1×108时为高亲和力抗体；实施例1和对比例3制备的单克隆抗体均与没有免疫原性的抗原发生了沉淀，出现了白色沉淀线，而对比例1-2未出现白色沉淀线，表明实施例1和对比例3制备的单克隆抗体可以很好的识别没有免疫原性的抗原。所以本发明一种重组兔单克隆抗体的制备方法，制备的单克隆抗体具有更高的亲和力，识别的抗原表位丰富，可以识别小鼠体内没有免疫原性抗原，且该方法制备效率更高，操作更便捷。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；
(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；
(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；
(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；
(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的兔为3公斤健康新西兰大自兔，所述的重组蛋白的浓度为1mg/ml；所述的免疫增强的兔的培养过程如下：将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的兔。
3.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的兔B细胞提取过程如下：对免疫增强的兔进行耳缘静脉采血10ml，使用兔淋巴细胞分离液进行处理，获得兔外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的兔CD19蛋白，得到高纯度的兔B细胞；所述的混合抗体基因片段的制取方法如下：通过Trizol法提取兔B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得混合抗体基因片段。
4.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的噬菌体文库建立方法如下：用特异性引物分别扩增混合抗体基因片段抗体VH和VL，过胶回收330bp的片段，使用Overlapping PCR连接成ScFv，然后经Sfi1酶切后，连接pComb3xss载体，连接产物纯化以后电转XL1-Blue感受态细胞，形成噬菌体抗体文库；所述的包装方法如下：将抗体文库菌扩增至OD600＝0.5，然后加入野生型辅助噬菌体，感染宿主菌，过夜扩增宿主菌，用PEG-NaCl沉淀细菌得到上清液，即可得到抗体文库。
5.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的抗体序列的测定方法如下：将目的抗原包被于固相表面加入抗体文库，用PH＝2.2盐酸洗脱结合的噬菌体，再将噬菌体感染宿主细菌，重复上述步骤三次得到目的抗体，挑取再感染后的单个细菌进行克隆，扩增培养以后加入辅助噬菌体，用Phage-ELISA鉴定与目的抗原结合的特异性，将Phage-ELISA阳性的抗体进行测序，获得抗体序列。
6.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的分析方法为：抗体序列通过IMGT数据库进行分析，用NCBI中Ig-Blast分析抗体序列信息，比较个抗体差异及同源性分析。
7.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的构建表达载体方法为：将抗体片段还原成IgG形式的全抗体，并使用EXPI293系统进行表达。
8.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的鉴定分别为：1)单克隆抗体与抗原结合的特异性鉴定，通过ELISA,WB以及IFA进行鉴定；2)单克隆抗体生物学活性鉴定，为抗体的阻断，中和以及对目的抗原的功能的限制；3)单克隆抗体亲和力鉴定，是抗体结合抗原的动力学参数。
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