CN105017422A - 一种抗cd3/抗cd19双特异性抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗CD3/抗CD19双特异性抗体及其应用。它包含全人源抗CD3单链抗体和全人源抗CD19单链抗体的结合结构域,全人源抗CD3单链抗体的重链、轻链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO:7-8所示,全人源抗CD19单链抗体的重链、轻链可变区氨基酸序列为SEQ?ID?NO:15-16所示。本发明的抗CD3/抗CD19双特异性抗体对人CD3和CD19分子具有高亲和力,具有介导激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。且抗体分子的重链和轻链是全人源,避免很多副作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗体药物开发和生产技术领域。具体地,本发明涉及抗CD3/抗CD19双特异性抗体及其应用。
背景技术
B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶性肿瘤。传统的放化疗虽然有一定疗效,但没有选择性,对正常组织的损伤很大。近年来,生物治疗方法广泛应用于肿瘤治疗,尤其是单克隆抗体,如rituximab,并因其特异靶向性、高亲和性而收到了良好效果。单抗通过Fc段与效应细胞表面活性受体FcγRⅠ/FcγRⅢ结合,从而介导杀伤作用,但具有免疫杀伤作用的T细胞因为表面缺乏上述受体而不能被有效介导,从而削弱了机体对肿瘤的免疫效应。
双特异性抗体(bispecific T cell engagers,BiTEs)是一种以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体,它具有两个抗原结合臂,可以同时和T细胞及靶细胞结合,并激活细胞毒性T细胞杀伤病变细胞。和其它双特异性抗体相比,BiTEs的分子柔韧性更好,能更好地促进CD3复合体和肿瘤靶标的连接,并且它不受T细胞受体和靶细胞上MHCⅠ类分子的约束,不需要共刺激分子的参与,是一种极具应用潜力的抗体形式。
BiTEs采用单链抗体技术,将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上,其基本的形式是VL1-linker-VH1-linker-VH2-linker-VL2。BiTEs具有两个抗原结合部位,可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合,从而有效地激活静止的T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。由于其独特的结构形式和特性,BiTEs可以用于克服其它双特异性抗体在肿瘤治疗上的缺陷。双特异性抗体是通过鼠源性单克隆抗体的化学偶联、双杂交瘤和基因工程3个发展阶段所制备的一种非天然抗体或抗体杂合分子,随着生物技术的日益进步,国内外双特异性抗体的相关研究日趋深入,其在临床治疗中作为一种新的二次导向系统具有潜在的应用价值。
非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin,s lympho-ma,NHL)是一组起源于淋巴组织并弥漫全身的恶性肿瘤,其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位。大部分NHL来源于B淋巴细胞(B-NHL)。CD3是T淋巴细胞表面特异分子,通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞,而CD19是B淋巴细胞表面特异标志,分子量为95×103的穿膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,与B细胞活化和信号的转导有关,在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活的B淋巴细胞中表达,在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其他组织中均无表达。大多数NHL起源于B淋巴细胞,95%以上的B细胞NHL表达CD19抗原,且CD19抗原比较暴露,人体血清中也无游离的CD19存在,因此CD19可作为治疗B细胞淋巴瘤的靶点。单抗应用于肿瘤治疗由于其分子量大、半衰期长,很难穿透肿瘤细胞发挥杀伤作用。而微型双特异性抗体具有分子量小、半衰期短且具有较好的肿瘤细胞穿透性,本身细胞毒作用低。T细胞表面抗原CD3和肿瘤细胞表面相关表达抗原的双特异性微型抗体介导的抗肿瘤治疗,以及体外致敏的树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导的相对特异的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)对肿瘤的杀伤等,被认为是传统的手术治疗、放化疗方法之外最有希望清除残余肿瘤细胞和微小转移病灶从而根治肿瘤的辅助治疗措施,许多动物实验和临床试验已经证实了该生物治疗措施的疗效。
本发明的抗CD3/抗CD19双特异性抗体是在抗CD3scFv和抗CD19scFv载体基础上构建而成。CD19是较为理想的肿瘤相关抗原,它表达于除干细胞以外的B淋巴细胞发育的各个阶段,因此B细胞来源的恶性细胞均有CD19表达,CD3是T淋巴细胞表面特异分子。因此本发明提供了一种新型抗CD3/抗CD19双特异性抗体的构建,以期能够获得比已有抗CD3/抗CD19双特异性抗体家族的其他抗体更好的通过桥接作用介导T细胞高效特异杀伤B淋巴细胞来源的肿瘤细胞。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库,从中筛选获得了全人源抗CD3单链抗体和抗CD19单链抗体。
本发明的技术方案是:一种抗CD3/抗CD19双特异性抗体,它包含全人源抗CD3单链抗体和全人源抗CD19单链抗体的结合结构域,其中相应的重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)从N-未端到C-未端按照如下顺序排列:
VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)或
VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)。
本发明公开的全人源抗CD3单链抗体,重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:7所示,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示。
本发明公开的全人源抗CD19单链抗体,重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:15所示,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:16所示。
本发明的抗CD3/抗CD19双特异性抗体通过构建真核或原核表达载体,转化入相应的真核或原核细胞内进行重组表达。
本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞,为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌,中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小仓鼠肾细胞(BHK)、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞。
本发明抗CD3/抗CD19双特异性抗体的制备方法:将上述构建的表达载体转化至上述的宿主细胞中,在适合所述全人源单克隆抗体表达的条件下培养转有上述表达载体的宿主细胞,对培养物进行分离纯化获得上述的双特异性抗体。
本发明通过试验证明:该抗体可以应用于治疗肿瘤的治疗药物的制备中。上述的肿瘤可以为:非霍奇金淋巴瘤、B细胞白血病或霍奇金淋巴瘤等。同时通过现有的研究推测:该抗体还有望应用于自身免疫性疾病的治疗药物的制备中。
本发明的有益效果是:本发明的抗CD3/抗CD19双特异性抗体对人CD3和CD19分子具有高亲和力,具有介导激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。且抗体分子的重链和轻链是全人源的,尽管嵌合的或人源化的也可以使用,但是用于人体时,全人源的可以避免很多副作用,例如HAMA和HACA反应引起的那些副作用。
附图说明
图1:针对CD3和CD19的单链双特异性抗体的表达和纯化的蛋白质级分的代表性SDS-PAGE分析。其中,泳道1为Marker;泳道2为CHO细胞表达上清;泳道3为二步纯化样品1;泳道4为二步纯化样品2。
图2A、B、C、E、F、G:FACS分析抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体与Nalm6细胞和Jurkat细胞结合活性。应用流式细胞仪进行间接免疫荧光测定。其中,图2A为Nalm6细胞在PBS中孵育的阴性对照,图2B为Nalm6细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体的结合结果,图2C为Nalm6细胞与HIT19a单抗的结合结果(阳性对照),图2E为Jurkat细胞在PBS中孵育的阴性对照,图2F为Jurkat细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体的结合结果,图2G为Jurkat细胞与HIT3a单抗的结合结果(阳性对照)。结果表明抗CD3/抗CD19双特异性抗体能与Nalm6和Jurkat细胞特异性结合,说明该双功能抗体具有与CD3和CD19靶抗原结合能力。
图3D、H:FACS分析抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体与HIT3a、HIT19a竞争结合活性。单抗HIT19a和HIT3a分别与Nalm6细胞和Jurkat细胞单独温育,细胞结合阳性率为接近100%,而抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体与上述单抗混合,再与Nalm6细胞或Jurkat细胞共同温育,单抗HIT3a、HIT19a与Nalm6细胞和Jurkat细胞结合阳性率仅有63.3%和51.1%(图2C、图2G)。图3D为Nalm6细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体和HIT19a单抗的竞争性结合结果,图3H为Nalm6细胞与抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体和HIT3a单抗的竞争性结合结果。结果表明抗CD3/抗CD19双特异性抗体能与单抗HIT3a、HIT19a竞争性特异性结合Nalm6和Jurkat细胞,进一步说明该双功能抗体具有与CD3和CD19靶抗原的结合能力。
图4A-D:抗CD3/抗CD19双功能抗体介导的体外杀伤活性测定。在双功能抗体存在的情况下,激活的T淋巴细胞能够特异性杀伤Nalm6细胞,杀伤百分率明显高于对照各组(P<0.05)。其中:
图4A(1)显示同效靶比的T细胞被500、50和5ng/mL的双功能抗体介导的体外特异性杀伤靶细胞效果对比;图4A(2)显示同效靶比的CD4+T细胞被500、50和5ng/mL的双功能抗体介导的体外特异性杀伤靶细胞效果对比;图4A(3)显示同效靶比的CD8+T细胞被500、50和5ng/mL的双功能抗体介导的体外特异性杀伤靶细胞效果对比。
图4B(1)显示不同效靶比下T细胞被双功能抗体(500ng/mL)以及对照抗体介导的体外特异性杀伤效果对比;图4B(2)显示不同效靶比下CD4+T细胞被双功能抗体(500ng/mL)以及对照抗体介导的体外特异性杀伤效果对比;图4B(3)显示不同效靶比下CD8+T细胞被双功能抗体(500ng/mL)以及对照抗体介导的体外特异性杀伤效果对比。
图4C显示双功能抗体介导T细胞在不同靶效比下体外杀伤K562细胞效果对比。
图4D(1)显示双功能抗体介导T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞杀伤Daudi细胞的效果对比,;图4D(2)显示双功能抗体介导T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞杀伤Ramous细胞的效果对比。图中的1为PBS,2为抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体,3为抗CD3/抗CD19的scFv+,4为抗CD3/抗PGP抗体。
结果表明,随着抗体浓度的增高,效靶比的增高,激活的T淋巴细胞对靶细胞的杀伤百分率明显增强,对于T细胞亚群,以CD8+T细胞的杀伤作用最强,而以CD19表达阴性的K562细胞作为靶细胞时,双功能抗体相对于对照组的杀伤百分率差异无统计学意义(P>0.05),对于CD19表达阳性的另外2种细胞,双功能抗体都有明显的介导效应。这些结果提示抗CD3/抗CD19双功能抗体具有特异性介导激活的T淋巴细胞杀伤CD19表达阳性的肿瘤细胞的作用,且杀伤作用的强弱显示出与效靶比和剂量的关系。
图5:激活的T淋巴细胞分泌IL-2的测定。先用标准品做出IL-2的标准曲线,根据实验孔测得的A值代入标准曲线,得到IL-2释放量得绝对值,以单独培养的T淋巴细胞IL-2释放量作对照,其余各组表达量与对照的比值即为相对表达量,可见双功能抗体组IL-2的释放较对照组明显增高(P<0.05),其余各组差异无统计学意义(P>0.05),说明IL-2对T细胞的活化起了非常重要的作用。图中的1为抗CD3/抗PGP抗体,2为抗CD3/抗CD19的scFv+,3为抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体,4为PBS。
图6:Real-time PCR法测定激活的T淋巴细胞IL-3、IFN-γ和TNF-α的分泌。图中的1为PBS,2为抗CD3/抗CD19的单链双特异性抗体,3为抗CD3/抗CD19的scFv+,4为抗CD3/抗PGP抗体。
双功能抗体抗CD3/抗CD19组较对照组IL-3、IFN-γ和TNF-α的释放显著升高(P<0.05),而抗CD3scFv+抗CD19scFv组和非相关抗体抗CD3/抗PGP组与PBS组差异无统计学意义(P>0.05),这些与体外杀伤结果相符,说明双功能抗体介导效果明显。
具体实施方式
现在通过参考以下实施例对本发明进行进一步的说明,这些实施例仅仅是说明性的,不能理解为对本发明范围的限制。
实施例1:抗人CD3和CD19单链抗体的获得
1、cDNA的制备
收集肝癌、肾癌和黑色素瘤以及健康人共50人的外周血各10毫升混合,肝素钠抗凝并采用密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC),用CD3或CD19抗原进行体外致敏。PBMC体外致敏后,按4×106PBMC加入1ml EBV培养上清,于37℃孵育3h,吸弃上清,加入含100ml/L FCS的RPMI1640完全培养基,培养2周后,换用含200ml/L NBS的RPMI1640完全培养基。转化细胞培养上清的筛选采用间接ELISA法,用CD3或CD19作为肿瘤细胞抗原固相板,收集的B细胞培养上清作为一抗,HRP标记的羊抗人IgG/M(HRP-GAH-IgG/M)为二抗。将阳性孔的细胞扩大培养至106~107个细胞。然后用Invitrogen公司的Trizol试剂抽提转化后B细胞总RNA,并逆转录合成cDNA第1链,以此为模板扩增抗体可变区基因并连接成scFv,继而克隆入载体FUSE5构建噬菌体单链抗体库。
2、VH和VL基因的PCR扩增与连接。
按文献(Cai X H,GarenA.PNAS,1995.92(14):6537-6541)设计合成扩增人抗体基因的引物,可选引物见下表1。
表1目的基因片段PCR引物序列
以cDNA第一链为模板,进行PCR扩增VH和VL基因。并通过编码连接肽(Gly4Ser)3使VH和VL基因连成ScFv基因。
3、初级噬菌体抗体库的构建
以VH和VL基因片段为模板,按照正常人各亚群的使用频率,将扩增产物以适当比例混合,通过重叠PCR拼接,扩增ScFv基因,克隆入pComb3XSS载体中,电穿孔转化XL1-Blue,计数克隆测定库容为107,细菌增殖后经辅助病毒超感染获噬菌体抗体库,沉淀浓缩后测定滴度为1013CFU/ml。
4、构建大容量噬菌体抗体库及淘选
从初级噬菌体抗体库中取出5×1012CFU的噬菌体颗粒以高比例(MOI=100/l)感染大肠杆菌BS1365,通过loxp-ere介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻/重链随机交换配对,所获噬菌体上清再低比例(MOI≤1)感染XL1-Blue菌,获得库容为1×1010的大容量人源噬菌体抗体库。以CD3/CD19为抗原,对噬菌体单链抗体库进行了4轮亲和筛选过程,测定投入和产出的噬菌体的数目,产出/投入比增加了约500倍,说明特异性结合CD3/CD19蛋白的ScFv得到了有效富集。
5、筛选结合CD3/CD19的阳性噬菌体抗体单克隆
每轮随机挑选500个左右分隔良好的单克隆,挑取3-4轮淘选之后产出的共1500克隆进行噬菌体单克隆挽救,噬菌体抗体经ELISA检测,得到特异性结合CD3/CD19的噬菌体单链抗体克隆。将经过ELISA鉴定阳性的噬菌体单克隆抗体,利用直标FITC-AntiM13,通过流式检测其与CD3/CD19结合,得到特异性结合CD3/CD19的噬菌体单链抗体克隆,对获得的阳性克隆进行序列测序,并对其进一步分析氨基酸序列和CDR区。具体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-16所示。
实施例2:针对CD3和CD19的单链双特异性抗体的表达和纯化
双特异性单链抗体构建体包含人CD3和人CD19的特异结合结构域,其中相应的可支重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N-末端到C-未端按如下顺序排列:VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)或VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-L(CD19)。
1、抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的表达。选取含有重组质粒的大肠杆菌单菌落,接种到含氨苄青霉素(0.1mg/mL)的2YT培养基中(1.6%胰蛋白胨,1%酵母提取物,0.5%NaCl),37℃振荡培养8h后,按1∶2的比例转接于含氨苄青霉素(0.1mg/mL)的Ap5培养基中(0.6g/L酵母提取物,11g/L酸水解酪蛋白,1.5g/L葡萄糖,1.2g/L NaCl,3.73g/L KCl,1.07g/L NH4Cl,0.19g/L MgSO4,0.12moL/L三乙醇胺,pH7.4),28℃振荡培养28h,4℃,2500×g,离心30min,收集菌体。冻融菌体沉淀后,加入细菌外周质腔提取液(三羟甲基氨基甲烷25mmol/L,乙二胺四乙酸1mmol/L,苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L,质量浓度为200g/L的蔗糖,NaCl200mmol/L,pH=7.5),4℃震荡裂解1h,13000×g,4℃离心30min,收集上清液即表达产物的粗提物。
2、抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的纯化和鉴定。上清液经PBS透析过夜,0.45μm微孔滤膜过滤后,系统和软件用于层析。用平衡缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液,pH7.5,0.4M NaCl)平衡柱子,细胞培养上清液(500ml)以3ml/min的流速加样于柱子(10ml)上。用缓冲液A2洗涤柱子以除去未结合的样品。按如下步骤用缓冲液B2(20mM磷酸钠缓冲液,pH7.5,0.4MNaCl、0.5M咪唑)2步梯度洗脱结合蛋白质:
步骤1:6倍柱体积的20%缓冲液B2;
步骤2:6倍柱体积的100%缓冲液B2。
合并步骤2的洗脱,蛋白质级分用于进一步纯化。
在PBS平衡的Sephadex S200HiPrep column上实施凝胶过滤层析。用标准SDS-PAGE和免疫印迹法检测洗脱的蛋白质样品(流速lml/min)。在纯化之前,为进行分子量测定而定标柱子。用蛋白质测定染料和IgG作为标准蛋白质来测定蛋白质浓度。
用IMAC的两步纯化方法和凝胶过滤分离单链双特异性抗体。通过在PBS中凝胶过滤测定在天然条件下主要产物分子量大约为59KDa(如图1所示)。此分子量对应于单链双特异性抗体。
在还原条件下用预制12%SDS-PAGE对纯化的双特异性蛋白质进行分析,凝胶用考马斯亮蓝染色。通过SDS-PAGE测定,所分离蛋白质的纯度>95%。
实施例3:间接免疫荧光法测定抗CD3/抗CD19双特异性抗体的结合活性
为了测试构建体关于CD19和CD3结合能力的功能,进行流式细胞术分析(FACS)。为此,使用CD19阳性Nalm6细胞(人B细胞前体白血病)和CD3阳性Jurkat细胞(人T细胞白血病)。200,000个Nalm6细胞和200,000个Jurkat细胞各自与50ul的纯化抗CD3/抗CD19双功能抗体在冰上孵育30min,300×g,4℃离心5min,弃上清液,冷PBS洗细胞,重复3次。细胞再与鼠抗His-tag单克隆抗体(1∶1000稀释)4℃共同温育1h,该抗体通过构建体的C未端组氨酸标签特异结合与细胞结合的构建体,300×g,4℃离心5min,弃上清液,PBS洗细胞,重复3次,除去未结合的鼠五组氨酸抗体。将细胞重悬于20μLFITC标记的兔抗鼠IgG多抗,4℃共同温育30min,300×g,4℃离心5min,弃上清液,PBS洗细胞,重复2次,FACS测定荧光强度。以单抗HIT3a和HIT19a作为阳性对照。用新鲜培养基代替培养物上清液作为阴性对照。检测结果如图2所示,从图中可以看出,抗CD3/抗CD19双特异性抗体能与Nalm6和Jurkat细胞特异性结合,说明该双功能抗体具有与CD3和CD19靶抗原结合能力。
实施例4:抗CD3/抗CD19双特异性抗体的竞争性免疫荧光抑制实验
取一定浓度的纯化抗CD3/抗CD19双功能抗体分别与单抗HIT19a或单抗HIT3a混合,再与1×106Nalm6细胞或Jurkat细胞4℃共同温育1h,300×g,4℃离心5min,弃上清液,PBS洗细胞,重复3次。20μL FITC标记的兔抗鼠IgG多抗,4℃共同温育30min,300×g,4℃离心5min,弃上清液,PBS洗细胞,重复2次,FACS测定荧光强度。通过基于荧光染料释放的细胞毒性测定法来测定具有重排的VH和VL结构域的双特异性抗体的细胞毒活性。
试验结果如图3所示,从图中可以看出:抗CD3/抗CD19双特异性抗体能与单抗HIT3a、HIT19a竞争性特异性结合Nalm6和Jurkat细胞,进一步说明该双功能抗体具有与CD3和CD19靶抗原的结合能力。
实施例5:抗CD3/抗CD19双功能抗体介导的体外杀伤活性测定
外周血淋巴细胞(peripheralblood lymphocyte,PBL)的制备:健康成人富含血小板白膜(天津市血液中心提供)经密度梯度离心法(Ficoll-Hypaque)分离后得到单个核细胞,在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中,于37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养2h后,保留非贴壁的外周血淋巴细胞,调整其细胞密度为3×106/mL,加入重组人IL-2(山东金泰生物工程有限公司)至终浓度为50U/mL,继续培养72h。
分选CD4+和CD8+T淋巴细胞:300×g离心收集培养了72h的PBL,PBS洗2遍,PBS重悬细胞调整密度为每毫升1×108个细胞,每毫升细胞加入10μL直标抗CD3-APC,抗CD4-FITC,抗CD8-PE IgG单抗4℃温育1h,灭菌300目尼龙布过滤后,流式细胞仪分选CD4+、CD8+T细胞。将靶细胞CD19+的Nalm6细胞培养至对数生长期后,收获细胞。
接种靶细胞(Nalm6)和效应细胞(CD4+T细胞或CD8+T细胞)到96孔板:调整靶细胞密度为每毫升1×106个,加入终浓度为10μmol/L的Calcein-AM的RPMI1640培养基温育细胞1h后,按照每孔加入50μL细胞悬液,浓度为每毫升2×105个细胞,加入96孔板。效应细胞按照效靶比25∶1、12.5∶1、6∶1和3∶1分别加入活化的T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞体积共50μL,并且设立分组,加入不同浓度的(500、50和5ng/mL)双功能抗体以及对照抗体,每种实验孔设3个复孔,同时设立靶细胞自发释放和最大释放对照组。
抗体浓度与效靶比分组:(1)T细胞(CD4+T细胞或CD8+T细胞)+PBS+Nalm6细胞;(2)T细胞(CD4+T细胞或CD8+T细胞)+抗CD3/抗CD19双功能抗体+Nalm6细胞;(3)T细胞(CD4+T细胞或CD8+T细胞)+T+抗CD3scFv+抗CD19scFv+Nalm6细胞;(4)T细胞(CD4+T细胞或CD8+T细胞)+抗CD3/抗PGP双功能抗体+Nalm6细胞;(5)Nalm6细胞自发释放,即Nalm6细胞+50μL1640培养基;(6)Nalm6细胞最大释放,即收集上清液前45min加入终浓度为2%TritonX-100于37℃,CO2体积分数为5%的条件下温育45min。
共4个效靶比,3个浓度梯度,反应体系共100μL;其中抗CD3scFv+抗CD19scFv为抗CD-3scFv和抗CD19scFv的混合物,抗CD3/抗PGP双功能抗体为非相关抗体对照。因为K562细胞不表达CD19,以其为非相关靶细胞,设T细胞+PBS+K562细胞、T细胞+抗CD3/抗CD19双功能抗体+K562细胞为对照组,观察双功能抗体对CD19表达阴性的K562细胞是否有介导杀伤作用,双功能抗体的浓度为500ng/mL,效靶比为25∶1。
以Daudi和Ramous细胞为靶细胞,双功能抗体及对照抗体均取500ng/mL,观察其在效靶比25∶1下,能否特异性介导T细胞或CD4+T细胞或CD8+T细胞的杀伤作用。加样后250×g离心4min,使效应细胞和靶细胞充分接触。在37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养4h后,离心300×g,5min,各组分别取上清液80μL,用Fluoroskan Ascent FL(Thermo)荧光酶标仪测定荧光强度,激发波长为485nm,发射波长为535nm。按下式计算特异性杀伤的百分率:
细胞特异杀伤率(%)=(A实验组-A靶细胞自发释放)/(A靶细胞最大释放-A靶细胞自发释放)×100%。
试验结果如图4所示,从图4可以看出:随着抗体浓度的增高,效靶比的增高,激活的T淋巴细胞对靶细胞的杀伤百分率明显增强,对于T细胞亚群,以CD8+T细胞的杀伤作用最强,而以CD19表达阴性的K562细胞作为靶细胞时,双功能抗体相对于对照组的杀伤百分率差异无统计学意义(P>0.05),对于CD19表达阳性的另外2种细胞,双功能抗体都有明显的介导效应。这些结果提示抗CD3/抗CD19双功能抗体具有特异性介导激活的T淋巴细胞杀伤CD19表达阳性的肿瘤细胞的作用,且杀伤作用的强弱显示出与效靶比和剂量的关系。
实施例6:激活的T淋巴细胞释放细胞因子IL-2的测定
ELISA法测定效靶比25∶1,抗体浓度500ng/mL组中各实验孔激活的T细胞释放IL-2的量并比较,同时测定IL-2的标准曲线,按照ELISA试剂盒操作说明完成。
试验结果如图5所示,从图5中可以看出:双功能抗体能够激活的T淋巴细胞分泌IL-2,而IL-2对T细胞的活化可以起到非常重要的作用。
实施例7:细胞因子IL-3、IFN-γ和TNF-α的测定
采用荧光实时定量PCR方法测定并比较细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α的释放,取上述杀伤实验效靶比25∶1,抗体500ng/mL组细胞,PBS洗2遍,按TRIzolReagent总RNA提取试剂盒操作步骤提取细胞总RNA,然后进行逆转录。采用实时定量PCR检测,反应体系20μL,加入2×SYBR Green PCR Master Mix10.0μL,IL-3、IFN-γ、TNF-α及上游引物(10pmol/μL)1.0μL,下游引物(10pmoL/μL)1.0μL,模板cDNA2.0μL,用H2O补足反应体系。反应条件:95℃15s,95℃5s,延伸60℃40s,共计40个循环。并做溶解曲线,以单独培养的T淋巴细胞IL-3、IFN-γ和TNF-α表达量作对照,其余各组表达量与对照的比值即为相对表达量,将CD3活性双特异性单链抗体归于不同的CD3结合模式。
试验结果如图6所示,从图6可以看出:抗CD3/抗CD19双功能抗体能够激活的T淋巴细胞IL-3、IFN-γ和TNF-α的分泌,其介导效果明显。
根据试验结果,综上说明:本发明将新型抗CD3/抗CD19双功能抗体表达载体转化原核表达系统大肠埃希菌,获得高效可溶性表达,方法简单易行,产量达6mg/L以上,利于该抗体的体内外研究和后续应用开发。构建的抗CD3/抗CD19双功能抗体通过FACS检测,其与CD3+Jurkat细胞和CD19+Nalm6细胞均有较高的亲和力,并且体内外实验具有介导激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用,且杀伤作用的强弱呈剂量依赖关系。
Claims (6)
1.一种抗CD3/抗CD19双特异性抗体,它包含全人源抗CD3单链抗体和全人源抗CD19单链抗体的结合结构域,其中相应的重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)从N-未端到C-未端按照如下顺序排列:
VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)或
VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19);
所述全人源抗CD3单链抗体,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示;
所述全人源抗CD19单链抗体,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:15所示,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:16所示。
2.一种含有权利要求1的抗CD3/抗CD19双特异性抗体的表达载体,其特征是,将权利要求1所述的抗CD3/抗CD19双特异性抗体通过构建真核或原核表达载体,转化进相应的真核或原核细胞内进行重组表达。
3.一种抗CD3/抗CD19双特异性抗体的制备方法,其特征是,将权利要求2所述的表达载体转化至宿主细胞中,在适合全人源单克隆抗体表达的条件下培养转有权利要求2所示表达载体的宿主细胞,对培养物进行分离纯化获得上述的双特异性抗体。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征是,所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、中华仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、COS细胞或者小鼠NSO胸腺瘤细胞。
5.权利要求1所述的抗CD3/抗CD19双特异性抗体在制备治疗肿瘤的治疗药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征是,所述肿瘤为非霍奇金淋巴瘤、B细胞白血病或霍奇金淋巴瘤。
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