CN105051066B

CN105051066B - 作为T细胞衔接器的双特异性IgG抗体

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Publication number: CN105051066B
Application number: CN201380061615.9A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·贝特霍尔德·亨德里克·巴克; 彼得·福科·万隆; 敦·洛格滕伯格
Original assignee: Meares Co
Current assignee: Meares Co
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: AU2013324527A1; JP6471095B2; AU2013324527B9; ZA201502835B; IL237945B; HK1211966A1; ES2692951T3; SG11201502451QA; RS57910B1; PL2900694T3; JP2019068803A; CA2889681A1; JP2015532278A; TR201815768T4; IL237945A0; CN105051066A; AU2018204173A1; NZ630563A; EP2900694A1; DK2900694T3

Abstract

本发明提供了人IgG双特异性抗体，其中所述抗体的一条臂与免疫效应细胞上的表位相结合，而另一条臂靶向CLEC12A或其功能等同物。还提供了针对恶性疾病例如MDS、CML或AML的这些抗体的制药用途。

Description

作为T细胞衔接器的双特异性IgG抗体

技术领域

本发明涉及抗体工程领域。特别地，其涉及用于治疗与异常细胞有关之疾病的治疗性(人)抗体的领域。更特别地，其涉及用于治疗肿瘤的双特异性抗体。

背景技术

在实验室中，双特异性抗体已被广泛地用于将免疫效应细胞重新靶向至肿瘤细胞。在这种情况下，一个结合位点针对肿瘤相关抗原(TAA)，而第二抗原针对效应细胞上的触发分子，例如T细胞上的CD3(Kontermann，MABS 2012(4)182-197；Chames和Baty，MABS2009(1)539-547；Moore等，Blood 2011(117)4542-4551)。靶向CD3和肿瘤细胞相关抗原的第一个双特异性抗体具有啮齿类动物性质并且使用杂交的杂交瘤来产生(Liu等1985，PNAS82：8648，Staerz等1986，PNAS83：1453，Lanzavecchia等1987，Eur.J.Imm 17：105)。在这些杂交的杂交瘤中，Ig重链和轻链的重配导致在单特异性和因重链和轻链错配造成的非功能双特异性抗体之大得多的库内产生双特异性功能抗体分子。因为它们的双特异性，这些功能双特异性抗体能够将鼠和人的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)桥接(bridge)到靶细胞并触发细胞毒性作用，从而导致展示出相关抗原的肿瘤细胞裂解。然而，无法实现CD3×TAA双特异性IgG介导的多克隆静息人T细胞对肿瘤细胞裂解的诱导，除非通过添加外源IL-2或抗CD28mAb提供共刺激。这通过杂交大鼠IgG2b/小鼠IgG1CD3×CD19双特异性分子得以例证，所述分子仅在共施用IL-2后才能诱导静息人T淋巴细胞对CD19阳性REH B-ALL肿瘤细胞系的裂解(Haagen等，1995Blood 85：3208)。Zeidler等使用类似的大鼠IgG2b/小鼠IgG2a CD3×Epcam分子证明，可在包含外周血单核细胞(PBMC)和肿瘤细胞两者而不添加外源IL2的混合的细胞培养物中实现双特异性IgG诱导的Epcam阳性肿瘤细胞的裂解(Zeidler等1999J.Immunol.163：1246)。作者声称该抗体的“第三”臂(Fc区)，通过与在PBMC级分中存在的Fcγ受体阳性辅助细胞(accessory cell)相互作用而引起这种效果。特别地，强活化潜力与杂交亚类组合小鼠IgG2a/大鼠IgG2b有关，与其他报道的组合(例如小鼠IgG2a/小鼠IgG1或大鼠IgG2b/小鼠IgG1)相比，所述组合不仅与Fcγ受体阳性辅助细胞结合而且将其活化。这种所谓的triomAb CD3×Epcam双特异性抗体(也称为卡妥索单抗(catumaxomab))，已经在临床上开发并且在欧洲注册用于上皮源性腹部肿瘤的姑息治疗。虽然已经清楚地证明了这种双特异性抗体的临床功效，但是其啮齿类动物性质在重复给药后诱导抗产品免疫应答，因此阻止了这种形式的广泛应用。

已经探究了可替代的CD3×TAA形式来解决与杂交啮齿类动物triomAb形式相关的制造问题和免疫原性问题两者。这样的形式通常是衍生自全长人IgG分子的免疫球蛋白样分子，并且包括以下分子，例如由在macrogenics.com/Platforms-DART.html的Macrogenics万维网开发的双亲和重新靶向(Dual-Affinity Re-Targeting，DART^TM)分子，由Micromet(现为Amgen)开发的双特异性T细胞衔接器(engager)分子(SheridanC，Nat Biotechnol.2012(30)：300-1)，由Abbott开发的双可变结构域-免疫球蛋白(DVD-Ig^TM)分子以及由在affimed.com/tandab-recruit的Affimed万维网开发的分子。现在使用抗CD3抗体加人IL-2已经证明，对于这些形式中的一种，使用CD3×CD19双抗体将外周血淋巴细胞成功地重新靶向以裂解CD19阳性肿瘤细胞需要预活化外周血T淋巴细胞(Kipriyanov等，1998Int.J.Can.77：763)。另一些形式(例如二价单链Fv CD3×TAA 形式(Loffler等，2000Blood 95：2098))不需要预活化静息T细胞并且能够以非常有效的方式诱导抗原阳性肿瘤细胞体外裂解(Dreier等，2002Int.J.Canc.100：690)。使用靶向不同的TAA的另一些研究显示，形式的有效效力与抗原的尺寸，特别是TAA上的表位与肿瘤细胞膜的距离有关(Bluemel等，2010Cancer Immunol.Immunother.59：1197)。对于分子已证明溶细胞性T细胞突触的有效形成，这可解释为形成其效力的结构基础(Offner等，Molecular Immunology2006(43)763-771)，也认为这与所述形式的小尺寸相关。如果尺寸重要，这将暗示较大的分子(例如完整的IgG)将会过大以致于不能形成有效的溶细胞突触。已经证明CD3×CD19(blinatumomab)在难治的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)和急性淋巴性白血病患者中具有显著的临床功效(Bargou等，2008Science 321：974)。虽然CD3×CD19在体外于低水平时显示非常有效的肿瘤细胞裂解，但是向患者施用这种双特异性的形式也伴随有重大的挑战。由于它们的小尺寸，被迅速从循环中清除，因此患者的给药需要持续输注。因为给药方案具有超过2个月的总持续时间，这种治疗对患者的生活质量具有显著影响。

因此，在根除异常细胞中，仍然需要有效的全长双特异性T细胞衔接IgG分子，其组合了在静脉内施用后具有长的循环半衰期，不需要持续输注，不具有免疫原性以及只有有限的副作用。

附图简述

图1：CLEC12A及相关序列。

图2：由多种抗体活化T细胞：单克隆二价CD3 IgG，双特异性CD3×CLEC12 IgG，双特异性CD3×同种型对照IgG，单克隆二价CLEC12A IgG，单克隆二价同种型对照IgG。

图3：由CD3×CLEC12A双特异性IgG和对照抗体特异性裂解HL60细胞。

图4：由CD3×CLEC12A双特异性IgG和对照抗体特异性裂解HL60细胞(E∶T比)。

图5：用由多种CLEC12A臂和固定的CD3臂组成的数个CD3×CLEC12A双特异性IgG分子和对照抗体特异性裂解HL60细胞。

图6：用CD3×CLEC12A双特异性IgG与Fc沉默组合特异性裂解HL60细胞(DM＝双突变体；TM＝三突变体；WT＝野生型，无Fc沉默)。

图7：FC沉默不影响FcRn结合。

图8：CD3×CLEC12A bsAb靶向特异性诱导T细胞增殖。

图9：与健康供体相比，AML患者的CD8+T细胞区室。

图10：特异的CD3×CLEC12A DM-Fc诱导的T细胞活化和通过AML患者T细胞裂解HL60肿瘤细胞。

图11：通过自体AML患者T细胞特异性裂解AML母细胞。

图12：通过患者T细胞的特异性单核细胞裂解。

图13：Fc沉默显著地消除了旁观者(bystander)细胞细胞因子的释放。

图14A：HPB-ALL细胞上FACS染色的抗CD3抗体。

图14B：板结合的IgG，用CFSE标记的T细胞，在第5天通过FACS读出。

图15：HL60细胞毒性测定。

图16：HL60细胞上FACS染色的抗CLEC12A抗体。

图17：HL60细胞毒性测定。

图18：FACS分析。

图19：HL60细胞毒性测定。

图20：CD3特异性Fab臂和CLEC12A特异性Fab臂的VH序列。O12共有轻链的VL序列。CDR序列以粗体和下划线表示。

发明内容

本发明描述了用于治疗AML的完全人IgG双特异性全长抗体。抗体的一条臂与免疫效应细胞上的表位(优选CD3)结合，而另一条臂靶向CLEC12A(在90-95％新生和复发的AML患者中表达的一种骨髓细胞特异性表面靶标)。CLEC12A在AML白血病干细胞上表达，但不在正常的造血细胞上表达。不同于CD33，CLEC12A不在红细胞前体或巨核细胞上表达，因此本发明的CD3×CLEC12A双特异性IgG1抗体不应诱导血小板或红细胞的损耗。用骨髓细胞集落进行的实验已经表明，正常骨髓中CLEC12A+细胞的损耗不影响产生血小板和红细胞的髓系。在一个优选的实施方案中，根据本发明的CD3×CLEC12A双特异性IgG抗体包含经修饰的Fc区，以减少PBMC内T细胞和表达FcγR的细胞的衔接而导致的非特异性免疫活化。根据现有技术中描述triomAb双特异性抗体的数据，高度怀疑完全人IgG1形式的CD3×TAA双特异性抗体将能够在静息外周血淋巴细胞中诱导裂解性抗肿瘤活性，而不需要T细胞的预活化。此外，形式的可用数据表明全长IgG分子太大以致于无法在肿瘤细胞和效应细胞之间产生有效的溶细胞突触。出乎意料地，我们证明了完全人CD3×CLEC12A双特异性全长IgG1能够体外诱导非常有效的T细胞介导的CLEC12A阳性HL60AML肿瘤细胞的裂解。事实上，有效的裂解是由从PBMC纯化的静息T淋巴细胞介导的，而不需要预先活化所述T细胞。此外，我们证明了当在含有人血清的培养基中进行测定时，这种裂解活性不一定依赖于与HL60细胞上存在的FcγR的相互作用，因为这种裂解活性并未受到过量的人IgG存在的影响。这是首次全长人IgG1双特异性T细胞衔接器抗体发挥有效的肿瘤细胞裂解作用而不需要T细胞的预活化或不需要活性FcγR的相互作用。当与分子相比较时，尽管IgG1的尺寸相对较大，但仍可实现有效的裂解。显然，当将CH2/下铰链突变引入CD3×CLEC12A双特异性IgG1分子中以进一步减少Fc受体相互作用时，这仍然导致了通过免疫效应细胞的有效肿瘤细胞裂解。双特异性人IgG1 T细胞衔接器抗体相比于使用杂交亚类组合小鼠IgG2a/大鼠IgG2b的当前IgG具有优点，因为人IgG1有较小的免疫原性，因此可以应用于重复治疗。此外，全长双特异性人IgG1 T细胞衔接器抗体相比于免疫球蛋白/样分子(例如DART^TM、或)具有优点，因为全长人IgG1不会被从循环迅速清除，因此患者给药不需要持续输注，这对患者更加有益。

实施方案

本发明提供了双特异性IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体包含特异性识别CLEC12A或其功能等同物的一条臂和特异性识别免疫效应细胞上之抗原的第二臂，所述双特异性IgG抗体能够将这样的细胞募集到表达CLEC12A或所述功能等同物的异常细胞。

如本文所使用的术语“特异性识别CLEC12A或其功能等同物”意指在CLEC12A或所述功能等同物存在于所述抗体附近的情况下，所述臂具有特异性识别CLEC12A或所述功能等同物的能力。同样地，术语“特异性识别免疫效应细胞上的抗原”意指当所述抗原存在于所述抗体附近时，所述臂具有特异性识别所述抗原的能力。这种抗体对抗原的识别通常是通过抗体的互补区以及抗原和抗体臂二者的特定三维结构来介导的，不同于抗体随机的非特异性连接，其允许这两个结构精确结合在一起(类似于锁和钥匙的相互作用)。因为抗体通常识别抗原的表位，并且因为表位同样也可存在于其他化合物中，所以根据本发明“特异性识别CLEC12A或其功能等同物”并且“特异性识别免疫效应细胞上的抗原”的抗体也可识别其他化合物，如果这些其他化合物包含相同种类的表位的话。因此，术语“特异性识别CLEC12A或其功能等同物”，“特异性识别免疫效应细胞上的抗原”和“特异性识别CD3”不排除抗体与包含相同(种类)表位的其他化合物相结合。替代地，允许交叉反应性。根据本发明的抗体通常能够以至少1×10-⁵M的结合亲和力与CLEC12A(或其功能等同物)和免疫效应细胞上的抗原(优选CD3)相结合，如下进行了更详细的概述。

如本文所使用的术语“抗体”意指属于免疫球蛋白类蛋白质的蛋白质分子，其含有与抗原上的表位结合的一个或更多个结构域，其中这些结构域衍生自抗体的可变区或与抗体的可变区共享序列同源性。用于治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗对象的天然抗体(例如用于人对象的人抗体)。可以以特异性和亲和力来表示抗体结合。特异性决定哪些抗原或其表位被结合结构域特异性地结合。亲和力是与特定抗原或表位结合的强度的量度。特异性结合或“特异性识别”被定义为具有至少1×10^-5 M，更优选1×10^-7M，更优选高于1×10^-9M的亲和力(KD)的结合。通常，用于治疗应用的抗体具有高达1×10^-10M或甚至更高的亲和力。本发明的抗体通常是人IgG亚类的双特异性全长抗体。优选地，本发明的抗体是人IgG1亚类抗体。

根据本发明的术语“全长IgG”被定义为包括基本上完全的IgG，然而其并不一定要具有完整IgG的所有功能。为了避免疑义，全长IgG包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定区(C)和可变区(V)，其可以被分成指定的CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL结构域。IgG抗体通过包含在Fab部分的可变区结构域与抗原相结合，并且在结合后，可通过恒定结构域(主要是通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。术语“可变区结构域”、“可变区”、“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”、“Fab部分”、“Fab臂”、“Fab”或“臂”在本文中可互换使用。根据本发明的全长抗体涵盖IgG分子，其中可能存在提供所需特性的突变。这些突变不应该是任何区域实质部分的缺失。然而，其中一个或多个氨基酸残基缺失但是基本上没有改变所得IgG分子的结合特性的IgG分子也包含在术语“全长IgG”之内。例如，这类IgG分子可具有1至10氨基酸残基之间的一个或更多个缺失，优选在非CDR区，其中缺失的氨基酸对于IgG的结合特异性不是必需的。

优选全长IgG抗体，这是因为其有利的半衰期以及由于免疫原性的缘故，需要保持与完全自体(人)分子接近。根据本发明，使用双特异性IgG抗体。在一个优选的实施方案中，使用双特异性全长IgG1抗体。基于其在人中的长循环半衰期，IgG1是有利的。为了避免人类中的任何免疫原性，根据本发明的双特异性IgG抗体优选的是人IgG1。术语“双特异性”(bs)意指抗体的一条臂与第一抗原相结合，而第二臂与第二抗原相结合，其中所述第一抗原和第二抗原不相同。根据本发明，所述第一抗原和第二抗原实际上是位于两个不同细胞类型上的两个不同分子。术语“[抗体的]一条臂”优选意指全长IgG抗体的一个Fab部分。通过募集和活化内源免疫细胞而介导细胞毒性的双特异性抗体是下一代抗体治疗的新兴种类。这可通过在一个分子中组合对靶细胞(即肿瘤细胞)和效应细胞(即T细胞、NK细胞和巨噬细胞)特异性的抗原结合来实现(Cui等，JBC 2012(287)28206-28214；Kontermann，MABS 2012(4)182-197；Chames和Baty，MABS 2009(1)539-547；Moore等，Blood 2011(117)4542-4551；Loffler等.2000Blood 95：2098；Zeidler等，1999J.Immunol.163：1246)。根据本发明，提供双特异性抗体，其中一条臂与异常(肿瘤)细胞上的CLEC12A抗原结合，而第二臂与免疫效应细胞上的抗原结合。

还考虑这样的抗体，其中VH能够特异性识别第一抗原且与免疫球蛋白可变区中的VH配对的VL能够特异性识别第二抗原。所得的VH/VL对将与抗原1或抗原2相结合。例如在WO2008/027236、WO 2010/108127和Schaefer等(Cancer Cell20，472-486，2011年10月)中描述的这些所谓的“二合一抗体(two-in-one antibody)”也包含在术语“双特异性抗体”中，因为它们也具有结合两种不同抗原的能力。在一个实施方案中，VH用于特异性识别CLEC12A或其功能等同物，而VL用于特异性识别免疫效应细胞上的抗原。或者，根据本发明的抗体包含特异性识别免疫效应细胞上之抗原的VH和特异性识别CLEC12A或其功能等同物的VL。无论哪种方式，所得到的抗体通常包含两个VH/VL对，其中每个VH/VL对将与CLEC12A(或其功能等同物)或者免疫效应细胞上的抗原相结合。二合一抗体通常与两种相似的抗原(AA或BB；单特异性二价)或两种不同的抗原(AB；双特异性)相结合。因此，如果二合一抗体用于根据本发明的治疗应用，这些抗体的一部分将不能发挥所期望的效果，这是由于其与两种CLEC12A分子(或其功能等同物)或者免疫效应细胞上的两种抗原(例如CD3)相结合。由于用所施用抗体的一部分仍可以实现治疗目标，因此二合一抗体仍然合适。

如本文所使用的术语“CLEC12A”指的是C型凝集素结构域家族12成员A，也称为C型凝集素样分子-1(CLL-1)(在急性髓性白血病(AML)的白血病母细胞和白血病干细胞上表达的抗原)，其包括CD34阴性或CD34低表达的白血病干细胞(侧群)(A.B.Bakker等，CancerRes 2004，64，8443-50页；Van Rhenen等，2007Blood 110：2659；Moshaver等，2008StemCells 26：3059)。CLEC12A的表达另外受限于造血系，特别受限于在外周血和骨髓中的骨髓细胞，即粒细胞、单核细胞和树突细胞前体。更重要的是，CLEC12A不存在于造血干细胞上。这种表达谱使得CLEC12A特别有利于在AML中靶向。CLEC12A的替代名称包括树突细胞相关的C型凝集素2(DCAL-2)、髓性抑制C型凝集素样受体(MICL)和杀伤细胞凝集素样受体亚家族L成员1(KLRL1)(Zhang W等，GenBankTM登录号：AF247788；A.S.Marshall等，J Biol Chem2004，279，14792-802页；GenBankTM登录号：AY498550；Y.Han等，Blood 2004，104，2858-66页；H.Floyd等，GenBankTM登录号：AY426759；C.H.Chen等，Blood 2006，107，1459-67页)。在图1中示出了这些序列的比对。CLEC12A的全长形式包含275个氨基酸残基，其包括在大多数其他同工型中不存在的并显示出严格的髓表达谱(表面表达和mRNA水平)之额外的10个氨基酸胞内段(intracellular stretch)。术语“CLEC12A或其功能等同物”意指上述提到的所有变体以及其保留了严格的髓表达谱(在表面表达水平和mRNA水平两者)的同工型，如在Bakker等，Cancer Res 2004，64，8443-50页中所描述。因此，本发明包括其中一条臂特异性识别CLEC12A的功能等同物的双特异性IgG抗体，其包括那些缺乏上述额外的10个氨基酸胞内段的功能等同物。然而，优选的是根据本发明的双特异性IgG抗体，其中一条臂特异性识别全长形式的CLEC12A。

如本文所用的术语“异常细胞”包括肿瘤细胞，更具体的是血液学来源的肿瘤细胞，其还包括白血病前期细胞(例如导致骨髓增生异常综合征(MDS)的细胞)和白血病细胞(例如急性髓性白血病(AML)肿瘤细胞或慢性髓性白血病(CML)细胞)。

如本文所使用的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”指的是在哺乳动物免疫系统中细胞的天然库(repertoire)内的细胞，其可被活化以影响靶细胞的生存力。免疫效应细胞包括淋巴系的细胞例如天然杀伤(NK)细胞，T细胞包括细胞毒性T细胞或B细胞，而且骨髓系的细胞也可被视为免疫效应细胞，例如单核细胞或巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。根据本发明，将效应细胞募集至异常细胞意指免疫效应细胞被带到靠近异常靶细胞的附近，使得效应细胞可以直接杀伤它们被募集至的异常细胞或间接地启动异常细胞的杀伤。为了避免非特异性相互作用，优选地本发明的双特异性抗体特异性识别免疫效应细胞上的抗原，其与体内的其他细胞相比被这些免疫效应细胞至少过表达。存在于免疫效应细胞上的靶抗原可包括CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D和NKp46。优选地，在免疫效应细胞上的抗原是在T细胞上表达的CD3或其功能等同物(功能等同物是在T细胞上具有类似分布和类似功能(在性质上，未必在数量上)的CD3样分子)。如本文所使用的术语“CD3”也涵盖CD3的功能等同物。在免疫效应细胞上最优选的抗原是CD3ε链。已证明该抗原在募集T细胞至异常细胞中非常有效。因此，根据本发明的双特异性IgG抗体优选地包含特异性识别CD3ε的一条臂。

因此，本发明提供了双特异性全长IgG抗体，其中所述双特异性抗体包含特异性识别CLEC12A或其功能等同物的一条臂和特异性识别免疫效应细胞上之抗原的第二臂，所述双特异性IgG抗体能够将这样的细胞募集到表达CLEC12A或所述功能等同物的异常细胞，其中所述免疫效应细胞包含T细胞。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中在所述免疫效应细胞上的所述抗原是CD3或其功能等同物，优选人CD3ε。在另一个实施方案中，本发明提供了这样的双特异性IgG CLEC12A×CD3抗体的F(ab)’2片段。

本发明的一个方面提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中两条臂包含共有轻链。根据本发明的术语“共有轻链”指的是可以是相同的或具有一些氨基酸序列差异同时保留了抗体结合特异性的轻链。例如，可能在本文所使用的共有轻链的定义范围之内，例如，通过引入和测试保守氨基酸改变来制备或发现不相同的但仍然功能上等同的轻链，所述保守氨基酸改变是指当与重链配对时，对结合特异性没有帮助或仅有部分帮助的区域内氨基酸的变化等。添加或不添加术语“重排”的术语“共有轻链”、“共有VL”、“单条轻链”、“单VL”在本文中全都可以互换使用。本发明的一个方面是使用可与不同的重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域之抗体的人轻链作为共有轻链(WO2004/009618、WO2009/157771、Merchant等，1998，Nissim等，1994)。优选地，共有轻链具有种系序列。一种优选的种系序列是经常在人类库中使用的且具有与许多不同的VH区配对的优越能力，以及具有良好的热力学稳定性、产率和溶解度的轻链可变区。最优选的种系轻链是O12，优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39＊01/IGJκ1＊01(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名法)或者其片段或功能衍生物。术语重排的种系人κ轻链IgVκ1-39＊01/IGJκ1＊01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ139轻链或简称huVκ1-39在整个申请中可互换使用。显然，本领域的技术人员将认识到“共有”还指其氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。所述轻链存在许多变体，其中突变(缺失、替换、添加)的存在实质上不影响功能性结合区的形成。

在一个特别优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含以下序列：由与SGYTFTSY至少90％相同的序列组成的重链CDR1序列、由与IINPSGGS至少90％相同的序列组成的重链CDR2序列以及由与GTTGDWFD至少90％相同的序列组成的重链CDR3序列。优选地，所述重链CDR 1、2和3序列由与所列举的CDR序列至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％相同的序列组成。通常，允许与所列举的CDR序列相比有1、2或3个氨基酸残基的变化，同时保持相同种类的结合活性(在性质上，未必在数量上)。因此，所述重链CDR1、2和3序列优选包含偏离所列举CDR序列不超过3个，优选不超过2个，更优选不超过1个氨基酸的序列。在一个特别优选的实施方案中，所述重链CDR 1、2和3序列与所列举的CDR序列相同。如实施例中所示，所列举的CDR序列是Fab臂4327的CDR序列，其具有良好的CLEC12A结合性质。因此，在图20中示出了Fab臂4327的重链序列，CLEC12A特异性抗体4327的VH。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性IgG抗体包含与抗体4327的该VH至少90％相同的可变重链(VH)序列。因此，还提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含由与序列

至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％或甚至100％相同的序列组成的VH序列。如实施例中所示，包含上述VH序列以及识别CD3Fab臂的VH序列(连同共有轻链)之根据本发明的双特异性抗体具有诱导T细胞介导的CLEC12A阳性AML肿瘤细胞裂解的优异能力。

在另一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含以下序列：由与SGYTFTSY至少90％相同的序列组成的重链CDR1序列、由与IINPSGGS至少90％相同的序列组成的重链CDR2序列以及由与GNYGDEFDY至少90％相同的序列组成的重链CDR3序列。优选地，所述重链CDR1、2和3的序列由与所列举的CDR序列至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％相同的序列所组成。如上所述，通常，允许与所列举的CDR序列相比有1、2或3个氨基酸残基的变化，同时保持相同种类的结合活性(在性质上，未必在数量上)。因此，所述重链CDR1、2和3序列优选包含偏离所列举的CDR序列不超过3个，优选不超过2个，更优选不超过1个氨基酸的序列。在一个特别优选的实施方案中，所述重链CDR1、2和3序列与所列举的CDR序列相同。如在实施例中所示，所列举的CDR序列是抗体4331VH区的CDR序列，其具有良好的CLEC12A结合性质。在图20中也示出了Fab臂4331的VH序列。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性的IgG抗体包含与Fab臂4331的该VH至少90％相同的VH序列。因此，还提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含由与序列

至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％或甚至100％相同的序列组成的VH序列。如实施例所示，根据本发明的包含Fab臂4331的VH序列以及识别CD3的Fab臂的VH序列(连同共有轻链)之根据本发明的双特异性抗体具有诱导T细胞介导的CLEC12A阳性AML肿瘤细胞裂解的优异能力。

另一个优选的实施方案提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含以下序列：由与SGYTFTGY至少90％相同的序列组成的重链CDR1序列、由与WINPNSGG至少90％相同的序列组成的重链CDR2序列以及由与DGYFADAFDY至少90％相同的序列组成的重链CDR3序列。优选地，所述重链CDR1、2和3由与所列举的CDR序列至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％相同的序列所组成。此外，通常，允许与所列举的CDR序列相比有1、2或3个氨基酸残基的变化，同时保持相同种类的结合活性(在性质上，未必在数量上)。因此，所述重链CDR1、2和3序列优选包含偏离所列举的CDR序列不超过3个，优选不超过2个，更优选不超过1个氨基酸的序列。在一个特别优选的实施方案中，所述重链CDR1、2和3的序列与所列举的CDR序列相同。如在实施例中所示，所列举的CDR序列是抗体3918的VH的CDR序列，其也具有良好的CLEC12A结合性质。在图20中也示出了抗体3918的VH序列。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性IgG抗体包含与抗体3918的该VH至少90％相同的VH序列。因此，还提供了根据本发明的双特异性抗体，其中特异性识别CLEC12A或其功能等同物的臂包含由与序列

至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％或甚至100％相同的序列组成的VH序列。如实施例中所示，包含Fab臂3918的VH序列以及识别CD3的Fab臂的VH序列(连同共有轻链)之根据本发明的双特异性抗体具有诱导T细胞介导的CLEC12A阳性AML肿瘤细胞裂解的良好能力。

在另一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中第二臂特异性识别CD3并且包含以下序列：由序列SYGMH组成的重链CDR1序列、由序列IIWYSGSKKNYADSVKG组成的重链CDR2序列以及由序列GTGYNWFDP组成的重链CDR3序列。优选地，所述CD3特异性的臂包含由序列

组成的VH序列。所列举的CDR序列和VH序列是抗体3896的序列。在图20中也描述了这些序列。包含这些CD3特异性CDR序列和/或Fab臂3896的所列举的VH序列的重链优选用于根据本发明的双特异性抗体，因为这些序列为双特异性抗体提供了对于表达CD3之免疫细胞的最佳亲和力，同时使得足以与CLEC12A阳性AML肿瘤细胞相结合。不希望受限于理论，认为双特异性抗体的总体效果是由一条臂对抗原1的亲和力与另一条臂对抗原2的亲和力的组合效果来确定的。对于本发明的对CLEC12A(或其功能等同物)和在免疫效应细胞上的抗原(优选CD3)具有特异性的抗体，优选结合至CD3-阳性免疫细胞和表达CLEC12A的肿瘤细胞的最佳时间以有效地诱导T细胞介导的CLEC12A阳性肿瘤细胞的裂解。假设CLEC12A/CD3双特异性抗体的亲和力之间的平衡是非常重要的。认为对于CD3显著较高的亲和力与对于CLEC12A低得多的亲和力(即对于CD3过高的亲和力)将导致其中抗体将主要与表达CD3的T细胞结合的情况。这样的“装载双特异性抗体”的T细胞可内在化其CD3或者可以侵入组织，从而甚至在它们遇到CLEC12A-阳性肿瘤细胞之前离开循环。这会降低双特异性抗体的治疗效果。

以一种更加有利的作用方式，CLEC12A-阳性肿瘤细胞首先由根据本发明的一种或更能多种双特异性抗体所结合，当T细胞由双特异性抗体游离的CD3臂吸引后，随后发生T细胞活化。或者，CD3阳性T细胞和CLEC12A-阳性肿瘤细胞基本上同时被双特异性抗体所结合。因此，优选地选择或调节对于CLEC12A(或其功能等同物)和免疫效应细胞上的抗原(优选CD3)两者的亲和力，使得达到正确的平衡，即所得到的双特异性抗体将基本上同时与CLEC12A和CD3结合或双特异性抗体具有与CLEC12A阳性肿瘤细胞结合至足够程度的趋势，当T细胞的活化发生后，肿瘤细胞裂解。根据本发明，优选通过使具有Fab臂3896(其为CD3特异性)之CDR序列的VH(或整个VH序列)与具有Fab臂4327或4331或3918或3116(其为CLEC12A特异性)之CDR序列的VH(或整个VH序列)组合来实现CD3和CLEC12A结合亲和力之间这种优异的平衡。这样得到的双特异性抗体显示了CD3和CLEC12A结合亲和力之间的有利平衡，从而使T细胞和CLEC12A阳性AML肿瘤细胞有效地集合在一起，并且最佳地诱导T细胞介导的CLEC12A阳性AML肿瘤细胞的裂解。

如前文所述，优选提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中两条臂都包含共有轻链可变结构域。特别优选的共有轻链是人重排的κ轻链IgVκ1-39＊01/IgJκ1＊01，又名O12。在图20中也描述了O12VL的核苷酸序列和氨基酸序列。CDR序列以粗体和下划线表示。因此，优选含有至少包含O12之CDR序列的共有轻链的根据本发明的双特异性抗体。因此，本发明的一个方面提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中，第一臂和第二臂还包含以下序列：由与RASQSISSYLN至少90％相同的序列组成的轻链CDR1序列、由与AASSLQS至少90％相同的序列组成的轻链CDR2序列以及由与QQSYSTPPT至少90％相同的序列组成的轻链CDR3序列。优选地，所述轻链CDR1、2和3序列由与所列举的CDR序列至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％相同的序列所组成。此外，通常，允许与所列举的CDR序列相比有1、2或3个氨基酸残基的变化。因此，所述轻链CDR1、2和3序列优选包含偏离所列举的CDR序列不超过3个，优选不超过2个，更优选不超过1个氨基酸的序列。在一个特别优选的实施方案中，所述轻链CDR1、2和3序列与所列举的CDR序列相同。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性IgG抗体包含与O12VL链至少90％相同的VL序列。因此，还提供了根据本发明的双特异性抗体，其中第一臂和第二臂包含由与序列

至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％或甚至100％相同的序列所组成的VL序列。

本文中将术语“％相同的”定义为在比对两个序列和引入空位(如果必要的话)以获得最大相同百分比之后，与参考序列中的残基相同的候选氨基酸序列中的残基的百分比。比对的方法和计算机程序是本领域中公知的。一种目的在于确定候选序列是否属于这一定义范围内之可使用或可改编的计算机程序是“Align 2”，其由Genentech公司创造，已于1991年12月10日与用户文档(user documentation)一起提交美国版权局，Washington，D.C.20559。

根据本发明定义的双特异性全长IgG抗体具有两个不同的抗原结合位点，但IgG的Fc区还包含Fc受体的第三结合位点。如果细胞携带Fc受体和一种双特异性抗体的靶标两者，Fc受体和所述细胞表面上的靶标可能发生交联，这可能会导致不期望的效果。在一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的双特异性全长IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体具有突变的下铰链和/或CH2结构域，使得所述双特异性IgG抗体与Fcγ受体的相互作用显著降低。如本文所使用的术语“使得所述双特异性IgG抗体与Fcγ受体的相互作用显著降低”意指如果这样的Fcγ受体存在于所述抗体的附近，那么所述双特异性IgG抗体与Fcγ受体相互作用的能力降低。因此，根据本发明，使抗体的区域(优选抗体的下铰链和/或CH2结构域)突变(通常通过表达编码其的突变核酸序列)，由此与Fc受体相互作用的能力被减弱。优选与Fc受体的相互作用基本上被消除。之前已经对参与结合Fcγ受体的人IgG1中的氨基酸残基进行了作图(map)。除了当改变时仅提高了对特定受体的结合或同时提高了对一种类型的受体的结合而降低了对另一种类型的受体结合的残基，发现几个消除了与一种或更多种受体结合的残基(Shields RL等，JBC.2001(276)6591-6604；Armour等，Mol.Immunol.2003(40)585-593)。在另一个优选的实施方案中，所述突变的下铰链和/或CH2结构域在235和/或236位氨基酸(根据EU编号)包含至少一个替换。优选地，235和236位氨基酸两者都被替换。在实施例中表明在这些位置的替换基本上能够防止双特异性抗体与存在于肿瘤细胞上的Fc受体之间的相互作用。特别地，表明了替换L235G和/或G236R非常适合于该目的。因此，本文还提供了根据本发明的双特异性IgG抗体，其中所述突变的CH2和/或下铰链结构域包含替换L235G和/或G236R。优选地，L235G和G236R两者都被替换。或者，本领域技术人员可引入包含替换234F、235E和/或331S的下铰链和/或CH2结构域突变(Oganesyan等，Biol.Crystall.2008(D64)700)。优选地，所有的三个替换是在该替选方案中引入的。

在我们的美国临时申请61/635,935中，其已被美国正式申请No.13/866,747和PCT申请No.PCT/NL2013/050294(通过引用并入本文)所跟进，我们公开了用于从单个细胞产生双特异性抗体的方法和手段，从而提供了相对于单特异性抗体的形成，更有利于双特异性抗体的形成的手段。这些方法也可有利地用于本发明。因此，本发明提供了用于从单个细胞产生根据本发明的双特异性全长IgG抗体的方法，其中所述双特异性全长IgG抗体包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：a)编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子，b)编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，其中所述核酸分子具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的手段，所述方法还包括培养所述宿主细胞以及允许所述两种核酸分子表达并且从培养物收获所述双特异性全长IgG抗体的步骤。所述第一核酸分子和第二核酸分子可以是相同载体或基因递送载剂的一部分，并且可以被整合到宿主细胞基因组的相同位点上。或者，将所述第一核酸分子和第二核酸分子分开提供给所述细胞。

一个优选的实施方案提供了用于从单个细胞产生根据本发明的全长双特异性IgG抗体的方法，其中所述双特异性抗体包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括提供：

-这样的细胞，所述细胞具有a)编码特异性识别CLEC12A且包含第一CH3结构域之IgG重链的第一核酸序列；和b)编码特异性识别免疫效应细胞上的抗原(优选CD3)且包含第二CH3结构域之IgG重链的第二核酸序列，其中所述核酸序列具有用于使所述第一CH3结构域和第二CH3结构域优先配对的手段，所述方法还包括培养所述细胞以及允许所述两种核酸序列表达并从培养物收获所述双特异性IgG抗体的步骤。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞还具有编码共有轻链的第三核酸序列。如上所述，优选的共有轻链是O12，优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39＊01/IGJκ1＊01。基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是第一CH3结构域中的氨基酸替换L351K和T366K(根据EU编号)以及第二CH3结构域中的氨基酸替换L351D和L368E，或反之亦然。因此，还提供了根据本发明用于产生双特异性IgG1抗体的方法，其中所述第一CH3结构域包含氨基酸替换L351K和T366K(根据EU编号)并且其中所述第二CH3结构域包含氨基酸替换L351D和L368E，所述方法还包括培养所述细胞以及允许所述核酸序列表达并且从培养物收获所述双特异性抗体的步骤。还提供了根据本发明用于产生双特异性IgG1抗体的方法，其中所述第一CH3结构域包含氨基酸替换L351D和L368E(根据EU编号)并且其中所述第二CH3结构域包含氨基酸替换L351K和T366K，所述方法还包括培养所述细胞以及允许所述核酸序列表达并且从培养物收获所述双特异性抗体的步骤。可通过这些方法生产的抗体也是本发明的一部分。

本发明还提供了包含根据本发明的双特异性IgG抗体和可药用载体的药物组合物。如本文所用的，这样的“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有的溶剂、盐、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。根据施用的途径(例如，静脉内、皮下、关节内等)，活性化合物可被包被在材料中以保护化合物免受酸和其他可失活所述化合物的天然条件的作用。

根据本发明的抗体和药物组合物可用于治疗多种骨髓来源的白血病和白血病前期疾病，以及B细胞淋巴瘤。可根据本发明治疗的疾病包括髓性白血病或白血病前期疾病例如AML、MDS和CML以及霍奇金淋巴瘤和大多数非霍奇金淋巴瘤。因此，本发明提供了根据本发明的双特异性全长IgG抗体在治疗骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓性白血病(CML)或优选急性髓性白血病(AML)中用作药物。还提供了根据本发明的双特异性IgG抗体在制备用于治疗或预防骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓性白血病(CML)或优选急性髓性白血病(AML)的药物中的用途。

待向患者施用的根据本发明的抗体的量通常在治疗窗(therapeutic window)中，这意味着使用足够的量用于获得治疗效果，然而量不能超过导致不可接受程度之副作用的阈值。需要用于获得期望治疗效果的抗体的量越低，治疗窗通常越大。因此，优选在低剂量下发挥足够治疗效果的根据本发明的抗体。

在欧洲和美国，每年大约有30,000患者被诊断为患有急性髓性白血病(AML)。这些患者大多数为60岁或更大年龄。较大的年龄是AML结果的主要负决定因素并且强化治疗的老年AML患者的长期生存(5年)为约10％。在诱导化疗后，在几乎所有的已经实现缓解的患者中，在3年内观察疾病进展。目前的缓解后治疗已经在患有AML的老年患者中显示出有限的值(如果有的话)。因此，保留显著负荷的残留抗性白血病而且存活的抗药性白血病细胞亚群迅速产生复发。需要具有完全不同作用方式的新型药物来靶向这些化疗无响应的AML肿瘤细胞以努力地诱发和维持完全的缓解。虽然在超过50％的稍老AML患者和约80％的稍年轻患者中可用许多加强化疗组合来实现完全缓解(CR)，但是响应或存活的提升仍然是重要的研究挑战。在一项最近发表的患有AML的老年患者之65个随机临床试验(15.110位患者)的网络元分析中，大多数修正的研究诱导方案相比于具有柔红霉素和阿糖胞苷的常规3+7诱导方案具有类似或甚至更差的效力谱。AML的这种标准治疗与高发病率以及甚至死亡率相关。由于化疗后剩余的白血病干细胞，大多数患者在CR中复发。由于不可接受的毒性，进一步剂量强化受到限制。因此，迫切需要特别在患有AML的老年患者中出现优选的具有较小毒性的新治疗方式。

可通过使用双特异性抗体使得来自患者自身免疫系统的T细胞与AML肿瘤细胞衔接来实现化疗无响应的AML治疗。以这种方式，患者的免疫系统被加强并重新靶向以攻击和根除AML肿瘤细胞。本发明提供了有效诱导AML肿瘤细胞裂解的CD3×CLEC12A双特异性IgG抗体。因此，CD3×CLEC12A双特异性抗体是特异性根除白血病干细胞以改善AML患者预后的几乎无副作用的靶向治疗。因为CLEC12A在白血病干细胞(LSC)上表达而不在正常的造血干细胞上表达，所以针对此抗原(如已在体外示出)的治疗将根除LSC同时不伤害(spare)正常的干细胞。最可能其将会在微小残留病(Minimal Residual Disease，MRD)的情况下具有最大的影响。期望的是，由于MRD的根除，复发百分比将会下降。因此，这种新的治疗方式对AML患者的影响将是具有较小的复发百分比的毒性较低的治疗，导致了与更好的生活质量相关的改善结果。在复发的AML患者中对这些全长IgG双特异性抗体进行临床评价。使用在骨髓中AML母细胞的减少作为客观响应标准对临床功效进行分析。对于目前还没有可用治疗的大部分患者(patient segment)，AML的有效双特异性IgG提供了一种新的治疗选择。除了提供实现持久缓解的手段外，当在缓解期间施用时，该治疗选择还具有AML的治愈潜力。

实施例

实施例1：候选CD3×CLEC12双特异性IgG1的产生与功能表征为了证实用双特异性全长IgG将免疫效应细胞靶向至异常细胞的概念，产生了候选CD3×CLEC12A双特异性IgG1，其中CD3和CLEC12A的Fab臂衍生自先前所描述的抗体。在CD3Fab臂上，使用来自抗-CD3抗体15C3(如在WO2005/118635中公开的一种CD3特异性抗体)的VH区，该VH被称为‘3056’。在CLEC12A Fab臂上，使用来自scFv SC02-357(如在WO2005/000894中公开的一种CLEC12A特异性抗体)的VH区(以下称为‘CLEC12A基准[Fab臂或抗体]’；或者，该VH被称为‘3116’)。在图20中提供了这种候选分子的CD3臂VH(3056)的核苷酸序列和氨基酸序列以及CLEC12A臂VH(3116)的核苷酸序列和氨基酸序列，这种候选分子被称为候选3056×3116。在图20中还提供了共有VL(huVκ1-39；O12)的核苷酸序列和氨基酸序列。

使用本领域中已知的用于产生双特异性IgG1的方法(Gunasekaran等JBC 2010(285)19637-19646；WO2009/089004)将各个VH区连同重排的人IGKV1-39/IGKJ1(huVκ1-39)轻链克隆到表达载体中。先前表明huVκ1-39能够与超过一条重链进行配对，从而产生具有不同特异性的抗体，这有利于双特异性分子的产生(De Wildt RM等，J.Mol.Biol，1999(285)895901；De Kruif等，J.Mol.Biol.2009(387)548-58；WO2009/157771)。

首先，通过流式细胞术证明了候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性IgG1与HPB-ALL细胞上CD3ε的结合，其根据本领域已知的标准程序进行(表1)。使用转染有CD3δ/ε或CD3γ/ε的CHO细胞证实了与表达CD3ε细胞的结合。使用转染有CLEC12A表达构建体的CHO细胞确定了候选3056×3116双特异性IgG1与CLEC12A的结合；CD3单特异性抗体(3056×3056)和CLEC12A单特异性抗体(3116×3116)以及不相关的IgG1同种型对照mAb作为对照。

表1：通过流式细胞术的与表达CD3和CLEC12A之细胞的结合。

＊以平均荧光强度给出结果。

通过表面等离振子共振(BIAcore)来确定候选3056×3116双特异性IgG1对CD3δ/ε和CLEC12A之胞外结构域的亲和力测量。简言之，使用游离胺化学将纯化的重组抗原共价偶联至CM5传感器芯片的表面：在kAc缓冲液中将抗原稀释至10μg/mL并偶联至用NHS/EDC活化的表面(根据制造商的建议)。为了确定存在于双特异性抗体中的Fab臂的亲和力，在Hepes缓冲盐水(HBS)中将这些连续稀释至100nM、50nM、20nM、10nM、1nM和0.1nM并以高(30μL/分钟)流速流过CM5传感器芯片的抗原偶联表面(以防止重新结合)。使用流动池(flow cell)1(FC1)作为对照(空白)表面并且从其他流动池(FC)所测量的响应中减去从该表面产生的响应(传感图(sensor gram))。对于被双特异性抗体识别的两种不同的抗原使用FC2和FC3以能够在所有三个表面之上运行的单动力学中测量两条Fab臂的亲和力。因为当抗体流过抗原偶联的表面时，抗体的浓度并没有显著改变，所以同时测量了双特异性抗体识别的两种不同抗原上它们的结合率(on-rate)(其为浓度依赖性的)。由此获得了不同双特异性蛋白的缔合和解离相的传感图。使用BIA评估软件和采用1∶1相互作用模型(对于单价相互作用)的曲线拟合，测定了Fab臂的亲和力。在双特异性蛋白与传感器芯片之抗原包被的表面的结合被破坏的情况下(即，当结合很少蛋白质时，导致了低响应和/或非常快的解离率(off-rate))，实验的设置是相反的：使用游离胺化学将双特异性抗体共价偶联到传感器芯片的表面并将重组的纯化抗原以高(30μL/分钟)流速流过所述表面以测量Fab臂对该抗原的亲和力。

接着，测试了候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性Ig的功能。首先，用健康供体静息T细胞研究了T细胞的刺激能力。简言之，在知情同意后，从健康供体获得外周血。通过标准密度梯度分离来分离T细胞以富集外周血单核细胞(PBMC)，接着使用磁珠(全T细胞试剂盒，Miltenyi Biotec目录号130-091-155)进行阴性选择。使用这种纯化策略，T细胞是所谓的“未接触的(untouched)”(即，不被抗体染色的，所谓的“静息T细胞”)来限制预活化的可能性。随后在10％胎牛血清(FBS)或10％正常人血清(HS)中用来自白血病衍生的HL60细胞系的细胞以效应细胞：靶细胞10：1的比孵育纯化的静息T细胞两天。结果表示为CD4阳性或CD8阳性T细胞群中CD69阳性或CD25阳性细胞的百分比。

二价的CD3IgG和CD3×CLEC12A双特异性IgG抗体两者都有效地诱导CD4阳性和CD8阳性T细胞上的T细胞活化标志物CD69和CD25的上调(图2)。在存在不阻断存在于HL60细胞上之Fc受体的FBS的情况下(Liesveld等，1988，J.Immunol.140(5)，第1527-1533页)，对照双特异性分子CD3×同种型对照IgG也显示出诱导T细胞活化。在HS存在时这种效果被削弱，表明观察到的由单价CD3结合的CD3×同种型对照IgG的T细胞活化依赖于Fc的交联。然而，由候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性IgG诱导的T细胞活化仅部分依赖于Fc的相互作用，因为在HS存在时，大部分保留了上调CD69和CD25的效力(图2)。这表明在与其他Fab臂结合后当结合分子桥接到HL60靶细胞上的CLEC12A抗原时，单价CD3结合的固有效力足以活化T细胞。

为了研究由候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性IgG引起的T细胞活化的程度是否足以诱导靶细胞裂解，在此测定中，用羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记HL60细胞并以多种效应细胞：靶细胞的比与T细胞进行共培养。在一天、两天或三天之后，通过流式细胞术对存活的CFSE阳性HL60细胞进行定量。结果表示为PBS相关之特异性裂解的百分比。

正如所预期的，CD3单特异性二价IgG诱导了静息T细胞介导的HL60细胞的杀伤(图3)。出人意料的是，CD3×CLEC12A双特异性单价IgG和对照CD3×同种型对照也诱导了静息T细胞介导的HL60细胞的杀伤。当不存在过量的人IgG，即当不阻断HL60靶细胞上的Fc受体的情况下进行测定时，这些效果最显著(FBS条件；图3)。出人意料的是，即使在存在过量的人IgG(10％的HS条件)时，CD3×CLEC12A双特异性IgG在杀伤HL60细胞中也非常有效，表明诱导HL60裂解不依赖于与Fcγ受体的相互作用。在第3天，还观察到CD3×同种型对照诱导的HL60裂解，可能是由于经延长的孵育期后，不完整的Fcγ受体阻断。HL60靶细胞的杀伤随不同的效应细胞：靶细胞比而变化(图4)。

总之，本实施例证明了CD3×CLEC12A双特异性分子是T细胞介导的肿瘤细胞裂解的有效诱导物，并且证实了我们的假设，即有效地杀伤异常细胞的T细胞衔接可通过CD3×CLEC12A全长IgG1双特异性抗体来介导。出人意料的是，由CD3×CLEC12A双特异性IgG诱导的活性不依赖于Fcγ受体的相互作用。为了延长CD3×CLEC12A双特异性全长IgG的组以达到最终的临床候选，产生了CD3Fab臂和CLEC12A Fab臂的组。通过使用在当前实施例示出的来自候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性IgG之各自的Fab来固定另一条臂以完成对CD3和CLEC12A Fab臂的特异性和功能的证实。

实施例2：CD3×CLEC12bsAb之CD3 Fab臂的产生和表征

实施例1表明CD3×CLEC12A双特异性分子可以是T细胞介导的肿瘤细胞裂解的有效诱导物。因此，为了产生更大量的这种双特异性分子的组，产生了CD3结合物以及CLEC12A结合物的单独组。

为了产生CD3结合物的组，通过用以下多种形式的CD3ε对具有huVκ1-39轻链(WO2009/157771)和人重链(HC)微小基因座(minilocus)之转基因的小鼠进行免疫接种以产生CD3ε特异性VH区：(1)可被融合偶联至本领域中已知的载体分子(例如人IgG-Fc或His-标签)的分离的CD3δ/ε或CD3γ/ε，有或没有佐剂，(2)表达CD3δ/ε或CD3γ/ε的细胞，或(3)编码CD3δ/ε或CD3γ/ε的DNA构建体，或这些策略的组合。从通过ELISA和/或流式细胞术测定显示了足够的抗原特异性效价的免疫小鼠中，收获脾和/或淋巴结，由此产生Fab噬菌体文库。或者，通过深度测序VH区序列直接衍生自脾和淋巴结材料(共同未决的美国临时申请61/539,116)。

抗原特异性的Fab臂选自免疫小鼠的噬菌体文库或选自其中包含huVκ1-39轻链的VL区和人VH区集合的合成噬菌体展示文库。为了产生合成文库，使用如在De Kruif等，1995，J Mol Biol 248(1)，第97-105页中描述的随机CDR3引物。在多轮中针对与可偶联到载体分子(见上文)之分离的CD3δ/ε蛋白的结合，或与表达CD3ε的细胞(例如HPB-ALL或与转染以表达CD3δ/ε或CD3γ/ε的细胞)的结合，或这些策略的组合选择来自这些文库的噬菌体。除去未结合的噬菌体并且将结合的噬菌体用酸性缓冲液洗脱，或用针对特定表位的抗体(例如用与食蟹猴CD3ε交叉反应的抗体)将所选择的Fab库指向期望的特异性。然后将这些噬菌体转染到感受态细菌中，其在含有噬菌体细菌的选择压力下生长。在挑选了一些存活的细菌菌落后，营救(rescue)噬菌体并提交至下一轮选择。

在完成选择后，通过流式细胞术筛选与表达抗原的细胞结合的剩余噬菌体并通过ELISA分离抗原。作为结合的阳性对照，使用本领域那些已知的基准CD3抗体，例如OKT-3。将来自基本上所有噬菌体的核苷酸材料提交至菌落PCR以扩增VH区和测序PCR(sequencePCR)以确定VH区序列，所述噬菌体表现出与表达抗原之细胞的特异性结合。所得的序列基于它们HCDR3的独特性而被聚类。对于来自免疫小鼠的序列，其中可发生(有限的)体细胞超变，基于独特VDJ的可能性(即如果不同簇中的HCDR3含有＜2个氨基酸的差异，则认为它们是相同簇的部分并将其分到一起)将VH序列进一步分组。对于每个簇，每个簇的一个或几个VH区被选择克隆到载体中以IgG单特异性二价形式连同huVκ1-39轻链中进行表达。随后，将确认的特异性与分离的抗原和表达抗原的细胞结合的VH区克隆到用于以CD3×CLEC12A双特异性形式表达的载体中。然后，表征它们以选择具有治疗潜力的候选物(参见以下实施例)。

实施例3：CD3×CLEC12 bsAb之CLEC12 Fab臂的产生和表征

如实施例1证明的，CD3×CLEC12A双特异性分子具有诱导T细胞介导的肿瘤细胞裂解的效力，接下来我们希望建立更大量的此类双特异性分子的组。除了如实施例2中描述的CD3结合物的组之外，我们还产生了CLEC12A结合物的组。

简言之，从含有重排的人IGKV1-39/IGKJ1 VL区和人VH区集的Fab合成噬菌体展示文库选择CLEC12A特异性Fab臂(De Kruif等，Biotechnol Bioeng.2010(106)741-50)。在两轮中针对与CLEC12A的结合选择来自这些库的噬菌体。这是通过用偶联至包被到表面上之His标签(Sino Biological，目录号11896-H07H)的CLEC12A的胞外结构域(氨基酸75至275)孵育来完成的。除去未结合的噬菌体，将结合的噬菌体进行化学洗脱并用来感染在含噬菌体细菌的选择压力下生长的细菌。在挑选了一些存活的细菌菌落后，营救噬菌体并提交至下一轮的选择和繁殖。

在完成选择之后，通过流式细胞术筛选与肿瘤细胞系HL60上表达的CLEC12A结合的剩余噬菌体。作为结合的阳性对照，使用CLEC12A基准抗体。将来自基本上所有噬菌体的核苷酸材料提交至菌落PCR以扩增VH区和测序PCR以确定VH区序列，所述噬菌体表现出与表达CLEC12A之细胞的特异性结合。所得的序列基于它们HCDR3的独特性而被聚类。来自每个独特HCDR3簇的VH区被克隆到用于以IgG单特异性或双特异性形式连同重排的人IGKV1-39/IGKJ1 LC表达的载体中。

三个选择的具有独特HCDR3序列的CLEC12A结合分子表现出以IgG形式的所需谱，其包括下列特征(表2和数据未示出)：

与分离的CLEC12A胞外结构域特异性地结合。

与在肿瘤细胞系上表达的CLEC12A特异性地结合。

确认人PBMC上髓系特异性的表达模式。

表2：CLEC12A Fab臂的表征。

＊在ELISA中测试，以2μg/mL包被的CLEC12A(Sino Biological)的胞外结构域，以光密度(同种型对照背景信号：0.127)给出结果。

＊＊通过流式细胞术对具有优化的IgG浓度的HL60细胞进行测试，以平均荧光强度(同种型对照背景信号：116)给出结果。

＊＊＊ELISA中以Fab形式的测试，以20μg/mL针对基准IgG。

实施例4：CD3×CLEC12 bsAb之功能CLEC12 Fab臂的选择

随后在具有新CD3Fab臂作为固定臂的双特异性IgG形式中表达如实施例3中所描述之选定的CLEC12A Fab臂。这个新的CD3Fab臂，称为“3896CD3IgG”或简称“3896”，其也使用huVκ1-39轻链。图20中描述了这种CD3特异性VH候选3896的核苷酸序列和氨基酸序列。因此，表达的多种双特异性CD3×CLEC12A分子均具有相同的3896抗CD3臂但CLEC12A臂不同(CLEC12A基准臂或候选CLEC12A Fab臂4327、4331或3918中的任一)。然后，在如实施例1中所述的靶细胞裂解测定中对这些CD3×CLEC12A双特异性分子进行功能测试。结果表示为同种型对照相关的特异性裂解的百分比。所有的候选CLEC12A Fab臂都表现了双特异性形式的HL60靶细胞的剂量依赖性特异性裂解，与使用CLEC12A基准Fab臂具有类似的或更好的动力学(图5)。

另外，虽然对于相同的程度的特异性裂解需要高1log的浓度，但是CD3×同种型对照bsAb示出了剂量依赖性的靶细胞裂解。尽管通过添加HS，存在过量的人IgG，此单价CD3IgG的杀伤活性仍然明显，可能是通过Fc介导的交联。如由实施例7清楚地，这个靶标的非特异性裂解确实可以通过CH2改造沉默Fc受体的相互作用而完全消除。

实施例5：使用AML T细胞和/或AML肿瘤细胞之CD3×CLEC12产物候选物的效力

实施例1和4证明了使用CD3 Fab臂3056或3896和使用CLEC12A Fab臂候选物4327、4331或3918或CLEC12A基准Fab臂3116之CD3×CLEC12A双特异性IgG在诱导由健康供体静息T细胞介导的HL60靶细胞裂解中的效力。在本实例中，研究T细胞是否衍生自AML患者(为CD3×CLEC12A双特异性药物的治疗应用中的一个主要指示)，在用CD3×CLEC12A双特异性全长IgG刺激后，其可被刺激以杀伤肿瘤靶标。接着，确定来源于患者的T细胞在CD3×CLEC12A双特异性全长IgG刺激后是否可以杀伤自体AML肿瘤细胞母细胞。

根据实施例1中所述的程序，从AML患者的外周血分离T细胞。然后，用CFSE标记的HL60细胞孵育纯化的来源于患者的T细胞并如实施例1中所述对细胞裂解进行监测。

另外，用从相同患者分离的AML肿瘤母细胞进行T细胞介导的靶细胞裂解测定(Norde等，Blood 2009(113)2312)。然后用CFSE标记分离的母细胞并在如Norde等所述的细胞因子混合物存在的情况下以及CD3×CLEC12A双特异性IgG或对照存在的情况下，与来源于患者的自体T细胞进行共培养。如实施例1中所述对靶细胞裂解进行监测。

实施例6：在与CD3×CLEC12A双特异性IgG接触之后由T细胞释放细胞因子

使用T细胞刺激性生物制品，T细胞的过度刺激是有严重风险的，因为这可能会导致细胞因子释放综合征(Suntharalingam等，2006，New England J Med 355(10)，第1018-1028页；Chatenoud等1990，Transplantation 49(4)，第697-702页)。为了研究由CD3×CLEC12A双特异性IgG诱导的T细胞刺激的程度，研究了T细胞和表达Fc受体的靶细胞之共培养物中T细胞细胞因子的诱导。

简言之，如实施例1中所述，在候选3056×3116CD3×CLEC12A双特异性IgG(1μg/mL)或对照IgG存在的情况下，与HL60靶细胞共培养健康供体静息T细胞。两天之后，将上清液取样并使用人细胞因子人10-Plex面板(lnvitrogen，目录号LHC0001)以本领域已知的Luminex测定来测定细胞因子的产生水平。此面板覆盖了10种主要的Th1和Th2细胞因子。

如预期的，CD3单特异性二价IgG诱导IFNγ、TNFα和IL-2的强产生(表3)，认为这主要驱动了细胞因子释放综合征。此外，通过与CD3 IgG进行孵育，增加了IL-4、IL-6、IL-8和IL 10的产生。与此相反，CD3×CLEC12A双特异性IgG仅诱导IL 8生产至与CD3 IgG类似的水平；其他细胞因子并没有通过双特异性IgG被显著诱导。在任何条件下GM-CSF都低于检测极限。

表3：抗体诱导的T细胞细胞因子释放。

结果以两个供体细胞因子的平均浓度pg/ml±标准差给出。

这里示出的数据表明对于不同的CD3×CLEC12A双特异性IgG分子有利的治疗特性，因为它们有效地诱导靶细胞裂解(实施例1和4)，而没有触发如用CD3 IgG所观察到的T细胞分泌潜在有害量的促炎性细胞因子。

实施例7：Fc沉默对CD3×CLEC12A bsAb之体外效力的影响

表明实施例4中示出的通过CD3×同种型对照bsAb的剂量依赖性靶细胞裂解是由bsAb Fc部分与HL60靶细胞上Fc受体的相互作用引起的。因为这种靶向非特异性细胞裂解还可通过与在靶细胞上或旁观者细胞(例如NK细胞)上的Fc受体的相互作用体内发生，所以采用CH2/下铰链区的改造来诱导Fc介导的bsAb活性的沉默。

为此，使用235G 236R双突变(DM；DM-FC)或234F 235E 331S三突变(TM，TM-Fc)检验了两种Fc突变策略。产生了具有DM-Fc或TM-Fc的CD3×CLEC12A bsAb(3056×3116)并通过流式细胞术证实了与表达CLEC12A的细胞结合，其与具有野生型Fc的bsAb有相同的强度(数据未示出)。接着，在HL60靶细胞裂解测定(参见实施例1和4)中测试了这些bsAb和CD3×同种型对照bsAb的野生型、DM-Fc和TM-Fc形式。结果表示为同种型对照相关的特异性裂解的百分比。

通过DM或通过TM的Fc沉默对于CD3×CLEC12A bsAb诱导的HL60细胞特异性裂解的程度没有影响或只有轻微的影响(图6)。然而，对于CD3×同种型对照bsAb，诱导HL60细胞裂解的效力被TM显著降低，并甚至被DM进一步降低。

这证明由CH2/下铰链改造引起的Fc沉默通过产生高效且特异性募集效应细胞的双特异性CD3×CLEC12A IgG1形式进一步有助于异常细胞的靶向特异性杀伤，并减少由表达正常Fcγ受体的辅助细胞介导的潜在非特异性免疫活化。

实施例8：Fc沉默对于与FcRn、CD16、CD32、CD64和C1q结合的影响

通过生物膜层干涉技术(Bio-Layer Interferometry，BLI，Octet QK，FortéBio)确定具有WT Fc或具有沉默的DM-Fc或TM-Fc之候选3056×3116CD3×CLEC12A bsAb与人FcRn的结合。简言之，于室温下在含1.0mg/ml BSA pH6.0的0.1M磷酸盐缓冲液/0.002％吐温20(FcRn结合缓冲液)中，以50μg/ml的浓度将纯化的CD3×CLEC12AWT Fc IgG1、DM-FcIgG1或TM-Fc IgG1捕获至Protein L传感器(FortéBio，目录号18-5085)。接着于室温下，以FcRn结合缓冲液中的1μg/ml浓度添加可溶人FcRn(Sino Biological Inc，CT009-H08H))。使用Octet QK分析软件分析数据显示，在将IgG与ProtL传感器的结合归一化之后，随后具有DM或TM沉默Fc的CD3×CLEC12A bsAb与人FcRN的结合与具有野生型Fc尾的CD3×CLEC12AbsAb相当(图7)，因而FC沉默不会影响FcRn结合。

通过生物膜层干涉技术(BLI，Octet QK，FortéBio)确定具有沉默Fc的CD3×CLEC12A bsAb与CD16、CD32和CD64的结合。方案简述如下：于室温下在1×动力学缓冲液(FortéBio 18-5032)中以50μg/ml的浓度将纯化的CD3×CLEC12A WT Fc IgG1、DM-Fc IgG1或TM-Fc IgG1捕获至Protein L生物传感器(FortéBio，目录号18-5085)。随后于室温下，以动力学缓冲液(FortéBio18-5032)中1.0μg/ml的浓度添加重组的CD16(Sino BiologicalInc，10389-H08H1)、CD32(Sino Biological Inc，10374-H08H)和CD64(Sino BiologicalInc，10256-H08H)蛋白。使用Octet QK分析软件分析Fc受体与bsAb的结合。

通过捕获ELISA测定具有沉默Fc的CD3×CLEC12A bsAb与人C1q的结合。为此，于4℃下在PBS中将纯化的CD3×CLEC12AWT Fc IgG1、DM-Fc IgG1或TM-Fc IgG1以25-0.012μg/ml的浓度范围包被在Nunc-Immuno maxisorp F96板上(Nunc，439454)过夜。随后，在ELISA缓冲液(2％MILK/PBST)中以2.0μg/ml添加人C1q抗体(Quidel，A400)。然后使用绵羊抗人C1q多克隆IgG(Meridian，K90020C)和兔抗绵羊HRP缀合的多克隆IgG(Southern Biotech，6150-05)使复合物可见。最后，开发使用TMB底物(BD 51-2606KC/51-2607KC)结合并且使用微板阅读器(Multiskan EX，Thermo Electron Corporation)量化OD450。

实施例9：评估CD3×CLEC12A双特异性IgG的体内效力。

使用表达荧光素酶的HL60细胞(HL60(-Luc)细胞)进行动物的异种移植研究以确认并扩展使用CD3×CLEC12A双特异性IgG1的体外发现。更具体地，进行这些研究以确定有效剂量的稳态血浆浓度，将在设定1期临床评价的起始剂量中考虑到这点。为此，NOD/SCID小鼠(或相当的免疫受损小鼠)经皮下注射一定量的活HL60(-Luc)细胞，其导致了在注射后两周内大多数动物中建立了皮下HL60肿瘤。在HL60(Luc)接种的同时或在最初的肿瘤形成后，施用5×10E6或1×10E7人PBMC。在施用PBMC的第1天以及3、6和9天后，以多个剂量水平静脉内施用CD3×CLEC12A双特异性IgG或对照单特异性IgG或对照双特异性IgG。在初始HL60(Luc)接种后1周对肿瘤尺寸进行评分。将每个组中肿瘤尺寸的算术平均值(或者表示为肿瘤体积或总生物发光)相对于时间作图。

实施例10：双特异性全长IgG1抗体CD3×CLEC12A在Ia/Ib期研究中的用途。

最后领先的CD3×CLEC12A双特异性全长IgG1候选物被用于制造GMP级的材料以及在AML患者中进行临床评价。首先，进行产物候选物的正式的非临床安全性分析以建立首次在人研究中的安全起始剂量。此后，在复发性和/或难治性AML以及在不宜强化治疗的患者中进行开放(open-lable)多中心剂量递增的Ia/b期试验，以探索静脉(i.v.)施用后CD3×CLEC12A双特异性IgG的安全性和耐受性。次要的评估指标(endpoint)包括药代动力学和药效学特征以及初步的效力分析。通过评估骨髓中AML母细胞的减少来评价总体反应率。根据单次/多次剂量的递增评估Ia期中的最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)。在中期PK分析后，研究的1b期部分形成在MTD的剂量扩展队列(dose extension cohort)或形成给药频率的进一步探索。

实施例11：CD3×CLEC12A bsAb诱导T细胞增殖的能力。

AML患者的T细胞数目比诊断时AML母细胞的量低。众所周知活化后T细胞进行增殖从而导致了T细胞数母的增加。此外，在实施例1中我们已经证明了CD3×CLEC12A bsAb可以活化T细胞并且具有诱导T细胞介导的肿瘤细胞裂解的效力。我们假设用CD3×CLEC12AbsAb处理的AML患者受益于CD3×CLEC12A双特异性分子介导的T细胞活化后T细胞亚群的扩增，因为T细胞的增殖将导致效应T细胞的数目增加。为了证明CD3×CLEC12A bsAb体外诱导T细胞增殖，将静息T细胞进行纯化，用羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行标记并在CD3×CLEC12A bsAb或对照Ab的存在下与自体CLEC12A+单核细胞共培养。为了具体地研究没有非特异性Fcγ活化的CD3×CLEC12A诱导的T细胞增殖，使用如实施例7和8中描述的具有DM-Fc尾的CD3×CLEC12A bsAb。作为对照，包括CD3×同种型对照WT-Fc bsAb，CD3×同种型对照DM-Fc bsAb，具有WT-Fc的单克隆CD3和不相关的同种型对照(具有WT-FC的IgG)。通过标准密度梯度分离来分离来自健康供体外周血的单核细胞和T细胞以富集外周血单核细胞(PBMC)，接着使用CD14微珠(人CD14微珠，Miltenyi Biotec，目录号130-050-201)对单核细胞进行CD14阳性选择，并且使用与针对其他白细胞的磁珠(全T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec，目录号130-096-535)对未接触的T细胞进行阴性选择。全T细胞分离试剂盒使得分离静息(未接触)的T细胞(即未用抗体染色)以避免T细胞预活化的可能性。

随后在具有10％正常人血清(HS)的培养基中以效应细胞：靶细胞为5∶1的比值用纯化的单核细胞和bsAb孵育CFSE标记的纯化的静息T细胞7天。在第7天，通过流式细胞术测量作为T细胞增殖读出的CFSE信号的降低。结果表示为直方图中每个CD3+、CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞的CFSE信号。

阳性对照CD3WT-FcAb诱导T细胞增殖，然而具有WT-Fc的同种型对照IgG不诱导T细胞增殖(图8)。如所预期的，CD3×同种型对照WT-Fc bsAb确实诱导T细胞增殖，但当与二价单特异性抗CD3IgG对照相比时程度较低。相比之下，CD3×同种型对照DM-Fc bsAb由于其沉默的Fc尾不诱导T细胞增殖。CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb也诱导由特异性桥接CD3与CLEC12A抗原所介导的所需T细胞增殖。

这表明如以前证明的CD3×CLEC12A bsAb不仅能够靶特异性诱导T细胞介导的肿瘤裂解，而且还可以有效地诱导导致T细胞数目增加的靶特异性T细胞增殖。此外，这还证明了由CH2/下铰链改造引起的Fc沉默不仅有助于靶特异性杀伤异常细胞，而且通过CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb IgG靶特异性诱导T细胞增殖。

实施例12：评估CD3×CLEC12A诱导来自AML患者的T_EMRA亚群的扩增。

因为证明了CD3×CLEC12 DM-Fc bsAb的T细胞增殖的活化，所以我们接下来想研究CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb是否能够诱导AML患者中CD8+细胞毒性T细胞区室的增殖。已经认识到CD8⁺细胞毒性T细胞是介导肿瘤消退的主要效应因子(Sluijter等，2010)。CD8+T细胞可被分为四个亚群：幼稚细胞(CCR7+CD45RA+)，中央记忆细胞(T_CM，CCR7+CD45RA-)，效应记忆细胞(T_EM，CCR7-CD45RA-)和CD45RA+效应记忆细胞(T_EMRA，CCR7-CD45RA+)。研究表明幼稚和记忆CD8+T细胞亚群响应TCR刺激具有不同增殖和分化能力(Geginat等，2003)。

首先，分析了相比于健康供体，在临床缓解的AML患者外周中血的CD8+区室。为此，通过标准密度梯度分离的方法从来自AML患者和健康供体的冷冻外周血分离PBMC。接着，用CCR7、CD3、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO抗体对PBMC进行染色以通过流式细胞术分析CD8+T细胞亚群。结果表示为在总CD8+T细胞区室中亚群的百分比。

类似于之前所描述的，观察到与来自健康个体的幼稚CD8+T细胞亚群相比，来自AML患者的血液中幼稚CD8+T细胞亚群减少，然而，相比于健康供体，AML患者中T_EMRA区室(CCR7-CD45RA+)增加(图9)。

接下来，进行实验以研究AML患者T细胞区室的肿瘤靶特异性T细胞增殖。更具体地，进行这些实验以确定相对于AML患者的幼稚CD8+T细胞，CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb是否可以增强AML患者的T细胞的增殖和效应T细胞亚群(T_EM和T_EMRA)的生长。

为此，根据实施例11纯化来自临床缓解之AML患者的静息T细胞。通过用CCR7、CD3、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO抗体对PBMC染色随后进行流式细胞术分析在第0天对CD8+T细胞亚群的组分进行分析。此外，用CFSE标记静息T细胞或者不进行标记(如实施例11中所述的CFSE标记)并与具有对照或测试抗体的HL60白血病细胞以E：T比5：1共培养7天。使用CFSE标记的T细胞进行T细胞增殖的量化，而使用未标记的T细胞来确定增殖T细胞亚群的百分比。用1μg/ml的PBS、同种型对照WT-Fc Ab、CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb，CD3×同种型对照DM-FcbsAb和具有WT-Fc的CD3单克隆Ab孵育CFSE标记和未标记的T细胞。7天后，用CD3、CD4和CD8抗体对CFSE标记的T细胞染色，并进行FACS分析以确定绝对的T细胞数和细胞分裂的次数，而用CCR7、CD3、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO抗体染色未标记的CFSE T细胞，通过流式细胞术确定增殖的CD8+T细胞亚群的组分。T细胞的增殖表示为直方图中每个T细胞亚群的CFSE信号并且四个CD8+T细胞亚群的大小表示为总CD8+T细胞区室内的百分比。

实施例13：CD3×CLEC12A bsAb诱导AML患者T细胞介导的肿瘤细胞裂解的功效

在实施例1中证明了CD3×CLEC12A bsAb可诱导通过来自健康供体的静息T细胞对CLEC12A阳性HL60细胞的杀伤。接下来，我们研究了CD3×CLEC12A bsAb诱导AML患者T细胞之靶特异性活化的能力以及其诱导AML患者T细胞介导的HL60细胞杀伤的能力。

使用如实施例11中描述的全T细胞分离试剂盒从临床缓解中的AML患者(AML FAB分类AML-M1/M2、M4或M5)的冷冻外周血分离T细胞。随后，在PBS、同种型对照WT-Fc Ab、CD3×CLEC12A DM-FC、CD3×同种型DM-Fc和阳性对照CD3WT-Fc Ab(所有抗体都以1μg/ml的浓度)存在下，在补充有10％正常HS的培养基中以效应细胞：靶细胞5∶1的比值用CSFE标记的HL60细胞孵育纯化的来源于AML患者的静息T-细胞两天。在共培养两天后，通过流式细胞术分析测定CD3、CD4和CD25的T细胞活化。这些结果表示为每个CD4+T细胞的CD25+细胞百分比。此外，通过流式细胞术对存活的CFSE阳性HL60细胞进行量化。结果表示为相对于IgG的特异性裂解百分比。

这些数据表明由CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb介导的健康供体和AML患者T细胞的抗原特异性活化是可比较的(图10A)。如所预期的，CD3×同种型对照DM-Fc bsAb不诱导健康供体或来源于AML患者的T细胞的活化。证明了通过来源于AML患者的T细胞之CD3×CLEC12ADM-Fc bsAb介导的HL60细胞的裂解(68％的HL60细胞裂解)与健康供体T细胞(69％的HL60细胞裂解，图10B)相当。如所预期的，CD3×同种型对照DM-Fc bsAb不诱导通过AML患者T细胞或者通过健康供体T细胞对HL60细胞的杀伤。因此，CD3×CLEC12A双特异性分子是T细胞介导的肿瘤细胞裂解的有效诱导物，而不管这些T细胞是否来源于AML患者或来自健康供体。

如所表明的，CD3×CLEC12A bsAb具有诱导通过AML患者T细胞有效裂解HL60肿瘤细胞的能力，随后对CD3×CLEC12A bsAb靶向特异性活化AML T细胞的能力进行了评价。此外，测定了CD3×CLEC12A bsAb诱导通过来源于AML患者的自体T细胞裂解原代CLEC12A阳性AML母细胞的能力。首先，将来自诊断期AML患者冷冻保存的骨髓样品解冻，通过流式细胞术分析确定所述样品含有＞70％的原代AML母细胞，在如前所述(Norde等，2009)的补充有10％FCS、100ng/ml GM-CSF、100ng/ml G-CSF、50ng/ml IL-3、25ng/ml SCF和20ng/mlFlt3L的IMDM培养基中培养过夜(O/N)。过夜培养后，通过流式细胞术对表面表达CLEC12A、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45和CD117的原代AML母细胞进行表型并用CFSE进行标记。当患者达到了临床缓解时，收集来源于患者的静息自体T细胞，使用如实施例11所述的全T细胞分离试剂盒从外周血进行分离。随后，在具有10％HS的培养基中以E∶T比5∶1用静息自体T细胞共培养AML母细胞两天。测试的条件包括PBS、同种型对照Ab WT-FC、CD3×CLEC12A DM-FC、CD3×同种型对照DM-Fc和阳性对照CD3WT-Fc Ab(所有抗体都为1μg/ml)。在共培养两天后，通过流式细胞术分析CD3、CD4、CD8和CD25以确定T细胞的活化。这些结果表示为每个CD4+或CD8+AML T细胞的CD25+细胞百分比。通过细胞流式术量化存活的CFSE+/CD45^低双阳性AML母细胞以测定AML母细胞的裂解。结果表示为相对于IgG的特异性母细胞裂解百分比。

这些数据证明CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb具有与单克隆CD3WT-Fc阳性对照Ab相当的诱导AML母细胞靶特异性活化AML T细胞的能力(图11A/B)。此外，这些数据证明CD3×CLEC12A bsAb通过来源于AML患者的T细胞诱导自体AML母细胞的有效杀伤，这与通过单克隆CD3WT-Fc阳性对照Ab诱导的杀伤一样有效(图11C)。如预期的，通过CD3×同种型对照DM-Fc Ab没有诱导AML母细胞的杀伤或有轻微杀伤，这表明观察到的由CD3×CLEC12A bsAb介导的AML母细胞杀伤是T细胞抗原特异性活化和CLEC12A+AML肿瘤细胞特异性裂解的主要结果。总的来说，这项研究证明了CD3×CLEC12A bsAb可通过AML患者T细胞有效地诱导CLEC12A阳性肿瘤细胞的杀伤。

实施例14：Fc沉默对非特异性细胞因子释放的影响

实施例7和8中已证明具有由CH2/下铰链改造引起的Fc沉默(DM-Fc)的CD3×CLEC12A bsAb IgG1形式导致了Fcγ受体亲和力的降低并消除了非特异性Fc受体介导之白血病衍生的HL60细胞系的细胞毒性。接着，研究了在Fc受体阳性旁观者细胞(例如NK细胞)的存在下，具有DM-Fc沉默的bsAb IgG1形式是否消除了非特异性Fc受体介导的细胞毒性。在这项研究中，在其他Fc受体阳性旁观者先天效应细胞(例如NK细胞)的存在下，自体健康供体来源的静息T细胞被重定向以针对CLEC12A阳性单核细胞。为此，通过密度梯度离心从健康供体的肝素化外周血液分离PBMC并以1＊10^6细胞/ml的密度进行铺板。在PBS、同种型对照Ab、CD3×CLEC12A WT-Fc bsAb、CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb、CD3×同种型对照WT-FcbsAb、CD3×同种型对照DM-Fc bsAb或具有WT-Fc的CD3单克隆Ab存在的情况下，在具有10％FBS的培养基中将PBMC培养两天。在两天培养之后，通过流式细胞术根据CD14的表达对存活的单核细胞进行量化。结果表示为相对于IgG的特异性裂解百分比。

这证明对于CD3×CLEC12A双特异性抗体，通过存在DM-Fc区的Fc沉默仅对单核细胞的裂解有较小的影响(图12)。与此相反，对于CD3×同种型对照bsAb，通过存在DM-Fc区的Fc沉默显著降低了单核细胞的非特异性裂解。由此可得出结论，在CD3×CLEC12A bsAb中的Fc沉默还有助于靶特异性杀伤：CD3×CLEC12A DM-Fc bsAb特异性募集T细胞并减少由正常表达Fcγ受体的辅助细胞介导的非特异性免疫活化。

接下来被质疑的是通过在CD3×CLEC12A bsAb中的DM突变引起的Fc沉默是否消除了Fc受体介导的细胞因子的释放，已知其与细胞因子释放综合征(CRS)有关，其是由辅助细胞带来的抗体治疗的常见临床事件。为此，根据制造商的说明书使用Luminex平台的细胞因子人10-plex面板(lnvitrogen，LHC0001)，分析了图13中描述的单核细胞杀伤测定之上清液中的细胞因子谱。在第2天测定了上清液中以下人细胞因子的谱：GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α。示出的结果都是以pg/ml计量的细胞因子浓度。GM-CSF、IL-4和IL-5细胞因子的水平都低于该测定的检测限(数据未示出)。

数据表明CD3×CLEC12A和CD3×同种型对照bsAb都具有WT-Fc尾，诱导IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-2和IFN-γ的释放(图13)。然而，当携带DM-Fc尾时，在CD3×CLEC12A和CD3×同种型对照bsAb中没有发现或仅发现低水平的那些细胞因子，IL-8例外。因为单核细胞是IL-8的主要来源，高IL-8水平被假定为从裂解的单核细胞中释放，并且不是特异的FcR介导的释放的结果。结论是通过bsAb IgG形式中DM突变引起的Fc沉默显著消除了Fc受体介导的与CRS相关的IL-1b、IL-6、TNF-α、IL-2和IFN-γ细胞因子的释放。总的来说，这些数据证明由在CH2/下铰链区中的DM突变引起的Fc沉默通过减低表达正常Fcγ受体的辅助细胞和相关的促炎性细胞因子的释放介导潜在的非特异性免疫活化，而有助于增强通过CD3×CLEC12A DM-bsAb的效应细胞的功效和特异性募集。

实施例15

使用表达CD3的HPB-ALL细胞通过FACS分析比较了候选3896作为全长二价单克隆抗CD3 IgG和候选3056作为全长二价单克隆抗CD3IgG与膜结合CD3的结合。不相关的人IgG1充当同种型对照IgG。根据本领域已知的标准程序进行流式细胞术。如图14A中所示，和3056CD3IgG一样，3896CD3 IgG剂量依赖性地与HPB-ALL细胞上的CD3结合。

接下来，在与鼠OKT3 CD3抗体、3056 CD3 IgG和同种型对照IgG的直接比较中，测试了3896 CD3 IgG诱导T细胞增殖的能力。简言之，将抗体进行系列稀释并固定在96孔板上。在除去未结合的IgG后，添加CFSE标记的T细胞并在37℃下孵育。在第5天，通过流式细胞术分析诱导的T细胞增殖的水平。结果表示为显示出CFSE表达水平至少两倍下降的活T细胞的百分比，并示于图14B中。证明了3896 CD3 IgG作为二价单特异性抗体与候选3056 CD3IgG和鼠OKT3相比，在诱导T细胞增殖方面效力较低。这些数据表明与3056 CD3 IgG相比，作为由3896诱导的T细胞增殖的降低的水平反映了通过流式细胞仪所分析的CD3结合能力的降低。这种结合的差异允许选择具有所需亲和力的臂，产生了在CD3和CLEC12A结合亲和力之间显示有利平衡的双特异性抗体，使得T细胞和CLEC12A阳性AML肿瘤细胞有效地集合在一起并且最佳地诱导了T细胞介导的CLEC12A阳性AML肿瘤细胞的裂解。

为了测试在CD3×CLEC12A双特异性抗体形式中新3896抗CD3臂相对于3056抗CD3臂的效力，在如先前所述的HL60细胞毒性测定中对实施例4的3896×CLEC12A基准双特异性抗体(候选3896×3116)和实施例1的3056×CLEC12A基准双特异性(bs)抗体(候选3056×3116)进行了直接的比较。结果示于图15中。观察到3896×CLEC12A基准bsAb与3056×CLEC12A基准bsAb具有相似的效力。因此，因为两个双特异性抗体的不同仅在于它们的CD3Fab臂，而CLEC12A Fab臂相同，所以结论是在CD3×CLEC12A双特异性Ab中，3896 CD3 Fab臂的功能类似于3056 CD3 Fab臂。应该注意的是在较低浓度时，候选3896×3116甚至比候选3056×3116更好。如本文前面所解释的，这是有利的，因为它提供了更大的治疗窗。

实施例16

在实施例3中，从噬菌体展示文库选择CLEC12A特异性Fab臂组。所有的CLEC12A结合分子都包含huVk1-39轻链。选择了三个CLEC12A结合分子：Fab 3918、4327和4331。这些Fab表示为全长的人IgG1：3918CLEC12A IgG、4327 CLEC12A IgG和4331 CLEC12A IgG。在图20中提供了3918CLEC12A IgG的VH，4327CLEC12A IgG的VH和4331CLEC12A IgG的VH以及共有VL(IGKV1-39；O12)的核苷酸序列和氨基酸序列。

对于与由HL60细胞表达的CLEC12A结合的全长的CLEC12A抗体进行了测试。

通过使用表达CLEC12A的HL60细胞由FACS分析比较了3918CLEC12A IgG、4327CLEC12A IgG和4331 CLEC12A IgG与CLEC12A基准抗体(3116)与膜结合CLEC12A的结合。不相关的人IgG1充当同种型对照IgG。根据本领域已知的标准程序进行流式细胞术。如图16所示，4327CLEC12A IgG以与CLEC12A基准抗体类似的方式与CLEC12A结合。另外两种抗体，3918CLEC12A IgG和4331CLEC12A IgG也证明了与HL60细胞上之CLEC12A良好的剂量依赖性结合。它们与CLEC12A的结合似乎比CLEC12A基准抗体稍低。总之，Fab 3918、4327和4331是良好的CLEC12A结合臂。

实施例17

测试了包含3896 CD3 Fab臂和CLEC12A Fab臂3981、4327或4331的双特异性分子是否具有功能。

为此，使用本领域用于产生双特异性IgG1的已知方法(Gunasekaran等，WO2009/089004)将3896CD3Fab臂的VH序列和CLEC12A基准抗体或3918CLEC12A Fab、4327CLEC12AFab或4331CLEC12A Fab的VH区连同重排的huVκ1-39轻链克隆到表达载体中以产生双特异性抗体：3896×CLEC12A基准、3896×3918、3896×4327和3896×4331。

按照之前所述的HL60细胞毒性测定测试这些双特异性的功能。在不同浓度的双特异性抗体以E∶T比5∶1存在下或在10％HS存在48小时下，与CFSE标记的HL60细胞共培养来自两个健康供体(HD1和HD2)的静息T细胞。在第2天通过流式细胞术对存活的CFSE阳性HL60细胞进行量化。在图17中结果被表示为特异性裂解百分比。对于来自供体1(HD1；图17上图)的T细胞和供体2(HD2；图17下图)的T细胞的两个单独实验，证明当在高浓度下孵育时，所有的双特异性都与3896×CLEC12A基准双特异性一样有效。

应当注意，特别是双特异性抗体在较低浓度时，观察到3896×4327和3896×4331的双特异性抗体均比3896×CLEC12A基准双特异性更有效。因此，因为这些双特异性抗体的不同仅在于其CLEC12A的Fab臂，而CD3的Fab臂相同，所以可得出的结论是4327和4331CLEC12A Fab臂的功能比CLEC12A基准Fab臂更有效。不希望受限于理论，观察到的3896×4327和3896×4331相对于3896×CLEC12A基准双特异性IgG之间的差异可能反映了这些新抗CLEC12A Fab臂的结合亲和力的不同或它们可能靶向不同的CLEC12A表位，使得肿瘤细胞与表达CD3的T细胞更有效的交联。

实施例18

在实施例2中，证明了当在ELISA中进行测试时，CLEC12A Fab 3918和4331竞争性地与CLEC12A上的表位结合，因为Fab形式针对CLEC12A基准抗体的Fab片段。然而。在该测定中，4327 CLEC12A Fab并没有与CLEC12A基准IgG竞争结合(表2)。

在这个实验中，测试了4327CLEC12A IgG的全长IgG是否与CLEC12A基准抗体竞争性地与CLEC12A结合。简言之，用50μg/ml的第一抗体在冰上预孵育HL60细胞20分钟。接着，将Oregon Green(OG)标记(Invitrogen，目录号A10476)的第二抗体以1μg/ml添加至细胞以及第一抗体(加入OG标记IgG后第一抗体的浓度为约45μg/ml)。20分钟后，洗涤细胞并通过FACS进行分析。

结果示于图18中：结论是4327CLEC12A IgG和CLEC12A基准IgG竞争地与CLEC12A结合。这表明这两种IgG结合CLEC12A抗原上密切相关的表位或它们结合到由于空间位阻而不容许两个IgG同时结合的不同的表位上。

实施例19

前面的实施例中已证明CD3×CLEC12A双特异性形式中的CLEC12A Fab臂4327、4331、3918以及3116是CLEC12A的良好结合物以及T细胞介导的杀伤的有效诱导物。迄今，使用用于驱动免疫球蛋白重链异源二聚化的已知方法获得双特异性抗体(Gunasekaran等)。

在我们的共同未决的US和PCT申请(美国正式申请NO：13/866,747和PCT/NL2013/050294；通过引用并入本文)中，我们已经公开了用于从单个细胞产生双特异性抗体的方法和手段，其中提供了相比于单特异性抗体的形成，有利于双特异性抗体形成的手段。这些方法也可有利地用于本发明中。特别地，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是第一CH3结构域中的氨基酸替换L351K和T366K(根据EU编号)(‘KK-变体’重链)和第二CH3结构域中的氨基酸替换L351D和L368E(‘DE-变体’重链)，或者反之亦然。在我们之前的共同未决的US13/866,747和PCT/NL2013/050294申请中证明了DE变体和KK-变体优先配对以形成异源二聚体(所谓的‘DEKK’双特异性分子)。由于相同重链之间的CH3-CH3界面中带电荷残基间的强斥力，因此几乎不发生DE-变体重链的同源二聚化(DEDE同源二聚体)或KK-变体重链的同源二聚化(KKKK同源二聚体)。

为了证明CD3×CLEC12A双特异性分子的作用不受已知的用于异源二聚化的突变(Gunasekaran)或DEKK突变的影响，使用DE变体和KK变体重链驱动不同重链的异源二聚化以制备CD3×CLEC12A双特异性。另外，在这些DE和KK变体重链中引入CH2/下铰链双突变(L235G和G236R；DM)。这些所得的双特异性分子的Fc尾被称为‘DM DEKK’。

简言之，将3116、4327或4331CLEC12A Fab臂的VH区克隆到含有DE-变体+DM重链的表达载体中，而将3056CD3抗体的VH区克隆到含有KK-变体+DM重链的表达载体中(美国正式申请No：13/866,747和PCT/NL2013/050294)，并且将这些表达载体连同编码重排的人IGKV1-39/IGKJ1(huVκ1-39)轻链的核酸分子一起提供至宿主细胞，使得所述宿主细胞表达并产生双特异性抗体。随后，以如之前所述在HL60细胞毒性测定中测试所得3056×3116DMDEKK、3056×4327DM DEKK和3056×4331DM DEKK双特异性抗体的效力。其结果示于图19中：证明所有的变体仍能够有效的裂解肿瘤细胞，并由此得出结论，DM和DEKK突变可被引入到CD3×CLEC12A双特异性抗体的Fc区，同时保持诱导肿瘤细胞裂解的能力。

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WO 2010/108127

Claims

1.双特异性人IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体包含特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的一条臂和特异性识别免疫效应细胞上之抗原的第二臂，所述双特异性IgG抗体能够将所述免疫效应细胞募集到表达CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的异常细胞，其中所述特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的臂包含含有序列的可变重链序列，以及含有序列的可变轻链序列。

2.根据权利要求1所述的双特异性IgG抗体，其中所述免疫效应细胞包含T细胞。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性IgG抗体，其中所述免疫效应细胞上的所述抗原是CD3。

4.根据权利要求3所述的双特异性IgG抗体，其中所述抗体特异性地识别CD3ε。

5.根据权利要求1所述的双特异性IgG抗体，其中所述轻链是重排的种系人κ轻链IgVκ1-39＊01/IGJκ1＊01。

6.根据权利要求1或2所述的双特异性IgG抗体，其中所述双特异性抗体是人IgG1。

7.双特异性人IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体包含特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的一条臂和特异性识别免疫效应细胞上之抗原的第二臂，所述双特异性IgG抗体能够将所述免疫效应细胞募集到表达CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的异常细胞，其中所述特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的臂包含以下序列：含有序列的可变重链序列，以及含有序列的可变轻链序列。

8.双特异性人IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体包含特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的一条臂和特异性识别免疫效应细胞上之抗原的第二臂，所述双特异性IgG抗体能够将所述免疫效应细胞募集到表达CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的异常细胞，其中所述特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1的臂包含以下序列：含有序列的可变重链序列，以及含有序列的可变轻链序列。

9.根据权利要求3所述的双特异性IgG抗体，其中所述特异性识别CD3的第二臂包含以下序列：由序列SYGMH组成的重链CDR1序列、由序列IIWYSGSKKNYADSVKG组成的重链CDR2序列以及由序列GTGYNWFDP组成的重链CDR3序列。

10.根据权利要求9所述的双特异性IgG抗体，其中所述特异性识别CD3的第二臂包含由序列组成的可变重链序列。

11.根据权利要求1或2所述的双特异性IgG抗体，其中所述双特异性IgG抗体具有突变的CH2和/或下铰链结构域，使得所述双特异性IgG抗体与Fcγ受体的相互作用显著降低。

12.根据权利要求11所述的双特异性IgG抗体，其中所述突变的CH2和/或下铰链结构域在根据EU编号的235位和/或236位氨基酸包含至少一个替换。

13.根据权利要求11所述的双特异性IgG抗体，其中所述突变的CH2和/或下铰链结构域包含根据EU编号的替换L235G和/或G236R。

14.根据权利要求11所述的双特异性IgG抗体，其中所述突变的CH2和/或下铰链结构域包含根据EU编号的替换L235G和G236R。

15.用于从单个细胞产生根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性IgG抗体的方法，其中所述双特异性IgG抗体包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括提供：

-这样的细胞，所述细胞具有a)编码特异性识别CLEC12A或CLL-1或DCAL-2或MICL或KLRL1且包含第一CH3结构域之所述IgG重链的第一核酸序列；和b)编码特异性识别免疫效应细胞上的抗原，且包含第二CH3结构域之所述IgG重链的第二核酸序列，其中所述核酸序列具有用于使所述第一CH3结构域和第二CH3结构域优先配对的手段，所述方法还包括培养所述细胞以及允许所述两种核酸序列表达并从培养物收获所述双特异性IgG抗体的步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗原是CD3。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞具有编码重排的种系人κ轻链IgVκ139＊01/IGJκ1＊01的第三核酸序列。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的用于产生双特异性IgG1抗体的方法，其中所述第一CH3结构域包含根据EU编号的氨基酸替换L351K和T366K并且其中所述第二CH3结构域包含根据EU编号的氨基酸替换L351D和L368E，所述方法还包括培养所述细胞以及允许所述核酸序列表达并从培养物收获所述双特异性抗体的步骤。

19.药物组合物，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性IgG抗体和可药用载体。

20.根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性IgG抗体在制备用于治疗或预防骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓性白血病(CML)或急性髓性白血病(AML)的药物中的用途。