CN103797033B - 多特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多特异性抗体构建物，所述构建物包括含有Fab片段，所述Fab片段在CH1和CL结构域的界面处有突变，所述突变防止了重链/轻链的错配。

Description

多特异性抗体
本发明涉及多特异性(特别是双特异性)的抗体分子的生产。
在基于蛋白质的药物中，单克隆抗体(mAbs)具有特殊的特性，可作为药物以及作为靶向递送系统发挥作用。最近发现，单克隆抗体在治疗各种疾病方面具有巨大的潜力，特别是包括多种类型的癌症，其较传统化疗具有更高的特异性。
天然形成的抗体分子的基本结构为Y形四聚体的四级结构，它由两条相同的重链以及两条相同的轻链构成，这些链通过非共价键相互作用和链间二硫键保持在一起。
在哺乳动物中，有5种类型的重链：α、δ、ε、γ和μ，它们分别决定了免疫球蛋白的类别(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。重链的N端可变区(VH)后接着一个恒定区，在重链α、β和δ中包括三个结构域(自N端至C端编号为CH1、CH2和CH3)，而重链μ和ε的恒定区包含了4个结构域(自N端至C端编号为CH1、CH2、CH3和CH4)。IgA、IgG和IgD的CH1和CH2结构域被一柔性铰链所分隔，该铰链的长度随类型不同而有所不同，并且在IgA和IgG的情况下，在不同亚型中长度也有所不同：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4分别具有长为15、12、62(或77)和12个氨基酸的铰链，而IgA1和IgA2分别具有20和7个氨基酸的铰链。
轻链有2种：λ和κ。轻链可与任何同种型的重链相结合，但在一个给定抗体分子中的两条轻链皆为同一种轻链。两条轻链在功能上显示出相同性。它们的N末端可变区(VL)后接一恒定区，该恒定区由一个单一的结构域(称为CL)构成。
重链和轻链通过CH1和CL结构域之间的蛋白/蛋白相互作用进行配对，而2条重链通过它们的CH3结构域之间的蛋白/蛋白相互作用相结合。免疫球蛋白分子结构，一般通过CH1和CL结构域之间及铰链之间的链间二硫键而进行稳定。
治疗性抗体的临床效力，有赖于它们的抗原结合功能以及效应子功能(effector function)，这些功能分别与免疫球蛋白分子的不同部位相关。
抗原结合区对应于Y形结构的臂区，包含每条与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链，并称作Fab片段(即抗原结合片段)。Fab片段最初是天然免疫球蛋白分子经木瓜蛋白酶消化而产生的，该酶在铰链区中位于链间二硫键的氨基端处，将抗体分子切开，从而释放2个相同的抗原结合臂。其它蛋白酶例如胃蛋白酶，也在铰链区切割抗体分子，但切割位点位于链间二硫键的羧基端，从而释放由2个相同Fab片段构成的并且仍通过二硫键连接在一起的片段；对F(ab’)2片段中的二硫键进行还原，会生成Fab’片段。
对应于VH和VL结构域的抗原结合区部分，被称作Fv片段(即可变片段)；它包含形成抗原结合位点(也作互补位)的CDR(complementarity determiningregions，互补决定区)。除了使抗体特异性导向至其靶目标，抗原结合区在结合于其靶抗原之后，可诱导各种不同的生物信号；取决于靶抗原和所述抗原上被抗体所识别的表位，所述信号可为正的或负的。就肿瘤治疗领域的应用而言，一般偏好这样的抗体，该抗体能够传递生长抑制性或细胞凋亡的信号，从而导致肿瘤细胞的细胞停滞(cytostasis)或死亡(VERMA等人,J Immunol,186,3265-76;2011)。
抗体的效应子功能，来自于其与诸如补体蛋白之类的效应子分子的结合，或来自其与如巨噬细胞或自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞表面的Fc受体的结合。它导致了不同的效应，从而引发对靶抗原的吞噬作用或裂解，例如抗体依赖性吞噬作用(ADP)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)、或补体依赖性细胞介导的细胞毒反应(CDC)。
负责使抗体结合于效应子分子或效应子细胞的抗体效应子区，对应于Y形结构的茎部(stem)，它包含配对的重链CH2和CH3结构域(或CH2、CH3和CH4结构域，视抗体类型不同而异)，并称作Fc(即“可结晶片段”)区。
由Fc区介导的ADCC、ACP和CDC，在单克隆抗体的治疗活性中起着主要作用。ADCC机制似乎是核心的，因为已表明，在Fcγ受体基因缺陷型裸鼠中，2种主要的临床上成功的单克隆抗体(抗HER2和抗CD20的mAb)的抗人肿瘤异种移植物的治疗作用，几乎完全丧失(CLYNES等人,Nat Med,6,443-6,2000)。ADP机制也在若干例人肿瘤的鼠模型中显示出是至关重要的(UCH1DA等人,J.Exp.Med.199:1659-69,2004)，而CDC也经证实于抗CD20抗体的体内治疗活性中扮演着根本的角色(DI GAETANO等人,J Immunol,171,1581-7,2003)。
取决于2条重链和2条轻链的种类(identity)，天然存在的抗体分子具有2个相同的抗原结合位点，且由此可同时与2个相同的表位进行结合。
在1980年代，在同一个分子上具有识别2个不同表位的2个抗原结合位点并因而能同时结合于2个不同靶目标的双特异性抗体，是通过将产生特异性迥异的抗体的2个细胞融合在一起而产生的(MILSTEIN&CUELLO,Nature,305,537-40,1983)。据显示，这样的双特异性抗体能将效应T细胞靶向引导至肿瘤细胞(STAERZ等人,Nature,314,628-31,1985)。
已有一系列文献对双特异性抗体的广泛应用作了描述(SONGSIVILAI&LACHMANN,Clin Exp Immunol,79,315-21,1990)，其中包括例如，在治疗领域，对效应子细胞(细胞毒性T细胞、NK细胞和巨噬细胞)或效应分子(毒素、药物、药物前体、细胞因子、放射性同位素和补体系统)进行靶向引导，以及在诊断领域，用作免疫分析的试剂。
最初，双特异性抗体通过化学偶联进行制备，或通过使用经2株产生不同单克隆抗体的细胞杂交瘤细胞系融合而成的四元瘤(quadroma)进行制备。然而，化学偶联偶尔可能改变抗原结合位点，从而导致对该抗体的生物特性的损害。而四元瘤方法有着这样的缺陷：两个不同抗体的重链和轻链的随机配对，理论上导致10种可能性相同的结合，从而在得到免疫球蛋白分子的混合物中，仅一种为所需的双特异性产物，而该产物还需要自错配的其它产物中分离出。
近年来，基因工程已成为了生产双特异性抗体的供选择的方法，并已导致开发了各种不同的重组双特异性抗体形式。其中，一些双特异性抗体非常简单，它们衍生自两个或多个不同抗体来源的单链Fv(scFv)片段，而所述Fv片段通过合适的肽接头相连。这些抗体的生产相对容易，且因为它们由单个肽链形成并仅包含亲本抗体的Fv区，因此没有链间错配的问题。然而，它们小于全长的免疫球蛋白，并且缺少恒定区（特别是Fc区）。尽管在某些用途中这可能具有优势（例如当人们希望避免Fc介导的效应子功能时），而当需要Fc介导的效应子功能(例如CDC、ADCC或ADP)时，这是不利的。并且，由于它们的分子较小并缺乏Fc区，因此在体内的半衰期非常短。
因此，还设计了其它形式的双特异性重组抗体，它们对自然存在的免疫球蛋白分子的模拟更接近并特别具有完整Fc区。它们可以分为两种主要形式。
在第一种形式中(IgG scFv)，来自抗体A的scFv片段被融合于抗体B的重链末端(一般为C末端)。所得的抗体仅有一种类型的重链（其中包括抗体B的VH、CH1、CH2和CH3结构域以及抗体A的VH和VL结构域）以及一种类型的轻链（其中包括抗体B的VL和CL结构域），故不发生链间的错配。此类形式由例如QU等人描述(Blood,111,2211-9,2008)。
在第二种形式中，来自抗体A的重链和轻链与来自抗体B的重链和轻链配对。该形式复制了四元瘤所产生的双特异性抗体，并因此引发了类似的错配问题。为了解决重链错配的问题，有人提出将抗体的CH3结构域进行突变，以利于异二聚体化(即重链A和重链B进行配对)并防止同二聚体化。这已经由所谓的“凸起-嵌-凹孔”(“knob-into-holes”)法得以实现(RIDGWAY等人,ProteinEng,9,617-21,1996;US7695936)。在抗体A重链CH3的二聚体界面处，对小氨基酸分子用更大的氨基酸分子进行取代，这样形成“凸起（knob）”突变，从而造成阻止同二聚体化的空间阻碍。同时，为了促进异二聚体化，在抗体B的CH3结构域处引入一互补的“凹孔（hole）”突变，该突变是对一个大氨基酸分子用更小的氨基酸分子进行替代。为了解决重链/轻链的错配问题，有人提出，使用具有不同特异性但具有相同轻链的抗体，而这些抗体可先从scFv噬菌体文库中被鉴定出(MERCHANT等人,Nat Biotechnol,16,677-81,1998;US7183076)。此方法的缺点在于，鉴定具有相同轻链的抗体有一定困难性。
本发明人现在发现，通过对位于CH1和CL结构域的界面的某些关键残基进行突变，可防止重链/轻链错配并由此确保形成所需的链匹配。
更具体地，本发明人发现了适用于此目的若干组的突变。在第一个例子中，一个相互作用的极性界面残基对，被替换为中性的和可形成盐桥的残基对。选取CH1链上的Thrl92用Glu进行替换以及将CL链上Asnl37替换为Lys。这两个突变的残基形成一盐桥，据推测该盐桥增强了结合的特异性，并且应避免不需要的配对，这可通过使得野生型和变异链之间缺乏空间互补性和电荷互补性而实现。此外，将CL链上Ser1l4替换为Ala，可避免其与更大的赖氨酸侧链发生空间碰撞。
在第二组突变形式中，本发明人选择对CH1结构域的Leul43用Gln残基进行替换，而CL链上的面对面的残基，即Val133，被替换为Thr残基。该第一双重突变构成了从疏水性相互作用向极性相互作用的转换。同时，选择将两个相互作用的丝氨酸(位于CH1上的Serl88和位于CL链的Serl76)突变为缬氨酸残基，从而实现从极性相互作用向疏水相互作用的转换。这种界面相互作用的极性/疏水性的变换，预计将保持突变型CL和CH1结构域之间的亲和力不变，同时降低它们各自同其他野生型的对应结构域(counterparts)的亲和力，从而防止因为不匹配的(变异/野生型)链复合时发生的不良相互作用而产生的错配（一对相互作用的非极性残基变换为一对极性氨基酸，而一对相互作用的极性残基同时变换为一对疏水残基）。
第三组和第四组突变为“凸起-嵌-凹孔”型突变。更具体地，在第三组突变(KH1)中，CH1结构域的Leu124和Leu143分别被替换为Ala和Glu残基，并且CL链的Val133被替换为Trp残基；而在第四组突变(KH2)中，CH1结构域中的Val190被替换为Ala残基，而CL链的Leu135和Asn137分别被替换为Trp和Ala残基。
如本文所用，用于CH1和CL结构域的序列位置编号，指Kabat编号法(Kabat,E.A.等人,Sequences of proteins of immunological interest.第五版-美国卫生和公众服务部,NIH publication n°91-3242,pp662,680,689,1991)。
因此，本发明的一个目的在于提供一种突变的Fab片段，它选自：
a)一种Fab片段，该片段包括：
*感兴趣抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第192位的苏氨酸残基用谷氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第137位的天冬酰胺残基用赖氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第114位的丝氨酸残基用丙氨酸残基进行取代而形成；
b)一种Fab片段，该片段包括：
*感兴趣抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第143位的亮氨酸残基用谷氨酰胺残基进行取代以及对所述CH1结构域第188位的丝氨酸残基用缬氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CL结构域，通过对所述CL结构域第133位的缬氨酸残基用苏氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第176位的丝氨酸残基用缬氨酸残基进行取代而形成；
c)一种Fab片段，该片段包括：
*感兴趣抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自IgG免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第124位的亮氨酸残基用丙氨酸残基进行取代以及对所述CH1结构域第143位的亮氨酸残基用谷氨酸残基进行取代而形成；
*一种CL结构域，该结构域衍生自IgG免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第133位的缬氨酸残基用色氨酸残基进行取代而形成；
d)一种Fab片段，该片段包括：
*感兴趣抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第190位的缬氨酸残基用丙氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第135位的亮氨酸残基用色氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第137位的天冬酰胺残基用丙氨酸残基进行取代而形成。
在一个优选实施方式中，所述CH1结构域衍生自IgG免疫球蛋白，优选IgG1亚型。所述CL结构域优选为κ型。更优选地，用于对人的治疗时，用于衍生形成所述突变型CH1和CL结构域的免疫球蛋白，是人免疫球蛋白。
所述VH和VL结构域可衍生自任何识别靶向表位的抗体，包括天然的或经基因工程(改造)的抗体。
本发明的突变的Fab片段可运用于任何需要防止重链/轻链错配的多特异性抗体构建物。
有利的是，它们被用于本发明人设计的新的多特异性抗体构建物中，该构建物包含一个或多个多特异性抗原结合片段，每个片段主要包含串联排列的、被合适接头所隔开的Fab片段。
如本文所定义，“抗原结合片段”是一种具有两个或多个抗原结合区域的分子，每个区域识别不同的表位。不同的表位可位于同一抗原性分子或不同的抗原性分子上。
因此，本发明的另一个目的在于提供一种多特异性抗原结合片段，它包括至少2个，并可多至5个，不同的Fab片段，所述片段选自：
-Fab片段(此处也定义为“野生型Fab片段”)，它包含免疫球蛋白的野生型CH1和CL结构域；
-如上文定义的突变的Fab片段(a)；
-如上文定义的突变的Fab片段(b)；
-如上文定义的突变的Fab片段(c)；
-如上文定义的突变的Fab片段(d)；
其中，每种Fab片段识别不同的感兴趣的表位，所述Fab片段以任何顺序呈串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C末端与后一Fab片段的VH结构域的N末端，通过多肽接头进行连接。一般，所述的多肽接头长度应至少为20个，优选至少25个，更优选至少30个氨基酸，并且至多80个，优选至多60个，更为优选至多40个氨基酸。
有利的是，所述多肽接头包含选自IgA、IgG和IgD的一种或多种免疫球蛋白的绞链区的全部或部分序列。如果所述抗体将用于人体治疗，则优选人源的铰链序列。
人IgG、IgA和IgD的绞链区的序列如下所示：
IgAl(SEQ ID NO:1):
VPSTPPTPS PSTPPTPSPS
IgA2(SEQ ID NO:2):
VPPPPP
IgD(SEQ ID NO:3):
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP
IgG1(SEQ ID NO:4):
EPKSCDKTHTCPPCP
IgG2(SEQ ID NO:5):
ERKCCVECPPCP
IgG3:
ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:6),后接0个或1-4个以下序列的重复序列：EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO:7)。
IgG4:
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:8)
所述多肽接头可以包含仅一种免疫球蛋白的绞链区的全部或部分序列。在此情况下，所述免疫球蛋白与衍生出相邻CH1结构域的免疫球蛋白，两者可属于相同的同种型或亚型，或属于不同的同种型或亚型。
或者，所述多肽接头可以包含至少2个不同的同种型或亚型的免疫球蛋白的绞链区的全部或部分序列。在此情况下，直接连于CH1结构域的多肽接头的N末端部分，优选包括与衍生出所述CH1结构域的免疫球蛋白属于同一同种型或亚型的免疫球蛋白的全部或部分绞链区。
任选地，所述多肽接头还可包含免疫球蛋白CH2结构域N末端的长度为2-15个氨基酸，优选5-10个氨基酸的序列。
在一些情况下，可使用来自天然绞链区的序列；在另一些情况下，可以对这些序列进行点突变，特别是对天然IgGl、IgG2或IgG3绞链区的一个或多个半胱氨酸残基用丙氨酸或丝氨酸进行取代，从而避免不利的链内或链间二硫键。
可用于本发明多特异性抗原结合片段的、非限定性的多肽接头例子，是具有以下序列的多肽：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:9)。所述多肽由人IgGl绞链区的全长序列(SEQ ID NO:4)构成，后接人IgGl CH2结构域的9个N末端氨基酸(APELLGGPS,SEQ ID NO:10)，后接人IgAl铰链区的一部分序列(TPPTPSPS,SEQ ID NO:11)，后接二肽GG（添加所述二肽以便为接头提供补充性的柔性）。
任选地，可使用一段人Ig1CH2结构域的N末端序列的较短片段。也可使用人IgA1铰链的较长片段，最长可为绞链的全长序列(优选去除N端缬氨酸残基)。在一个具体实施方式中，所述人IgA1铰链序列可以被人工序列所替代，所述人工序列含有交替的苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基。
例如，SEQ ID NO:9多肽的变体(其亦适合用于本发明的多特异性抗原结合片段)，是具有以下序列的多肽:EPKSCDKTHTCPPCPAPELLPSTPPSPSTPGG(SEQID NO:12)。在该多肽中，人IgG1绞链的全长序列后接人IgG1CH2的5个N端氨基酸(APELL,SEQ ID NO:13)以及序列PSTPPSPSTP(SEQ ID NO:14)。
在本发明的多特异性抗原结合片段包含2个以上的不同Fab片段的情况下，分隔Fab片段的多肽接头可以相同的或不同的。
在优选的本发明多特异性抗体中，该抗体具有2个相同的抗原结合臂，各臂为如上定义的多特异性抗原结合片段。所述抗体结合臂可依所述抗体的所需用途，以多种多样的方式连接在一起。
若需获取一种无Fc-介导效应的抗体，所述抗体将不包含Fc区。在此情况下，两条抗原结合臂可例如用下述方式连接在一起：
－当所述接头包含半胱氨酸(cystein)残基时，通过隔开所述Fab片段的多肽接头所提供的链间二硫键，使得抗原连接臂同二聚体化；和/或
－通过在每条抗原结合臂的C末端添加包括半胱氨酸(cystein)残基的多肽延伸片段，其中所述残基可形成链间二硫键，以及所述多肽延伸片段的同二聚体化可产生类似于绞链的结构；作为非限定性的例子，所述多肽延伸片段可以是例如IgGl、IgG2或IgG3的铰链序列；
－通过一个半刚性接头连接两条抗原结合臂的重链的C末端，从而形成一个单一多肽链并将所述抗原结合臂各自之间保持足够距离。
或者，若是需要效应子功能（如CDC、ADCC或ADP），本发明的多特异性抗体还包括提供这些效应子功能的Fc结构域。Fc结构域的选择视所需的效应子功能类型而定。
在这个例子中，本发明的多特异性抗体具有类似于免疫球蛋白的结构，它包含：
－如上文定义的2条相同的多特异性抗原结合臂；
－二聚体化的免疫球蛋白CH2和CH3结构域；
－IgA、IgG或IgD的铰链区，其将抗原结合臂CH1结构域的C末端连接至CH2结构域的N末端，或者，IgM或IgE的CH4结构域，其中该CH4结构域在CH3结构域之后，并且在此情况下抗原结合臂CH1结构域C末端直接连接至CH2结构域的N末端。
优选地，所述的CH2和CH3结构域以及或者铰链区或CH4结构域，可衍生自相同的免疫球蛋白，或衍生自与抗原结合臂的CH1结构域相同的同种型和亚型的免疫球蛋白。
可以使用来自天然免疫球蛋白的铰链区、CH2、CH3和最终的CH4结构域。也可以在需要时对它们进行突变，例如为了调整抗体的效应子功能。在一些例子中，可以删去整个或部分的CH2或CH3结构域。
本发明还包括选自下组的任意蛋白链：
－本发明中突变型Fab片段的轻链；
－本发明中突变型Fab片段的重链；
－本发明中抗原结合片段的重链；
－本发明中免疫球蛋白样的多特异性抗体的重链。
本发明的另一目的是提供一种多核苷酸，它包括一编码本发明蛋白链的序列。所述多核苷酸也可以包含附加的序列：特别是，其可有利地包含编码一前导序列或信号肽的序列，以便分泌所述蛋白链。
本发明还包含重组载体（特别是表达载体），所述载体包含本发明的多核苷酸，所述多核苷酸连接于在选定的宿主细胞中有活性的转录调控元件以及翻译调控元件。可用于构建本发明表达载体的载体本身为公众所知晓，并且可基于所需使用的宿主细胞进行具体选择。
本发明还包括用本发明多核苷酸进行转化的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞被以下多核苷酸转化：编码本发明抗原结合片段或多特异性抗体的重链的多核苷酸以及编码2条不同轻链的两条多核苷酸，其中第一条轻链与所述重链的第一VH/CH1区特异性配对；第二条轻链与所述重链的VH/CH1区特异性配对并且所述轻链中至少一条为权利要求1中突变型Fab片段的轻链。任选地，所述宿主细胞可以附加地用编码第三轻链的第三多核苷酸进行转化，所述第三轻链与第一和第二轻链不同并特异性地与所述重链的第三VH/CH1区配对，并且所述宿主细胞可最终用编码第四轻链的第四多核苷酸进行转化，所述第四轻链与第一、二和三轻链不同并特异性地与所述重链的第四VH/CH1区配对，并且所述宿主细胞还可能用编码第五轻链的第五多核苷酸进行转化，所述第五轻链与第一、二、三和四轻链不同的并与所述重链的第五VH/CH1区特异性配对。
所述多核苷酸可以插入同一的表达载体，或分别插入不同的表达载体。
可用于本发明的宿主细胞可以为原核或真核细胞。在可用的真核细胞中，特别提到有植物细胞、来自酵母（如酵母属(Saccharomyces)）的细胞、昆虫细胞（例如果蝇属或Spodoptera属细胞）、以及哺乳动物细胞例如Hela、CHO、3T3、C127、BHK、COS细胞等等。
本发明表达载体的构建以及宿主细胞的转化，可使用常规的细胞生物学技术进行。
本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的抗原结合片段或抗体的方法。所述方法包含：培养本发明的宿主细胞并自所述培养物中回收所述抗原结合片段或抗体。
如果蛋白是由宿主细胞分泌的，则可直接自培养基中回收；若不是，可事先进行细胞裂解。然后，所述抗体可以通过常规方法，自培养基或细胞裂解液纯化得到，所述常规方法是本领域普通技术人员所知晓的，例如通过分级沉淀（特别是用硫酸铵进行沉淀）、电泳、凝胶过滤法、亲和色谱法等。
本发明的多特异性抗体可用于特异性抗体的所有应用领域。特别是可以用于制取在广泛的治疗性领域中可用的药物。这些药物产品也是本发明的目的。
特别地，本发明多特异性抗体可通过免疫疗法用于治疗各种不同疾病，包括例如：用于恶性病变的被动免疫治疗、血液系统肿瘤和实体瘤或自身免疫性疾病、炎症、移植物排斥反应、移植；主动免疫治疗，其通过调节自身免疫疾病或炎症过程中不同细胞群(尤其是免疫细胞)之间的互相作用；过继免疫治疗（其中将免疫细胞与多特异性抗体混合）；将中和抗体导入所选的胞间区室(intracellular compartment)的内部化。
举出的非限定性的例子包括例如：
－可使用本发明的针对靶细胞所表达的不同抗原的多特异性抗体，从而诱导靶细胞通过细胞凋亡、其下调或（相反地）其活化而死亡；
－可使用本发明的针对靶细胞和效应子细胞所表达的抗原的多特异性抗体，从而桥连2种类型细胞，从而诱导例如效应子细胞对靶细胞的杀伤。
－可使用针对不同可溶性循环因子(circulating factor)的多特异性抗体，以便同时对所述可溶性循环因子进行清除或封闭，例如，在肿瘤治疗中同时清除对VEGF和PDGF，或同时清除(或封闭)对免疫治疗活性有抑制作用的不同分子，如CTLA4、PD1(编程细胞死亡1)或TIM3或BTLA，或在抗炎治疗领域，使用针对不同炎症细胞因子（如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素1beta(ILl-β)）的多特异性抗体。
通过下文进一步的描述，可更清楚地理解本发明。这些描述结合了本发明重组双特异性抗体的制备及其特性的非限定性实施例。
实施例1：设计抗-CD5/抗-HLA-DR双特异性抗体
突变型Fab片段的设计
选择用于构建双特异性抗体的抗体为PCT WO2010/145895中描述的抗-CD5抗体和抗-HLA-DR抗体。
在天然形式下，这些抗体为鼠单克隆抗体（mAbs），分别为IgG2a和IgGl的同种型，具有κ轻链。两个mAbs都预先转化为鼠/人嵌合mAbs，所述单克隆抗体具有人IgG1亚型重链恒定区，且轻链恒定区为κ型，而两条链的可变区仍保留为鼠源。
对抗-CD5抗体的CH1和CL链上所选的位点进行两组不同的互补突变，抗-HLA－DR抗体保持其天然形式。
抗-CD5抗体上的突变位点选择对CL/CH1结合重要的，同时保留合适折叠所涉及的最基本的残基。
使用以下称作“带电残基”以及“疏水性－极性互换”的方式。
在“带电残基”方式中，将一对相互作用的极性界面残基替换为一对中性且盐桥形成性的残基。盐桥的引入被认为能增强结合的特异性，同时可因野生型和变异型链之间缺乏空间和电荷互补性来避免不需要的配对。在广泛的计算机(in silico)测试后，选择对CH1链的Thrl92用Glu进行取代，并对CL链上的Asnl37替换为Lys。这两个突变残基可形成盐桥。此外，将CL链的Serll4取代为Ala，以避免同更大的赖氨酸侧链发生空间碰撞。获得的突变体以下标为“CR3突变体”。
对“疏水性－极性互换”方式,修饰的恒定区通过引入四重突变(在每条链上进行双突变)而制得。该修饰对IgG CH1/CL界面上2个残基－残基间互相作用的性质进行了互换。一对相互作用的非极性残基替换为一对极性氨基酸，同时一对相互作用的极性残基同时地替换为一对疏水残基。该界面相互作用的极性/疏水性能交换，被认为能保持突变的CL和CH1结构域间的亲和力不变，同时降低它们各自与其它野生型对应物的亲和力，从而防止由于不匹配(变异/野生型)链复合时发生不利的相互作用所引起的错配。
在对许多潜在突变形式进行计算机(in silico)测试后，我们选择用Gln残基取代CH1结构域的Leu143，同时，其对面的CL链上的残基，即Val133，被Thr残基取代。该第一对双突变构成了从疏水性到极性相互作用的转换。同时，选择将两个相互作用的丝氨酸(CH1链上的Serl88和CL链上的Serl76)突变为缬氨酸残基，来实现自极性至疏水性相互作用的转换。获得的突变体以下标为“mut4突变体”。
所选的突变概括于下面的表I中：
表I
其它突变采用“突起-嵌-凹孔”方式进行(RIDGWAY等人,Protein Eng,9,617-21,1996)。
这些突变概括于下面的表II中：
表II
CH1/重链 CL/轻链
KH1 Leu124Ala和Leu143Glu Val133Trp
KH2 Val190Ala Leu135Trp和Asn137Ala
结合自由能的突变复合体用MM－GBSA法进行评价。与此同时，错配的复合物模型被建立，并且它们互相作用的能量用同样的方法进行计算。对于选定的修饰，在被修饰的CL和CH1链间的复合物，据估算，和野生型复合物一样稳定，然而观测到在错配复合物中有着显著不利的相互作用。
多肽接头的设计
设计了一种多肽接头以连接抗-HLADR抗体CH1区的C末端至突变的抗-CD5抗体VH区的N末端。
该多肽接头包括了全长的IgGl铰链区,后接人IgG1CH2的9个N末端氨基酸，后接人IgA1铰链一部分的序列，并后接二肽GG。它具以下序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:9)。
实施例2：构建表达抗-HLADR(MAB1)和抗-CD5(MAB2)双特异性抗体的重组杆状病毒。
使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达并产生了双特异性抗体。
该生产需要合成一种改造的重链，该重链包含来自mAb1的VH/CH1/铰链区，它们融合至mAb2的全长的重链，并为一接头所隔开，所述接头包含例如(在本发明目前的构建物中)用衍生自人IgA1＋GG天然型铰链的肽进行延伸的下铰链(lower hinge)。
该两种不同的轻链（其中一个轻链是第一抗体特异性的，而另一个轻链是第二抗体特异性的），各自独立地进行合成，并将被配对至相关的重链，其中相互突变被引入不同的CL和CH1结构域，如上文中描述的那样。
构建两种不同的杆状病毒是更容易的，第一种病毒表达融合重链以及仅一条轻链，第二种病毒表达融合重链以及第二条轻链，并且以混合病毒共同感染昆虫细胞。然而，此方法不仅耗时，并且若要控制每一种病毒的剂量，将会是非常困难的。因此，我们决定构建仅一种重组病毒，来表达融合重链以及两条轻链。
这需要在所述杆状病毒中引入两条相同CL结构域序列，以及两条相同的重链CH1-铰链(CH1＋Hg)结构域序列。该特性可能会诱导同源重组并导致基因组重组(reorganisation)以及遗传信息的丢失。
为了避免该现象发生，我们仅引入了一个野生型编码序列，其中第二个为人工序列(修改所有密码子)。在后一序列中，DNA序列与原始的序列不同，但编码与野生型相同的(100％)蛋白。
2.1构建编码融合重链的cDNA
抗-HLADR Fab+接头(linker)
一个编码融合于多肽接头(SEQ ID NO.:9)的抗HLADR抗体的CH1结构域的人工基因，是使用人工重叠寡核苷酸杂交进行构建的。于pUC质粒中进行克隆并对序列进行质控后，将人工基因引入质粒pOCγlKCHlSII/LinkerAlPstI/VHanti-HLADR中,而不是野生型序列,位于编码抗-HLADR VH结构域的序列和编码上述实施例1中描述的延伸肽的序列之间。结果获得的质粒命名为pOCγlKCHlεlinkerAl/VH。
突变型抗CD5Fab：
为了确保重链和轻链间适当的配对，在抗-CD5Fab部分的CH1结构域引入突变CR3、mut4、(KH1或KH2)。质粒pUCCγlmutT192E（亦用于为CR3突变体)经NheI/BstXI消化，且携带突变序列的片段经纯化并被插入被NheI/BstXI消化的pUCKPSCγl/VHCD5，从而得到pUCKPSCγl/VHCD5-CR3。
用相同方法，构建pUCKPSCγl/VHCD5-mut4，(PUCKPSCγ1/VHCD5-KH1和pUCKPSCγl/VHCD5-KH2)。
全长融合重链：
构建编码全长融合重链的cDNA，分别获得
pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/CR3，pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/mut4，(pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/KH1、pVTanti-HLADR/linkerA1/antiCD5/KH2)。
结果获得的转移载体分别命名为：pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/CR3和pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/mut4(pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/KHl和pVTanti-HLADR/linkerAl/antiCD5/KH2)。
2.2构建编码轻链的cDNA
构建新的转移载体
生产全功能的双特异性抗体需要共同表达(i)上述的融合重链，以及(ii)两条轻链，具有突变(CR3,mut4,KH1或KH2)的抗-CD5抗体的特异的轻链和抗-HLADR(Mabl)的轻链。这需要在经典的多角体蛋白（polyedrin）和p10位点之外选择一个第三基因座，从而将第三编码序列链插入杆状病毒基因组。选择称作"gp37"的位点(CHENG等人J.Gen.Virol,82,299-305,2001)，该位点对杆状病毒复制不是关键的，因此允许插入外来基因。
构建了一个新的转移载体(pVTgp37)，它包含一独特的XbaI克隆位点，受人工P10启动子调控，侧翼为gp37序列。
构建人工CL结构域
如同对重建重链CH1结构域的描述,人工的CL结构域是使用重叠人工寡核苷酸进行人工合成。生产2条亚片段,CKFrl和CKFr2。
在克隆入pUC质粒中并对序列进行质控后，在pUCK/VLanti-HLADR质粒中，引入了CKFrl和CKFr2，而不是引入编码Cκ结构域的野生型序列。
在gp37转移载体中引入轻链
编码包含人工恒定区Cκ的轻链的重新构建的序列，，在被XbaI消化后被分离，并被引入至转移载体pVTgp37中独特的XbaI位点，得到最终的构建物pVTgp37P10SlCKεVLanti-HLADR。
2.3构建重组病毒
构建表达双特异性抗体的重组病毒需要2个步骤：(i)构建第一杆状病毒，其仅表达Mab1（即抗HLADR抗体）的轻链，(ii)构建表达双特异性抗体的（抗CD5/抗HLADR的病毒）。
构建表达抗HLADR的重组病毒
为此，用pVTgp37P10SlCKεVL/anti-HLADR以及自改造的杆状病毒中抽提的DNA共同转染Sf9细胞，其中所述病毒表达受位于gp37位点的gp37启动子调控的多角蛋白基因。
显示“多角蛋白阴性”表型的重组病毒被分离，4种重组病毒的基因组经Southern印迹法质控，使用人工合成的κc-DNA作为探针。重组病毒被选择，称为BacLC/anti-HLADR。
构建表达双特异性抗体的重组病毒
使用携带编码融合重链cDNA的转移载体pVTanti-HLADR/linkerAl/anti-CD5(CR3,mut4,KH1或KH2)和带有编码Mab2轻链cDNA的转移载体pVTVLIICD5CkmutCR3,pVTVLIICD5Ckmut4,(pVTVLIICD5CkKHl或pVTVLIICD5CkKH2)，在提取自BacLC/抗HLADR的病毒DNA的存在下，对Sf9细胞进行共同转染。生产性克隆通过ELISA进行筛选。重组病毒的基因组，使用分别编码人恒定γl区和恒定κ区的cDNA作为探针，经Southern印迹法进行质控。使用所选克隆中的2个(C683克隆用于抗CD5/抗HLADR(CR3)以及C977克隆用于抗CD5/抗HLADR(mut4)，来生产抗体。
2.4重组抗体的生产和纯化
将Sf9细胞以600,000细胞/ml的细胞密度，接种于含400ml无血清培养基的摇瓶中，并用C683克隆株系或C977克隆株系按每细胞2PFU的感染复数下进行感染。28℃下温育4日后，收集上清液，并将分泌的重组抗体在蛋白A琼脂糖凝胶(购自GE医疗公司)上进行纯化。纯化的双特异性抗体的浓度，使用BCA试验进行测定（用如生产商PIERCE所推荐的方法）,并用牛IgG(ref StandardPIERCE23209)作为标准。
最终双特异性抗体的结构如图1所示。
图1的说明：Mabl：抗HLA-DR Fab；Mab2：抗CD5突变型Fab；接头：多肽接头；铰链:人IgGl铰链；Fc：人IgGl Fc区。由于IgG1铰链存在2个半胱氨酸残基，2条抗原结合臂通过2个链间二硫桥相连。
纯化的抗CD5/抗HLADR突变型抗体的分子量在Superose6上进行测定。经Superose6测定，高于90%的经Protein A琼脂糖凝胶上纯化的分子呈现出的分子量约为299kDa，因而，与图1重组双特异性抗体的理论分子量260kDa(不含聚糖计算的分子量)相关。
这些抗体进一步被SDS-PAGE在还原或非还原性条件下进行分析。结果显示于图2。
图2的说明：(A)在还原性条件下分析的样本；(B)在非还原性条件下分析的样本；BS：双特异性抗体；Mab:对照IgGl重组抗HLADR。
双特异性抗体的重链大小，经在此凝胶上进行测算，与图1抗体的融合重链的计算分子量78000道尔顿相一致。
这些分析显示，本发明描述的方法，导致形成了由2条融合重链与2对轻链相连所形成的分子。
实施例3：抗CD5/抗HLADR(CR3)抗体的功能特性
结合位点的功能性
证明双特异性抗体具有通过其2个不同的抗体结合位点进行结合的能力是至关重要的。为此，我们用流式细胞计量术测试了它们与表达CD5或HLADR的细胞的结合能力。简言之，研究中所有抗体都与藻红蛋白(PE)偶联，使用ZenonR-藻红蛋白人(或鼠)IgG标记盒。然后将细胞株和用PE标记的抗CD5、抗HLADR、CR3双特异性抗体或对照的鼠或人IgGl不相关抗体进行孵育，洗涤并经流式细胞计量术进行分析。
结合至CD5+/HLADR-Jurkat细胞株和结合至CD5-/HLA-DR+JOK1细胞株的结果分别显示于图3和4。
图3的说明:Jurkat细胞株(CD5+/HLADR-)用PE标记的鼠抗CD5(抗CD5m)、鼠抗HLADR(抗HLADRm)、双特异性抗CD5/抗HLADR CR3嵌合抗体或对照的人或鼠IgGl抗体(分别为hIgGl和mIgGl)进行着色。所有抗体都用PE标记。然后将细胞用标准流式细胞计量术进行分析。每个抗体的叠加直方图如图所示，其中各抗体的平均荧光密度值(MFI)标于括号内。1.mIgG-PE1μg(MFI=2.6)；2.抗CD5m-PE1μg(MFI=17)；3.抗HLADRm-PE1μg(MFI=2.5)；4.hIgGl-PE1μg(MFI=3.9)；5.抗CD5/抗HLADR/chi-PE CR31μg(MFI=103)。
图4的说明:JOK1细胞株(CD5-/HLADR+)用PE标记的鼠抗CD5(抗CD5m)、鼠抗HLADR(抗HLADRm)、双特异性抗CD5/抗HLADR CR3嵌合抗体或对照的人或鼠IgGl抗体(分别为mIgGl和hIgGl)进行着色。所有抗体都用PE标记。然后将细胞用标准流式细胞计量术进行分析。每个抗体的叠加直方图如图所示，其中各抗体的平均荧光密度值(MFI)标于括号内。1.mIgGl–PE1μg(MFI=25)；2.(孵化的)抗CD5m-PE1μg(MFI=18)；3.抗HLADRm-PE1μg(MFI=432)；4.hIgGl-PE1μg(MFI=3)；5.抗CD5/抗HLADR/chi-PE CR31μg(MFI=3521)。
图3显示了鼠抗CD5抗体和双特异性CR3抗体都能结合至CD5+Jurkat细胞株，而抗HLADR抗体却不能结合，这正如预期的那样。因此，双特异性CR3抗体识别了CD5阳性细胞株上的CD5抗原。
图4显示了鼠抗HLADR抗体和双特异性CR3抗体高强度地结合于CD5-/HLADR+JOK细胞株，而鼠抗CD5抗体却不能结合，这正如预期的那样。这证明了双特异性CR3抗体识别了HLADR+细胞株上的HLADR抗原。
我们得出结论，双特异性CR3抗体对两者的特异性(CD5和HLADR)都能正确识别。
与表达于同一细胞中的抗原结合
接下来，我们想进一步证明我们展示的双特异性CR3抗体可以在其2个靶细胞表达于同一细胞表面时与其结合，即所述两个靶细胞为顺式(cis)。为此，我们先鉴别出B-CLL患者样本，所述样本对CD5和HLADR的表达量大致相同。B-CLL患者细胞细胞与鼠抗CD5、鼠抗HLADR或鼠IgGl对照抗体在室温下温育30分钟，而后与FITC标记的抗鼠IgG二抗一同温育。洗涤后，细胞用标准流式细胞计量术进行分析。如图5A所示，细胞表达了近似量的CD5和HLADR,平均荧光密度分别为65和98。
为了显示双特异性抗CD5/抗HLADR CR3抗体结合于同一细胞上的两个抗原，我们接着对B-CLL样本进行了交叉封闭实验(cross-blocking experiment)。在过量的(10μg/ml)鼠抗CD5或鼠抗HLADR抗体或两者存在或不存在的情况下，细胞同1μg/ml的嵌合CR3双特异性抗体一起进行温育。洗涤后，通过与第二单克隆FITC标记抗体(Sigma-Aldrich)(对人Fc特异且不结合于鼠Fc)进行温育从而进行双特异性CR3抗体的结合情况的检测(数据未作显示)。
图5的说明：
图A:B-CLL患者细胞与鼠抗CD5(mCD5)、鼠抗HLADR(mDR)或作为对照的鼠非相关IgG抗体(mIgG)一起进行温育。洗涤后，细胞用FITC标记的抗鼠第二抗体进行染色而后用标准流式细胞计量术进行分析。mCD5和mDR的MFI表示于括号内。
图B:来自与图A相同的患者的细胞同1μg/ml嵌合CR3(暗粗线)单独温育，或在10μg/ml鼠抗CD5(淡灰线)或鼠抗HLADR(暗灰线)或两者(不连续的线)的存在下进行温育。洗涤后，细胞用单克隆的FITC标记的抗人Fc抗体进行温育，洗涤并用流式细胞计量术分析。各条件的叠加直方图与在每例所测的MFI值一起显示于每条曲线的上方。BS:双特异性，m:鼠，h:人，CHi:嵌合。
如图5B所示，双特异性CR3抗体单独的平均荧光密度(MFI)结果为97。抗CD5或抗HLADR的单个竞争仅部分地取代了CR3(MFI分别为72和54)。相反，将两个抗体一起加入则几近完全地取代了双特异性CR3抗体(MFI20)。这些数据表明，双特异性CR3抗体通过CD5或HLADR部分结合至细胞，而对它的取代需要抗CD5和抗HLADR抗体混合物的竞争。
我们从这些数据总结认为，双特异性抗体CR3、嵌合抗CD5/抗HLADR抗体可结合至同一细胞上的HLADR和CD5。
实施例4：双特异性抗体Fc部分和抗原结合部分的功能特性
Fc部分
抗体分子的Fc部分能够活化各种不同的免疫功能，例如吞噬作用(ADP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中分别通过结合至巨噬细胞(FcγRI,II和III)以及NK细胞(FcγRIII)的FcγRs进行。由于构建的双特异性抗体具有来源于人IgG1的Fc部分，我们就其是否具有功能并因而能够介导这些免疫介导功能进行了测试。
天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞细胞毒性(Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)
首先，我们想确定，双特异性CR3分子的Fc部分是否是有活性的，当其任何一个抗体结合部位(paratope，亦译作“互补位”)结合至其相应的分子时。我们分析了ADCC，该ADCC由Fc结合至NK细胞进行介导，并在CD5+/HLA-DR-靶细胞(如Jurkat细胞)以及HLA-DR+/CD5-靶细胞(如JOK1)和双阳性靶细胞（如JOK1.5.3)上进行诱导。从外周血单核细胞中，通过免疫珠选择纯化NK细胞。靶细胞用1μM羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行标记，该反应于4℃下进行20分钟，经洗涤，与纯化的NK细胞一起于37℃下培养4h，效应子比靶细胞比率(E:T)为10:1。而后，细胞用7AAD标记，并用流式细胞计量术进行分析。杀伤百分比测算为7AAD阳性靶细胞(CFSE+)相对于总CFSE+细胞的百分数。
这些结果显示于图6。
图6的说明：JURKAT(CD5+HLADR-,图A)、JOKl(CD5-HLADR+,图B)和JOKl5.3(CD5+HLADR+，图C)用CFSE标记并用于ADCC分析，在人NK细胞存在的情况下，E:T比为10:1以及1μg/ml嵌合抗CD5(抗CD5chi)或嵌合抗HLADR(抗HLADRchi)或2μg/ml双特异性CR3抗体。细胞毒性用流式细胞计量术，于37℃下4小时后，进行测量。
数据显示，双特异性CR3抗体在所有的3株细胞株中介导ADCC(33-78%细胞毒性)。相反，抗CD5chi和抗HLADRchi仅分别对CD5+或HLADR+细胞株具有细胞毒性。
我们总结认为，双特异性CR3抗体的Fc部分有这样的功能：使抗体能够介导表达CD5抗原或HLADR抗原或两者的靶细胞的ADCC。
吞噬作用
为确定CR3分子Fc部分具有结合至巨噬细胞上的FcγRs(FcγRI,FcγRII和FcγRIII)并同时以其抗体结合部位结合于它们各自的分子的功能，我们进行了体外ADP测试。CD14+单核细胞纯化自健康供体的单核细胞，通过抗CD14微珠磁性细胞分拣(microbeads magnetic cell sorting)的方法进行纯化，根据制造商的操作说明进行(Miltenyi Biotec公司)。它们在8孔板(chamber slides)(LabTek;Nunc)中，以2×l05/孔，于RPMI1640培养基中，添加20%胎牛血清和20ng/ml人rM-CSF(R&D Systems)，进行培养6-7日。而后测试巨噬细胞对B-CLL靶细胞(CD5+/HLA-DR+)的吞噬作用。将总数为2×lO5的B-CLL靶细胞加至各孔，同时加或不加0.01－0.1μg/ml CR3双特异性抗体或抗CD20mAb利妥昔单抗。反应在37℃下进行2h后，将板用PBS轻柔地洗涤，固定，并用May-GruenwaldGiemsa染色。吞噬作用通过在显微镜下对每个实验条件中至少200个细胞作计数进行测定，使用ImageJ1.38图像处理和分析软件，并就吞噬了至少一个肿瘤靶细胞的巨噬细胞占巨噬细胞总数的百分比进行计算。
结果显示于图7。
图7的说明：吞噬百分比显示于Y轴，所用抗体的浓度显示于x轴，自0.01至1μg/ml范围的双特异性抗体CR3或单特异性抗CD20抗体利妥昔单抗(RTX)。0:未加抗体。
下方数据显示了，双特异性CR3抗体介导高于背景值约40%的吞噬作用，在0.1-1μg/ml,近似利妥昔单抗。阴性对照抗体曲妥单抗(抗HER2)不介导吞噬作用(数据未显示)。
我们因此总结认为，双特异性CR3抗体分子的Fc部分是功能性的，并且能通过Fc与这些细胞上的FcγRs相互作用，介导巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用。
抗原结合部分
双特异性CR3抗体重新导向细胞因子诱导的杀伤细胞的杀伤作用
我们接着确定双特异性CR3抗体的抗体结合部位，是否可以结合至位于2种不同的细胞类型上的靶抗原。
细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是活化的CD3+CD56+双阳性T淋巴细胞产生的,所述淋巴细胞是在体外经外周血单核细胞刺激而形成的，所述刺激是用干扰素-γ、抗CD3并用白介素-2在体外扩增3-4周(SCHMIDT WOLFF等人J.Exp.Med.174:139-149;1991)。CIK细胞在体外对肿瘤具有显著的天然细胞毒性而对正常细胞则无毒性，这类似于NK细胞。然而，CIK细胞不表达FcγR，并因此在单特异性IgG抗体例如利妥昔单抗存在下不介导ADCC。CIK细胞表达CD5。因此，CIK细胞可以被双特异性抗体CR3重新导向至HLADR阳性而不是阴性的肿瘤细胞，其中双特异性抗体CR3识别CIK上的CD5和肿瘤靶位上HLA-DR。与ADCC不同，该重新导向的杀伤作用使用抗体的2个Fab特异性而非Fc部分。
方法
外周血单核细胞以3×l06/ml培养于无血清的X-VIVO15培养基(购自美国马里兰州Walkersville的BioWhittaker公司)，其中在第日加入1000U/mLIFN-γ(Gammakine;奥地利维也纳的Boehringer Ingelheim公司)，在第1日加入0.50ng/mL抗CD3(OKT-3,Janssen-Cilag S.p.a.,意大利)，并于第1日往后在培养基中加入500U/mL rhIL-2。扩增21-28天，每3-4天于新鲜的含rhIL-2的培养基中调节细胞至l×l06/ml。扩增结束后，CD3+/CD5+/CD56+细胞毒性CIK细胞占群体中的40-70%。剩余的细胞几乎均为CD3+/CD56-CIK前体细胞。
人肿瘤靶细胞株BJAB(CD5-/HLA-DR+)，JOK1.5.3(CD5+/HLA-DR+)，Jurkat(CD5+/HLA-DR-)和KCL22(CD5-/HLA-DR-)用RPMI-1640培养基(购自Lonza,瑞士巴塞尔)进行维持，其中培养基中添加10%胎牛血清(购自Euroclone,Wetherby,英国西约克郡),2mM L-谷氨酰胺(购自Euroclone)和110μΜ庆大霉素(购自PHT Pharma,意大利米兰)。
对于重新导向细胞毒性试验，靶细胞株在37℃下用3.5μΜ钙黄绿素-AM(购自Fluka,Sigma-Aldrich公司,英国埃尔郡)标记30分钟。洗涤后将标记的靶细胞分布于96孔板内（5×103/孔）。在含或不含1μg/ml双特异性CR3抗体的情况下，以效应子与靶细胞比10:1加入CIK细胞。4小时后，细胞经离心沉淀，收集100μl上清液，并用荧光微孔板检测仪(购自GENios,TECAN奥地利公司，奥地利萨尔斯堡)于485nm激发和535nm发射条件下，测定钙黄绿素释放量。特异性裂解百分比(%)计算如下：(测得钙黄绿素释放量-自发钙黄绿素释放量)×100/(最大钙黄绿素释放量-自发钙黄绿素释放量)。最大裂解量通过加入1%Triton X-100得到。
结果显示于图8。
图8的说明：载有钙黄绿素-AM的靶细胞株BJAB、JOK1.5.3、Jurkat和KCL22在含(空心柱)或不含(黑柱)1μg/ml双特异性CR3抗体情况下，以及在CIK细胞以10:1的效应子与靶细胞比值存在下，进行孵育。4h后，收集上清液并测定释放的钙黄绿素。数据显示了测得的裂解百分比(Y-轴)，为每个细胞株的2-6个实验的均值和标准偏差。对照(CTRL):无抗体的对照。
结果显示，在体外，通过加入1μg/ml CR3抗体在CIK细胞以效应子与靶细胞比为10：1比率存在下，HLADR阳性(BJAB,JOK15.3)靶细胞的杀伤(细胞裂解)百分比增加了50-60%，而HLADR阴性靶细胞(Jurkat,KCL22)则没有增加。这显示了，双特异性CR3抗体形成的细胞间桥连，显著地增进了CIK细胞对HLADR+靶细胞的杀伤。未观测到HLADR阴性靶细胞的杀伤有所增强，从而表明了特异性。
双特异性CR3抗体增强CIK细胞对正常T细胞细胞毒性的的特异性，进一步显示如下：HLADR+BJAB靶细胞与不同量的外周血单核细胞作为效应子细胞进行孵育，效应子:靶细胞比值范围为1:1至10:1，并在行含或不含1μg/ml CR3条件下进行。4h时后测量细胞裂解。
结果显示于图9。
图9的说明：进行细胞毒性实验，PBMC作为效应子，BJAB作为靶细胞，使用不同的效应子细胞与靶细胞比值，有(黑圈)和无(空心圈)双特异性抗体CR3存在下进行。X轴：效应子细胞与靶细胞比；Y轴：裂解百分比；CR3:双特异性CR3抗体；对照(CTRL):无抗体的对照。
未观测到CR3抗体对普通T细胞裂解HLADR+靶细胞有作用。
这些结果显示，二价的双特异性抗体CR3可与细胞因子诱导性杀伤(CIK)细胞在过继免疫治疗中结合使用。在这种情况下，使用不同特异性的2对Fab，一对(此例中为抗-HLADR)识别靶细胞，另一对(抗-CD5)识别效应子CIK细胞。结果显示，不同靶抗原可被插入（例如HER1,HER2,EpCAM,CD19,CD20或其它），以替代HLADR。结果还显示，效应子细胞表达的其它抗原可以在不同形式的肿瘤治疗方案中，用于替代CD5，如T淋巴细胞表达的CD3，NK细胞上的FcγRIII或NKG2D或在巨噬细胞上的FcγRI-III。
双特异性MUT4抗体重新导向的、细胞因子诱导的杀伤细胞的杀伤作用
我们确定了双特异性MUT4抗体是否能结合至其位于2种不同细胞类型上的靶抗原并重新导向CD5+细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)杀伤HLADR+淋巴瘤靶细胞(JOK15.3)。CIK是活化的CD3+CD56+双阳性T淋巴细胞,该淋巴细胞是在体外经外周血单核细胞激发而形成的，所述激发用干扰素-γ、抗CD3并用白介素-2在体外扩增3-4周(SCHMIDT WOLFF等人J.Exp.Med.174:139-149;1991)。CIK细胞在体外对肿瘤具有显著的天然细胞毒性而对正常细胞则无毒性，这类似于NK细胞。然而，CIK细胞不表达FcγR，并因此在单特异性IgG抗体例如利妥昔单抗存在下不介导ADCC。CIK细胞表达CD5。因此，CIK细胞可以被双特异性抗体MUT4重新导向，至HLADR阳性而不是阴性的肿瘤细胞，其中双特异性抗体MUT4识别CIK上的CD5和肿瘤靶位上HLADR。与ADCC不同，该重新导向的杀伤作用使用抗体的2个Fab特异性而非Fc部分。
方法
外周血单核细胞以3×l06/ml培养于无血清的X-VIVO15培养基(购自美国马里兰州Walkersville的BioWhittaker公司)中，在第日加入1000U/mL IFN-γ(Gammakine;奥地利维也纳的Boehringer Ingelheim公司)，在第1日加入0.50ng/mL抗CD3(OKT-3,Janssen-Cilag S.p.a.,意大利)，并于第1日往后在培养基中加入500U/mL rhIL-2。扩增21-28天，每3-4天于新鲜的含rhIL-2的培养基中调节细胞至l×l06/ml。扩增结束后，CD3+/CD5+/CD56+细胞毒性CIK细胞占群体中的50%。剩余的细胞几乎均为CD3+/CD56-CIK前体细胞。
人肿瘤靶细胞株JOK1.5.3(CD5+/HLADR+)用RPMI-1640培养基(购自Lonza,瑞士巴塞尔)进行维持，其中培养基中添加10%胎牛血清(购自Euroclone,Wetherby,英国西约克郡),2mM L-谷氨酰胺(购自Euroclone)和110μΜ庆大霉素(购自PHT Pharma,意大利米兰)。
对于重新导向细胞毒性试验，靶细胞株在37℃下用3.5μΜ钙黄绿素-AM(购自Fluka,Sigma-Aldrich公司,英国埃尔郡)标记30分钟。洗涤后将标记的靶细胞分布于96孔板内（5×103/孔）。在含或不含1或5μg/ml双特异性MUT4抗体的情况下，以效应子与靶细胞比10:1加入CIK细胞。CR3抗体或利妥昔单抗（RTX）作为对照。4小时后，细胞经离心沉淀，收集100μl上清液，并用荧光微孔板检测仪(购自GENios,TECAN奥地利公司，奥地利萨尔斯堡)于485nm激发和535nm发射条件下，测定钙黄绿素释放量。具体裂解百分比(%)计算如下：(测得钙黄绿素释放量-自发钙黄绿素释放量)×100/(最大钙黄绿素释放量-自发钙黄绿素释放量)。最大裂解量通过加入1%Triton X-100得到。
结果显示于图10。
图10的说明：载有钙黄绿素-AM的靶细胞株JOK1.5.3在含或不含1μg/ml或5μg/ml双特异性MUT4、CR3或利妥昔单抗（RTX）抗体情况下，以及在CIK细胞以10:1的效应子与靶细胞比值存在下，进行孵育。4h后，收集上清液并测定释放的钙黄绿素。数据显示了测得的裂解百分比(Y-轴)，为两个独立实验的均值和标准偏差。-：无抗体的对照。
结果显示了，在体外，HLADR阳性JOK15.3的杀伤百分比(细胞裂解)，在CIK细胞以效应子与靶细胞比为10：1比率存在下，通过加入1-5μg/ml MUT4抗体增加了60-70%，通过加入CR3抗体增加了40-50％。相反地，利妥昔单抗未显示出显著效果。这显示了，双特异性MUT4抗体形成的细胞间桥连，显著地增强了CIK细胞对HLADR+靶细胞的杀伤，该杀伤效果高于或近似于用CR3获得的效果。

Claims (12)

1.一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括至少2个不同的Fab片段，选自：
－野生型Fab片段，包括人免疫球蛋白的野生型CH1和CL结构域，以及识别感兴趣表位的抗体的VH和VL结构域；
—突变型Fab片段，所述片段包括：
*识别感兴趣表位的抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第192位的苏氨酸残基用谷氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第137位的天冬酰胺残基用赖氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第114位的丝氨酸残基用丙氨酸残基进行取代而形成；
—突变型Fab片段，所述片段包括：
*识别感兴趣表位的抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第143位的亮氨酸残基用谷氨酰胺残基进行取代以及对所述CH1结构域第188位的丝氨酸残基用缬氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CL结构域，通过对所述CL结构域第133位的缬氨酸残基用苏氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第176位的丝氨酸残基用缬氨酸残基进行取代而形成；
—突变型Fab片段，所述片段包括：
*识别感兴趣表位的抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自人IgG免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第124位的亮氨酸残基用丙氨酸残基进行取代以及对所述CH1结构域第143位的亮氨酸残基用谷氨酸残基进行取代而形成；
*一种CL结构域，该结构域衍生自人IgG免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第133位的缬氨酸残基用色氨酸残基进行取代而形成；
—突变型Fab片段，所述片段包括：
*识别感兴趣表位的抗体的VH和VL结构域；
*一种CH1结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CH1结构域，并通过对所述CH1结构域第190位的缬氨酸残基用丙氨酸残基进行取代而形成；和
*一种CL结构域，该结构域衍生自人免疫球蛋白CL结构域，并通过对所述CL结构域第135位的亮氨酸残基用色氨酸残基进行取代以及对所述CL结构域第137位的天冬酰胺残基用丙氨酸残基进行取代而形成；
每个Fab片段识别不同的感兴趣表位，且所述Fab片段以任何顺序呈串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C末端通过多肽接头连接于后一Fab片段的VH结构域的N末端。
2.如权利要求1所述的多特异性抗原结合片段，其中所述多肽接头长度至少为20个氨基酸。
3.如权利要求1所述的多特异性抗原结合片段，其中所述多肽接头包含一个或多个选自IgA、IgG和IgD免疫球蛋白的铰链区的序列。
4.如权利要求1所述的多特异性抗原结合片段，其中所述多肽接头具有以下序列：EPKSCDTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG。
5.一种具有2条相同抗原结合臂的多特异性抗体，其中每条臂包含一个如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段。
6.一种如权利要求5所述的多特异性抗体，其中，所述抗体具有免疫球蛋白样结构，所述结构包含：
-两条相同的抗原结合臂，每条臂包含如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段；
-免疫球蛋白的二聚体化的CH2和CH3结构域；
-IgA、IgG或IgD的铰链区，其将抗原结合臂CH1结构域的C末端连接至CH2结构域的N末端。
7.一种蛋白链，其特征在于，选自下组：
-如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段的重链；
-如权利要求5或6中任一所述的多特异性抗体的重链。
8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码如权利要求7所述蛋白链的序列。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞被一多核苷酸所转化，所述多核苷酸编码如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段的重链或如权利要求5或6中任一所述的多特异性抗体的重链，并且所述宿主细胞被至少2条编码不同轻链的多核苷酸所转化，其中第一轻链与所述重链的第一VH/CH1区特异性配对；第二轻链与所述重链的第二VH/CH1区特异性配对，并且至少一条所述轻链为权利要求1中所定义的突变型Fab片段的轻链。
10.如权利要求9所述的宿主细胞,其特征在于，所述宿主细胞还附加地被编码第三轻链的第三多核苷酸所转化，所述的第三轻链与第一和第二轻链不同并与所述重链的第三VH/CH1区特异性配对。
11.一种用于制备如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段或如权利要求5或6中任一所述的多特异性抗体的方法，其中所述方法包含：培养如权利要求9或10所述的宿主细胞，和从所述培养物回收所述抗原结合片段或所述抗体。
12.如权利要求1-4中任一所述的多特异性抗原结合片段或如权利要求5或6中任一所述的多特异性抗体,它被用作药物。
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