KR102095886B1 - 다중특이성 돌연변이된 항체 fab 단편 - Google Patents

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쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스)
아지엔다 오스페달리에라 파파 지오바니 23
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Abstract

본 발명은 CH1 및 CL 도메인의 계면에서 돌연변이를 갖는 Fab 단편을 포함하며, 상기 돌연변이는 중쇄/경쇄 잘못 쌍을 이루는 것을 방지하는 다중특이성 항체 구조에 관한 것이다.

Description

다중특이성 돌연변이된 항체 FAB 단편 {Multispecific mutated antibody FAB fragments}
본 발명은 다중 특이성 (multispecific), 특히 이-특이성 (bispecific) 항체 분자의 제조에 관한 것이다.
단백질-계 약물 가운데, 단일클론 항체 (monoclonal antibody) (mAbs)는 약물 및 표적 운반 시스템 모두로 작용하는 특별한 특징을 갖는다. Mabs은 다양한 질병, 특히 여러 가지 암의 유형을 포함하는, 다양한 질병의 치료에 큰 잠재력을 최근 나타내는데, 여기서 이들은 종래의 화학요법보다 더욱 특이성을 갖는다.
자연적으로 발생하는 항체 분자의 기본 구조는 비-공유 상호작용 및 내부-사슬 이황화 결합 (disulfide bonds)에 의해 서로 유지되는, 두 개의 동일한 중쇄 (heavy chains) 및 두 개의 동일한 경쇄 (light chain)로 이루어진 Y-형상 사량체 4차 구조 (Y-shaped tetrameric quaternary structure)이다.
포유류 종 (species)에 있어서, 다섯 타입의 중쇄 (heavy chain)가 있다: 면역글로블린의 부류 (동종형 (isotype))를 결정하는 α, δ, ε, γ, 및 μ: 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 상기 중쇄 N-터미널 가변 도메인 (VH)은 중쇄 γ, α 및 δ에서 세 개의 도메인 (N-터미널으로부터 C-터미널으로 넘버링된 CH1, CH2, 및 CH3)을 함유하는, 불변 영역 (constant region)을 수반하는 반면, 중쇄 μ 및 ε의 불변 영역은 4 개의 도메인 (N-터미널으로부터 C-터미널으로 넘버링된 CH1, CH2, CH3 및 CH4)으로 구성된다. IgA, IgG, 및 IgD의 CH1 및 CH2 도메인은, 다른 부류들 사이 및 IgA 및 IgG의 경우에 있어서, 다른 서브타입: 15, 12, 62 (또는 77), 및 12 아미노산의 힌지를 각각 갖는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 20 및 7 아미노산의 힌지를 각각 갖는 IgAl 및 IgA2 사이에서 길이가 변화하는 플렉시블 힌지 (flexible hinge)에 의해 분리된다.
두 가지 타입의 경쇄가 있다: λ 및 κ는 어떤 중쇄 동종형과 관련될 수 있지만, 제공된 항체 분자에서 모두 동일한 타입이다. 경쇄 모두는 기능적으로 동일한 것으로 나타난다. 이들의 N-터미널 가변 도메인 (VL)은 CL이라 하는 단일 도메인으로 이루어진 불변 영역을 수반한다.
상기 중쇄 및 경쇄들은 CH1 및 CL 도메인 사이에서 단백질/단백질 상호작용에 의해 쌍을 이루고, 상기 두 개의 중쇄들은 이들의 CH3 도메인 사이에서 단백질/단백질 상호작용에 의해 결합한다. 상기 면역글로블린 분자의 구조는 일반적으로 상기 CH1 및 CL 도메인 사이 및 상기 힌지들 사이에서 사슬간 (interchain) 이황화 결합에 의해 안정화된다.
치료학적 항체의 임상 효능은, 상기 면역글로블린 분자의 다른 부분과 각각 관련되는, 이들의 항원-결합 기능 및 이들의 작동인자 기능 (effector function) 모두에 의존한다.
상기 항원-결합 영역은, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완성 경쇄로 각각 이루어지고, (단편 항원 결합에 대하여) Fab 단편 (fragments)으로 불리는 Y-형상 구조의 팔에 상응한다. Fab 단편은 사슬간 이황화 결합의 아미노-말단 측면에, 상기 힌지 영역에서 항체 분자를 절단하는, 파파인 소화 (papain digestion)에 의한 천연 면역글로블린 분자로부터 먼저 발생되고, 따라서 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 방출한다. 펩신과 같은 다른 프로테아제 (protease)는 또한 상기 힌지 영역에서 항체 분자를 절단하지만, 사슬간 이황화 결합의 카르복시-말단 측면에서, 두 개의 동일한 Fab 단편으로 이루어지고, 이황화 결합을 통해 연결된 나머지 단편을 방출하며; 상기 F(ab')2 단편에서 이황화 결합의 감소는 Fab' 단편을 발생시킨다.
상기 VH 및 VL 도메인에 상응하는 항원 결합 영역의 일부는 (가변하는 단편에 대하여) Fv 단편으로 불리고; 이것은, 항원-결합 부위 (또한 파라토프 (paratope)라 한다)를 형성하는, 상기 CDRs (상보성 결정 영역 (complementarity determining regions))을 함유한다.
이의 목표로 상기 항체에 직접적인 특이성을 허용하는 것 외에, 상기 항원-결합 영역은, 표적화된 항원 및 상기 항원에 대해 항체에 의해 인지된 에피토프 (epitope) 모두에 의존하여 양성 또는 음성일 수 있는, 이의 표적 항원에 결합시 다양한 생물학적 신호를 유도할 수 있다. 암 치료의 분야에서 사용하기 위하여, 하나는, 세포성 색전 (cytostasis) 또는 종양 세포의 사멸을 결과하는, 성장-억제 (growth-inhibitory) 또는 세포-사멸 신호 (pro-apoptotic signal)를 전달하는 항체를 일반적으로 선호한다 (VERMA et al., J Immunol, 186, 3265-76; 2011).
상기 항체의 작동인자 기능은 보체 단백질 (complement protein)과 같은 작동인자 분자에 또는 대식세포 (macrophages) 또는 천연 킬러 (NK) 세포와 같은 면역 세포의 표면상에 Fc 수용체 (receptor)에 이의 결합을 결과한다. 이것은 항원 의존 식작용 (ADP), 항체-의존 세포 매개 세포독성 (cytotoxicity) (ADCC), 또는 보체 의존 세포 매개 세포독성 (CDC)과 같은 상기 표적화된 항원의 식작용 (phagocytosis) 또는 용해 (lysis)를 유도하는 다른 효과를 결과한다.
작동인자 분자 또는 세포에 이의 결합을 담당하는 상기 항체의 작동인자 영역은, Y-형상의 구조의 줄기 (stem)에 상응하고, 상기 중쇄의 쌍을 이룬 CH2 및 CH3 도메인 (또는 항체의 부류에 의존하여, CH2, CH3 및 CH4 도메인)을 함유하며, 상기 (결정성 단편에 대한) Fc 영역으로 불린다.
상기 Fc 영역에 의해 매개된 ADCC, ADP, 및 CDC는 mAbs의 치료학적 활성에서 주요 부분으로 역할한다. 상기 ADCC 메커니즘은, 상기 Fc 감마 수용체에 대해 유전적으로 결함 있는 누드 마우스에서, 두 개의 주요 임상학적으로 성공적인 mAbs, 항-HER2 및 항-CD20의 인간 종양 이종이식 (xenografts)에 대한 치료학적 작용이, 거의 완전히 없어졌기 때문에 (CLYNES et al., Nat Med, 6, 443-6, 2000), 중심적인 것을 알 수 있다. 상기 ADP 메커니즘은 인간 종양의 여러 가지 쥐 모델 (murine model)에서 중심적 중요성을 나타내고 (UCHIDA et al., J. Exp. Med.199: 1659-69, 2004), CDC는 생체내에서 (in vivo) 항-CD20의 치료학적 활성에서 근본적 역할을 한다는 것을 입증하였다 (DI GAETANO et al., J Immunol, 171, 1581-7, 2003).
두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄의 동일성에 기인하여, 자연적으로 발생하는 항체 분자는 두 개의 동일한 항원-결합 부의를 갖고, 따라서, 동시에 두 개의 동일한 에피토프에 결합한다.
1980년대에, 두 개의 다른 에피토프를 인지하는, 따라서 두 개의 다른 표적에 동시에 결합할 수 있는, 두 개의 항원-결합 부위를 동일한 분자에서 갖는 이특이성 항체는, 고유한 특이성을 갖는 항체를 생산하는 두 개의 세포를 융합하여 발생된다 (MILSTEIN & CUELLO, Nature, 305, 537-40, 1983). 이러한 이-특이성 항체는 종양 세포로 향하는 작동인자 T 세포를 표적화할 수 있는 것을 나타낸다 (MILSTEIN & CUELLO, Nature, 305, 537-40, 1983).
이-특이성 항체에 대한 광범위한 범위의 적용은, 예를 들어, 치료학적 분야에서, 작동인자 세포의 (세포독성 T 세포, NK 세포, 및 대식세포), 또는 작동인자 분자 (독소, 약물, 전구약물, 사이토킨, 방사성 동위 원소 및 보체 시스템)의 표적화, 및 진단 분야에 있어서, 면역분석에서 시약으로 사용을 포함하여, 기재되었다 (SONGSIVILAI & LACHMANN, Clin Exp Immunol, 79, 315-21, 1990).
초기에, 이-특이성 항체는 두 개의 다른 Mabs를 생산하는 두 개의 하이브리도마 (hybridoma) 세포 사이에서 융합으로부터 결과하는 쿼드로마 (quadromas)의 사용, 또는 화학적 접합에 의해 제조되어 왔다. 그러나, 화학적 접합은 항원 결합 부위를 종종 변형시킬 수 있어, 상기 항체의 생물학적 특성의 손상을 결과한다. 상기 쿼드로마 접근법은, 두 개의 다른 항체로부터 중쇄 및 경쇄의 무작위 쌍이, 잘못 쌍을 이룬 (mispaired) 생산물로부터 분리되는, 이중 오직 하나가 원하는 이-특이성 생산물인, 면역 글로블린 분자의 혼합물을 결과하는 열 개의 동일하게 가능한 조합으로 이론적으로 유도하는 결점을 갖는다.
더욱 최근에, 유전 공학은 이-특이성 항체를 생산하기 위한 선택의 방법이 되었고, 다른 재조합 이-특이성 항체 포맷의 광범위한 다양성의 발전을 이끌고 있다. 이들 이-특이성 항체의 몇몇은 매우 간단하고, 적절한 펩타이트 링커를 통해 관련된, 둘 (또는 그 이상)의 다른 항체 유래의 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로부터 유도된다. 이들 항체는 상대적으로 생산하기에 쉽고, 이들이 단일 폴리펩타이드 사슬에 의해 형성되고, 모 항체의 Fv 영역만을 함유하기 때문에, 사슬 사이에서 잘못 쌍을 이루는 문제점이 없다. 그러나, 이들은 전체-길이 면역글로블린보다 더 작고, 불변 영역, 특히 Fc 영역이 없다. 비록 이것이 몇몇 적용에서, 예를 들어, Fc-매개 효과를 피하기 위해 한번 세척한 경우에 이로울지라도, 이것은 CDC, ADCC 또는 ADP과 같은 Fc-매개 작동인자 기능이 요구된 경우 불리하다. 또한, 이들의 작은 크기 및 Fc 영역의 결손에 기인하여, 이들은 생체 내에서 매우 짧은 반감기를 갖는다.
따라서, 자연적으로 발생하는 면역글로블린 분자, 특히 전체 Fc 영역을 갖는 면역글로블린 분자를 좀더 근접하게 모방하는, 다른 이-특이성 재조합 항체 포맷은 설계되어 왔다. 이들은 두 개의 주요 포맷에 그룹화될 수 있다.
제1 그룹 (IgG scFv)에 있어서, 항체 A로부터 scFv 단편은 항체 B의 중쇄의 말단 (일반적으로 C-터미널 말단)에 융합된다. 항체 B의 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 항체 A의 VH 및 VL을 함유하는, 오직 하나의 중쇄 타입, 및 항체 B의 VL 및 CL 도메인을 함유하는 하나의 경쇄 타입을 갖는 최종 항체는, 사슬 사이에 잘못 쌍을 이루는 것이 발생하지 않는다. 이러한 포맷은, 예를 들어, QU et al에서 기재되었다 (Blood, 111, 2211-9, 2008).
제2 그룹에 있어서, 항체 A로부터 중쇄 및 경쇄는 항체 B로부터 중쇄 및 경쇄와 쌍을 이룬다. 이들 포맷은 상기 쿼드로마에 의해 생산된 이-특이성 항체를 재생산하고, 따라서 잘못 쌍을 이루는 유사한 문제점이 발생한다. 상기 중쇄의 잘못 쌍을 이루는 문제점을 해결하기 위하여, 이들의 이종이량체화 (heterodimerization) (즉, 중쇄 B로 중쇄 A의 쌍)을 선호하고, 이들의 동종이량체화 (homodimerization)를 방지하기 위하여 상기 항체의 CH3 도메인을 돌연변이시키는 것을 제안하고 있다. 이것은 소위 "knob into holes" 접근법 (RIDGWAY et al., Protein Eng, 9, 617-21, 1996; US 7695936)에 의해 수행된다. 더 큰 아미노산에 의해 작은 아미노-산의 대체로 이루어지는 "노브 (konb)" 돌연변이는, 항체 A의 중쇄의 CH3 이량체 (dimer) 계면에서 도입되어, 동종이량체화를 방지하는 입체 장애 (steric hindrance)를 결과한다. 동시에 이종이량체화를 촉진하기 위하여, 더 작은 아미노산에 의해 더 큰 아미노-산의 대체로 이루어진 상보적인 "홀 (hole)" 돌연변이는 항체 B의 CH3 도메인으로 도입된다. 상기 중쇄/경쇄 잘못된 쌍의 문제점을 해결하기 위하여, 다른 특이성이지만, scFv 파지 라이브러리 (phage library)로부터 이전에 확인된, 공통 경쇄를 공유하는 항체를 사용하는 것이 제안되었다 (MERCHANT et al., Nat Biotechnol, 16, 677-81, 1998; US 7183076). 이러한 접근법의 단점은 공통 경쇄를 갖는 항체를 확인하는데 어려움이 있다.
본 발명자들은 CH1 및 CL 도메인의 계면에서 몇몇 키 잔기 (key residues)를 돌연변이시켜, 중쇄/경쇄 잘못 쌍을 이루는 것을 방지하고, 상기 사슬의 원하는 매칭을 보장하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
이를 위하여 본 발명자들은 여러 가지 세트의 적절한 돌연변이를 좀더 구체적으로 발견했다. 제1 세트에 있어서, 상호작용하는 극성 계면 잔기의 쌍은 잔기를 형성하는 중성 (neutral) 및 염 브릿지 (salt bridge)의 쌍에 대해 이온교환된다. CH1 사슬 상에 Glu에 의한 Thr192의 대체 및 CL 사슬 상에 Lys에 대한 Asn137의 교환은 선택된다. 이들 두 개의 돌연변이된 잔기는, 상기 조합의 특이성을 강화하는 것으로 추측되는, 염 브릿지를 형성하는 반면, 원하지 않는 쌍은 와일드 타입 (wild type) 및 변이체 사슬 (variant chain) 사이에서 상보적 전하 및 입체의 결핍에 의해 피할 수 있다. 부가적으로, CL 사슬 상에 Ala에 대한 Ser114의 치환은 더 큰 라이신 측쇄로 입체 충돌을 피하도록 만들었다.
돌연변이의 제2 세트에 있어서, 본 발명자들은 Gln 잔기에 의해 상기 CH1 도메인의 Leu143을 대체하는 것을 선택하고, 반면에 상기 CL 사슬의 직면 잔기 (facing residue), 즉, Val133은 Thr 잔기에 의해 대체된다. 이러한 제1 이중 돌연변이는 소수성 (hydrophobic)으로부터 극성 상호작용으로 전환을 구성한다. 동시에, 발린 잔기에 대한 두 개의 상호작용하는 세린 (CH1 사슬 상에 Ser188 및 CL 사슬 상에 Ser176)의 돌연변이는 극성으로부터 소수성 상호작용으로 전환을 수행하기 위해 선택된다. 상기 계면 상호작용의 극성/소수성 특성의 이러한 교환은 변하지 않는 돌연변이 CL 및 CH1 도메인 사이의 친화도 (affinity)를 유지하는 것이 기대되는 반면, 다른 와일드 타입의 대응부 (counterpart)에 대한 이들의 각각 친화도를 감소시키고, 따라서, 잘못된 쌍을 이룬 (변이체/와일드 타입) 사슬 복합체에서 일어나는 선호하지 않는 상호작용 덕분에 잘못된 쌍을 방지하며, 상호작용 무극 잔기 (apolar residues)의 쌍은 극성 아미노산의 쌍에 대해 교환되는 반면, 상호작용 극성 잔기의 쌍은 소수성 잔기의 쌍에 대해 동시에 교환된다.
돌연변이의 제3 및 제4 세트는 "노브 인투 홀 (knob into holes)" 돌연변이이다. 좀더 구체적으로는, 돌연변이의 제3 세트 (KH1)에 있어서, CH1 도메인의 Leu124 및 Leu143은 Ala 및 Glu 잔기에 의해 각각 대체되고, 반면 상기 CL 사슬의 Val133은 Trp 잔기에 의해 대체되며, 돌연변이의 제4 세트 (KH2)에 있어서, 상기 CH1 도메인의 Val190은 Ala 잔기에 의해 대체되고, 상기 CL 사슬의 Leu135 및 Asn137은 각각 Trp 및 Ala 잔기에 의해 대체된다.
상기 CH1 및 CL 도메인에 대해 본 발명에 사용된 배열 위치 숫자는 Kabat 넘버링이라 한다 (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n°91-3242, pp 662,680,689, 1991).
따라서, 본 발명의 목적은 하기 중에서 선택된 돌연변이된 Fab 단편이다:
a) 하기로 이루어진 Fab 단편:
* 관심의 항체의 VH 및 VL 도메인;
* 글루타민산 잔기로 CH1 도메인의 위치 192에서 트레오닌 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인; 및
* 라이신 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 137에서 아스파라긴 잔기의 치환 및 알라닌 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 114에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CL 도메인으로부터 유도된 CL 도메인;
b) 하기로 이루어진 Fab 단편:
* 관심의 항체 VH 및 VL 도메인;
* 글루타민 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 143에서 루신 잔기의 치환 및 발린 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 188에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인; 및
* 트레오닌 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 133에서 발린 잔기의 치환 및 발린 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 176에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CL 도메인으로부터 유도된 CL 도메인;
c) 하기로 이루어진 Fab 단편:
* 관심의 항체의 VH 및 VL 도메인;
* 알라닌 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 124에서 루신 잔기의 치환 및 글루타민산 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 143에서 루신 잔기의 치환에 의해 IgG 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인;
* 트립토판 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 133에서 발린 잔기의 치환에 의해 IgG 면역글로블린의 CL 도메일으로부터 유도된 CL 도메인;
d) 하기로 이루어진 Fab 단편:
* 관심의 항체의 VH 및 VL 도메인;
* 알라닌 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 190에서 발린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인; 및
* 트립토판 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 135에서 루신 잔기의 치환, 및 알라닌 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 137에서 아스파라긴 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CL 도메인으로부터 유도된 CL 도메인.
도 1은 최종 이-특이성 항체의 구조이다.
도 2는 감소 또는 감소되지 않는 조건 하에서 항체를 SDS-PAGE에 의해 분석된 결과를 나타낸다.
도 3은 CD5+/HLADR- Jurkat 세포주에 결합의 결과는 나타낸 그래프이다.
도 4는 CD5-/HLA-DR+ JOK1 세포 주에 결합의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 이-특이성 항-CD5/항-HLADR CR3 항체가 동일한 세포 상에서 항원 모두와 결합한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 이-특이성 CR3 항체의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 이-특이성 항체 CR3 또는 단일특이 항-CD20 항체 리툭시맵 (RTX)의 식작용 퍼센트를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 이-특이성 CR3 항체의 존재 (개방 바) 또는 부재 (검정 바)하 및 10:1 작동인자:표적 비에서 용해 퍼센트를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 이-특이성 항체 CR3의 존재 (검정 원) 및 부재 (개방 원)하에서, 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 이-특이성 항체 CR3의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
바람직한 구현 예에 따르면, 상기 CH1 도메인은 IgG 면역글로블린, 유리하게는 IgG1 서브타입으로부터 유도된다. 상기 CL 도메인은 바람직하게는 카파 타입 (kappa type)이다. 바람직하게는, 인간 치료에 사용하기 위해, 상기 돌연변이된 CH1 및 CL 도메인이 유도된 면역글로블린은 인간 면역글로블린이다.
상기 VH 및 VL 도메인은, 표적화를 원하는 에피토프로 인지하는, 본래의 또는 유전자 조작된, 어떤 항체로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 돌연변이된 Fab 단편은 중쇄/경쇄 잘못된 쌍을 방지하는 것이 필수적인 어떤 다중특이성 항체 구조체 (construct)에 사용될 수 있다.
유리하게도, 이들은 적절한 링커에 의해 분리된, 각각이 탠덤하게(tandemly) 배열된 Fab 단편으로 필수적으로 이루어진 하나 이상의 다중특이성 항원-결합 단편을 포함하는, 본 발명자들에 의해 설계된 새로운 다중특이성 항체 구조체에서 사용된다.
"항원-결합 단편"은 각각 다른 에피토프를 인지하는, 둘 이상의 항원-결합 영역을 갖는 분자로서 본 발명에 정의된다. 상기 다른 에피토프는 동일한 항원 분자 또는 다른 항원 분자에 의해 매개될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 적어도 둘, 및 다섯까지의 하기 중에서 선택된 다른 Fab 단편을 포함하는, 다중특이성 항원-결합 단편이다:
- 면역글로블린의 와일드-타입 CH1 및 CL 도메인을 포함하는 Fab 단편 (본 발명에서 또한 "와일드-타입 Fab 단편"으로 정의됨);
- 전술된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (a);
- 전술된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (b);
- 전술된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (c);
- 전술된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (d);
각 Fab 단편은 관심의 다른 에피토프를 인지하고 상기 Fab 단편은 무작위 순서로 탠덤하게(tandemly) 배열되며, 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-터미널 말단은 폴리펩타이드 링커를 통해 다음의 Fab 단편의 VH 도메인의 N-터미널 말단 연결된다. 일반적으로, 상기 폴리펩타이드 링커는 적어도 20, 바람직하게는 적어도 25, 더욱 바람직하게는 적어도 30, 및 80까지, 바람직하게는 60까지 및 더더욱 바람직하게는 40까지의 아미노-산 길이를 가질 수 있다.
유리하게, 상기 폴리펩타이드 링커는 IgA, IgG, 및 IgD 중에서 선택된 하나 이상의 면역글로블린의 힌지 영역의 서열 모두 또는 일부를 포함한다. 만약 항체가 사람 치료에 사용된다면, 사람 기관의 힌지 서열은 바람직할 것이다.
사람 IgG, IgA 및 IgD의 힌지 영역의 서열은 하기에 나타내었다:
IgA1 (SEQ　ID　NO: 1):
VPSTPPTPSPSTPPTPSPS
IgA2 (SEQ　ID　NO: 2):
VPPPPP
IgD (SEQ　ID　NO: 3):
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP
IgG1 (SEQ　ID　NO: 4):
EPKSCDKTHTCPPCP
IgG2 (SEQ　ID　NO: 5):
ERKCCVECPPCP
IgG3:
EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ　ID　NO: 7)의 0 또는 1 내지 4 반복을 수반하는ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ　ID　NO: 6)
IgG4:
ESKYGPPCPSCP (SEQ　ID　NO: 8)
상기 폴리펩타이드 링커는 오직 하나의 면역글로블린의 힌지 영역의 서열 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상기 면역글로블린은 인접한 CH1 도메인이 유도되는 면역글로블린에 따라 동일한 동종형 및 아강 (subclass), 또는 다른 동종형 또는 아강에 속할 수 있다.
선택적으로, 상기 폴리펩타이드 링커는 다른 동종형 또는 아강의 적어도 두 개의 면역글로블린의 힌지 영역의 서열 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, CH1 도메인을 직접 뒤따르는, 상기 폴리펩타이드 링커의 N-터미널 부분은, 상기 CH1 도메인이 유도되는 면역글로블린에 따라 동일한 동종형 및 아강에 속하는 면역글로블린의 힌지 영역 모두 또는 일부로 바람직하게 이루어진다.
선택적으로, 상기 폴리펩타이드 링커는 면역글로블린의 CH2 도메인의 2 내지 15, 바람직하게는 5 내지 10 N-터미널 아미노-산의 서열을 더욱 포함할 수 있다.
몇몇 경우에 있어서, 본래의 힌지 영역으로부터 서역은 사용될 수 있고; 다른 경우에 있어서, 포인트 돌연변이 (point mutations)는 이들 서열에서 일어날 수 있는데, 특히 원하지 않는 사슬-간 또는 사슬-간 이황화 결합을 피하기 위하여, 알라닌 또는 세린에 의해 본래의 IgG1, IgG2 또는 IgG3 힌지 서열에서 하나 이상의 시스테인 잔기의 대체를 일으킬 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항원-결합 단편에 사용될 수 있는 폴리펩타이드 링커의 비-제한적 예로는 다음의 서열: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ　ID　NO: 9)을 갖는 폴리펩타이드이다. 상기 폴리펩타이드는 링커에 보충적인 유연성 (flexibility)을 제공하기 위해 첨가된, 사람 IgG1 CH2 (APELLGGPS, SEQ　ID　NO: 10)의 9 N-터미널 아미노-산, 사람 IgA1 힌지 (TPPTPSPS, SEQ　ID　NO: 11)의 서열의 일부, 및 디펩타이드 GG를 수반하는, 사람 IgG1 힌지 (SEQ　ID　NO: 4)의 전체 길이 서열로 이루어진다.
선택적으로, 인간 IgG1 CH2 도메인의 N-터미널 서열의 더 짧은 부분은 사용될 수 있다. 또한, 사람 IgA1 힌지의 더 긴 부분, (바람직하게는 N-터미널 발린 잔기를 제외한) 이의 전체-길이 서열까지 사용될 수 있다. 특별한 구현 예에 따르면, 상기 사람 IgA1 힌지 서열은 트레오닌, 세린 및 프롤린 잔기들의 교번 (alternation)를 함유하는, 인공 서열에 의해 대체될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단편에 사용하기 위해 적절한, SEQ　ID　NO:9의 폴리펩타이드 변이체는 다음의 서열: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLPSTPPSPSTPGG (SEQ　ID　NO: 12)을 갖는 폴리펩타이드이다. 이러한 폴리펩타이드에 있어서, 사람 IgG1 힌지의 전체 길이 서열은 사람IgG1 CH2 (APELL, SEQ　ID　NO: 13)의 5 N-터미널 아미노-산, 및 서열 PSTPPSPSTP (SEQ　ID　NO: 14)이 수반된다.
둘 이상의 다른 Fab 단편을 포함하는, 본 발명의 다중특이성 항원-결합 단편의 경우에 있어서, 상기 Fab 단편을 분리하는 폴리펩타이드 링커는 동일하거나 또는 다를 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체의 바람직한 구현 예에 따르면, 이것은 전술된 바와 같은 다중특이성 항원-결합 단편으로 각각 이루어진, 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 갖는다. 상기 항원-결합 팔은 상기 항체에 대해 의도된 사용에 의존하여, 다양한 방식으로 서로 연결될 수 있다.
만약 Fc-매개 효과 없이 항체를 얻기 원한다면, 상기 항체는 Fc 영역을 포함하지 않을 것이다. 이러한 경우에 있어서, 상기 두 개의 항원-결합 팔은, 예를 들어:
- 만약 상기 링커가 시스테인 잔기를 함유한다면, 상기 Fab 단편을 분리시키는 폴리펩타이드 링커에 의해 제공된 사슬-간 이황화 결합을 통해 상기 항원-결합 팔의 동종이량체화에 의해; 및/또는
- 힌지-유사 구조를 결과하는 폴리펩타이드 연장의 동종이량체화, 사슬-간 이황화 결합의 형성을 허용하는 시스테인 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 연장, 및 각 항원-결합 팔의 C-터미널 말단에서 부가를 통해; 비-제한적인 예로는, 상기 폴리펩타이드 연장은, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG3의 힌지 서열일 수 있고;
- 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하기 위해 두 개의 항원-결합 팔의 중쇄의 C-터미널 말단에 결합 및 서로 사이의 충분한 거리에서 상기 항원-결합 팔을 유지하는 세미-리지드 링커 (semi-rigid linker)를 통해 서로 연결될 수 있다.
선택적으로, 만약 CDC, ADCC 또는 ADP와 같은 작동인자 기능이 요구된다면, 본 발명의 다중특이성 항체는 이들 작동인자 기능을 제공하는 Fc 도메인을 더욱 포함할 것이다. 상기 Fc 도메인의 선택은 요구된 작동인자 기능의 타입에 의존할 것이다.
이러한 경우에 있어서, 본 발명의 다중특이성 항체는 하기를 포함하는, 면역글로블린-유사 구조를 갖는다:
- 전술된 바와 같은 두 개의 동일한 다중특이성 항원-결합 팔;
- 면역글로블린의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인;
- CH2 도메인의 N-터미널 말단에 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-터미널 말단에 연결하는, IgA, IgG, 또는 IgD의 힌지 영역, 또는 선택적으로, CH3 도메인을 따르는 IgM 또는 IgE의 CH4 도메인, 이러한 경우에 있어서, 상기 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-터미널 말단은 CH2 도메인의 N-터미널 말단에 직접적으로 연결된다.
바람직하게는, 상기 CH2 및 CH3 도메인 및 상기 힌지 영역 또는 CH4 도메인은 동일한 면역글로블린 또는 동일한 동종형 및 상기 항원 결합 팔의 CH1 도메인 같은 아강의 면역글로블린으로부터 유도된다.
본래의 면역글로블린으로부터의 힌지 영역뿐만 아니라, 상기 CH2, CH3, 및 궁극적으로 CH4는 사용될 수 있다. 만약 원한다면, 예를 들어, 상기 항체의 작동인자 기능을 조절하기 위하여, 이들을 돌열변이시키는 것이 또한 가능하다. 몇몇 예에 있어서, 상기 CH2 또는 CH3 도메인의 전체 또는 부분은 생략될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 중에서 선택된 어떤 단백질 사슬을 포함한다:
- 본 발명의 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄;
- 본 발명의 돌연변이된 Fab 단편의 중쇄;
- 본 발명의 항원-결합 단편의 중쇄;
- 본 발명의 면역글로블린-유사 다중특이성 항체의 중쇄.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 단백질 사슬을 인코딩 (encoding)하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 부가적인 서열을 포함할 수 있고; 특히 상기 단백질 사슬의 분비물 (secretion)을 허용하는 리더 서열 또는 단일 펩타이드를 인코딩하는 서열을 유리하게 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 선택된 숙주 세포에서 활성이 있는 전사 (transcription)- 및 번역 (translation)-조절 인자와 연관된, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터, 특히 발현 벡터를 포함한다. 본 발명에 따른 발현 벡터를 구조체화하는데 사용될 수 있는 벡터는 그 자체로 알려져 있고, 특히 사용을 위해 의도하는 숙주세포의 기능으로서 선택될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환 숙주-세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며: 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며; 그리고 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1의 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄이다. 선택적으로, 상기 숙주-세포는, 상기 제1 및 제2 경쇄와 다른 제3 경쇄를 인코딩하고, 상기 중쇄의 제3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제1, 제2 및 제3 경쇄와 다른 제4 경쇄를 인코딩하고, 상기 중쇄의 제4 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제4 폴리뉴클레오티드, 및 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 경쇄와 다른 제5 경쇄를 인코딩하고, 상기 중쇄의 제5 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제5 폴리뉴클레오티드로 부가적으로 형질전환될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 발현 벡터, 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 (prokaryotic) 또는 진핵 (eukaryotic) 세포일 수 있다. 사용될 수 있는 진핵 세포 중에서, 식물 세포, 세레비지애 (Saccharomyces)와 같은, 효모로부터의 세포, Drosophila 또는 Spodoptera 세포와 같은, 곤충 세포, 및 HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS 세포와 같은 포유류 세포 등이 언급될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터의 구조체 및 숙주 세포의 형질전환은 분자 생물학의 종래의 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항원-결합 단편 또는 항체를 제조하기 위한 방법이다. 상기 방법은 본 발명의 숙주-세포를 배양하는 단계 및 상기 배양으로부터 항원-결합 단편 또는 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
만약 단백질이 숙주 세포에 의해 분비된다면, 배양 배지로부터 직접 회수될 수 있고, 만약 그렇지 않다면, 세포 용해 (cell lysis)는 사전에 수행될 것이다. 상기 항체는 기술분야의 당업자에게 알려진, 예를 들어, 분별 침전에 의해, 특히, 암모늄 설페이트로 침전, 전기영동, 겔 여과, 친화 크로마토그래피 등, 종래의 절차에 의해, 배양 배지 또는 세포 용해로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 다중특이성 항체의 적용 모두에 사용될 수 있다. 특히, 이들은 광범위한 치료학적 적용에 유용한 약제를 얻는데 사용될 수 있다. 이들 약제 제품은 또한 본 발명의 목적의 일부이다.
특히, 본 발명의 다중특이성 항체는, 예를 들어, 악성 병리학 (malignant pathologies)에 대한 수동 면역요법 (passive immunotherapy), 혈액학적 (haematological) 및 고체 종양 (solid tumors) 또는 자가-면역 질환 (auto-immune diseases), 염증 (inflammation), 이식 거부 (graft rejection), 이식 (transplantation); 자가-면역 질환 또는 감염 동안 다른 세포 군 사이, 특히 면역 세포들의 상호작용을 조절에 의한, 활성 면역 요법; 다중특이성 항체와 면역 세포를 조합하는 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy); 선택된 세포내 구획 (compartment)에 중화 항체의 내재화 (internalisation)를 포함하는, 면역요법에 의한 다양한 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
비-제한적 예로는:
- 표적 세포에 의해 발현된 다른 항원에 대한 본 발명의 다중특이성 항체는 세포사멸 (apoptosis)에 의한 이의 사멸, 이의 하향조절 (downregulation) 또는 반대로 이의 활성을 유도하기 위하여 사용될 수 있고;
- 표적 및 작동인자 세포 상에 발현된 항원에 대하여 본 발명의 다중특이성 항체는, 예를 들어, 상기 작동인자 세포에 의해, 상기 표적 세포의 사멸을 유도되기 위하여 두 타입의 세포들을 브릿지하기 위하여 사용될 수 있고;
- 용해가능한 순환 인자 (factors)를 동시에 세정 또는 차단을 위한 다른 용해가능한 순환 인자에 대한 다중특이성 항체, 예를 들어, 암 치료의 과정에서 VEGF 및 PDGF의 동시 세정, 또는 CTLA4, 프로그램 세포 사멸 1 (PD1) 또는 TIM3 또는 BTLA같은, 면역요법의 활성을 억제하는 다른 분자의 동시 세정 (또는 차단), 또는 항-염증성 치료의 분야에서, Tumor Necrosis Factor (TNF) 및 인터루킨 1 베타 (Interleukin 1 beta)(IL1-β)과 같은, 다른 염증성 사이토킨에 대한 다중특이성 항체를 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 본 발명에 따른 재조합 이-특이성 항체의 제조 및 특성의 실시 예를 참조하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1: 항-CD5/항-HLA-DR 이-특이성 항체의 설계
돌연변이 Fab 단편의 설계
이-특이성 항체의 구조체를 위해 선택된 항체는 PCT WO 2010/145895호에 모두 기재된 항-CD5 항체 및 항-HLA-DR 항체이다.
이들의 본래의 형태하에서, 이들 항체는 카파 경쇄로, 각각 IgG2a 및 IgG1 동종형의 쥐 (murine)의 단일 클론 항체 (mAbs)이다. mAbs 모두는 사람 IgG1 아강인 중쇄의 불변 도메인 및 카파 타입의 경쇄의 불변 부를 갖는 키메라 쥐/사람 mAbs로 미리 형질전환되지만, 사슬 모두의 가변 도메인은 쥐 기원으로 남아있다.
상보적 돌연변이의 두 개의 다른 세트는 이의 본래 형태 하에서 남아있는 상기 항-HLA-DR 항체, 상기 항-CD5 항체의 CH1 및 CL 사슬의 선택된 부위에서 가져온다.
상기 항-CD5 항체에서 돌연변이 부위는 CL/CH1 결합에 대해 중요하게 선택되고, 반면 적절한 폴딩 (proper folding)에 포함된 가장 필수적 잔기를 보존한다.
"전하 잔기" 및 "소수성-극성-교환" (hydrophobicity-polarity-swap)으로 불리는 하기 접근법은 사용된다.
"전하 잔기" 접근법에 있어서, 상호작용 극성 계면 잔기의 쌍은 중성 및 염 브릿지 형성 잔기의 쌍에 대해 교환된다. 염 브릿지의 도입은 회합 (association)의 특이성을 강화하도록 추측되는 반면, 원하지 않는 쌍을 이루는 것은 와일드 타입 및 변이체 사슬 사이에서 입체의 결핍 및 상보적 전하에 의해 피할 수 있다. 광범위한 인 실리코 (in silico) 시험 후, CH1 사슬 상 Glu에 의한 Thr192의 대체 및 CL 사슬 상에 Lys에 대한 Asn137의 교환은 선택된다. 이들 두 개의 돌연변이된 잔기는 염 브릿지를 형성한다. 부가적으로, CL 사슬 상에 Ala에 대한 Ser114의 치환은 더 큰 라이신 측쇄로 입체 충돌을 피하도록 만들어진다. 최종 돌연변이는 이후 "CR3 돌연변이"라 명명된다.
"소수성-극성-교환" 접근법에 대하여, 상기 변형된 불변 도메인은 사중 (quadruple) 돌연변이 (각 사슬 상에 이중 돌연변이)를 도입시켜 얻어진다. 이러한 변형은 IgG CH1/CL 계면 상에 두 개의 잔기-잔기 상호작용의 성질을 교환한다. 상호작용 무극 잔기의 쌍은 극성 아미노산의 쌍에 대해 교환되고, 반면 상호작용 극성 잔기의 쌍은 소수성 잔기의 쌍에 대해 동시에 교환된다. 상기 계면 상호작용의 극성/소수성 특성의 이러한 교환은 변화되지 않은 돌연변이된 CL 및 CH1 도메인 사이에 친화도를 유지하는 것으로 추측되는 반면, 다른 와일드 타입 대응부에 대한 각각 친화도를 감소시키며, 따라서 사슬 복합체를 잘못 연결 (변이체/와일드 타입)시 발생하는 바람직하지 않은 상호작용의 관점에서 잘못된 쌍을 이루는 것을 방지한다.
다수의 잠재적 돌연변이의 인 실리콘 시험 후, 본 발명자들은 Gln 잔기에 의해 CH1 도메인의 Leu143을 대체하는 것을 선택하는 반면, CL 사슬의 대향면 잔기, 즉, Val133는 Thr 잔기에 의해 대체된다. 이러한 제1 이중 돌연변이는 소수성으로부터 극성 상호작용으로 스위치를 구성한다. 동시에 발린 잔기에 대한 두 개의 상호작용 세린 (CH1 사슬상에 Ser188 및 CL 사슬 상에 Ser176)의 돌연변이는 극성으로부터 소수성 상호작용으로 스위치를 수행하도록 선택된다. 최종 돌연변이는 이하 "mut4 돌연변이"라 명명된다.
상기 선택된 돌연변이는 하기에 표 1에 요약되었다:
변형 중쇄의 CH1 경쇄의 CL
전하 잔기
CR3 돌연변이		 Thr192Glu Asn137Lys 및 Ser114Ala
소수성-극성-교환
mut4 돌연변이		 Leu143Gln 및 Ser188Val Val133Thr 및 Ser176Val
다른 돌연변이는 "knob into holes" 접근법 (RIDGWAY et al., Protein Eng, 9, 617-21, 1996)을 사용하여 수행된다. 이들 돌연변이는 하기 표 2에 요약되었다:
CH1/중쇄 CL/경쇄
KH1 Leu124Ala 및 Leu143Glu Val133Trp
KH2 Val190Ala Leu135Trp 및 Asn137Ala
상기 돌연변이된 복합체 결합 자유 에너지는 MM-GBSA 방법을 사용하여 평가된다. 동시에, 잘못된 쌍 복합체 모델은 생성되고, 이들의 상호작용 에너지는 동일한 방법론을 사용하여 계산된다. 선택된 변형에 대하여, 상기 변형된 CL 및 CH1 사슬 사이에 복합체는 와일드 타입 복합체로서 안정한 것으로 평가되는 반면, 잘못된 쌍 복합체에서 의미 있는 바람직하지 않은 상호작용은 관찰된다.
폴리펩타이드 링커의 설계
폴리펩타이드 링커는 돌연변이 항-CD5 항체의 N-터미널 영역에 항-HLADR 항체의 CH1 영역의 C-터미널을 연결하도록 설계된다.
이러한 폴리펩타이드 링커는 사람 IgG1 CH2의 9 N-터미널 아미노-산, 인간 IgA1 힌지의 서열의 부분, 및 디펩타이드 GG를 수반하는, 전체 길이 IgG1 힌지 영역을 포함한다. 이것은 다음의 서열: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ　ID　NO: 9)을 갖는다.
실시 예 2: 항-HLADR (mAb1) 및 항-CD5 (mAb2) 이-특이성 항체를 발현하는 재조합 베큘로바이러스 (baculovirus)의 구조체
상기 이-특이성 항체는 상기 베큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 발현되고 생산된다.
이러한 생산은 mAb2의 전체 길이 중쇄에 융합된 mAb 1로부터 VH/CH1/힌지 도메인을 포함하는 변형된 중쇄의 합성을 요구하며, 예를 들어, 인간 IgA1 + GG의 천연 힌지를 펩타이드 유도된 형태로 연장된 저급 힌지 (현행 구조체)를 포함하는 링커에 의해 분리된다.
두 개의 다른 경쇄들, 상기 제1 항체의 하나의 특이성 및 상기 제2 항체의 다른 하나의 특이성은 독립적으로 합성되고, 전술된 바와 같은 다른 CL 및 CH1 도메인으로 도입된 가역적 돌연변이 (reciprocal mutations) 덕택에, 관련 중쇄에 대해 쌍을 이룰 것이다.
융합된-중쇄 및 오직 하나의 경쇄를 발현하는 제1 하나 및 융합된-중쇄 및 제2 경쇄를 발현하는 제2 하나인 두 개의 다른 베큘로바이러스를 구조체화시키고, 및 상기 혼합물과 곤충 세포를 함께-감염시키는 것은 쉬울 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 더 오래 걸리고, 각 파트너의 화학양론 (stoichiometry)을 조절하는 것을 매우 어려울 것이다. 그래서 본 발명자들은 상기 융합된-중쇄 및 두 개의 경쇄를 발현하는 오직 하나의 재조합 바이러스를 구조체화하는 것을 결정하였다.
이것은 CL 도메인에 대한 두 개의 동일한 서열, 및 상기 중쇄의 CH1-힌지 (CH1+Hg) 도메인에 대한 두 개의 동일한 서열의 상기 베큘로바이러스에 도입을 요구한다. 이러한 동일성 (identity)은 게놈의 재조직 및 유전 정보의 손실을 이끄는 동종의 재조합을 유도할 수 있다.
이러한 현상을 피하기 위하여, 본 발명자들은 서열을 코딩하는 오직 하나의 와일드 타입을 도입하였고, 제2의 것은 합성하였다 (모든 코돈의 변형). 후자에 있어서, 상기 DNA 서열은 원래의 것과 다르지만, 상기 와일드 타입에 단백질 동일성 (100%)를 인코딩한다.
2.1 상기 융합된- 중쇄를 인코딩하는 cDNA 의 구조체
항-HLADR Fab+링커
SEQ　ID　NO: 9의 폴리펩타이드 링커에 융합된 항-HLADR 항체의 CH1 도메인을 인코딩하는 합성 유전자는 합성 오버랩핑 올리고뉴클레오티드의 교잡 (hybridization)을 사용하여 구성된다.
pUC 플라스미드에서 클로닝 및 서열의 조절 후, 이러한 합성 유전자는, 상기 실시 예 1에 기재된 상기 연장 펩타이드를 인코딩하는 서열 및 항-HLADR VH 도메인을 인코딩하는 서열 사이에서, 플라스미드 pOCγKCH1SII/링커A1PstI/VHanti-HLADR에서의 와일드 타입 서열 대신에, 도입된다. 최종 플라스미드는 pOCγKCH1ε링커A1/VH로 명명된다.
돌연변이된 항- CD5 Fab :
중쇄 및 경쇄 사이에 적절한 쌍을 보장하기 위하여, 돌연변이 CR3, mut4, (KH1 또는 KH2)은 항-CD5 Fab 부분구조 (moiety)의 CH1 도메인에 도입된다. 플라스미드 pUCCγmutT192E (즉, CR3 돌연변이)는 NheI/BstXI로 소화되고, 돌연변이된 서열을 갖는 단편은 pUCKPSCγ/VHCD5-CR3을 제공하는 NheI/BstXI으로 소화된 pUCKPSCγ/VHCD5에 삽입되고 정제된다.
동일한 방식에 있어서, pUCKPSCγ/VHCD5-mut4, (pUCKPSCγ/VHCD5-KH1 및 pUCKPSCγ/VHCD5-KH2)은 구성된다.
전체-길이 융합된- 중쇄 :
전체-길이 융합-중쇄를 인코딩하는 cDNA는 pVTanti-HLADR/링커A1/antiCD5/CR3, pVTanti-HLADR/링커A1/antiCD5/mut4, (pVTanti-HLADR/링커A1/antiCD5/KH1, pVTanti-HLADR/링커A1/antiCD5/KH2) 각각을 제공하여 구성된다.
최종 전달 벡터 (transfer vectors)는 각각 pVT항-HLADR/링커A1/항CD5/CR3 및 pVT항-HLADR/링커A1/항CD5/mut4 (pVT항-HLADR/링커A1/항CD5/KH1, 및 pVT항-HLADR/링커A1/항CD5/KH2)로 명명된다.
2.2 cDNA 인코딩 경쇄의 구조체
새로운 전달 벡터의 구조체
전체 기능성 이-특이성 항체의 생산은 (i) 전술된 융합된-중쇄, 및 (ii) 두 개의 경쇄, 상기 돌연변이들 (CR3, mut4, KH1 또는 KH2)을 갖는 항-CD5의 경쇄 특이성 및 항-HLADR의 경쇄 (Mab1)의 공 발현을 요구한다. 이것은 베큘로바이러스 게놈으로 제3 코딩 서열을 삽입하기 위한, 부류 폴리에드린 (polyedrin) 및 p10 loci 외에, 제3 로커스 (locus)를 선택하는 것을 필요로 한다. 베큘로바이러스 복제에 대해 필수적이지 않아서 외부 유전자의 삽입을 허용하는 "gp37"로 불리는 로커스 (Cheng et al. J. Gen. Virol., 82, 299-305, 2001)는 선택된다.
gp37 서열의 측면에 있는, 합성 P10 프로모터의 조절하에서 고유의 XbaI 클로닝 부위를 함유하는 새로운 전달 벡터 (pVTgp37)는 구성된다.
합성 CL 도메인의 구조체
상기 중쇄의 CH1 도메인의 재구성을 위해 기재된 바와 같이, 상기 합성 CL 도메인은 오버랩핑 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 합성된다. 두 개의 서브-단편, CKFr1 및 CKFr2은 발생된다.
pUC 플라스미드에서 클로닝 및 서열의 조절 후, CKFr1 및 CKFr2은, 플라스미드 pUCK/VL항-HLADR에서, 상기 Ck 도메인을 인코딩하는 와일드 타입 서열 대신에, 도입된다.
상기 gp37 전달 벡터에서 경쇄의 도입
합성 불변 도메인 Ck를 함유하는 경쇄를 인코딩하는 재구성된 서열은 XbaI로 소화된 후 분리되고, 최종 구조체 pVTgp37P10S1CKεL항-HLADR을 제공하는, 고유의 XbaI 부위에서 전달 벡터 pVTgp37에 도입된다.
2.3 재조합 바이러스의 구조체
상기 이-특이성 항체를 발현하는 재조합 바이러스의 구조체는 두 개의 단계: (i) 항-HLADR, Mab 1의 경쇄를 오직 발현하는 제1 바큘로바이러스의 구조체 (ii) 항-CD5/항-HLADR, 이-특이성 항체을 발현하는 바이러스의 구조체를 요구한다.
항- HLADR 을 발현하는 재조합 바이러스의 구조체
이러한 목적을 위하여, Sf9 세포는 gp37 로커스에서 gp37 프로모터의 조절 하에서 폴리헤드린 유전자를 발현하는 변형된 바큘로바이러스로부터 추출된 DNA 및 pVTgp37P10S1CKεVL/항-HLADR으로 공 형질감염 (cotransfect)된다.
"폴리헤드린 음성" 표현형을 나타내는 재조합 바이러스는 분리되고, 네 개의 재조합 바이러스의 게놈은 프로브 (probe)로서 합성 카파 c-DNA를 사용하여 서던 블롯 (Southern blot)으로 조절된다. BacLC/항-HLADR 불리는 하나의 재조합 바이러스는 선택된다.
이-특이성 항체를 발현하는 재조합 바이러스의 구조체
Sf9 세포는 융합된-중쇄 pVT항-HLADR/링커A1/항-CD5 (CR3, mut4, KH1 또는 KH2)을 인코딩하는 cDNA를 갖는 전달 벡터 및 BacLC/항-HLADR로부터 추출된 바이러스성 DNA의 존재하에서 Mab2 경쇄 pVTVLIICD5CkmutCR3, pVTVLIICD5Ckmut4, (pVTVLIICD5CkKH1 또는 pVTVLIICD5CkKH2)을 인코딩하는 cDNA를 갖는 전달 벡터로 공-형질전환된다. 생산성 클론은 ELISA에 의해 스크린된다. 재조합 바이러스의 게놈은 프로브로서 사람 불변 γ1 및 불변 κ영역 각각을 인코딩하는 cDNAs를 사용하여 서던 블롯에 의해 조절된다. 두 개의 선택된 클론 (항-CD5/항-HLADR(CR3)에 대한 클론 C683 및 항-CD5/항-HLADR(mut4)에 대한 클론 C977)은 항체의 생산을 위해 사용된다.
2.4 재조합 항체의 생산 및 정제
Sf9 세포는 롤러 용기 (roller bottle)에서 400 ml의 혈청이 없는 배지에서 600,000 cells/ml의 밀도로 접종되고, 세포당 2 PFU의 감염의 다중성에서 클론 C683 또는 클론 C977로 감염된다. 28℃에서 4일간 배양 후, 상층액은 수집되고, 분비된 재조합 항체는 단백질 A Sepharose (GE, HealthCare) 상에서 정제된다. 정제된 이-특이성 항체의 농도는, 제조자 PIERCE에 의해 권장된 바와 같이, BCA 분석을 사용하고, 표준으로 소 IgG (ref 표준 PIERCE 23209)로 결정된다.
최종 이-특이성 항체의 구조는 도 1에 나타내었다.
도 1의 범례 (Legend): Mab1: 항-HLA-DR Fab; Mab2: 항-CD5 돌연변이 Fab; 링커: 폴리펩타이드 링커; 힌지: 사람 IgG1 힌지; Fc 사람 IgG1 Fc 영역. IgG1 힌지로부터 2 시스테인 잔기의 존재에 기인하여, 두 개의 항원-결합 팔은 두 개의 사슬-간 이황산 브릿지를 통해 연결된다.
상기 정제된 항-CD5/항-HLADR 돌연변이 항체의 분자량은 Superose 6 상에서 평가된다. 단백질 A Sepharose 상에서 정제된 분자의 90% 이상은 Superose 6 상에서 약 299 kDa의 예상된 분자량으로 존재하고, 따라서 도 1의 재조합 이-특이성 항체에 대해 이론적인 분자량 260　kDa (글리칸 없이 계산된 MW)에 상응한다.
이들 항체는 감소 또는 감소되지 않는 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 더욱 분석된다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 범례: (A) 감소 조건에서 분석된 샘플; (B) 비-감소 조건에서 분석된 샘플; BS: 이-특이성 항체; Mab: 조절 IgG1 재조합 항-HLADR.
이러한 겔 상에 평가된 이-특이성 항체의 중쇄 크기는 도 1의 항체의 융합된-중쇄의 78,000 Da의 계산된 분자량에 상응한다.
이러한 분석은 본 발명에 기재된 상기 방법론이 두 커플의 경쇄를 갖는 두 개의 융합-중쇄의 교번을 결과하는 분자의 형성을 유도하는 것을 나타낸다.
실시 예 3: 항-CD5/항-HLADR (CR3)의 기능적 특성
결합 부위의 기능성
상기 이-특이성 항체가 이들의 두 개의 다른 항체 결합 부위를 통해 결합할 수 있는 것을 보여주는 것이 중요하다. 목표를 위하여 본 발명자들은 유세포 분석기 (flow cytometry)에 의해 CD5 또는 HLADR을 발현하는 세포에 대해 이들의 결합을 시험하였다. 간단하게, 연구하에서 모든 항체는 Zenon R-피코에리트린 (phycoerythrin) 사람 (또는 쥐) IgG 라벨링 키트 (labelling kit)를 사용하여, 피코에리트린 (PE)으로 커플된다. 세포주는 그 다음 PE-라벨된 항-CD5, 항-HLADR, CR3 이-특이성 항체 또는 조절 쥐 또는 사람 IgG1 무관련 (irrelevant) 항체들로 배양되고, 세척되고 및 그 다음 유세포 분석기에 의해 분석된다.
CD5+/HLADR- Jurkat 세포주 및 CD5-/HLA-DR+ JOK1 세포 주에 결합의 결과는 각각 도 3 및 4에 나타낸다.
도 3의 범례: 상기 Jurkat 세포주 (CD5+/HLADR-)는 모두 PE-라벨된, PE-라벨된 쥐 항-CD5 (항-CD5m), 쥐 항-HLADR (항-HLADRm), 이-특이성 항-CD5/항-HLADR CR3 키메라 항체 또는 조절 사람 또는 쥐 IgG1 항체 (hIgG1 및 mIgG1, 각각)로 염색된다. 세포는 그 다음 표준 유세포 분석기에 의해 분석된다. 각 항체에 대해 중첩된 히스토그램 (histograms)은 각 항체의 괄호로 나타낸 평균 형광 강도 값 (mean fluorescence intensity values) (MFI)으로, 나타낸다. 1. mIgG-PE 1㎍ (MFI=2.6); 2. 항-CD5m-PE 1㎍ (MFI=17); 3. 항-HLADRm-PE 1㎍ (MFI=2.5); 4. hIgG1-PE 1㎍ (MFI=3.9); 5. 항-CD5/항-HLADR/chi-PE CR3 1㎍ (MFI=103).
도 4의 범례: JOK1 세포주 ((CD5-/HLADR+)는 모두 PE-라벨된, PE-라벨된 쥐 항-CD5 (항-CD5m), 쥐 항-HLADR (항-HLADRm), 이-특이성 항-CD5/항-HLADR CR3 키메라 항체 또는 조절 인간 또는 쥐 IgG1 항체 (mIgG1 및 hIgG1, 각각)로 염색된다. 세포는 그 다음 표준 유세포 분석기에 의해 분석된다. 각 항체에 대해 중첩된 히스토그램은 각 항체에 대해 괄호로 나타낸 평균 형광 강도 값 (mean fluorescence intensity values) (MFI)으로 나타낸다. 1. mIgG1-PE 1㎍ (MFI=25); 2. (hatched) 항-CD5m-PE 1㎍ (MFI=18); 3. 항-HLADRm-PE 1㎍ (MFI=432); 4. hIgG1-PE 1㎍ (MFI=3); 5. 항-CD5/항-HLADR/chi-PE CR3 1㎍ (MFI=3521).
도 3은 쥐 항-CD5 및 이-특이성 CR3 모두가 CD5+ Jurkat 세포주에 결합할 수 있는 반면, 항-HLADR 항체는, 예상된 바와 같이, 그렇지 않은 것을 나타낸다. 따라서, 이-특이성 CR3 항체는 CD5 양성 세포주 상에 상기 CD5 항원을 인지한다.
도 4는 쥐 항-HLADR 및 이-특이성 CR3 항체가 CD5-/HLADR+ JOK 세포주에 높은 강도로 결합하는 반면, 쥐 항-CD5는, 예상된 바와 같이, 그렇지 않은 것을 나타낸다. 이것은 상기 이-특이성 CR3 항체가 HLADR+ 세포주 상에 HLADR 항원을 인지하는 것을 입증한다.
본 발명자들은 상기 이-특이성 CR3 항체가 모든 특이성 (CD5 및 HLADR)을 정확하게 인지하는 것으로 결론내렸다.
동일한 세포 상에 발현된 항원에 결합
그 다음 본 발명자들이 보여준 이-특이성 CR3 항체가 동일한 세포 표면, 즉 cis에서 발현된 경우, 이의 2 표적에 결합할 수 있다는 것을 더욱 기록하였다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명자들은 CD5 및 HLADR의 동일한 양을 대략적으로 발현하는 B-CLL 환자 샘플을 먼저 확인하였다. B-CLL 환자 세포는 실온에서 30 분 동안 쥐 항-CD5, 쥐 항-HLADR 및 쥐 IgG1 조절 항체로 배양되고, 그 다음 FITC-라벨된 항-쥐 IgG 2차 항체로 배양된다. 세척 후, 세포는 표준 유세포 분석기에 의해 분석된다. 도 5A에서 나타낸 바와 같이, 상기 세포는 65 및 98 각각의 평균 형광 강도로, CD5 및 HLADR의 유사한 양을 발현한다.
이-특이성 항-CD5/항-HLADR CR3 항체가 동일한 세포 상에서 항원 모두와 결합한다는 것을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 그 다음 동일한 B-CLL 샘플 상에서 가교-차단 (cross-blocking) 실험을 수행하였다. 세포는 과량 (10㎍/ml)의 쥐 항-CD5 또는 쥐 항-HLADR 항체 또는 모두의 존재 또는 부재하에서, 1 ㎍/ml 키메라 CR3 이-특이성 항체로 배양된다. 세척 후, 이-특이성 CR3 항체의 결합은 2차 단일 클론 FITC-라벨된 항체 (Sigma-Aldrich)로 배양, 사람 Fc에 대한 특이성, 및 쥐 Fc에 결합할 수 없는 것 (나타낸 데이터 없음)에 의해 검출된다.
도 5의 범례:
패널 A: B-CLL 환자 세포는 쥐 항-CD5 (mCD5), 쥐 항-HLADR (mDR) 또는 대조구로서 쥐 무관한 IgG 항체 (mIgG)로 배양된다. 세척 후, 세포는 FITC-라벨된 항-쥐 2차 항체로 염색되고, 그 다음 표준 유세포 분석기에 의해 분석된다. mCD5 및 mDR에 대한 MFI는 괄호 (bracket) 사이에 표시된다.
패널 B: A에서와 같은 동일한 환자로부터 세포는 1 ㎍/ml 키메라 CR3 단독 (어두운 두꺼운 선) 또는 10 ㎍/ml 쥐 항-CD5의 존재에서 (밝은 회색 선) 또는 쥐 항-HLADR (어두운 회색 선) 또는 모두 (불연속선)로 배양된다. 세척 후, 세포는 단일 클론 FITC-라벨된 항 인간 Fc 항체로 배양하고, 세척되고 및 유세포 분석기에 의해 분석된다. 각 조건에 대하여 중첩된 히스토그램은 각 곡선상에 나타낸 각 경우에서 얻어진 MFI로 보여진다. BS:이-특이성, m:쥐, h:사람, chi: 키메라.
Figure 112014011864593-pct00001
도 5B 및 상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 이-특이성 CR3 항체 단독은 97의 평균 형광 강도 (MFI)를 결과한다. 항-CD5 또는 항-HLADR 단독에 의한 경쟁은 오직 부분적으로 CR3 (MFI 72 및 54, 각각)을 대신한다. 반대로, 함께 두 항체를 첨가하는 것은 거의 완전하게 이-특이성 CR3 항체 (MFI 20)를 대신한다. 이들 데이터는 이-특이성 CR3 항체가 CD5 또는 HLADR 부분구조를 통해 세포에 결합되고, 이것을 대신하는 것은 항-CD5 및 항-HLADR 항체의 혼합물에 의한 경쟁을 요구하는 것을 암시한다.
본 발명자들은 이-특이성 항체 CR3, 키메라 항-CD5/항-HLADR 항체가 동일한 세포 상에 HLADR 및 CD5 모두에 결합할 수 있다는 것을 이들 데이터로부터 결론을 얻었다.
실시 예 4: Fc 부분구조의 및 이-특이성 항체의 항원-결합 부분구조의 기능성
Fc 부분구조
항체 분자의 Fc 부분구조는 대식세포 (macrophages) (FcγRI, II 및 III) 및 NK 세포 (FcγRIII), 각각에서 FcγRs에 결합하는 항체 의존 세포독성 (cytotoxicity) (ADCC) 및 식작용 (phagocytosis) (ADP)과 같이 다양한 면역 기능을 활성화시킬 수 있다. 구성된 이-특이성 항체가 사람 IgG1로부터 유도된 Fc 부분구조를 갖기 때문에, 본 발명자들은 이것이 기능적인지를 시험했고, 따라서 이들 면역 매개된 기능을 매개할 수 있었다.
천연 킬러 세포에 의해 항체-의존 세포독성 ( Antibody - dependent cellular cytotoxicity) ( ADCC )
먼저 본 발명자들은 이의 파라토프 (paratope) 중 하나가 이것의 각자의 분자에 결합 경우, 이-특이성 CR3 분자의 Fc 부분이 활성인지 아닌지를 결정하는 것을 원했다. 본 발명자들은 ADCC를 분석하고, NK 세포에 Fc 결합에 의해 매개하며, Jurkat 세포와 같은 CD5+/HLA-DR- 표적 상, 및 JOK1과 같은 HLA-DR+/CD5- 표적 및 이중 양성 표적 JOK1.5.3 세포 상에 유도했다. NK 세포는 면역비드 (immunobead) 선택에 의해 말초혈액단핵구 (peripheral blood mononuclear cell)로부터 정제된다. 표적 세포는 20분 동안 4℃에서 1μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석시니미딜 에스테르 (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) (CFSE)로 라벨되고, 세척되고 및 10:1 작동인자 대 표적 비 (E:T)에서 4 시간 동안 37℃에서 정제된 NK 세포로 배양된다. 세포는 그 다음 7AAD로 라벨되고, 유세포 분석기에 의해 분석된다. 사멸 퍼센트는 총 CFSE+ 세포에 대하여 퍼센트 7AAD 양성 표적 (CFSE+)으로서 측정된다.
그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6의 범례: JURKAT (CD5+HLADR-, 패널 A), JOK1 (CD5-HLADR+, 패널 B) 및 JOK1 5.3 (CD5+HLADR+, 패널 C)는 CFSE 라벨되고, 10:1 E:T 비에서 사람 NK 세포 및 1 ㎍/ml 키메라 항-CD5 (항-CD5chi) 또는 키메라 항-HLADR (항-HLADRchi) 또는 2 ㎍/ml 이-특이성 CR3 항체의 존재하에서 ADCC 분석에서 사용된다. 세포독성은 37℃에서 4 시간 후 유세포 분석기에 의해 측정된다.
상기 데이터는 이-특이성 CR3 항체가 모든 3개의 세포주 상에 ADCC를 매개하는 것을 나타낸다 (33-78% 독성). 반대로, 항-CD5chi 및 항-HLADRchi은 CD5+ 또는 HLADR+ 세포주 각각에 대해 오직 세포독성이 있다.
본 발명자들은 이-특이성 CR3 항체의 Fc 부분구조가 CD5, HLADR 또는 두 항원을 발현하는 표적의 ADCC를 매개하도록 항체를 기능적으로 허용한다는 결론을 얻었다.
식작용
대식세포 (FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII) 상에 존재하는 FcγRs에 결합, 및 이들 각각의 분자에 이의 파라토프의 동시 결합에 대하여 CR3분자의 Fc 부분의 기능성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 생체외에서 ADP를 평가했다. CD14+ 단핵구는 제작자의 설명서 (Miltenyi Biotec)에 따라, 항-CD14 마이크로비드 자기 세포 분류 (microbeads magnetic cell sorting)에 의해 건강한 도너의 모노뉴클레어 세포로부터 정제된다. 이들은 20% 소태아 혈청 (foetal bovine serum) 및 20 ng/ml 사람 rM-CSF (R&D Systems)으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 6-7일 동안 2 x105/웰에서 8-웰 챔버 슬라이드 (LabTek; Nunc)에서 배양된다. 이들 대식 세포에 의해 B-CLL 표적 세포 (CD5+/HLA-DR+)의 식작용은 그 다음 수행된다. 2 x105 B-CLL 표적의 전체는 0.01 내지 0.1 ㎍/ml CR3 이-특이성 항체 또는 항-CD20 mAb 리툭시맵 (rituximab)의 존재 또는 부재하에서 각 웰에 첨가된다. 37℃에서 2 시간 후, 슬라이드는 PBS에서 부드럽게 헹구어내고, 고정하고, May-Gruenwald Giemsa로 염색한다. 식작용은 ImageJ 1.38 이미지 공정 및 소프트웨어 분석을 사용하여 각 실험 조건에 대하여 적어도 200 세포를 현미경 하에서 카운팅, 및 총 대식세포에 대하여 적어도 하나의 종양 표적 세포를 삼키는 대식 세포의 퍼센트를 계산하여 평가된다.
상기 결과는 도 7에 나타낸다.
도 7의 범례: 0.01 내지 1 ㎍/ml의 이-특이성 항체 CR3 또는 단일특이 항-CD20 항체 리툭시맵 (RTX) 범위에서, 식작용 퍼센트는 Y-축에서 나타내고, 사용된 항체의 농도는 X-축에서 나타낸다. 0: 첨가된 항체가 없음.
하기 데이터는 상기 이-특이성 CR3 항체가 리툭시맵과 유사하게, 0.1-1 ㎍/ml에서 바탕 이상의 약 40% 식작용을 매개하는 것을 나타낸다. 음의 대조구 항체 트라스투주맵 (trastuzumab) (항-HER2)은 식작용을 매개하지 않는다 (나타낸 데이터 없음).
따라서 본 발명자는 이-특이성 CR3 항체 분자의 Fc 부분구조가 기능적이고 이들 세포 상에 FcγRs와 Fc의 상호작용을 통해 대식세포에 의해 표적 세포의 식작용을 매개할 수 있는 것으로 결론을 얻었다.
항원-결합 부분구조
이-특이성 CR3 항체에 의해 사이토킨 ( Cytokine ) 유도된 킬러 세포에 의해 리디렉트된 ( Redirected ) 사멸
본 발명자들은 그 다음 이-특이성 CR3 항체의 파라토프가 2 개의 다른 세포 타입 상에 존재하는 이의 표적 항원에 결합 수 있는지를 결정하였다.
사이토킨 유도 킬러 세포 (CIK)는 항-CD3, 인터페론-감마로 말초혈액단핵구의 자극 및 인터루킨-2로 3-4 주동안 생체 외에서 팽창에 의해 생체 외에서 발생된 활성화된 CD3+CD56+ 이중 양성 T 림프구이다 (Schmidt Wolff et al. J. Exp. Med. 174:139-149; 1991). CIK 세포는 종양에 대한 상당한 천연 세포독성 활성을 갖지만 NK 세포와 유사하게, 생체 외에서 정상 세포는 아니다. 그러나 CIK 세포는 FcγR을 발현하지 않고, 따라서 리툭시맵과 같은 단일-특이 IgG 항체의 존재하에서 ADCC를 매개하지 않는다. CIK 세포는 CD5를 발현한다. 이러한 이유 때문에, CIK 세포는 CIK 상에 CD5 및 종양 표적 상에 HLADR를 인지하는 이-특이성 항체 MUT 4에 의해 음성 종양 세포가 아닌 양성 HLADR로 향하여 리디렉트될 수 있다. ADCC와 다르게, 이러한 리디렉트된 사멸은 상기 항체의 두 개의 Fab 특이성 및 Fc 부분이 없는 것을 사용한다.
방법
말초혈액단핵구는 당일 첨가된 1000 U/mL IFN-γ (Gammakine; Boehringer Ingelheim, Vienna, Austria), 1일 차에 첨가된 0.50 ng/mL 항-CD3 (OKT-3, Janssen-Cilag S.p.a., Italy) 및 1일 이후로부터 배지에서 배양된 500 U/mL rhIL-2로 혈청-없는 X-VIVO 15 배지에서 3x106/ml로 배양된다. 연장은 3-4일마다 배지를 함유하는 신선한 rhIL-2에서 1x106/ml로 세포를 조정하는 21-28 일 동안 수행된다. 상기 연장의 끝에서, CD3+/CD5+/CD56+ 세포독성 CIK 세포는 개체군의 40-70%이다. 나머지 세포는 대부분 CD3+/CD56- CIK 전구 세포이다.
사람 종양 표적 세포주 BJAB (CD5-/HLA-DR+), JOK1.5.3 (CD5+/HLA-DR+), Jurkat (CD5+/HLA-DR-) 및 KCL22 (CD5-/HLA-DR-)은 10% 소태아 혈청 (Euroclone, Wetherby, West Yorkshire, U.K.), 2 mM L-글루타민 (Euroclone) 및 110 μM 젠타마이신 (PHT Pharma, Milano, Italy)으로 보충된, RPMI-1640 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 유지된다.
리디렉트된 세포 독성 분석을 위하여, 표적 세포주는 3.5 μＭ Calcein-AM (Fluka, Sigma-Aldrich Company, Ayrshire, UK)으로 37℃에서 30분 동안 표지된다. 세척 후 표지된 표적 세포는 5 x 103/웰에서 96-웰 플레이트에 분포된다. CIK 세포는 1 ㎍/ml 이-특이성 CR3 항체의 존재 또는 부재하에서 10:1 작동인자 대 표적 비에서 첨가된다. 4 시간 후, 상기 세포는 원심분리에 의해 침전되고, 100 ㎕ 상층액은 수집되고, 칼세인 방출 (calcein release)은 485nm에서 여기 (excitation) 및 535nm에서 방출로 형광 마이크로플레이트 리더 (fluorescence microplate reader) (GENios, TECAN, Austria GmbH, Salzburg, Austria)을 사용하여 결정된다. 퍼센트 (%) 특이 용해 (lysis)는 (시험 칼세인 방출 - 자발적인 칼세인 방출) × 100/(최대 칼세인 방출 - 자발적인 칼세인 방출)로서 계산된다. 최대 용해는 1% Triton X-100을 첨가하여 달성된다.
그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8의 범례: 칼세인-AM (Calcein-AM) 로딩된 표적 세포주 BJAB, JOK1.5.3, Jurkat 및 KCL22는 1 ㎍/ml 이-특이성 CR3 항체의 존재 (개방 바) 또는 부재 (검정 바)하에서 및 10:1 작동인자:표적 비에서 CIK 세포의 존재하에서 배양된다. 4 시간 후, 상층액은 수집되고 측정된 칼세인을 방출된다. 상기 데이터는 평균 및 각 세포주로 2-6 개별적 실험의 표준 편차로서 측정된 퍼센트 용해 (Y-축)를 나타낸다. CTRL: 항체 없는 대조구.
그 결과는 생체 외에서, HLADR 양성 (BJAB, JOK15.3), 그러나 HLADR 음성 표적 (Jurkat, KCL22) 아닌 사멸 퍼센트 (용해)는, 10:1 작동인자:표적 비에서 CIK 세포의 존재하에서 1 ㎍/ml CR3 항체의 첨가에 의해 50-60%로 증가되는 것을 보여준다. 이것은 이-특이성 CR3 항체에 의해 형성된 세포내 브릿지가 CIK 세포에 의해 HLADR+ 표적의 사멸을 증진시키는 것을 입증한다. 특이성을 입증하는, 관찰된 HLADR 음성 표적의 사멸의 증진은 없다.
정상 T 세포에 대하여 CIK 세포의 세포독성 효과의 이-특이성 CR3 항체에 의한 증진의 특이성은 다음과 같이 더욱 입증된다: HLADR+ BJAB 표적 세포는 1 ㎍/ml CR3의 존재 또는 부재하에서 1:1 내지 10:1 범위의 작동인자:표적 비에서 작동인자 세포로서 말초혈액단핵구의 다른 양으로 배양된다. 용해는 4 시간에 측정된다.
상기 결과는 도 9에 나타낸다.
도 9의 범례: 세포독성 실험은 이-특이성 항체 CR3의 존재 (검정 원) 및 부재 (개방 원)하에서, 다른 작동인자:표적 비에서 표적 세포로서 BJAB 및 작동인자로서 PBMC로 수행된다. X-축: 작동인자:표적 비; 용해의 Y-축 퍼센트; CR3: 이-특이성 CR3 항체; CTRL: 항체 없는 대조구.
정상 T에 의해 HLADR+ 표적의 용해 상에 CR3 항체의 효과는 관측되지 않았다.
이들 결과는 이가 이-특이성 항체 CR3가 차용 면역 치료 (adoptive immunotherapy treatment)에서 사이토킨 유도된 킬러 (CIK) 세포와 공동으로 사용될 수 있는 것을 보여준다. 이러한 경우에 있어서, 상기 2 Fab 쌍의 다른 특이성은 사용되는데, 한 쌍 (이러한 경우에 있어서, 항-HLADR)은 표적 세포를 인지하고 및 다른 것은 (항-CD5) 작동인자 CIK 세포이다. 이러한 결과는 다른 표적 항원이 HLADR 대신에, HER1, HER2, EpCAM, CD19, CD20 또는 기타와 같이 삽입될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 또한 작동인자 세포에 의해 발현된 다른 항원이 T 림프구에 의해 발현된 CD3와 같은, CD5 대신에, 암 치료의 다른 형태의 틀거리에서 대식세포 상에 FcγRI-III 또는 NK 세포 상에 존재하는 FcγRIII 또는 NKG2D이 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
이-특이성 MUT 4 항체에 의해 사이토킨 유도 킬러 세포에 의해 리디렉트된 사멸
본 발명자들은 이-특이성 MUT 4 항체가 2 개의 다른 세포 타입 상에 존재하는 이의 표적 항원에 결합할 수 있는지, 및 HLADR+ 림프종 (lymphoma) 표적 (JOK1 5.3)으로 향하는 CD5+ 사이토킨 유도 킬러 세포 (CIK)의 사멸을 리디렉트할 수 있는 지를 결정하였다. CIK는 항-CD3, 인터페론-감마로 말초혈액단핵구의 자극 및 인터루킨-2로 3-4 주동안 생체 외에서 팽창에 의해 생체 외에서 발생된 활성화된 CD3+CD56+ 이중 양성 T 림프구이다 (Schmidt Wolff et al. J. Exp. Med. 174:139-149; 1991). CIK 세포는 NK 세포와 유사하게, 생체 외에서 정상세포가 아닌 종양에 대해서 의미 있는 천연적 세포독성 활성을 갖는다. 그러나, CIK 세포는 FcγR을 발현하지 않고, 따라서 리툭시맵과 같은 단일-특이 IgG 항체의 존재하에서 ADCC를 매개하지 않는다. CIK 세포는 CD5를 발현한다. 이러한 이유 때문에, CIK 세포는 CIK 상에 CD5 및 종양 표적 상에 HLADR를 인지하는 이-특이성 항체 MUT 4에 의해 음성 종양 세포가 아닌 양성 HLADR로 향하여 리디렉트될 수 있다. ADCC와 다르게, 이러한 리디렉트된 사멸은 상기 항체의 두 개의 Fab 특이성 및 Fc 부분이 없는 것을 사용한다.
방법
말초혈액단핵구는 당일 첨가된 1000 U/mL IFN-γ (Gammakine; Boehringer Ingelheim, Vienna, Austria), 1일 차에 첨가된 0.50 ng/mL 항-CD3 (OKT-3, Janssen-Cilag S.p.a., Italy) 및 1일 이후로부터 배지에서 배양된 500 U/mL rhIL-2로 혈청-없는 X-VIVO 15 배지에서 3x106/ml로 배양된다. 연장은 3-4일마다 배지를 함유하는 신선한 rhIL-2에서 1x106/ml로 세포를 조정하여 세포를 21-28일 동안 수행된다. 상기 연장의 마지막에서, CD3+/CD5+/CD56+ 세포독성 CIK 세포는 개체군의 약 50%이다. 나머지 세포는 대부분 CD3+/CD56- CIK 전구 세포이다.
사람 종양 표적 세포주 JOK1.5.3 (CD5+/HLA-DR+)은 10% 소태아 혈청 (Euroclone, Wetherby, West Yorkshire, U.K.), 2 mM L-글루타민 (Euroclone) 및 110 μM 젠타마이신 (PHT Pharma, Milano, Italy)으로 보충된, RPMI-1640 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 유지된다.
리디렉트된 세포 독성 분석을 위하여, 표적 세포주는 3.5 μＭ Calcein-AM (Fluka, Sigma-Aldrich Company, Ayrshire, UK)으로 37℃에서 30분 동안 표지된다. 세척 후 표지된 표적 세포는 5 x 103/웰에서 96-웰 플레이트에 분포된다. CIK 세포는 1 또는 5 ㎍/ml 이-특이성 MUT 4 항체, CR3 항체 또는 대조구로 리툭시맵 (RTX)의 존재 또는 부재하에서 10:1 작동인자 대 표적 비에서 첨가된다. 4 시간 후, 상기 세포는 원심분리에 의해 침전되고, 100 ㎕ 상층액은 수집되고, 칼세인 방출 (calcein release)은 485nm에서 여기 및 535nm에서 방출로 형광 마이크로플레이트 리더 (GENios, TECAN, Austria GmbH, Salzburg, Austria)을 사용하여 결정된다. 퍼센트 (%) 특이 용해 (lysis)는 (시험 칼세인 방출 - 자발적인 칼세인 방출) × 100/(최대 칼세인 방출 - 자발적인 칼세인 방출)로서 계산된다. 최대 용해는 1% Triton X-100을 첨가하여 달성된다.
상기 결과는 도 10에서 나타낸다.
도 10의 범례: 칼세인-AM 로딩된 표적 세포 JOK1.5.3는 1 또는 5 ㎍/ml 이-특이성 MUT 4, CR3 또는 리툭시맵 (RTX) 항체의 존재 또는 부재 및 CIK 세포의 존재에서 10:1 작동인자:표적 비로 배양된다. 4 시간 후, 상층액은 수집되고 측정된 칼세인을 방출된다. 상기 데이터는 평균 및 2개의 독립 실험의 표준 편차로 측정된 퍼센트 용해 (Y-축)을 나타낸다. -: 항체 없는 대조구.
상기 결과는 생체 외에서, HLADR 양성 JOK15.3의 퍼센트 사멸 (용해)이 10:1 작동인자:표적 비에서 CIK 세포의 존재하에서, CR3 항체의 첨가에 의해 40-50% 및 1-5 ㎍/ml MUT 4 항체의 첨가에 의해 60-70%로 증가된다. 반대로 리쿡시맵는 의미 있는 효과가 없다. 이것은 이-특이성 MUT 4 항체에 의해 형성된 세포내 브릿지가, CR3로 얻어진 것과 유사하거나 또는 더 높은, CIK 세포에 의한 HLADR+ 표적의 사멸을 극적으로 증진시키는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE KADOUCHE, Jean MACH, Jean-Pierre MICHIELIN, Olivier ZOETE, Vincent IWASZKIEWICZ, Justyna CERUTTI, Martine CHOBLET, Sylvie GOLAY, Jos? <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES <130> MJPll-F644-319PCT <150> EP 11 305 872.1 <151> 2011-07-07 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu 35 40 45 Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro 50 55 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 9 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Gly Gly <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 12 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Pro Ser Thr Pro Pro Ser Pro Ser Thr Pro Gly Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker fragment <400> 14 Pro Ser Thr Pro Pro Ser Pro Ser Thr Pro 1 5 10

Claims (18)

  1. 다른 CH1 및 CL 도메인을 갖는 적어도 두 개의 Fab 단편을 포함하는 다중특이성 항원-결합 단편으로, 상기 Fab 단편은 하기 중에서 선택되며
    - 면역글로블린의 와일드-타입 CH1 및 CL 도메인, 및 관심의 에피토프를 인지하는 항체의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 와일드-타입 Fab 단편;
    - 하기로 이루어진 돌연변이된 Fab 단편
    * 관심의 에피토프를 인지하는 항체의 VH 및 VL 도메인;
    * 글루타민산 잔기로 CH1 도메인의 위치 192에서 트레오닌 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인; 및
    * 라이신 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 137에서 아스파라긴 잔기의 치환 및 알라닌 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 114에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CL 도메인으로부터 유도된 CL 도메인;
    - 하기로 이루어진 돌연변이된 Fab 단편
    * 관심의 에피토프를 인지하는 항체의 VH 및 VL 도메인;
    * 글루타민 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 143에서 루신 잔기의 치환 및 발린 잔기로 상기 CH1 도메인의 위치 188에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CH1 도메인으로부터 유도된 CH1 도메인; 및
    * 트레오닌 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 133에서 발린 잔기의 치환 및 발린 잔기로 상기 CL 도메인의 위치 176에서 세린 잔기의 치환에 의해 면역글로블린의 CL 도메인으로부터 유도된 CL 도메인;
    여기서 상기 Fab 단편 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편이고,
    상기 CH1 및 CL 도메인에 대해 사용된 배열 위치 숫자(sequence position number)는 Kabat 넘버링이며,
    각각의 Fab 단편은 관심의 다른 에피토프를 인지하고,
    상기 Fab 단편은 순서와 상관없이 탠덤하게(tandemly) 배열되며, 제1 Fab 단편의 상기 CH1 도메인의 C-터미널 말단은 폴리펩타이드 링커를 통한 다음의 Fab 단편의 상기 VH 도메인의 N-터미널 말단에 연결되는 다중특이성 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 링커는 적어도 20 아미노-산의 길이를 갖는 다중특이성 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 링커는 IgA, IgG, 및 IgD 중에서 선택된 하나 이상의 면역글로블린(들)의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 다중특이성 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 링커는 하기 서열을 갖는 다중특이성 항원-결합 단편
    EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 다중특이성 항원-결합 단편으로 각각 이루어진, 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 갖는 다중특이성 항체로서, 여기서 상기 두 개의 다중특이성 항원-결합 단편은 동일한 다중특이성 항체.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 다중특이성 항체는 면역글로블린-유사 구조를 가지며
    - 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 다중특이성 항원-결합 단편으로 각각 이루어진 두 개의 동일한 항원-결합 팔, 여기서 상기 두 개의 다중특이성 항원-결합 단편은 동일하며;
    - 면역글로블린의 이량체화된 CH2 및 CH3 도메인; 및
    - 상기 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-터미널 말단을 상기 CH2 도메인의 N-터미널 말단에 연결시키는 IgA, IgG, or IgD의 힌지 영역을 포함하는 다중특이성 항체.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항원-결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 숙주-세포.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 숙주 세포는 상기 제1 및 제2 경쇄와 다르며, 상기 중쇄의 제3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는, 제3 경쇄를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드로 부가적으로 형질전환된 형질전환된 숙주 세포.
  9. 청구항 5의 다중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 숙주-세포.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 숙주 세포는 상기 제1 및 제2 경쇄와 다르며, 상기 중쇄의 제3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는, 제3 경쇄를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드로 부가적으로 형질전환된 형질전환된 숙주 세포.
  11. 청구항 6의 다중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 숙주-세포.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 숙주-세포는 상기 제1 및 제2 경쇄와 다르며, 상기 중쇄의 제3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는, 제3 경쇄를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드로 부가적으로 형질전환되는, 형질전환된 숙주-세포.
  13. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항원-결합 단편의 제조방법으로, 상기 방법은 숙주-세포를 배양하는 단계 및 상기 항원-결합 단편을 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 숙주-세포는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항원-결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 것인 항원-결합 단편의 제조방법.
  14. 청구항 5의 다중특이성 항체의 제조방법으로, 상기 방법은 숙주-세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 숙주-세포는 청구항 5의 다중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 것인 항원-결합 단편 또는 다중특이성 항체의 제조방법.
  15. 청구항 6의 다중특이성 항체의 제조방법으로, 상기 방법은 숙주-세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 숙주-세포는 청구항 6의 다중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 두 개의 다른 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되며 제1 경쇄는 상기 중쇄의 제1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루고; 제2 경쇄는 상기 중쇄의 제2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루며, 상기 경쇄의 적어도 하나는 청구항 1에 정의된 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄인 형질전환된 것인 항원-결합 단편 또는 다중특이성 항체의 제조방법.
  16. 약제로 사용하기 위한, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항원-결합 단편.
  17. 약제로 사용하기 위한, 청구항 5의 다중특이성 항체.
  18. 약제로 사용하기 위한, 청구항 6의 다중특이성 항체.
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013532153A (ja) * 2010-06-18 2013-08-15 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 慢性免疫病に対する免疫治療のためのｔｉｍ−３およびｐｄ−１に対する二重特異性抗体
EP2543680A1 (en) * 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
MX362705B (es) 2012-05-10 2019-02-01 Bioatla Llc Anticuerpos monoclonales multiespecíficos.
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
EP2925785A4 (en) * 2012-11-28 2016-11-16 Zymeworks Inc MANIPULATED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN LIGHT CHAIN COUPLES AND USES THEREOF
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
US20160145355A1 (en) * 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
DK3107938T3 (da) 2014-05-28 2022-07-11 Zymeworks Inc Modificerede, antigenbindende polypeptidkonstrukter og anvendelser heraf
GB201411420D0 (en) * 2014-06-26 2014-08-13 Ucb Biopharma Sprl Antibody constructs
CN104371974B (zh) * 2014-10-24 2017-03-22 杭州阿诺生物医药科技股份有限公司 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法
EP3212231B1 (en) * 2014-10-27 2021-04-28 Agency For Science, Technology And Research Anti-tim-3 antibodies
AU2016252773B2 (en) * 2015-04-24 2022-06-02 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins
MY192202A (en) * 2015-10-02 2022-08-06 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
US11161915B2 (en) 2015-10-08 2021-11-02 Zymeworks Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
AU2016381605A1 (en) 2015-12-28 2018-07-12 Massachusetts Institute Of Technology Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor
DK3433273T3 (da) 2016-03-25 2022-02-14 Biomunex Pharmaceuticals Binding af molekyler til cd38 og pd-l1
CN109563166B (zh) * 2016-04-28 2022-12-20 拜奥穆尼克斯制药 靶向egfr和her2的双特异性抗体
KR20170123849A (ko) * 2016-04-29 2017-11-09 주식회사유한양행 Ccl3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
EP3489262A4 (en) * 2016-07-19 2020-07-08 Ibentrus, Inc. SPECIFIC PROTEINS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
JP7269167B2 (ja) * 2016-10-14 2023-05-08 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド モジュラー四価二重特異性抗体プラットフォーム
CN108264557B (zh) * 2016-12-30 2021-08-24 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd3和t细胞负共刺激分子的双功能分子及其应用
CN108264562B (zh) * 2016-12-30 2021-08-10 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd3和t细胞正共刺激分子的双功能分子及其应用
CN110520444A (zh) 2017-01-09 2019-11-29 拜奥穆尼克斯制药 用于制备多特异性抗体的多肽接头
BR112019019998A2 (pt) * 2017-03-27 2020-04-28 Biomunex Pharmaceuticals anticorpos multiespecíficos estáveis
MX2019011770A (es) 2017-04-03 2020-01-09 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-pd-1 con un mutante il-2 o con il-15.
CN116375876A (zh) 2017-04-05 2023-07-04 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
FR3072686B1 (fr) 2017-10-25 2021-10-22 Centre Nat Rech Scient Systeme d'expression baculovirus
CA3084398A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 I-Mab Biopharma Us Limited Modified c.kappa. and ch1 domains
EP3674316A1 (en) 2018-12-24 2020-07-01 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
AU2019412561A1 (en) * 2018-12-24 2021-08-12 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant Fab domains
WO2021058729A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-müllerian inhibiting substance type i receptor antibodies and uses thereof
EP4322938A1 (en) 2021-04-14 2024-02-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) New method to improve nk cells cytotoxicity
WO2022219076A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to improve the anti-tumoral activity of macrophages
CN114106192A (zh) * 2021-12-20 2022-03-01 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
WO2023166098A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Biomunex Pharmaceuticals Bispecific antibodies binding to her-3 and to either her-2 or egfr

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007147901A1 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4118120A1 (de) * 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
DE4419399C1 (de) * 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0826696B1 (de) * 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
LT2857516T (lt) * 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
JP2010535032A (ja) 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
WO2009015518A1 (fr) 2007-08-02 2009-02-05 Essence Technology Solution, Inc. Procédé de communication pour fournir un téléphone multimode voix sur ip dans un dispositif mobile
CA2709847C (en) * 2008-01-07 2018-07-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
PT2310970E (pt) * 2008-06-20 2013-07-26 Massachusetts Inst Technology Métodos de identificação de regiões de ligação macromolecular e de regiões predispostas à agregação nas proteínas e suas utilizações
CN102625813A (zh) * 2008-06-20 2012-08-01 诺华公司 具有降低的聚集的免疫球蛋白
CA2736408A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Roche Glycart Ag Bispecific anti-egfr/anti-igf-1r antibodies
JP2012525149A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
PL2430051T3 (pl) 2009-05-14 2017-04-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Kompozycje zawierające przeciwciała do leczenia chorób związanych z komórkami B lub T CD5+ HLA-DR+
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
AR080794A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
EP2543680A1 (en) * 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007147901A1 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies

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