CN105296421A - 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用，包括如下步骤：S1、取外周血进行离心，分离细胞和血浆，然后灭活血浆中的补体，收集细胞和血浆，备用；S2、将获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，洗涤，备用；S3、将获得的单个核细胞加入无血清培养液中，加入双特异性抗体、靶细胞、细胞因子和血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养的细胞，采用生理盐水离心洗涤，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞；所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，双特异性抗体与T细胞表面抗原的解离系数大于1×10-7，与靶细胞表面抗原的解离系数小于1×10-9；双特异性抗体分子量为小于50KD；通过上述方法制备得到双特异性抗体活化的T细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、CD3AK细胞、TIL细胞、CTL细胞、NK细胞和CIK细胞的免疫治疗。过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及细胞因子和分子靶向治疗广泛联合，成为肿瘤综合治理的一个组成部分，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。
其中，T-细胞(即T淋巴细胞)输入(transfusion)，称为过继T-细胞疗法,已经过测试用于癌症和慢性感染的治疗。过继T-细胞疗法具有增强抗肿瘤免疫,提高疫苗效力以及限制移植物抗宿主疾病的潜力。过继T-细胞疗法用作细胞源，尤其是,细胞毒性T-细胞(CTLs),或肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。在现有技术中常采用双特异性抗体“武装(arm)”(活化的)T-细胞以形成它们和肿瘤细胞表面抗原之间的桥梁，以增强T-细胞的杀瘤效应。双特异性抗体(bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，使功能分子(细胞)集中在靶细胞周围，进而对靶细胞进行杀伤，产生靶向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点之一，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。
如中国专利文献CN104630146A中公开的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)获取外周血单个核细胞；(2)将获取的外周血单个核细胞与基因修饰肿瘤细胞混合；(3)将获取的混合细胞重悬于含有能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子的培养基中。通过上述所制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞，主要在预防或治疗癌症的药物中的应用，其优点在于制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞具有数量多、特异性高和杀伤能力强等特性，此外，该制备方法还具有工艺简单而且成本较目前特异性T细胞制备成本显著降低。然而，上述方案中通过双特异性抗体的连接，使肿瘤细胞对T细胞进行抗原递呈，然后激活T细胞，再杀伤靶细胞，使得制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞具有特异性高的特点，由于其具有高特异性，则产生特异性杀伤效果，肿瘤细胞特异性多克隆T细胞仅能杀伤靶细胞，而对于非靶细胞则没有杀伤作用。
鉴于现有技术中还未提出一种方法制备具有扩增能力强、细胞活性强、细胞毒性强和细胞数量多的具有非特异性杀伤效果的T细胞。为此，本发明提供了一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供了一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。
为此，本发明提供了一种双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、取外周全血进行离心，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，然后洗涤，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养液中加入双特异性抗体、靶细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤S1中收集的血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得；
其中，所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含至少一个靶向T细胞抗原表位的结合位点和至少一个靶向靶细胞表面抗原表位的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。
所述T细胞抗原为CD3和/或CD28。
所述靶细胞抗原为CD19、CD20和/或肿瘤、微生物的特异性抗原靶点。
优选的，所述T细胞抗原为CD3，所述靶细胞抗原为CD19。
所述靶细胞为灭活的B细胞、癌细胞或病原体细胞。
所述的方法，所述靶细胞为灭活的B细胞。
所述的方法，所述步骤S3中，所述单个核细胞的终浓度为(0.5-2)×106/ml，加入的所述双特异性抗体的终浓度为0.1ng/ml-1000ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为(0.001-50)×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为0.1％-10％。
所述的方法，所述步骤S3中，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为50-2000U/ml，所述IFN-γ的终浓度为50-3000U/ml。
所述的方法，所述步骤S3中，所述孵育培养的步骤，培养条件为36-38℃，3-6％CO2的二氧化碳培养箱中培养5-28天。
所述的方法，所述步骤S3中，所述孵育培养的步骤中还包括补充培养液的步骤，所述培养液包括所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的灭活血浆。
所述的方法，所述步骤S3中，所述孵育培养的步骤中还包括补充靶细胞的步骤，每间隔4-10天适量补充靶细胞一次。
所述的方法，所述步骤S1中，将分离的所述血浆置于56-61℃下水浴3-30分钟灭活补体，优选的，于56℃水浴30分钟，于60℃水浴5分钟或于61℃水浴3分钟。
本发明提供了一种由上述的方法制备得到的双特异性抗体活化的T细胞。
本发明还提供了一种所述的双特异性抗体活化的T细胞或其联合双特异性抗体在制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物中的用途。
在所述的用途中，所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包括如下步骤：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。
在所述的用途中，所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同抗原靶点的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包括如下步骤：取所述的双特异性抗体活化的T细胞进行洗涤，然后向其中加入适量的与T细胞抗原具有高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育培养，然后洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。
本发明技术方案相比现有技术，具有如下优点：
1、本发明所述的双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，包括如下步骤：S1、取外周血进行离心，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，备用；S2、将所述步骤S1中获得的细胞稀释成细胞悬液，分离出单个核细胞，收集单个核细胞洗涤，备用；S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养液中加入双特异性抗体、靶细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤S1中收集的血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，细胞数量能满足治疗的数量后，并且经流式细胞仪检测获得的细胞中不含有靶细胞时，离心收集细胞，生理盐水离心洗涤，洗掉双特异性抗体，所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得；其中，所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含至少一个结合T细胞抗原表位的结合位点和至少一个结合靶细胞表面抗原表位的位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于1×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD；通过在获取的单个核细胞中加入双特异性抗体，由于该双特异性抗体分子量小于50KD，属于小分子双特异性抗体，使得其在将效应T细胞与靶细胞连接在一起时立即分泌杀伤性因子杀灭靶细胞，直接引起效应T细胞对靶细胞的杀伤，无需通过抗原递呈作用产生特异性T细胞对靶细胞进行杀伤，同时还具备活化T细胞的功能，在杀灭靶细胞的过程中，杀伤性T细胞的活性、增殖能力和杀伤活性都大幅提高，又由于双特异性抗体与T细胞抗原低亲和力，对靶细胞是高亲和力，这种设计在保证了双特异性抗体对T细胞活化作用的同时，还可以被轻易地洗掉，使得双特异性抗体可以从T细胞上脱落，使得T细胞特异性杀伤效果丧失，成为非特异性的杀伤细胞，起着杀灭MHC分子低表达的肿瘤细胞，并长期对肿瘤产生细胞免疫监视作用，防止肿瘤再次复发，在根除肿瘤方面效果显著；
在使用所述双特异性抗体活化的T细胞时，加入不同类型的对T细胞和靶细胞高亲和力的双特异性抗体，则所述双特异性抗体活化的T细胞产生特异性杀伤效果，效果类似于CAR-T的作用；若不加入双特异性抗体，所述双特异性抗体活化的T细胞则产生非特异性杀伤效果，类似于高活性NK或CIK的作用。由于结合在T细胞表面的双特异性抗体可以被降解和脱落，双特异性抗体从T细胞表面消失，此时的T细胞丧失了特异性的杀伤能力，成为非特异性T细胞，实现了将所述双特异性抗体活化的T细胞的非特异性——特异性——非特异性杀伤的相互之间的转变，既可以顾及特异性靶点的杀伤，也可以产生非特异性杀伤作用，兼顾到肿瘤的不同特性；
所述双特异性抗体活化的T细胞结合高亲和力的双特异性抗体后，其杀伤活性较CAR-T弱，但安全性远高于CAR-T，其操作简单，各个技术环节可控，细胞质量可靠，临床毒副作用可控、并且远低于CAR-T。以治疗B细胞恶性疾病为例，由于特异性杀伤和非特异性杀伤之间的转换，大部分病人可以避免B细胞缺乏，能有效的减少溶瘤综合症、细胞因子风暴和巨噬细胞活化综合症的发生率和这些副作用的严重程度。病人一般不会有远期的不良反应，如永久性B细胞缺乏症等；
2、本发明所述的双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，所述T细胞抗原为CD3，所述靶细胞抗原为CD19，靶向所述T细胞抗原表位CD3和靶向靶细胞表面抗原CD19的双特异性抗体满足分子量小于50KD，同时满足与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于1×10-9，属于小分子双特异性抗体，保证其在将效应T细胞与靶细胞连接在一起时立即分泌杀伤性因子杀灭靶细胞，直接引起效应T细胞对靶细胞的杀伤，同时还具备活化T细胞的功能，杀伤性T细胞的活性、增殖能力和杀伤活性都大幅提高，又由于所述双特异性抗体与T细胞抗原低亲和力，对靶细胞是高亲和力，这种设计使得所述双特异性抗体可以从T细胞上脱落，使得T细胞特异性杀伤效果丧失，成为非特异性的杀伤细胞；
3、本发明所述的双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，所述靶细胞为灭活的B细胞，临床安全的基本保障，临床安全风险较小；
4、本发明所述方法制备的双特异性抗体活化的T细胞可单独应用，也可与双特性抗体一起使用制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物中的应用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的无血清培养液的生产厂家为Gibco公司生产的AIM-V培养液。
所使用的流式细胞仪生产厂家为BD公司。
所述靶细胞为灭活的RomasB细胞淋巴瘤细胞系由中国医学科学院提供。
所述的生理盐水为药用生理盐水，质量浓度为0.9％。
所述双特异性抗体购自上海近岸医疗科技有限公司，批号:0030129。
实施例1
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血20ml，在离心机于1800rpm下离心20分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于56℃下水浴30分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用20ml生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2700rpm下分离10分钟，然后吸取界面的细胞层，用生理盐水洗涤1次，获得单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入15ml适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为0.4×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为1100ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为0.0008×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为11％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为45U/ml，所述IFN-γ的终浓度为3100U/ml，在34℃，6.5％CO2的二氧化碳培养箱中培养30天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述IL-2终浓度为45U/ml，所述IFN-γ的终浓度为3100U/ml，所述血浆的终浓度为11％，每间隔1天补充10-100ml所述无血清培养液，每间隔3天补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为0.0008×106/ml，然后收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤6次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，具体步骤如下：取少量的上述制备的T细胞，加入等量的相应的靶细胞，混匀，低速离心5分钟，弃上清，将沉淀细胞混匀，显微镜下观察是否有细胞凝集现象，有细胞凝集为阳性，无细胞凝集为阴性，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性：细菌培养阴性、霉菌培养阴性、支原体培养阴性、内毒素检查阴性，细胞表型为CD3+86％，CD8+65％，CD56+21％，CD9+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3和靶细胞抗原高亲和力的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤1次，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例2
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血30ml，在离心机于2200rpm下离心5分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于61℃下水浴3分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2300rpm下离心分离30分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤6次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为2.2×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为0.08ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为50.5×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为0.08％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为2050U/ml，所述IFN-γ的终浓度为45U/ml，在38℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4天，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤1次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD28的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD20的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+31％，CD8+27％，CD56+1％，CD19+63％。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3和靶细胞特异性抗原高亲和力的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例3
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血30ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出血浆于56℃下水浴35分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤1次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为2×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为0.1ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为50×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为0.1％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为2000U/ml，所述IFN-γ的终浓度为50U/ml，在38℃，3％CO2的二氧化碳培养箱中培养28天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述IL-2终浓度为2000U/ml，所述IFN-γ的终浓度为50U/ml，所述血浆的终浓度为0.1％，每间隔4天补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为50×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤5次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD20的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测同实施例1，细胞表型为CD3+93％，CD8+87％，CD56+27％，CD19+2％。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3和靶细胞特异性抗原高亲和力的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤一次，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例4
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血30ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于61℃下水浴3分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤5次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为0.5×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为1000ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为0.001×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为10％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为50U/ml，所述IFN-γ的终浓度为3000U/ml，在36℃，6％CO2的二氧化碳培养箱中培养5天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述IL-2终浓度为50U/ml，所述IFN-γ的终浓度为3000U/ml，所述血浆的终浓度为10％，每间隔1天补充5-30ml所述无血清培养液，每间隔3天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为0.001×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤1次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+86％，CD8+77％，CD56+12％，CD19+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD8高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例5
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血50ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于56℃下水浴30分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤3次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为2×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为50ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为2×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为2％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为200U/ml，所述IFN-γ的终浓度为500U/ml，在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养16天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为2％，所述IL-2终浓度为200U/ml，所述IFN-γ的终浓度为500U/ml，每间隔1-3天补充5-200ml所述无血清培养液，每间隔6天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为2×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤3次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+98％，CD8+87％，CD56+63％，CD19+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例6
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血35ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于56℃下水浴30分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤2次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为1×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为100ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为1×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为1％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为150U/ml，所述IFN-γ的终浓度为2850U/ml，在36℃，4％CO2的二氧化碳培养箱中培养10天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为1％，所述IL-2终浓度为150U/ml，所述IFN-γ的终浓度为2850U/ml，每间隔1天补充7-100ml所述无血清培养液，每间隔5天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为1×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤4次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD13的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的粒细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+96％，CD8+86％，CD56+35％，CD19+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD28高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
实施例7
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血25ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于60℃下水浴5分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤3次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为1.5×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为800ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为10×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为7％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为1500U/ml，所述IFN-γ的终浓度为250U/ml，在38℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养24天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为7％，所述IL-2终浓度为1500U/ml，所述IFN-γ的终浓度为250U/ml，每间隔5天补充7-200ml所述无血清培养液，每间隔6天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为10×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤3次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+98％，CD8+85％，CD56+46％，CD19+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3高亲和力和HBsAg的特定靶标的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。用于清除乙型肝炎的治疗。
实施例8
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血30ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于61℃下水浴3分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤3次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为1.8×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为350ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为35×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为4％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为350U/ml，所述IFN-γ的终浓度为250U/ml，在36℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养25天，在此期间，适量补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为4％，所述IL-2终浓度为350U/ml，所述IFN-γ的终浓度为250U/ml，每间隔4天补充5-20ml所述无血清培养液，每间隔5天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为35×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤3次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+98％，CD8+86％，CD56+67％，CD19+0。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3和CD13高亲和力的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。用于治疗粒细胞白血病
实施例9
本实施例所述的制备双特异性抗体活化的T细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血30ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于56℃下水浴30分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤3次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为1×106/ml，加入所述双特异性抗体的终浓度为550ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为26×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为5％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为300U/ml，所述IFN-γ的终浓度为300U/ml，在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养15天，在此期间，适量补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为5％，所述IL-2终浓度为300U/ml，所述IFN-γ的终浓度为300U/ml，每间隔1天补充8-150ml所述无血清培养液，每间隔5天适量补充靶细胞一次，所述靶细胞的终浓度为26×106/ml，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤3次，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得。
所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含一个靶向T细胞抗原表位CD3的结合位点和一个靶向靶细胞表面抗原表位CD19的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。所述靶细胞为灭活的B细胞。
上述方法中制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞部分进行冷冻保存，部分进行回输：待冷冻保存的细胞直接加入适量的细胞冷冻保存液，分装于多支冻存管中，-80℃冰箱或液氮罐中保存，备用。细胞冷冻保存和复苏的方法，参考各种临床使用细胞的操作流程；
回输部分细胞或冷冻保存复苏的细胞，用生理盐水离心洗涤3-4次，用靶细胞与所述的双特异性抗体活化的T细胞进行细胞凝集反应检测双特异性抗体是否洗涤干净，当凝集反应为阴性时，表示制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。检测结果显示本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞中不含有双特异性抗体。
所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性检测和细胞表型参考CIK相应的内容和方法，检测结果表示，本实施例制备的所述的双特异性抗体活化的T细胞安全性同实施例1，细胞表型为CD3+97％，CD8+85％，CD56+38％，CD19+2％。
本实施例提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
本实施例还提供了所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同类型的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，具体如下：采用生理盐水洗涤所述的双特异性抗体活化的T细胞，然后向其中加入适量的具有CD3高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育5分钟以上，然后再用生理盐水洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入适量的白蛋白和IL-2等添加剂，制成细胞悬液，即得。
效果例
以实施例5制备的双特异性抗体活化的T细胞为检测对象，以用经典的培养方法制备的CIK细胞做对照。制备对照组CIK细胞的方法，具体包括如下步骤：
S1、采集外周血50ml，在离心机于2000rpm下离心10分钟将细胞和血浆分离，取出所述血浆于56℃下水浴30分钟灭活补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞用生理盐水稀释成细胞悬液，备用，然后取50ml离心管2支，每只试管加入15-20ml淋巴细胞分层液(比重1.077-1.078；奥地利PAA公司生产)，将上述细胞悬液缓慢地加到所述淋巴细胞分层液上面，并保证两种液体之间的界面清晰，然后在2500rpm下离心分离20分钟，然后吸取界面的细胞层，采用生理盐水洗涤3次，获得的单个核细胞，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入适合淋巴细胞生长的无血清培养液中，调整所述细胞终浓度为2×106/ml，加入CD3单克隆抗体的终浓度为20ng/ml，加入的所述血浆的终浓度为2％，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为200U/ml，所述IFN-γ的终浓度为500U/ml，在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养16天，在此期间，补充所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的血浆，维持所述血浆的终浓度为2％，所述IL-2终浓度为200U/ml，所述IFN-γ的终浓度为500U/ml，每间隔1-3天补充5-200ml所述无血清培养液，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤3次，获得所述的CIK细胞，即得。
一、上述的双特异性抗体活化的T细胞和CIK对照的效应T细胞的增殖能力的检测方法，包括如下步骤：
(1)将上述细胞分别培养72h，即可见细胞沉于培养瓶的底部，呈较为密集的集落状态，培养96h后集落变大。对培养12-14天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养12-14天的细胞100μl，加入100μl的0.4％台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。结果显示，本发明制备的细胞活力大于98％。
(2)在第0、3、6、9、12、15、18、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数。选用抗CD3-FITC和CD19-PE对细胞进行标记，然后进行流式细胞仪检测，最后分析CD3阳性等阳性细胞的比例，并结合细胞计数算出所占比例，结果如表1所示，结果说明本发明制备的T细胞是安全无毒的，同时也是高效扩增的T细胞。
二、上述的双特异性抗体活化的T细胞和CIK对照的免疫表型检测方法，包括如下步骤：
取第14天的细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，调整细胞密度为1×106/ml，每个检测管内分别加入100μl细胞悬液，实验管分为2管，其中一管加入荧光标记抗体为抗CD3-PECY5.5、CD4-FITC、和CD19-PE，另一管加入抗CD3-PECY5.5、CD8-FITC和CD56-PE，室温避光孵育30min，用PBS缓冲液洗涤3次后，再用200μlPBS缓冲液重悬细胞，最后用流式细胞仪进行检测并分析，结果如表1所示，说明本发明制备的T细胞是以CD3阳性CTL为主要细胞的异质性细胞群体。
表1所述的双特异性抗体活化的T细胞和阳性对照的表型和增殖
三、上述的双特异性抗体活化的T细胞和阳性对照对肿瘤细胞杀伤能力检测方法，包括如下步骤：
(1)取所述双特异性抗体活化的T细胞(BAAT)和CIK对照，检测对K562肿瘤细胞的杀伤活性。
(2)调整K562(所述K562由中国医学科学院提供)的细胞密度为1×106/ml，每孔500μl，24孔板，按效靶比(BAAT(或CIK对照)：靶细胞)1:10、1：3、1：1、3：1、10：1、30：1、100：1的比例与BAAT(或CIK对照)细胞混合，同时设置单独靶细胞(肿瘤细胞)对照、单独BAAT细胞(效应细胞)对照、单独CIK对照和单独培养基做空白对照。
(3)置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养4小时后，收集细胞，离心，弃上清，重新悬浮细胞，每孔加入50μl的PI溶液(所述PI溶液美国CIGMA公司生产)(50ug/ml)，再孵育15分钟，然后用流式细胞检测靶细胞的荧光细胞数量，计算出比例，即为杀伤细胞比例
表2双特异性抗体活化的T细胞和CIK对照对肿瘤细胞(K562)的杀伤效率
| 样本效靶比 | 1：10 | 1：3 | 1：1 | 3：1 | 10：1 | 30：1 | 100：1 |
| 实施例5 | 25％ | 67％ | 85％ | 96％ | 99％ | 100％ | 100％ |
| CIK对照 | 2％ | 4％ | 9％ | 15％ | 21％ | 36％ | 56％ |
由上述表1-2的结果可知，实施例5制备的杀伤性T细胞的活性、增殖能力和杀伤活性都显著，并且为非特异性的杀伤细胞，起着杀灭MHC分子低表达的肿瘤细胞，并长期对肿瘤产生细胞免疫监视作用，防止肿瘤再次复发，有希望根除肿瘤。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取外周全血进行离心，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，收集所述细胞和血浆，备用；
S2、将所述步骤S1中获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，然后洗涤，备用；
S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养液中加入双特异性抗体、靶细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤S1中收集的血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤，即得所述的双特异性抗体活化的T细胞；
其中，所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含至少一个靶向T细胞抗原表位的结合位点和至少一个靶向靶细胞表面抗原表位的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10-7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于5×10-9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞抗原为CD3和/或CD28；所述靶细胞抗原为CD19、CD20和/或肿瘤、微生物的特异性抗原靶点。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶细胞为灭活的B细胞、癌细胞或病原体细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述单个核细胞的终浓度为(0.5-2)×106/ml，加入的所述双特异性抗体的终浓度为0.1ng/ml-1000ng/ml，加入的所述靶细胞的终浓度为(0.001-50)×106/ml，加入的所述血浆的终浓度为0.1％-10％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN-γ，所述IL-2终浓度为50-2000U/ml，所述IFN-γ的终浓度为50-3000U/ml。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述孵育培养的步骤中还包括补充培养液的步骤，所述培养液包括所述IL-2、所述IFN-γ和所述步骤S1中收集的灭活血浆。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的双特异性抗体活化的T细胞。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体活化的T细胞或其联合双特异性抗体在制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包括如下步骤：将所述的双特异性抗体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同抗原靶点的双特异性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包括如下步骤：取所述的双特异性抗体活化的T细胞进行洗涤，然后向其中加入与T细胞抗原具有高亲和力的特定靶标的双特异性抗体，孵育培养，然后洗涤，收集细胞，加入生理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。
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