CN109456411A - 一种靶向nyeso1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向nyeso1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和应用。所述抗体通过下述方法制备得到：(1)选购Anit‑CD3+，Anti‑NYESO1单克隆抗体；(2)取人源CD3单克隆抗体，溶于交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；(3)取人源NYESO1单克隆抗体，溶于交联剂Sulfo‑SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；(4)将人源CD3单链抗体和人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose‑G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；(5)将纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；(6)采用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定得到的双抗体复合物分子量，Sephrose‑G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。

Description

一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药、细胞生物学、肿瘤临床医学等技术领域，具体涉及一种靶向NYESO1 阳性恶性肿瘤双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗因其副作用小、特异性强等特点，被公认为是治疗恶性肿瘤的有效途径之 一，特别是针对恶性肿瘤的特异性T细胞治疗研究更是学术界关注的焦点，目前关于靶向T 细胞治疗恶性肿瘤的众多基础及临床研究正在开展，显示特异性CTL细胞具有深远而广阔的 应用前景。
NY-ESO-1抗原是肿瘤-睾丸抗原(CTA)家族中的重要成员，除睾丸组织和胎盘组织外， 在正常组织中几乎不表达。NY-ESO-1在多种组织类型肿瘤中呈不同程度的表达，表达频率最 高的是神经母细胞瘤(82％)、滑膜肉瘤(80％)、黑素瘤(46％)和卵巢上皮癌(43％)。 NY-ESO-1155-163是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原之一，可以在NY-ESO-1表达阳性的肿瘤 患者体内引起自发性体液免疫反应和特异性T细胞免疫反应。因此，NY-ESO-1155-163抗原理论 上可作为肿瘤特异性免疫治疗的靶标。
发明内容
本发明针对背景技术中的问题，提供一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体及其制 备方法和应用。
本发明为解决上述问题而采取的技术方案为：
一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃ 下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25 凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系 为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris， 100mMNaCl,pH7.3。
一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃ 下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25 凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系 为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris， 100mMNaCl,pH7.3。
本发明靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体用于治疗恶性肿瘤。
本发明用于治疗恶性肿瘤之前对非特异性T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下 步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离 1900-2300rpm/min,离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml T细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无 菌细胞培养瓶中_Tc1；
(3)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，800-1200U/ml白介素2(IL-2)，培养3-5天；
(4)上述细胞隔天添加新鲜T细胞养基联合培养5-9天；
(5)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
为进一步表明本发明对恶性肿瘤的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复 合物诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)并对高表达NYESO1恶性肿瘤细胞株体外杀伤，验证的 具体步骤如下：
(1)收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复 合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向NYESO1的CTL；
(2)荧光定量PCR鉴定恶性肿瘤细胞株：A375、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中NYESO1抗原基因表达水平，作Westren blot鉴定，以恶性 肿瘤细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，显微镜观察T细胞 靶向NYESO1恶性肿瘤细胞能力；
(3)结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞，对NYESO1高表达的恶性肿瘤细 胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-NYESO1”双 抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现 如图(1-8)，说明T细胞可以自发寻找NYESO1+肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯 度观察结果显示，T细胞具有较强的细胞因子分泌能力及肿瘤细胞杀伤能力，实验结果显示 18小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。
本发明采用上述技术方案，利用双抗体偶联技术，选择Anti-CD3+单抗及恶性肿瘤高表 达抗原NYESO1的单克隆抗体Anti-NYESO1单抗，利用SMCC定向偶联技术，构建“Anti-CD3+ ×Anti-NYESO1双特异性抗体”，并用以诱导特异性T淋巴细胞毒性效应，对高表达NYESO1 恶性肿瘤细胞株进行体杀伤检测，以验证该技术不仅能高靶向性杀灭肿瘤细胞，对肿瘤的发 展、转移也能起到抑制性作用，利用抗原—抗体特异性吸附引发的ADCC效应诱导特异性CTL， 具有极强的靶向性及抗原特异性，可在抗原—抗体分子水平做到“精准治疗”。同时该技术 的建立，可针对不同肿瘤表达的特异性抗原偶联合成“双特异性抗体复合物”，为广大肿瘤患 者治疗带来新的希望。
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用SMCC化学偶联法制备Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体复合物， 抗体偶联产率高，技术可行性较强，不需要复杂的基因工程技术，该技术所选抗体均为已商 业化单抗药物或试剂，保证了本双抗体复合物的安全性及有效性；
(2)本发明可诱导高效的T淋巴细胞毒性效应，同时通过抗原-抗体反应使T细胞具备 强效的肿瘤靶向性，可对抗原特异表达肿瘤进行高效的杀灭，并且该技术实施过程中抗体使 用量少，具备很好的市场推广前景；
(3)本发明通过双抗体偶联技术与过继免疫细胞治疗紧密结合，通过T细胞体外扩增技 术大量培养CD3+T细胞，再进行双抗体靶向诱导，可将T细胞快速吸附在肿瘤细胞上，为肿 瘤的“精准治疗”探索一条安全、可行、简便、高效的治疗方法及模式；
(4)本发明根据患者肿瘤细胞表达抗原不同选择不同的单克隆抗体，制备不同的双抗体 复合物，同时该双抗体复合物可以单独使用，可为一种新药的研发提供前期基础研究。
附图说明
图1是本发明T细胞扩增曲线
图2是本发明T细胞因子分泌能力分析，结果显示IFN-γ，IL-2分泌水平显著提升。
图3是本发明贴壁培养的NYESO1+恶性肿瘤细胞；
图4是本发明未加双特异性抗体的T细胞与NYESO1+恶性肿瘤细胞混合。未见明显杀伤 及T细胞的浓度趋向性；
图5是本发明添加双特异性抗体组结果显示，T细胞具有较强的靶细胞趋向性；
图6是本发明添加NYESO1+双特异性抗体后结果显示,T细胞发挥较强的肿瘤细胞杀伤功 能；
图7是本发明12小时内靶细胞杀伤率对比图，结果显示添加NYESO1双特异性抗体组12 小时杀伤率可达90％以上；
图8是本发明对不同种类肿瘤细胞8小时杀伤率比较(效靶比30:1)，结果显示经本发 明双特异性抗体装载的T细胞对NYESO1+肿瘤细胞具有较较强的杀伤能力。
具体实施方式
实施例1
一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋 中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的 组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25 凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
实施例2
一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋 中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的 组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25 凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
实施例3
一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体用于治疗恶性肿瘤，在治疗恶性肿瘤之前首 选对非特异性DC-T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300/min, 离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml淋巴细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个 无菌细胞培养瓶中Tc1，贴壁细胞用于培养DC细胞Dc1；
(3)上述Dc1细胞培养过程中加入0.5-1.2mM维生素C，与Dc1混合培养3-5天；
(4)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，700-1500U/ml白介素二(IL-2)，培养3-5天；
(5)将(1-3)与(1-4)细胞混合培养，利用(1-3)培养的Dc1细胞增强Tc1细胞， 联合培养5-9天；
(6)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
为进一步表明本发明对恶性肿瘤的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复 合物诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)并对高表达NYESO1恶性肿瘤细胞株体外杀伤，验证的 具体步骤如下：
(1)收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复 合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向NYESO1的CTL；
(2)荧光定量PCR鉴定恶性肿瘤细胞株：A375、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中NYESO1抗原基因表达水平，作Westren blot鉴定，以恶性 肿瘤细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，荧光显微镜观察T 细胞靶向NYESO1恶性肿瘤细胞能力；(3)结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞， 对NYESO1高表达的恶性肿瘤细胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-NYESO1”双抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现如图(1-8)，图1为T细胞培养增长曲线(*108)，结果显示14 天时T细胞生长处于对数生长期；图2为流式细胞仪分析T细胞分泌细胞因子能力，结果显 示IFN-γ，IL-2分泌水平显著提升；图3为显微镜下观察NYESO1+肿瘤细胞(A375)贴壁生 长(*200倍)；图4为未经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体处理的T细胞，对NYESO1+ 肿瘤细胞杀伤能力有限利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围；图5为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1 双特异性抗体装载的T细胞具有良好的靶向性，利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围，效靶比30:1(倒置显微镜下x50倍观察结果)；图6为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体装载的T细胞具有良好的靶向性，利用ADCC效应聚集在肿瘤细胞周围，效靶比30:1，(倒置显微镜下x20倍观察结果)；图7为经Anti-CD3+*Anti-NYESO1双特异性抗体装载的T细胞具有良好的杀伤效果，12小时NYESO1+肿瘤细胞杀伤率可达90％以上；图8为双特异性抗体装载的T细胞对不同肿瘤细胞8小时杀伤率(效靶比＝30:1)，结果显示对NYESO1+肿瘤细胞A375具有很好的杀伤效果，8小时杀伤率可达60％以上，远高于NYESO1-肿瘤细胞。图1-8说明T细胞可以自发寻找肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯度观察结果显示实验结果显示12 小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。

Claims (10)

1.一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
3.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。
4.根据权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
5.权利要求1所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-NYESO1单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源NYESO1单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源NYESO1单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源NYESO1单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
6.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
7.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。
8.根据权利要求5所述一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
9.权利要求1所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗恶性肿瘤。
10.根据权利要求9所述的一种靶向NYESO1阳性恶性肿瘤双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗恶性肿瘤之前对非特异性T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300rpm/min,离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml T细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中_Tc1；
(3)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，800-1200U/ml白介素2(IL-2)，培养3-5天；
(4)上述细胞隔天添加新鲜T细胞养基联合培养5-9天；
(5)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
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