CN112794916A

CN112794916A - 三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用

Info

Publication number: CN112794916A
Application number: CN202110375757.9A
Authority: CN
Inventors: 张兵; 赵伟; 陆亚敏; 杜敏; 李裕鑫; 汪鑫; 席俊晓; 宋馨; 张喜全
Original assignee: Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd; Nanjing Shunxin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd; Nanjing Shunxin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2041-04-08
Also published as: CN112794916B

Abstract

本发明涉及三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用。具体地公开了三特异性抗原结合构建体、编码它们的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的细胞、包含它们的药物组合物，还提供了其用途。其中，抗原结合构建体靶向第一肿瘤相关抗原、第二肿瘤相关抗原和CD3。

Description

三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及抗原结合构建体，具体的涉及靶向肿瘤相关抗原和CD3的三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用。

背景技术

CD19抗原，也称为CD19分子或分化簇19，为95 kd跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CD19为I型跨膜蛋白，具有单个跨膜结构域、一个胞质C末端和细胞外N末端。CD19广泛分布于B淋巴细胞表面，其从祖B细胞开始表达，持续整个B细胞成熟期，直至分化为浆细胞时消失，与B细胞活化和发育紧密相关。CD19还在癌性B细胞以及滤泡树突状细胞上表达。

CD20是MS4A家族成员，CD20表达在祖B细胞发育阶段开始，并一直存在，直到最终分化为浆细胞。CD20可直接借助于调节跨膜钙离子流在B细胞上起作用，还可以在B细胞增殖和分化中起重要调节作用。

CD19和CD20是治疗B淋巴细胞系肿瘤的靶点。目前已经开发多种抗体用于治疗或潜在的治疗B细胞恶性肿瘤，如靶向CD19的单抗tafasitamab（MOR208），靶向CD20的单抗利妥昔（Rituxan）、奥法木（ofatumumab）等。

天然抗体具有2个相同的Fab臂识别同一抗原表位，单特异性靶向不针对在信号传导和发病机制中可能有关的其它靶表位，允许药物抗性和逃避机制。而当前的一些治疗范例需要使用多靶向的抗体，例如靶向不同靶点或靶向同一靶抗原的多个不同表位的多特异性抗体。由于多特异性抗体如双特异性抗体、三特异性抗体等可以识别至少两个不同靶点或至少两个不同表位结合位点，因此可应用于肿瘤细胞靶向的T细胞或NK细胞招募与激活、信号传导途径的双抑制等。

已上市产品安进公司Blincyto®同时靶向CD19和CD3，桥接CD19阳性B细胞与CD3阳性T细胞，同时激活T细胞杀伤CD19阳性B细胞。REGN1979则是一款靶向CD3 和CD20的双特异性抗体，由再生元（Regeneron）公司开发。

然而目前所提供的治疗抗体是有限的，更多可用的选择仍然是需要的。

发明内容

本发明提供了靶向不同肿瘤相关抗原（如CD19和CD20）以及CD3的三特异性抗原结合构建体。本发明还提供了能够编码所提供的三特异性抗原结合构建体的相关核酸、载体、细胞、组合物、构建方法及用途。

一方面，本发明提供了三特异性抗原结合构建体，其包含：

特异性的结合第一肿瘤相关抗原的第一抗原结合多肽构建体；

特异性的结合第二肿瘤相关抗原的第二抗原结合多肽构建体；

特异性地结合CD3的第三抗原结合多肽构建体，所述第三抗原结合多肽构建体与第一抗原结合多肽构建体融合；

与第三抗原结合多肽构建体融合的第一免疫球蛋白功能域多肽，以及，与第二抗原结合多肽构建体融合的第二免疫球蛋白功能域多肽，所述的第一免疫球蛋白功能域多肽和第二免疫球蛋白功能域多肽能够形成二聚结构的骨架；

其中所述的第一抗原结合多肽构建体为scFv，所述的第二抗原结合多肽构建体为Fab，所述的第三抗原结合多肽构建体为scFv。

一些实施方案中，所述的第一肿瘤相关抗原和第二肿瘤相关抗原各自独立的选自CD19、CD20、CD22、CD123、BCMA、CD33、CLL1、 CD138、CS1、CD38、CD133、FLT3、CD52、TNFRSF13C、TNFRSF13B、CXCR4、PD-L1、LY9、CD200、FCGR2B、CD21、CD23、CD24、CD40L、CD72、CD79a或CD79b。

优选的，所述的第一肿瘤相关抗原和第二肿瘤相关抗原各自独立的选自CD19或CD20，且第一肿瘤相关抗原与第二肿瘤相关抗原不同。

在一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的三特异性抗原结合构建体和药学上可接受的载体。

在一方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码本文所述的三特异性抗原结合构建体。

在一方面，本发明提供了载体，其包含本文所述的核酸。

在一方面，本发明提供了分离的细胞，其包含根据本文所述的核酸，或根据本文所述的载体。

在一方面，本发明提供了试剂盒，其包含本文所述的三特异性抗原结合构建体。

在一方面，本发明提供了制备本文所述的三特异性抗原结合构建体的方法，其包括在适于表达所述三特异性抗原结合构建体的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码本文所述的三特异性抗原结合构建体的核酸；并且纯化所述三特异性抗原结合构建体。

另一方面，本发明提供了所述的三特异性抗原结合构建体在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物的用途。

附图说明

图1示意了示例性三特异性抗原结合构建体的构型；其中第一Fc多肽和第二Fc多肽形成异二聚体结构的Fc，第一抗原结合多肽构建体和第三抗原结合多肽构建体均为scFv，第二抗原结合多肽构建体为Fab，第一抗原结合多肽构建体在其C端与第三抗原结合多肽构建体的N端融合，第三抗原结合多肽构建体在其C端与第一Fc多肽的N端融合，第二抗原结合多肽构建体在其C端与第二Fc多肽的N端融合。

图2示意了实施例1中抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的构型。

图3为抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Daudi/CD19++&CD20+++ 肿瘤细胞的裂解率。

图4为抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Nalm6/CD19++&CD20+肿瘤细胞的裂解率。

图5为抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Raji/CD19++&CD20+++肿瘤细胞的裂解率。

具体实施方式

术语。

术语“抗原结合构建体”是指能够与抗原结合的任何生物工程构建体，如多肽或多肽复合物。在一些方面，抗原结合构建体是与目标抗原特异性结合的多肽。抗原结合构建体可以是单体、二聚体、多聚体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物；抗体或其抗原结合片段；scFv等。抗原结合构建体可以是单特异性、或多特异性(如双特异性、三特异性等)的多肽构建体。在一些方面，抗原结合构建体可包括，例如，与一个或多个Fc连接的一个或多个抗原结合组分(例如，Fab或scFv)。在下面描述并且在实施例中提供了抗原结合构建体的其它实例。

术语“三特异”意指抗原结合构建体能够特异性结合三种不同的抗原决定簇。通常，三特异性抗原结合构建体包含三个或更多个抗原结合部分(例如抗原结合多肽构建体)。

术语“特异性的结合”或“特异性结合”意为结合对于抗原而言是选择性的并且可以与不需要或非特异性的相互作用区别开。抗原结合构建体与特定抗原决定簇结合的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J 17 ,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley，Endocr Res 28 ,217-229(2002))。

术语“价”指抗原结合构建体中指定数目的抗原结合部位(如抗原结合多肽构建体)的存在。因此，术语“单价结合”指存在一个(且不超过一个)对抗原特异的抗原结合部位(如抗原结合多肽构建体)。

术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指在肿瘤或癌细胞表面上表达的分子(通常是蛋白质，碳水化合物，脂质或其某种组合)，其整体或者片段(例如，MHC /肽)可用于将药理学试剂优先靶向肿瘤或癌细胞。在一些实施方案中，TAA是正常细胞和肿瘤或癌细胞二者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施方案中，TAA是与正常细胞相比在肿瘤或癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，相对于正常细胞过度表达1倍，过度表达2倍，过度表达3倍或更多。在一些实施方案中，TAA是在肿瘤或癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如，与在正常细胞上表达的分子相比，包含缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，TAA的整体或片段(例如，MHC/肽)仅在肿瘤或癌细胞的细胞表面上表达，而不在正常细胞的表面上合成或表达。因此，术语“TAA”涵盖对肿瘤或癌细胞具有特异性的细胞抗原，在本领域中有时称为肿瘤特异性抗原(“TSA”)。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，涵盖包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)以及抗体片段的多种天然的或人工构建的抗体结构，只要它们显示希望的抗原结合活性。

术语“免疫球蛋白”指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。从N端至C端，每条重链具有重链可变区(VH)，随后是铰链区(HR)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。在IgE类免疫球蛋白的情况下，重链还具有CH4结构域。因此，免疫球蛋白重链是在N端至C端方向上由以下结构域组成的多肽：VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有轻链可变区(VL)，随后是恒定轻链结构域，也称为轻链恒定区(CL)。因此，免疫球蛋白轻链是在N端至C端方向上由以下结构域组成的多肽：VL-CL。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab和Fc结构域组成。

“融合”意指成分(例如Fab、ScFv和Fc多肽等)直接或经一个或多个肽接头通过肽键连接。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个可变区包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。

术语“CDR”(互补决定区)，也称为“高变区”，是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环的抗体可变区的每个区域。天然四链抗体通常包含六个 CDR，三个在重链可变区中(重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3)，三个在轻链可变区中(轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3)。

术语“Fab”是指由免疫球蛋白的重链VH和CH1结构域及轻链VL和CL结构域组成，“Fab重链”指重链VH和CH1结构域所在的多肽链，“Fab轻链”指轻链VL和CL结构域所在的多肽链。

术语“scFv”是指单链抗体（single chain antibody fragment，scFv），包括抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，scFv还包含介于VH和VL结构域之间的接头多肽，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。

术语“Fc结构域”或“Fc”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc和变体Fc。Fc的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。除非另有说明，Fc或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，描述于Kabat，E.A等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991) ,NIHPublication 91-3242。本文所用的Fc的“Fc多肽”指形成二聚体Fc的两条多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区、能够稳定地自我结合的多肽。例如，IgG Fc的Fc多肽包含IgGCH2和IgG CH3恒定区。

Fc结构域包含CH3和CH2结构域，CH3结构域包含两个CH3序列，分别来自于二聚体Fc的两个Fc多肽中的每一个，CH2结构域包含两个CH2序列，分别来自于二聚体Fc的两个Fc多肽中的每一个。

术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc结构域的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。

术语“EC50”是指有效浓度，抗原结合构建体的50％最大应答。术语“IC50”是指抑制浓度，抗原结合构建体的50％最大应答。EC50和IC50两者均可以通过ELISA或FACS分析或本领域已知的任何其他方法进行测量。

术语“KD”在用于本文时指解离常数，以摩尔浓度(M)表示。抗原结合构建体的KD值可以使用本领域公知的方法测定。一种测定抗原结合构建体KD的方法是使用表面等离振子共振(surface plasmon resonance)，如使用生物传感器系统，例如Biacore系统。

术语“治疗”是指为了以统计学显著的方式治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾患(例如疾病)、疾患的症状，或预防或延缓症状、并发症、生化指标的发作，或以其他方式阻滞或抑制疾病、疾患或病症的进一步发展而使用措施。

术语“治疗有效量”是指向受试者提供治疗性和/或预防性益处所必需的抗原结合构建体或组合物或其他施用物的量。

术语“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、锚、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。优选地，根据本发明的受试者是人。除非标明，术语“患者”或“受试者”可以互换使用。

倍林妥莫抗体(blinatumomab)具有CD19抗原结合结构域和CD3抗原结合结构域，是靶向CD19和CD3的双特异性抗体，一个实例是以商品名Blincyto上市的产品。奥法木单抗(ofatumumab)为靶向CD20的人源化单克隆抗体，一个实例是以商品名Arzerra上市的产品。

本文关于抗原结合多肽构建体、肿瘤相关抗原、接头多肽、铰链、多肽链等所用的术语“第一”、“第二”或“第三”是为了在存在一个以上各类型的部分时方便区分而使用。除非明确说明，这些术语的使用并非旨在赋予抗原结合构建体的具体顺序或取向。

本发明的各个方面将在下述分部中进一步详细描述。

三特异性抗原结合构建体。

本发明提供的三特异性抗原结合构建体具有结合CD19和CD20的抗原结合结构域，可以靶向肿瘤细胞表达的CD19或/和CD20，此外还可以与T细胞桥接，激活T细胞杀伤肿瘤细胞，本发明的三特异性抗原结合构建体具有优异的抗肿瘤活性，例如裂解肿瘤细胞。

意外的，在一些实验中观察到，本发明的三特异性抗原结合构建体对CD19或/和CD20表达的肿瘤细胞的杀伤效果显著优于单一靶向肿瘤相关抗原CD19或CD20的双特异性抗体，特别的，这种效果在多种CD19或CD20表达水平的肿瘤细胞（例如Daudi细胞、Nalm6细胞、Raji细胞）中均有展现。

在另一方面，三个抗原结合多肽构建体中两个采用scFv，一个采用Fab，相较于更多个（例如两个）抗原结合多肽构建体采用Fab的形式，可降低轻链和重链的错配。

本发明提供了三特异性抗原结合构建体，其包含：

其中所述的第一抗原结合多肽构建体为scFv，所述的第二抗原结合多肽构建体为Fab，所述的第三抗原结合多肽构建体为scFv；所述的第一肿瘤相关抗原和第二肿瘤相关抗原各自独立的选自CD19或CD20，且第一肿瘤相关抗原与第二肿瘤相关抗原不同。

在一些实施方案中，所述的第一肿瘤相关抗原为CD19，所述的第二肿瘤相关抗原为CD20。在另一些实施方案中，所述的第一肿瘤相关抗原为CD20，所述的第二肿瘤相关抗原为CD19。

在一些实施方案中，所述的第一抗原结合多肽构建体单价结合第一肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述的第二抗原结合多肽构建体单价结合第二肿瘤相关抗原。在另一些实施方案中，所述的第一抗原结合多肽构建体单价结合第一肿瘤相关抗原，并且所述的第二抗原结合多肽构建体单价结合第二肿瘤相关抗原；具体的实例，例如第一抗原结合多肽构建体单价结合CD19，第二抗原结合多肽构建体单价结合CD20。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第一抗原结合多肽构建体在其C端与第三抗原结合多肽构建体的N端融合。所述第一抗原结合多肽构建体为scFv，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，而VH和VL的排列顺序是任意的，例如，在一个实施方案中，所述第一抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照VL-VH的顺序排列；在另一个实施方案中，所述第一抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照VH- VL的顺序排列。所述第一抗原结合多肽构建体的VH 和VL经第一接头多肽融合。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第三抗原结合多肽构建体在其C端与第一免疫球蛋白功能域多肽的N端融合。所述第三抗原结合多肽构建体为scFv，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，而VH和VL的排列顺序是任意的，例如，在一些实施方案中，所述第三抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照VH- VL的顺序排列；在另一些实施方案中，所述第三抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照VL- VH的顺序排列。所述的第三抗原结合多肽构建体的VH和VL经第二接头多肽融合。

第一抗原结合多肽构建体与第三抗原结合多肽构建体的可变区顺序的组合也是任意的，一个具体的实例，所述第一抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照如下顺序排列：VL- VH，并且所述第三抗原结合多肽构建体的VH和VL从N端到C端按照如下顺序排列：VH- VL。所述第一抗原结合多肽构建体与第三抗原结合多肽构建体经第三接头多肽融合。

在一些实施方案中，所述第三抗原结合多肽构建体在其C端经第一铰链(H1)与第一免疫球蛋白功能域多肽的N端融合，所述第二抗原结合多肽构建体在其C端经第二铰链(H2)与第二免疫球蛋白功能域多肽的N端融合。

本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第二抗原结合多肽构建体为Fab，在一些实施方案中，其Fab重链的C端与第二免疫球蛋白功能域多肽的N端融合。在一些具体的实施方案中，第二抗原结合多肽构建体的Fab重链在其C端经第二铰链(H2)与第一免疫球蛋白功能域多肽的N端融合。

一个具体的实例，本文的三特异性抗原结合构建体具有重链1、重链2和轻链三条多肽链，三条多肽链形成分别结合第一肿瘤相关抗原、第二肿瘤相关抗原和CD3的三个抗原结合位点，从每条多肽链的N端到C端，

重链1具有结构：VL_TAA1-L1-VH_TAA1-L3-VH_CD3-L2-VL_CD3-H1-第一免疫球蛋白功能域多肽；

重链2具有结构：VH_TAA2-CH1-H2-第二免疫球蛋白功能域多肽；

轻链具有结构：VL_TAA2-CL；

其中，VH_TAA1为结合第一肿瘤相关抗原(TAA1)的重链可变区，VL_TAA1为结合第一肿瘤相关抗原(TAA1)的轻链可变区，VH_TAA2为结合第二肿瘤相关抗原(TAA2)的重链可变区，VL_TAA2为结合第二肿瘤相关抗原(TAA2)的轻链可变区，VH_CD3为结合CD3的重链可变区，VL_CD3为结合CD3的轻链可变区，L1、L2、L3、H1、H2依次分别为第一接头多肽、第二接头多肽、第三接头多肽、第一铰链和第二铰链。在这个具体的实例中，一个具体的实例，TAA1为CD19，TAA2为CD20。

本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第一接头多肽、第二接头多肽、第三接头多肽均可以各自独立的采用任何适宜的，例如可以使用带电的和/或柔性的接头多肽。在具体的实施方案中，接头多肽由通过肽键连接的1到50个氨基酸组成，其中所述氨基酸可以选自20个天然存在的氨基酸；在更优选的实施方案中，1到50个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。因此，示例性的接头可以是聚甘氨酸(尤其是(Gly)4、(Gly)5)、聚(Gly-Ser)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2、(Gly)3Cys(Gly)4、GlyProAsnGlyGly，或者专利申请WO2019195535的表4所公开的那些，等等。

在一些实施方案中，所述第一接头多肽、第二接头多肽或/和第三接头多肽可以是由甘氨酸和丝氨酸组成的接头多肽。

在一些实施方案中，所述第一接头多肽、第二接头多肽或/和第三接头多肽包含的氨基酸数目可以是0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、或20个以上。

在一些实施方案中，所述第一接头多肽、第二接头多肽或第三接头多肽各自独立的选自：包含以GGGGS为单位的接头多肽或包含GGSGGSGGSGGSGG的接头多肽。

优选的，所述以GGGGS为单位的接头多肽为(GGGGS)n，其中n是1-10之间的任意数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或由前述数字中的任意两个限定的任何范围，例如1-5、2-5、3-6、2-4、1-4等等。

在一些具体的实施方案中，所述的第一接头多肽、第二接头多肽或/和第三接头多肽为包含GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3或(GGGGS)4的接头多肽。

在一些具体的实施方案中，所述的第一接头多肽、第二接头多肽或/和第三接头多肽为包含GGSGGSGGSGGSGG的接头多肽。

在另一些具体的实施方案中，所述的第一接头多肽为包含(GGGGS)3的接头多肽，第二接头多肽为包含GGSGGSGGSGGSGG的接头多肽，第三接头多肽为包含GGGGS的接头多肽。一个优选的实例，第一接头多肽为(GGGGS)3（SEQ ID NO：45），第二接头多肽为GGSGGSGGSGGSGG（SEQ ID NO：46），第三接头多肽为GGGGS（SEQ ID NO：47）。

所述第一铰链和第二铰链能够相互形成共价键，例如二硫键。第一铰链或/和第二铰链可以包含人IgG的铰链区的氨基酸，人IgG的铰链区包含天然的铰链区或其变体。在一些实施方案中，第一铰链或/和第二铰链包含人IgG1的铰链区的氨基酸；在一些实施方案中，第一铰链或/和第二铰链包含人IgG2的铰链区的氨基酸；在一些实施方案中，第一铰链或/和第二铰链包含人IgG3的铰链区的氨基酸；在一些实施方案中，第一铰链或/和第二铰链包含人IgG4的铰链区的氨基酸。在一些具体的实施方案中，第一铰链包含GEPKSSDKTHTCPPCP，第二铰链包含EPKSCDKTHTCPPCP；在另一些具体的实施方案中，第一铰链包含EPKSCDKTHTCPPCP，第二铰链包含GEPKSSDKTHTCPPCP。一个优选的实例，第一铰链为GEPKSSDKTHTCPPCP（SEQ ID NO：48），第二铰链为EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO：49）。

本文的三特异性抗原结合构建体中，三个抗原结合多肽构建体特异性的结合各自相应的抗原，其中第一抗原结合多肽构建体结合CD19，第二抗原结合构建体结合CD20，或者第一抗原结合多肽构建体结合CD20，第二抗原结合构建体结合CD19。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第一抗原结合多肽构建体的重链可变区包含选自益基利仑赛(Yescarta)、替沙来塞(kymriah)、倍林妥莫抗体的CD19抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列，所述第一抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含选自益基利仑赛、替沙来塞、倍林妥莫抗体的CD19抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列；所述第二抗原结合多肽构建体的重链可变区包含选自利妥昔单抗(Rituximab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥克利珠单抗(Ocrelizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、奥妥珠单抗(GA101)的重链可变区的氨基酸序列，以及所述第二抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含选自利妥昔单抗、奥法木单抗、奥克利珠单抗、奥妥珠单抗的轻链可变区的氨基酸序列。

在另一些实施方案中，所述第二抗原结合多肽构建体的重链可变区包含选自益基利仑赛、替沙来塞、倍林妥莫抗体的CD19抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列，所述第二抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含选自益基利仑赛、替沙来塞、倍林妥莫抗体的CD19抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列, 所述第一抗原结合多肽构建体的重链可变区包含选自利妥昔单抗、奥法木单抗、奥克利珠单抗、奥妥珠单抗的重链可变区的氨基酸序列，所述第一抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含选自利妥昔单抗、奥法木单抗、奥克利珠单抗、奥妥珠单抗的轻链可变区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第一抗原结合多肽构建体包含包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的重链可变区，以及包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的轻链可变区，其中所述重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3包含分别根据SEQID NO：22、23、24的氨基酸序列，所述轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3包含分别根据SEQ IDNO：26、27、28的氨基酸序列。一个具体的实例，所述第一抗原结合多肽构建体包含：包含SEQID NO：22所示的重链CDR1、SEQ ID NO：23所示的重链CDR2和SEQ ID NO：24所示的重链CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：26所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：27所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：28所示的轻链CDR3的轻链可变区。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第二抗原结合多肽构建体包含包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的重链可变区，以及包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的轻链可变区，其中所述重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3包含分别根据SEQID NO：30、31、32的氨基酸序列，以及所述轻链CDR1、轻链CDR2 和轻链CDR3包含分别根据SEQ ID NO：34、35、36的氨基酸序列。一个具体的实例，所述的第二抗原结合多肽构建体包含：包含SEQ ID NO：30所示的重链CDR1、SEQ ID NO：31所示的重链CDR2和SEQ ID NO：32所示的重链CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：34所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：35所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：36所示的轻链CDR3的轻链可变区。

另一个具体的实例，所述第一抗原结合多肽构建体包含：包含SEQ ID NO：22所示的重链CDR1、SEQ ID NO：23所示的重链CDR2和SEQ ID NO：24所示的重链CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：26所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：27所示的轻链CDR2和SEQ ID NO：28所示的轻链CDR3的轻链可变区；和，所述的第二抗原结合构建体包含：包含SEQ ID NO：30所示的重链CDR1、SEQ ID NO：31所示的重链CDR2、SEQ ID NO：32所示的重链CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：34所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：35所示的轻链CDR2和SEQ IDNO：36所示的轻链CDR3的轻链可变区。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第一抗原结合多肽构建体的重链可变区包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述第一抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第二抗原结合多肽构建体的重链可变区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，所述第二抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在另一些实施方案中，所述第一抗原结合多肽构建体的重链可变区包含SEQ IDNO：21的氨基酸序列，所述第一抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；并且，所述第二抗原结合多肽构建体的重链可变区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，所述第二抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。一个具体的实例，第一抗原结合构建体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；以及，第二抗原结合构建体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。

所述的第三抗原结合多肽构建体结合人CD3，在一些实施方案中，所述第三抗原结合多肽构建体单价结合人CD3。第三抗原结合多肽构建体的可变区或CDR区来自抗CD3抗体。现有技术中的一种抗CD3抗体是SP34(Yang SJ，The Journal of Immunology，(1986)137；1097-1100)。SP34与灵长类和人CD3反应。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是UCHT-1(参见WO2000041474)。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是BC-3(Fred Hutchinson CancerResearch Institute，用于GvHD的I/II期试验，Anasetti等人，Transplantation，54:844(1992))。SP34与UCHT-1和BC-3的不同之处在于，SP-34识别仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人，1991年，J .Immunol .，第147卷，第3047页)，而UCHT-1和BC-3识别由ε链和γ链二者贡献的表位。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第三抗原结合多肽构建体包含包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的重链可变区，以及包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的轻链可变区，所述重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3包含分别根据SEQ IDNO：37所示重链可变区的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列，所述轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3包含分别根据SEQ ID NO:41所示轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第三抗原结合多肽构建体包含包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的重链可变区，以及包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的轻链可变区，其中所述重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3包含分别根据SEQID NO：38、39、40的氨基酸序列，所述轻链CDR1、轻链CDR2 和轻链CDR3包含分别根据SEQ IDNO：42、43、44的氨基酸序列。一个优选的实例，所述第三抗原结合多肽包含：包含SEQ IDNO：38所示的重链CDR1、SEQ ID NO：39所示的重链CDR2和SEQ ID NO：40所示的重链CDR3的重链可变区，以及包含SEQ ID NO：42所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：43所示的轻链CDR2和SEQID NO：44所示的轻链CDR3的轻链可变区。

在一些实施方案中，本文的三特异性抗原结合构建体中，所述第三抗原结合多肽构建体的重链可变区包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列，所述第三抗原结合多肽构建体的轻链可变区包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。一个优选的方案，所述第三抗原结合多肽的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示。

表S1示例性的提供了抗原结合构建体的可变区和CDR的氨基酸序列，本领域已知，CDR序列根据编号的规则不同可能有所变化。

表S1 示例性抗原结合构建体的序列

本文中，所述的第一免疫球蛋白功能域多肽和第二免疫球蛋白功能域多肽能够形成二聚体结构的骨架。

在一些实施方案中，所述骨架包含CL、CH1、CH2或CH3中的一个或几个。

在一些实施方案中，所述的骨架为Fc，即所述第一免疫球蛋白功能域多肽为第一Fc多肽，所述第二免疫球蛋白功能域多肽为第二Fc多肽，所述的第一Fc多肽与第二Fc多肽形成二聚体结构的Fc。

所述的Fc为人Fc。在一些实施方案中，所述的Fc为人IgG1的Fc。在一些实施方案中，所述的Fc为人IgG4的Fc。

在一些实施方案中，所述Fc包含修饰。所述修饰例如可以是促进异二聚化的修饰、改变效应子功能的修饰、改变与A蛋白结合能力的修饰等。

在一些实施方案中，所述Fc包含促进异二聚化的修饰。

本文的三特异性抗原结合构建体包含与Fc中的两条Fc多肽中的一个或另一个融合的不同抗原结合多肽构建体，因此，两条Fc多肽通常包含在两条不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化产生两种多肽的几种可能的组合。为了提高重组产生中抗原结合构建体的产率和纯度，在该抗原结合构建体的Fc中引入促进希望的多肽结合的修饰将是有利的。因此，在具体实施方案中，该Fc包含促进该第一Fc多肽和第二Fc多肽结合的修饰。修饰可以存在于该第一Fc多肽和/或第二Fc多肽中。

人IgG Fc结构域的两条Fc多肽之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的部位在Fc的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，该修饰在Fc的CH3结构域中。

在具体实施方案中，该修饰是所谓的“杵入臼(knob-into-hole)”修饰，其包含Fc结构域的两个Fc多肽之一中的“杵”修饰和Fc结构域的两个Fc多肽的另一个中的“臼”修饰。杵入臼技术描述于例如US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等,ProtEng9 ,617-621(1996)；和Carter,J Immunol Meth248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在一条Fc多肽的界面引入凸起(“杵”)，而在另一条Fc多肽的界面引入对应的凹陷(“臼”)，使得该凸起可以定位在该凹陷中，以促进异二聚体形成和妨碍同二聚体形成。通过用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸等)取代来自一条Fc多肽的界面的小的氨基酸侧链来构建凸起。通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸等)取代大的氨基酸侧链来在另一条Fc多肽的界面中产生具有与凸起相同或相似的大小的互补凹陷。

因此，在具体实施方案中，在该抗原结合构建体的一条Fc多肽的CH3结构域中，用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而在该Fc多肽的CH3结构域内产生可定位在另一条Fc多肽的CH3结构域内的凹陷中的凸起，在另一条Fc多肽的CH3结构域中，用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而在该Fc多肽的CH3结构域内产生凹陷。

在一些具体实施方案中，Fc的一条Fc多肽包含T366Y/W或/和S354C，且另一条Fc多肽包含Y407T/V、Y349C、T366S或/和L368A。一个更具体的实例，第一Fc多肽包含T366Y/W和S354C，第二Fc多肽包含Y407T/V、Y349C、T366S和L368A。另一个更具体的实例，第一Fc多肽包含Y407T/V、Y349C、T366S和L368A，第二Fc多肽包含T366Y/W和S354C。在更具体的实例中，Fc可以是人IgG1的Fc。

在一些实施方案中，所述Fc包含改变效应子功能的修饰。在一些具体的实施方案中，将该三特异性抗原结合构建体的Fc进行修饰为与未进行所述修饰的Fc相比，具有减少的对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能。对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能对改善细胞因子释放和副作用是有利的。

在一些实施方案中，降低该Fc与Fc受体的结合亲和力和/或减少效应子功能的修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，该Fc在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的一个或多个位置上包含氨基酸取代。在一些实施方案中，该Fc在选自L234、L235和P329的一个或多个位置上包含氨基酸取代。在一些实施方案中，该Fc包含氨基酸取代L234A和L235A。在一个这种实施方案中，该Fc是IgG1Fc，尤其是人IgG1Fc。在一些实施方案中，该Fc在P329位包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，该氨基酸取代是P329A或P329G。在一些实施方案中，该Fc包含P329位的氨基酸取代及选自E233、L234、L235、N297和P331的位置上的另一氨基酸取代。在更具体的实施方案中，该另一氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一些实施方案中，该Fc在P329、L234和L235位包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，该Fc包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“ P329G LALA”)。在更具体的另一个实施方案中，该Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329A(“ P329ALALA”)。在一个这种实施方案中，该Fc是IgG1Fc，尤其是人IgG1Fc。

在一些具体实施方案中，与天然IgG1 Fc相比，显示减少的对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和可选的P329A的人IgG1Fc结构域。

以上所述降低该Fc与Fc受体的结合亲和力和/或减少效应子功能的氨基酸取代发生在Fc的两条多肽链上。

在一些实施方案中，所述Fc包含减少或消除Fc中的一条Fc多肽的CH3区与A蛋白(Protein A from Staphylococcus aureus)的结合的修饰。在一些实施方案中，该修饰为氨基酸取代。在一些实施方案中，所述Fc包含氨基酸取代H435R或/和Y436F，该氨基酸取代仅发生在一条Fc多肽上，而不发生在另一条Fc多肽上。在一些具体的实施方案中，所述Fc包含只在第一Fc多肽的氨基酸取代H435R和Y436F。在另一些具体的实施方案中，所述Fc包含只在第二Fc多肽氨基酸取代H435R和Y436F。在一个这种具体的实施方案中，该Fc是IgG1Fc，尤其是人IgG1Fc。

本文的三特异性抗原结合构建体中，所述Fc修饰可以包含促进异二聚化的修饰、改变效应子功能的修饰、减少或消除Fc中的一条Fc多肽的CH3区与A蛋白的结合的修饰中的一种、两种或三种。在一些实施方案中，所述Fc包含促进第一Fc多肽和第二Fc多肽结合的修饰、所述减少对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能的修饰、以及减少或消除Fc中的一条Fc多肽的CH3区与A蛋白的结合的修饰。对于上述不同种修饰类型的具体方案，可以进行组合。例如，一个具体的实施方案，所述Fc包含下组的氨基酸取代：

. Y407T/V、Y349C、T366S、L368A、T366Y/W和S354C；其中，氨基酸取代T366Y/W和 S354C在同一条Fc多肽上，且与(

.)中的其他氨基酸取代均不在同一条Fc多肽上；

. L234A、L235A和P329A；以及，

. H435R和Y436F，仅发生在其中一条Fc多肽上。

一个更具体的实施方案中，第一Fc多肽包含氨基酸取代：L234A、L235A、P329A、Y349C、T366S、L368A和Y407V，第二Fc多肽包含氨基酸取代：L234A、L235A、P329A、S354C、T366W、H435R和Y436F。另一个更具体的实施方案中，第二Fc多肽包含氨基酸取代：L234A、L235A、P329A、Y349C、T366S、L368A和Y407V，第一Fc多肽包含氨基酸取代：L234A、L235A、P329A、S354C、T366W、H435R和Y436F。在这两个这种具体的实施方案中，该Fc是IgG1Fc，尤其是人IgG1Fc。

本发明上下文中，氨基酸取代表示为：原氨基酸-位置-取代的氨基酸，使用三字母码或单字母码，包括编码Xaa和X来表示氨基酸残基。因此，例如“H435R”意为将位置435处的氨基酸H取代为氨基酸R；对于取代的氨基酸可以包含多于1个，例如T366Y/W意为将位置366处的氨基酸T取代为氨基酸Y或W。

在一些实施方案中，本文所述的三特异性抗原结合构建体是三特异性抗体。在一些实施方案中，所述的抗原结合构建体是三价的。本文提供了示例性的三特异性抗原结合构建体(如抗CD3-CD19-CD20三特异性抗体)，其是三价三特异性的。

一个具体的实例，示例性的三特性抗体，具有重链1、重链2和轻链三条多肽链，三条多肽链形成了结合CD19的scFv、结合CD3的scFv、结合CD20的Fab，其中，重链1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.9所示。

组合物。

本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含三特异性抗原结合构建体，并且还包含一种或多种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包括三特异性抗体例如抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体，以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括，例如，赋形剂、稀释剂、包封材料、填充剂、缓冲剂或其他试剂。

分离的核酸。

本发明提供了分离的核酸，其包含编码本发明所述三特异性抗原结合构建体序列表中示例性的列举了一些三特异性抗原结合构建体例如三特异性抗体的重链和轻链的核酸序列。

载体。

本发明提供了包含所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，所述的载体为克隆载体；在另一些实施方案中，所述的载体为表达载体，一个具体的例子，表达载体为pcDNA3.1。

所述表达载体可选的能够表达本发明所述三特异性抗原结合构建体的任意表达载体。

宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供包含所述本发明载体的宿主细胞，宿主细胞为用于克隆或编码三特异性抗原结合构建体的适当宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为原核细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳细胞或适用于制备三特异性抗原结合构建体的其他细胞。哺乳细胞例如为中国仓鼠(CHO)卵巢细胞、CHO-S细胞。

制备三特异性抗原结合构建体的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了制备三特异性抗原结合构建体的方法，所述方法包括：在适合所述三特异性抗原结合构建体表达的条件下，培养包含编码所述三特异性抗原结合构建体的核酸的宿主细胞，从所述宿主细胞或宿主细胞培养基中回收所述三特异性抗原结合构建体。为了产生所述的三特异性抗原结合构建体，分离编码所述三特异性抗原结合构建体的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆或/和表达。所述核酸可以采用基因拼接、化学合成等多种本领域所熟知的方法获取。

用途。

本发明提供了三特异性抗原结合构建体的用途。在具体的实施方案中，使用的三特异性抗原结合构建体可以为抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体。

在一些实施方案中，提供了所述的三特异性抗原结合构建体在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物的用途。

在一些实施方案中，所述癌症表达CD19或/和CD20。

在一些实施方案中，所述癌症为弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、原发中枢神经系统淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、急性早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、原发性系统性淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症或原发性骨髓纤维化。

在一些实施方案中，提供了检测或测量样品中的CD19或/和CD20的方法，其包括使所述样品与本文所述的三特异性抗原结合构建体接触并且检测或测量结合复合物。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教义，本领域的普通技术人员将显而易见的是，可另外对本发明进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神和范围。以下实施例仅以说明方式提供，而并不起限制作用。本领域的技术人员将容易地识别多种非关键性参数，所述参数可发生改变或修改以产生基本上类似的结果。

实施例1：抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体及对照的制备。

如下所述制备示例性抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体和对照。

抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的制备：

图2示意了本实施例抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的构型；其中第一Fc多肽和第二Fc多肽形成异二聚体结构的Fc。第一抗原结合多肽构建体和第三抗原结合多肽构建体均为scFv，第二抗原结合多肽构建体为Fab。第一抗原结合多肽构建体在其C端与第三抗原结合多肽构建体的N端融合，第三抗原结合多肽构建体在其C端与第一Fc多肽的N端融合，第二抗原结合多肽构建体的Fab重链在其C端与第二Fc多肽的N端融合。

第一抗原结合多肽构建体为scFv，结合抗原CD19，其可变区序列基于倍林妥莫抗体(商品名Blincyto)的CD19抗原结合结构域构建；结合CD19的重链可变区和轻链可变区经第一接头多肽融合形成scFv结构的第一抗原多肽结合构建体anti-CD19-scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第三抗原结合多肽构建体为scFv，结合抗原CD3，其可变区序列由对鼠源sp34抗体进行人源化改造获得；结合CD3的重链可变区和轻链可变区经第二接头多肽融合形成scFv结构的第三抗原结合构建体anti-CD3-scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

anti-CD19-scFv在其C端经第三接头多肽与anti-CD3-scFv的N端融合，anti-CD3-scFv在其C端经第一铰链(H1)与第一Fc多肽的N端融合，形成重链anti-CD19-scFv-CD3-scFv-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

第二抗原结合多肽构建体为Fab，结合抗原CD20，其可变区序列基于奥法木单抗(商品名Arzerra)的可变区构建。第二抗原结合多肽构建体的Fab重链在其C端经第二铰链(H2)与第二Fc多肽的N端融合，形成重链anti-CD20-VH-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

第二抗原结合多肽构建体的Fab轻链即轻链anti-CD20-Lc，其氨基酸序列如SEQID NO：9所示。

重链anti-CD20-VH-Fc与轻链anti-CD20-Lc缔合，第一Fc多肽和第二Fc多肽能形成异二聚体结构的Fc，Fc采用人IgG1的Fc，并引入氨基酸取代。

分子构建中采用的接头和铰链的氨基酸序列分别为：

第一接头多肽：(GGGGS)3

第二接头多肽：GGSGGSGGSGGSGG

第三接头多肽：GGGGS

第一铰链(H1)：GEPKSSDKTHTCPPCP

第二铰链(H2)：EPKSCDKTHTCPPCP。

表1 实施例1中抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的序列

合成编码抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体多肽链的DNA序列(SEQ ID NO：6, 8,10)并且分别克隆到pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO^TM表达试剂盒(Thermo Fisher，目录号A29133)将抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的表达载体共转染到ExpiCHO(CHO-S, Thermo公司)中，其中重链anti-CD19-scFv-CD3-scFv-Fc：重链anti-CD20-VH-Fc：轻链anti-CD20-Lc的转染比率为1:1:1.5。将细胞在ExpiCHO表达培养基中于37℃、含有8% CO₂的湿润气氛的培养箱中并在以130 rpm旋转的有轨摇床平台上连续培养12天。收集培养上清，经离心、过滤后进行protein A亲和纯化，纯化设备为AKTA(GE)，层析介质为Eshmuno® A(默克，货号1.20089.0010)。采用pH梯度洗脱，分管收集洗脱后的蛋白，并及时用中和液(1M Tris-HCl，pH9.5)中和洗脱的目的蛋白缓冲液至约pH7.0，于4℃保存，并进行SDS-PAGE及HPLC-SEC检测。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop lite, Thermo Scientific)测量蛋白浓度。

对照抗体的制备：

双特异性抗体CD20-CD3 BisAb1和REGN1979均靶向CD20和CD3，倍林妥莫抗体靶向CD19和CD3。

(1)双特异性抗体CD20-CD3 BisAb1

双特异性抗体CD20-CD3 BisAb1能够结合抗原CD20和CD3，结合CD3的抗原结合结构域为scFv，其可变区序列由对鼠源sp34抗体进行人源化改造获得；结合CD20的抗原结合结构域为Fab，其可变区序列基于奥法木单抗(商品名ARZERRA)的可变区构建；Fc采用人IgG1的Fc，并引入氨基酸取代。双特异抗体CD20-CD3 BisAb1具有三条多肽链，分别为重链anti-CD20-VH-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO：7)和轻链anti-CD20-Lc(氨基酸序列如SEQ IDNO：9)和重链anti-CD3-scFv-Fc (氨基酸序列如SEQ ID NO：11)。

合成编码双特异抗体CD20-CD3 BisAb1三条多肽链的DNA序列(SEQ ID NO：8, 10,12)并且分别克隆到pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO表达试剂盒(Thermo Fisher，目录号A29133)将双特异抗体CD20-CD3 BisAb1的表达载体共转染到ExpiCHO(CHO-S, Thermo公司)中。将细胞在ExpiCHO表达培养基中于含有8% CO₂的湿润气氛的37℃培养箱中并在以130 rpm旋转的有轨摇床平台上培养。收集培养上清，经离心、过滤后进行proteinA亲和纯化，纯化设备为AKTA(GE)，层析介质为Eshmuno A(默克，1.20089.0010)。采用pH梯度洗脱，分管收集洗脱后的蛋白，并及时用中和液(1M Tris-HCl，pH9.5)中和洗脱的目的蛋白缓冲液至约pH7.0，于4℃保存，并进行SDS-PAGE及HPLC-SEC检测。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop lite, Thermo Scientific)测量蛋白浓度。

(2)倍林妥莫抗体

根据世界卫生组织国际非专利名称（INN）目录所公示的blinatumomab(Blincyto®)序列，构建表达了倍林妥莫抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO：13)。

(3)REGN1979

REGN1979为靶向抗原CD20和CD3的双特异性抗体，结合CD3和CD20的抗原结合结构域均为Fab，包含重链Anti-CD20-VH(氨基酸序列如SEQ ID NO：15)、重链Anti-CD3-VH(氨基酸序列如SEQ ID NO：17)以及共同轻链Anti-CD20-CD3 VL(氨基酸序列如SEQ ID NO：19)。

合成编码REGN1979抗体的多肽链的DNA序列(SEQ ID NO：16, 18, 20)，并且克隆到pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO表达试剂盒(Thermo Fisher，目录号A29133)将anti-CD20-CD3双特异抗体的表达载体按重链Anti-CD20-VH：重链Anti-CD3-VH：轻链Anti-CD20-CD3 VL的转染比率1：1：2.5共转染到ExpiCHO (CHO-S, Thermo公司)中。将细胞在ExpiCHO表达培养基中于含有8% CO2的湿润气氛的37℃培养箱中并在以130 rpm旋转的有轨摇床平台上培养。收集培养上清，经离心、过滤后进行proteinA亲和纯化，纯化设备为AKTA(GE)，层析介质为Eshmuno A(默克，1.20089.0010)。采用pH梯度洗脱，分管收集洗脱后的蛋白，并及时用中和液(1M Tris-HCl，pH9.5)中和洗脱的目的蛋白缓冲液至约pH7.0，于4℃保存，并进行SDS-PAGE及HPLC-SEC检测。通过UV-Vis分光光度计(NanoDrop lite, ThermoScientific)测量蛋白浓度。

表2 实施例1中对照抗体的序列

实施例2：抗原CD19、CD20在不同淋巴瘤细胞系上的表达水平。

使用流式细胞术染色测定淋巴瘤细胞系上的抗原CD19、CD20表面表达。活细胞群体通过FCS/SCC参数门控。在AttuneTM NxT流式细胞仪上进行流动采集，并使用AttuneTMNxT软件进行流动分析。

具体实验过程如下：

分别收集Daudi(来源：北纳生物)，Raji(来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，Nalm6(来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞系，加入1mlAutomacs Running Buffer(MACS，货号130-091-221)洗涤细胞，400g，4℃离心5分钟，离心两次。调整细胞密度为2.5×10⁶个/ml，取100 μl细胞分装至新的EP管中。加入对应抗体鼠抗人CD19 FITC标记抗体(克隆号HIB19)(FITC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19(RUO)；BD，货号555412)或者鼠抗人CD20 APC标记抗体(克隆号2H7)(APC Mouse Anti-Human CD20 Clone 2H7 (RUO)，BD，货号559776)2.5 μl，冰上避光孵育30 min。400 g，4℃离心5 min，去上清。加入1 ml Automacs Running buffer洗涤两次，用200 μl AutomacsRunning buffer重悬细胞后上机检测。以平均荧光强度(MFI)反映抗原的表达丰度。

淋巴瘤细胞系Daudi、Nalm6和Raji的细胞表面上抗原CD19、CD20的表达检测结果见表3。其中，Daudi、Raji和Nalm6细胞的CD19表达丰度比较接近，Daudi和Raji的CD20表达量均较高，Nalm6细胞的CD20表达量较低。

表3 流式检测不同细胞系表面的CD19和CD20的表达(MFI)

实施例3：抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对靶细胞Daudi的杀伤。

通过人PBMC(外周血单个核细胞)提供T细胞来研究三特异性抗体对靶细胞(实施例2的Daudi CD19++；CD20+++，来源：北纳生物)的杀伤作用。

具体实验过程如下：

Daudi细胞使用含2% FBS(胎牛血清)的1640实验培养基调整细胞密度至5 x 10⁵个/ml，50 μl每孔接种于96孔细胞培养板(eppendorf，货号：0030730199)。使用实验培养基配制不同浓度的三特异性抗体或对照抗体，将不同浓度的抗体加入上述96孔细胞培养板中，每孔50 μl。人PBMC使用实验培养基调整细胞密度至2.5 x 10⁶个/ml，每孔100 μl。设置给药组(靶细胞50 μl +效应细胞100 μl +抗体50 μl)，靶细胞组(Daudi细胞50 μl+培养基150 μl)，效应细胞组(人PBMC100 μl+培养基100 μl)，靶细胞+效应细胞组(靶细胞50 μl+效应细胞100 μl +培养基50 μl)，空白对照组(培养基200 μl)和裂解液对照组(培养基200 μl+20 μl裂解液)，靶细胞最大释放组(靶细胞50 μl +培养基150 μl+20 μl裂解液)，效靶比为10：1。在检测前45min，靶细胞最大释放组和裂解液对照组加入20 μl/孔裂解液(Promega，货号G182A)。45min后使用CytoTox96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒(cytotox96 nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780)试剂盒检测细胞裂解率。

。

图3显示了抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Daudi/CD19++&CD20+++ 肿瘤细胞的裂解率。抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Daudi肿瘤细胞的杀伤优于CD20-CD3 BisAb1和倍林妥莫抗体(BLINCYTO)；其中抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体EC50为0.83pM，CD20-CD3BisAb1的EC50为2.83pM，倍林妥莫抗体的EC50为3.30pM。

实施例4：抗CD19-C20-CD3三特异性抗体对靶细胞Nalm6的杀伤。

通过人PBMC(外周血单个核细胞)提供T细胞来研究三特异性抗体对靶细胞(实施例2的Nalm6 CD19++；CD20+，来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的杀伤作用。

具体实验过程如下：

Nalm6细胞使用含2% FBS(胎牛血清)的1640实验培养基调整细胞密度至5 x 10⁵个/ml，50 μl每孔接种于96孔细胞培养板(eppendorf，货号：0030730199)。使用实验培养基配制不同浓度的三特异性抗体，将不同浓度的抗体加入上述96孔细胞培养板中，每孔50 μl。人PBMC使用实验培养基调整细胞密度至2.5 x 10⁶个/ml，每孔100 μl。设置给药组(靶细胞50 μl +效应细胞100 μl +抗体50 μl)，靶细胞组(Nalm6细胞50 μl+培养基150 μl)，效应细胞组(人PBMC100 μl+培养基100 μl)，靶细胞+效应细胞组(靶细胞50 μl +效应细胞100 μl +培养基50 μl)，空白对照组(培养基200 μl)和裂解液对照组(培养基200 μl+20 μl裂解液)，靶细胞最大释放组(靶细胞50 μl +培养基150 μl+20 μl裂解液)，效靶比为10：1。在检测前45min，靶细胞最大释放组和裂解液对照组加入20 μl/孔裂解液(Promega，货号G182A)。45min后使用CytoTox96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒(cytotox 96nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780)试剂盒检测细胞裂解率。

。

图4显示了抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Nalm6/CD19++&CD20+ 肿瘤细胞的裂解率。抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Nalm6肿瘤细胞的杀伤优于CD20-CD3 BisAb1和倍林妥莫抗体(BLINCYTO)，其具有更高的细胞裂解率和更低的EC50；其中抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的EC50为0.21pM，CD20-CD3 BisAb1的EC50为13.01pM，倍林妥莫抗体的EC50为1.76pM。

实施例5：抗CD19-C20-CD3三特异性抗体对靶细胞Raji的杀伤。

通过人PBMC(外周血单个核细胞)提供T细胞来研究三特异性抗体对靶细胞(实施例2的Raji CD19++；CD20+++，来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的杀伤作用。

具体实验过程如下：

Raji细胞使用含2% FBS(胎牛血清)的1640实验培养基调整细胞密度至5 x 10⁵个/ml，50 μl每孔接种于96孔细胞培养板(eppendorf，货号：0030730199)。使用实验培养基配制不同浓度的三特异性抗体，将不同浓度的抗体加入上述96孔细胞培养板中，每孔50 μl。人PBMC使用实验培养基调整细胞密度至2.5 x 10⁶个/ml，每孔100 μl。设置给药组(靶细胞50 μl +效应细胞100 μl +抗体50 μl)，靶细胞组(Raji细胞50 μl+培养基150 μl)，效应细胞组(人PBMC100 μl+培养基100 μl)，靶细胞+效应细胞组(靶细胞50 μl +效应细胞100 μl +培养基50 μl)，空白对照组(培养基200 μl)和裂解液对照组(培养基200 μl+20 μl裂解液)，靶细胞最大释放组(靶细胞50 μl +培养基150 μl+20 μl裂解液)，效靶比为10：1。在检测前45min，靶细胞最大释放组和裂解液对照组加入20 μl/孔裂解液(Promega，货号G182A)。45min后使用CytoTox96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒(cytotox 96nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780)试剂盒检测细胞裂解率。

。

图5显示了抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Raji/CD19++&CD20+++ 肿瘤细胞的裂解率。抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体对Raji肿瘤细胞的杀伤优于CD20-CD3 BisAb1、倍林妥莫抗体(BLINCYTO)和REGN1979；其中抗CD19-CD20-CD3三特异性抗体的EC50为0.40pM，CD20-CD3 BisAb1的EC50为3.73pM；倍林妥莫抗体(BLINCYTO)的EC50为5.31pM，抗体REGN1979的EC50为47.57pM。

序列表

<110> 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司

正大天晴药业集团股份有限公司

<120> 三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln

165 170 175

Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccagc tgacccagtc tcctgcctct ctggccgtgt ctttgggcca gagagccacc 60

atctcttgca aggcctctca gtcggtggac tacgatggcg actcctacct gaactggtac 120

cagcagatcc ctggccaacc tcctaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgtcc 180

ggcatccccc ctagattctc cggctctggc tccggcaccg acttcacact gaacatccac 240

cccgtggaaa aggtagatgc cgctacctac cactgccagc aaagcaccga agatccttgg 300

accttcggcg gcggcaccaa actcgagatc aagggcggag ggggatccgg cggcggcgga 360

tctggcgggg gaggatccca ggtgcaactg cagcagtccg gcgctgagct ggttaggcct 420

ggctcttctg tgaagatctc ctgcaaggcc tccggctacg ccttctcttc ttactggatg 480

aactgggtca agcagcggcc tggccagggc ctggaatgga tcggccagat ctggcctggc 540

gacggcgata ccaactacaa cggcaagttc aagggcaagg caaccctgac cgctgatgaa 600

tcctcctcta cagcttacat gcagctgtcc tccctggcct ccgaggactc tgccgtgtac 660

ttctgcgccc ggagagagac cacaaccgtg ggcagatact actacgccat ggactactgg 720

ggccagggca caacagtgac cgtgtccagc 750

<210> 3

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu

195 200 205

Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 4

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggtgcagc tggtcgagtc cggcggcgga ctcgtgcagc ccggcggctc tctgagactg 60

tcttgcgccg cctccggctt taccttcaac acctacgcca tgaactgggt gcggcaggct 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggctaga atcagatcca agtacaacaa ctacgctacc 180

tactacgccg actcggtgaa ggaccggttc accatcagcc gggacgactc caagaatacc 240

gcctacctgc agatgaacaa tctgaagacc gaggacaccg ctatgtacta ctgcgtgcgg 300

cacggcaact tcggcaactc ttacgtgtct tggttcgcct actggggaca aggaaccctg 360

gtgacagtgt cctcaggcgg ctccggcggc agcggcggca gcggcggaag cggcggcgag 420

ctggtggtga cccaagagcc cagcctcacc acctctcctg gaggcaccgt gaccctgacc 480

tgcagatcct ccaccggcgc tgtgaccacc tccaactacg ccaactgggt gcaacagaag 540

cctggacagg cccccagagg cctgatcgga ggcaccaaca agagagctcc tggaactcct 600

gctcggttta gcggaagtct gctgggtggc aaggccgccc tgaccatcac cggcgtccag 660

cctgaggacg aggccgagta ctactgtgcc ctgtggtact ccaacctgtg ggtctttggc 720

ggaggcacca agctgacagt cctg 744

<210> 5

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln

165 170 175

Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

245 250 255

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

260 265 270

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

275 280 285

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

290 295 300

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

305 310 315 320

Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala

325 330 335

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

340 345 350

Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala

355 360 365

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Val Val Thr Gln

385 390 395 400

Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys

405 410 415

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val

420 425 430

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn

435 440 445

Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly

450 455 460

Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala

465 470 475 480

Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly

485 490 495

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

500 505 510

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

515 520 525

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

530 535 540

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

545 550 555 560

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

565 570 575

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

580 585 590

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

595 600 605

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr

610 615 620

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

625 630 635 640

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

645 650 655

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

660 665 670

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

675 680 685

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

690 695 700

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

705 710 715 720

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

725 730 735

<210> 6

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacatccagc tgacccagtc tcctgcctct ctggccgtgt ctttgggcca gagagccacc 60

atctcttgca aggcctctca gtcggtggac tacgatggcg actcctacct gaactggtac 120

cagcagatcc ctggccaacc tcctaagctg ctgatctacg acgccagcaa cctggtgtcc 180

ggcatccccc ctagattctc cggctctggc tccggcaccg acttcacact gaacatccac 240

cccgtggaaa aggtagatgc cgctacctac cactgccagc aaagcaccga agatccttgg 300

accttcggcg gcggcaccaa actcgagatc aagggcggag ggggatccgg cggcggcgga 360

tctggcgggg gaggatccca ggtgcaactg cagcagtccg gcgctgagct ggttaggcct 420

ggctcttctg tgaagatctc ctgcaaggcc tccggctacg ccttctcttc ttactggatg 480

aactgggtca agcagcggcc tggccagggc ctggaatgga tcggccagat ctggcctggc 540

gacggcgata ccaactacaa cggcaagttc aagggcaagg caaccctgac cgctgatgaa 600

tcctcctcta cagcttacat gcagctgtcc tccctggcct ccgaggactc tgccgtgtac 660

ttctgcgccc ggagagagac cacaaccgtg ggcagatact actacgccat ggactactgg 720

ggccagggca caacagtgac cgtgtccagc ggtggcggcg gttctgaggt gcagctggtc 780

gagtccggcg gcggactcgt gcagcccggc ggctctctga gactgtcttg cgccgcctcc 840

ggctttacct tcaacaccta cgccatgaac tgggtgcggc aggctcctgg caaaggactg 900

gaatgggtgg ctagaatcag atccaagtac aacaactacg ctacctacta cgccgactcg 960

gtgaaggacc ggttcaccat cagccgggac gactccaaga ataccgccta cctgcagatg 1020

aacaatctga agaccgagga caccgctatg tactactgcg tgcggcacgg caacttcggc 1080

aactcttacg tgtcttggtt cgcctactgg ggacaaggaa ccctggtgac agtgtcctca 1140

ggcggctccg gcggcagcgg cggcagcggc ggaagcggcg gcgagctggt ggtgacccaa 1200

gagcccagcc tcaccacctc tcctggaggc accgtgaccc tgacctgcag atcctccacc 1260

ggcgctgtga ccacctccaa ctacgccaac tgggtgcaac agaagcctgg acaggccccc 1320

agaggcctga tcggaggcac caacaagaga gctcctggaa ctcctgctcg gtttagcgga 1380

agtctgctgg gtggcaaggc cgccctgacc atcaccggcg tccagcctga ggacgaggcc 1440

gagtactact gtgccctgtg gtactccaac ctgtgggtct ttggcggagg caccaagctg 1500

acagtcctgg gcgaacccaa gtcgtctgac aagacccaca cctgtcctcc ttgccccgct 1560

cccgaggctg ctggcggccc ttccgtgttc ctgttccctc caaagcctaa ggacacactg 1620

atgatctcca gaacccctga agtgacatgc gtggtcgtgg acgtgtccca cgaggatccc 1680

gaagtaaagt tcaattggta tgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 1740

cgggaagagc agtacaactc cacctacaga gtggtgtctg tcttaaccgt gctgcaccag 1800

gactggctga acggaaaaga gtacaagtgc aaagtgtcca acaaggctct ggctgctcct 1860

atcgagaaga caatctccaa ggccaagggc cagcctcgcg agcctcaggt gtgcaccctg 1920

cctccatcca gagaggaaat gaccaagaac caggtatccc tgtcttgtgc tgtgaaaggc 1980

ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagtctaacg gccagcctga gaacaactac 2040

aaaaccaccc ctcctgtgct ggactctgat ggctccttct tcctcgtgtc taaactgacg 2100

gtggataagt ctagatggca gcagggcaac gtgttctcct gttctgtgat gcacgaggcg 2160

ctgcacaacc actacaccca gaaatccctg tccctgagcc ccggcaag 2208

<210> 7

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

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His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro

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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 8

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 10

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<210> 11

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Val Val Thr

130 135 140

Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

165 170 175

Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

180 185 190

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu

195 200 205

Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu

210 215 220

Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

245 250 255

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

275 280 285

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

290 295 300

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

325 330 335

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

340 345 350

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

370 375 380

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

405 410 415

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

420 425 430

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Lys

<210> 12

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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aag 1443

<210> 13

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln

165 170 175

Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

260 265 270

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

275 280 285

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

290 295 300

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

305 310 315 320

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

325 330 335

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

355 360 365

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

385 390 395 400

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

405 410 415

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

420 425 430

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

435 440 445

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

450 455 460

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

465 470 475 480

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

485 490 495

Leu Lys His His His His His His

500

<210> 14

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacatccaac tgacccagtc ccctgctagc ctggctgtgt ccctgggcca gcgcgctacc 60

atctcctgca aggcctctca atctgtggac tacgacggcg actcctacct gaactggtat 120

cagcagatcc ccggccagcc tcccaagctg ctgatctacg atgcctccaa cctggtgtcc 180

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<210> 15

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

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Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

225 230 235 240

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 16

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcgga ctcgtgcaac caggcagatc cctgcggctg 60

tcctgtgtgg cctctggatt taccttcaac gactacgcca tgcactgggt cagacaggcc 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtctgtg atctcttgga actccgactc tatcggctac 180

gccgactccg tgaaaggccg gttcaccatc agccgggata atgccaagaa cagcctttac 240

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gttgacaagc gggtcgagtc caagtacggc cccccttgcc ctccttgtcc agctcctcct 720

gtggctggcc cttctgtgtt tctgttccca cctaagccca aggacaccct gatgatcagc 780

cggacacctg aagtgacatg cgtggtggtt gatgtgtctc aagaggaccc tgaggtgcag 840

ttcaactggt acgtggacgg agtggaagtg cataacgcta aaactaaacc tagagaggaa 900

cagttcaact ccacctacag agtggtcagt gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 960

aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtct aacaagggcc tgcctagctc catcgagaag 1020

accatctcca aggccaaagg acagcctcgc gagcctcagg tgtacaccct gccaccctcc 1080

caagaagaga tgaccaagaa ccaggtctct ctgacctgtc tggtcaaggg cttctacccc 1140

tctgacatcg ccgtggagtg ggagtccaat ggccagcctg agaacaacta caagaccacc 1200

cctcctgtgc tggactccga tggctccttc ttcctgtact ccagactgac agtggataag 1260

tccagatggc aggagggcaa cgtgttctcc tgctccgtga tgcacgaggc tctgcataat 1320

cactacaccc agaagtctct gagcctgtct ctgggcaag 1359

<210> 17

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn Ser Gly Tyr Gly His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 18

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggtgcaac tggtagaatc tggcggcggt ttggttcagc ctggaagatc tctgcggctg 60

agctgtgccg cttccggctt taccttcgac gactacacca tgcactgggt gagacaggcc 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgagcggc atcagctgga actccggctc catcggctac 180

gccgactccg tcaagggcag attcaccatc tcccgggaca acgccaagaa gtccctgtac 240

ctgcaaatga actctctgag agccgaggac acagccctgt actactgcgc caaggataac 300

tccggctatg gccactacta ttacggcatg gacgtgtggg gacagggcac cacagtgacc 360

gtggcctctg cctccacaaa gggaccttct gtgtttcctc tggctccttg ctctcggtcc 420

acctccgagt ctaccgctgc tctgggctgc ctggtgaagg actacttccc agagcctgtc 480

acagtgtctt ggaactcagg cgctctgacc tctggcgtgc acacctttcc tgctgtgctg 540

cagtcctctg gcctgtatag cctgtcttct gtcgttaccg tgccctcttc cagcctggga 600

acaaaaacct acacctgcaa tgtggaccac aagccttcca acaccaaagt ggacaagcgg 660

gtggagtcta agtacggccc cccttgtcct ccatgccctg ctcctcccgt ggctggcccc 720

agcgtcttcc tgttccctcc taagcccaag gacaccctga tgatctccag aactcctgag 780

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccag gaagatcctg aagtgcagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaagtgca taatgccaag acaaagccta gagaggaaca gttcaactcc 900

acctacagag tggtctccgt gctcaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 960

tacaagtgca aggtgtctaa caagggcctg ccttcctcca tcgagaagac catctccaag 1020

gccaagggcc agcctcggga acctcaggtg tacaccctgc ccccatctca ggaagagatg 1080

accaagaacc aggtgtctct gacctgtctg gtcaaagggt tctaccccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agtccaatgg acaacccgag aacaactaca agaccacccc acctgtgctg 1200

gactctgatg gctccttctt cctgtactcc cgcctcaccg tggataagtc tagatggcag 1260

gagggcaacg tgttctcctg cagcgtgatg catgaggccc tgcacaaccg gttcacccag 1320

aaatccctgt ccctgtctct gggcaag 1347

<210> 19

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 20

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaaatcgtga tgacccagag ccctgctacc ctctcagtct ctccaggcga acgggctaca 60

ctgtcctgcc gggcctctca gtccgtgtcc tccaacctgg cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaggctc ctagactgct gatctacggc gcttctacca gagccaccgg catccccgcc 180

agattctccg gctctggctc cggcaccgag ttcaccctga caatctccag cctgcagtcc 240

gaggactttg ccgtgtacta ctgccagcac tacatcaact ggcctctgac cttcggcgga 300

ggtaccaaag tggaaatcaa gcggaccgtg gctgctccct ctgtgttcat ctttcctcct 360

tctgatgagc agctgaagtc tggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420

cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcaatctgg aaattcccaa 480

gagtccgtca cagaacagga ctccaaagat tccacctatt ctctgtctag caccctgaca 540

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccatcagggc 600

ctgagctctc ctgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gt 642

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 29

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr

1 5

<210> 37

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 48

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Claims

1.一种三特异性抗原结合构建体，其特征在于，其包含：

特异性的结合CD19且为scFv的第一抗原结合多肽构建体；

特异性的结合CD20且为scFv的第二抗原结合多肽构建体；

特异性地结合CD3且为Fab的第三抗原结合多肽构建体，以及由第一Fc多肽和第二Fc多肽形成二聚结构的Fc；其中所述第一抗原结合多肽构建体在其C端与第三抗原结合多肽构建体的N端融合，所述第三抗原结合多肽构建体在其C端与第一Fc多肽的N端融合，所述第二抗原结合多肽构建体在其C端与第二Fc多肽的N端融合；

所述第一抗原结合多肽构建体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：22所示的重链CDR1、SEQ ID NO：23所示的重链CDR2和SEQ ID NO：24所示的重链CDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：26所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：27所示的轻链CDR2和SEQID NO：28所示的轻链CDR3；

所述第二抗原结合多肽构建体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：30所示的重链CDR1、SEQ ID NO：31所示的重链CDR2和SEQ ID NO：32所示的重链CDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：34所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：35所示的轻链CDR2和SEQID NO：36所示的轻链CDR3；

所述第三抗原结合多肽构建体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：38所示的重链CDR1、SEQ ID NO：39所示的重链CDR2和SEQ ID NO：40所示的重链CDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO：42所示的轻链CDR1、SEQ ID NO：43所示的轻链CDR2和SEQID NO：44所示的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的三特异性抗原结合构建体，其特征在于，所述第一抗原结合多肽构建体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述第二抗原结合多肽构建体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：29所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；以及所述第三抗原结合多肽构建体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：41所示。

3.根据权利要求1或2所述的三特异性抗原结合构建体，其特征在于，所述Fc为人IgG1或人IgG4的Fc。

4.根据权利要求3所述的三特异性抗原结合构建体，其特征在于，所述Fc包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G；或者所述Fc包含氨基酸取代L234A、L235A和P329A。

5.根据权利要求1或2所述的三特异性抗原结合构建体，其特征在于，所述三特异性抗原结合构建体是三价的。

6.根据权利要求1所述的三特异性抗原结合构建体，其特征在于，所述三特异性抗原结合构建体包含三条多肽链，三条多肽链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示。

7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的三特异性抗原结合构建体和药学上可接受的载体。

8.一种核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的三特异性抗原结合构建体。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的三特异性抗原结合构建体在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物的用途。