RU2774451C2 - Биспецифический рекомбинантный белок и его применение - Google Patents
Биспецифический рекомбинантный белок и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2774451C2 RU2774451C2 RU2019138624A RU2019138624A RU2774451C2 RU 2774451 C2 RU2774451 C2 RU 2774451C2 RU 2019138624 A RU2019138624 A RU 2019138624A RU 2019138624 A RU2019138624 A RU 2019138624A RU 2774451 C2 RU2774451 C2 RU 2774451C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ser
- val
- thr
- leu
- pro
- Prior art date
Links
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 250
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 250
- 102100013078 CD47 Human genes 0.000 claims abstract description 214
- 101700033237 CD47 Proteins 0.000 claims abstract description 214
- 102100004476 SIRPA Human genes 0.000 claims abstract description 175
- 101710024246 SIRPA Proteins 0.000 claims abstract description 175
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 101
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 73
- 102100000165 MS4A1 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 101710010909 MS4A1 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 41
- 101710012053 CD274 Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102100007290 CD274 Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 102000017256 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108040009258 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000000903 blocking Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101710037934 QRSL1 Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims description 222
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims description 222
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 209
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 163
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 109
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 109
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 54
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims description 54
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims description 54
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 53
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 claims description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 23
- 101710042656 BQ2027_MB1231C Proteins 0.000 claims description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 15
- 230000035693 Fab Effects 0.000 claims description 13
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 10
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims description 8
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 6
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 claims description 6
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008334 Dermatofibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010057070 Dermatofibrosarcoma protuberans Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002030 Merkel Cell Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000587 Small Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046766 Uterine cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003793 myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 66
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 82
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 55
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 48
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 47
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 43
- GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Threonine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 40
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 37
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 33
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 33
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 31
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 30
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 30
- -1 IGF-1R Proteins 0.000 description 29
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 29
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 29
- 108010052070 ofatumumab Proteins 0.000 description 28
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 28
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 26
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 26
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 26
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 25
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 25
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 25
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 25
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 24
- 102000006355 CD47 Antigen Human genes 0.000 description 24
- 108010058590 CD47 Antigen Proteins 0.000 description 24
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 24
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 24
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 23
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 23
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 22
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 21
- 229960002450 Ofatumumab Drugs 0.000 description 21
- LZMPYSIUWPEIRA-XFXZXTDPSA-N Ofatumumab Chemical compound N1=C2C=3COCCC=3N=CC2=N\C1=C1\NOC=C1 LZMPYSIUWPEIRA-XFXZXTDPSA-N 0.000 description 21
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 21
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 21
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 20
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 20
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 20
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 20
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N pro glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 20
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 19
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 19
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 18
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 18
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 18
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 18
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 18
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 17
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 17
- RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Arginine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 17
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 17
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 17
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 16
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 16
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 16
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 16
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 16
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 16
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 16
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 15
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 15
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 15
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 15
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 15
- 108010010691 Trastuzumab Proteins 0.000 description 15
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 15
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 15
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 15
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 14
- NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102100011842 CEACAM5 Human genes 0.000 description 14
- 101710043956 CEACAM5 Proteins 0.000 description 14
- SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Aspartate Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O SSHIXEILTLPAQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 14
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 14
- WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N Thr-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N 0.000 description 14
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010072668 atezolizumab Proteins 0.000 description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 14
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 14
- MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(4-amino-1-carboxy-4-oxobutyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O MGHKSHCBDXNTHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 13
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 13
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 13
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 13
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 13
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 13
- BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N Thr-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 13
- CUTPSEKWUPZFLV-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Cysteine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Lysine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 13
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 13
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 13
- UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Serine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N (2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 12
- 102100005826 CD19 Human genes 0.000 description 12
- 101700087100 CD19 Proteins 0.000 description 12
- HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CS HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 12
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 12
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 12
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 12
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 12
- LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 12
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 media Substances 0.000 description 12
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 12
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 11
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 11
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 11
- WSDOHRLQDGAOGU-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 WSDOHRLQDGAOGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 11
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 11
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 11
- 229940003641 Rituxan Drugs 0.000 description 11
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 11
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 11
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 11
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 11
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 11
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 11
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N (2S)-1-[(2S)-2-azaniumyl-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 10
- RFCVXVPWSPOMFJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-azaniumyl-3-phenylpropanoyl)amino]-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 10
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 10
- 230000037250 Clearance Effects 0.000 description 10
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 10
- WXOFKRKAHJQKLT-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS WXOFKRKAHJQKLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 10
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 10
- VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 10
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 10
- 230000024126 agglutination involved in conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 10
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 10
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 230000035512 clearance Effects 0.000 description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 10
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 10
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 10
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 10
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 10
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 9
- RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N Cys-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 9
- 102100014519 GPNMB Human genes 0.000 description 9
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 9
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 9
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 9
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 9
- LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 9
- 108010042024 pertuzumab Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 9
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCNC(N)=N XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Asparagine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000003950 B-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 8
- UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Lysine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 8
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 8
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 8
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 8
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 8
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 8
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 8
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine zwitterion Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 8
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 8
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 8
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 8
- 101710027366 ACVRL1 Proteins 0.000 description 7
- 101710043855 ANGPT2 Proteins 0.000 description 7
- 102100007747 ANGPT2 Human genes 0.000 description 7
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- NPDLYUOYAGBHFB-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N NPDLYUOYAGBHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100001533 CA6 Human genes 0.000 description 7
- 101710040943 CA6 Proteins 0.000 description 7
- 102100000189 CD22 Human genes 0.000 description 7
- 101700020617 CD22 Proteins 0.000 description 7
- 102100000196 CD248 Human genes 0.000 description 7
- 101700053901 CD248 Proteins 0.000 description 7
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 description 7
- 102000007499 CD27 Ligand Human genes 0.000 description 7
- 102100019456 CD276 Human genes 0.000 description 7
- 101700015421 CD276 Proteins 0.000 description 7
- 102100016530 CD37 Human genes 0.000 description 7
- 101700044364 CD37 Proteins 0.000 description 7
- 102100003279 CD38 Human genes 0.000 description 7
- 101700044948 CD38 Proteins 0.000 description 7
- 102100019283 CD52 Human genes 0.000 description 7
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 7
- 102100005830 CD70 Human genes 0.000 description 7
- 101700017377 CD70 Proteins 0.000 description 7
- 102100004099 CD74 Human genes 0.000 description 7
- 101710007476 CD74 Proteins 0.000 description 7
- 101710043948 CEACAM7 Proteins 0.000 description 7
- 102100012302 CLDN6 Human genes 0.000 description 7
- 101710018272 CLDN6 Proteins 0.000 description 7
- 101710030372 CLSTN1 Proteins 0.000 description 7
- 101710038812 CS1 Proteins 0.000 description 7
- 102100002212 CXCR4 Human genes 0.000 description 7
- 101710003734 CXCR4 Proteins 0.000 description 7
- 102100015284 DKK1 Human genes 0.000 description 7
- 101700029587 DKK1 Proteins 0.000 description 7
- 102100016622 ENPP3 Human genes 0.000 description 7
- 101700054532 ENPP3 Proteins 0.000 description 7
- 102100001810 EPHA3 Human genes 0.000 description 7
- 101700041204 ERBB3 Proteins 0.000 description 7
- 102100009850 ERBB3 Human genes 0.000 description 7
- 108010055191 EphA3 Receptor Proteins 0.000 description 7
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 7
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 7
- 102100018000 FGFR2 Human genes 0.000 description 7
- 101700010580 FLO11 Proteins 0.000 description 7
- 101700036477 FOLH1 Proteins 0.000 description 7
- 102100008453 FOLH1 Human genes 0.000 description 7
- 102000010451 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 7
- 108050001931 Folate receptor alpha Proteins 0.000 description 7
- 101700040370 GPNMB Proteins 0.000 description 7
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 7
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 7
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 7
- 101700082799 IL2RA Proteins 0.000 description 7
- 102100018760 IL3RA Human genes 0.000 description 7
- 101700029869 IL3RA Proteins 0.000 description 7
- 101700015336 ISG20 Proteins 0.000 description 7
- 102100002950 ISG20 Human genes 0.000 description 7
- 101710021997 ITPRID2 Proteins 0.000 description 7
- 102100013180 KDR Human genes 0.000 description 7
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 7
- 102100013822 MSLN Human genes 0.000 description 7
- 101700047896 MSLN Proteins 0.000 description 7
- 102100006037 MUC1 Human genes 0.000 description 7
- 101700052761 MUC1 Proteins 0.000 description 7
- 102100006044 MUC16 Human genes 0.000 description 7
- 101700008449 MUC16 Proteins 0.000 description 7
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 7
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- 102100012131 NOTCH1 Human genes 0.000 description 7
- 101710036042 NOTCH1 Proteins 0.000 description 7
- 102100012126 NOTCH2 Human genes 0.000 description 7
- 101700004495 PSG2 Proteins 0.000 description 7
- 101700008337 PSMA Proteins 0.000 description 7
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 7
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 7
- 102100017640 SLAMF7 Human genes 0.000 description 7
- 101710030435 SLAMF7 Proteins 0.000 description 7
- 101710007458 SLC3A2 Proteins 0.000 description 7
- 101710015409 SLC7A5 Proteins 0.000 description 7
- 102100006692 SLC7A5 Human genes 0.000 description 7
- 101710009474 STEAP1 Proteins 0.000 description 7
- 102100006460 STEAP1 Human genes 0.000 description 7
- 102100018484 TACSTD2 Human genes 0.000 description 7
- 101710024898 TACSTD2 Proteins 0.000 description 7
- 101700039171 TEM1 Proteins 0.000 description 7
- 101710040533 TNFRSF8 Proteins 0.000 description 7
- 102100009538 TNFRSF8 Human genes 0.000 description 7
- NZCPCJCJZHKFGZ-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Glutamine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 NZCPCJCJZHKFGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010081268 Type 2 Fibroblast Growth Factor Receptor Proteins 0.000 description 7
- OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 7
- 108091007928 VEGF receptors Proteins 0.000 description 7
- WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Cysteine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101700036918 XMT1 Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 108040006856 interleukin-3 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 7
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 108010045555 obinutuzumab Proteins 0.000 description 7
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 7
- 101710029131 rpsA Proteins 0.000 description 7
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 7
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 7
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 7
- 101710041788 ygbT Proteins 0.000 description 7
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 6
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N (2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-N-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-N,1-N-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- 208000007502 Anemia Diseases 0.000 description 6
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Phenylalanine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 6
- 108010071919 Bispecific Antibodies Proteins 0.000 description 6
- 101710040446 CD40 Proteins 0.000 description 6
- 102100013137 CD40 Human genes 0.000 description 6
- 102100005175 CSF1R Human genes 0.000 description 6
- 101700063802 CSF1R Proteins 0.000 description 6
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 6
- OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- 102100004115 ICAM1 Human genes 0.000 description 6
- 108090001095 Immunoglobulin G Proteins 0.000 description 6
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 6
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 6
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- 102100000565 NECTIN4 Human genes 0.000 description 6
- 101710005664 NECTIN4 Proteins 0.000 description 6
- 101710036046 NOTCH2 Proteins 0.000 description 6
- 102100007289 PDCD1LG2 Human genes 0.000 description 6
- 101710011976 PDCD1LG2 Proteins 0.000 description 6
- 102100004940 PDGFRA Human genes 0.000 description 6
- 101710018349 PDGFRA Proteins 0.000 description 6
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100010114 SLC39A6 Human genes 0.000 description 6
- 101710017109 SLC39A6 Proteins 0.000 description 6
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 6
- UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 6
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 6
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101700068327 VTCN1 Proteins 0.000 description 6
- 102100014952 VTCN1 Human genes 0.000 description 6
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 6
- 108010081404 acein-2 Proteins 0.000 description 6
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 6
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 6
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 6
- 229960003347 obinutuzumab Drugs 0.000 description 6
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 6
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 6
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Proline Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N (2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N 0.000 description 5
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 5
- FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N Asn-His Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 5
- RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Arginine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YHDXIZKDOIWPBW-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Glutamine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O YHDXIZKDOIWPBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 5
- DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Threonine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 5
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- OGGRSJFVXREKOR-CIUDSAMLSA-N Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC OGGRSJFVXREKOR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 5
- 102100005499 PTPRC Human genes 0.000 description 5
- 101700059076 PTPRC Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 5
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 5
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 5
- PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PWIQCLSQVQBOQV-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 5
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 5
- QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 5
- BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N Tyr-Trp Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C([O-])=O)C1=CC=C(O)C=C1 BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 5
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 5
- KGNSGRRALVIRGR-UHFFFAOYSA-N gln-tyr Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KGNSGRRALVIRGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 5
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 5
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 5
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 5
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 5
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 4
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N (2S)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 4
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 2-((2,6-Dichlorophenyl)imino)imidazolidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 4
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Asparagine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 4
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 4
- CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 4
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Histidine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 4
- JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N Methionyl-Asparagine Chemical compound CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000004697 Polyetherimide Substances 0.000 description 4
- SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N Pro-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 102100016152 SIRPG Human genes 0.000 description 4
- 101700021698 SIRPG Proteins 0.000 description 4
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- FFOKMZOAVHEWET-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Cysteine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 4
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010031614 immunorphin Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 4
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 4
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 4
- ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CCC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N (2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-sulfanylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- OSASDIVHOSJVII-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Cysteine Chemical compound SCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCNC(N)=N OSASDIVHOSJVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060001251 CD34 Proteins 0.000 description 3
- 102100016492 CD34 Human genes 0.000 description 3
- WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 3
- 101700051117 FUT1 Proteins 0.000 description 3
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 3
- WRPDZHJNLYNFFT-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 WRPDZHJNLYNFFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- NTISAKGPIGTIJJ-IUCAKERBSA-N Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C NTISAKGPIGTIJJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 3
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 206010029592 Non-Hodgkin's lymphomas Diseases 0.000 description 3
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003531 Phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 3
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 108010001645 Rituximab Proteins 0.000 description 3
- 102000033172 SIRPB1 Human genes 0.000 description 3
- 101710016425 SIRPB1 Proteins 0.000 description 3
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfizole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 3
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 3
- GRQCSEWEPIHLBI-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Asparagine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 GRQCSEWEPIHLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 3
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N gly pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic Effects 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000001024 immunotherapeutic Effects 0.000 description 3
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 3
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 3
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 3
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N (2R)-2-[[(2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- INGJLBQKTRJLFO-UKJIMTQDSA-N (4S)-4-amino-5-[[(2S,3S)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O INGJLBQKTRJLFO-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino)butyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N MPZWMIIOPAPAKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N BNC210 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002216 Heart Anatomy 0.000 description 2
- 229940022353 Herceptin Drugs 0.000 description 2
- QNBYCZTZNOVDMI-HGNGGELXSA-N Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 QNBYCZTZNOVDMI-HGNGGELXSA-N 0.000 description 2
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Asparagine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 208000002154 Non-Small-Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108009000071 Non-small cell lung cancer Proteins 0.000 description 2
- 229940039551 Perjeta Drugs 0.000 description 2
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 2
- 229940066453 Tecentriq Drugs 0.000 description 2
- DXYQIGZZWYBXSD-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Proline Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DXYQIGZZWYBXSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- 231100000131 acute cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 2
- 231100000224 toxic side effect Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091007206 transmembrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 2
- OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N (+)-methoprene Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N (2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N (2S)-1-[2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N (2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N (2S)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoate Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-sulfanylpropanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-4-carboxybutanoyl)amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumyl-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2S)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-phenylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 Abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 108010026410 Ado-Trastuzumab Emtansine Proteins 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Arginine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N Arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Asparagine Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Histidine Chemical compound NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940110584 Arzerra Drugs 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Aspartyl-L-proline Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229940120638 Avastin Drugs 0.000 description 1
- 108010005144 Bevacizumab Proteins 0.000 description 1
- 210000000621 Bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 210000003679 Cervix Uteri Anatomy 0.000 description 1
- 108010022830 Cetuximab Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Phenylalanine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940082789 Erbitux Drugs 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003414 Extremities Anatomy 0.000 description 1
- 102100015541 FCGR3A Human genes 0.000 description 1
- 101710044656 FCGR3A Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091006004 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 210000003191 Femoral Vein Anatomy 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Histidine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHLZDSUANXBJHW-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Phenylalanine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHLZDSUANXBJHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101700051176 ICAM1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108090000539 Immunoglobulin Isotypes Proteins 0.000 description 1
- 102000004090 Immunoglobulin Isotypes Human genes 0.000 description 1
- 229940089787 KADCYLA Drugs 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 210000000088 Lip Anatomy 0.000 description 1
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 210000000214 Mouth Anatomy 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 210000001331 Nose Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 108010061219 Panitumumab Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N Pro-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- HXNYBZQLBWIADP-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)C(CS)NC(=O)C1CCCN1 HXNYBZQLBWIADP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 1
- 206010038038 Rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100011242 THBS1 Human genes 0.000 description 1
- 108010023469 TTI-621 Proteins 0.000 description 1
- 108060008723 TYROBP Proteins 0.000 description 1
- 102100008188 TYROBP Human genes 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Asparagine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 Thyroid Gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004291 Uterus Anatomy 0.000 description 1
- 102100015249 VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 229940058865 Vectibix Drugs 0.000 description 1
- 210000003905 Vulva Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 102000035425 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005736 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002730 additional Effects 0.000 description 1
- 229940089792 ado-trastuzumab emtansine Drugs 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal Effects 0.000 description 1
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 238000003453 ammonium sulfate precipitation method Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 108010038850 arginyl-isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000003376 axonal Effects 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 description 1
- 235000020828 fasting Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010358 genetic engineering technique Methods 0.000 description 1
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010065713 glycyl-glycyl-tyrosyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000036433 growing body Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 108010061572 ibritumomab tiuxetan Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121650 immune-checkpoint protein inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010060857 isoleucyl-valyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010089198 phenylalanyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 108010026911 ramucirumab Proteins 0.000 description 1
- 229960002633 ramucirumab Drugs 0.000 description 1
- 108091006057 receptor regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000037327 stress response Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 108010058119 tryptophyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- SIGGQAHUPUBWNF-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O SIGGQAHUPUBWNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению биспецифического рекомбинантного белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, и может быть использовано в медицине. Полученный белок, содержащий усеченный вариант SIRPα, высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо специфическое к CD20, EGFR, HER2 или PD-L1, и Fc-область, может быть использован в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 22 ил., 12 табл., 9 пр.
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Китая № CN 201710317926.7, поданной 8 мая 2017 года, и заявке на патент Китая № CN 201711269620.5, поданной 5 декабря 2017 года, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности относится к рекомбинантному белку и его применению.
Предшествующий уровень техники
С углублением исследований в области терапии рака уделяется все больше внимания исследованиям, разработке и применению молекулярных таргетных терапевтических лекарственных средств против рака. Благодаря преимуществам четкой нацеленности, минимальных побочных эффектов и заметных терапевтических эффектов лекарственные средства на основе антител быстро становятся точкой повышенного интереса таргетной терапии рака. Уже существует множество нацеливающихся на опухоль лекарственных средств на основе антитела, одобренных для клинического использования, которые достигли значительных терапевтических эффектов. Лекарственные средства на основе антитела включают в себя, например, антитела, нацеливающиеся на CD20, такие как Rituxan® (ритуксимаб, который разработан компанией Roche, представляет собой первое моноклональное антитело, одобренное для лечения рака в Соединенных Штатах Америки и изначально применяемое для лечения неходжкинской лимфомы), Zevalin® (ибритумомаба тиуксетан, который разработан компанией IDEC Pharmaceuticals, изначально одобренный для лечения низкодифференцированной неходжкинской лимфомы с устойчивостью к Rituxan® от FDA), Bexxar® (тозитумомаб и йод I131 тозитумомаб, GSK), Arzerra® (офатумумаб, GSK); антитела, нацеливающиеся на Her2, такие как Herceptin® (трастузумаб, который разработан компанией Genentech, является хорошо известным лекарственным средством для лечения рака молочной железы), Perjeta® (пертузумаб, Roche), Kadcyla® (адотрастузумаба эмтанзин, Roche); антитела, нацеливающиеся на VEGF или его рецептор, такие как Avastin® (бевацизумаб, Genentech/Roche), Cyramaza® (рамуцирумаб, Eli Lilly); антитела, нацеливающиеся на EGFR, такие как Erbitux® (цетуксимаб, который разработан компанией Eli Lilly, является одним из 10 наиболее продаваемых в мире кораковых лекарственных средств и изначально одобренным для лечения рака прямой кишки), Vectibix® (панитумумаб, который разработан компанией Amgen для лечения колоректального рака); антитела, нацеливающиеся на PD-L1, такие как Tecentriq® (атезолизумаб, Roche) (Cao Rui et al., Advances in antibody drugs for cancer targeted therapy, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2016, 36(6): 15-18).
Клинически применяемые противоопухолевые лекарственные средства на основе антитела, которые нацеливаются на опухолевые клетки (неконъюгированные голые антитела), достигают противоопухолевого эффекта главным образом благодаря двум функциям антител. Первой функцией антител является аффинность, т.е. специфическое связывание с антигеном-мишенью на поверхности опухолевых клеток и выполнение их эффекторной функции с обеспечением уничтожения опухолевых клеток. Молекулы антител могут блокировать сигнальный путь фактора роста опухолей, индуцировать апоптоз или подавлять неоваскуляризацию в микроокружении опухоли путем связывания с антигеном-мишенью. Вторая функция антител достигается посредством иммунной системы, т.e. зависит от иммунной системы, опосредующей клеточную гибель, с целью достижения эффекта уничтожения опухолевых клеток, такого как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), опосредованная константной областью антител, комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и зависимый от антител клеточный фагоцитоз (ADCP). Все больше исследований демонстрируют, что цитотоксичность опосредованного антителами иммунного ответа является важным механизмом противоопухолевой активности антител (для обзора см. Barnhart BC, et al. Role of Fc-FcγR interactions in the antitumor activity of therapeutic antibodies. Immunology и Cell Biology, 2017, 95: 340-346).
В последние годы в исследованиях подтверждено, что опухолевые клетки могут непрерывно делиться и расти, модифицируя свои собственные поверхностные антигены и изменяя микроокружение вокруг ткани опухоли, чтобы избежать надзора, распознавания и атаки врожденной иммунной системы, т.е. так называемое ускользание опухоли от иммунного ответа. Например, опухолевые клетки подавляют иммунную функцию макрофагов и значительно подавляют активность иммунных клеток путем высокой экспрессии CD47, который связывается с ингибиторным сигнальным рецепторным регуляторным белком α (SIRPα) на поверхности макрофагов. Между тем, высокая экспрессия CD47 на опухолевых клетках обеспечивает подавление опосредованного Fc-рецептором фагоцитоза, что в конечном итоге влияет на целевые противораковые терапевтические эффекты лекарственных средств на основе антитела (Willingham SB, et al. The CD47-signal regulatory protein Alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012, 109(17): 6662-6667).
CD47 представляет собой широко экспрессируемый мембранный гликопротеин, который взаимодействует с SIRPα как одновременно рецептор и лиганд и образует сигнальный комплекс CD47-SIRPα, вызывая таким образом ряд реакций, таких как апоптоз, пролиферация и иммунитет. В 2000 году Oldenborg et al. продемонстрировали, что CD47 является важным сигнальным маркером на клеточной поверхности для регуляции фагоцитоза макрофагов (Oldenborg PA, et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science, 2000, 288 (5473): 2051-2054). CD47 обеспечивает высвобождение сигнала «не ешь меня» путем связывания с SIRPα на поверхности макрофагов, фосфорилирования его иммунорецепторного ингибирующего мотива на основе тирозина (ITIM), с последующим рекрутингом SH2-содержащего белка тирозинфосфатазы 1 и запуском ряда каскадов для подавления фагоцитоза макрофагов. Более молодые красные кровяные клетки (RBC) в высокой степени экспрессируют CD47 и высвобождают сигнал «я твой союзник, не ешь меня» для макрофагов, в то время как старые RBC снижают экспрессию CD47 и в конечном итоге устраняются макрофагами.
CD47 может быть мишенью при лечении различных видов рака, поскольку он широко экспрессируется на поверхности различных раковых клеток. В модели трансплантации аллогенной опухоли мыши продемонстрирована эффективность блокады CD47, поэтому CD47 стал новой мишенью терапии на основе иммунной контрольной точки в случае рака (Vonderheide R H. CD47 blockade as another immune checkpoint therapy for cancer. Nature Medicine, 2015, 21(10): 1122-1123). Антитело к CD47, слитый белок SIRPα-Fc и т.п. могут ослаблять подавляющее действие CD47 в отношении иммунных клеток путем блокирования пути передачи сигнала CD47-SIRPα и проявлять определенную противоопухолевую активность. Однако, поскольку RBC также в высокой степени экспрессируют белок CD47, обработка антителом к CD47, которое связывается с белком CD47 с высокой аффинностью, может вызывать токсические побочные эффекты, такие как агглютинация RBC и анемия (Mccracken MN, et al. Molecular Pathways: Activating T Cells after Cancer Cell Phagocytosis from Blockade of CD47 "Don't Eat Me" Signals. Clinical Cancer Research, 2015, 21(16): 3597-3601), что очень осложняет клиническую разработку лекарственных средств на основе антитела к CD47. До сих пор не существует лекарственных средств на основе антитела к CD47, поступающих в фазу III клинических испытаний. Слитый белок SIRPα-Fc дикого типа не обладает высокой эффективностью вследствие его низкой аффинности к CD47. Некоторые исследователи получают мутанты SIRPα с тысячекратным усилением аффинности и лучшей противоопухолевой эффективностью благодаря мутациям, обеспечивающим высокую аффинность, в SIRPα дикого типа (Weiskopf K, et al. Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science, 2013, 341 (6141): 88-91). Однако еще предстоит клинически проверить, влияют ли множественные точечные мутации на безопасность, иммуногенность, стабильность и даже специфичность к мишени слитых белков у человека.
С другой стороны, исследования показали, что противоопухолевая эффективность антител к CD47 может быть значительно улучшена путем объединения с другими нацеливающимися на опухоль терапевтическими антителами, такими как комбинированное средство терапии с помощью CD47+CD20, CD47+Her2 (Chao MP, et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell, 2010, 142(5): 699-713; Zhao XW, et al. CD47-signal regulatory protein-α (SIRPα) interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011, 108(45): 18342-18347). Однако существует большая неопределенность в отношении того, можно ли выпускать на рынок антитело к CD47 и когда это делать. Кроме того, даже если антитело к CD47 будет доступно на рынке, пациентам будет все еще сложно принимать комбинированное средство терапии с помощью нацеливающихся на опухоль лекарственных средств на основе антитела по причине их высокой стоимости.
Следовательно, существует необходимость в разработке нового лекарственного средства, нацеливающегося на опухоль, которое может специфически нацеливаться на опухоль, активировать и усиливать иммунную функцию у пациентов, значительно улучшать эффективность при обеспечении безопасности и при этом снижении стоимости лекарственного препарата.
Кроме того, ввиду потенциального риска безопасности нацеливающихся на CD47 моновалентных или поливалентных антител или рекомбинантных белков (например, анемия, агглютинация RBC, цитотоксичность CD47-положительных неопухолевых клеток-мишеней), связывание человеческого SIRPα с CD47 человека является видоспецифическим, в то время как применение человеческой крови ограничено этикой и доступностью генетических ресурсов и т.д., срочно необходим способ ранней оценки иммунологической безопасности для оценки иммунологической безопасности антител или рекомбинантных белков, нацеливающихся на CD47 in vivo/in vitro.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к биспецифическому рекомбинантному белку и его применению, который может обеспечивать значительное увеличение относительного содержания рекомбинантного белка, обеспечивающее его насыщающее связывание с нацеливанием на опухоль с эффектом модулирования функции макрофагов и снижения нецелевых побочных эффектов в отношении опухоли.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическому рекомбинантному белку, где биспецифический рекомбинантный белок содержит «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» не связывается с CD47, и отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке (клетках) к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке (клетках) составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше, или любое значение между ними.
Аффинность связывания «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера «мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα», с CD47. «Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα.
В одном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит полную аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого SIRPα (дикого типа или варианта с невысокой аффинностью к CD47) или ее часть.
В одном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα. В конкретном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4): a1) SEQ ID No: 30; a2) SEQ ID No: 31; a3) SEQ ID No: 32; a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.
В одном варианте осуществления биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично, при этом «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» расположено в левом плече, а «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» расположен в правом плече; предпочтительно левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, а правое плечо является внеклеточным усеченным вариантом SIRPα. При этом термин «левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично» в настоящем документе описан в отношении традиционной «Y»-конфигурации иммуноглобулина, в данном случае левая и правая стороны биспецифического рекомбинантного белка в соответствии с настоящим изобретением имеют специфические функциональные белки, нацеливающиеся на разные мишени соответственно; такое структурное описание в основном отличается от случая, когда два специфических функциональных белка образуют структуру «вверх и вниз» путем связывания С-конца и N-конца. Следовательно, пространственные положения левого и правого плеч, описанных в настоящем изобретении, не являются конкретными ограничениями для структуры биспецифического рекомбинантного белка и служат только для того, чтобы отличить структуру двух плеч рекомбинантного белка от структуры «вверх и вниз», образованной путем связывания С-конца и N-конца, описанной выше. Следует учитывать, что когда одно плечо расположено на одной стороне, другое плечо расположено на другой стороне; очевидно, что левое и правое положения двух плеч взаимозаменяемы.
В одном варианте осуществления длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени. Предпочтительно, если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.
Предпочтительно, если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) или a2).
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» объединены посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» дополнительно содержат Fc-область. Обычно Fc-область в соответствии с настоящим изобретением содержит природную последовательность Fc-области. Однако Fc-область в соответствии с настоящим изобретением может иметь одно или более изменений или модификаций аминокислотной последовательности в природной последовательности Fc-области, таких как изменение(-ия) или модификация(-ии) аминокислотной последовательности, обеспечивающие изменение активности связывания C1q Fc-области.
В одном варианте осуществления «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» представляет собой слитый белок, включающий в себя внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания плеча, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно соединены адапторной последовательностью, и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно содержит Fc-область.
В одном варианте осуществления Fc-область в соответствии с настоящим изобретением является концептуальной, т. e., хотя она может фактически не присутствовать, конструирование антитела может быть выполнено в соответствии с аминокислотной последовательностью желаемого варианта Fc-области с получением полипептида или слитого белка, содержащего последовательность, или ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность желаемого варианта Fc-области.
В одном варианте осуществления Fc-область может представлять собой вариант Fc-области. «Вариант Fc-области», используемый в настоящем документе, относится к Fc-области с модификацией(-ями) одного или более аминокислотных остатков в природной аминокислотной последовательности Fc. Способы таких модификаций хорошо известны специалистам в данной области, включают в себя без ограничения сайт-направленный мутагенез последовательности ДНК, кодирующей Fc-область, такой как мутагенез с применением ПЦР и кассетный мутагенез, для получения варианта Fc-области. Например, один или более аминокислотных остатков Fc-области могут быть удалены с целью усиления связывания FcR. Например, в одном варианте осуществления тип вставки варианта Fc-области может быть осуществлен с изменением эффекторной функции Fc-области.
В одном варианте осуществления, например, по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, 1-2 аминокислотных остатка, обычно не более 10 аминокислотных остатков) могут быть вставлены рядом с одним или более сайтами Fc-области, которые, как определено, влияниют на связывание FcR. «Рядом» означает на расстоянии 1-2 аминокислотных остатка от сайта Fc-области, который, как определено, влияет на связывание FcR. Такие варианты Fc-области могут демонстрировать повышенное или пониженное связывание FcR и/или активность ADCC. Для получения такого типа вставки в вариантах сокристаллическая структура полипептида, содержащего область связывания FcR (такую как внеклеточный домен FcR мишени) и Fc-область, в которую аминокислотный остаток должен быть вставлен, может быть оценена для включения варианта Fc-области, обладающего, например, повышенной способностью связывания FcR. Такие вставки обычно располагаются в петле Fc-области.
В одном варианте осуществления вариант Fc-области, который опосредует зависимую от антитела опосредуемую клеткой цитотоксичность (ADCC) более эффективно и/или связывается с Fcγ-рецептором (FcγR) с более высокой аффинностью по сравнению с рекомбинантным белком, содержащим природную Fc-область, в присутствии человеческих эффекторных клеток, может быть получен путем введения соответствующей модификации аминокислотной последовательности в природную Fc-область. Вариант Fc-области в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в Fc-области. Предпочтительно объединяют множество аминокислотных модификаций. Например, вариант Fc-области может содержать 2, 3, 4, 5 или больше замен аминокислотных остатков, например, в идентифицированном специфическом сайте связывания FcR.
Природной Fc-областью предпочтительно является человеческая Fc-область, такая как природная последовательность Fc-области человеческого IgG1 (изотипа A или отличного от A), IgG2, IgG3 или IgG4.
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины». Например, «выступы-во-впадины» представляют собой выступающие «выступы», образованные с помощью мутации T366W, и полые «впадины», образованные с помощью одной аминокислотной мутации (Y407V) или трех аминокислотных мутаций (T366S, L368A и Y407V). Мутация следует схеме нумерации согласно Kabat [Eu numbering scheme of Kabat et al. (1991)] с указанием исходного аминокислотного остатка, сайта мутации и замены аминокислотного остатка соответственно слева направо, например, в T366W T представляет собой исходный аминокислотный остаток, 366 представляет собой сайт мутации, а W представляет собой аминокислотный остаток для замены Т.
В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» представляет собой полуантитело, специфическое по отношению к мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138, предпочтительно полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело; более предпочтительно гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.
В одном варианте осуществления «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4): b1) SEQ ID No: 26; b2) SEQ ID No: 27; b3) SEQ ID No: 28; b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47. Последовательность области сигнального пептида, адапторная последовательность, последовательность шарнирной области, последовательность Fc-области и/или связывающая последовательность, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно заменены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или общими последовательностями области сигнального пептида, адапторными последовательностями, последовательностями шарнирной области, последовательностями Fc-области и/или связывающими последовательностями.
В одном варианте осуществления биспецифический рекомбинантный белок содержит следующую последовательность:
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на CD20, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на EGFR, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 19 и SEQ ID No: 8, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на Her2, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 21 или SEQ ID No: 22 и SEQ ID No: 23, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28; или
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на PD-L1, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 24 и SEQ ID No: 13, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифический рекомбинантный белок. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены вместе в одной и той же нити ДНК, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены в разных нитях ДНК.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор экспрессии.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического рекомбинантного белка, предусматривающему: 1) обеспечение «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча»; 2) обеспечение «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα»; 3) приведение в контакт «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с образованием рекомбинантного белка.
В одном варианте осуществления способ получения рекомбинантного белка предусматривает обеспечение экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине, содержащей вектор экспрессии, где вектор экспрессии содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу осуществления нацеленной на опухоль терапии.
В одном варианте осуществления опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы, миелодиспластического синдрома и т.п.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением и необязательные адъювант, вспомогательное средство или фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может быть представлена в любой форме фармацевтического препарата, в том числе без ограничения инъекции, порошка, лиофилизированного порошка и т.д. Фармацевтическая композиция в форме фармацевтического препарата может быть получена согласно традиционным фармацевтическим методикам, включая смешивание смеси фармацевтически активного ингредиента, такого как рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтического носителя с образованием желаемой лекарственной формы согласно традиционным фармацевтическим методикам.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли, предусматривающему введение пациенту или субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Опухоль экспрессирует дополнительную молекулу-мишень, которая включает без ограничения 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектин-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA, CD138.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу генной терапии in vivo, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты или ее производного, кодирующих рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, пациенту или субъекту.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) обеспечение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), которые нацеливаются и обладают ADCC-активностью; b) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и c) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) получение эффекторной клетки (такой как человеческая эффекторная клетка NK92MI-CD16a); b) приведение в контакт эффекторной клетки и рекомбинантного белка/антитела; c) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании ADCC-активности.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу оценки ранней иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) сбор хорошо растущих человеческих эффекторных клеток NK92MI-CD16a, повторное суспендирование собранных эффекторных клеток до плотности клеток от 1×105 клеток/мл до 5×106 клеток/мл; b) инкубирование рекомбинантного белка/антитела при градиенте концентрации с эффекторными клетками, полученными на стадии a), в течение 0,5-5 ч; c) определение активности LDH и расчет степени лизиса клеток после завершения инкубации; и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании степени лизиса клеток, при этом рекомбинантный белок/антитело с более низкой степенью лизиса клеток характеризуется более высокой иммунологической безопасностью.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает: a) обеспечение белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47; b) обеспечение мыши Hu-NSG; c) приведение в контакт рекомбинантного белка/антитела и мыши Hu-NSG и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела у мыши Hu-NSG.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает: a) обеспечение мыши Hu-NSG; b) введение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного); c) через 24-96 ч. после введения осуществление отбора венозной крови у мыши, лизирование RBC, инкубирование оставшихся клеток и флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD45, антитела к человеческому CD19 или антитела к человеческому CD3 в течение 15-60 мин. и выявление с помощью проточной цитометрии; и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании уровня клиренса клеток, где рекомбинантные белки/антитело с более низким уровнем клиренса клеток (за исключением клеток-мишеней) характеризуются более высокой иммунологической безопасностью.
Преимущественными эффектами в соответствии с настоящим изобретением являются следующие.
Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут достигать более высокой безопасности (например, предотвращение анемии, агглютинации RBC, цитотоксичности CD47-положительных неопухолевых клеток-мишеней, вызванной антителами к CD47/рекомбинантными белками (такими как Hu5F9-G4), снижение угрозы в отношении потенциальной безопасности, иммуногенности, стабильности и других неопределенных аспектов, что обеспечивается высокоаффинными мутантами слитого белка SIRPα-Fc и т.д.) за счет «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», который снижает связывание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с CD47 на неопухолевых клетках (таких как RBC, NK-клетки, T-клетки и т.д.).
Согласно настоящему изобретению неожиданно обнаружено, что аффинность связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с опухолевыми клетками может быть значительно улучшена с помощью «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с опосредованием тем самым эффективного уничтожения опухолевых клеток (в том числе без ограничения эффекторной функции антител при специфическом связывании с антигеном-мишенью на поверхности опухолевых клеток, нацеленного фагоцитоза макрофагов).
Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать эффект двойных мишеней за счет «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» (такого как без ограничения полуантитело) и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», и результаты в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением проявляют противоопухолевые эффекты посредством ряда механизмов с помощью нескольких функций «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с достижением тем самым более высокой эффективности.
По сравнению с комбинированным средством терапии на основе двух отдельных нацеливающихся антител, рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обладают такими преимуществами, как более низкая стоимость и более удобное использование, и, таким образом, могут обеспечивать решение проблемы плохого соблюдения пациентом режима лечения и высокой стоимости, связанных с комбинированной терапией на основе антител.
Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обладают более высокой проницаемостью в ткани и эффективностью, чем классические биспецифические антитела (состоящие из двух полуантител), поскольку «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» имеет меньшую молекулярную массу, чем одно плечо классических биспецифических антител (полуантитело).
«Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» в соответствии с настоящим изобретением включает в себя внеклеточные усеченные варианты SIRPα различной длины, которые можно быстро оптимизировать для спаривания с «высокоаффинным нацеливающимся на опухоль плечом» (таким как полуантитело), что тем самым позволяет избежать ситуации, когда одновременное связывание традиционных бифункциональных антител с двумя антигенами-мишенями может зависеть от пространственной структуры двух антигенов-мишеней (в частности, когда сайты распознавания антител двух антигенов-мишеней сильно отличаются по расстоянию до клеточной мембраны, сложно одновременно связывать как нацеливающий на опухоль антиген, так и антиген CD47), и обеспечивает улучшенное связывание полученных рекомбинантных белков с опухолевыми клетками и лучшее уничтожение опухолевых клеток.
Настоящее изобретение относится к новому способу оценки безопасности иммунотерапевтических лекарственных средств, нацеливающихся на CD47 in vitro. Традиционное проведение ранней оценки безопасности антител к CD47 обычно выполняют путем определения эффекта лекарственных средств в отношении агглютинации RBC. Ввиду видоспецифического связывания человеческого SIRPα с человеческим CD47 кровь человека следует использовать при оценке того, обладает ли рекомбинантный белок/антитело, нацеливающиеся на CD47, проблему безопасности в отношении агглютинации RBC в организме человека, однако применение человеческой крови ограничено этикой и доступностью генетических ресурсов. Кроме того, эксперименты по агглютинации RBC не могут быть применены для ранней оценки иммунологической безопасности лекарственных средств. В настоящем изобретении применяется оптимизированный способ определения ADCC-активности (эксперименты по ранней оценке in vitro иммунологической безопасности) вместо традиционного эксперимента с применением агглютинации RBC человека для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков/антител (в том числе моновалентных или поливалентных), которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью. Способ является простым, быстрым и не ограничен ресурсами крови.
Настоящее изобретение относится к новому способу in vivo оценки безопасности иммунотерапевтических лекарственных средств, нацеливающихся на CD47. При доклинической оценке in vivo иммунологической безопасности лекарственных средств обычно используются отличные от человека приматы, что требует большего количества образца и, следовательно, увеличивает сложность и стоимость ранней подготовки образца. Пока еще не существует готового способа ранней оценки иммунологической безопасности на других видах in vivo, что влечет за собой большие риски безопасности в будущих клинических исследованиях и растрате инвестиций в исследование и разработку. Настоящее изобретение относится к мыши Hu-NSG, при этом эксперимент по ранней оценке безопасности, выполняемый на Hu-NSG, может имитировать условие безопасности лекарственного средства в иммунной системе человека, обеспечить снижение сложности и стоимости препарата, получить преимущества, заключающиеся в низкой стоимости выявления и высокой эффективности выявления, а также обеспечить снижение риска в исследовании и разработке иммунных терапевтических лекарственных средств против рака по сравнению с доклиническими или клиническими исследованиями.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным белкам, которые достигают высокой аффинности и специфической нацеливаемости на опухоль посредством «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и блокирования взаимодействия CD47-SIRPα с помощью «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».
Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают решение технических проблем, связанных с низким выходом и трудностями очистки продукта, характерных для традиционных бифункциональных антител. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в случае рекомбинантных белков, имеющих одноцепочечный белок в качестве правого плеча (мутация Fc по типу выступа), если все из легкой цепи левого плеча, тяжелой цепи левого плеча (мутация Fc по типу впадины) и правого плеча (мутация Fc по типу выступа) экспрессированы в клетках, более чем 80% экспрессируемых продуктов составляют белки-мишени при очистке с помощью белка A, то выход экспрессируемого продукта эффективно повышается. Хотя имеется небольшое количество димеров левого плеча, димеров правого плеча, мономера левого плеча и мономера правого плеча, они существенно отличаются от желаемого продукта по таким свойствам, как молекулярная масса, распределение заряда, и, таким образом, могут быть легко удалены традиционными способами очистки, такими как ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография, способ высаливания (такой как способ осаждения сульфатом аммония), поэтому способ в соответствии с настоящим изобретением подходит для получения в промышленных масштабах.
«Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» в соответствии с настоящим изобретением и «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» (такое как без ограничения полуантитело) обычно способны образовывать рекомбинантный белок, который способен обеспечивать антагонистическое действие в отношении иммуносупрессивного эффекта CD47.
Настоящее изобретение обсепечивает преодоление недостатков низкой фармакологической эффективности слитых белков SIRPα-Fc из известного уровня техники вследствие их низкой аффинности к CD47 и предотвращение неблагоприятных эффектов вследствие высокой иммуногенности и высокой специфичности в отношении неопухолевых мишеней высокоаффинных вариантов SIRPα. Между тем, рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением обладает слабой аффинностью связывания с CD47, экспрессируемым на поверхности нормальных клеток (таких как RBC), поэтому побочные эффекты, такие как агглютинация RBC и анемия, вызванные лечением традиционными антителами к CD47, могут быть уменьшены или устранены.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что объем настоящего изобретения не должен быть неправомерно ограничен одним определенным техническим решением настоящего изобретения, которое может достигать одного определенно выраженного или подразумеваемого полезного эффекта в соответствии с настоящим изобретением, но не может достигать или полностью достичь другого полезного эффекта. Специалистам в данной области должно быть понятно, что любой продукт, способ или применение в объеме настоящего изобретения считается решающим техническую проблему настоящего изобретения и достигающим соответствующего технического эффекта, поскольку он достигает любого из явных или подразумеваемых полезных эффектов настоящего изобретения или их произвольную комбинацию.
В частности, настоящее изобретение относится к следующим вариантам осуществления.
Вариант осуществления 1. Биспецифический рекомбинантный белок, где биспецифический рекомбинантный белок содержит «нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».
Вариант осуществления 2. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 1, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα (в том числе внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα дикого типа или его вариант с невысокой аффинностью по отношению к CD47).
Вариант осуществления 3. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 2, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит всю аминокислотную последовательность внеклеточного домена SIRPα или ее часть.
Вариант осуществления 4. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-3, где «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» не связывается с CD47, и отношение аффинности связывания, характеризующего антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6.
Вариант осуществления 5. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-4, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4):
a1) SEQ ID No: 30;
a2) SEQ ID No: 31;
a3) SEQ ID No: 32;
a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.
Вариант осуществления 6. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-5, где биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично, при этом «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» расположено в левом плече, а «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» расположен в правом плече.
Вариант осуществления 7. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 6, где левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, правое плечо представляет собой внеклеточный усеченный вариант SIRPα.
Вариант осуществления 8. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 7, где длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени.
Вариант осуществления 9. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 8, где если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).
Вариант осуществления 10. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-9, где нацеливающееся на опухоль плечо является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.
Вариант осуществления 11. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 10, где, если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) и a2).
Вариант осуществления 12. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-11, где «нацеливающееся на опухоль плечо» связывается со «слитым белком, блокирующим взаимодействие между CD47 и SIRPα» посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.
Вариант осуществления 13. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-12, где «нацеливающееся на опухоль плечо» и/или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» дополнительно содержат Fc-область.
Вариант осуществления 14. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 13, где Fc-область содержит природную последовательность Fc-области или неприродную последовательность Fc-области.
Вариант осуществления 15. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 14, где Fc-область является человеческой Fc-областью.
Вариант осуществления 16. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 15, где «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины».
Вариант осуществления 17. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-16, где «нацеливающееся на опухоль плечо» представляет собой полуантитело, специфическое по отношению к мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138, предпочтительно полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело; более предпочтительно гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.
Вариант осуществления 18. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-17, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания плеча, при этом внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно соединены адапторной последовательностью, связывающая последовательность для связывания плеча необязательно содержит Fc-область.
Вариант осуществления 19. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-18, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4):
b1) SEQ ID No: 26;
b2) SEQ ID No: 27;
b3) SEQ ID No: 28;
b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47.
Вариант осуществления 20. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 19, где, если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на CD20, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26; если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на EGFR, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 19 и SEQ ID No: 8, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28; если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на Her2, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 21 или SEQ ID No: 22 и SEQ ID No: 23, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26 или SEQ ID No: 27; или если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на PD-L1, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 24 и SEQ ID No: 13, и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26.
Вариант осуществления 21. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20.
Вариант осуществления 22. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 21, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены на одной и той же нити ДНК, или представлены на отдельных нитях ДНК.
Вариант осуществления 23. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по вариантам осуществления 21 или 22.
Вариант осуществления 24. Клетка, содержащая вектор экспрессии по варианту осуществления 23.
Вариант осуществления 25. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка, предусматривающий:
1) обеспечение «нацеливающегося на опухоль плеча»;
2) обеспечение «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα»;
3) приведение в контакт «нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с образованием рекомбинантного белка.
Вариант осуществления 26. Способ по варианту осуществления 25, где обеспечивают экспрессию рекомбинантного белка в клетке по варианту осуществления 24.
Вариант осуществления 27. Способ по варианту осуществления 25, где приведение в контакт предусматривает связывание посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.
Вариант осуществления 28. Способ по любому из вариантов осуществления 25-27, где приведение в контакт предусматривает связывание посредством методики «выступов-во-впадины».
Вариант осуществления 29. Слитый белок, где слитый белок содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания другого полипептида.
Вариант осуществления 30. Слитый белок по варианту осуществления 29, где связывающая последовательность для связывания другого полипептида необязательно представляет собой Fc-область; необязательно Fc-область содержит мутацию(-и) по типу впадин и/или мутацию(-и) по типу выступов.
Вариант осуществления 31. Слитый белок по вариантам осуществления 29 или 30, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит всю аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого SIRPα дикого типа или его высокоаффинного варианта или ее часть.
Вариант осуществления 32. Слитый белок по варианту осуществления 31, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4):
a1) SEQ ID No: 30;
a2) SEQ ID No: 31;
a3) SEQ ID No: 32;
a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.
Вариант осуществления 33. Слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-31, где слитый белок выбран из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4):
b1) SEQ ID No: 26;
b2) SEQ ID No: 27;
b3) SEQ ID No: 28;
b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47.
Вариант осуществления 34. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 29-33.
Вариант осуществления 35. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 34.
Вариант осуществления 36. Клетка, содержащая вектор экспрессии по варианту осуществления 35.
Вариант осуществления 37. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 29-33, где способ предусматривает:
1) обеспечение внеклеточного усеченного варианта SIRPα;
2) обеспечение связывающей последовательности для связывания другого полипептида;
3) приведение в контакт внеклеточного усеченного варианта SIRPα и связывающей последовательности для связывания другого полипептида с образованием биспецифического рекомбинантного белка.
Вариант осуществления 38. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 29-33, где способ предусматривает обеспечение экспрессии биспецифического рекомбинантного белка в клетке по варианту осуществления 32.
Вариант осуществления 39. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-33 и необязательные адъювант, вспомогательное средство или фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант осуществления 40. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 39, которая находится в форме инъекции или лиофилизированного порошка.
Вариант осуществления 41. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-33, и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант осуществления 42. Применение слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в получении рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20.
Вариант осуществления 43. Применение рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли.
Вариант осуществления 44. Применение по варианту осуществления 43, где опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы, миелодиспластического синдрома и т.п.
Вариант осуществления 45. Применение рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в изготовлении лекарственного препарата для генной терапии in vivo.
Вариант осуществления 46. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает:
a) обеспечение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), который нацеливается и обладает ADCC-активностью;
b) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и
c) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела.
Вариант осуществления 47. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает:
a) получение эффекторной клетки, например, без ограничения человеческой эффекторной клетки NK92MI-CD16a;
b) приведение в контакт эффекторной клетки и рекомбинантного белка/антитела;
c) выявление ADCC активности рекомбинантного белка/антитела и
d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании ADCC-активности.
Вариант осуществления 48. Способ по варианту осуществления 47, предусматривающий:
a) сбор хорошо растущих человеческих эффекторных клеток NK92MI-CD16a, повторное суспендирование собранных эффекторных клеток до плотности клеток от 1×105 клеток/мл до 5×106 клеток/мл;
b) инкубирование рекомбинантного белка/антитела при градиенте концентрации с эффекторными клетками, полученными на стадии a), в течение 0,5-5 часов;
c) определение активности LDH и расчет степени лизиса клеток после завершения инкубирования; и
d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании степени лизиса клеток, при этом рекомбинантный белок/антитело с более низкой степенью лизиса клеток характеризуется более высокой иммунологической безопасностью.
Вариант осуществления 49. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает:
a) обеспечение белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47;
b) обеспечение мыши Hu-NSG;
c) приведение в контакт рекомбинантного белка/антитела и мыши Hu-NSG; и
d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела у мыши Hu-NSG.
Вариант осуществления 50. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает:
a) обеспечение мыши Hu-NSG;
b) введение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного);
c) через 24-96 часов после введения осуществление отбора венозной крови у мыши, лизирование RBC, инкубирование оставшихся клеток и флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD45, антитела к человеческому CD19 или антитела к человеческому CD3 в течение 15-60 мин. и выявление с помощью проточной цитометрии; и
d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании уровня клиренса клеток, где рекомбинантные белки/антитело с более низким уровнем клиренса клеток (за исключением клеток-мишеней) характеризуются более высокой иммунологической безопасностью.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показана структура вставки в соответствии с настоящим изобретением, вставляемой в вектор экспрессии.
На фиг. 2 показана плазмидная карта иллюстративного вектора экспрессии pCHO-TE2 в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 3 показана структура иллюстративного варианта осуществления рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 4A-4B показана электрофореграмма SDS-PAGE рекомбинантных белков, очищенных с помощью белка A. Дорожки 1-6 на фиг. 4A показывают образцы в восстанавливающих условиях, где 1: маркер; 2: mAb к CD20 (офатумумаб); 3: mAb к CD47 (Hu5F9-G4); 4: D1 SIRPα-Fc; 5: Ofa-Fc1-D1-Fc2; 6: Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. Дорожки 7-12 на фиг. 4A показывают образцы в невосстанавливающих условиях, где 7: маркер; 8: mAb к CD20 (офатумумаб); 9: mAb к CD47 (Hu5F9-G4); 10: D1 SIRPα-Fc; 11: Ofa-Fc1-D1-Fc2; 12: Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. Дорожка 1 на фиг. 4B: образец в невосстанавливающих условиях Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2; дорожка 2 на фиг. 4B: маркер; дорожка 3 на фиг. 4B: образец в восстанавливающих условиях Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2.
На фиг. 5 показаны результаты выявления с помощью ELISA аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с человеческим CD47 (белковый уровень).
На фиг. 6 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с человеческим CD47 (клеточный уровень).
На фиг. 7 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с мишенью, соответствующей левому плечу. Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc относятся к средней интенсивности флуоресценции после связывания образцов Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc с клетками Raji, которые не блокированы антителом к CD47 Hu5F9-G4(Fab)2. Hu5F9-G4 (b), Ofa-Fc1-D1-Fc2(b) и D1 SIRPα-Fc(b) относятся к средней интенсивности флуоресценции после связывания Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc с клетками Raji, которые блокированы антителом к CD47 Hu5F9-G4(Fab)2.
На фиг. 8 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с клетками, экспрессирующими как CD47, так и мишень, соответствующую левому плечу. Фиг. 8A соответствует клеткам Raji (CD20+CD47); фиг. 8B соответствует клеткам SKBR-3 (Her2+CD47); фиг. 8C соответствует клеткам A431 (EGFR+CD47); фиг. 8D соответствует клеткам NCI-H441 (PD-L1+CD47).
На фиг. 9 показаны результаты ELISA конкурентного связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с SICRα D1-Fc и антител к CD47 с CD47.
На фиг. 10 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением и их высокоаффинных вариантов с CD47, антител к CD47 и антител к CD20 с человеческим CD47.
На фиг. 11 показаны результаты анализа оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением in vitro.
На фиг. 12 показаны результаты фармакодинамического анализа рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением на мышиной модели NSG подкожно трансплантированной лимфомы Raji.
На фиг. 13 показаны результаты выявления содержания B-клеток через 96 часов после обработки мышей Hu-NSG различными образцами при одной и той же дозе. При этом фиг. 13A соответствует 0,9% физиологическому солевому раствору; фиг. 13B соответствует Hu5F9-G4 (6,7 мкг/мышь); фиг. 13C соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5 мкг/мышь).
На фиг. 14 показаны результаты анализа ранней оценки иммунологической безопасности Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Ofa-Fc1-D1m-Fc2 у мышей Hu-NSG (анализ FACS типов иммунных клеток) in vivo. Фиг. 14A-D соответствуют Ofa-Fc1-D1-Fc2 (1 мкг/мышь), при этом на фиг. 14A и 14B показаны результаты выявления перед введением, а на фиг. 14C и 14D показаны результаты выявления через 72 часа после введения. Фиг. 14E-H соответствуют Ofa-Fc1-D1m-Fc2 (1 мкг/мышь), при этом на фиг. 14E и фиг. 14F показаны результаты выявления перед введением, на фиг. 14G и фиг. 14H показаны результаты выявления через 72 часа после введения.
На фиг. 15 показан анализ иммунофенотипирования с помощью FACS через 96 часов после обработки мышей Hu-NSG различными образцами при высокой дозе. На фиг. 15A-B показаны результаты через 96 часов после введения, при этом фиг. A соответствует Hu5F9-G4 (200 мкг/мышь), а фиг. 15B соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 при высокой дозе (150 мкг/мышь). На фиг. 15C-D показаны результаты через 14 часов после введения, при этом фиг. 15С соответствует Hu5F9-G4 (200 мкг/мышь), а фиг. 15D соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 при высокой дозе (150 мкг/мышь).
На фиг. 16 показаны результаты связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с двойными мишенями (Her2, CD47) в SKBR-3. На фиг. 16A показаны результаты выявления антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2; и на фиг. 16B показаны результаты выявления антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2.
На фиг. 17A-E показаны аминокислотные последовательности и последовательности ДНК, соответствующие иллюстративным белкам в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 18A показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении числа RBC яванских макаков при двух дозах; на фиг. 18B показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении гемоглобина яванских макаков при двух дозах.
На фиг. 19 показаны результаты выявления Ofa-Fc1-D1-Fc2 по содержанию B-клеток яванских макаков при двух дозах.
На фиг. 20 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении роста подкожных ксенотрансплантатов человеческой В-клеточной лимфомы Daudi.
На фиг. 21 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении массы тела несущих опухоль мышей.
На фиг. 22 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении подкожных ксенотрансплантатов человеческой В-клеточной лимфомы Daudi.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Для обеспечения понимания настоящего изобретения оно будет иллюстрировано с помощью ссылки на некоторые примеры и некоторые специфические термины, описанные ниже. Однако следует учитывать, что эти конкретные примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, любые изменения и дополнительные модификации описанных примеров, а также любые дополнительные пути применения настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области.
Рекомбинантный белок
Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный белок» относится к белку, который искусственно создан методом генной инженерии/сконструирован, а не к встречающемуся в природе белку. «Рекомбинантный», содержащийся в термине «рекомбинантный белок» в соответствии с настоящим изобретением, не обозначает способ получения и используется исключительно для указания того, что «рекомбинантный белок» не встречается в природе. Рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением может быть экспрессированным белком, а может быть собранным белком.
Необязательно биспецифический рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением содержит «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».
Используемый в настоящем документе термин «высокоаффинное нацеливание на опухоль» относится к тому, что аффинность связывания рекомбинантного белка в соответствии с настоящим изобретением с опухолью выше или по существу эквивалентна аффинности связывания связывающихся с опухолью лекарственных средств на основе антител из известного уровня техники с опухолью, при этом аффинность связывания связывающихся с опухолью лекарственных средств на основе антител из известного уровня техники с опухолью обычно имеет EC50 на уровне нМ или пМ. Предпочтительно отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше или любое значение между ними. Необязательно в рекомбинантном белке в соответствии с настоящим изобретением отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера SIRPα-Fc, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше или любое значение между ними.
При использовании в настоящем документе «низкая аффинность для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» относится к тому, что рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением способен блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPα с низкой аффинностью. Предпочтительно аффинность связывания «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с CD47 не превышает аффинность связывания «гомодимера мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα» с CD47. Более предпочтительно аффинность его связывания не превышает аффинность связывания гуманизированного слитого белка SIRPα-Fc с CD47.
Биспецифический рекомбинантный белок, описанный в настоящем документе, может значительно увеличивать относительное содержание рекомбинантного белка, обеспечивающее его насыщающее связывание с нацеливанием на опухоль, с эффектом модулирования функции макрофагов и снижения нецелевых побочных эффектов в отношении опухоли, при условии, что отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα с CD47» на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6.
Способ выявления аффинности связывания, применяемый в настоящем документе, хорошо известен специалистам в данной области, в том числе без ограничения ELISA и/или проточная цитометрия.
Необязательно слитый белок внеклеточного усеченного варианта сигнального регуляторного белка альфа α (в том числе усеченного варианта дикого типа и его невысокоаффинного варианта) и Fc, описанный в настоящем изобретении, и полуантитело могут образовывать гетеродимер за счет модификации тяжелой цепи антитела, в частности, могут быть гетеродимеризированы с помощью «выступов-во-впадины», и/или посредством межцепочечной дисульфидной связи, и/или солевой связи с образованием рекомбинантного белка.
Необязательно, если «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» и «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc» гетеродимеризированы с помощью «выступов-во-впадины» с образованием рекомбинантного белка, то структура полученного рекомбинантного белка такая, как показано на фиг. 3. При этом левое плечо представляет собой нацеливающееся на опухоль полуантитело, в том числе без ограничения полуантитело к 5T4, полуантитело к AGS-16, полуантитело к ALK1, полуантитело к ANG-2, полуантитело к B7-H3, полуантитело к B7-H4, полуантитело к c-fms, полуантитело к c-Met, полуантитело к CA6, полуантитело к CD123, полуантитело к CD19, полуантитело к CD20, полуантитело к CD22, полуантитело к EpCAM, полуантитело к CD30, полуантитело к CD32b, полуантитело к CD37, полуантитело к CD38, полуантитело к CD40, полуантитело к CD52, полуантитело к CD70, полуантитело к CD74, полуантитело к CD79b, полуантитело к CD98, полуантитело к CEA, полуантитело к CEACAM5, полуантитело к CLDN18.2, полуантитело к CLDN6, полуантитело к CS1, полуантитело к CXCR4, полуантитело к DLL-4, полуантитело к EGFR, полуантитело к EGP-1, полуантитело к ENPP3, полуантитело к EphA3, полуантитело к ETBR, полуантитело к FGFR2, полуантитело к FN, полуантитело к FR-α, полуантитело к GCC, полуантитело к GD2, полуантитело к GPC-3, полуантитело к GPNMB, полуантитело, антитело к HER2, полуантитело, антитело к HER3, полуантитело к HLA-DR, полуантитело к ICAM-1, полуантитело к IGF-1R, полуантитело к IL-3R, полуантитело к LIV-1, полуантитело к MSLN, полуантитело к MUC16, полуантитело к MUC1, полуантитело к NaPi2b, полуантитело к нектина-4, полуантитело к Notch 2, полуантитело к Notch 1, полуантитело, антитело к PD-L1, полуантитело, антитело к PD-L2, полуантитело, антитело к PDGFR-α, полуантитело к PS, полуантитело к PSMA, полуантитело к SLTRK6, полуантитело к STEAP1, полуантитело к TEM1, полуантитело к VEGFR, полуантитело к CD25, полуантитело к CD27L, полуантитело к DKK-1, полуантитело к CSF-1R, полуантитело к MSB0010718C, полуантитело к BCMA, полуантитело к CD138. Правое плечо представляет собой слитый белок, образованный путем соединения внеклеточного усеченного варианта SIRPα (в том числе человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта), а также шарнирной области и Fc-области антитела IgG. Если Fc-область правого плеча является мутантом по типу «впадины», то соответствующая Fc-область левого плеча является мутантом по типу «выступа»; или если правое плечо является мутантом по типу «выступа», то соответствующая Fc-область левого плеча является мутантом по типу «впадины». Как известно специалистам в данной области, Fc-область также может содержать множество мутаций по типу «впадин» и/или «выступов» одновременно.
В таблице 1 показана конфигурация молекул иллюстративных рекомбинантных белков.
Таблица 1. Молекулы иллюстративных рекомбинантных белков
Примечание: D1m представляет собой высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта D1 SIRPα; D1 представляет собой внеклеточный D1 домен человеческого SIRPα дикого типа или его невысокоаффинного мутанта; Fc представляет собой Fc-область дикого типа; Fc1 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию по типу «впадины» или «впадин», Fc2 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию по типу «выступа» или «выступов».
Соответствующая аминокислотная последовательность и последовательность ДНК рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением показаны на фиг. 17A-E и в файле перечня последовательностей в соответствии с настоящим изобретением.
Антитело
Используемый в настоящем документе термин «антитело» или «иммуноглобулин» представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин приблизительно 150000 дальтон, обладающий сходной структурной особенностью, состоящий из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (H). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью ковалентной дисульфидной связью(-ями), в то время как число межцепочечных дисульфидных связей тяжелых цепей варьируется в различных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.
Нацеливающееся на опухоль плечо
Используемые в настоящем документе термины «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» относятся к гетеродимерному гликопротеину, состоящему из легкой цепи (L) и тяжелой цепи (H) антитела, что является основной структурой молекулы иммуноглобулина, и данные термины могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Его молекулярная масса равняется половине молекулярной массы соответствующего антитела, приблизительно 75000 дальтон, при этом легкая цепь связана с тяжелой цепью ковалентной дисульфидной связью. Тяжелая и легкая цепь также имеют регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.
Используемые в настоящем документе термины «нацеливающееся на опухоль плечо», «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» могут представлять собой белок IgG, нацеливающийся на различные опухоли. Молекулы-мишени включают в себя без ограничения 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектин-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.
Последовательность Fc «нацеливающегося на опухоль плеча», «полуантитела», или «левого плеча», или «структуры полуантитела», или «молекулярного мономера Ig» может предусматривать мутацию по типу «впадины» или «впадин» и/или мутацию по типу «выступа» или «выступов».
CD47-нацеливающееся плечо
Используемые в настоящем документе термины «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Как известно специалистам в данной области, «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок, блокирующий взаимодействие между CD47 и SIRPα» характеризуются варьирующей длиной молекулы. Необязательно «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок, блокирующий взаимодействие между CD47 и SIRPα» с множеством различных длин молекулы могут быть образованы путем связывания внеклеточного усеченного варианта SIRPα (в том числе человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта) с шарнирной областью и Fc-областью антитела IgG1. IgG1 может быть человеческим IgG1.
Fc из «CD47-нацеливающегося плеча», или «правого плеча», или «слитого белка усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» предусматривать мутацию по типу «впадины» или «впадин» и/или мутацию по типу «выступа» или «выступов».
Как известно специалистам в данной области, «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» и «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» могут образовывать гетеродимерный рекомбинантный белок путем модификации фрагмента (области) Fc. В частности, рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи. Необязательно рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением получают с помощью методики «выступов-во-впадины».
Методика «выступы-во-впадины»
Используемый в настоящем документе термин «методика выступы-во-впадины» или «выступы-во-впадины» означает применение методик генной инженерии для индуцирования различных мутаций в двух доменах CH3 тяжелой цепи с обеспечением тем самым гетеродимеризации тяжелой цепи. В данной технологии «выступ» выполняется на одной тяжелой цепи, а «впадина» выполняется на другой тяжелой цепи, затем две тяжелые цепи преимущественно соединяют вместе с образованием асимметричного антитела (Ridgway JB, et al. Методика конструирования «выступов-во-впадины» доменов CH3 антитела для гетеродимеризации тяжелых цепей. Protein Engineering, 1996, 9(7): 617-621). Как известно специалистам в данной области, множество «выступов» и/или «впадин» могут быть выполнены на одной тяжелой цепи, и, соответственно, множество «впадин» и/или «впадины» также могут быть выполнены на другой тяжелой цепи.
SIRPα
Используемый в настоящем документе термин «SIRPα» означает сигнальный регуляторный белок α, также известный как CD172a. Сигнальный регуляторный белок (SIRP) является трансмембранным гликопротеином, включающим в себя трех представителей семейства, SIRPα (CD172a), SIRPβ (CD172b) и SIRPγ (CD172g). Эти три представителя имеют сходную внемембранную область и отличающуюся внутримембранную область. Внемембранная область содержит три подобных иммуноглобулину (Ig) области, из которых первая область принадлежит области IgV, а вторая и третья области принадлежат области IgC. Внутримембранная область SIRPα (CD172a) содержит два ингибирующих сигнальных домена, которые передают ингибирующий сигнал и подавляют соответствующую функцию клетки. Внутримембранная область SIRPβ (CD172b) и SIRPγ (CD172g) является короткой и не имеет области передачи сигнала, но SIRPβ (CD172b) может передавать сигнал активации посредством адапторного белка (такого как DAP12). Белки SIRP главным образом экспрессируются в макрофагах (Mϕ), дендритных клетках (DC) и нейронных клетках. Это конкретно относится к человеческому SIRPα дикого типа и его мутанту с невысокой аффинностью в отношении CD47.
Внеклеточный усеченный вариант SIRPα
Термин «внеклеточный усеченный вариант» используют в отношении белка, который обладает трансмембранной функцией. Используемый в настоящем документе «внеклеточный усеченный вариант SIRPα» относится ко всей аминокислотной последовательности внемембранной области человеческого SIRPα дикого типа и его мутанта с невысокой аффинностью по отношению к CD47, которая была избирательно усечена, или ее части.
Используемые в настоящем документе термины «D1», «D2» и «D3» относятся к трем подобным Ig внеклеточным доменам SIRPα, которые последовательно представляют собой домен D1 (подобный вариабельной области Ig домен, область IgV), домен D2 (подобный константной области Ig домен, область IgC) и домен D3 (подобный константной области Ig домен, область IgC), начиная от N-конца белка (Lee WY, et al. The Role of cis Dimerization of Signal Regulatory Protein α (SIRPα) in Binding to CD47. J Biol Chem, 2010, 285 (49): 37953-37963).
Слитый белок SIRPα-Fc
Используемый в настоящем документе термин «слитый белок SIRPα-Fc» относится к слитому белку, содержащему внеклеточный усеченный вариант SIRPα, адапторную последовательность и Fc-область. Адапторная последовательность и/или Fc-область, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно замещены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными адапторными последовательностями и/или Fc-областями.
Во избежание влияния гликозилирования в соответствии с настоящим изобретением осуществляют мутацию замены аспарагина на аланин в D1 (Reference: Lee WY, et al. Novel Structural Determinants on SIRP α that Mediate Binding to CD47. Journal of Immunology, 2007, 179(11): 7741-7750).
D1, D2 и D3 в соответствии с настоящим изобретением также включают в себя соответствующую адапторную последовательность.
Адапторная последовательность
Используемый в настоящем документе термин «адапторная последовательность» относится к аминокислотной последовательности, соединяющей внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность, адапторная последовательность необязательно является шарнирной областью антитела IgG, необязательно содержащего шарнирную область и домен CH1 тяжелой цепи IgG. Адапторная последовательность или последовательность шарнирной области, содержащаяся в упомянутых выше последовательностях, может быть произвольно замещена согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными адапторными последовательностями или последовательностями шарнирной области.
Связывающая последовательность
Используемый в настоящем документе термин «связывающая последовательность» относится к последовательности, которая связывает «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» с «белком слияния с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», при этом связывающая последовательность необязательно содержит шарнирную область и Fc-область; более необязательно Fc-область содержит мутацию(-ии) по типу «выступа» или «выступов» и/или мутацию(-ии) по типу «впадины» или «впадин». Связывающая последовательность, последовательность шарнирной области или последовательность Fc-области, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно замещены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными связывающими последовательностями, последовательностями шарнирной области или последовательностями Fc-области.
CD47
CD47 представляет собой трансмембранный гликопротеин, принадлежащий суперсемейству иммуноглобулинов и экспрессируемый на клеточной поверхности почти всех клеток, в том числе RBC. Лиганды для CD47 включают в себя интегрин, тромбоспондин-1 и сигнальный регуляторный белок (SIRP). CD47 обладает рядом биологических функций, в том числе клеточной миграции, активации Т-клеток, активации дендритных клеток, аксонального развития и т.п. Кроме того, CD47 может подавлять фагоцитоз макрофагов путем взаимодействия с SIRPα. Таким образом, CD47 передает так называемый сигнал «не ешь меня», который защищает нормальные клетки, такие как RBC, B-клетки и T-клетки, от фагоцитоза макрофагами.
Ofa
Используемые в настоящем документе термины «Ofa», «офатумумаб» и «антитело к CD20 (офатумумаб)» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD20 офатумумабу.
Obi
Используемые в настоящем документе термины «Obi», «обинутузумаб» и «антитело к CD20 (обинутузумаб)» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD20 обинутузумабу.
Hu5F9-G4
Используемые в настоящем документе термины «mAb к CD47», «антитело к CD47» и «Hu5F9-G4» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD47 Hu5F9-G4.
mAb к EGFR
Используемые в настоящем документе термины «mAb к EGFR» и «JMT101» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к EGFR JMT101. JMT101 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к EGFR, см. BA03 в патентном документе ZL201210406288.3.
Трастузумаб
Используемые в настоящем документе термины «трастузумаб», «Трастузумаб», «mAb к Her2(T)» и «герцептин» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к Her2 трастузумабу.
Пертузумаб
Используемые в настоящем документе термины «патезумаб», «пертузумаб», «mAb к Her2(Р)» и «перьета» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к Her2 пертузумабу.
Атезолизумаб
Используемые в настоящем документе термины «тецентрик» и «атезолизумаб» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к PD-L1 атезолизумабу.
D1 SIRPα-Fc
Используемые в настоящем документе термины «D1 SIRPα-Fc» и «D1-Fc» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к димеру одноцепочечного слитого белка SIRPα. D1-Fc.
Ofa-Fc1
Ofa-Fc1 относится к полуантителу офатумумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».
Антитело-к-Her2(T)-Fc1
Антитело-к-Her2(T)-Fc1 относится к полуантителу трантузумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».
Антитело-к-Her2(P)-Fc1
Антитело-к-Her2(P)-Fc1 относится к полуантителу пертузумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».
Антитело-к-EGFR-Fc1
Антитело-к-EGFR-Fc1 относится к полуантителу к EGFR, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».
D1-Fc2
D1-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченный домен D1 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область, имеющую мутацию по типу «выступа».
D1-D2-Fc2
D1-D2-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченные домены D1 и D2 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область с мутацией по типу «выступа».
D1-D2-D3-Fc2
D1-D2-D3-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченные домены D1, D2 и D3 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область с мутацией по типу «выступа».
Лечение
Используемые в настоящем документе термины «осуществление лечения», «терапия» и «лечение» используются взаимозаменяемо. Термин «осуществление лечения» включает в себя контроль прогрессирования заболевания, нарушения и состояния, а также связанных симптомов, предпочтительно снижение или ослабление влияния одного или более симптомов заболевания, нарушения и состояния. Данный термин включает излечение заболевания или полное устранение симптома. Данный термин включает ремиссию симптома. Данный термин также включает без ограничения не излечивающее паллиативное лечение. Термин «осуществление лечения» включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, для предотвращения или замедления, ослабления или облегчения прогрессирования заболевания, нарушения, состояния или влияния одного или более симптомов заболевания, нарушения и состояния.
Введение
Используемый в настоящем документе термин «введение» относится к доставке терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, субъекту. Введение может быть системным или местным. Введение может быть выполнено с помощью устройства доставки, такого как шприц. Способ введения включает без ограничения заливку, втягивание носом, распыление, инъецирование и т.п. Путь введения включает в себя ингаляционное, интраназальное, пероральное, внутривенное, подкожное или внутримышечное введение и т.п.
Таблица 2-1. Соответствие между названием последовательности и номером последовательности
Таблица 2. Соответствие между рекомбинантными белками и последовательностями
Пример 1. Конструкция вектора экспрессии
На основании разработанной молекулярной структуры аминокислотные последовательности каждого компонента подвергали сплайсингу вместе. В соответствии с предпочтительностью в отношении кодонов у китайских хомячков (Cricetulus griseus) разрабатывали оптимальную кодирующую последовательность ДНК и исключали сайты распознавания рестрикции эндонуклеазой для последующего применения в операции клонирования генов. Затем последовательно добавляли сайт клонирования, последовательность Козака и последовательность, кодирующую сигнальный пептид, на 5'-конце последовательности и последовательно добавляли стоп-кодон и сайт клонирования на 3'-конце последовательности, как показано на фиг. 1.
Осуществляли синтез всего гена и весь ген направленно клонировали между соответствующими сайтами клонирования вектора экспрессии pCHO-TE2 (приобретенного у Thermo Fisher) с применением сайтов клонирования на 5'-конце и 3'-конце. После проверки правильности последовательности получали плазмиду экспрессии. Все сайты клонирования, применяемые на 5'-конце и 3'-конце, являются сайтами EcoRV и PacI соответственно. На фиг. 2 показана карта плазмиды вектора экспрессии pCHO-TE2.
Пример 2. Получение плазмиды экспрессии, клеточная трансфекция, экспрессия и очистка белка-мишени
Получение плазмиды экспрессии
Исходный раствор в глицерине без бактерий, содержащий плазмиду экспрессии (1 мл раствора Escherichia coli, содержащего плазмиду экспрессии, тщательно смешивали с 0,5 мл 60% стерилизованного раствора глицерина) инокулировали в жидкую среду LB при отношении 1:1000. Через 16 часов культивирования на шейкере при 37°C, 220 об/мин, бактерии собирали центрифугированием. Плазмиду экспрессии получали с применением наборов для получения плазмид без эндотоксина (DP117, приобретенных у Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) согласно стандартной процедуре, представленной в инструкциях к набору.
Трансфекция клеток и экспрессия белка
После того как полученную плазмиду экспрессии фильтровали через микрофильтрационную мембрану 0,22 мкм 3 мг раствора плазмиды (где продукт представлял собой типичную молекулу антитела, а соотношение плазмид экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи составляло 1:1 (молярное соотношение), при этом продукт представлял собой рекомбинантный белок, соотношение плазмид экспрессии легкой цепи, тяжелой цепи и правого плеча составляло 1:1:1 (молярное соотношение), как показано в таблице 3), пипеткой вносили в 50 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I (приобретенной у GIBCO), затем тщательно перемешивали. Переносили 6 мг полиэфиримидного реагента для трансфекции (PEI, приобретенного у Polysciences, растворенного в стерильной сверхчистой воде в концентрации 1 мг/мл) в 50 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I, затем тщательно перемешивали. Полученный раствор PEI добавляли в раствор среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I, содержащий плазмиду, и тщательно перемешивали. Обеспечивали отстаивание смеси плазмиды и PEI при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем медленно и равномерно добавляли в 1 л суспензии клетки-хозяина CHO-S (приобретенной у Thermo Fisher) с плотностью клеток 3×106 клеток/мл. Клетки культивировали в инкубаторе, содержащем 5% CO2, при 37°C. Через 4 часа к ним добавляли питательную среду (питательную среду получали путем растворения 80 г CD Efficient Feed C AGT (приобретенной у Gibco) и 75 г 5×00483 (приобретенной у Kerry) в 1 л воды) объемом, эквивалентным 7% от начального объема. Температуру культуры понижали до 33°C и клетки собирали после 6 дней культивирования. Клеточную суспензию центрифугировали при 10000 g, 10°C, в течение 30 минут и использовали надосадочную жидкость (т.e. раствор после сбора клеточной культуры) для очистки белка-мишени.
Очистка белка
В следующем способе использовали Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера с применением белка A для аффинного захвата продукта.
Упомянутый выше раствор после сбора клеточной культуры центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин для удаления клеток и их фрагментов, затем загружали в колонку для аффинной хроматографии с белком A (№ по каталогу 17-5438-02, GE Healthcare) и элюировали для сбора белка-мишени. Чистоту белка-мишени определяли с помощью SDS-PAGE.
Способ очистки с помощью белка A является традиционным способом очистки белка, хорошо известным специалистам в данной области, и подробная процедура исследования может относиться к описанию продукта белка A GE Healthcare и справочнику по очистке антител GE.
Теоретическая молекулярная масса четырех белков D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2 и Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 составляет 37,8 кДа, 110,7 кДа, 121,7 кДа и 131,4 кДа соответственно. Результаты SDS-PAGE показаны на фиг. 4A и фиг. 4B.
Электрофорез белка (SDS-PAGE): Результаты показывают (фиг. 4A и фиг. 4B), что белки-мишени в каждой дорожке эффективно экспрессированы и очищены, при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 11), Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 1) и Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 12) демонстрируют разные степени содержания димера левого плеча (Ofa-Fc1-Ofa-Fc1), димера правого плеча (SIRPα-Fc2) и/или мультимера.
Таблица 3. Соотношение плазмиды экспрессии
Примечание: D1m представляет собой высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта D1 SIRPα; D1 представляет собой внеклеточный домен D1 человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта; Fc представляет собой Fc-область дикого типа; Fc1 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию(-ии) по типу «впадины» или «впадин», и Fc2 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию(-ии) по типу «выступа» или «выступов».
Пример 3. Определение аффинности, активности конкурентного связывания с мишенью
1. Способ выявления аффинности мишеней CD47, CD20, EGFR и Her2
Аффинность связывания рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1m-D2-Fc и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и CD20 определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на CD20.
Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и Her2 определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на Her2.
Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и EGFR определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на EGFR.
Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и PD-L1 определяли с помощью ELISA. При использовании антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на PD-L1.
Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 к мишени CD47 с помощью ELISA
Планшет для ELISA (№ по каталогу 9018, Corning) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл CD47-His (12283-H08H-200, Sino Biological) и помещали при 4°C в течение ночи. Планшет промывали раствором PBST (PBS, содержащим 0,1% Tween 20), а затем блокировали с помощью PBS + 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания 100 мкл разбавленного Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (2,5-кратные серийные разведения, начиная от 1000 нг/мл, 11 разведений) добавляли в каждую лунку покрытого планшета, затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C. После отбрасывания образца и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли 100 мкл разбавленного мышиного антитела к человеческому Fc IgG-HRP (1:10000) (Ab7499, abcam), затем инкубировали при 25°C в течение 1 часа. После отбрасывания раствора и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли TMB (P0209, Beyotime), обеспечивали протекание реакции в планшете и защищали его от света в течение приблизительно 20 минут. Реакцию останавливали с помощью H2SO4 и считывали значение OD при 450-650 нм на устройстве для считывания микропланшетов.
Результаты исследования продемонстрировали, что все антитела к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1m-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, были способны связываться с CD47; аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с CD47 была слегка слабее, чем аффинность связывания антитела к CD47 Hu5F9-G4 и/или D1 SIRPα-Fc с CD47.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически нацеливаться на антиген CD47 на опухолевых клетках на белковом уровне, и их аффинность связывания с CD47 не превышает аффинность связывания слитого белка D1 SIRPα-Fc с CD47. Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать снижение побочных эффектов или избежание побочных эффектов, таких как агглютинация RBC, анемия, вызванная лечением с помощью антитела к CD47, и/или уничтожение неопухолевых клеток-мишеней, вызванное лечением с помощью высокоаффинного мутанта SIRPα (Petrova PS, et al. TTI-621 (SIRPα Fc): A CD47-Blocking Innate Immune Checkpoint Inhibitor with Broad Antitumor Activity and Minimal Erythrocyte Binding. Clin Cancer Res, 2017, 23(4): 1068-1079).
Например, как показано на фиг. 5, за исключением того, что антитело к CD20 офатумумаб и антитело к EGFR JMT101 не могут связываться с CD47, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, OFa-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, были способны связываться с CD47. Однако аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (EC50 = 52,57 нг/мл, EC50 = 93,86 нг/мл), у которого только правое плечо может связываться с антигеном CD47, меньше, чем у антитела к CD47 (EC50 = 5,439 нг/мл) и D1 SIRPα-Fc (EC50 = 6,118 нг/мл).
Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении мишени CD47 с помощью ELISA и проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки A431 (человеческая эпидермальная раковая клетка) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS (приобретенным у Gibco). Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 9 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5-кратных серийных разведений, начиная от 15000 нг/мл, всего 9 концентраций) и инкубировали в холодильнике при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку клетки A431 не экспрессируют антиген CD20 и не могут связываться с офатумумабом и обинутузумабом, клетки A431 могут быть использованы для проведения оценки аффинности связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc с CD47 на клеточном уровне.
Результаты исследования продемонстрировали, что за исключением того, что антитела к CD20 офатумумаб и обинутузумаб не могут связываться с клетками A431, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, были способны связываться с клетками A431. Аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с CD47 была слегка слабее, чем аффинность связывания антитела к CD47 и/или D1 SIRPα-Fc с CD47, что соответствует тенденции данных ELISA.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически нацеливаться на антиген CD47 на опухолевых клетках на белковом уровне, и аффинность связывания с CD47 не превышает аффинность связывания слитого белка D1 SIRPα-Fc с CD47. Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать снижение побочных эффектов или избежание побочных эффектов, таких как агглютинация RBC, анемия, вызванная лечением с помощью антитела к CD47, и/или уничтожение неопухолевых клеток-мишеней, вызванное лечением с помощью высокоаффинного мутанта SIRPα.
Например, как показано на фиг. 6, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc и Ofa-Fc1-D1-Fc2, были способны связываться с клетками A431. В частности, аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 слегка слабее таковой антитела к CD47 и/или D1 SIRPα-Fc, что соответствует тенденции данных ELISA.
Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении мишени CD20 с помощью проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки Raji (человеческой B-клеточной лимфомы, приобретенные в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 100 мкл PBS + 2% FBS (контрольная группа) или 1,5 мкг/мл антитела к CD47 Hu5F9-G4 (Fab)2 (группа обработки) (вырезание Fc пепсином, набор Thermo Fisher, 44988) и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли 7 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc (4-кратные серийные разведения, начиная от 6250 нг/мл, всего 7 разведений, и молярная концентрация после превращения показана на фиг. 7) соответственно, а затем инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Результаты исследования продемонстрировали, что антитело к CD47, Hu5F9-G4(Fab)2, эффективно блокировало связывание антитела к CD47, Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc с CD47 в клетках Raji. Однако эффект блокирования Hu5F9-G4(Fab)2 в отношении антигена CD47 не значительно подавлял связывание Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi Fc1-D1-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с клетками Raji.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что в случае если антиген CD47 на поверхности опухолевых клеток экранируется и связывание с SIRPα-CD47 блокируется, то рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением все еще способны специфически связываться с соответствующим антигеном на опухолевых клетках посредством левого плеча, и на аффинность левого плеча не влияет в значительной степени блокирование связывания правого плеча.
Например, как показано на фиг. 7, антитело к CD47, Hu5F9-G4(Fab)2, эффективно блокирует связывание антитела к CD47, Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc с CD47 на клетках Raji. Однако блокирующий эффект Hu5F9-G4(Fab)2 в отношении антигена CD47 незначительно подавляет связывание Ofa-Fc1-D1-Fc2 с клетками Raji, что указывает на то, что Ofa-Fc1-D1-Fc2 все еще способен специфически связываться с антигеном CD20 на клетках Raji с помощью своего левого плеча (полуантитела к CD20) после блокирования взаимной комбинации SIRPα-CD47, и на аффинность не влияет в значительной степени блокирование связывания правого плеча.
Определение активности биспецифического связывания с мишенями CD20 и CD47 с помощью проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки Raji (человеческой B-клеточной лимфомы, приобретенные в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, офатумумаба, Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc (50000 нг/мл, 25000 нг/мл, 6250 нг/мл и 4-кратные серийные разведения, начиная от 6250 нг/мл, всего 12 разведений, и молярная концентрация после превращения показана на фиг. 8A) соответственно, и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку на поверхности клеток Raji одновременно экспрессируются антигены CD20 и CD47, все антитела к CD20 офатумумаб, обинутузумаб, антитело к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками Raji, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу.
Результаты исследования продемонстрировали, что Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками Raji и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с антителами к CD20 офатумумабом, обинутузумабом, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют существенное преимущество в количестве молекул в среде с одинаковой перенасыщенной концентрацией белка. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания антитела к CD20 и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками, в среде с одинаковой сверхнасыщенной концентрацией белка.
Таблица 4. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC50 (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками Raji
Например, как показано на фиг. 8A и в таблице 4, все из антитела к CD20 офатумумаба, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками Raji, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции являются разными; при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками Raji и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивностью флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрации белка количество молекул Ofa-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками Raji, существенно превышает количество молекул антитела к CD20 офатумумаба, или антитела к CD47 Hu5F9-G4, или D1 SIRPα-Fc, превышает сумму молекул антитела к CD20 офатумумаба или антитела к CD47 Hu5F9-G4 и превышает сумму молекул антитела офатумумаба и D1 SIRPα-Fc.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с комбинированным средством терапии на основе антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.
Определение биспецифической активности связывания с мишенями Her2 и CD47 с помощью проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки SKBR-3 (человеческая клетка рака молочной железы, приобретенная в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 10 разведений антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, трастузумаба или Hu5F9-G4 (4-кратных серийных разведений, начиная от 433,2 нМ, всего 10 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку на поверхности клеток SKBR-3 одновременно экспрессируются антигены Her2 и CD47, все из антител к Her2 трастузумаба, пертузумаба, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции различны.
Результаты исследования продемонстрировали, что антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками SKBR-3 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка по сравнению с антителами к Her2 трастузумабом, пертузумабом, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания антитела к Her2 и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками, в среде с одинаковой сверхнасыщенной концентрацией белка.
Таблица 5. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC50 (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками SKBR-3
Например, как показано на фиг. 8В и в таблице 5, и антитело к Her2 трастузумаб, и антитело к CD47 Hu5F9-G4 способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу; при этом антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками SKBR-3 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрацией белка количество молекул антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками SKBR-3, существенно превышает количество молекул антитела к Her2 трастузумаба или антитела к CD47 Hu5F9-G4 и превышает сумму молекул антитела к Her2 трастузумаба и антитела к CD47 Hu5F9-G4.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.
Определение биспецифической активности связывания с мишенями EGFR и CD47 с помощью проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки A431 (человеческая эпидермальная раковая клетка, приобретенная в Институте основных медицинских наук, Академия медицинских наук Китая) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 11 серийных разведений антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, JMT101, D1 SIRPα-Fc или Hu5F9-G4 (4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 11 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку на поверхности клеток A431 одновременно экспрессируются антигены EGFR и CD47, все из антитела к EGFR JMT101, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками A431, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции различны.
Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками A431 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка по сравнению с антителом к EGFR JMT101, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания соответствующего антитела к EGFR и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка.
Таблица 6. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC50 (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками A431
Например, как показано на фиг. 8C и в таблице 6, все из антитела к EGFR JMT101, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками A431, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу; и EC50 (JMT101) = 0,598 нМ, EC50 (D1 SIRPα-Fc) = 3,677 нМ, EC50 (Hu5F9-G4) = 0,865 нМ. Можно видеть, что аффинность связывания JMT101 с клетками A431 более чем в 6 раз превышает аффинность связывания D1 SIRPα-Fc с клетками A431. При этом антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками A431 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка количество молекул антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками A431, существенно превышает количество молекул антитела к EGFR JMT101, или D1 SIRPα-Fc, или антитела к CD47 Hu5F9-G4, а также превышает сумму молекул антитела к EGFR JMT101 и D1 SIRPα-Fc.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.
Определение биспецифической активности связывания с мишенями PD-L1 и CD47 с помощью проточной цитометрии
2×107 клеток NCI-H441 (человеческая клетка аденокарциномы легкого, приобретенных у BeinaChuanglian Biotechnology Research Institute Co., Ltd, Пекин) стимулировали с помощью 10 нг/мл hIFN-γ (BD, № по каталогу 554616), затем расщепляли, собирали, подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 или атезолизумаба (433,2 нМ, 216,6 нМ, 4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 12 концентраций) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку на поверхности клеток NCI-H441 одновременно экспрессируются антигены PD-L1 и CD47, все из антитела к PD-L1 атезолизумаба, 13G4, 12A4, антитела к CD47 Hu5F9-G4, SIRPαD1-Fc способны специфически связываться с клетками NCI-H441.
Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками NCI-H441 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.
Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с антителом к PD-L1 атезолизумабом, 13G4 и 12A4 способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка. Например, в среде с одинаковой перенасыщенной концентрацией белка рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением связываются в большей степени с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул, чем антитело к PD-L1 атезолизумаб.
Таблица 7. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC50 (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками NCI-H441
Например, как показано на фиг. 8D и в таблице 7, антитело к PD-L1 атезолизумаб способно специфически связываться с клетками NCI-H441; при этом антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками NCI-H441 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрации белка количество молекул антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками NCI-H441, существенно превышает количество молекул антитела к PD-L1 атезолизумаба. EC50 (атезолизумаб) = 0,2006 нМ, EC50 (D1 SIRPα-Fc) = 1,643 нМ, EC50 (Hu5F9-G4) = 0,3865 нМ. Можно видеть, что аффинность связывания атезолизумаба с клетками NCI-H441 более чем в 6 раз превышает аффинность связывания D1 SIRPα-Fc с клетками NCI-H441.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.
2. Определение активности конкурентного связывания с мишенью
В следующем способе используют Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера с применением ELISA для определения активности конкурентного связывания с мишенями CD47 и SIRPα.
Определение активности конкурентного связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 с помощью ELISA
Планшет для ELISA (9018, Corning) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл CD47-His (12283-H08H-200, Sino Biological) и помещали при 4°C в течение ночи. Планшет промывали с помощью PBST, а затем блокировали с помощью PBS + 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания аликвотировали 100 мкл смеси разбавленного Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (3-кратные серийные разведения, начиная от 1000 нг/мл, всего 11 разведений) и меченного биотином D1 SIRPα-Fc (набор для мечения биотином, 21925, Thermo, концентрация для добавления составляла 100 нг/мл) в каждую лунку покрытого планшета, затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C. После отбрасывания образца и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли 100 мкл разбавленного стрептавидин-HRP (1:10000) (ML-0437P-HRP, ZI501-1, Yanyu Chemical Reagent Co., Ltd), затем инкубировали при 25°C в течение 1 часа. После отбрасывания раствора и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли TMB (P0209, Beyotime), обеспечивали протекание реакции в планшете в течение приблизительно 20 минут и помещали в недоступное для света место. Реакцию останавливали с помощью H2SO4 и считывали значение OD при 450-650 нм на устройстве для считывания микропланшетов.
Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны конкурировать с меченным биотином D1 SIRPα-Fc за связывание с антигеном CD47 с различной степенью, проявляя активность конкурентного связывания.
Например, как показано на фиг. 9, все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, OFa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 способны конкурировать с меченным биотином D1 SIRPα-Fc за связывание с антигеном CD47, проявляя активность конкурентного связывания; при этом способность к конкурентному связыванию у Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 с CD47 слабее, чем таковая у антитела к CD47 Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc соответственно, что согласуется с результатами исследований в отношении аффинности, описанных в упомянутых выше примерах.
Пример 4. Проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков in vitro
Раннее исследование иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1m-Fc2 в качестве примера следующий способ подходит для рекомбинантных белков, содержащих высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече.
Раннее исследование иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ подходит для рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.
Определение специфического связывания биспецифических антител с мишенью CD47 до и после осуществления мутации в правом плече с помощью проточной цитометрии
Клетки NCI-H441 (человеческая клетка аденокарциномы легкого, приобретенная у BeinaChuanglian Biotechnology Research Institute Co., Ltd, Пекин) расщепляли, собирали, подсчитывали, центрифугировали, а затем повторно суспендировали до концентрации 3×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Hu5F9-G4 или офатумумаба (433,2 нМ, 216,6 нМ, 4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 12 концентраций) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому IgG Fc-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Таблица 8. Специфическое связывание биспецифических антител с мишенью CD47 до и после осуществления мутации в правом плече с помощью проточной цитометрии
Например, как показано на фиг. 10 и в таблице 8, за исключением того, что антитело к CD20 офатумумаб не способно связываться с CD47, все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Ofa-Fc1-D1m-Fc2 способны связываться с CD47, и аффинность связывания Ofa-Fc1-D1m-Fc2 (EC50 = 0,529 нМ) с клетками NCI-H441 выше, чем у OFa-Fc1-D1-Fc2 (EC50 = 8,68 нМ), где D1m представляет собой высокоаффинный мутант в области D1 SIRPα (т.e. Seq ID No: 10 в CN106519036A).
In vitro анализ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков
(1) Получение суспензии человеческих эффекторных клеток
Хорошо растущие человеческие эффекторные клетки NK92MI-CD16a со стабильной и высокой экспрессией CD16a (приобретенные у Huabo Biotech Co., Ltd) центрифугировали (201 g, 5 мин) с отбрасыванием надосадочной жидкости и повторно суспендировали в 5 мл основной среды (без фенолового красного) MEM (приобретенной у Gibco, 51200-038). После подсчитывания клеточную суспензию доводили до плотности клеток 2,4×106 клеток/мл основной средой MEM (без фенолового красного), которую применяли в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.
(2) Инкубация эффекторных клеток и антител
Аликвотировали 50 мкл основной среды MEM (без фенолового красного) в каждую лунку 96-луночного черного планшета с прозрачным дном, затем 25 мкл каждого разведения биспецифического антитела Ofa-Fc1-D1-Fc2 или Ofa-Fc1-D1m-Fc2 аликвотировали в каждую лунку планшета, соответственно, в двух повторностях. Добавляли 25 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученную на стадии (1) (60000 клеток/лунка). После тщательного перемешивания биспецифическое антитело Ofa-Fc1-D1-Fc2 или Ofa-Fc1-D1m-Fc2 характеризовалось конечной серийной концентрацией (4-кратные серийные разведения, начиная от 433,2 нМ, всего 10 разведений). Обеспечивали реагирование смеси при 37°C в течение 5,5 часа, затем добавляли буфер для лизиса (полученный из набора Promega, G7891) в контрольную группу и инкубировали в течение 0,5 часа.
(3) Выявление ADCC-активности
После инкубации непокрытый планшет помещали в безопасное помещение и охлаждали естественным путем до комнатной температуры в течение приблизительно 15 минут. 100 мкл реакционного раствора субстрата LDH (полученного из набора Promega, G7891), уравновешенного при комнатной температуре в течение 30 минут, аликвотировали в каждую лунку планшета, осторожно перемешивали, а затем инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Немедленно добавляли 50 мкл стоп-раствора (полученного из набора Promega, G7891) в каждую лунку и тщательно перемешивали, затем определяли значение флуоресценции на устройстве для считывания микропланшетов.
Результаты исследования продемонстрировали, что ADCC-положительные рекомбинантные белки и/или антитела, нацеливающиеся на CD47, приводили к взаимному уничтожению NK-клеток вследствие экспрессии антигена CD47 на NK-клетках. Поэтому, по сравнению с Ofa-Fc1-D1m-Fc2, или Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-EGFR -Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, каждое из которых содержало высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα, рекомбинантный белок Ofa-Fc1-D1-Fc2, или Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, или Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или Obi-Fc1-D1-Fc2, или Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, или Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 существенно снижали токсические побочные эффекты, вызванные NK-клетками, в по меньшей мере 1000 раз благодаря своей слабой аффинности в отношении CD47.
Например, как показано на фиг. 11, если концентрация антитела/рекомбинантного белка достигала 10-1 нМ, то начинался клеточный лизис, и если концентрация антитела/рекомбинантного белка достигала 103 нМ, то степень лизиса клеток достигала 15,25% в группе обработки Ofa-Fc1-D1m-Fc2, тогда как клеточный лизис не наблюдали в группе обработки Oba-Fc1-D1-Fc2 при концентрации 103 нМ.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, обладающие ADCC-активностью и низкой аффинностью в отношении антигена CD47, имеют более высокую иммунологическую безопасность.
Как известно специалистам в данной области, упомянутых выше результаты исследования указывают на то, что оптимизированный способ выявления ADCC-активности (т. e. анализ ранней оценки иммунологической безопасности in vitro), описанный в настоящем изобретении, можно применять для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков (в том числе моновалентных или поливалентных) или антител (в том числе моновалентных или поливалентных), нацеливающихся на CD47 и обладающих ADCC-активностью. Способ является простым, быстрым и не ограничен ресурсами крови.
Пример 5. Подавление роста опухолевых клеток с помощью рекомбинантного белка in vivo
Подавление роста опухолевых клеток с помощью рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vivo. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для выявления рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.
Самцам мышей NSG (приобретенным у Beijing Idmo Co., Ltd) подкожно инокулировали клетки Raji B-клеточной лимфомы человека. После того, как объем опухоли достигал 80 мм3 - 150 мм3, мышей делили на 2 следующие группы (6 мышей на группу, в каждой группе мышей внутрибрюшинно вводили данные средства): 1) контрольная группа, получавшая среду-носитель (Tris-цитрат, pH 6,5); 2) группа, получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 (150 мкг/мышь); дважды в неделю в течение 2 недель. Наблюдали рост опухоли и измеряли объем опухоли перед введением (0 день) и в 3ий день, 5ый день, 7ой день, 10ый день, 12ый день и 14ый день после введения для проведения оценки противоопухолевого эффекта Ofa-Fc1-D1-Fc2.
Результаты исследования продемонстрировали, что в модели мыши NSG с подкожно трансплантированной лимфомой Raji рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 блокировали путь передачи сигнала CD47-SIRPα и, таким образом, активировали нацеленный фагоцитоз макрофагами и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), опосредованный макрофагами, с демонстрацией тем самым значительного эффекта подавления опухоли.
Например, как показано на фиг. 12, на оси абсцисс представлено время (дни) от момента получения мышами NSG с подкожно трансплантированной лимфомой Raji обработки лекарственным средством, а на оси ординат представлен объем опухоли (мм3). На фиг. 12 показано, что после периода обработки лекарственным средством Ofa-Fc1-D1-Fc2 получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа демонстрировала тенденцию значительного подавления опухоли по сравнению с контрольной группой, получавшей среду-носитель, и степень подавления опухоли у получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группы в 14ый день достигала 63,14%.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с антигеном-мишенью, так и с антигеном CD47 на опухолевых клетках, могут достигать значительного эффекта подавления опухоли у мышей NSG с подкожно трансплантированными опухолевыми клетками.
Пример 6. Анализ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков in vitro
Раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1m-Fc2, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1m-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для рекомбинантных белков, содержащих высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече.
Раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для выявления рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.
Поскольку B-клетки в высокой степени экспрессируют антиген CD20, в данном эксперименте оценивали уничтожение опухолевых клеток путем определения содержания B-клеток. В анализе ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков, нацеливающихся на другой опухолевый антиген и антиген CD47, in vitro экспериментальным мышам в данном примере нужно было подкожно трансплантировать соответствующие опухолевые клетки.
Специфический эффект нацеливания на опухоль
Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34+ HSC отбирали и делили на следующие 3 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая 0,9% солевой раствор контрольная группа; 2) получавшая Hu5F9-G4 группа (6,7 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (5 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 96 часов после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном соотношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец подвергали выявлению с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD).
Результаты исследования продемонстрировали, что, если мышам Hu-NSG вводили одну и ту же дозу Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитела к CD47 Hu5F9-G4, то через 96 часов после введения Ofa-Fc1-D1-Fc2 обеспечивал преимущественный клиренс B-клеток, экспрессирующих антиген CD20 (т. e. клетки-мишени), тогда как антитело к CD47 Hu5F9-G4 обеспечивало преимущественный клиренс нецелевых клеток с высокой относительной интенсивностью экспрессии CD47 (таких как T-клетки) по причине своей высокой аффинности в отношении антигена CD47.
Например, как показано на фиг. 13, получавшая антитело к CD47 Hu5F9-G4 группа (фиг. 13B) демонстрировала существенное выведение нецелевых клеток с высокой относительной интенсивностью экспрессии CD47 (таких как T-клетки) по сравнению с получавшей 0,9% нормальный солевой раствор группой (фиг. 13A) (доля B-клеток (т.e. клеток-мишеней с антигеном CD20) среди всех выявляемых клеток повышалась от 40,9% до 73,5% через 96 часов после введения); тогда как получавшая рекомбинантный белок Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (фиг. 13C) демонстрировала существенный клиренс В-клеток (т.e. клеток-мишеней с антигеном CD20) по сравнению с получавшими 0,9% нормальный солевой раствор (фиг. 13A), т.e. Ofa-Fc1-D1-Fc2 обеспечивал преимущественный клиренс B-клеток через 96 часов после введения (доля B-клеток среди всех выявляемых клеток снижалась от 40,9% до 3,7% через 96 часов после введения).
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с антигеном CD47, обеспечивают преимущественный клиренс клеток и/или опухолевых клеток с нацеливающим на опухоль антигеном в условиях одной и той же дозы.
Иммунологическая безопасность при низкой дозе
Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34+ HSC отбирали и делили на следующие 2 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (1 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1m-Fc2 группа (1 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 72 часов после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном отношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец от получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группы (1 мкг/мышь) выявляли с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD), и образец от получавшей Ofa-Fc1-D1m-Fc2 группы (1 мкг/мышь) выявляли с помощью проточного цитометра (NovoCyte™ 3130, ACEA).
Результаты исследования продемонстрировали, что в случае если мышам Hu-NSG вводили рекомбинантные белки при низкой дозе, то через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 клетки-мишени, которые экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо, (такие как опухолевые клетки), в значительной степени были устранены, тогда как клетки, которые не экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо (такие как T-клетки, другие иммунные клетки), не подвергались существенному влиянию; однако через 72 часа после однократного введения рекомбинантного белка, содержащего высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα, Ofa-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1m-Fc2, или антитела к EGFR -Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1m-D2-Fc2, хотя целевые клетки, которые экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо, (такие как опухолевые клетки), в значительной степени устранялись, клетки, которые не экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) также устранялись в значительной степени.
Например, как показано на фиг. 14, через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2B (фиг. 14C, фиг. 14D) B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) в значительной степени были устранены (почти полностью устранены), тогда как клетки, которые на экспрессировали антиген CD20 (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) не подвергались существенному влиянию по сравнению с состоянием до введения (фиг. 14A, фиг. 14B). Через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1m-Fc2 (фиг. 14G, фиг. 14H) по сравнению с состоянием до введения (фиг. 14E, фиг. 14F), несмотря на то, что B-клетки (клетки-мишени с антигеном CD20) в значительной степени были устранены, клетки, которые не экспрессировали антиген CD20 (T-клетки и другие иммунные клетки), также в значительной степени были устранены.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты указывают на то, что рекомбинантные белки, содержащие внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече, обладают более высоким эффектом специфического нацеливания на опухоль и демонстрируют более высокую иммунологическую безопасность, чем рекомбинантные белки, содержащие высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече, при одной и той же дозе.
Восстановление иммунитета при высокой дозе
Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34+ HSC отбирали и делили на следующие 2 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая Hu5F9-G4 группа (200 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (150 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 4 дня и 14 дней после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном отношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец подвергали выявлению с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD).
Результаты исследования продемонстрировали, что в случае если мышам Hu-NSG вводили рекомбинантные белки при высокой дозе, то через 96 часов после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 или антитела к CD47 Hu5F9-G4 B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) и нецелевые клетки (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) были устранены в значительной степени в каждой группе. Через 14 дней после введения в получавших Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 группах B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) все еще находились в состоянии устранения, тогда как другие нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) в значительной степени восстанавливались; однако в получавшей антитело к CD47 Hu5F9-G4 группе ни B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), ни нецелевые клетки, экспрессирующие CD47, не восстанавливались.
Например, как показано на фиг. 15, через 96 часов после введения высокой дозы антитела к CD47 Hu5F9-G4 (фиг. 15A) или Ofa-Fc1-D1-Fc2 (фиг. 15B) и B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), и нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) устранялись в значительной степени; но через 14 дней после введения B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) все еще находились в состоянии устранения, тогда как нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки), в отличие от B-клеток (клетка-мишень с антигеном CD20), в значительной степени восстанавливались в получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группе (фиг. 15D); однако ни B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), ни нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) не проявляли признака восстановления в получавшей антитело к CD47 Hu5F9-G4 группе (фиг. 15C).
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с антигеном CD47, характеризуются более высокой иммунологической безопасностью, поскольку нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как иммунные клетки, например, T-клетки) могут быть восстановлены при обработке высокой дозой данных рекомбинантных белков.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что способ ранней оценки иммунологической безопасности in vitro, описанный в настоящем изобретении, можно применять для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков (в том числе моновалентных или поливалентных) или антител (в том числе моновалентных или поливалентных).
Пример 7. Влияние различных усечений на аффинность связывания с мишенью
Из рекомбинантных белков в качестве примеров применяли Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, и следующий способ применим для рекомбинантных белков, имеющих одинаковое левое плечо и различную длину внеклеточных усеченных вариантов SIRPα.
Определение биспецифической активности связывания с мишенями Her2 и CD47 с помощью проточной цитометрии
Хорошо растущие клетки SKBR-3 (человеческая клетка рака молочной железы, приобретенная в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали, подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×106 клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 11 разведений антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 (4-кратных серийных разведений, начиная от 433,2 нМ, всего 11 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому IgG Fc-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).
Поскольку трастузумаб и пертузумаб действуют на разные эпитопы антигена Her2, и существует большая разница в расстояниях от двух эпитопов до клеточной мембраны, следовательно, все их рекомбинантных белков антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их аффинности связывания и их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции являются разными.
Результаты исследования продемонстрировали, что, поскольку эпитопы трастузумаба и Her2 (Pedersen M W, et al. Targeting Three Distinct HER2 Domains with a Recombinant Antibody Mixture Overcomes Trastuzumab Resistance. Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3): 669-680) расположены относительно ближе к поверхности клеточной мембраны, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 обладает лучшей аффинностью в отношении клеток SKBR-3, чем антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2. Поскольку эпитопы пертузумаба и Her2 (внеклеточного домена II Her2) раположены относительно дальше от поверхности клеточной мембраны, следовательно, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 обладает эквивалентной аффинностью в отношении клеток SKBR-3 по сравнению с антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 SKBR-3.
Упомянутые выше результаты исследования демонстрируют, что правое плечо с разными значениями длины усечения будет влиять на аффинность рекомбинантных белков в отношении клеток-мишеней. Для левого плеча, которое связывается с проксимальным по отношению к мембране эпитопом, правое плечо с более коротким усечением SIRPα может обеспечивать сильное усиление связывания рекомбинантных белков с двумя мишенями. Однако в случае левого плеча, которое связывается с дистальным по отношению к мембране эпитопом, правое плечо с более коротким усечением SIRPα может утратить свое преимущество. Чем дальше антиген, на который нацеливается левое плечо, удален от клеточной мембраны, тем длиннее должно быть усечение варианта SIRPα в правом плече, чтобы достичь оптимального соответствия.
Например, как показано на фиг. 16, способность связывания антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 (EC50 = 2,04 нМ) с клетками SKBR-3 значительно выше, чем способность антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2 (EC50 = 25,95 нМ) (фиг. 16A). Способность связывания антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 с клетками SKBR-3 (EC50 = 15,22 нМ) эквивалентна таковой антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 (EC50 = 11,03 нМ) (фиг. 16B).
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что на основании расстояния между эпитопом антигена-мишени и поверхностью мембраны клетки-мишени внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα с подходящей длиной для правого плеча может обеспечивать эффективное усиление способности связывания рекомбинантных белков с клеткой-мишенью.
Пример 8. Исследование острой цитотоксичности рекомбинантных белков
В данном варианте осуществления представлено исследование острой цитотоксичности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. В следующем способе используют Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера, который также применим для рекомбинантных белков с внеклеточным усеченным вариантом SIRPα в правом плече.
Соответствующее количество раствора Ofa-Fc1-D1-Fc2 (4,02 мг/мл) разбавляли до 0,25 мг/мл и 2,5 мг/мл с помощью буфера (Tris-цитрат, pH 6,5) для инъекции и применяли для введения экспериментальным животным группы 1 и группы 2 соответственно.
Четыре здоровые самки яванского макака возрастом 4 года приобретали у Guangxi Guidong Primates Development и Experiment Co., Ltd. Получение экспериментальных животных одобрено Департаментом науки и технологии Гуанси-Чжуанской автономной области и имеет лицензионный номер SCXK Gui2016-0001. Экспериментальных животных тщательно клинически обследовали и взвешивали перед введением, и патологий обнаружено не было. Масса тела составляла 2,47-2,85 кг в день первоначального введения.
Таблица 9. Экспериментальная схема
Примечание: * внутривенная инъекция.
Четыре самки яванского макака делили на две группы по две обезьяны в каждую группу. Животным внутривенно вводили дозу 0,5 мг/кг и 5 мг/кг соответственно, и объем вводимой дозы составлял 2 мл/кг. Схема эксперимента показана в таблице 9. Животным осуществляли однократное введение, а затем постоянно наблюдали на протяжении 28 дней после введения. Яванских макаков содержали в подвижных клетках из нержавеющей стали с одним животным в каждой клетке. Ежедневно на примерно 12 часов свет включали и на 12 часов выключали. Корм для животных приобретали у Beijing KeaoXieli Feed Co., Ltd., и животные имели свободный доступ к корму на протяжении эксперимента за исключением определенного периода голодания. Партию корма проверяли с помощью Shanghai Pony Testing Technology Co., Ltd. (PONY) на наличие определенных микроорганизмов, тяжелых металлов и остатков пестицидов. Во время эксперимента все животные имели свободный доступ к питьевой воде с помощью бутылок с водой. Питьевую воду очищали фильтрацией и стерилизацией воды с помощью системы обратного осмоса. Уровень pH, жесткость, содержание тяжелых металлов и микроорганизмов питьевой воды определяли с помощью датчика.
Всех животных осматривали дважды в день (один раз утром и один раз во второй половине дня) возле клетки на протяжении эксперимента, и наблюдения включали в себя без ограничения заболеваемость, повреждение, смерть и получение корма и воды. Всех животных подробно клинически обследовали один раз перед экспериментом. Всех животных подробно клинически обследовали по меньшей мере один раз в день после введения на протяжении эксперимента. Клинические обследования включали в себя без ограничения заболеваемость, смертность, повреждение и получение корма и воды, кожу, шерсть, глаза, уши, нос, рот, грудь, живот, наружные половые органы, конечности, органы дыхания и кровообращения, вегетативные эффекты (такие как слюноотделение), нервную систему (например, дрожание, судороги, стрессовая реакция и аномальное поведение). Массу тела животных измеряли в D-1 (перед введением), D1, D4, D8, D11, D15, D18, D22, D25 и перед вскрытием. Потребление пищи животными на протяжении 24 часов (24 часа ± 1 час) измеряли в D2, D4, D8, D11, D15, D18, D22, D25 соответственно. Электрокардиограмму контролировали в D-1, D2, D14 и D28 с использованием стандартного отведения II (8 отведений) при скорости регистрации 50 мм/секунда.
Клинико-патологические образцы собирали и определяли параметры гематологии, коагуляции крови, показатели биохимии крови и типирование лимфоцитов перед введением (D-1) и в D2, D7, D14 и D28 после введения. Образцы мочи собирали и анализировали перед введением и в день 28 после введения.
Перед забором образца всех животных не кормили, за исключением свободного доступа к воде на протяжении ночи (по меньшей мере 10 часов). Образцы крови (4,5-6 мл) собирали из бедренной вены, при этом приблизительно 1,8 мл цельной крови использовали для анализа коагуляции крови в пробирке с антикоагулянтом, содержащей цитрат натрия; приблизительно 1 мл цельной крови использовали для гематологического анализа в пробирке с антикоагулянтом, содержащей K3-EDTA, приблизительно 2 мл цельной крови использовали для биохимического анализа крови в пробирке для сбора крови (без антикоагулянта) с разделительным гелем, а сыворотку крови выделяли центрифугированием в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Между тем выделенные образцы сыворотки крови в D-1 перед введением и в D2 после введения использовали для типирования T/B-клеток с помощью проточной цитометрии.
Животных умерщвляли в D29, собирали и консервировали ткани сердца, печени, селезенки, легких и почек, а также взвешивали печень, легкое (включая главный бронх), почку, селезенку, сердце, надпочечник, гипофиз, щитовидную железу и околощитовидную железу, тимус, яичник, матку (включая шейку матки) и головной мозг.
Результаты показали, что после однократного внутривенного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2 при дозе 0,5 мг/кг и 5 мг/кг соответственно, при этом за животными постоянно наблюдали в течение 28 дней после введения, существенных патологий, связанных с лекарственным средством, у животных не наблюдали, потребление пищи и масса тела колебались в пределах нормального диапазона; по сравнению с данными перед введением показатели коагуляции крови, мочи и данные электрокардиограммы животных после введения не имели существенных изменений; после вскрытия животных наблюдалось, что все органы находились в пределах нормального диапазона, а масса органов, висцеральный коэффициент и отношение висцеральной области мозга к головному мозгу также находились в пределах нормального диапазона.
В D2 после введения количество лимфоцитов и доля лимфоцитов в получавших низкую и высокую дозу группах демонстрировали значительное снижение и возвращались к нормальному уровню после D7. Это изменение может быть связано с действием лекарственного средства.
Рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 имели результат, сходный с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2 при той же дозе.
Таблица 10. Эффект рекомбинантного белка в отношении количества RBC (1012 клеток/л) у яванских макаков
Как показано на фиг. 18A и в таблице 10, Ofa-Fc1-D1-Fc2 не влияет на количество RBC у яванских макаков как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг; как показано на фиг. 18B и в таблице 10, Ofa-Fc1-D1-Fc2 не влияет на уровень гемоглобина у яванских макаков как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг.
Таблица 11. Эффект рекомбинантного белка в отношении уровня гемоглобина (г/л) у яванских макаков
Рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 характеризовались сходным эффектом в отношении количества RBC и уровня гемоглобина у яванских макаков по сравнению с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2 при той же дозе.
Как показано на фиг. 19, на основании результатов исследования типирования T/B-клеток Ofa-Fc1-D1-Fc2 может в значительной степени устранять B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) у животных как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что после однократного введения рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, существенных патологий, связанных с лекарственным средством, у животных не наблюдали, потребление пищи и масса тела колебались в пределах нормального диапазона; по сравнению с данными перед введением параметры коагуляции крови, мочи и данные электрокардиограммы животных после введения не имели существенных изменений; после вскрытия животных наблюдалось, что все органы находились в пределах нормального диапазона, а масса органов, висцеральный коэффициент и отношение висцеральной области мозга к головному мозгу также находились в пределах нормального диапазона.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что однократное введение рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, не влияло на количество RBC и уровень гемоглобина у животного.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, обеспечивают преимущественный клиренс клеток и/или опухолевых клеток с нацеливающим на опухоль антигеном при условии одной и той же дозы.
Пример 9. Подавление роста опухоли с помощью рекомбинантных белков in vivo
Эксперименты с рекомбинантными белками Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антителом к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 по подавлению роста опухоли проводили, соответственно, in vivo. Ofa-Fc1-D1-Fc2 использовали в качестве примера, и следующий способ применим для рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.
Ofa-Fc1-D1-Fc2: бесцветную прозрачную жидкость с концентрацией 1,14-4,02 мг/мл аликвотировали и хранили при -80°C; Rituxan® (ритуксимаб для инъекции): бесцветную прозрачную жидкость, 100 мг/10 мл, № по каталогу H0205, хранили при 2-8°C и защищали от света. Буфер для получения (Tris-цитрат, pH 6,5): бесцветную прозрачную жидкость хранили при 2-8°C. Составление: Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® разбавляли буфером для получения; буфер для получения непосредственно вводили в качестве растворителя.
Клетка: CD20-положительные клетки Daudi человеческой B-клеточной лимфомы приобретали в Клеточном банке Китайской Академии наук и культивировали со средой RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллином и стрептомицином, в инкубаторе, содержащем 5% CO2, при 37°C. Клетки пересевали дважды в неделю и клетки в экспоненциальной фазе роста собирали, подсчитывали и инокулировали.
Экспериментальные животные: самок мышей NOD-SCID, 6-7 недель, приобретали у Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd.; лицензионный номер: SCXK (Hu) 2013-0018. Номер сертификата животных: 2013001829463, 2013001827545. Кормовая среда: уровень SPF. Использование и благополучие экспериментальных животных должны соответствовать положениям Ассоциации по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). Состояние здоровья и смертность животных контролировали ежедневно. Обычный мониторинг включал в себя наблюдение влияния исследуемых веществ и лекарственных средств на ежедневное поведение животных, такое как поведенческая активность, на изменения массы и внешний вид.
Каждой мыши подкожно инокулировали 1,5×107 клеток Daudi, и когда на 18-й день после инокуляции средний объем опухоли достигал 100-150 мм3, животных делили на разные группы и осуществляли введение (D0). Мышам внутривенно (IV) инъецировали лекарственные средства; мышам в контрольной группе инъецировали такой же объем растворителя; объем инъекции составлял 0,1 мл на 10 г массы тела. Доза и схема введения дозы представлены в таблице 12.
Диаметр опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля с нониусом. Объем опухоли (V) рассчитывали по следующей формуле:
Объем опухоли (V) рассчитывали по следующей формуле:
V = 1/2×a×b2;
где a и b представляют собой длину и ширину соответственно.
T/C(%) = (T-T0)/(C-C0) × 100;
где T и C представляют собой опухоли в конце эксперимента; T0 и C0 представляют собой объем опухоли в начале эксперимента; T представляет собой группу обработки, а C представляет собой контрольную группу.
Степень подавления опухоли: (TGI) (%) = 100-T/C(%).
При регрессии опухоли степень подавления опухоли (TGI) (%) = 100-(T-T0)/T0×100.
Если объем опухоли меньше первоначального объема, т.e. T<T0 или C<C0, это определяют как частичную регрессию опухоли (PR); если опухоль полностью исчезает, это определяют как полную регрессию опухоли (CR).
Когда эксперимент завершен, или когда объем опухоли животного достигал конечной точки для эвтаназии, составляющей 1500 мм3, животных подвергали эвтаназии с помощью анестезии углекислым газом, а затем опухоль отбирали путем вскрытия и фотографировали.
Сравнение объема опухоли и массы между двумя группами проводили с помощью двустороннего критерия Стьюдента и P<0,05 определяли как статистически значимое различие.
Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5 мг/кг, IV, дважды в неделю 5 раз) обеспечивал значительное подавление роста подкожно трансплантированной опухоли из Daudi со степенью подавления 80,8% и частичной регрессией опухоли у 1/6 мышей. Rituxan® (7 мг/кг, IV, дважды в неделю 5 раз) характеризовался степенью подавления опухоли 24,5% в отношении подкожно трансплантированной опухоли из Daudi. Несущие опухоль мыши обычно хорошо переносили упомянутые выше лекарственные средства (таблица 12, фиг. 20, 21, 22).
Таблица 12. Эффективность Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении подкожно трансплантированной опухоли человеческой B-клеточной лимфомы из Daudi
Примечание: случайное деление на группы, момент времени первого введения - D0; IV: внутривенная инъекция.
Можно видеть, что и Ofa-Fc1-D1-Fc2, и Rituxan® подавляли рост подкожного ксенотрансплантата опухоли CD20-положительной человеческой B-клеточной лимфомы из Daudi при различных степенях, при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 существенно превосходил Rituxan®; мыши обычно хорошо переносили упомянутые выше лекарственные средства.
Противоопухолевый эффект рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 в отношении трансплантированной опухоли у мышей NOD-SCID при той же дозе и переносимость мышами рекомбинантных белков были сходными с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2.
Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с нацеливающим на опухоль антигеном и антигеном CD47, обладают неожиданно значительным противоопухолевым эффектом по сравнению с нацеливающимся на опухоль антителом при условии одной и той же дозы.
Использование и благополучие экспериментальных животных должны соответствовать положениям Ассоциации по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). Состояние здоровья и смертность животных контролировали ежедневно. Обычный мониторинг включал в себя наблюдение влияния исследуемых веществ и лекарственных средств на ежедневное поведение животных, такое как поведенческая активность, на изменения массы и внешний вид.
Применение любого и всех примеров или иллюстративной фразы (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено исключительно для лучшего объяснения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, если не заявлено иное. Ни одна фраза в настоящем описании не должна быть истолкована как указывающая на какой-либо не заявленный элемент как существенный для осуществления настоящего изобретения.
Все публикации и заявки на выдачу патентов, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на выдачу патента конкретно и индивидуально указывалась включенной в качестве ссылки. Кроме того, любые теория, механизм, доказательство или результат, изложенные в настоящем документе, предназначены для дальнейшего улучшения понимания настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретений каким-либо образом такими теорией, механизмом, доказательством или результатом. Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано и подробно описано в графических материалах и в приведенном выше описании, такие иллюстрация и описание следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ШАНХАЙ ДжиЭмТИ-БИО ТЕКНОЛОДЖИ КО., ЛТД.
<120> БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> P19413573RU
<150> CN201710317926.7
<151> 08-05-2017
<150> CN201711269620.5
<151> 05-12-2017
<160> 44
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Ofa
<400> 1
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 2
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Ofa
<400> 2
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 3
<211> 468
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Obi
<400> 3
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 4
<211> 239
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Obi/Obi-Fc1
<400> 4
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 5
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Hu5F9-G4
<400> 5
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
20 25 30
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp
50 55 60
Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala
85 90 95
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 6
<211> 236
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Hu5F9-G4
<400> 6
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
20 25 30
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr
35 40 45
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
85 90 95
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
100 105 110
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 7
<211> 466
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи JMT101
<400> 7
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
20 25 30
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn
35 40 45
Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
65 70 75 80
Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
85 90 95
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 8
<211> 231
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи JMT101/Anti-EGFR-Fc1
<400> 8
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro
20 25 30
Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr
35 40 45
Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
85 90 95
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Trp Pro
100 105 110
Thr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 9
<211> 468
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи трастузумаба
<400> 9
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp
35 40 45
Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
85 90 95
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 10
<211> 231
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи трастузумаба
<400> 10
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
20 25 30
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr
35 40 45
Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro
100 105 110
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 11
<211> 359
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность SIRP D1-Fc
<400> 11
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 12
<211> 467
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи атезолизумаба
<400> 12
Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 13
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи атезолизумаба/антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1
<400> 13
Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
35 40 45
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr
100 105 110
His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 14
<211> 1092
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК D1-Fc2
<400> 14
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60
gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120
atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180
gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240
accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300
acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360
gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagcctga caagacccac 420
acctgtcccc cttgtcctgc ccctgaactg ctgggcggac cttccgtgtt cctgttcccc 480
ccaaagccca aggacaccct gatgatctcc cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg 540
gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 600
cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa cagtacaact ccacctaccg ggtggtgtcc 660
gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 720
aacaaggccc tgcctgcccc catcgaaaag accatctcca aggccaaggg ccagccccgg 780
gaaccccagg tgtacacact gccccctagc agggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc 840
ctgtggtgtc tcgtgaaagg cttctacccc tccgacattg ccgtggaatg ggagtccaac 900
ggccagcctg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggactccga cggctcattc 960
ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1020
tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgagc 1080
cccggcaaat ga 1092
<210> 15
<211> 1389
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК D1-D2-Fc2
<400> 15
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60
gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120
atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180
gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240
accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300
acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360
gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagccttc tgctccagtg 420
gtgtcaggac cagcagctag agctacccct cagcacaccg tgtccttcac ctgcgagtct 480
cacggcttct cccctagaga catcaccctc aagtggttca agaacggcaa cgagctgtcc 540
gacttccaga ccaacgtgga tccagtgggc gagagcgtgt cttactccat ccactccacc 600
gccaaggtgg tgctgacaag ggaggacgtg cactcccagg tcatttgcga ggtggcacac 660
gtgacattgc agggcgaccc cctgagggga accgccaact tgagtgacaa gacccacacc 720
tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca 780
aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 840
gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 900
aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960
ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1020
aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa 1080
ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg 1140
tggtgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc gacattgccg tggaatggga gtccaacggc 1200
cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc 1260
ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1320
tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc 1380
ggcaaatga 1389
<210> 16
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Ofa-Fc1
<400> 16
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 17
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Ofa-Fc1
<400> 17
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 18
<211> 468
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Obi-Fc1
<400> 18
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Asn Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr
65 70 75 80
Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 19
<211> 468
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-EGFR-Fc1
<400> 19
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Asn Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr
65 70 75 80
Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 20
<211> 469
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1
<400> 20
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 21
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1
<400> 21
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 22
<211> 468
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1
<400> 22
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 23
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1
<400> 23
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr
100 105 110
Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 24
<211> 467
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1
<400> 24
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 25
<211> 1641
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК D1-D2-D3-Fc2
<400> 25
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60
gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120
atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180
gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240
accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300
acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360
gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagccttc tgctccagtg 420
gtgtcaggac cagcagctag agctacccct cagcacaccg tgtccttcac ctgcgagtct 480
cacggcttct cccctagaga catcaccctc aagtggttca agaacggcaa cgagctgtcc 540
gacttccaga ccaacgtgga tccagtgggc gagagcgtgt cttactccat ccactccacc 600
gccaaggtgg tgctgacaag ggaggacgtg cactcccagg tcatttgcga ggtggcacac 660
gtgacattgc agggcgaccc cctgagaggc acagcaaact tgagcgagac aattagagtg 720
ccccccaccc tggaagttac acagcagccc gttagagccg agaaccaggt caacgtcacc 780
tgccaggtca gaaagtttta tccacagaga ctgcagctga cctggctcga gaacggaaac 840
gtgagcagaa cagagaccgc cagcaccgtg acagagaaca aggacgggac ctacaactgg 900
atgagttggc tgctggtgaa cgtcagcgcc cacagagacg acgtcaagct gacctgcgac 960
aagacccaca cctgtccccc ttgtcctgcc cctgaactgc tgggcggacc ttccgtgttc 1020
ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 1080
gtggtggtgg atgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 1140
gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctaccgg 1200
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1260
aaggtgtcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1320
cagccccggg aaccccaggt gtacacactg ccccctagca gggacgagct gaccaagaac 1380
caggtgtccc tgtggtgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgacattgc cgtggaatgg 1440
gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1500
ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1560
gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1620
tccctgagcc ccggcaaatg a 1641
<210> 26
<211> 363
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1-Fc2
<400> 26
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
130 135 140
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
145 150 155 160
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
165 170 175
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
180 185 190
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
195 200 205
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
210 215 220
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
225 230 235 240
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
245 250 255
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
260 265 270
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
275 280 285
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
290 295 300
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
305 310 315 320
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
325 330 335
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
340 345 350
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 27
<211> 462
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-Fc2
<400> 27
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro
130 135 140
Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser
145 150 155 160
His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly
165 170 175
Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser
180 185 190
Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu
195 200 205
Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln
210 215 220
Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Asp Lys Thr His Thr
225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
275 280 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
355 360 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
420 425 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 28
<211> 546
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-D3-Fc2
<400> 28
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro
130 135 140
Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser
145 150 155 160
His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly
165 170 175
Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser
180 185 190
Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu
195 200 205
Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln
210 215 220
Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val
225 230 235 240
Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln
245 250 255
Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln
260 265 270
Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser
275 280 285
Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu
290 295 300
Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Asp
305 310 315 320
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
325 330 335
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
340 345 350
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
355 360 365
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
370 375 380
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
385 390 395 400
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
405 410 415
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
420 425 430
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
435 440 445
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
450 455 460
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
465 470 475 480
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
485 490 495
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
500 505 510
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
515 520 525
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
530 535 540
Gly Lys
545
<210> 29
<211> 369
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1m-Fc2
<400> 29
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser
35 40 45
Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 30
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1
<400> 30
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro
115
<210> 31
<211> 216
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1-D2
<400> 31
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe
130 135 140
Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu
145 150 155 160
Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr
165 170 175
Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His
180 185 190
Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro
195 200 205
Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser
210 215
<210> 32
<211> 300
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-D3
<400> 32
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe
130 135 140
Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu
145 150 155 160
Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr
165 170 175
Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His
180 185 190
Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro
195 200 205
Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr
210 215 220
Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp
245 250 255
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr
260 265 270
Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn
275 280 285
Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys
290 295 300
<210> 33
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1m
<400> 33
Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 1416
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи Ofa-Fc1
<400> 34
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60
gtgcagctgg tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcagatccct gagactgtct 120
tgtgccgcct ccggcttcac cttcaacgac tacgccatgc actgggtgcg acaggcccct 180
ggcaaaggcc tggaatgggt gtccaccatc agctggaact ccggctccat cggctacgcc 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaacg ccaagaagtc cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccctgtact actgtgccaa ggacatccag 360
tacggcaact actactacgg catggacgtg tggggccagg gcaccacagt gaccgtgtca 420
tctgcttcta ccaagggccc ctccgtgttt cctctggccc cttccagcaa gtccacctct 480
ggcggaacag ccgctctggg ctgcctcgtg aaggactact tccccgagcc tgtgaccgtg 540
tcctggaact ctggcgctct gacatccggc gtgcacacct tccctgctgt gctgcagtct 600
agcggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgcctt ccagctctct gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 720
cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga actgctgggc 780
ggaccttccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 840
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 900
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 960
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1080
tccaaggcca agggccagcc ccgggaaccc caggtgtaca cactgccccc tagcagggac 1140
gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgcagtga aaggcttcta cccctccgac 1200
attgccgtgg aatgggagtc caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1260
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg gtgagcaagc tgacagtgga caagtcccgg 1320
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaagt ccctgtccct gagccccggc aaatga 1416
<210> 35
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК легкой цепи Ofa-Fc1
<400> 35
atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60
gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagctacc 120
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tcttacctgg cctggtatca gcagaagccc 180
ggccaggctc cccggctgct gatctacgat gcctccaata gagccaccgg catccctgcc 240
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctggaaccc 300
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cggtccaact ggcccatcac ctttggccag 360
ggcacccggc tggaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705
<210> 36
<211> 1407
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи Obi-Fc1
<400> 36
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctcag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggctt ccggctacgc cttctcctac tcctggatca actgggtgcg acaggcccct 180
ggacagggcc tggaatggat gggcagaatc ttccctggcg acggcgacac cgactacaac 240
ggcaagttca agggcagagt gaccatcacc gccgacaagt ccacctccac cgcctacatg 300
gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gaacgtgttc 360
gacggctact ggctggtgta ttggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctctgcttct 420
accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480
gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540
tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600
tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720
tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080
aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140
aagaaccagg tgtccctgtc ctgtgctgtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200
gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260
tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380
tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407
<210> 37
<211> 1407
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-EGFR-Fc1
<400> 37
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctcag 60
gtccagctcc aggaaagcgg ccccggcctc gtcaaaccct ccgagacact ctccctcaca 120
tgcacagtct ccggcttctc cctcagcaac tacgacgtcc actgggtcag acaggccccc 180
ggcaaaggac tggaatggct cggcgtcatc tggtccggcg gaaacaccga ctacaacacc 240
ccattcacct ccaggctcac catctccgtg gacacctcca agaaccagtt ctccctcaaa 300
ctgagctccg tgaccgccgc cgacaccgct gtctattatt gcgccagagc cctcgactac 360
tacgactacg aattcgccta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc atctgcttct 420
accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480
gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540
tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600
tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720
tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080
aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140
aagaaccagg tgtccctgag ctgtgcagtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200
gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260
tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380
tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407
<210> 38
<211> 1410
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1
<400> 38
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgag 60
gtgcagttgg tggagagcgg gggggggctg gtgcagcctg gaggaagttt gaggttgagc 120
tgtgccgcaa gcgggttcaa cattaaggac acatacattc actgggtgag gcaggcaccc 180
ggaaagggac tggagtgggt ggctaggatc taccccacca acggctacac aaggtacgcc 240
gacagtgtga agggccggtt caccatttcc gccgacacct ccaagaacac cgcctacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtctact actgctccag gtggggagga 360
gacggattct atgctatgga ctactgggga cagggcaccc tggtgaccgt gtcatctgct 420
tctaccaagg gcccctccgt gtttcctctg gccccttcca gcaagtccac ctctggcgga 480
acagccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg 540
aactctggcg ctctgacatc cggcgtgcac accttccctg ctgtgctgca gtctagcggc 600
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccttccagct ctctgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 720
tcctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 780
tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 840
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 900
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 960
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag 1080
gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagcag ggacgagctg 1140
accaagaacc aggtgtccct gagctgtgca gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 1200
gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1260
gactccgacg gctcattctt cctggtgagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1320
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380
aagtccctgt ccctgagccc cggcaaatga 1410
<210> 39
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК легкой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1
<400> 39
atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60
gacattcaga tgacccagag cccctcctcc ctctccgcct ccgtgggaga cagagttacc 120
atcacctgca gggcctccca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaaaccc 180
ggcaaagccc ccaaactgct catctactcc gcctcatttc tgtacagcgg cgtgccctcc 240
cgcttctccg gttccagatc cggcaccgac ttcaccctga ctatctcctc cctccagccc 300
gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 360
ggcacaaagg tcgaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705
<210> 40
<211> 1407
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1
<400> 40
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgag 60
gtgcagttgg tggagagcgg gggggggctg gtgcagcctg gaggaagttt gaggttgagc 120
tgtgccgcaa gcgggttcac atttacagac tacacaatgg actgggtgag gcaggcaccc 180
ggaaagggac tggagtgggt ggctgatgtg aatcccaata gcggagggag catttacaac 240
cagagattca aggggcggtt caccttgtcc gtggacagga gcaagaacac actgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc cgaggatacc gccgtctact attgcgccag gaacctcgga 360
ccctccttct attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc atctgcttct 420
accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480
gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540
tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600
tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720
tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080
aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140
aagaaccagg tgtccctgag ctgtgcagtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200
gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260
tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320
ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380
tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407
<210> 41
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК легкой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1
<400> 41
atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60
gacattcaga tgacccagag cccctcctcc ctctccgcct ccgtgggaga cagagttacc 120
atcacctgca aagccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaaaccc 180
ggcaaagccc ccaaactgct catttactcc gcctcatacc gttacaccgg cgttccctcc 240
cgcttcagcg gatccggctc cggaaccgac ttcaccctga ctatctcctc cctccagccc 300
gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacattt acccctacac cttcggccag 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705
<210> 42
<211> 1404
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1
<400> 42
atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60
gtgcagctgg tggaaagcgg cggcggcctg gtgcagccgg gcggcagcct gcgcctgagc 120
tgcgcggcga gcggctttac ctttagcgat agctggattc attgggtgcg ccaggcgccg 180
ggcaaaggcc tggaatgggt ggcgtggatt agcccgtatg gcggcagcac ctattatgcg 240
gatagcgtga aaggccgctt taccattagc gcggatacca gcaaaaacac cgcgtatctg 300
cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcgcg ccgccattgg 360
ccgggcggct ttgattactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcatc tgcttctacc 420
aagggcccct ccgtgtttcc tctggcccct tccagcaagt ccacctctgg cggaacagcc 480
gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 540
ggcgctctga catccggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtctag cggcctgtac 600
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 720
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg 780
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 840
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 900
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac 960
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 1020
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1080
ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gcagggacga gctgaccaag 1140
aaccaggtgt ccctgagctg tgcagtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1200
tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1260
gacggctcat tcttcctggt gagcaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1320
aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380
ctgtccctga gccccggcaa atga 1404
<210> 43
<211> 1110
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК D1m-Fc2
<400> 43
atggagtgga gctgggtgtt cttgttcttc ttgtccgtga ccaccggggt gcacagcgag 60
gaggagttgc agatcatcca gcctgacaag agcgtgagcg tggccgccgg ggagagcgct 120
attctgcact gtaccatcac ctccctcttc cccgtgggcc ccattcagtg gttcagggga 180
gccgggcccg ccagagttct gatttacaac cagaggcagg gcccctttcc ccgggttacc 240
actgtctctg agaccaccaa gcgggagaac atggatttca gcatctccat cagcaacatt 300
actcccgccg acgccggcac ctactactgc atcaaattca gaaagggctc tcccgacacc 360
gaattcaaaa gcggcgccgg caccgaactg tccgtgcgag ctaagccctc cgagcccaaa 420
tcctcagaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 480
tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 540
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 600
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 660
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 720
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag 780
gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagcag ggacgagctg 840
accaagaacc aggtgtccct gtggtgtctc gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 900
gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 960
gactccgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1020
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1080
aagtccctgt ccctgagccc cggcaaatga 1110
<210> 44
<211> 462
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность D1m-D2-Fc2
<400> 44
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser
35 40 45
Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Gly Pro
130 135 140
Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser
145 150 155 160
His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly
165 170 175
Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser
180 185 190
Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu
195 200 205
Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln
210 215 220
Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Asp Lys Thr His Thr
225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
275 280 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
355 360 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
420 425 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<---
Claims (30)
1. Биспецифический рекомбинантный белок, где биспецифический рекомбинантный белок содержит высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα; где
высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо не связывается с CD47, и аффинность его связывания, характеризующая антитело, соответствующее высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу, с антигеном-мишенью на опухолевой клетке в по меньшей мере 6 раз превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, с CD47 на опухолевой клетке;
аффинность связывания слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα, с CD47; где внеклеточный усеченный вариант SIRPα включает внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα дикого типа или внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα с невысокой аффинностью в отношении CD47;
где биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены противоположно, при этом высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо расположено в качестве левого плеча, слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα расположен в качестве правого плеча;
где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из CD20, EGFR, HER2 и PD-L1;
где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα, и внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4): a1) SEQ ID NO: 30; a2) SEQ ID NO: 31; a3) SEQ ID NO: 32; a4) аминокислотная последовательность, имеющая замену A80N по сравнению с а1), а2) или а3);
где биспецифический рекомбинантный белок дополнительно содержит Fc-область.
2. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, а правое плечо является внеклеточным усеченным вариантом SIRPα.
3. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 2, где длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени.
4. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 3, отличающийся тем, что если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).
5. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, отличающийся тем, что если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) или a2).
6. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα объединены посредством одного, двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи, такой как межцепочечная дисульфидная связь, и солевой связи.
7. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 6, где Fc-область содержит природную последовательность Fc-области или неприродную последовательность Fc-области.
8. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где Fc-область является человеческой Fc-областью.
9. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 8, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины».
10. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 9, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо представляет собой полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело.
11. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 10, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо представляет собой гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.
12. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4): b1) SEQ ID NO: 26; b2) SEQ ID NO: 27; b3) SEQ ID NO: 28; b4) аминокислотная последовательность, имеющая замену A80N по сравнению с b1), b2) или b3).
13. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 12, где
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на CD20, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на EGFR, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 8, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на Her2, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27; или
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на PD-L1, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 13, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26.
14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по п. 1.
15. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены вместе в одной и той же нити ДНК, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены в разных нитях ДНК.
16. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 14.
17. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п. 16.
18. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка, где способ предусматривает клетку по п. 17 для экспрессии рекомбинантного белка путем культивирования клетки.
19. Применение биспецифического рекомбинантного белка по п. 1 в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли.
20. Применение по п. 19, где опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома, и где опухоль является положительной для мишени, выбранной из группы, состоящей из CD20, EGFR, HER2 и PD-L1.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710317926.7 | 2017-05-08 | ||
CN201710317926 | 2017-05-08 | ||
CN201711269620 | 2017-12-05 | ||
CN201711269620.5 | 2017-12-05 | ||
PCT/CN2018/086050 WO2018205936A1 (zh) | 2017-05-08 | 2018-05-08 | 双特异性重组蛋白及其应用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019138624A RU2019138624A (ru) | 2021-06-09 |
RU2019138624A3 RU2019138624A3 (ru) | 2021-07-22 |
RU2774451C2 true RU2774451C2 (ru) | 2022-06-21 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016024021A1 (en) * | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Merck Patent Gmbh | Sirp-alpha immunoglobulin fusion proteins |
CN106519036A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-22 | 新乡医学院 | 抗cd47和egfr的双功能蛋白及其制备方法与应用 |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016024021A1 (en) * | 2014-08-15 | 2016-02-18 | Merck Patent Gmbh | Sirp-alpha immunoglobulin fusion proteins |
CN106519036A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-22 | 新乡医学院 | 抗cd47和egfr的双功能蛋白及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
КОСОБОКОВА Е. Н. и др., Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии, Современные технологии в медицине, 2013, V. 5, N. 4, с.102-111. COLMAN P. M., Effects of amino acid sequence changes on antibody-antigen interactions, Research in Immunology, 1994, V. 145, N. 1, p.33-36. SAFDARI Y. et al., Antibody humanization methods-a review and update, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2013, V. 29, N. 2, p.175-186. HATHERLEY D. et al., Paired receptor specificity explained by structures of signal regulatory proteins alone and complexed with CD47, Molecular cell, 2008, V. 31, N. 2, p.266-277. TORRES M. et al., The immunoglobulin constant region contributes to affinity and specificity, Trends in immunology, 2008, V. 29, N. 2, p.91-97. TZANKOV A. et al., Prognostic significance of CD20 expression in classical Hodgkin lymphoma: a clinicopathological study of 119 cases, Clinical cancer research, 2003, V. 9, N. 4, p.1381-1386 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108864290B (zh) | 双特异性重组蛋白及其应用 | |
JP7173993B2 (ja) | 細胞傷害性tリンパ球関連タンパク質4(ctla-4)に対する新規モノクローナル抗体 | |
US20210130459A1 (en) | Antibodies specific to human nectin4 | |
KR102629403B1 (ko) | Vista 항원 결합 분자 | |
JP2021508676A (ja) | 抗tigit抗体並びに治療剤及び診断剤としてのその使用 | |
JP2020515239A (ja) | 抗icosアゴニスト抗体およびそれらの使用 | |
KR20180040671A (ko) | Bcma와 cd3에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자인 항-bcma 항체, 및 이들의 용도 | |
KR20180100238A (ko) | 항-ror1 항체, ror1 × cd3 이중특이성 항체, 및 이를 사용하는 방법 | |
KR20210084587A (ko) | 다가 조절 t 세포 조정제 | |
KR20200139725A (ko) | Her3 항원 결합 분자 | |
CN112794916B (zh) | 三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用 | |
JP2024507180A (ja) | Bcma、gprc5d、及びcd3を標的とする三重特異的抗体 | |
JP2019521648A (ja) | ヒト化抗ベイシジン抗体およびその使用 | |
US20240190989A1 (en) | Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use | |
CN113321735B (zh) | 一种多功能融合蛋白 | |
CA3062479A1 (en) | Bispecific recombinant protein and use thereof | |
KR20220042137A (ko) | 항-뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (ny-eso-1) 항원-결합 단백질 및 이의 사용 방법 | |
JP2022529269A (ja) | ヒト化抗pd-l1抗体 | |
RU2774451C2 (ru) | Биспецифический рекомбинантный белок и его применение | |
US20240209113A1 (en) | Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use | |
US20240209106A1 (en) | Anti-cd137 antibodies and methods of use | |
WO2022242679A1 (en) | Anti-cd137 antibodies and methods of use | |
KR20230170721A (ko) | Bcma를 표적으로 하는 다중 특이성 항체 | |
KR20230117379A (ko) | 이종이량체 psma 및 cd3-결합 이중특이적 항체 | |
CA3221866A1 (en) | Antibodies and bispecific binding proteins that bind ox40 and/or pd-l1 |