JP2019521648A - ヒト化抗ベイシジン抗体およびその使用 - Google Patents
ヒト化抗ベイシジン抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[0013]本発明の開示は、高い結合親和性を有するヒト化抗ベイシジン抗体を提供し、その生物活性は、実験を介して検証される。
[0015]一部の実施態様において、VHは、配列番号1のアミノ酸配列(EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)を有し、配列番号1の位置iにおけるX(i=5、23、49、79、80、89、94)は、XHiと称され、XH5、XH23、XH49、XH79、XH80、XH89、XH94のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。
[0019]一部の実施態様において、VHは、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15に記載のフレームワーク領域(FR)を含む。
[0021]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域(VL)をさらに含む。
[0026]一部の実施態様において、VLは、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28に記載のFRを含む。
[0028]一部の実施態様において、抗原結合フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、dAb、および単鎖結合ポリペプチドから選択される抗体フラグメントである。
[0032]一部の実施態様において、単離された核酸配列は、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号17、配列番号19、または配列番号21のヌクレオチド配列を含む。
[0035]さらに別の形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントおよび医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
[0047]以下の本発明の開示の説明は、単に様々な本発明の開示の実施態様を例示することが意図されている。そのようなものとして、論じられた具体的な改変は、本発明の開示の範囲に対する限定として解釈されないものとする。当業者であれば、本発明の開示の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更、および改変が可能であることが明らかであると予想され、このような等価な実施態様が本明細書に包含されることが理解される。本明細書において引用された全ての参考文献、例えば公報、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
[0048]一形態において、本発明の開示は、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
[0075]一部の実施態様において、VLは、配列番号16、配列番号18または配列番号20のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様において、VLは、配列番号16、配列番号18または配列番号20のアミノ酸配列からなる。
[0085]「F(ab’)2」は、ジスルフィド結合により一緒に結合した2つのFab’フラグメントの二量体を指す。
[0087]「dsFv」は、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域との間の連結がジスルフィド結合である、ジスルフィド安定化Fvフラグメントを指す。一部の実施態様において、「(dsFv)2」は、3つのペプチド鎖、すなわち、ペプチドリンカーにより連結され、ジスルフィド架橋により2つのVL部分に結合した2つのVH部分を含む。一部の実施態様において、dsFvは、二重特異性であり、重鎖と軽鎖とを対合させた各ジスルフィドは、異なる抗原特異性を有する。
[0092]「単鎖結合ポリペプチド」は、抗原またはエピトープに結合することが可能なあらゆる単鎖ポリペプチドを指す。
[0099]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え方法を使用して調製される。ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する組換えプロセスは、以下を含む:
[00100] 1)ヒトベイシジンタンパク質またはhベイシジン生産細胞で好適な非ヒト動物を免疫化すること。動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、またはモルモットであってもよい。非ヒト動物からの脾臓またはリンパ節を使用して抗体を生産するハイブリドーマを生成するか、または免疫化された非ヒト動物のB細胞を集め、非ヒトモノクローナル抗ベイシジン抗体の力価を測定する。従来の手順を使用することによって(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、モノクローナル抗体をコードするDNAを単離およびシーケンシングする。
[00106]一形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列を提供する。
[00112]別の形態において、本発明の開示はまた、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列を含むベクターも提供する。
[00115]別の形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
[00120]一形態において、本発明の開示は、本明細書で提供される1つまたはそれより多くのヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
[00123]用語「医薬的に許容される」は、本明細書で使用される場合、指定された担体が、一般的に、医薬組成物中に含まれる他の成分と化学的および/または物理的に適合性を有し、確実な医療的判断の範囲内であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなくレシピエント対象(例えば、ヒトおよび動物)におけるインビボでの使用に好適であり、適度なベネフィット/リスク比に見合っていることを意味する。
[00128]本発明の開示は、本明細書で提供される抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。一部の実施態様において、キットは、生体サンプル中でベイシジンの存在またはレベルを検出するのに有用である。生体サンプルは、細胞または組織であり得る。
[00132]一形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書で提供される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
[00147]単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、本明細書で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の形態も同様に含むことが意図される。用語「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「有する」および/または「有すること」は、本明細書において使用される場合、述べられた特徴、工程、操作、エレメントおよび/または構成要素の存在を明記するものであるが、1つまたはそれより多くの他の特徴、工程、操作、エレメント、構成要素および/またはそれらの群の存在または追加を除外しないことがさらに理解されるものとする。用語「約」は、本明細書で使用されるように、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から10%以下で変動する可能性があることを意味する。
[00150]2006年に、ハイブリドーマ細胞株HAb18GC2を生成し、中国典型培養物保存センター(China Center for Type Culture Collection)に受託番号CCTCC−C200636で寄託した。細胞株、細胞株によって生産される抗体および調製方法に関する詳細な情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる中国特許第ZL200710007452.2号に記載されている。
[00160]マウスモノクローナル抗hベイシジン抗体6H8の軽鎖および重鎖可変領域中のCDR(HAb18GC2としても公知である。中国特許第ZL200710007452.2号を参照)を、Kabatデータベースに従って決定した。3つの軽鎖CDRのアミノ酸配列は、配列表中、それぞれ配列番号22、配列番号23および配列番号24に示される。3つの重鎖CDRのアミノ酸配列は、配列表中、それぞれ配列番号9、配列番号10および配列番号11に示される。
[00161]抗体のヒト化のために、Kabatデータベースから得られたヒトFR配列を上述のCDRでグラフト化し、グラフト化した抗体の可変領域を相同性および構造に関してスクリーニングした。ディスカバリービジョン(Discovery Vision)(VIOVIA、バージョン3.5)という名称のコンピューターソフトウェアを使用して、分子モデリング、相同性モデリングおよび力学の最適化を介してヒト化の前および後の抗体の分子構造を分析し、置き換えられたFRがVHおよびVLの全体的な骨格構造を変化させずに、具体的には、マウスモノクローナル抗体のβ鎖の2次構造を破壊せずに、確実に元のマウス抗体の親和性を維持するかまたは改善するような、ヒトFRにおいて可能な変更を検証した。本発明の開示の図1および図2に、選択されたヒト重鎖/軽鎖可変FR配列を、特定の部位に起こり得るバリエーションと共に、マウスFR配列と一致させて列挙した。
[00162]実施例2で決定されたCDRおよび実施例3で検証されたFR配列の配列に基づき、哺乳類細胞において一般的に使用されるコドンを使用することによって、ヒト化抗体のScFvフラグメントをコードする対応するヌクレオチド配列を得た。オーバーラップ−PCR方法によってコード化遺伝子を得て、次いでクローニングベクターにクローニングし、増幅し、陽性クローンをシーケンシング分析に供した。重鎖/軽鎖FRのコード配列中の特異的なアミノ酸部位に、プライマーにより変更およびバリエーションを導入することによって、FRのヒト化を実行した。詳細なプロトコールは後述される。
[00164]実施例1からのマウス由来のscFvフラグメントを、テンプレートとして使用した。以下のプライマーを、ヒト化された重鎖可変領域(hVH)およびヒト化された軽鎖可変領域(hVL)の増幅のために使用した:
[00165]hVHフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる:
[00166] 1)6H8−L1−F1:配列番号37
[00167]CAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTG
[00168] 2)6H8−L1−F2:配列番号38(6H8−L1−F2はプライマーの混合物を表し、式中R=GまたはA、S=GまたはCである)
[00169]CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTTRSCGAAATTAGATTGAAATC
[00170] 3)6H8−L1−F3:配列番号39(6H8−L1−F3はプライマーの混合物を表し、式中R=GまたはAである)
[00171]CAGATGAACTCCTTAARGACTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTACCAG
[00172]hVHリバースプライマーとしては、以下が挙げられる:
[00173] 1)6H8−L1−R1:配列番号40(6H8−L1−R1はプライマーの混合物を表し、式中M=AまたはC、Y=TまたはCである)
[00174]GAAAGTGAATCCAGAGGCGGMACAGGAGAGCYTCAGGGATCCTCCAGG
[00175] 2)6H8−L1_R2:配列番号41
[00176]CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG
[00177] 3)6H8−L1−R3:配列番号42(6H8−L1−R3はプライマーの混合物を表し、式中R=GまたはA、K=GまたはTである)
[00178]TAAGGAGTTCATCTGCAGGTACAGGRTGKTTTTGGAATCATCTCTTG
[00179] 4)6H8−L1−R4:配列番号43
[00180]GGGAGATTGGGTCATCTGAATGTCGCTAGCACCGCCAC
[00181] 5)6H8−L1_R5:配列番号44(6H8−L1_R5はプライマーの混合物を表し、式中R=GまたはA、S=GまたはC、W=AまたはT、V=GまたはCまたはAである)
[00182]GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC
[00183]hVLフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる:
[00184] 1)6H8−L1_F4:配列番号45(6H8−L1_F4はプライマーの混合物を表し、式中M=AまたはC、W=AまたはTである)
[00185]GTGGGCGACAGGGTCACCMTCWCCTGCAAGGCCAGTGAG
[00186] 2)6H8−L1_F6:配列番号46(6H8−L1_F6はプライマーの混合物を表し、式中Y=TまたはC、S=GまたはC、W=AまたはTである)
[00187]TCAGCAGTCTGCAGYCCGASGACWTCGCAACCTATTACTGTGGACAGAGTTAC
[00188] 3)6H8−L1_F5:配列番号47
[00189]CCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAG
[00190]hVLリバースプライマーとしては、以下が挙げられる:
[00191] 1)6H8−L1_R6:配列番号48(6H8−L1_R6はプライマーの混合物を表し、式中H=AまたはCまたはT、K=GまたはTである)
[00192]GTTGGATGCCCCGTATATCAGCAGTTTAGGGGHCTKGCCTGGTTTCTGTTG
[00193] 2)6H8−L1_R8:配列番号49
[00194]TTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTGTCCC
[00195] 3)6H8−L1_R7:配列番号50(プライマー6H8−L1_R7は、プライマーの混合物であり、式中W=AまたはT、M=AまたはCである)
[00196]AGATCCACTGCCGGWGAAGCGGGMGGGGACCCCAGTGTACCGGTTGGATGCCCC
[00197]方法および結果
[00198]標的フラグメントを、以下で設定した通りの以下の増幅スキームによって増幅した。
[00199] 第1の工程の増幅:5つのプライマーの対(6H8−L1−F1+6H8−L1−R1、6H8−L1−F2+6H8−L1−R3、6H8−L1−F3+6H8−L1−R4、6H8−L1_F4+6H8−L1_R6、6H8−L1_F6+6H8−L1_R8)を使用して、実施例1で得られたpFL−6H8ベクターから、5つの第1の工程のフラグメントを増幅した。PCR反応条件を以下のように設定した:95℃、3分;(95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、40秒)×40サイクル;72℃、10分。PCRの後、増幅されたフラグメントのサイズを、1%アガロースゲル電気泳動で決定し、次いでpMD18−Tベクター(TaKaRa)にライゲートした。ライゲーション生成物をコンピテント細胞に形質転換し、クローンを選択し、正しい挿入に関してスクリーニングした。シーケンシング結果に基づき、正しい配列を有するフラグメントをそれぞれ6H8−L1−1、6H8−L1−2、6H8−L1−3、6H8−L1−4および6H8−L1−5と名付けた。
[00205]6H8−L1抗体ファージライブラリーを60mlの2YT培地中で回復させ、振盪インキュベーター中、37℃で、培養物のOD600が0.3〜0.4に達するまでインキュベートした。M13KO7ヘルパーファージ(インビトロジェン(Invitrogen))を添加し、培養物を静止したインキュベーター中で30分インキュベートし、振盪インキュベーター中、37℃で60分インキュベートした。培養物を、1500rpmで10分遠心分離し、上清を捨て、細胞を、60mlの50μg/mlカナマイシンを含有する2YT培地(グルコース非含有)で再懸濁した。再懸濁した培養物を、振盪インキュベーター中、30℃で一晩インキュベートし、12,000rpmで10分遠心分離して、ファージディスプレイライブラリーを含有する細菌を沈殿させた。上清を新しい遠心管に移し、30ml/チューブのロットに等分し、7.5mlのPEG/NaClを各遠心管に添加し、よく混合し、氷上に1時間置き、12000rpmで5分遠心分離し、上清を捨て、ファージを、PBS−5%BSAを含有する溶液2.2mlで再懸濁した。再懸濁したファージを、12000rpmで再度5分遠心分離して、死細胞片を除去した。
[00207]ヒトベイシジンを、コーティング緩衝液(200mMのNa2CO3/NaHCO3、pH9.2)で1μg/mlに希釈し、そのうち50μlを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。各ウェル中のコーティング溶液を捨て、プレートを、1×PBS緩衝液で3回洗浄し、1ウェル当たり200μlのブロッキング緩衝液(2%BSA/1×PBS緩衝液)で室温で1時間ブロックし、次いで1ウェル当たり200μlの1×PBS緩衝液で洗浄した。プレートの個々のウェルにScFv抗体および陰性対照を含有する細胞培養上清を添加し、室温で2時間インキュベートした。次いでプレートを200μlの1×PBS緩衝液で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液で(1:2500に)希釈された二次抗体としての抗c−MycAb(HRP)(Abcamカタログ番号ab19312、50μl/ウェル)をプレートの個々のウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次いでプレートを200μlの1×PBS緩衝液で6回洗浄した。TMB基質溶液(50μl/ウェル)を各ウェルに添加して、10分反応させ、停止溶液(2MのHCl、50μl/ウェル)を添加して反応を終わらせた。450nmにおける吸光度をELISAプレートリーダーで読んだ。ELISAの結果に従って、シーケンシング分析のためにA450>2.0の123個のクローンを選択した。
[00209]抗体の親和性をProteOn XPR36(バイオ−ラッド(Bio-Rad))を用いて測定した。GLCチップ(バイオ−ラッド、1765011)を、0.04MのEDC+0.01Mのスルホ−NHS(バイオ−ラッド)で活性化した。ヒトベイシジンを、10mMのNaAc(pH4.5)を用いて10mMに希釈し、次いで30μl/分の速度でチップ上に注入し、活性化されたチップに抗原をアミノ基を介してカップリングした。最終的に、チップを1Mのエタノールアミン−HCl(バイオ−ラッド)で不活性化し、チップを90度回転させ、それを、ベースラインが安定になるまで緩衝液(PBS/0.005%のTween20)で洗浄した。scFv抗体および1つの陰性対照を含有する5つの細胞培養上清を、6つの水平のチャネル上に、それぞれ30μl/分の供給速度で注入した。結合のための時間を60秒と設定し、解離のための時間を900秒と設定した。反応速度論−ラングミュアモデルを使用してデータを分析した。
[00213]以前の親和性ソーティングの結果に従って、選択されたscFvを有する5つのクローンを一晩植え付けた。一晩の培養物のそれぞれからプラスミドを抽出し、それらの配列をシーケンシングによって確認した。
[00215]VLフォワードプライマー:PCI−wbp229_F1、配列番号51
[00216]GCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATTCAGATGACCCAATC
[00217]VLリバースプライマー:pCI−6H8_R8、配列番号52
[00218]GGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG
[00219]VHフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる:
[00220]1)PCI−wbp229_F2:配列番号53
[00221]CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTCTGGAGTC
[00222]2)PCI−wbp229_F3:配列番号54
[00223]CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTC
[00224]3)6H8−L1_R2:配列番号55
[00225]CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG
[00226]4)6H8−L1_R5:配列番号56
[00227]GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC
[00228]VHリバースプライマー:PCI−wbp229_R1、配列番号57を参照。
[00229]GGGCCCTTGGTCGACGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC
[00230]標的フラグメントを、以下で設定した通りの以下の増幅スキームによって増幅した:
[00231]11188からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対(PCI−wbp229_F1+pCI−6H8_R8およびPCI−wbp229_F2+PCI−wbp229_R1)を使用して、インタクトなヒト化抗体WBP229−201のためにVLおよびVH領域を増幅した。
[00237]精製されたVL/VHフラグメントをNgoMIVおよびSnaBIで消化し、消化されたフラグメントをDNA精製キットで精製し、次いで哺乳類発現ベクターである、(hIgG2重鎖定常領域またはヒトκ鎖定常領域)遺伝子を包含するpCI−ベクターにライゲートし、これを同じ酵素で消化した。ライゲーション生成物をTOP10大腸菌(E. coli)細胞(インビトロジェン)に形質転換し、形質転換した細胞を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に塗り広げた。次いで100μg/mlのアンピシリンを含むLB液状培地中に陽性クローンをを植え付け、シーケンシングによってクローンを検証した後、Midi−Prepプラスミド抽出キット(キアゲン(QIAGEN))を使用することによってクローンプラスミドを抽出した。調製したプラスミドを、それぞれpCI−WBP229−201LおよびpCI−WBP229−201H、pCI−WBP229−202LおよびpCI−WBP229−202H、pCI−WBP229−203LおよびpCI−WBP229−203H、pCI−WBP229−204LおよびpCI−WBP229−204H、pCI−WBP229−205LおよびpCI−WBP229−205Hと名付け、これらのそれぞれは、インタクトなヒト化抗体を生産するために完全な軽鎖遺伝子または完全な重鎖遺伝子を含有する。
[00238]HEK293細胞(細胞1.0×106個/ml)を、インビトロジェンからのフリースタイルマックス試薬(Freestyle Max Reagent)トランスフェクション試薬を使用することによって、1つの軽鎖遺伝子および1つの対応する重鎖遺伝子を含有するプラスミドの対(例えば、pCI−WBP229−201L/H〜205L/H)と共にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、振盪インキュベーター中、37℃、5%CO2で、さらに120rpmの回転速度で植え付けた。トランスフェクションから7日後に遠心分離によって培養上清を収集し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、上清から標的抗体を単離および精製した。最も高いヒト化抗体を生産した以下の3つの培養物を選択した。
[00242]200ngのヒトベイシジン組換えタンパク質をELISAプレートにコーティングし、4℃で一晩静置した。コーティングされたプレートを0.1%BSAで室温で1時間ブロックした。実施例8で得られた3種の抗体を、親マウスモノクローナル6H8およびキメラ抗体c6H8と共に、それぞれ10,100、1,000、10,000および100,000ng/mlの勾配濃度を有する5種の溶液を用いて調製した。100μlの各溶液を個々のウェルに添加し、プレートを室温で1時間静置した。二次抗体として、100μlの1:4,000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト軽鎖定常領域(ミリポア(Millipore))を添加し、室温で1時間静置した。次いでプレートを200μlの1×PBS緩衝液で3回洗浄し、TMB基質溶液(50μl/ウェル)を各ウェルに添加して、10分反応させ、停止溶液(2MのHCl、50μl/ウェル)を添加して反応を終わらせた。450nmにおける吸光度をELISAプレートリーダーで読んだ。
[00244]3種のヒト化抗体、マウス抗体6H8およびキメラ抗体c6H8の結合親和性もSPRによって決定し(詳細な工程については実施例6の説明を参照されたい)、表2にデータを示した。
[00247]実施例9の結果に従って、HP6H8−1の遺伝子配列を、高度に効率的なヒト化抗体の発現ベクターの構築に使用した。
[00249]HP6H8−1のVL領域をコードする遺伝子配列を合成し、XbaIおよびBsiWIの制限酵素認識部位をそれぞれ配列の5’および3’末端に付加した。合成された分子および軽鎖定常遺伝子を有するpcDNA3.3−LC−104new−Mプラスミドを制限酵素XbaIおよびBsiWIで消化した。消化された生成物を1%アガロースゲル電気泳動で分離し、期待されるサイズにおけるバンドを回収し、精製した。精製したフラグメント(合成分子由来の416bpのフラグメントおよびpcDNA3.3−LC−104new−Mプラスミド由来の5,712bpのフラグメント)をT4リガーゼを使用することによってライゲートし、反応ミックスを16℃で20分維持した。20μlのライゲーション溶液のうち10μlを使用して、大腸菌TOP10コンピテント細胞(インビトロジェン)を形質転換した。PCR分析、酵素消化分析およびシーケンシングによって形質転換したコロニーを確認した後、1つの正しいモノクローンを、220rpmの振盪インキュベーターにおいて200mlのLB培地中で37℃で一晩植え付けた。プラスミドを抽出し、pcDNA3.3−LC−N−229−205と名付けた(図4に示す)。
[00251]同様に、HP6H8−1のVH領域をコードする遺伝子配列を合成し、XbaIおよびNheIの制限酵素認識部位をそれぞれ配列の5’および3’末端に付加した。合成された分子および重鎖定常遺伝子を有するpOptivec−HC−208−Mプラスミドを制限酵素XbaIおよびNheIで消化した。消化された生成物を1%アガロースゲル電気泳動で分離し、期待されるサイズにおけるバンドを回収し、精製した。精製したフラグメント(合成分子由来の434bpのフラグメントおよびpOptivec−HC−208−Mプラスミド由来の5,364bpのフラグメント)をT4リガーゼを使用することによってライゲートし、反応ミックスを16℃で20分維持した。20μlのライゲーション溶液のうち10μlを使用して、大腸菌TOP10コンピテント細胞(インビトロジェン)を形質転換した。PCR分析、酵素消化分析およびシーケンシングによって形質転換したコロニーを確認した後、1つの正しいモノクローンを、220rpmの振盪インキュベーターにおいて200mlのLB培地中で37℃で一晩植え付けた。プラスミドを抽出し、pOptivec−HC−D−229−205と名付けた(図5に示す)。
[00253]ヒト化抗体軽鎖の発現ベクターpcDNA3.3−LC−N−229−205およびヒト化抗体重鎖の発現ベクターpOptivec−HC−D−229−205を、フリースタイルマックス試薬(インビトロジェン)を使用することによってCHO/DHFR細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞を初代継代し、細胞の生存率が85%を超えて回復するまで500μg/mlのG418を補充したOptiCHO培地でスクリーニングした。2ラウンドのスクリーニングを、500nMのMTXを含有するスクリーニング培地中で実行した。ClonePixFLを用いて単一のクローンを選択した。モノクローナル培養の7〜10日の後、培養物上清中のHP6H8−1の発現レベルは、HTRF方法で測定したところ2.23±0.18g/Lであった(図6に示す)。
[00254]免疫組織化学的方法を使用して、抗体HP6H8−1の腫瘍組織への特異的な結合を検出し、抗体の免疫組織化学的な交差反応性を調査した。内因性ペルオキシダーゼをブロックして不活性化するために3%H2O2を使用し、ブロックのために正常ヒツジ血清使用溶液を使用し、一次抗体としてHP6H8−1を使用し、二次抗体としてビオチン標識ウサギ抗ヒトFc抗体を使用し、標識試薬としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトマイシンアルブミン溶液を使用し、発色のためにDABを使用し、再染色のためにヘマトキシリンを使用した。サンプルを脱水した後、それを有するスライドを顕微鏡検査のためにマウントした。
実施例12:インビトロにおけるHP6H8−1抗体を用いた抗マラリア性の試験
[00257]ヒト赤血球(O型)を、熱帯熱マラリア原虫株Dd2、3D7、FCC1およびNf54それぞれで感染させた。感染率が≧1%であり、マラリアによる環状体が≧80%の場合、抗マラリア性の試験を実行した。培養物をモノクローナル抗体で希釈して、寄生虫血症の初期レベルを0.5%に設定し、新鮮な赤血球を添加して、初期のヘマトクリットを2%に設定し、モノクローナル抗体HP6H8−1を、それぞれ100、10、1、0.1、0.01μg/mlの濃度で添加して、各濃度勾配を3連で試験した。37℃で72時間培養した後、薄い血液塗抹標本を調製し、100倍の油浸顕微鏡下で観察して、寄生体の割合を数えた。実験を独立して3回繰り返し、結果を平均し、統計のためにSPSSで分析した。
Claims (30)
- ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域(VH)を含み、VHは、配列番号1のアミノ酸配列(EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)を含み、ここで配列番号1の位置i(i=5、23、49、79、80、89、94)におけるXは、XHiと称され、XH5、XH23、XH49、XH79、XH80、XH89、XH94のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- XH5が、VまたはLであり、XH23が、AまたはSであり、XH49が、S、AまたはGであり、XH79が、NまたはSであり、XH80が、TまたはIであり、XH89が、KまたはRであり、XH94が、AまたはTである、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
(a)XH5が、Vであり、XH23が、Aであり;および/または
(b)XH49が、SまたはAであり;および/または
(c)XH79が、Nであり、XH80が、Tであり、XH89が、KまたはRであり、XH94が、Aである、
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。 - VHが、配列番号3、配列番号5または配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- VHが、配列番号12、配列番号13、配列番号14、および配列番号15に記載のフレームワーク領域(FR)を含む、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 軽鎖可変領域(VL)をさらに含み、ここでVLは、配列番号22、配列番号23または配列番号24に記載のCDRを含む、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- VLが、配列番号2のアミノ酸配列(DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)を含み、ここで配列番号2の位置j(j=9、10、13、21、22、42、43、60、65、80、81、83)におけるXは、XLjと称され、XL9、XL10、XL13、XL21、XL22、XL42、XL43、XL60、XL65、XL80、XL81、XL83のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る、請求項6に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- XL9が、S、PまたはAであり、XL10が、TまたはSであり、XL13が、A、LまたはVであり、XL21が、LまたはIであり、XL22が、SまたはTであり、XL42が、KまたはQであり、XL43が、A、TまたはSであり、XL60が、SまたはAであり、XL65が、SまたはTであり、XL80が、PまたはSであり、XL81が、EまたはDであり、XL83が、FまたはIである、請求項7に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項7に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
(a)XL9が、SまたはAであり、XL10が、TまたはSであり、XL13が、Aであり、XL21が、LまたはIであり、XL22が、SまたはTであり;および/または
(b)XL42が、KまたはQであり、XL43が、AまたはTであり;および/または(c)XL60が、Sであり、XL65が、SまたはTであり、XL80が、Pであり、XL81が、EまたはDであり、XL83が、Fである、
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。 - VLが、配列番号16、配列番号18または配列番号20のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- VLが、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28に記載のFRを含む、請求項6に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗原結合フラグメントが、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、dAb、および単鎖結合ポリペプチドから選択される抗体フラグメントである、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 重鎖ポリペプチドが、ヒトIgG重鎖の定常領域を含む、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトIgGが、ヒトIgG2である、請求項10に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 軽鎖ポリペプチドが、ヒトκ鎖の定常領域を含む、請求項6に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 約1×10−11M〜約5×10−10MのKDでベイシジンに結合する、請求項1に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 5×10−11M〜約1.1×10−10MのKDでベイシジンに結合する、請求項16に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントと、ベイシジンとの結合に関して競合することができる、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列。
- 配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号17、配列番号19、または配列番号21のヌクレオチド配列を含む、請求項19に記載の単離された核酸配列。
- ヒトIgG重鎖またはヒトカッパ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項19に記載の単離された核酸配列。
- 請求項20または21に記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項22に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が、CHO細胞である、請求項23に記載の宿主細胞。
- (a)請求項1〜18のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント、および(b)医薬的に許容される担体を含む組成物。
- 対象におけるベイシジンに関連する疾患を治療する方法であって、対象に有効量の請求項25に記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
- ベイシジンに関連する疾患が、がんまたはマラリアである、請求項26に記載の方法。
- がんが、肺がん、肝臓がん、子宮頸がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、食道がんまたは胃がんである、請求項27に記載の方法。
- 対象が、ヒトである、請求項26に記載の方法。
- 対象においてベイシジンに関連する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項1〜18のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
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