CN111690062A

CN111690062A - 针对恶性疟PfRh5靶点的全人源单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN111690062A
Application number: CN201910194566.5A
Authority: CN
Inventors: 应天雷; 胡丹; 吴艳玲; 陆荫英
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN111690062B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及针对恶性疟PfRh5表位的抗体、其抗原结合片段。它包括框架区FR区、CDR区；所述的FR区包含SEQ ID NO:1的1‑26位、33‑49位、53‑88位和/或98‑107位氨基酸，及SEQ ID NO:2的1‑25位、34‑50位、59‑96位和/或116‑126位氨基酸；所述的抗体的CDR区包含SEQ ID NO:1的27‑32位、50‑52位和/或89‑97位氨基酸，及SEQ ID NO:2的26‑33位、51‑58位和/或97‑115位氨基酸。利用此抗体或者抗原结合片段，检测恶性疟PfRh5表位或者筛选相应的药物，用于临床上预防或治疗恶性疟相关疾病。

Description

针对恶性疟PfRh5靶点的全人源单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及针对恶性疟PfRh5靶点的全人源单克隆抗体、其抗原结合片段的氨基酸序列，和它们的应用。

背景技术

由疟原虫感染导致的疟疾(malaria)是全世界最为严重的传染病之一，与艾滋病、结核病一起被世界卫生组织(WHO)列为全球亟需控制的公共卫生问题[1]。2016年WHO公布的数据显示，目前全球97个国家、领土和地区中大约32亿人处于罹患疟疾的危险之中，报告了2.16亿疟疾感染患者，其中50万人死亡，迄今为止还没有有效疫苗。目前用于疟疾治疗的有效药物主要分为两类，第一类以青蒿素为代表的杀灭红细胞内滋养体和裂殖体的药物，第二类为杀灭肝细胞内迟发型孢子和红细胞内配子体的药物。但是这些抗疟药物通常只对部分种类的疟原虫有效，长期服用会产生耐药性及毒副作用[2,3]，这也是疟疾防治一直以来的难题。值得关注的是，原本无疟疾的国家最近暴发流行了疟疾，以及过去十年中在降低疟疾发病率和死亡率方面已取得重要进展的国家中也出现了疟疾死灰复燃的情况，这些都显示了疟疾再次爆发流行和大规模传播的危险。最使人堪忧的是，柬泰边境一些地区的恶性疟原虫目前已经对几乎所有可用的抗疟药都有耐药性。因此，开发安全、耐受性好、经济上可负担、作用范围广泛的新型抗疟疾特效药物用于恶性疟治疗，意义非常重大。

恶性疟原虫红细胞结合蛋白同源物(PfRh)和红细胞结合类蛋白是参与入侵的重要信号[4]。Crosnier等人发现恶性疟原虫在人体血液中入侵红细胞的时候，疟原虫表面PfRh5蛋白与红细胞表面的basigin受体结合可以诱导Ca²⁺释放到红细胞中，并标志着裂殖子和血细胞膜的桥连通道的形成[5]。因此，PfRh5对于裂殖子的侵入至关重要，用抗PfRh5抗体或抗basigin抗体可抑制疟原虫感染红细胞[6]。最为重要的是，PfRh5蛋白在所有种类的恶性疟原虫中很保守，因此开发针对PfRh5蛋白的全人源单克隆抗体可有效防治恶性疟原虫的传播，有望开发成恶性疟原虫的防治药物。

参考文献

1.Vitoria,M.,et al.,The global fight against HIV/AIDS,tuberculosis,and malaria:current status and future perspectives.Am J Clin Pathol,2009.131(6):p.844-8.

2.Wyler,D.J.,Malaria:overview and update.Clin Infect Dis,1993.16(4):p.449-56.

3.Horton,R.J.,Introduction of halofantrine for malariatreatment.Parasitol Today,1988.4(9):p.238-9.

4.Riglar,D.T.,et al.,Super-resolution dissection of coordinatedevents during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.Cell HostMicrobe,2011.9(1):p.9-20.

5.Crosnier,C.,et al.,Basigin is a receptor essential for erythrocyteinvasion by Plasmodium falciparum.Nature,2011.480(7378):p.534-U158.

6.Douglas,A.D.,et al.,Neutralization of Plasmodium falciparummerozoites by antibodies against PfRH5.J Immunol,2014.192(1):p.245-58.。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种针对恶性疟PfRh5的抗体。

本发明提供了一种针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，所述的抗体或抗原结合片段包括框架区FR区，或者含有重链和轻链的互补决定区CDR区；

所述的FR区包含：

抗体的轻链框架区含有SEQ ID NO:1的1-26位、33-49位、53-88位和/或98-107位氨基酸，及抗体的重链框架区含有SEQ ID NO:2的1-25位、34-50位、59-96位和/或116-126位氨基酸；

所述的抗体的CDR区包含：

抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1的27-32位、50-52位和/或89-97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2的26-33位、51-58位和/或97-115位氨基酸。

本发明中，所述的抗体、CDR区以及FR区都是全人源的。

较好的，本发明的抗体是单克隆抗体。

所述的CDR区中抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸；抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2的26-33位，51-58位，和/或97-115位氨基酸。

所述的FR区中，抗体的轻链框架区是SEQ ID NO:1的1-26位，33-49位，53-88位，和/或98-107位氨基酸；抗体的重链框架区是SEQ ID NO:2的1-25位，34-50位，59-96位，和/或116-126位氨基酸。

本发明中，针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，具有如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

在本发明的一个实施例中，所述的抗体为IgG1。

本发明中，所述的抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)₂。

本发明还提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段。

本发明还提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有上述的单克隆抗体或抗原结合片段，或权者双特异性抗体，并且与一种效应分子偶联。

其中，所述的偶联分子是可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

另一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述多核苷酸编码上述针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段或者双特异性抗体，或者上述免疫偶联物。

较好的，上述核酸分子可以可操作地连接至启动子。

本发明提供了一种质粒，所述的质粒含有上述核酸分子。

较好的，所述的质粒是一种病毒质粒。

本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的质粒，或其基因组中整合前述核酸分子。

另一方面，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段的用途，即用于检测生物样品中恶性疟的PfRh5蛋白或用于预防和治疗恶性疟的药物。

其中，检测恶性疟PfRh5蛋白的方法包含：

生物样品；

上述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段或者双特异性抗体，或者前述偶联物；

在足以形成免疫复合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在恶性疟PfRh5蛋白。

其中，生物样品来源于人类或鼠类的血液或骨髓。

本发明提供了用于预防和治疗恶性疟的一种药用组合物，含有有效预防剂量的上述的单克隆抗体或抗原结合片段或者双特异性抗体、上述偶联物、上述核酸分子或者质粒；以及一种药学可接受载体。

本发明公开了特异性结合恶性疟原虫PfRh5蛋白的全人源单克隆抗体及其氨基酸序列，用于表达本发明中的单克隆抗体的载体和宿主细胞。本发明还公开了这些抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物。这里公开的抗体和组合物可以用于恶性疟原虫的预防和治疗。

在本发明的优选实施方式中，单克隆抗体，或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列和/或重链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆G9的轻链和/或重链可变区的互补决定区(CDR)。利用此抗体CDR区或部分或全基因，可在原核和真核细胞及任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体，可在临床上预防或治疗恶性疟原虫。

附图说明

图1.针对PfRh5蛋白特异性抗体筛选富集。用生物素标记的PfRh5对抗体库进行3轮噬菌体筛选，多克隆噬菌体ELISA检测特异性抗体的富集。

图2.利用生物膜干涉技术(BLI)检测特异性抗体G9的抗原结合片段(Fab)与恶性疟PfRh5的结合亲和力。

图3.G9抗体可有效抑制蚊子体内疟原虫。

具体实施方式

实施例1恶性疟PfRh5蛋白的生产

将合成的恶性疟PfRh5基因插入到表达质粒中。将表达质粒瞬时转染昆虫细胞sf9，表达PfRh5蛋白并进行纯化。

实施例2恶性疟特异性抗原结合片段(Fab)的筛选

利用之前构建的库容量为1.5×10¹¹的超大型噬菌体展示的全人源Fab抗体库，针对生物素标记的PfRh5蛋白来筛选抗体。将生物素标记的PfRh5蛋白固定在链亲和素包被的磁珠上，10¹²个噬菌体展示的抗体在常温下于1,2,3轮分别与5,3,3微克抗原孵育两小时，每轮的筛选所用的噬菌体均为10¹²个。

实施例3多克隆噬菌体-酶联免疫分析检测

经过3轮筛选后，对每轮筛选后得到的噬菌体抗体库进行多克隆噬菌体ELISA检测，以确定抗体的富集。PfRh5以每孔100ng包被于96孔ELISA酶标板4℃过夜。用含有3％(m/v)脱脂奶粉的PBS(MPBS)封闭1h后，加入10¹¹个第1、2、3轮筛选后得到的噬菌体抗体库上清与包被的抗原于37℃孵育1.5h。洗去未结合的噬菌体，结合的噬菌体可用HRP-anti-M13抗体检测。加入ABTS显色，于酶标仪读取405nm处的吸光度值。根据多克隆噬菌体ELISA结果(图1)，显示特异性的抗体在第3轮得到富集。

实施例4特异性抗原结合片段(Fab)与恶性疟PfRh5蛋白的结合能力的检测

对于抗体Fab片段的表达及纯化，依先前所述，将挑选出来的阳性克隆的噬菌体质粒转入E.coli HB2151感受态细胞，从过夜生长的2YT-AG平皿中挑取单个菌落，接种到SB培养基中，30℃条件下进行IPTG诱导表达并收获细菌用Ni-NTA进行纯化，SDS-PAGE电泳检测纯度。

使用BLI技术对抗体G9与PfRh5蛋白的结合动力学进行检测，BLI实验在Octet-Red96仪器上进行，使用氨基偶联传感器(AR2G biosensor)，固定PfRh5蛋白，抗体溶液作为分析样品。步骤如下：将PfRh5蛋白用10mM乙酸钠(pH 5.0)稀释至30μg/ml，然后固化到激活的AR2G传感器上，与3倍梯度稀释的抗体(浓度范围为1.2～100nM)在running buffer(含有0.05％Tween-20的PBS溶液)中进行结合，其中空白对照孔中不加入抗体。程序设定为：Association，300s；dissociation，300s，温度设定为37℃。应用ForteBio Data analysis8.1软件对数据进行分析。以对应的空白对照孔作为对照扣减背景，各浓度的曲线按照1：1结合模式进行拟合，得到动力学分析结果，报告中显示抗体与各抗原结合的平衡常数(KD)值以及结合速率常数(Kon)和解离速率常数(Koff)。如图2所示，G9与PfRh5蛋白的亲和力为4.9nM。

实施例5G9抗体可有效抑制蚊子体内疟原虫

将抗体G9(60ug/ml)喂食携带疟原虫的蚊子，然后对蚊子进行解剖，比较对照组和抗体组中的蚊子其体内的虫卵数目。结果显示，发现抗体组的蚊子体内虫卵数目较对照组明显减少，说明抗体G9可以有效地抑制蚊子体内的疟原虫(图3)。

本发明涉及的序列如下:

>G9VL(SEQ ID NO:1):

SEQ ID NO:1是G9轻链可变区的氨基酸序列；

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKLEIK。

>G9VH(SEQ ID NO:2):

SEQ ID NO:2是G9重链可变区的氨基酸序列；

EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHIDDPAMVPSPPAFDIWGQGTMVTVSS。

G9LCDR1:

SEQ ID NO:3是G9轻链可变区CDR1的氨基酸序列；

QSVSSY(SEQ ID NO:3)。

G9LCDR2:

SEQ ID NO:4是G9轻链可变区CDR2的氨基酸序列；

DAS(SEQ ID NO:4)。

G9LCDR3:

SEQ ID NO:5是G9轻链可变区CDR3的氨基酸序列；

QQSYSTPRT(SEQ ID NO:5)。

G9HCDR1:

SEQ ID NO:6是G9重链可变区CDR1的氨基酸序列；

GFTFDDYA(SEQ ID NO:6)。

G9HCDR2:

SEQ ID NO:7是G9重链可变区CDR2的氨基酸序列；

IWYDGSNK(SEQ ID NO:7)。

G9HCDR3:

SEQ ID NO:8是G9重链可变区CDR3的氨基酸序列；

AREHIDDPAMVPSPPAFDI(SEQ ID NO:8)。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 针对恶性疟PfRh5靶点的全人源单克隆抗体及应用

<130> 20190301

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu His Ile Asp Asp Pro Ala Met Val Pro Ser Pro Pro Ala

100 105 110

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Gln Ser Val Ser Ser Tyr

1 5

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 4

Asp Ala Ser

1

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 5

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 7

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 8

Ala Arg Glu His Ile Asp Asp Pro Ala Met Val Pro Ser Pro Pro Ala

1 5 10 15

Phe Asp Ile

Claims

1.一种针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或抗原结合片段包括框架区FR区，或者含有重链和轻链的互补决定区CDR区；

所述的FR区包含：

抗体的轻链框架区是SEQ ID NO:1的1-26位、33-49位、53-88位和/或98-107位氨基酸，及抗体的重链框架区是SEQ ID NO:2的1-25位、34-50位、59-96位和/或116-126位氨基酸；

所述的抗体的CDR区包含：

2.如权利要求1所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体、CDR区以及FR区是全人源的。

3.如权利要求1所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的CDR区中抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸；抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2的26-33位，51-58位，和/或97-115位氨基酸。

4.如权利要求1所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的FR区中，抗体的轻链框架区含有SEQ ID NO:1的1-26位，33-49位，53-88位，和/或98-107位氨基酸；抗体的重链框架区含有SEQ ID NO:2的1-25位，34-50位，59-96位，和/或116-126位氨基酸。

5.如权利要求1所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体为IgG1。

7.如权利要求1-5中任一项所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)₂。

8.一种双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体含有权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。

9.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，或权利要求8所述的双特异性抗体，并且与一种效应分子偶联。

10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的偶联分子是可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

11.一种核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-7中任一项所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段或者权利要求8所述的双特异性抗体，以及权利要求9-10中任一项所述的免疫偶联物。

12.如权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，它可操作地连接至启动子。

13.一种质粒，其特征在于，所述的质粒含有权利要求11或者12所述的核酸分子。

14.如权利要求13所述的质粒，其特征在于，所述的质粒是一种病毒质粒。

15.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求13或者14所述的质粒，或其基因组中整合权利要求11所述的核酸分子。

16.如权利要求1-7任一项所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段在制备用于检测生物样品中恶性疟的PfRh5蛋白或用于预防和治疗恶性疟的药物中的用途。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的检测恶性疟PfRh5蛋白的方法包含：

(1)生物样品；

(2)权利要求1-7中任一项所述的针对恶性疟PfRh5的抗体或抗原结合片段，权利要求8所述的双特异性抗体，或权利要求9-10中任一项所述的偶联物；

(3)在足以形成免疫复合物的条件下，检测免疫复合物的存在与否，其中免疫复合物的存在表示生物样品中存在恶性疟PfRh5蛋白。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述检测方法中其生物样品来源于人类或鼠类的血液或骨髓。

19.一种用于预防和治疗恶性疟的药用组合物，其特征在于，含有有效预防剂量的权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求8所述的双特异性抗体，权利要求9-10中任一项所述的偶联物，权利要求11-12中任一项所述的核酸，或权利要求13-14中任一项所述的质粒；以及一种药学可接受载体。