JP4475949B2 - 組換え抗マラリア原虫抗体 - Google Patents
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Description
毎年250万人を超える人々がマラリア病によって死亡しており、その大部分は子供である。
本発明者らは初めてMSP-3抗原に特異的な組換えヒト抗体を開発した。これらの抗体は、天然の非滅菌(non-sterile)マラリア免疫を受動的に誘導し(相関免疫と呼ばれる)、ADCIメカニズムを介してそれらの作用を発揮することができる。また、組換え抗体は感染赤血球および遊離寄生虫の食作用を誘発し得る。さらにこれらの抗体のもう1つの作用メカニズムは、エピトープに結合することによるMSP-3分子および/またはMSP-6分子の機能の直接妨害であると考えられる。
よって、第1の態様において本発明は、マラリア原虫のMSP-3抗原に特異的な抗体配列を含んでなる組換えヒト抗体を提供する。
(i) 標的分子(抗原など)を、好適なリンカーを用いてビーズに付着させる工程、
(ii) 標的分子を付着させたビーズを第1の量で、該標的分子と結合しうる、抗体配列などの配列を発現するファージディスプレーライブラリー由来の第1のファージ集団と混合する工程、
(iii) その第1のファージ集団から、標的分子と結合するファージが富化された第2のファージ集団を選択する工程、
(iv) この第2のファージ集団を、第1の量より少ない第2の量の上記ビーズと混合する工程、
(v) 第2のファージ集団から、標的分子と結合するファージが富化された第3のファージ集団を選択する工程、
を含んでなるファージディスプレーライブラリーをスクリーニングする方法が提供される。
本明細書に開示された抗体は、マラリア病の治療または予防のために使用することができる。
図1は、種々の末端切断型MSP-3のELISA反応性を示す。3つの異なるクローンから製造したFab-ΔpIIIフラグメントをELISAで分析した。別の分析では、組換え生産された末端切断型のMSP-322-257 (黒い棒グラフ)、MSP-3194-257 (灰色の棒グラフ)をコーティング抗原として用いた。種々のFabフラグメントを確実に同程度の量で使用できるようにFabフラグメント(抗Fab)検出のためのELISAも含めた(白い棒グラフ)。バックグラウンドは、HibCPに対する対照Fabとの反応性およびバッファーとの反応性として測定した。反応性はOD405-OD490として示した。棒グラフは中央値を示し、エラー・バーは、3回反復実験の標準偏差の2倍を示す。
図13。抗体の競合。RAM3クローン由来のFabフラグメントを2つの形態で作製した。1つの形態は、末端切断型ファージタンパク質であるΔpIIIでタグ付けされた、Fab-ΔpIIIと呼ばれる融合タンパク質であり、もう1つの形態はΔpIIIタグをもたない通常のFabフラグメントである。ΔpIIIタグは、ファージpIIIタンパク質に対する抗体を用いて容易に検出される。従って、ΔpIIIをもたないFabは競合物として存在できるが、Fab-ΔpIIIのみが検出される。MSP-3194-257コーティング上でのELISAにおいてOD405がおよそ1となるRAM1、RAM2およびRAM3 Fab-ΔpIIIの量を用いた。次に、逓増量の競合物、すなわちΔpIIIをもたないRAM3を加えることによりFab-ΔpIIIの結合に競合させる。この図はFab RAM3が、Fab-ΔpIII RAM2と競合するのと同程度に、Fab-ΔpIII RAM1と競合し得ることを示す。このことは、RAM1およびRAM2クローンの結合はRAM3クローンが利用するエピトープに依存することを実証している。Fab-ΔpIII RAM3の結合に対するRAM3の競合作用がより低いことは、RAM1およびRAM2と比較してRAM3の親和性がより高いことによって説明できる。この作用は、RAM1およびRAM2に対するRAM3の競合作用がRAM3自体に対するものよりも大きいということである。
実施例1 ライブラリーの構築
末梢血リンパ球のサンプリング
西アフリカのセネガルのマラリア流行地に居住している13人の成人のそれぞれからインフォームドコンセントの後、100ml量の末梢血を得た。血液は、ヘパリンよりも良好にRNAを保存する抗凝固剤ACD(クエン酸デキストロースアデニン)中に採取した。これらのサンプルを実験室に送り、簡易遠心分離を行い、軟膜を吸引し、細胞を塩酸グアニジニウム、β-メルカプトエタノールおよびサルコシンを含有するRNアーゼ保護バッファーに懸濁させた。次に、この材料を液体窒素中で凍結させ、さらなる処理のために発送した。
RNAは、Chirgwinら(Chirgwinら, 1979)の方法に従って酸フェノール抽出によりサンプルから単離した。Orumら(1993)により記載されたようにして、メッセンジャーRNAをcDNAへ変換した。
抗体遺伝子の増幅はこれまでに記載されているようにして行った(Dziegielら, 1995)。簡単に説明すると、VH遺伝子、λ軽鎖遺伝子について、およびκ軽鎖遺伝子について別個の反応を行った。12の個々のプライマーのプールをVH遺伝子の5'領域におけるプライミングに用い(逆方向プライマー)、3'プライマーのプールをJH領域のプライミングに用いた(順方向プライマー)。これらのプライマーの詳細はDziegiel (1995)に示されている。
抗体遺伝子をcDNAから、VH領域遺伝子、λ鎖遺伝子、およびκ鎖遺伝子のそれぞれについて別個の反応によるPCRによって増幅した。PCRは、0.2mM dNTPsおよび製造業者(HT Biotechnology, UK)により供給されている反応バッファー、総量20μMのプライマー等モル混合物(すなわち、0.65μMの各VHプライマー、0.74μMの各Vκプライマー、0.83μMの各Vλプライマー、20μMのκ鎖定常ドメインプライマー、5μMの各λ鎖定常ドメインプライマー、および5μMの各J領域プライマー)、cDNA、および酵素を含む100μl量で行った。最初に94℃で1分行った後、酵素を添加し、次に、サイクル(94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分)を30回繰り返した。反応は、HYBAID Omnigeneサーモサイクラーを用いたこと以外は記載(Orumら, 1993)のようにして行った。
pFAB73HHuiベクターはpFAB73H(Dziegielら, 1995; Engbergら, 1996)から作製した。このベクターはlacIリプレッサーの高効率突然変異体をコードする完全なlacIq遺伝子を担持している。これにより細菌のバックグラウンドとは無関係に高レベルの遺伝子抑制が確保できる。NheI-ApaI部位間の配列およびSfiI-AscI部位間の配列はヒトインスリンに対するマウス抗体に由来する配列で置き換えられていた。これにより、二次消化の効率が改善され、次に行う低融点アガロース電気泳動の際の二重消化されたプラスミドの単離が容易となる。このプラスミドのその他の特徴はpFAB4Hと同じである。簡単に説明すると、pFAB73HHUIは、定常ドメイン1(CH1)に相当するヒトγ1 H鎖のアミノ酸残基118〜230をコードするDNA断片を含む。スペーサーおよびトリプシン切断部位をコードするDNA断片を介して、CH1遺伝子が末端切断型の遺伝子III(ΔgIII)へとイン・フレームで続いている。ΔgIIIは繊維状ファージf1の末端切断型表面タンパク質pIII(ΔpIII)をコードする(Bassら, 1990; Orumら, 1993)。lacZプロモーターおよびPelBリーダー遺伝子の5'部分を、L鎖遺伝子のクローニング部位の前に配置した。リボゾーム結合部位(RBS)およびPelBリーダーをコードする遺伝子の5'部分を含むDNA断片はH鎖可変領域(VH)遺伝子のクローニング部位の5'側に配置した。
二次伸長PCR由来の増幅産物を低融点アガロース上で分離した後、アガラーゼで消化することにより分離した。伸長したVH断片を、逐次の二反応で制限酵素NheIおよびApaIにより消化した。NheI-ApaIで消化したVH遺伝子断片を低融点アガロースゲル上で精製した後、アガラーゼで消化した。このクローニングベクターpFAB73HHUIを逐次の二反応で制限酵素NheIおよびApaIで消化した。NheI-ApaI消化5.4kbプラスミドを低融点アガロースゲル上で精製した後、アガラーゼで消化した。このVH遺伝子をプラスミド中にライゲーションし、ライゲーション混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、大腸菌(E. coli)パルサーセット(BioRad)を用いて大腸菌Top10Tet中へエレクトロポレーションした。細菌をSOC培地(Sambrookら, 1989)に再懸濁し、振盪しながら37℃で1時間インキュベートした後、50mg/lカルベニシリン、12.5mg/lテトラサイクリンおよび2%グルコースを含むLB寒天(Sambrookら, 1989)上にプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。プレートからコロニーを、カルベニシリン、テトラサイクリンおよびグルコースを含むLB培地で洗い出し、これを用いて液体培養を開始し、OD600=1の時点でそれを用いて、Qiagenカラム(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を製造業者が推奨する手順に従って使用して、この組換えベクターを調製した。H鎖遺伝子を含む精製ベクターを、κおよびλ軽鎖遺伝子のクローニングのためのクローニングベクターとして用いた。
得られたライブラリーは5x107の各種H鎖、1x108のκ軽鎖および1x108のλ軽鎖を含んだ。66クローンに由来するVH遺伝子をPCRおよびBstNI消化により検討したところ、同一の消化パターンはに認められないことが示され、従って許容される多様性が示唆された。
一次ファージストックの作製
50mg/lカルベニシリン、12.5mg/lテトラサイクリンおよび2%グルコースを含むLB培地中のライブラリー培養物50mlに、OD600=0.8のVCSM13ヘルパーファージ(Stratagene)を用いて重複感染させた。感染多重度を100として用いて、その混合物を37℃で穏やかに振盪(500rpm)しながら1時間インキュベートした。次に、この培養物を、グルコースを含まない上記培地950ml中に希釈し、30℃で一晩インキュベートした。10,000 x gで15分スピンした後、ファージを含む上清について、PEG6000および塩化ナトリウムをそれぞれ終濃度4%および0.5Mで用いて沈殿させた。この上清を氷上で1時間インキュベートし、12,000 x gで30分遠心分離した。沈殿させたファージを、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁させ、すぐに使用した。コロニー形成単位の総数は1.3 x 1013であった(Sambrookら, 1989と同様に測定)。
ビオチン化MSP-3194-257を、ダイナビーズ(Dynabeads)M-280ストレプトアビジン(カタログ番号112.05)に、製造業者が記載しているようにして結合させた。この抗原コーティングビーズを、上下反転型(end-over-end)ミキサー中で、ファージとともに1時間インキュベートした後、磁性粒子濃縮装置(MPC-6, Dynalカタログ番号120.02)を用いて5分間かけてビーズを捕捉し、次に、0.05% Tween20を含む10ml PBSで2分間にわたる洗浄を6回行った。最後の洗浄の後、ビーズを1mgトリプシン(Worthington, USA)を含む1ml PBSに再懸濁させ、37℃で1時間インキュベートして、ファージを溶出した。次に、OD600=1である指数増殖期のTop10を3ml量加え、混合物を37℃で30分間インキュベートして、溶出したファージを大腸菌に付着させた。最後にこの細菌を、50mg/lカルベニシリン、12.5mg/lテトラサイクリンおよび2%グルコースを含むLB寒天(Sambrookら, 1989)上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。プレートからLB培地でコロニーを洗い出し、グリセロールストックとして-80℃で保存するか、またはファージおよびDNAの作製のために増殖させた。DNAは記載のように作製した。
ヘルパーファージVCSM13(Stratagene, USA)を添加することにより、OD600=0.6(約3時間後)のグリセロールストックの培養物15mlを重複感染させて、ファージを産生させた。感染多重度は約100であった。1時間穏やかに振盪した後、培養物を200mlのLB培地に希釈し、さらにイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)(終濃度50μMとなるように)、70mg/lカナマイシン、50mg/lカルベニシリンおよび12.5mg/lテトラサイクリンを添加した。この培養物を一晩増殖させた。ファージは、パンニングの前に17,320 x gで各20分のスピンをさらに2回行うことにより清澄化したこと以外は上記と同様にして単離した。
1回目のパンニングに続いて、3組の実験系のパンニングを並行して、計4ラウンド行った。第1の組では、ビーズの数はその後のパンニング毎に5分の1に減らした。第2および第3の組では、ビーズの数は、あるパンニングからその次のパンニングに移る毎にそれぞれ10分の1および20分の1に減らした。4回目のパンニングの後、3組の実験系全てからの単一コロニーを、Fab-ΔpIIIの産生のために無菌マイクロタイタープレート中で増殖させた。
4回目のパンニングからの溶出物を、Fab-ΔpIII産生体および抗原結合体のそれぞれが存在するかどうかについてスクリーニングした。Fab-ΔpIIIは、マイクロタイターウェル中で個々のコロニーを増殖させることにより産生させた。全部で376のクローンを調べた。23のクローンに由来する上清に遊離のFab-ΔpIIIが含まれ、これらのうち17がMSP-3194-257と結合することができた(表I参照)。これら17のクローンの抗体遺伝子を、Big Dyeを用いて製造業者(Applied Biosystems, USA)の手順に従い配列決定した。
これらクローンの、天然マラリア抗原との反応性を証明した。
ELISAプレート(Maxisorb, NUNC 4-39454, Denmark)を、10〜650ng/ウェルの精製組換えMSP-322-257もしくはMSP-3194-257、またはそのペプチドMSP-3190-217もしくはMSP-3211-237を含むPBSでコーティングし、非希釈上清またはPBS-BSAで希釈した上清を用い、これまでに記載されているようにして(Dziegielら, 1991; Dziegielら, 1995)標準的ELISAに用いた。洗浄後、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトFab(Sigma A8542)または抗ヒトIgG Fc(Sigma A9544)抗体を検出用抗体として添加した。最後に、p-ニトロフェニルリン酸(Sigmaホスファターゼ基質タブレット104-105)を基質として用いた。発色をOD405-OD490で測定した(図1参照)。RAM1およびRAM2の両者はMSP-3抗原の組換え形態である短鎖MSP-3194-257および長鎖MSP-322-257と結合する。これに対し、RAM3は短鎖MSP-3194-257形態とのみ結合する。対照(抗Hib CPおよびPBS 1%BSA)はこの抗原と反応しない。
固定希釈率のFab-ΔpIII 50μlを含むウェルに、種々の希釈率の競合抗原MSP-3193-256を50μl加えた。MSP-3194-257によるウェルのコーティングおよび結合した抗原の検出は上記のように行った。競合抗原の濃度は4nM〜1250nMの範囲とした。各希釈率の競合抗原を2回重複して試験した(図2参照)。3つのクローン全てが可溶性組換えMSP-3194-257抗原による競合を受けた。このことは、これらの抗体が溶液中の抗原のコンホメーションを指向しており、何らかの変性依存的なコンホメーション、例えばプラスチックとの結合に依存するエピトープを指向するものではないことを示す。
マラリア原虫クローン3D7のin vitro培養からの寄生赤血球をスライドグラスに接着させ、風乾した後、記載(Druilheら, 1987)のようにして室温にて5分間かけてアセトンで固定した。Fab-ΔpIIIまたは完全IgG1を加え、30分後にスライドグラスをPBS中で洗浄した。結合したFab-ΔpIIIはFITCコンジュゲートヤギ抗ヒトFab(Sigma F5512)の1:25希釈物を用いて検出した。Hib-CP特異的抗体を対応する濃度で対照として用いた。この、DNAを含む感染赤血球を染色するため、ヨウ化プロピジウムを二次抗体溶液に加えた。後期シゾントステージが、そのメロゾイトDNA含量が高いためにヨウ化プロピジウムで強く染色された。RAM1 Fabはまさにこのステージを染色した。これに対し、寄生虫DNAを少量しか含まない赤血球はRAM1 Fabと結合しなかった。少量のDNAしか含まない赤血球は初期ステージ、すなわち、輪状体期および栄養体期に相当する(図8参照)。
精製した寄生虫を、氷上にて超音波で4 x 15秒処理することにより2% Triton X-100中に可溶化し、氷上で2時間インキュベートした後、サンプルバッファーと混合し、100℃まで10分間加熱し、MOPS緩衝4〜12%グラジェントゲル(NOVEX)にてSDS-PAGEに付した。タンパク質をウェットブロッティングにより電気泳動法でPVDFメンブラン(Immobilon, Millipore)に転写し、膜を乾燥させ、使用直前に0.1% Tween20および0.2% I-Block(Tropixカタログ番号AI300)中でインキュベートすることによりブロッキングした。このブロットをIgG1として作製した抗マラリア抗体RAM1、RAM2またはRAM3とともに3時間インキュベートし、0.1% Tween20および0.2% I-Blockを添加したPBSにより3 x 5分間洗浄した後、アルカリホスファターゼコンジュゲートタンパク質G(Pierceカタログ番号32391)とともに1時間インキュベートした。膜を上記のように3回洗浄した。最後に、このブロットにCSPD化学発光基質(Tropixカタログ番号CD100R)を加え、Alpha Innotech FluorChem 8000 systemで発光を検出した。Hib-CP特異的抗体を対応する濃度で陰性対照として用いた(図7参照)。RAM1は、相対分子量が約51kDおよび53kDの寄生虫タンパク質のそれぞれと反応した。RAM2は、相対分子量が約14kDおよび64kDの寄生虫タンパク質のそれぞれと反応した。RAM3は約64kDの寄生虫タンパク質と反応した。ヒトおよびウサギ由来のポリクローナル抗体を用いても同じ範囲の分子量が認められた(Oeuvrayら, 1994; McCollら, 1994)。これら2つの抗体によって認識されたバンドの分子量の変動についてのバックグラウンドとしては、翻訳後修飾、タンパク質分解プロセシングまたはコンホメーションの異なる分子の部分集団の存在が考えられる。後者の可能性は、MSP-3が分子内または分子間のコイルドコイルコンホメーションを有する推定上の傾向(McColl et al, 1994)から導かれるものであり、これは後にMSP-1およびMSP-6のような他のメロゾイト特異的タンパク質に当てはめるようにTruccoら(2001)により拡張された。このような三次元コンホメーションは電気泳動移動度に影響を及ぼし、従って観察される分子量範囲の原因になりうる。14kDのバンドはタンパク質分解によるものであると考えられる。この範囲のバンドについての別の報告はなされていない。
精製したシゾントを、氷上で30分間、32%エタノール中でインキュベートすることにより透過化処理および固定した。次に寄生虫を1% BSAを含むPBS中で洗浄し、抗体(Fab-ΔpIIIまたはIgG1)とともに一晩インキュベートし、1% BSAを添加したPBSで2回洗浄し、FITCコンジュゲートヤギ抗ヒトFab(Sigma F5512)の1:25希釈物とともに30分間インキュベートした。細胞をCoulter EPICS-2フローサイトメーターで分析した。Hib-CP特異的抗体を、対応する濃度で対照として用いた。固定した感染赤血球および固定した非感染赤血球をヨウ化プロピジウムで染色し、比較することにより、感染赤血球に対してゲーティングすることが可能になる(図4参照)。
本発明者らのエピトープマッピングは、以前に利用した、MSP-3194-257のMSP-3a、MSP-3bおよびMSP-3c(Oeuvrayら, 1994)と呼ばれる3つのペプチドへの任意の分割と関連する。MSP-3194-257の切断の生物学的妥当性は、MSP-3211-237に相当するMSP-3bに対するポリクローナル抗体がADCIにおいてもマウスモデルにおいても明確な抗寄生虫作用を示すことである(Badellら, 2000)。
末端切断型抗原に対する結合についての研究に抗体競合実験を付け加えた。RAM3クローン由来のFabフラグメントを2つの形態で作製した。1つの形態は末端切断型ファージタンパク質ΔpIIIでタグ付けされた、Fab-ΔpIIIと称する融合タンパク質であり、もう1つの形態はΔpIIIタグをもたない通常のFabフラグメントであった。ΔpIIIタグはファージpIIIタンパク質に対する抗体を用いて容易に検出される。従って、ΔpIIIをもたないFabは競合物として存在できるが、Fab-ΔpIIIのみが検出される。
MSP-3194-257をコーティングしたELISAプレート(Maxisorb, NUNC 475515, Denmark)を免疫血清(マラリア免疫個体からのもの)または対照血清のいずれかの連続希釈液とともにインキュベートした。2時間後、プレートをPBS 0.05% Tween 20で5回洗浄した。FITCコンジュゲートRAM1 IgG1抗体を最大反応性が得られる希釈率で添加した。FITCのコンジュゲーションは製造業者(Molecular Probes, カタログ番号F-6434)が記載しているようにして行った。プレートを1時間インキュベートした後、5回洗浄し、その後、Polarstar蛍光リーダー(BMG, Germany)を用いて相対蛍光を測定した。
方法
プラスミド
2つのプラスミドpLNOH2およびpLNOKを用いて完全抗体の真核生物における発現を行った(Norderhaugら, 1997)。
各抗体について、2つの別個のPCR増幅、すなわち重鎖に対するものと軽鎖に対するものを行った。鋳型はpFAB73H+RAM1、pFAB73H+RAM2およびpFAB73H+RAM3であった。RAM1重鎖V領域断片の増幅のための、EuHVH-1と呼ばれる一方のプライマーにはRAM1 VHの5'配列(太字で示す)に基づくものであり、さらに制限酵素BsmIの認識配列(下線と斜体で示す)を含めた。
RAM1軽鎖V領域遺伝子断片を増幅するため、EuHVKユニバーサルおよびEuHJK-14aと呼ばれる2つのプライマーを用いた。EuHVKユニバーサルは、このプライマーセットに由来する全てのκ鎖遺伝子の不変5'配列(二重下線で示す)を利用することによって、Dziegielら, 1995が報告しているプライマーセットと適合させた。
EuHJK-14aは上記で示したEuHJHと同じ原理、すなわち、RAM1 Vκの3'配列に対する相補性(太字で示す)、制限酵素HindIII、BsiWIおよびHpaIの配列(下線で示す)、およびスプライス供与配列と相補的な配列5'A CTC ACG T 3' (大文字で示す)に基づいていた。
RAM2重鎖V領域断片を増幅するため、EuHVH-2と呼ばれる一方のプライマーはRAM2 VHの5'配列に基づいており(太字で示す)、さらに制限酵素BsmIの認識配列(下線と斜体で示す)を含んだ。
Gene Amp PCR System 9600、AmpliTaq Goldおよびその供給バッファーを用いてPCRを行った。プライマーは0.2μMの終濃度で用いた。PCRサイクルには以下の工程:95℃で10分(ホットスタート、AmpliTaqの活性化); 94℃で30秒、40℃で30秒、および72℃で30秒のサイクルを14回; 最後に72℃で10分を1サイクル含めた。
インタクトな抗原を安定発現させるため、真核宿主細胞としてCHO細胞を用いた。
細胞を、10%不活性化ウシ胎児血清(Life Technologies)を添加したハムF-12培地中で50〜80%集密になるまで増殖させた。次に細胞をリポフェクタミン(Life Technologies)を用いて製造業者の手順に従ってトランスフェクトした。翌日、トランスフェクト細胞をマイクロタイタープレートに移し、限定希釈によりクローンを選択した。約14日後、単一細胞コロニーを含むウェルを、ELISAにて抗MSP-3抗体の産生について調べた。ELISAアッセイで最も高い反応を示す約20個のウェル由来の細胞を24ウェルマイクロタイタープレートの新しいウェルに移し、集密になるまで増殖させ、それを6ウェルマイクロタイタープレートの新しいウェルに移し、集密になるまで増殖させ、最後に25cm2 TCフラスコに移した。1つのフラスコ内の細胞を集密になるまで増殖させた後、凍結させた。第2のフラスコ内では細胞を約4週間増殖させ、その時点で上清をELISAにて抗MSP-3抗体の産生について調べた。ELISAアッセイで最も高い反応を示すクローンを2回目の限界希釈に用いた。ELISAアッセイで最も高い反応を示す2回目の限界希釈から得られたクローンを、1)凍結用に、および2)抗体の発現用に用いるのに適当な細胞数まで増殖させた。発現用には、細胞を3個のTCフラスコ(NUNC, Denmark)中で約10%の集密となるように播き、約4週間増殖させた。続いてのアッセイで使用する前に、上清を20,000 x gで30分間遠心分離して、細胞片を除去した。
細胞培養物からの上清中のヒト抗体の組成をキャプチャーELISAにより調べた。ヒト抗体を、ヤギ抗ヒトFabフラグメント(Sigma I5260)のコーティング上に捕捉し、マウス抗ヒトIgG1(Zymed 05-3600)またはIgG3(Zymed 05-3300)をそれぞれ用いて検出した後、ウサギ抗マウスコンジュゲートホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(DAKO P260)で検出した。特異的抗原との反応性についてのELISAは、実施例3で記載したようにして行った。なお、IgG1型のRAM1、RAM2およびRAM3をウエスタンブロット法に用い、RAM1 IgG1をフローサイトメトリーに用いた。
組換えIgGの捕捉はFc部分に特異的なヤギ抗ヒトIgGの1:5,000希釈物(Sigma I2136)を用いて行い、検出はアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖の1:10,000(Sigma A3813)を用いて行った。精製したヒト組換え抗D IgG1、κ(751μg/mL)およびIgG3、κ(135μg/mL)をそれぞれ標準として用いた。標準IgGはマラリア抗体と同じアロタイプであった。ELISAの手順およびバッファーはDziegielら, 1991に記載の通りとした。
抗MSP-3抗体由来のVHおよびVκ遺伝子をプラスミドpLNOH2およびpLNOK中のそれぞれの定常ドメイン遺伝子と組み合わせた。2つの異なる形態の重鎖ベクターpLNOH2を用いた。すなわち、1つの形態はγ1定常ドメイン遺伝子を含み、もう1つの形態はγ3定常ドメイン遺伝子を含むものである。これら2つのベクターを抗MSP-3抗体のIgG1型ならびにIgG3型の産生のために用いた。これらの抗体の組成はELISAでの免疫化学により調べた。IgG1型およびIgG3型の特異性はELISA法で調べた。
清澄化した培養上清を硫酸アンモニウム沈殿(70%)させた後、タンパク質ペレットを水に再懸濁した。透析により、70mM酢酸ナトリウム pH5.0へのバッファー交換を行った。組換えIgGをDEAEセファロースFF(Pharmacia BioTech)を用いて精製した後、ABxカラム(Baker Bond)に流した。バッファーを50mMビシン pH8.5に交換し、0.5M NaClを添加した50mMビシン pH8.5の勾配でIgGを溶出させた。必要であれば、Abxカラムから抗体を含む画分を上記のように硫酸アンモニウムで沈殿させ、ゲル濾過カラム(Superdex200)に適用する。純度はSuperdex200を用いたゲルクロマトグラフィーおよびSDS-PAGE、その後の銀染色により確認した。
これらのアッセイは防御の臨床状態を反映するものである。ADCIは、Bouharoun-Tayounら(1995)に記載のようなヒト血液単球との協働により、マラリア原虫の増殖をin vitroで妨害する個々のIgGの能力を反映する。抗体の存在下でのマラリア原虫メロゾイト食作用アッセイはDielmoの住民200人の間で行われたが、それはその住民の臨床状態を密接に反映している。
このin vitro試験は、マラリア原虫に感染したタイ人の受容者への、アフリカ人IgGの受動移入によって得られた防御の状態と密接な相関があることがこれまでに分かっているADCI(Antibody-Dependant Cellular Inhibition of P. falciparum; マラリア原虫の抗体依存性細胞阻害)と呼ばれる単球依存性抗体媒介型の協働機構(Sabchareonら, 1991; Bouharou-Tayounら, 1990)、ならびにメロゾイト表面のメロゾイト表面タンパク質-3(MSP-3)分子の同定および該抗原のC末端領域内のMSP-3.bエピトープの同定の原点に存在する機構(Oeuvrayら, 1994)を測定することを目的とした。RAM1 IgG1およびRAM1 IgG3を、陽性対照、すなわち、マラリア原虫感染被験者における受動移入のためにより効果的であることが分かっているアフリカ成人IgGプール、MSP-3.bペプチドに対するアフィニティー精製抗体、およびHisテールベクターで発現させたC末端組換え抗原に対する、同じアフリカ人IgGプールの免疫精製によって得られた抗MSP-3 C末端抗体とともに、ADCIアッセイで試験した。陰性対照としては、マラリア流行地に旅行したことのない個体から得たヨーロッパ人の全IgG、アフリカ人被験者由来のRESA (Ring Infected Surface Antigen)に吸着された抗体 、およびメロゾイト表面タンパク質-1(MSP-1)抗原を含めた。これらの試験は3人の異なる正常な血液単球ドナー、およびマラリア原虫の、Ouganda Palo Alto株、またはNF54株由来の3D7クローンのいずれかを用いて3回繰り返した。
上記のようにin vivo試験はBadellら(1995, 2000)が記載しているマウスモデルで行ってもよい。ここで記載するin vivo試験は新たに開発された免疫無防備状態のマウスモデル、すなわち、ヒト赤血球を移植でき、4ヶ月半までの継続期間にわたってマラリア原虫血症を得られるモデルを用いて行った。このモデルは本質的に、Badellら(1995)(下記参照)による初期の説明のものを改良したものであり、本質的にBadellら(1995)(下記参照)およびMorenoら(2000)(下記参照)に記載のプロトコールに一致する。このマラリア原虫動物モデルの霊長類モデルに優る主な利点の1つは、寄生虫血症が慢性レベル、すなわちヒト被験者で得られるものと同等の濃度で持続することである。これは寄生虫血症が急速に発症し、また、数日内に動物を治療する必要があり、そうしなければそれらが感染によって死に至るであろう霊長類モデルとは対照的である。従って、この新しいマウスモデルでは、数日または数週間にわたって連続した実験を行うことができ、従って種々の成分の効果を検討する際に、対照抗体を同じ動物に逐次的に注射することができることから、この動物をそれ自身の対照とすることができる。
ヒト末梢血単核細胞(hu-PBMC):上記と同じ基準を用いて採血した。フィコール-ハイパックにより全hu-PBMC細胞を単離し、35mMのHepes(Gibco, BRL)で緩衝化したハンクス平衡塩溶液(HBSS)で2回洗浄した。HuMNを、プラスチックに接着させることにより富化した。付着した単球をセルスクラッパーで取り出し、非特異的エステラーゼ(NSE)染色により単球数を測定し(平均70%)、生存能をトリパンブルーにより評価した(平均80%)。3 x 107のhu-PBMCまたは3 x 106の精製HuMNのいずれかを各マウスに移植した。
マラリア原虫BXNマウスでは、正常血液単球を接種しても寄生虫血症の経過に有意な変化はなかった(図15および17参照)。同様に、対照抗RESA抗体を単独で、または正常ヒト単球の接種後に注射しても効果は全くなかった(図15)。同様に、抗MSP-1抗体も寄生虫血症の経過に有意な効果はないことが分かった。これに対し、アフィニティー精製したヒト抗MSP-3抗体を接種した場合、それがMSP-3.b合成ペプチドに対してアフィニティー精製することで得られたものであれ、組換えC末端MSP-3組換え体に対してアフィニティー精製することで得られたものであれ、クロロキンやアルテミシンなどの即効性抗マラリア薬による薬物治療と同程度に迅速にBXNマウスにおける寄生虫血症を排除した(図16)。これらの実験において、合成ペプチドまたは組換え抗原のいずれかに対してアフィニティー精製された抗MSP-3抗体は、抗MSP-3抗体が精製されたものと同様の濃度で、完全な防御を示すアフリカ人成人IgGよりも迅速で著しい効果を示したことは注目すべきことである(図18)。組換えRAM1 IgG1または組換えRAM1 IgG3抗体のいずれかを受容する動物では、正常な血液単球のみの接種では寄生虫血症の経過に有意な効果はなかった(顕著な例は図19に示されている)。同じ動物で、続いて陰性対照抗体であるRh D抗原に対する組換え抗体を接種しても有意な効果はなかった(初日は若干の低下が見られるが、その後は寄生虫血症は初期レベルまで再び上昇した)(図19)。これに対し、組換え抗体RAM1 IgG1を最終的に接種すると、これらのヒト化マウスにおいてマラリア原虫の循環寄生虫血症が迅速かつ完全に排除された(図19)。同様に、組換え抗体RAM1 IgG3を接種しても寄生虫血症の著しい低減が引き起こされたが、完全なものではなかった。すなわち、in vitro条件下で、組換えRAM1 IgG1とRAM1 IgG3の間で見られたものと同じ差異が、in vivo条件下のヒト化免疫無防備状態のマウスでも見られた。この組換えRAM1 IgG1がMSP-3.bに対するアフィニティー精製ポリクローナルヒト抗体と同程度の強度で寄生虫血症の低減をもたらすこと、およびこの寄生虫血症の排除が完全なものであり、すなわち、MSP-3に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体と同じように、そして、完全防御的なアフリカ人IgGとは対照的に、96時間で寄生虫血症が認められなくなったことは注目すべきことである。
ライブラリーの構築のために続いて行った戦略は、アフリカのセネガル由来のマラリア免疫個体13人からできる限り多くの抗体遺伝子のクローニングを試みるということであった。このことにより、1人または数人だけから全レパートリーをカバーしようとする戦略とは対照的な重要ないくつかの利点が得られた。マラリアに対する免疫は進化の過程でマラリア流行地の人間が曝された主要な選択圧の1つであると考えられる。各個体においてマラリア免疫が首尾よく生起する上での重要な要因は広範な反応性を示す抗体をコードする選択された重鎖遺伝子を限定された数、例えば105個持つことであると仮定された(Antibody repertoires and pathogen recognition: the role of germline diversity and somatic hypermutation. PhD thesis by Mihaela Oprea, 1999, Santa Fe Institute)。このような抗体の役割は、全く同一の個体において段階的により質の高い応答をもたらす抗体応答を誘発するために、重要かつ有害なあらゆる抗原と相互作用するというものであろう。その質の高さは特異性、親和性および防御的生物学的作用で表される。13人から5 x 107の異なる重鎖遺伝子をクローニングすることにより、ライブラリーには平均して各個体由来の4 x 106の異なる遺伝子が含まれ、従って、105個の重要な遺伝子が各々少なくとも1コピークローニングされた見込みが高まる。1個体から同様のサイズのライブラリーをクローニングすることに基づく別の戦略では、たいていの場合、105種の抗体の基本レパートリーからなる1つの完全レパートリーをクローニングすることになる。
RAM Fabフラグメントをコードするプラスミドを含む大腸菌TOP10菌株はブダペスト条約の規約に基づき以下のように寄託された。
TOP10/F' Tet(R)/pFAB73H+RAM1
寄託機関:
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany.
寄託日:
2002年8月14日
アクセッション番号:
DSM 15134
寄託者:
Morten Hanefeld Dziegiel, HS Blodbank, Copenhagen University Hospital, Blegdamsvej 9, DK-2100 Copenhagen, Denmark.
クローン:
TOP10/F' Tet(R)/pFAB73H+RAM2
寄託機関:
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany.
寄託日:
2002年8月14日
アクセッション番号:
DSM 15135
寄託者:
Morten Hanefeld Dziegiel, HS Blodbank, Copenhagen University Hospital, Blegdamsvej 9, DK-2100 Copenhagen, Denmark.
クローン:
TOP10/F' Tet(R)/pFAB73H+RAM3
寄託機関:
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany.
寄託日:
2002年8月14日
アクセッション番号:
DSM 15136
寄託者:
Morten Hanefeld Dziegiel, HS Blodbank, Copenhagen University Hospital, Blegdamsvej 9, DK-2100 Copenhagen, Denmark.
これらの各クローン中のベクターは、上記のように対応する抗MSP3 FabをコードするVk、CkおよびVH遺伝子を保持している。
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Claims (39)
- マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のMSP-3抗原に特異的な抗体配列を含んでなる組換えヒト抗体であって、該抗体のそれぞれの相補性決定領域(CDR)として、以下:アミノ酸配列SYAMHからなるRAM1 VHのCDR1、アミノ酸配列VISYDGSNKYYADSVKGからなるRAM1 VHのCDR2、アミノ酸配列GASSからなるRAM1 VHのCDR3、アミノ酸配列RASQSISSWLAからなるRAM1 VKのCDR1、アミノ酸配列KASSLESからなるRAM1 VKのCDR2、およびアミノ酸配列QQYKSFPYTからなるRAM1 VKのCDR3、を有している、組換えヒト抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するRAM1のVHドメインを含んでなる、請求項1に記載の組換えヒト抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列を有するRAM1のVLドメインを含んでなる、請求項1または2に記載の組換えヒト抗体。
- γ1、γ2、γ3、γ4、my、α1、α2、δ、またはεイソ型から選択される定常領域を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体。
- 上記定常領域がγ1、γ2、γ3またはγ4イソ型から選択され、IgG分子を形成する、請求項4に記載の組換えヒト抗体。
- 上記定常領域がγ1またはγ3イソ型から選択され、IgG1またはIgG3イソ型を形成する、請求項5に記載の組換えヒト抗体。
- アロタイプGlm(a,z)、Glm(f)、G3m(b)、G3m(c3c5)、G3m(c3)またはG3m(s)を有する、請求項6に記載の組換えヒト抗体。
- アロタイプGlm(a,z)またはG3m(b)を有する、請求項7に記載の組換えヒト抗体。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体をコードする核酸配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- 組換えベクターの形態である、請求項9に記載の核酸分子。
- 請求項10に記載の核酸分子を含んでなる、宿主細胞。
- 請求項10に記載の核酸分子から、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体を宿主細胞中で発現させる方法。
- 請求項11に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養することを含んでなる、抗体の製造方法。
- 宿主細胞が植物細胞である、請求項13に記載の方法。
- 上記抗体を細胞培養物から単離することをさらに含んでなる、請求項13または14に記載の方法。
- 単離された抗体を、別の抗体または賦形剤もしくは担体のような好適なさらなる成分と混合することをさらに含んでなる、請求項15に記載の方法。
- マラリア病の治療に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体。
- マラリア病の治療用の医薬の製造における、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体の使用。
- その用量が抗体10μg〜10mg/kg体重である、請求項17に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体1.5mg〜3.5mg/kg体重である、請求項19に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体2mg/kg体重である、請求項20に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体10μg〜10mg/kg体重である、請求項18に記載の使用。
- その用量が抗体1.5mg〜3.5mg/kg体重である、請求項22に記載の使用。
- その用量が抗体2mg/kg体重である、請求項23に記載の使用。
- マラリア病の予防に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体。
- マラリア病の予防用の医薬の製造における、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換えヒト抗体の使用。
- その用量が抗体0.1mg〜3mg/kg体重である、請求項25に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体0.2mg〜2mg/kg体重である、請求項27に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体0.5mg〜1.5mg/kg体重である、請求項28に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体0.75mg〜1mg/kg体重である、請求項29に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が最も好ましくは抗体1mg/kg体重である、請求項30に記載の組換えヒト抗体。
- その用量が抗体0.1mg〜3mg/kg体重である、請求項26に記載の使用。
- その用量が抗体0.2mg〜2mg/kg体重である、請求項32に記載の使用。
- その用量が抗体0.5mg〜1.5mg/kg体重である、請求項33に記載の使用。
- その用量が抗体0.75mg〜1mg/kg体重である、請求項34に記載の使用。
- その用量が最も好ましくは抗体1mg/kg体重である、請求項35に記載の使用。
- マラリア病の治療または予防に使用するための、請求項9または10に記載の核酸分子。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体の標的抗原へのin vitroでの結合を引き起こすか、該結合を可能にすることを含んでなる方法。
- 個体から採取された体液サンプルを請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体と接触させ、該抗体のサンプルへの結合を測定し、それによりサンプル中の標的抗原の有無を判定することを含んでなる、マラリアの診断に有用なマラリア原虫のMSP-3抗原を検出する方法。
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