CN102103141B

CN102103141B - 快速诊断疟疾及其病原体种属的免疫层析试剂盒及其制作方法

Info

Publication number: CN102103141B
Application number: CN200910201449.3A
Authority: CN
Inventors: 汪俊云; 石锋; 杨玥涛; 包意芳; 高春花; 汤林华
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Shanghai Xinji biological science and Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CN102103141A

Abstract

本发明公开了一种快速诊断疟疾及其病原体的免疫层析试剂盒及其制作方法。该试剂盒包括胶体金免疫层析试条和配套溶胞液、样品杯、采血针和使用说明书。其中胶体金免疫层析试条由样品垫、金标垫、纤维素膜和吸水垫组成，其中金标垫上含有胶体金标记抗体，纤维素膜上设有检测线、质控线，所述胶体金标抗记体、检测线由特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体组成。本发明的快速诊断疟疾及其病原体的免疫层析试剂盒可以区分恶性疟和间日疟，具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

快速诊断疟疾及其病原体种属的免疫层析试剂盒及其制作方法

技术领域

本发明涉及疾病检测领域，尤其涉及疟疾检测试条及其制作方法

背景技术

疟疾是一种严重危害人类健康的疾病，它通过在黄昏到拂晓间活动的按蚊叮咬人血而传播。据世界卫生组织(WHO)报道，疟疾是世界上10种最为普遍而又致命的疾病之一，威胁着101个国家和地区共24亿人口(占全球人口40％)。每年发生疟疾的临床案例在3～5亿之间，死亡2～2.7百万人。我国，据2004年疫情报告，全国23省(市、区)1005县都有疟疾病例数报告(未包括在台湾省、香港和澳门)。疟疾发病38972例，平均发病率为0.38/万；死亡31人。云南、海南两省仍是我国疟疾流行最严重的地区和恶性疟病灶区。中部安徽、湖北、河南和江苏四省疟疾疫情近年来一直处于不稳定状态，疫情回升和局部爆发较为突出。

疟疾诊断是疟疾防治工作中的重要环节。世界卫生组织以光学显微镜检测吉氏染色的厚、薄血膜作为疟疾诊断方法的“金标准”，但这种方法耗时、费力，需要较高的专业技术经验，容易造成误诊与漏诊。近年来，随着诊断技术不断创新，国内、外学者相继发展了血液棕黄定量分析法(QBC技术)，酶联免疫吸附法(ELISA)，DNA探针技术和聚合酶链式反应(PCR)等方法用于诊断疟疾。这些方法在现场使用时均有一定的局限性，需要较高的操作技术和复杂的设备仪器，同时也和传统方法一样不适合大规模的现场应用，所以在疾控工作中的实用价值有限。

利用免疫层析技术发展起来的免疫层析试条(Immunochromatographic trips；ICT，又简称Dipstick)，优点是操作极其简便，判断标准明确，不依赖专门仪器设备；可用末梢血(如手指血、耳垂血)作为样品；费时仅须5～15分钟，可以现场得到检测结果；试剂稳定性好，保存条件要求低；操作人员不需要特殊的专业知识和技术培训。因此适合在基层的疾控工作和条件差的卫生单位应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一组用于免疫学方法检测疟疾及其病原体种属的试剂。

本发明的另一目的是提供一种快速检测疟疾及其病原体种属的免疫层析试条。

本发明的另一目的是提供一种快速检测疟疾及其病原体种属的试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种快速检测疟疾及其病原体种属的免疫层析试条的制备方法。

本发明的第一方面，提供一组用于免疫学方法检测疟疾及其病原体种属的试剂，包括：

一株可以特异性结合恶性疟和间日疟乳酸脱氢酶的单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株M8B5B7产生，保藏号为CGMCC No.3105；和/或另一株抗原表位不同的特异性结合恶性疟和间日疟乳酸脱氢酶的单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株M8G4C9产生，保藏号为CGMCC No.3106；和/或一株特异性结合恶性疟乳酸脱氢酶的单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株M10A3B8产生，保藏号为：CGMCC No.3107。

本发明的第二方面，提供了一种用于快速检测疟疾及其病原体种属的免疫层析测试条，包括：

样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置两条相互分离的检测线；

其中所述的两条检测线由分别针对恶性疟、间日疟乳酸脱氢酶的特异性抗体组成；所述的胶体金标记抗体由特异性结合恶性疟和间日疟乳酸脱氢酶的双结合抗体组成；所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白(SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)组成。

在一个优选的方案中，所述的两条检测线，一条检测线由特异性结合恶性疟乳酸脱氢酶的单克隆抗体M10A3B8组成，另一条检测线由特异性结合恶性疟和间日疟的双结合单克隆抗体M8B5B7组成；所述的胶体金标记抗体由另一株抗原表位不同的特异性结合恶性疟和间日疟双结合单克隆抗体M8G4C9组成；所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。

在一个优选的方案中，所述检测线的抗疟原虫乳酸脱氢酶特异性抗体的包被量为0.1～4μg/cm；所述质控线的特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白的包被量为0.1～4μg/cm。

所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜或混合膜；所属支持胶体金标记抗体的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所述样品垫和吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。

所述纤维素膜宽度为25～40mm；所述金标垫的宽度为5～10mm；所述吸水垫和样品垫宽度为20～40mm，厚度为0.1～0.2mm。

所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。本发明的第三方面，提供一种快速检测疟疾及其病原体种属的试剂盒，包括：本发明第三方面所述的免疫层析测试条，用于采血的采血针和毛细滴管，用于处理血样的溶胞液和样品杯；

所述采血针为常规采血针；所述毛细滴管为8～12cm长，孔径1～2mm，一端封闭，另一端开放的PE(聚乙烯)管，该毛细滴管自开放端8～12mm处有一刻度；所述溶胞液为含有Tween20、TritonX-100或皂素等表面活性剂，pH值为7.2～8.0的硼酸缓冲液；所述样品杯为内径5～10mm，高10～15mm的PP(聚丙烯)样品杯。

在一个优选的方案中，所述样品杯用链球菌G蛋白(SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)封闭。

本发明的第四方面，提供了一种制备上述快速检测疟疾及其病原体种类的免疫层析试条的方法，包括以下步骤：

(1)制备检测线抗体溶液：将特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8B5B7，特异性结合恶性疟抗体M1A3B8分别用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到1.5mg/mL；

制备胶体金标记抗体溶液：向100mL pH8.5～9.0、HAuCl₄含量为0.01％的胶体金溶液中加入终浓度为15～30μg/mL的特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8G4C9，再加入终浓度为0.05％的PEG20000，离心弃上清，沉淀复溶到15～20mL的20mM硼酸缓冲液中；

制备质控线蛋白溶液：将羊抗鼠IgG或链球菌G蛋白或或金黄色葡萄球菌A蛋白用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到0.5mg/mL；

(2)将两种检测线抗体溶液分别喷到所述纤维素膜上形成两条分离的检测线，将质控线蛋白溶液喷到所述纤维素膜的另一区域形成质控线；

将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记抗体溶液，制备金标垫；

(3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端，得到检测疟疾及其病原体种属的免疫层析试条。

在一个优选的方案中，上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后，在37℃下干燥0.5～2小时，再粘贴吸水垫。

在一个优选的方案中，为使胶体金标记抗体溶液与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向胶体金标记探针溶液中添加2％～10％的蔗糖；为使金标垫更易于纤维素膜粘贴，可将金标垫在37℃下干燥0.5～1小时，再与纤维素膜粘贴。

本发明的免疫层析试剂盒具有以下优点：

敏感性、特异性高：实验室及现场检测结果：Pv(间日疟)敏感性93％，Pf(恶性疟)敏感性90％，总体特异性96％；

检测方法简单快速：检测过程中标本处理简单，结果观察迅速直观，整个检测过程只需不到10分钟，不需要专门的仪器和专业技术人员，适合基层使用和现场操作；

成本低，工业化生产方便，稳定性好，易于保存。

附图说明

图1为快速诊断疟疾及其病原体种属的免疫层析试条的正面示意图。

图2为快速诊断疟疾及其病原体种属的免疫层析试条的纵截面示意图。

图3为快速诊断疟疾及其病原体种属的试剂盒示意图。

其中：1为样品垫 2为金标垫 3为纤维素膜 4为吸水垫

5、6为检测线 7为质控线 8为背板

11位免疫检测试条 12为溶胞液 13为样品杯 14为毛细滴管

15为采血针 16为毛细滴管的刻度

具体实施方式

疟原虫乳酸脱氢酶抗原

寄生在人体的疟原虫共有4种，即间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵圆形疟原虫。在我国以间日疟原虫和恶性疟原虫流行为主，其它两种疟原虫较为少见。

早期研究发现，疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)与宿主乳酸脱氢酶在电泳特性、酶动力学特性、免疫学特性方面有很大差别。抗LDH抗体对疟原虫有属的特异性，某些抗LDH抗体与来自不同种的疟原虫乳酸脱氢酶抗原存在一定的交叉反应，而和哺乳动物的3种LDH同工酶(A4、B4和C4)无交叉反应。因此，检测病人血样中是否含有疟原虫的乳酸脱氢酶，可以作为病人感染疟原虫的指标。

抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体

本发明采用文献报道的一对引物：

P1：5′ATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT 3′

P2：5′TTAAGCTAATGCCTTCATTCTCT 3′

从来自云南的恶性疟患者全血中采用PCR方法扩增到恶性疟原虫LDH全长编码基因，通过本领域技术人员已知的基因表达技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶的重组抗原，该重组抗原用于制备针对疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。

单克隆抗体可用本领域技术人员已知的各种方法制备，例如，可利用杂交瘤技术来制备。本发明在采用恶性疟原虫乳酸脱氢酶重组抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞S/P20细胞按常规方法制备杂交瘤时，筛选到三株分泌特异性抗疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆细胞株：

(1)M8B5B7(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3105，保藏日期为2009年5月20日)，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型，可以与恶性疟和间日疟乳酸脱氢酶特异性结合；

(2)M8G4C9(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3106，保藏日期为2009年5月20日)，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG2型，可以与恶性疟和间日疟乳酸脱氢酶特异性结合；

(3)M10A3B8(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3107，保藏日期为2009年5月20日)，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型，可以与恶性疟乳酸脱氢酶特异性结合。

固定相抗体、流动相标记抗体的设置

可以将针对疟原虫乳酸脱氢酶抗原的特异性抗体固定在纤维素膜上作为固定相抗体(检测线)，用以捕获待检血样中的疟原虫乳酸脱氢酶抗原。将另一株抗原表位不同的抗疟原虫乳酸脱氢酶特异性抗体进行标记，作为标记的流动相抗体。在适当的反应体系中，当疟原虫乳酸脱氢酶抗原存在时，该抗原可以同时与固定相抗体、标记抗体结合，形成“三明治”形式的抗原抗体复合物，使得该抗原被固定到固定相抗体(检测线)位置。在与标记抗体的标记物相适应的显色底物存在的情况下，在检测线位置出现色带，以显示待检抗原的存在。

本发明的固定相抗体为两株针对恶性疟、间日疟乳酸脱氢酶的特异性抗体。其中一株(M8B5B7)可以与恶性疟原虫和间日疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合，用以捕获恶性疟原虫和间日疟原虫乳酸脱氢酶抗原，另一株(M10A3B8)只与恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合，只能捕获恶性疟虫的乳酸脱氢酶抗原。用上述两株针对疟原虫乳酸脱氢酶的特异性抗体包被纤维素膜，形成两条互相分离的检测线。

本发明的流动相标记抗体为另一株可以与恶性疟原虫和间日疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合的抗体(M8G4C9)，该抗体可以用辣根过氧化物酶、胶体金或其他的标记方法进行标记。

质控线

可以将与标记抗体特异性结合的二抗或其他蛋白固定在纤维素膜上作为质控线，例如链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白。本发明的胶体金标记抗体是鼠抗疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体，相应的，质控线采用羊抗鼠IgG的二抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白。无论待检样品中是否含有疟原虫乳酸脱氢酶抗原，本发明的快速检测疟疾以及病原体种属的免疫层析试条中质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。

免疫层析试条和试剂盒

如图1、2所示，图1为快速诊断疟疾的免疫层析试条的正面结构图，图2为快速诊断疟疾的免疫层析试条的纵截面结构图。快速诊断疟疾的免疫层析试条由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和样品垫1四部分粘贴在PVC底板8上组成；硝酸纤维素膜3上设有检测线5、6和质控线7。

如图3所示，图3为快速诊断疟疾试剂盒示意图，由快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条11、溶胞液12、样品杯13、毛细滴管14(带有刻度16)和采血针15(购于苏州医疗用品厂有限公司)、说明书共同组成快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒。

检测过程与结果判断

测定时将待检血样10μL加入60～80μL溶胞液处理，加在样品垫1上，随后再加60～100μL溶胞液到样品垫1上，溶胞液带动样品按样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动，流经金标垫2时使金标垫2上的胶体金标记抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移动。胶体金标记抗体(本发明实施例为特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8G4C9)可与样品中的疟原虫乳酸脱氢酶抗原结合，形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5(本发明实施例为特异性结合恶性疟抗体M10A3B8)和检测线6(本发明实施例为特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8B5B7)时，若标本中含有恶性疟乳酸脱氢酶抗原，即被检测线5和检测线6的特异性固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜3上的检测线5和6位置显出红色检测线条；若标本中有间日疟乳酸脱氢酶抗原，即被检测线6的特异性固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜3上的检测线6位置显出红色检测线条。此免疫复合物流经质控线7时，即被质控线7的固相抗体(本发明实施例为羊抗鼠抗体)所捕获，在硝酸纤维素膜3上的质控线7位置显出红色质控线条。

阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。如果质控带不显色，不论检测线是否显色，均判为试条失效。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。

实施例1.疟原虫抗原的制备

(1)PCR扩增pLDH基因引物

根据BzikDJ，FoxBA，GonyerK.Expressionof Plasmodium falciparumlactatedehydrogenasein Escherichiacoli[J].MolBiochemParasitol，199359：155-166.设计1对引物，用于扩增恶性疟原虫LDH全长编码基因。

P1：5′ATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT 3′

P2：5′TTAAGCTAATGCCTTCATTCTCT 3′

(2)模板

以采自云南恶性疟患者肝素抗凝全血，按JohnE.Protocolsinmolecularparasitology[M].HumanapressIncLondon，1993：205-211.方法处理作为PCR扩增模板：取20μL全血加200μL裂解液[50mmol/L NaCl，0.015％皂素，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]震荡混匀，室温置10mim以充分溶解红细胞，10000×g室温离心10min，再用250μL缓冲液[10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.01％明胶]将沉淀物洗2次，所得沉淀物即作为PCR扩增模板。PCR：高保真聚合酶PfuPCR扩增试剂盒(购自上海申能博彩生物技术有限公司)，按50μL反应体积在上述沉淀物中加49.5μLPCR反应液(含200μmol/LdATP/dTTP/dGTP/dCTP，200pmol/L引物)，加封石蜡油50μL后置沸水煮沸10min，立即置已热启动的PCR仪进行扩增。条件为：94℃变性3min，此时加015μLPfu聚合酶(5U/μL)，再按94℃30s，60℃45s，72℃1min的条件循环35次，随后72℃再延长10min。反应结束后取5μL反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检查。

(3)PCR产物的克隆、测序及重组质粒的表达和重组蛋白纯化

扩增的PCR产物按DNA纯化试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)说明纯化后用平端方法与经Sma I酶切的pGEX23X表达载体DNA连接，连接物转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞，在选择平板上挑取白色菌落接种LB培养基进行培养，收集菌体，用碱裂解法抽提质粒并进行酶切鉴定，大小符合的重组质粒进行测序。序列符合且克隆方向正确的重组质粒再转化大肠埃希菌BL221细胞，转化的细胞接种于LB液体培养基，28℃下用终浓度为1mmol/L的异丙基2β2D2硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达。收集细菌，用10％胶对重组蛋白进行十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。取经SDS-PAGE鉴定证明能正确表达重组蛋白的BL21细菌按上述方法进行大量培养并进行诱导表达。诱导表达结束后，3000×g离心20min，收集细菌，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次。按沉淀物压积体积20倍的量加入PBS重悬菌体并超声裂解。超声处理后加入TritonX-100至终浓度1％，置冰上搅拌1h。随后4℃，12000×g离心30min，取上清，按试剂盒说明用Glu2tathioneSepharose4B柱(丹麦Amersham公司)亲和纯化回收表达的融合蛋白，并进行SDS-PAGE分析和蛋白含量测定。

实施例2.疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备

免疫每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100μg上述纯化的重组融合蛋白+福氏完全佐剂的混悬液，以后每隔1月注射100μg纯化的重组融合蛋白+福氏不完全佐剂的混悬液1次，共2次，并于杀鼠取脾进行细胞融合的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。

杂交瘤细胞的产生与筛选SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的克隆按本实验室常规方法进行。以上述纯化的重组融合蛋白和谷胱甘肽2S2转移酶(GST)蛋白分别包板对杂交瘤细胞培养上清进行常规ELISA检测抗体分泌以筛选杂交瘤细胞株，对GST和重组融合蛋白均反应的克隆其分泌的抗体视为针对GST，所以只选择保留仅对重组融合蛋白反应的克隆。

单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液与羊抗鼠IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3在1％生理盐水琼脂板上进行免疫双扩散以鉴定McAb免疫球蛋白亚类。

腹水生产与腹水效价决定每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106杂交瘤细胞，1周后随时观察并取腹水。以纯化的重组融合蛋白包被酶标板，腹水进行倍比稀释，第1稀释度为1∶1000，用常规ELISA法确定腹水效价。

免疫印迹实验取培养纯化的恶性疟原虫和10份云南发热病人红细胞经处理后进行SDS-PAGE电泳，而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭1h，用PBS含0.5％TritonX-100(PBS-T)洗涤3次，按1∶20000稀释度加入单克隆抗体，4℃过夜，用PBS-T洗涤3次，加入用PBS稀释(1∶5000)的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体室温摇2h，同法洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用二氨基联苯胺(DAB)底物系统(DAB50mg，PBS100ml，30％H₂O₂ 10μL)显色。

制备得到特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体：

M8G4C9属于IgG2亚类，与重组抗原反应效价1∶51200，用于标记；

M8B5B7属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1∶51200，用于包被；

制备得到特异性结合恶性疟抗体：

M10A3B8属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1∶25600，用于包被。

疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的纯化

将含疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的小鼠腹水，先使用正辛酸-硫酸铵沉淀法抽提，然后再用G蛋白层析柱(美国GenScript产品)按产品说明书纯化单克隆抗体。

实施例3.疟原虫特异性抗体金探针溶液的制备

用以下方法制备疟原虫特异性抗体标记的胶体金金探针溶液和金标抗体垫：用柠檬酸还原法制备胶体金：将质量百分比浓度为0.01％的HAuCl₄(沪试牌购于上海国药集团化学试剂有限公司)水溶液煮沸，搅拌下加入2mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直到液体呈深红色，得到胶体金溶液。

确定胶体金偶联抗体饱和度：用0.1M K₂CO₃溶液调节pH值至8.5，准备96孔酶标板，在孔中用0.05M硼酸缓冲液倍比稀释疟原虫特异性抗体，做一个稀释度梯度，分别加入相同体积胶体金混匀，再加入相同体积的10％NaCl溶液，混匀，观察液体颜色变化，颜色没有变化最低的抗体量就是最适浓度。结果确定保持稳定的抗体浓度为15μg/mL。

疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体标记的免疫胶体金探针及金标抗体垫的制备：用0.1M K₂CO₃溶液调节pH值至8.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为15μg/mL的特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8G4C9，搅拌1小时，再加入终浓度为0.05％PEG20000，搅拌1小时，10000rpm离心30分钟，弃上清，用20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀，并将其保存于20mL含5％蔗糖的20mM硼酸缓冲液中，得到疟原虫特异性抗体金探针溶液。疟原虫特异性抗体金探针溶液800μL喷涂到玻璃纤维垫上，37℃下干燥0.5小时。得到金标抗体垫。

实施例4.快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的制备

如图1所示，图中A为快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的正面结构图，图中B为快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的纵截面结构图。快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标抗体垫2和样品垫1四部分粘贴在PVC底板8上组成；硝酸纤维素膜3上设有检测带5、6和质控带7，该试纸的制备方法包括以下步骤：

NC膜的包被：两种区分恶性疟和间日疟的疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体：特异性结合恶性疟和间日疟双结合抗体M8B5B7；特异性结合恶性疟抗体M10A3B8分别用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到1.5mg/mL，用于包被两条检测带；羊抗鼠IgG(购于捷宁生物公司)用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到0.5mg/mL，用于包被一条质控带。用BIODOT公司XZ1000点样机分别喷涂于300mm长、25mm宽的NC膜(购于MILLIPORE公司)上。形成互相分离的检测线。37℃下干燥2小时。

快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的制备：用一块单面涂了不干胶的PVC底板，中间粘贴上处理好的NC膜；NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴吸水垫(购于MILLIPORE公司)；NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴金标抗体垫；金标抗体垫另一端紧密粘贴样品垫(购于MILLIPORE公司)；样品垫和吸水垫的表面粘贴画有指示标记的贴皮；

按需要切割试条，宽4mm，长8mm。得到快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条，加干燥剂后密封保存。

实施例5.快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒的制备

溶胞液：含有0.25％TritonX-100的硼酸溶液，pH7.5；

样品杯：样品杯为内径8mm，高12mm的PP样品杯，用100μg/mL的链球菌G蛋白(SPG)封闭；

毛细滴管：长10cm，孔径2mm的PE管，一端封闭，另一端开放，开放端8mm处设一刻度线；

如图3所示，由快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条11(步骤3制备)、溶胞液 12、样品杯13、毛细滴管14和采血针15(购于苏州医疗用品厂有限公司)、说明书共同组成快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒。

实施例6.快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的实验室和现场检测考核

检测方法

用实施例1制备的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条按使用说明检测血样：使用采血针采集末梢血(现场)或使用已采集的静脉血(实验室)。用毛细滴管吸取待测血样标本至刻度线(10μL)，放入样品杯中。加入2滴(60～80μL)溶胞液，反复吹吸混合溶破血细胞和虫体。将快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的样品垫一端插入样品杯中。待杯中的溶血吸干后，再加入2～3滴(60～100μL)溶胞液。5分钟后观察结果，10分钟观察终止。结果判定：如果两条检测带和质控带均出现红色，即判为恶性疟；如果一条检测带和质控带出现红色条带，即判为间日疟；如果仅有质控带出现红色，即判为阴性；如果质控带不显色，不论检测线是否显色，均判为试条失效。

实验结果

用本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条进行实验室和现场检测考核结果如表1所示，由表1可以看出本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条对间日疟和恶性疟的敏感性可达93.7％和89.4％，特异性可达96％。上述检测结果表明本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒可以用于疟疾的快速检测。

表1本发明快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条的实验室和现场考核结果

血样来源	试验例数	阳性例数(P％)
			间日疟	349	327(93.7％)
恶性疟	132	118(89.4％)
			疟疾流行区非疟疾发热病人	300	15(5％)
非疟疾流行区正常人	117	3(2.6％)
			黑热病人	17	0

实施例7.快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒的稳定性考核考核方法

用实施例1制备的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒分别在室温(5～35℃ 不放冰箱，不开空调)下和37℃培养箱保存，进行老化试验。每隔2周抽样，按使用说明检测血样。

实验结果

用本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条进行稳定性考核结果，室温下可以至少稳定18个月，37℃下老化试验至少稳定8个月，检测结果仍符合要求。

Claims

1.一种检测疟疾及其病原体种属的免疫层析测试条，包括以下组分：

样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置两条相互分离的检测线；其特征在于：所述的一条检测线由特异性结合恶性疟乳酸脱氢酶的单克隆抗体组成，所述的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞株M10A3B8产生，其保藏号为：CGMCC No.3107；另一条检测线由特异性结合恶性疟和间日疟的双结合单克隆抗体组成，所述的双结合单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞株M8B5B7产生，其保藏号为CGMCC No.3105；所述的胶体金标记抗体由抗原表位不同的特异性结合恶性疟和间日疟双结合单克隆抗体组成，所述的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞株M8G4C9产生，其保藏号为CGMCC No.3106；所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。

2.根据权利要求1的检测疟疾以及病原体种属的免疫层析测试条，其特征在于，所述检测线的抗疟原虫乳酸脱氢酶特异性抗体的包被量为0.1～4μg/cm；所述质控线的特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白、或金黄色葡萄球菌A蛋白的包被量为0.1～4μg/cm。

3.根据权利要求1的检测疟疾以及病原体种属的免疫层析测试条，其特征在于，所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜或混合膜；所述支持胶体金标记抗体的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所述样品垫和吸水垫由吸水材料制备。

4.根据权利要求1的检测疟疾以及病原体种属的免疫层析测试条，其特征在于，所述纤维素膜宽度为25～40mm；所述金标垫的宽度为5～10mm；所述吸水垫和样品垫宽度为20～40mm，厚度为0.1～0.2mm。

5.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1的检测疟疾以及病原体种属的免疫层析测试条，还包括用于采血的采血针和毛细滴管，用于处理血样的溶胞液和样品杯；所述采血针为常规的采血针；所述毛细滴管为8～12cm长，孔径1～2mm，一端封闭，另一端开放的PE管，该毛细滴管自开放端8～12mm处有一刻度线；所述溶胞液为含有Tween20、TritonX-100或皂素、pH值为7.2～8.0的硼酸缓冲液；所述样品杯为内径5～10mm，高10～15mm的PP样品杯，所述样品杯用链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白封闭。