CN1979167A - 一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有疟原虫特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有疟原虫特异性抗体，所述质控线含有能与所述疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体。本发明的免疫层析试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种疟原虫的检测试纸及其制备方法，特别是涉及一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术
疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，其病原体为疟原虫(plasmodium)。寄生于人体的疟原虫主要有四种：间日疟原虫(Plasmodium vivax，P.v)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，P.f)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。在我国及世界上其它国家均以P.v和P.f最为常见，三日疟和卵形疟极少见。
疟疾为世界五大寄生虫病之一，有很高的发病率和死亡率。疟原虫子孢子通过疟蚊叮咬进入人体，经在肝脏发育繁殖，产生大量裂殖子释放入血，并侵入红细胞进行裂体增殖，引起肝、脾、脑及肾脏等器官的损害。特别是对无疟疾免疫力的人群，感染后可因并发脑型疟疾在几小时内死亡，也可因并发严重贫血或肾衰而死亡。据统计，若不及时治疗，约20％的恶性疟患者会死亡。
疟疾广泛流行于热带、亚热带以及温带边缘地区。据WHO估计，全球有40％的人口生活在疫区，约有21亿人受到疟疾感染威胁，每年有3-5亿人发病，死亡人数达270万(其中非洲达100多万)，是当今世界上发病率较高的疾病之一。在我国华中、华南的某些地区，特别是云南和海南省尚有不少疟疾病例。我国在控制疟疾方面虽然取得了重大成就，年发病数已从数千万降到几万，如1999年发病人数约为2.9万，然而，随着氯喹和DDT等药物的长期使用，疟原虫对抗疟药的抗药性和媒介按蚊对杀虫剂的抗性也随之出现，加之一些现代经济和社会因素的影响，疟疾(尤其是恶性疟)的流行有复燃趋势，其防治也将面临新的挑战，同时，由于疟疾的高发病率和死亡率，还会造成战争条件下的非战斗减员，特别是在台海局势复杂多变的情况下，开发出疟原虫的快速检测技术也是应对我国未来可能战争的迫切需要。
快速准确地检测疟原虫是有效防治疟疾的关键。传统厚薄血膜镜检是疟疾诊断的金标准，但费时费力，敏感性低，而且需要技术熟练的操作人员和特殊的仪器设备，此外，还常受到血片制作、染色质量和镜检人员专业水平等主客观因素影响而容易引起误诊或漏诊，不适于现场及基层大规模使用，亦不能达到现代疟疾控制、监测、药物试验和疫苗研究的要求。
聚合酶链反应(PCR)于20世纪80年代后期应用到疟疾诊断中，是公认的最有前途的疟疾诊断方法之一。目前用于PCR检测的目的基因主要有小亚单位核糖体RNA(SSrRNA)、16S rRNA、恶性疟裂殖子表面蛋白抗原基因(MSP)和环子孢子抗原(CS)基因等。SSrRNA基因在疟原虫中含量丰富，且具有种、属特异性和序列高度保守等特点，研究人员现已根据该基因序列设计出两对特异性引物，引物序列如下：
P.f上游引物：5′-ttaaactggtttgggaaaaccaaatatatt-3′
P.f下游引物：5′-acacaatgaactcaatcatgactacccgtc-3′；
P.v上游引物：5′-ttcgtatcgactttgtgcgcattt-3′
P.v下游引物：5′-acttccaagccgaagcaaagaaagtcctta-3′。
上述两对引物可分别用于P.f和P.v的检测(吴英松，江晓玲，李明等.聚合酶链反应检测疟疾的研究.热带医学杂志，2001，1(1)：50-52)。单一PCR仅能检测P.f或P.v其中一种，对于混合感染则不能有效的检测和鉴别。Tham JM等根据SSrRNA基因序列，分别设计出属特异性引物和种特异性引物，序列如下：
属特异性引物   L1：biotin-5′-GAC CTG CAT GAA AGA TG-3′；
               L2：5′-GTA TCG CTT TAA TAG GCG-3′
P.f特异性引物  Pf1：biotin-5′-GGA ATG TTA TTG CTA ACA C-3′；
               Pf2：5′-AAT GAA GAG CTG TGT ATC-3′
P.v特异性引物  Pv1：biotin-5′-CAC CAT TAA GTA CAT CAC-3′；
               Pv2：5′-TGT TAA TAC AAC TCC AAT-3′。
基于上述引物序列建立的巢式PCR技术既能同时检测P.f和P.v，又能检测其它疟原虫(Tham JM，Lee SH，Tan TMC，et al.Detection and Species Determinationof Malaria Parasites by PCR：Comparison with Microscopy and with ParaSight-Fand ICT Malaria Pf Tests in a Clinical Environment.J Clin Microbiol，1999，37(5)：1269-1273)。常规PCR诊断法，尽管有着快速、简便以及高度敏感等优点，但也存在着诸多问题，如产物常因受到污染而导致检测结果假阳性，PCR扩增后期因出现“平台效应”而难以准确定量等。近年来发展起来的荧光定量PCR(real-time PCR)，也已经应用于疟疾的检测。Perandin.F等根据三种疟原虫SSrRNA基因的保守序列，分别设计出针对P.f、P.v和卵形疟的特异性引物和TaqMan探针，从而建立了用于检测临床标本中P.f、P.v和卵形疟的荧光定量PCR技术，序列如表1所示：
表1针对P.f、P.v和卵形疟设计的特异性引物和TaqMan探针
 Species     Primer or probe     Sequence
 P.falciparumP.vivaxP.ovale     FAL-FFAL-RFAL probe(FAM)VIV-FVIV-RVIV probe(TET)OVA-FOVA-ROVA probe(VIC)     5′-CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA5′-TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA5′- TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA5′-ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT5′-ATTTACTCAAAGTAACAAGGACTTCCAAGC5′-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC5′-TTTTGAAGAATACATTAGGATACAATTAATG5′-CATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTACAAT5′- CCTTTTCCCTATTCTACTTAATTCGCAATTCATG
荧光定量PCR可检出P.f、P.v和卵形疟原虫的密度分别为0.7、4、1.5个虫体/ul虫血(Perandin.F，Manca.N，Calderaro.A，et al.Development of a Real-TimePCR Assay for Detection of Plasmodium falciparum，Plasmodium vivax andPlasmodium ovale for Routine Clinical Diagnosis.J Clin Microbiol，2004，42(3)：1214-1219)。荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及可进行定量分析等优点，并克服了常规PCR定性检测的一些不足，从而极大地提高了检测的敏感性和特异性，但是由于需要特殊的仪器设备、检测成本高等因素，也不可能在基层及现场大规模应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测疟原虫的免疫层析试纸(Immuno-ChromatographicAssay，ICA)。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种检测疟原虫的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有疟原虫特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有疟原虫特异性抗体，所述质控线含有能与所述疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体。
所述疟原虫特异性抗体为以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodium falciparumlactate dehydrogenase，LDHpf)为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物，优选为兔；所述疟原虫特异性抗体的抗抗体优选为抗兔抗抗体；所述检测线含有的疟原虫特异性抗体的浓度可为1-3mg/mL，所述质控线含有的能与疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度可为3-5mg/mL。
所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。
检测样品时可将上述检测疟原虫的免疫层析试纸的样品垫直接浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测疟原虫的免疫层析试纸的背面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测疟原虫的免疫层析试纸的方法。
本发明所提供的制备上述检测疟原虫的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：
1)制备疟原虫特异性抗体和疟原虫特异性抗体的抗抗体；将疟原虫特异性抗体溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将疟原虫特异性抗体的抗抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；
2)制备疟原虫特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；
3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测疟原虫的免疫层析试纸。
上述检测疟原虫的免疫层析试纸的制备方法中，步骤1)中所用的疟原虫特异性抗体为以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动物，优选为兔；所述疟原虫特异性抗体的抗抗体优选为抗兔抗抗体；检测线含有的疟原虫特异性抗体的浓度可为1-3mg/mL，质控线含有的能与疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度可为3-5mg/mL；可将步骤1)中喷有疟原虫特异性抗体溶液和疟原虫特异性抗体的抗抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥0.5-1小时，再粘贴吸水垫；
为使疟原虫特异性抗体标记的免疫胶体金探针与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向步骤2)中的疟原虫特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；为使金标垫更易与纤维素膜粘贴，可将金标垫在-20℃至-70℃冷冻5-12小时，低温抽干，再将其与纤维素膜粘贴。
为了使用更加方便，所述检测疟原虫的免疫层析试纸的背面还可再紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料或聚氯乙烯板(PVC板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
所述疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法，可包括以下步骤：
1)将质量百分浓度为0.01％的氯化金(HAuCl4)水溶液加热煮沸，并将每100mL0.01％HAuCl4溶液进行如下操作：搅动下加入1.6mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；
2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至9.2-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为30μg/mL的疟原虫特异性抗体，搅拌20-25分钟，加入5mL 10％BSA，搅拌20-25分钟，再加入1mL 10％ PEG20000，搅拌20-25分钟，先在2800-2900rpm下离心10-15分钟，吸出上清，再将上清在10000-12000rpm下离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针溶液。
在上述疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针的制备方法中，步骤1)中可用浓度为0.15-0.25M(优选为0.2M)的K2CO3溶液或浓度为0.05-0.2M(优选为0.1M)的HCl溶液调节胶体金溶液的pH值；为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。
在实际应用中，所述纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，宽度控制在2.5-3.0mm为宜；所述吸水垫可为吸水纸，宽度为20-40mm，厚度为0.1-0.2mm；所述金标垫的宽度为5-10mm；所述样品垫为玻璃纤维膜，宽度为20-40mm。
本发明提供了一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸利用了免疫胶体金技术及双抗体夹心检测法，用其检测疟原虫或疟原虫抗原的基本原理是：用疟原虫特异性抗体包被纤维素膜，用以捕捉标本中的疟原虫或疟原虫抗原，然后用标记了疟原虫特异性抗体的抗抗体的免疫胶体金探针进行检测。本发明的免疫层析试纸具有以下优点：1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试纸可用于检测疟原虫10个虫体/ul虫血的标本，并且不与其它生物发生交叉反应；2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的疟原虫或疟原虫经过5分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为疟疾的治疗争取了时间，很适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在疟原虫的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为检测疟原虫的免疫层析试纸的正面和纵截面结构示意图
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。
实施例1、检测疟原虫的免疫层析试纸的制备
以检测p.f的免疫层析试纸为例说明本发明检测疟原虫的免疫层析试纸的制备方法，具体过程包括以下步骤：
1、疟原虫特异性抗体的制备
本实施例采用以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶(rLDHpf)为抗原制备疟原虫特异性抗体，具体方法如下：
1)疟原虫抗原的制备
①重组p.f乳酸脱氢酶(LDHpf)抗原的制备
根据Honduras 1株的LDHpf基因序列(GenBank登录号：M93720)设计一对引物，引物序列如下：
P1(上游引物)：5’-CCTCGAATTCATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT一3’
P2(下游引物)：5’-CCCTGTCGACTTAAGCTAATGCCTTCATTCTCT一3’
以p.f中国海南株(FCC1/HN，购于军事医学科学院全军菌种保藏中心)的基因组DNA为模板，在引物P1和P2的引导下PCR扩增LDHpf基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化951bp的目的片段，并将其克隆入载体pET-32a-c(+)(Novagen公司)多克隆位点的EcoR I和Sal I酶切位点之间，得到LDHpf基因的重组表达载体，命名为pET-32a/LDHpf，将pET-32a/LDHpf转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞，筛选阳性重组子，以pET-32a-c(+)空载体转化菌为对照，在37℃下培养至OD600值为0.6-0.8时，添加0.5mMIPTG，在相同条件下诱导4-5小时。培养结束后，对表达蛋白用Western-blot方法(兔抗p.f免疫血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，对pET-32a-c(+)空载体转化菌、pET-32a/LDHpf转化菌表达蛋白进行Western-blot分析，具体操作参照《分子克隆》第三版)进行抗原性鉴定，结果显示pET-32a/LDHpf转化菌表达蛋白与兔抗p.f免疫血清反应后在53KDa处有一特异的反应条带，而空载体转化菌却没有相应的条带出现，表明表达蛋白具有较高抗原性，纯化，得到重组p.f乳酸脱氢酶抗原(命名为rLDHpf)。
②p.f虫体抗原的制备
参照Trager W和Jensen J.B的蜡烛缸法(Trager W，Jensen JB.Human malariaparasites in continuous culture.Science，1976，193(4254)：673-675)对p.f中国海南株(FCC1/HN)进行体外连续培养，所用培养基为含12％新鲜兔血清和25mM HEPES的1640完全培养基，待原虫密度达5-10％时，收集虫血于液氮中保存。将保存的虫血经反复冻融3次后，用含0.2％皂素的PBS溶液(pH7.4)裂解虫血，洗涤除去红细胞成份，离心收集虫体，用生理盐水稀释后得到p.f虫体抗原。
2)疟原虫特异性抗体的获得
①兔抗p.f特异性抗体的制备
选用体重约2kg健康雌性大耳白家兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心)，首次用福氏完全佐剂与步骤1)获得的p.f虫体抗原混合乳化后皮下及肌肉多点注射，约2mL/只(大约50个虫体/ul)，然后分别于初次免疫后第20日、第30日、第40日追加免疫水剂1针，追加剂量和途径与初次免疫相同，末次免疫后10天试血，用间接免疫荧光法测其效价，结果效价大于1∶128，颈动脉采血，离心收集抗血清。
②兔抗rLDHpf特异性抗体的制备
用兔抗p.f特异性抗体对纯化的rLDHpf进行Western-blot鉴定，结果显示该抗原有较好的抗原性。选用4只体重约2kg健康雌性大耳白家兔，将经步骤1)纯化的rLDHpf与福氏完全佐剂混合，皮下多点注射免疫家兔，免疫剂量为2mg rLDHpf/只，20天后用福氏不完全佐剂与纯化的rLDHpf混合加强免疫一次，以后每隔10天加强免疫一次，抗原免疫剂量逐次增加(增加幅度为0.2mg)，共免疫6次。末次免疫后试血，用免疫琼脂扩散法检测抗体效价，当抗体滴度达1∶36时，采血，离心收集抗血清。
③采用常规的饱和硫酸铵盐析法对步骤①、②获得的抗血清中的疟原虫特异性抗体进行纯化，用免疫琼脂扩散法检测抗体效价，结果抗体滴度均大于1∶36，表明获得的兔抗p.f特异性抗体和兔抗rLDHpf特异性抗体均具有较好的特异性和亲和性。
2、制备免疫胶体金探针及金标垫
用下述方法制备兔抗rLDHpf特异性抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫：
1)制备胶体金溶液
采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl4(购自Sigma公司，1g/瓶包装)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。
2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度
用0.2M K2CO3调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至9.2，准备5支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1制备的经纯化的疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入20μl、25μl、30μl、35μl，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量即为稳定1mL胶体金溶液所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μl，即25μg/mL，故选择偶联抗体浓度为30μg/mL。
3)兔抗rLDHpf特异性抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫的制备
取50mL胶体金溶液，用0.2M K2CO3调pH值为9.2(9.2-9.5均可)，按30μg/mL加入已纯化的疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)，得到含有浓度为30μg/mL疟原虫特异性抗体的免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌20-25分钟，然后加入10％BSA 5mL，搅拌20-25分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，在2800-2900rpm下离心10-15分钟，吸出上清，在10000-12000rpm下再离心25-35分钟，弃上清，将沉淀用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)标记的免疫胶体金探针溶液。取疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)标记的免疫胶体金探针溶液5mL，加入0.5g(0.25-0.5g均可)蔗糖，充分溶解后均匀加在玻璃纤维膜上，-40℃(-20℃至-70℃均可)放置11小时(5-12小时均可)，冻干机抽干，得到金标垫。
3、检测疟原虫的免疫层析试纸的制备
如图1所示(图中a为检测疟原虫的免疫层析试纸的正面结构图，图中b为检测疟原虫的免疫层析试纸的纵截面结构图)，检测疟原虫的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上设有检测线5和质控线6，该试纸的制备方法包括以下步骤：
1)NC膜3的包被
疟原虫特异性抗体(步骤1制备的兔抗rLDHpf特异性抗体)和质控抗体羊抗兔IgG(购自中杉金桥公司)的包被：用0.01M pH7.2 PB稀释疟原虫特异性抗体至终浓度为2mg/mL(1-3mg/mL均可)，用于包被检测线。用0.01M pH7.2的PBS稀释羊抗兔IgG至终浓度为4mg/mL(3-5mg/mL均可)，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜3上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥1小时(0.5-1小时均可)。
2)检测疟原虫的免疫层析试纸的制备
将用吸水滤纸(购自Millipore公司)制的吸水垫4用双面胶粘贴于步骤1)得到的设有有检测线5和质控线6的NC膜3靠近质控线6的一端；将在步骤2中制备的金标垫2用双面胶粘贴于NC膜3靠近检测线5的一端；再在金标垫2的上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫(购自Millipore公司)1，得到检测疟原虫的免疫层析试纸，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。
4、检测疟原虫的免疫层析试剂盒的制备
为了方便使用，将步骤3制备的检测疟原虫的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
5、检测疟原虫的免疫层析试纸的使用方法和原理
测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相二抗结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
实施例2、疟原虫的检测及与其它相关生物LDH同工酶的交叉试验
1、疟原虫的检测
将p.f虫血用含0.2％皂素的PBS溶液(pH7.4)裂解并稀释，使红细胞内的LDH全部释放，以备点样。用实施例1制备的包被疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)和质控抗体羊抗兔IgG的免疫层析试纸进行检测，结果均为阳性(检测线和质控线处均出现沉淀线)，与预期结果一致。
2、与其它相关生物LDH同工酶的交叉试验
将正常人红细胞、弓形虫、隐孢子虫、滴虫和大肠杆菌BL21用与步骤1相同的方法进行处理。同样，也用实施例1制备的包被疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)和质控抗体羊抗兔IgG的免疫层析试纸进行检测，结果均为阴性(仅质控线处出现沉淀线)，与预期结果一致。
上述检测结果表明本发明的免疫层析试纸可用于疟原虫的快速检测，并具有较好的特异性。
实施例3、检测疟原虫的免疫层析试纸的实验室考核
1、样品制备
将p.f虫血用含0.2％皂素的PBS溶液(pH7.4)裂解并稀释，虫体密度分别为10、50、100个/ul，将正常人红细胞、弓形虫、隐孢子虫、滴虫和大肠杆菌BL21也用相同方法进行处理，得到不同待测物含量的检测液，备用。将滤纸浸于检测液中，完全浸湿后干燥，即可得到滤纸血样本。用打孔机将滤纸血样本制成直径5mm的滤纸血斑，将滤纸血斑置于普通酶标板小孔内，加入含0.2％皂素的PBS溶液置于微量振荡器上洗脱血样并使其充分溶血后取出滤纸，以备点样。
2、检测方法
于实施例1制备的包被疟原虫特异性抗体(兔抗rLDHpf特异性抗体)和质控抗体羊抗兔IgG的免疫层析试纸的样品垫上加入步骤1制备的检测液3滴(约150μl)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果：用p.f制备的滤纸血检测样品在检测线和质控线处均出现沉淀线，即有疟原虫抗原检出，而用正常人红细胞、弓形虫、隐孢子虫、滴虫和大肠杆菌BL21制备的滤纸血检测样品仅在质控线处出现沉淀线，即无疟原虫抗原检出。
3、实验结果
用步骤1制备的不同待测物含量的检测液的实验室考核结果如表2所示，由表2可以看出，用本发明的免疫层析试纸可以检出10个虫体/ul虫血，文献报道最低检出的虫体密度为0.02％(相当于10个虫体/ul虫血)，且不与正常人红细胞、弓形虫、隐孢子虫、滴虫和大肠杆菌BL21等发生交叉反应。上述检测结果表明本发明的免疫层析试纸可用于疟原虫的快速检测，并具有较好的灵敏度和特异性。
表2本发明检测疟原虫的免疫层析试纸的实验室考核结果
病原 样本种类     虫体密度(个/ul)
    10     50     100
恶性疟原虫p.f    全血     +     +     +
   滤纸血     +     +     +
  正常人血    全血                -
  弓形虫    组织穿刺液                -
  隐孢子虫    细胞培养液                -
  滴虫    培养液                -
  大肠杆菌BL21    甘油保存                -

Claims (10)

1、一种检测疟原虫的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有疟原虫特异性抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫；所述纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线含有疟原虫特异性抗体，所述质控线含有能与所述疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体。
2、根据权利要求1所述的检测疟原虫的免疫层析试纸，其特征在于：所述疟原虫特异性抗体为以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物为兔、猴、鸡或鼠；所述检测线含有的疟原虫特异性抗体的浓度为1-3mg/mL，所述质控线含有的能与疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度为3-5mg/mL。
3、根据权利要求1或2所述的检测疟原虫的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸紧密连接有背板。
4、一种制备权利要求1或2或3所述的检测疟原虫的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：
1)制备疟原虫特异性抗体和疟原虫特异性抗体的抗抗体；将疟原虫特异性抗体溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将疟原虫特异性抗体的抗抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；
2)制备疟原虫特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；
3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测疟原虫的免疫层析试纸。
5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的疟原虫特异性抗体为以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物为兔、猴、鸡或鼠；所述检测线含有的疟原虫特异性抗体的浓度为1-3mg/mL，所述质控线含有的能与疟原虫特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度为3-5mg/mL；将喷有疟原虫特异性抗体溶液和疟原虫特异性抗体的抗抗体溶液的纤维素膜先在37℃下干燥0.5-1小时，再粘贴吸水垫。
6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：向所述步骤2)中的疟原虫特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液中添加0.05-0.1g/mL蔗糖；将金标垫在-20℃至-70℃冷冻5-12小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。
7、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法，包括以下步骤：
1)将质量百分浓度为0.01％的HAuCl4水溶液加热煮沸，并将每100mL 0.01％HAuCl4溶液进行如下操作：搅动下加入1.6mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；
2)将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至9.2-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为30μg/mL的疟原虫特异性抗体，搅拌20-25分钟，加入5mL 10％BSA，搅拌20-25分钟，再加入1mL 10％PEG20000，搅拌20-25分钟，先在2800-2900rpm下离心10-15分钟，吸出上清，再将上清在10000-12000rpm下离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针溶液。
8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述疟原虫特异性抗体标记的胶体金探针溶液的制备方法的步骤1)中用浓度为0.15-0.25M的K2CO3溶液或浓度为0.05-0.2M的HCl溶液调节胶体金溶液的pH值。
9、根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于：将所述步骤3)获得得的检测疟原虫的免疫层析试纸背面粘贴一背板。
10、根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于：所述纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述吸水垫为吸水纸；所述样品垫为玻璃纤维膜。
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