CN102141567A - 一种制备酶标记抗体的方法 - Google Patents
一种制备酶标记抗体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102141567A CN102141567A CN2010105943013A CN201010594301A CN102141567A CN 102141567 A CN102141567 A CN 102141567A CN 2010105943013 A CN2010105943013 A CN 2010105943013A CN 201010594301 A CN201010594301 A CN 201010594301A CN 102141567 A CN102141567 A CN 102141567A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- antibody
- colloidal gold
- mark
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 43
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 93
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 13
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 150000002344 gold compounds Chemical class 0.000 abstract 3
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 Chemical compound O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000283207 Indigofera tinctoria Species 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种制备酶标记抗体的方法，它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的pH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混匀，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶复合抗体。本发明通过直接吸附的简捷方式完成胶体金上的酶标记；酶和偶联剂的分离以及抗体连接后的分离纯化无需引入凝胶过滤、透析或亲和层析等繁琐且高损耗的昂贵步骤，只需通过简单的离心即可完成；胶体金吸附酶前进行的浓缩操作可以提高被连接试剂的连接量，同时可以增加酶标记胶体金复合抗体中金胶粒子的浓度酶标记金胶复合抗体同样符合这一特征。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种酶标记抗体的制备方法。
背景技术
酶免疫测定技术自问世以来发展迅速，在药物筛选、医疗诊断、食品安全检测等众多领域得到广泛应用。它既继承了放射性免疫测定的高灵敏度等优点，又克服了前者需使用放射性标记这一缺点。酶免疫测定将酶促反应的高效率和免疫反应的高特异性有机地结合起来，可对各种分析物如蛋白、毒素、农药、微生物等进行定量检测，是目前灵敏度高、适应性强、并在生产和临床中得到推广的免疫测定技术。另外，在免疫测定中使用酶作为标记，还在于酶能保持长期的稳定性、对操作人员无危害、并避免了放射性免疫中存在的废物处理问题。而制备特定抗体和酶偶联物（酶标记抗体）是能否实现对特定抗原分析物进行定量检测的关键。
目前用于酶标记抗体制备的方法传统的主要有戊二醛法和过碘酸钠法。戊二醛法也是至今最常见的标记酶到抗体上的偶联方法。它又分为一步法和两步法，一步法操作简便、快速，只要将一定量的酶和抗体加入到缓冲液中，同时加入一定量的戊二醛进行反应。但一步法的缺点是（1）偶联反应不易控制，若被偶联的两种物质与偶联剂的反应速度不同，则反应速度快的那种分子易发生自生聚合；（2）偶联效率不高，参与偶联反应的两种分子所占比率较低。而两步法克服了一步法的缺点，它采用将与偶联剂反应较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去除多余偶联剂后再加入反应速度相对快的偶联分子。两步法虽然操作繁琐，但偶联率提高，而且形成的同分子聚合物减少。过碘酸钠法是偶联酶和糖蛋白产率最高的方法，该法利用过碘酸钠将糖蛋白（抗体、糖基化的酶等）上的糖链基团氧化成醛基，再通过醛基与待偶联的分子发生连接。与戊二醛法相比，过碘酸钠法的效率提高至少3～4倍。用于偶联HRP和IgG时，约有70%的酶和99%的抗体反应。最佳时，每个IgG分子可与5～6个HRP分子连接。尽管按该法制备酶标记物时酶活的损失可达50%，但用于酶免疫测定时可将灵敏度提高5倍左右。过碘酸钠法虽有很高的产率，但操作中对于过碘酸钠的浓度和工作pH等都需十分注意，过碘酸钠浓度过高可以导致新形成的醛基被直接进一步氧化为羧基，浓度过低则无法使糖基氧化。针对不同批次的酶之间存在糖基化程度有差别的特点，使用过碘酸钠法时需对不同批次的方法有所调整。另一方面，由于重组抗体和许多单克隆抗体不含糖基，若准备用该法连接这类抗体时，需事先确定抗体上是否有合适的修饰位点。戊二醛法和过碘酸钠法各有优点，也成为了商业法酶标抗体（如Sigma公司）的主流制备方法，但这两种方法都涉及使用高浓度的酶和抗体，也需要较为繁琐的分离与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析或亲和层析柱纯化等。
近年来，纳米技术发展迅速，新兴的纳米材料也层出不穷，这为新一代的酶标抗体的发展提供了可能。西班牙Merkoci课题组分别于2007年和2010年报道将HRP二抗和胶体金结合形成胶体金HRP二抗复合标记抗体用于酶联免疫检测，结果表明新的酶标抗体能使检测的灵敏度提高10倍左右。该复合抗体是将传统方法制备的酶标记抗体以胶体金表面能承受的饱和吸附量吸附到胶体金表面，形成包被有酶标二抗的纳米胶体金。当胶体金上的任一抗体参与抗原捕捉后，与该抗体连接着的胶体金上的其他酶标记抗体都可以参与信号示踪（如加底物后显色），从而使灵敏度提升。另一方面，胶体金的相对大的表面积足以同时容纳更多的酶标记抗体（如1个18nm胶体金离子可容纳约13个HRP），Merkoci课题组使用的这种高灵敏度的胶体金复合酶标特点在于使参与信号示踪的酶标量增多，突破传统酶标抗体在参与捕捉抗原后，只有酶标抗体其自身所带1～2倍数量酶标分子能参与信号示踪这一局限。该胶体金复合酶标记抗体虽有更高的灵敏性，但是仍以制备好的传统酶标抗体为基础，并没变传统意义上抗体与酶的偶联过程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备酶标记抗体的方法，能以未经偶联的抗体和酶为基础，结合纳米材料（胶体金）制备高灵敏度的新一代酶标记胶体金复合抗体。为此，本发明采用以下技术方案：它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的pH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混匀，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶复合抗体。
Merkoci课题组制备的酶标记金胶复合抗体不仅需以现成的酶标抗体为基础，还需使用较高终浓度的酶标记抗体（8～9μg/mL）来饱和胶体金表面以使胶体稳定，这无疑增大了酶标记抗体的耗费量。目前，市售的大部分抗体的价格是等质量酶价格的数十到上百倍，考虑到酶相对低的成本，本发明的核心思路是在保证抗体捕捉抗原的能力（即抗体的量）不受影响的情况下，通过胶体金为载体来增大用于信号示踪的酶标分子的量。首先将胶体金溶液浓缩（通过离心后加少量水重溶）以增大单位体积溶液内胶体金可以用于吸附蛋白的总的表面积；将胶体金溶液的pH调到略高于酶的等电点，将酶加入后混匀，便可以以简捷的直接吸附在金胶表面包满一层酶分子，一方面可以为后续步骤获得充足的酶标分子，另一方面可以使金胶溶液稳定。再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记胶体金复合抗体。
在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案：
所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。
所采用胶体金粒子的直径范围在18～60nm之间；
所述略高于用于标记的酶的等电点的pH为高于用于标记的酶的等电点0.4-0.6个单位的pH。
所述双功能试剂为戊二醛或N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯。
所述方法包括制备用于标记的酶溶液的步骤，它将用于标记的酶用水配成0.1～2mg/mL的澄清溶液，所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶；
所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤，所述胶体金溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法来制备；
所述方法还包括以下步骤：
(1) 将所制备的胶体金溶液浓缩至原浓度的2倍，将浓缩过的胶体金溶液的pH值调节到适合标记酶的最佳pH范围，即高出用于标记的酶的等电点约0.4-0.6个单位的pH，然后将该胶体金溶液与所述用于标记的酶溶液进行混合，在室温或4°C条件下混合1h。随后将混合液于15000g 4°C下离心15min，吸走上清液后加入等体积的磷酸盐缓冲液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的pH =7.4，即得到标记有酶的胶体金溶液；
(2) 将步骤(1)所得溶液中加入双功能试剂，所述双功能试剂选自如戊二醛或N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯，使标记在胶体金上的酶经双功能试剂活化后修饰上功能基团；随后将反应液在15000g和 4°C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的pH =7.4，此离心步骤重复进行以去除未参与反应的多余双功能试剂；
(3) 往步骤(2)所得的产物中加入抗体，抗体的最终浓度为5～50μg/mL，混匀后过夜反应，使抗体连接到标记在胶体金上的酶的活化的功能基团上，随即加入封闭剂封闭掉酶上可能残余的双功能试剂功能基团；然后将产物进行离心后溶于磷酸盐缓冲液中，即制得以胶体金为载体的酶标记抗体。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性效果：（1）通过直接吸附这种简捷的方式完成了胶体金上的酶标记；（2）之后的双功能试剂两步法中，酶和偶联剂的分离以及抗体连接后的分离纯化无需引入凝胶过滤、透析或亲和层析等繁琐且高损耗的昂贵步骤，只需通过简单的离心即可完成，因为连接上的胶体金粒子可以很轻易的离心下来（如在15000g的条件下）；（3）胶体金吸附酶前进行的浓缩操作可以提高被连接试剂（酶和抗体）的连接量，同时可以增加酶标记胶体金复合抗体中金胶粒子的浓度；（4）酶分子要比传统的酶标记抗体分子直径要小，单位面积的胶体金表面可以吸附更多的酶分子来作为信号示踪分子；（5）所获得的酶标记胶体金复合抗体仍能和Merkoci课题组制备的酶标记胶体金复合抗体一样具有较传统酶标抗体的信号放大能力，第（3）和（4）点的效果更提升了这种信号放大能力。（6）酶标记胶体金复合抗体仍保有胶体金的酒红色，可以作为操作中是否加入酶标抗体的指示，可以省去商业化酶标抗体中加入有色染料来作为指示这一步骤。（7）吸附有蛋白的胶体金易于保存，在的4°C无菌环境下可以稳定保存一年以上。酶标记金胶复合抗体同样符合这一特征。
附图说明
图1是本发明制备过程的示意图。
具体实施方式
如图1所示，一种酶标记胶体金复合抗体，包括胶体金粒子1、酶分子2、双功能试剂分子3、抗体4。
以下采用本发明方法制备系列酶标记胶体金复合抗体。
实施例1：
取2.5mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的100mL含0.01%的氯金酸溶液中，并同时进行磁力搅拌使之混合均匀。反应一段时间后，溶液由黄变蓝，最终变成酒红色，停止加热并在磁搅拌的条件下直至冷却，即制得直径约为18nm的胶体金。
取一定体积的胶体金溶液，在15000g 和4°C条件下离心15min后吸走上清液，并用原体积一半的去离子水重新溶解。用0.2M K2CO3将浓缩后的胶体金pH值调至约8.2-8.5之间，随后加入一定浓度的辣根过氧化物酶（HRP, 等电点PI =7.2～8.0）,使HRP最终浓度为50μg/mL。在室温或4°C下旋转混合1－2小时，随后将反应液在15000g和 4°C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重新溶解。再往该标记有酶的胶体金溶液中加入戊二醛（戊二醛在溶液中的最终浓度0.2%），混匀后在旋转混合器上反应2小时。随后按之前的离心步骤重复两次。
产物中加入抗体（抗体在溶液中的最终浓度10μg/mL），混匀后在旋转混合器上过夜反应；之后加入与原反应液等体积的1M甘氨酸反应2小时。然后将产物进行离心后溶于磷酸盐缓冲液中，即制得以胶体金为载体的酶标记抗体。随后将反应液在15000g 和4°C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）重新溶解，此离心步骤重复两次，即制得酶标记胶体金复合抗体。
实施例2：
取1.5mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的100mL含0.01%的氯金酸溶液中，按实施例1中步骤可制得直径约为25nm的胶体金。
同实施例1中步骤将胶体金浓缩后用0.1M盐酸调pH值至5左右，随后加入一定浓度的碱性磷酸酶（AP, 等电点PI =4.5）,使AP最终浓度为50μg/mL。除了双功能试剂采用N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯（N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯在溶液中的最终浓度0.2%到1%），余下步骤同实施例1。
实施例3：
取1.2mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的100mL含0.01%的氯金酸溶液中，按例1中步骤可制得直径约为40nm的胶体金。
同实施例1中步骤将胶体金浓缩后用0.1M盐酸调pH值至5左右，随后加入一定浓度的半乳糖苷酶（β-Gal, 等电点PI =4.6）,使β-Gal最终浓度为100μg/mL。余下步骤同实施例1，除了把加入的抗体的最终浓度改为50μg/mL。
实施例4：
同实施例1制成18nm的胶体金，将胶体金浓缩后用0.1M盐酸调pH值至5左右，随后加入一定浓度的葡萄糖氧化酶（GO, PI=4.4）, 使GO最终浓度为50μg/mL，余下的步骤都同实施例1。
Claims (6)
1.一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的pH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混匀，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶复合抗体。
2.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。
3.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所采用胶体金粒子的直径范围在18～60nm之间。
4.如权利要求1、2或3所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述略高于用于标记的酶的等电点的pH为高于用于标记的酶的等电点0.4-0.6个单位的pH。
5.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述双功能试剂为戊二醛或N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯。
6.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述方法包括制备用于标记的酶溶液的步骤，它将用于标记的酶用水配成0.1～2mg/mL的澄清溶液，所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶；
所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤，所述胶体金溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法来制备；
所述方法还包括以下步骤：
(1) 将所制备的胶体金溶液浓缩至原浓度的2倍，将浓缩过的胶体金溶液的pH值调节到适合标记酶的最佳pH范围，即高出用于标记的酶的等电点约0.4-0.6个单位的pH，然后将该胶体金溶液与所述用于标记的酶溶液进行混合，在室温或4°C条件下混合1h；
随后将混合液于15000g 4°C下离心15min，吸走上清液后加入等体积的磷酸盐缓冲液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的pH =7.4，即得到标记有酶的胶体金溶液；
(2) 将步骤(1)所得溶液中加入双功能试剂，所述双功能试剂选自如戊二醛或N,N'-二琥珀酰亚胺碳酸酯，使标记在胶体金上的酶经双功能试剂活化后修饰上功能基团；随后将反应液在15000g 4°C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的pH =7.4，此离心步骤重复进行以去除未参与反应的多余双功能试剂；
(3) 往步骤(2)所得的产物中加入抗体，抗体的最终浓度为5～50μg/mL，混匀后过夜反应，使抗体连接到标记在胶体金上的酶的活化的功能基团上，随即加入封闭剂封闭掉酶上可能残余的双功能试剂功能基团；然后将产物进行离心后溶于磷酸盐缓冲液中，即制得以胶体金为载体的酶标记抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010594301.3A CN102141567B (zh) | 2010-12-19 | 2010-12-19 | 一种制备酶标记抗体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010594301.3A CN102141567B (zh) | 2010-12-19 | 2010-12-19 | 一种制备酶标记抗体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102141567A true CN102141567A (zh) | 2011-08-03 |
| CN102141567B CN102141567B (zh) | 2014-03-12 |
Family
ID=44409235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010594301.3A Expired - Fee Related CN102141567B (zh) | 2010-12-19 | 2010-12-19 | 一种制备酶标记抗体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102141567B (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102183633A (zh) * | 2011-02-24 | 2011-09-14 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 一种胶体金标记方法 |
| CN103940765A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-07-23 | 厦门大学 | 一种生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法和用途 |
| CN104076140A (zh) * | 2014-07-09 | 2014-10-01 | 国家纳米科学中心 | 一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用 |
| CN106226519A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-14 | 洛阳现代生物技术研究院有限公司 | 一种o型口蹄疫病毒抗体化学发光检测试剂盒 |
| CN106248956A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-21 | 南昌大学 | 一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法 |
| CN106290893A (zh) * | 2016-07-18 | 2017-01-04 | 南昌大学 | 一种基于纳米铂探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法 |
| CN106442996A (zh) * | 2016-09-10 | 2017-02-22 | 天津大学 | 基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法 |
| CN110108868A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-09 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种酶标记的方法及其应用 |
| JP2020016522A (ja) * | 2018-07-25 | 2020-01-30 | 国立大学法人 岡山大学 | 磁性粒子を用いた免疫染色法 |
| CN114544966A (zh) * | 2020-11-11 | 2022-05-27 | 艾克发(北京)生物技术有限公司 | 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10128093A1 (de) * | 2001-06-11 | 2003-03-27 | Christof M Niemeyer | Verfahren zum Nachweis von Substanzen und Artikel zur Durchführung dieser Verfahren |
| CN1804627A (zh) * | 2006-01-13 | 2006-07-19 | 东南大学 | 金或银纳米粒子的表面功能化及比色检测生物分子的方法 |
| CN1866017A (zh) * | 2005-05-16 | 2006-11-22 | 艾博（武汉）生物技术有限公司 | 急性心肌梗死早期诊断三合一检测试剂板 |
| CN1979167A (zh) * | 2006-12-15 | 2007-06-13 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN101620230A (zh) * | 2009-08-11 | 2010-01-06 | 无锡益达生物技术有限公司 | 一种乳制品中β-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法 |
-
2010
- 2010-12-19 CN CN201010594301.3A patent/CN102141567B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10128093A1 (de) * | 2001-06-11 | 2003-03-27 | Christof M Niemeyer | Verfahren zum Nachweis von Substanzen und Artikel zur Durchführung dieser Verfahren |
| CN1866017A (zh) * | 2005-05-16 | 2006-11-22 | 艾博（武汉）生物技术有限公司 | 急性心肌梗死早期诊断三合一检测试剂板 |
| CN1804627A (zh) * | 2006-01-13 | 2006-07-19 | 东南大学 | 金或银纳米粒子的表面功能化及比色检测生物分子的方法 |
| CN1979167A (zh) * | 2006-12-15 | 2007-06-13 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种检测疟原虫的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN101620230A (zh) * | 2009-08-11 | 2010-01-06 | 无锡益达生物技术有限公司 | 一种乳制品中β-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ADRIANO AMBROSI等: "Double-Codified Gold Nanolabels for Enhanced Immunoanalysis", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| ADRIANO AMBROSI等: "Enhanced Gold Nanoparticle Based ELISA for a Breast Cancer Biomarker", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| DIANPING TANG等: "Ultrasensitive Electrochemical Immunosensor for Clinical Immunoassay Using Thionine-Doped Magnetic Gold Nanospheres as Labels and Horseradish Peroxidase as Enhancer", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102183633A (zh) * | 2011-02-24 | 2011-09-14 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 一种胶体金标记方法 |
| CN102183633B (zh) * | 2011-02-24 | 2013-05-15 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 一种胶体金标记方法 |
| CN103940765A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-07-23 | 厦门大学 | 一种生物功能化的纳米微球颗粒联合氯金酸-金纳米颗粒探针及其制备方法和用途 |
| CN104076140A (zh) * | 2014-07-09 | 2014-10-01 | 国家纳米科学中心 | 一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用 |
| CN106226519A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-14 | 洛阳现代生物技术研究院有限公司 | 一种o型口蹄疫病毒抗体化学发光检测试剂盒 |
| CN106248956A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-12-21 | 南昌大学 | 一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法 |
| CN106290893A (zh) * | 2016-07-18 | 2017-01-04 | 南昌大学 | 一种基于纳米铂探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法 |
| CN106442996A (zh) * | 2016-09-10 | 2017-02-22 | 天津大学 | 基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法 |
| JP2020016522A (ja) * | 2018-07-25 | 2020-01-30 | 国立大学法人 岡山大学 | 磁性粒子を用いた免疫染色法 |
| CN110108868A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-09 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种酶标记的方法及其应用 |
| CN114544966A (zh) * | 2020-11-11 | 2022-05-27 | 艾克发(北京)生物技术有限公司 | 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102141567B (zh) | 2014-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102141567B (zh) | 一种制备酶标记抗体的方法 | |
| Tian et al. | A sensitive lateral flow immunochromatographic strip with prussian blue nanoparticles mediated signal generation and cascade amplification | |
| CN103048460B (zh) | 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法 | |
| CN102890155B (zh) | 基于能量共振转移的荧光试纸条及制备方法与应用 | |
| CN1311239C (zh) | 免疫层析测试条及其制造方法 | |
| CN102967706B (zh) | 检测肿瘤标志物流动注射化学发光免疫传感器的制备及应用 | |
| CN105242047A (zh) | 黄曲霉毒素b1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用 | |
| WO2015160753A1 (en) | Electrochemical detection systems and methods using modified coated multi-labeled magnetic beads with polymer brushes | |
| CN106706907A (zh) | 一种基于量子点微球和抗生素的金黄色葡萄球菌快速层析试纸条 | |
| CN104634973A (zh) | 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN112415193A (zh) | 基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法 | |
| CN102430392A (zh) | 一种复合纳米胶体金壳聚糖免疫载体及其制备方法 | |
| US20220113308A1 (en) | Catalytic signal enhancement for lateral flow immunoassays | |
| Wannlund et al. | A sensitive bioluminescent immunoassay for dinitrophenol and trinitrotoluene | |
| JP5104622B2 (ja) | 磁性粒子を用いた測定対象物質の濃度測定法 | |
| Li et al. | Luminol, horseradish peroxidase and antibody ternary codified gold nanoparticles for a label-free homogenous chemiluminescent immunoassay | |
| CN107955070A (zh) | 一种改进的重金属铜人工抗原的合成方法及nota在制备重金属铜人工抗原试剂中的用途 | |
| JPH03209166A (ja) | 金属ゾル試剤の製造及び使用 | |
| CN107955069A (zh) | 一种改进的重金属铅人工抗原的合成方法及dota在制备重金属铅人工抗原试剂中的用途 | |
| CN102879580A (zh) | 微量蛋白检测方法 | |
| CN101769919A (zh) | 免疫层析检测装置及其检测方法 | |
| CN115403672A (zh) | 一种生物素化抗溶菌酶金抗体及其构建方法 | |
| JP2001305139A (ja) | 特異的結合体 | |
| CN104569376B (zh) | 一种磁微粒介导的层析检测技术装置及其用途 | |
| CN104777317B (zh) | 一种金纳米粒子探针的制备及其在快速免疫检测中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140312 Termination date: 20151219 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |