CN107955069A - 一种改进的重金属铅人工抗原的合成方法及dota在制备重金属铅人工抗原试剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备基于新型双功能螯合剂DOTA的重金属铅的人工抗原的合成方法，以2‑S‑(4‑氨基苯）‑1,4,7,10四氮杂环壬烷‑1,4,7,10‑四乙酸为螯合剂，将铅离子螯合剂复合物与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白KHL偶联，制备人工抗原。该方法在原来传统基础上增加了采用硼氢化钠还原步骤，提高了偶联效率。本发明还提供DOTA在制备重金属铅的人工抗原上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用新型双功能螯合剂DOTA为连接载体的针对重金属铅的的人工抗原的合成技术，属于免疫化学技术中的人工抗原制备技术领域，可用于后续高特异性抗重金属铅抗体的制备和免疫分析技术的研究，并用于环境样品中微量和恒量重金属铅的检测。
背景技术
重金属污染主要指铜、镉、汞、镍、铬、砷、锌、铅等污染物。重金属分布广泛、难以降解，可通过大气、水、食物链进入人体，与体内蛋白质及各种酶发生作用，使它们失去活性，并在某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性或慢性中毒，具有致癌、致畸及致突变作用，对人体具有很大的危害。根据第一次全国污染源普查结果，2007年全国废水中铅、汞、镉、铬、砷等五种重金属产生量为2.54万吨，排放量897.3吨。大气中上述五种重金属污染物排放量约9500吨。列入国家危险废物名录中含上述五种重金属的废物产生量为1690万吨，我国生态环境中重金属的污染形势非常严峻，污染事件时有发生，据统计，在2011年1到8月，全国发生了11起严重的重金属污染事件，如云南曲靖铬污染事故，广西柳州的龙江河镉污染事故，儿童血铅超标事件等，重金属污染事件对周边生态环境的影响范围之广、对民众生命健康的危害之大，引起了社会的高度关注。因此加强重金属在环境、农产品和食品中残留检测成为保障重金属安全的重要手段，而新形势下检测新技术的研究和开发显得尤为迫切。
传统的重金属检测方法多采用原子吸收光谱分析(Atomic AbsorptionSpectroscopy，AAS)、电感耦合等离子发射光谱(Inductively Coupledplasma AtomicEmission Spectroscopy，ICP-AES)、阳极溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammetry,ASV)、色谱法和各种联用检测方法。这些方法虽然能对各种环境样品中的重金属离子进行有效分析，但大多需要大型仪器，分析方法成本高，样品需要经过消解，分析时间长，不适于重金属的现场快速检测，难以适应环境及市场产品的现场抽查、生产企业自查及产品进出口快速通关的要求。
免疫学检测技术具有检测速度快、分析容量大、费用低廉、仪器简单易携、使用人员技术要求不高，容易普及和推广、灵敏度高和选择性强等优点，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。
重金属离子免疫检测的关键在于抗重金属特异性抗体的制备，而特异性抗体制备的关键又在于优质重金属免疫原的合成。一方面，由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，引起动物中毒反应；另一方面，重金属的分子量低，不具有免疫原性，需将它与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原，但是由于重金属离子直接与蛋白连接，会使蛋白质变性，因此，需利用双功能螯合剂螯合重金属离子，制备金属-螯合剂复合物，将该复合物再与蛋白偶联后制备完全抗原，进而免疫动物制备特异性抗体。采取的是一种开环式的双功能螯合剂进行螯合，后再与载体蛋白偶联制备人工抗原进行动物免疫和抗体的制备，在此基础上建立不同的免疫分析技术和方法。
制备重金属免疫原的关键在于双功能螯合剂的选择，目前常用的双功能螯合剂主要是乙二胺四乙酸(ethylenediamie tetraacetic acid，EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(diethylene triamine penlaacetic acid，DTPA)的衍生物及其他具有螯合功能的结构类似物，属于链式开环结构的螯合剂，螯合物是由中心离子和多齿配体结合而成的具有环状结构的配合物。例如，EDTA与金属离子通过羧酸基和氮原子键合而形成比络合物更稳定的金属-EDTA螯合物，而双功能螯合剂应具有两个作用，除了能特异性螯合重金属离子之外，还能与载体蛋白偶联，形成免疫原，用于后续免疫动物、制备抗体。这些常规的螯合剂由于是开环式和直链型的结构结合重金属离子，重金属离子和螯合剂的复合物作为抗原识别位点在空间结构上比较简单，特征官能团特征不强，导致所制备的抗原决定簇抗原特性不强，直接影响高特异性和高灵敏度抗体的制备效率。
因此,需要提供一种新的螯合剂来制备重金属的抗原,从而生产的抗体具有特异性强, 有利于制备亲和力更高，特异性更强的抗重金属单克隆抗体。
发明内容
本发明选取的是新型双功能螯合剂DOTA，该螯合剂具有四氮闭环结构的特征，在结构上能更好的结合重金属离子，与三氮闭环结构骨架的螯合剂相比，对原子半径较大的重金属离子螯合效果更佳，在空间结构上能更好的将重金属铅离子的复合三维结构展现出来，作为抗原决定簇，有利于制备亲和力更高，特异性更强的抗重金属单克隆抗体。
本发明提供了一种制备基于新型双功能螯合剂DOTA的重金属铅的人工抗原的合成方法，该方法在原来传统基础上增加了采用硼氢化钠还原步骤，提高了偶联效率。
本发明的技术方案为：一种重金属铅人工抗原的合成方法，以2-S-(4-氨基苯）-1,4,7,10四氮杂环壬烷-1,4,7,10-四乙酸为螯合剂，将铅离子螯合剂复合物与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA偶联，制备人工抗原。
制备步骤为：
（1）重金属人工抗原的合成：
称取5-8 mg DOTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170-200 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3-5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入600-700 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取25-30 mg 牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA溶解于3 ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入150-200 μl硼氢化钠溶液（18 mg溶解于180 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3-5次，再用30 KD的超滤离心管7000-8000 rpm离心3-5次，用5-10 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
（2）人工抗原的鉴定：
采取SDS-PAGE鉴定其偶联效果，采用紫外扫描和ICP-MS法测定人工抗原的偶联结合比。
附图说明：
图1：Cu-DOTA-BSA和Cu-DOTA-OVA紫外扫描图谱。
图2：Cu-DOTA-BSA和Cu-DOTA-OVA电泳图谱。
图3：DOTA,DTPA和EDTA结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案、技术效果更加清楚明白，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明，并不限定本发明。
实施例1
称取7 mg DOTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为30:1,偶联效率高（一个螯合物偶联有30个重金属离子和螯合剂的复合物）。
实施例2
称取7 mg DOTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg 鸡卵清蛋白OVA溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为27:1,偶联效率高。（结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联率也越高，如结合比为27：1，则表示一个蛋白分子上结合27个重金属离子。）
实施例3
称取7 mg DOTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h获得F液；
反应液F液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为8:1,偶联效率一般。说明硼氢化钠可以提高偶联效率。
实施例4
称取7 mg DTPA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为10:1,偶联效率高。
实施例5
称取7 mg DTPA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg OVA溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为7:1,偶联效率高。
实施例6
称取7 mg EDTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成EDTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg BSA溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为8:1,偶联效率高。
实施例7
称取7 mg EDTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成EDTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3 h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入630 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20 mg OVA溶解于3 ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入170μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30 KD的超滤离心管7500 rpm离心4次，用8 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过偶联物蛋白浓度测定和ICP-MS测定计算结合比为6:1,偶联效率高。
实施例子8
对实施例子1、3、4和6制备的抗原分别进行BALB/C小鼠进行免疫，初次免疫采用完全佐剂乳化抗原，计量为200 μg/小鼠, 后每间隔21天加强免疫，共加强免疫3次，加强免疫采用不完全佐剂进行乳化，免疫计量为75 μg/小鼠， 最后进行末免，末免采用抗原直接腹腔注射的方式进行，免疫计量为100 μg/小鼠，后采血进行多抗血清的效价测定，结果如下：
| 免疫抗原 | 结合比 | 检测抗原 | 结合比 | 抗血清效价 |
| Pb- DOTA-BSA例1 | 30:1 | Pb- DOTA-OVA例2 | 27:1 | 256000 |
| Pb- DOTA-BSA例3 | 8:1 | Pb- DOTA-OVA例2 | 27:1 | 32000 |
| Pb- DTPA-BSA例4 | 10:1 | Pb- DTPA-OVA例5 | 7:1 | 32000 |
| Pb- EDTA-BSA例6 | 8:1 | Pb- EDTA-OVA例7 | 6:1 | 32000 |
通过以上数据表明，实施例子1的效价最高，而实施例子3中缺少硼氢化钠溶液的反应，让其抗血清效价显著降低，这说明硼氢化钠溶液不仅可以提高偶联效率，还可以显著提高抗血清的效价。同样，实施例子4和6中的抗血清效价可以知道，不同的螯合物对于同一抗体的亲和力显著降低，尽管也采用了硼氢化钠溶液进行了处理，但是实施例子4和6采取的螯合剂属于开环直链式结合方式，影响了特征抗原表位的形成，抗原特异性和结合度不够，不能更好的把重金属这一抗原决定簇表现出来，导致特异性抗体的制备没有实施例子1的好，体现了DOTA螯合剂的优越性。
Claims (2)
1.一种改进的重金属铅人工抗原的合成方法，其特征在于，以2-S-(4-氨基苯）-1,4,7,10四氮杂环壬烷-1,4,7,10-四乙酸（简称DOTA）为新型螯合剂，将铅离子与载体蛋白牛血清白蛋白BSA和鸡卵清蛋白OVA偶联，偶联方法如下：
称取5-8 mg DOTA，溶解于2 ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(0.01 mol/L,pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.19 mg硝酸铅溶解于5 ml超纯水中，制备成7.5X10-2M的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取170-200 μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3-5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入600-700 μl，20 mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取25-30 mg 牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA溶解于3 ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24 h，后逐滴加入150-200 μl硼氢化钠溶液（20 mg溶解于200 μl超纯水中），室温下避光反应1h；
反应液先用8 KD的透析袋透析3-5次，再用30 KD的超滤离心管7000-8000 rpm离心3-5次，用5-10 ml的0.01 M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20 ℃低温保存。
2.2-S-(4-氨基苯）-1,4,7,10四氮杂环壬烷-1,4,7,10-四乙酸（简称DOTA） 在制备重金属铅人工抗原试剂中的用途。
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