CN101935348A - 铅离子抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铅离子抗原及其制备方法与应用。本发明提供的制备铅离子抗原的方法，包括如下步骤：1)将螯合剂溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐水溶液，进行重氮化反应，得到重氮化的螯合剂；2)将步骤1)得到的重氮化的螯合剂和载体蛋白溶液混合，进行偶联反应，得到所述螯合剂与载体蛋白的偶联物；3)将步骤2)得到的所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子的溶液混合，进行络合反应，得到螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子形成的络合物。本发明的制备铅离子抗原的方法及由该方法获得的铅离子抗原在铅离子的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

Description

铅离子抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种铅离子抗原及其制备方法与应用。

背景技术

重金属是环境与农产品中的重要污染物质，可以通过食物链在动物及人的体内富集，对人类健康会带来严重的危害。铅是重金属污染中毒性较大的一种，一旦进入人体很难排除。直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经板，可造成先天大脑沟回浅，智力低下；对老年人造成痴呆、脑死亡。

目前，重金属铅的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光/质谱法、X-射线荧光光谱法、电位溶出分析法以及近几年发展的生物传感器检测法等。但是用这几种方法检测铅离子需要昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时，不能用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备铅离子抗原的方法。

本发明所提供方法，包括如下步骤：

1)将螯合剂溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐水溶液，进行重氮化反应，得到重氮化的螯合剂；

2)将步骤1)得到的重氮化的螯合剂和载体蛋白溶液混合，进行偶联反应，得到所述螯合剂与载体蛋白的偶联物；

3)将步骤2)得到的所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子的溶液混合，进行络合反应，得到螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子形成的络合物，即得到铅离子抗原。

步骤1)中，所述螯合剂、所述酸和所述亚硝酸盐的投料配比为2.5mg∶2.5×10^-4mol∶0.7×10^-5mol；

步骤2)中，所述重氮化螯合剂和所述载体蛋白的投料摩尔比为12∶1；

步骤3)中，所述偶联物与所述铅离子的投料摩尔比为1∶12。

步骤1)中，所述重氮化反应的条件为：反应温度为0℃，反应时间为15min，避光；

步骤2)中，所述偶联反应的条件为：反应温度为4℃，PH为7.5，避光，反应时间为8h；

在步骤3)中，所述络合反应的条件为：反应温度为25℃，pH值为7.5，反应时间为12h。

步骤1)中，所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述亚硝酸盐为亚硝酸钠，所述酸的水溶液中，所述酸为盐酸、硫酸、硝酸或硼酸；

在步骤2)中，所述载体蛋白溶液按照如下方法制备：将载体蛋白溶解到缓冲液中得到所述载体蛋白溶液；所述缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，所述缓冲液的pH值为9.6；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白；

在步骤3)中，所述铅离子的溶液为硝酸铅水溶液。

所述步骤3)中，所述络合反应后，包括将络合反应产物进行透析得到铅离子抗原的步骤，所述透析用的溶液是PH值为7.5、浓度为0.1mol/L PB(磷酸盐溶液)溶液，1L所述PB溶液按如下方法制备：将0.2g KH₂PO₄和2.96g Na₂HPO₄·12H₂O溶于水中，用水定容到1L。

由上述任一所述方法制备得到的铅离子抗原也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种铅离子抗原。

本发明提供的铅离子抗原，是重氮化的螯合剂与载体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与铅离子通过配位键连接形成的络合物；所述共价键是重氮化螯合剂上的氨基上的氮与载体蛋白酪氨酸上酚羟基的邻位或对位形成的；所述配位键是偶联物中重氮化螯合剂上的有孤对电子的氧或氮与铅离子中空轨道形成的；所述重氮化的螯合剂的结构式如下：

；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。由上述任一所述铅离子抗原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。

上述任一所述铅离子抗原和/或所述抗体在检测样品中铅离子的应用也属于本发明的保护范围；

上述任一所述铅离子抗原和/或所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的酶联免疫试剂盒中的应用；

上述任一所述铅离子抗原和/或所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的发光免疫试剂盒中的应用；

上述任一所述铅离子抗原和/或所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的免疫亲和色谱柱中的应用；

所述样品为水体、食品或土壤。

本发明的实验证明，本发明中的制备铅离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铅离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的铅离子抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。因此，本发明中的制备铅离子抗原的方法及由该方法获得的铅离子抗原在铅离子的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

附图说明

图1为铅离子抗原的合成路线图

图2为以EDTA-Pb为标准样品建立的铅离子间接ELISA法标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)购于Sigma公司，产品号A3473.，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，EDTA乙二胺四乙酸，牛血清白蛋白，卵清白蛋白和硝酸铅Pb(NO₃)₂(原子吸收级)均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺(OPD)等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。

实施例1、铅离子抗原及其制备

图1为铅离子抗原的合成路线图，具体步骤如下：

一、铅-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白抗原(Pb-对氨基苄基-EDTA-OVA)的制备

1、重氮化：将2.5mg对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)溶解于2mL 1M的HCl水溶液中，得到溶液I；在0℃避光条件下，向溶液I中滴加50ul 0.1％(质量百分含量)的NaNO₂水溶液，搅拌反应15分钟，得到重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液。该反应体系中对氨基苄基乙二胺四乙酸、HCl和NaNO₂的的投料配比为2.5mg∶2.5×10^-4mol∶0.7×10^-5mol。

重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式如式I所示：

(式I)。

2、偶联：将步骤1得到的重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液在10分钟内加入到2mL含有23mgOVA(卵清蛋白)的碳酸钠缓冲液(0.05M，PH9.6)中，调节pH值到7.5，4℃避光搅拌反应8小时，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与OVA的偶联物。该反应体系中所述重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸与所述载体蛋白OVA的投料摩尔比为12∶1。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与OVA的偶联物的结构式如式II所示：

(式II)。

3、络合：将步骤2得到的反应产物溶液用1M的HCl将pH值调节到7.5，然后向其中滴加80ul 0.01M的硝酸铅水溶液，室温(25℃)反应过夜(12小时)，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与OVA的偶联物与铅离子形成的络合物，偶联物与所述铅离子的投料摩尔比为1∶12。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与OVA的偶联物与铅离子形成的络合物的结构式如式III所示：

(式III)。

4、透析：将步骤3得到的反应产物溶液在PH值为7.5的浓度为0.1mol/L PB(磷酸盐溶液)溶液(1L所述PB溶液按如下方法制备：将0.2g KH₂PO₄和2.96g Na₂HPO₄·12H₂O溶于水中，用水定容到1L。)中透析完全，得到Pb-对氨基苄基-EDTA-OVA，将Pb-对氨基苄基-EDTA-OVA用PH值为7.5的浓度为0.1mol/L PB溶液稀释为1mg/mL的溶液，得到浓度为1mg/mL的Pb-对氨基苄基-EDTA-OVA，置于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未螯合的铅离子或未反应的其他小分子。

Pb-对氨基苄基EDTA-OVA是重氮化的螯合剂与OVA通过共价键连接形成的偶联物再与铅离子通过配位键连接形成的络合物；所述共价键是重氮化螯合剂上的氨基上的氮与OVA酪氨酸上酚羟基的邻位或对位形成的；所述配位键是偶联物中重氮化螯合剂上的有孤对电子的氧或氮与铅离子中空轨道形成的。

二、铅-对氨基苄基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗原(Pb-对氨基苄基EDTA-BSA)的制备

1、重氮化：将4mg对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)，溶解于2mL 1M的HCl水溶液中，得到溶液I；在0℃避光条件下，向溶液I中滴加60ul 2M的NaNO₂水溶液，搅拌反应15分钟，得到重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液。该反应体系中对氨基苄基乙二胺四乙酸、HCl和NaNO₂的投料配比为2.5mg∶2.5×10^-4mol∶0.7×10^-5mol；

重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式如式IV所示：

(式IV)。

2、偶联：将步骤1得到的重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液在10分钟内加入到2mL含有56mg BSA(牛血清白蛋白)的碳酸钠缓冲液(0.05M)，PH9.6)中，调节pH值到7.5，4℃避光搅拌反应4小时，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物。该反应体系中所述重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸与所述载体蛋白BSA的投料摩尔比为12∶1。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物的结构式如式V所示：

(式V)。

3、络合：将步骤2得到的反应产物溶液用1M的HCl将pH值调节到7.5，然后向其中滴加140ul 0.01M的硝酸铅水溶液，室温反应过夜，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物与铅离子形成的络合物。偶联物与所述铅离子的投料摩尔比为1∶12。

对氨基苄基乙二胺四乙酸与BSA的偶联物与铅离子形成的络合物的结构式如式VI所示：

(式VI)。

4、透析：将步骤3得到的反应产物溶液在PH值为7.5的浓度为0.1mol/L PB(磷酸盐溶液)溶液(1L所述PB溶液按如下方法制备：将0.2g KH₂PO₄和2.96g Na₂HPO₄·12H₂O溶于水中，用水定容到1L。)中透析完全，得到Pb-对氨基苄基EDTA-BSA，用PB缓冲液将Pb-对氨基苄基EDTA-BSA稀释为1mg/mL的溶液，得到浓度为1mg/mL的Pb-对氨基苄基EDTA-BSA，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未螯合的铅离子或未反应的其他小分子。

Pb-对氨基苄基EDTA-BSA是重氮化的螯合剂与BSA通过共价键连接形成的偶联物再与铅离子通过配位键连接形成的络合物；所述共价键是重氮化螯合剂上的氨基上的氮与BSA酪氨酸上酚羟基的邻位或对位形成的；所述配位键是偶联物中重氮化螯合剂上的有孤对电子的氧或氮与铅离子中空轨道形成的。

实施例2、铅-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白抗原(Pb-对氨基苄基EDTA-OVA)的应用

一、利用铅-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白抗原制备抗体

(1)取8-10周龄的Bal b/c小白鼠作为实验动物。

(2)基础免疫：由实施例1中得到浓度为1mg/mL的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗原溶液，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL浓度为1mg/mL的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原(8周龄的Bal b/C小鼠体重约23-25g)。

加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被原为1mg/mL稀释500倍用，待效价大于1∶8000后(效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗体。用于下述各实验。

二、抗体效果检测

下述实验中所用的各种缓冲液如下：

(1)包被缓冲液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；

(2)磷酸盐缓冲液PBS(pH7.5)：称量4.0g NaCl、0.1g KH₂PO₄、1.48g Na₂HPO₄·12H₂O用蒸馏水定容到500mL，浓度为0.1M、pH为7.5磷酸盐缓冲液；

(3)样品稀释液PBSTG：由0.5ml吐温20、0.5g明胶和500ml浓度为0.1M、PH为9.6的PBS缓冲液混合得到；

(4)柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液：由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；柠檬酸三钠在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.01M，Na₂HPO₄在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03M；柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的pH值为5.5；

(5)底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺(OPD)溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30％的H₂O₂水溶液得到的溶液，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为(4)中所述；

(6)终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液；

(7)洗涤液：由NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、Tween-20和水组成；NaCl在洗涤液中的浓度为8.0g/L，KH₂PO₄在洗涤液中的浓度为0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O在洗涤液中的浓度为2.96g/L，Tween-20在洗涤液中体积百分含量为1∶1000。

(一)抗体抑制实验

1、Pb-对氨基苄基EDTA-BSA包被抗原溶液的配制

将上述实施例1得到的浓度为1mg/mL的Pb-对氨基苄基EDTA-BSA抗原完全解冻后，用包被缓冲液按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000进行梯度稀释，得到不同浓度的Pb-对氨基苄基EDTA-BSA的包被抗原溶液。

2、EDTA-Pb螯合物标准品溶液的配制

(1)称取29.3mg EDTA，充分溶解于10mL去离子水中，用1M NaOH调节pH至8.0，得到溶液I；

(2)称取33.1mg Pb(NO₃)₂，溶解于去离子水中，并逐滴加入到上述步骤(1)配制的溶液I中，磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至20.7mL，得到螯合产物溶液，其中含有EDTA与Pb的螯合物(EDTA-Pb)，EDTA-Pb在溶液中的浓度为1.60mg/mL，Pb离子在螯合产物溶液中的浓度为1mg/mL；

(3)用样品稀释液将上述步骤(2)的螯合产物溶液配成浓度为2000ng Pb²⁺/mL的EDTA-Pb螯合物标准品溶液。

3、Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗血清稀释液的配制

将上述步骤一制备的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗体用样品稀释液按1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000进行梯度稀释，得到Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗血清稀释液。

4、抗原、抗体的棋盘格实验

包被：在96孔酶标板中每孔加入100mL步骤1制备得到的Pb-对氨基苄基EDTA-BSA包被抗原溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

封闭：封闭液150μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。

竞争：零孔每孔加50ul样品稀释液，抑制孔每孔加入50ul步骤2制备得到的EDTA-Pb螯合物标准品溶液。将上述步骤3得到的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗血清稀释液(从2.5×10³倍到40×10³倍)加入酶标板中(50ul/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP，Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)稀释1000倍，稀释液是0.1M，PH为9.6的PBSTG，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

显色：将底物缓冲液加入酶标板中，每孔100ul。避光显色15min。

终止：每孔加入50μL终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

效价的定义为零孔OD值为1时的血清稀释倍数。

结果如表1所示。

表1  抗Pb²⁺-EDTA小鼠的血清效价检测(OPD 37℃显色15min，2000ng标样抑制)

注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。

表1中结果表明，当包被抗原稀释度为1∶4000，抗血清稀释度为1∶2500时，此时的抑制率最好，为66.3％(抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％)，也即此时的抑制效果最好。说明上述实施例1制备的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA可以作为免疫原制备出检测铅离子的抗体。

A₀为对照孔OD值；A₂₀₀₀为抑制孔OD值；

抑制率的计算公式：抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％。

(二)EDTA-Pb标准曲线的建立

将上述制备的EDTA-Pb螯合物标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL。

(1)包被原的包被：将上述制备的1mg/ml Pb-对氨基苄基EDTA-BSA抗原按照1∶4000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的EDTA-Pb螯合物标准品溶液(实验孔)，每孔50μL，对照孔中不添加EDTA-Pb螯合物标准品溶液而加入50μL样品稀释液；

(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1∶2500的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA抗血清稀释液，每孔50μL；37℃温育30分钟；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1∶1000的IgG-HRP(Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)，37℃温育30分钟；用洗涤液洗板4次，倒掉酶标板中的溶液，甩干；

(5)向实验孔和对照孔中分别加入100μL底物缓冲液，37℃温育15分钟后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；

(6)在492nm下测定吸光值；

(7)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的EDTA-Pb螯合物标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为EDTA-Pb螯合物标准品溶液的平均吸光度值，B₀为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。结果表明，其灵敏度(IC₅₀)为56ng/mL，检测范围是10.4ng/mL-2000ng/mL。说明上述实施例1制备的Pb-对氨基苄基EDTA-OVA作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的效果。

(三)抗体特异性检测

EDTA-Pb螯合物标准品溶液的配制

1、EDTA-Pb类似鳌合物的制备

参照步骤(一)中EDTA-Pb螯合物的制备方法，制备Cd、Cu、Hg、Zn、Al、Fe、Ag、Mg、Ca金属的EDTA螯合物供试标准品溶液，以溶液中各金属离子实际含量计算各供试标准品溶液的浓度。

用样品稀释液将上述类似螯合物分别稀释成如下浓度：20000ng金属离子/mL、10000ng金属离子/mL、5000ng金属离子/mL、2500ng金属离子/mL、1250ng金属离子/mL、625ng金属离子/mL、312.5ng金属离子/mL。

2、各自建立标准曲线，测定抑制中浓度IC₅₀(抑制率达到50％的标样浓度值)。

标准曲线的建立方法与上述EDTA-Pb标准曲线的建立方法相同。

交叉反应率(％)＝(EDTA-Pb IC₅₀)/(EDTA-Pb类似鳌合物IC₅₀)×100％。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表2所示。

表2由Cu-对氨基苄基EDTA-OVA制备的抗体的特异性检测

分析物	IC50(ng/mL)	交叉反应率(％)
			EDTA-Pb	56	100
EDTA-Al	1080	5.2
			EDTA-Hg	2270	2.5
EDTA-Co	＞20000	＜1
			EDTA-Cu	＞20000	＜1

EDTA-Cd	＞20000	＜1
			EDTA-Fe	＞20000	＜1
EDTA-Ca	＞20000	＜1
			EDTA-Mg	＞20000	＜1
EDTA-Zn	＞20000	＜1
			EDTA-Ag	＞20000	＜1
EDTA	＞20000	＜1

结果表明，上述由Pb-对氨基苄基EDTA-OVA制备得到的抗体与其它EDTA-Pb类似鳌合物的交叉反应率很小，说明用Pb-对氨基苄基EDTA-OVA制备的抗体对铅离子具有很好的特异性。

Claims (9)

1.一种制备铅离子抗原的方法，包括如下步骤：

1)将螯合剂溶解于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐水溶液，进行重氮化反应，得到重氮化的螯合剂；

2)将步骤1)得到的重氮化的螯合剂和载体蛋白溶液混合，进行偶联反应，得到所述螯合剂与载体蛋白的偶联物；

3)将步骤2)得到的所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子的溶液混合，进行络合反应，得到螯合剂与载体蛋白的偶联物与铅离子形成的络合物，即得到铅离子抗原。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述螯合剂、所述酸和所述亚硝酸盐的投料配比为2.5mg∶2.5×10^-4mol∶0.7×10^-5mol；

步骤2)中，所述重氮化螯合剂和所述载体蛋白的投料摩尔比为12∶1；

步骤3)中，所述偶联物与所述铅离子的投料摩尔比为1∶12。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述重氮化反应的条件为：反应温度为0℃，避光，反应时间为15min；

步骤2)中，所述偶联反应的条件为：反应温度为4℃，PH为7.5，避光，反应时间为8h；

在步骤3)中，所述络合反应的条件为：反应温度为25℃，pH值为7.5，反应时间为12h。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸；所述亚硝酸盐水溶液中的亚硝酸盐为亚硝酸钠，所述酸的水溶液中的酸为盐酸、硫酸、硝酸或硼酸；

在步骤2)中，所述载体蛋白溶液按照如下方法制备：将载体蛋白溶解到缓冲液中得到所述载体蛋白溶液；所述缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，所述缓冲液的pH值为9.6；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白；

在步骤3)中，所述铅离子的溶液为硝酸铅水溶液。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述络合反应后，包括将络合反应产物进行透析得到铅离子抗原的步骤。

6.由权利要求1-5中任一所述方法制备得到的铅离子抗原。

7.一种铅离子抗原，是重氮化的螯合剂与载体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与铅离子通过配位键连接形成的络合物；所述重氮化的螯合剂的结构式如下：

；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

8.由权利要求6或7所述铅离子抗原制备得到的抗体。

9.权利要求6或7所述铅离子抗原和/或权利要求8中所述抗体在检测样品中铅离子中的应用；

权利要求6或7所述铅离子抗原和/或权利要求8中所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的酶联免疫试剂盒中的应用；

权利要求6或7所述铅离子抗原和/或权利要求8中所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的发光免疫试剂盒中的应用；

权利要求6或7所述铅离子抗原和/或权利要求8中所述抗体在制备用于检测样品中铅离子的免疫亲和色谱柱中的应用；

所述样品为水体、食品或土壤。

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