CN1769893A - 重金属Pb2+完全抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重金属Pb2+完全抗原的制备方法。该方法如下：取3.0～10.0mg重量份载体蛋白、0.4～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.3～0.8mg重量份Pb(NO3) 2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1.0～3.0ml体积份的HEPES缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于HEPES缓冲溶液中保存，分装，得成品。本发明所得抗原具有较好的免疫原性，用此抗原免疫小鼠能制备Pb特异性抗体，可以进一步制备重金属Pb快速检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测方法检测重金属Pb2+残留的抗原的制备方法。
背景技术
现已知至少20种左右的重金属有很大的毒性，它们中又有一半以上被大量排放的周围环境中。重金属属于永久性污染物质，它们的半衰期一般都在几十年以上，并且不能通过化学或生物修复等方法进行有效去除。我国目前沿用的传统重金属检测方法需要大型、昂贵的检测仪器，虽然能精确检测样品中单种金属的总量，但存在着费力、费时、费用昂贵、需要进行大量的样品预处理，并且样品的检测需在设有大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测等缺点。此外，这些检测方法不能提供重金属的氧化状态或者演变信息。
近年来由于我国社会经济的高速发展，重金属等污染物质被大量排放到周围环境中，由于重金属属于永久性污染物，并能被初等植物富集，通过食物链传递而进行生物放大作用，对人类健康造成严重威胁，因而需要对环境中的重金属残留尤其是市售食品重金属残留进行长期监测。
免疫学检测方法是一种新型、高效快速的检测方法，该方法具有检测速度快、费用低廉、简单易携、具有高度的灵敏度和选择性的特点，理论上能应用于能产生合适抗体的任何污染物质，目前被广泛应用于临床医学、动物检疫、食品科学、植物病毒、药物残留、病虫害防治等分析领域。建立重金属免疫学检测方法的关键点在于重金属完全抗原的制备，重金属离子由于其分子量较小，并且具有毒性，不能直接作为免疫原免疫动物，因而需要运用特殊的方法制备重金属完全抗原。
国外自从Reardan等人首次通过金属-鳌合剂抗原制备出单克隆抗体以来，越来越多的抗Hg2+、In3+、Cd2+、Pb2+、U6+等金属-鳌合剂复合物的单克隆抗体被制备出来，建立了KinExA法、间接竞争ELISA法、一步竞争性免疫检测法、荧光偏振免疫检测法等重金属免疫检测方法，检测限能达到ppb级别，并进行了抗原-抗体的结合属性的相关研究，这些研究基本上还处于实验室研究阶段。此外，国外水体受Cd2+离子污染最为严重，因而针对对Cd2+离子进行的相关研究最多，并取得了一定的进展：Blake等人正在研制Cd2+离子免疫传感器模型，检测结果能达到与ICP-AES可比的检测水平，并且他们正在与公司合作开发重金属免疫传感器。而国内尚未见到相关报道。
重金属免疫学检测方法的建立为重金属污染物的检测提供了另一途径。重金属免疫学检测方法建立的关键在于金属完全抗原的制备。重金属离子自身不能作为有效的抗体识别目标，因为它们带有电荷，趋向于与生物分子发生强烈的不可逆的反应(这也是重金属的毒性所在)，选用鳌合剂与金属离子配位使之与生物分子的反应能力减弱，这种金属—鳌合剂复合物应能够提供一个能被动物免疫系统识别的有机物外壳。但这种重金属—鳌合剂复合物是低分子的半抗原，不足于引起小鼠的免疫反应的发生，因此选用结构较复杂的大分子双功能鳌合剂，一方面鳌合重金属，另一方面通过其上的硫氰基团将其偶联到载体蛋白(BSA或KLH)上，从而制备出完全抗原。国外运用此理论目前已经建立了Hg2+、In3+、Cd2+、Pb2+、U6+等重金属酶联免疫快速高效检测方法，检测限能达到ppb级别，其检测结果甚至能达到与ICP-AES可比的程度，但这些研究成果目前还处于实验室研究阶段，离实际应用还有一段距离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重金属Pb2+完全抗原的制备方法，为制备重金属Pb2+残留快速检测试剂盒或者传感器提供物质基础。
为达上述目的，本发明的重金属Pb2+完全抗原的制备方法如下：取3.0～10.0mg重量份载体蛋白、0.4～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.3～0.8mg重量份Pb(NO3)2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1.0～3.0ml体积份的HEPES缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于HEPES缓冲溶液中保存，分装，得成品。
所述双功能鳌合剂为常用重金属鳌合剂二乙烯三胺五乙酸(以下称DTPA)或者乙二胺四乙酸(以下称EDTA)的硫氰基衍生物，例如CHX-A”-DTPA(N-[2-amino-3-p-isothiocyanatophenyl-proppy]-trans-cyclohexane-1，2-diamine-N，N’，N’，N”，N”-diethylenetriamine pentaacetic acid)、1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)等。
所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的优选重量比为(4～8)∶(0.7～1.2)∶(0.4～0.7)∶(2.5～4.0)。
所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的最佳重量比为5∶0.9∶0.6∶3。
所述的Pb(NO3)2的纯度级别为光谱纯度级别。
所述载体蛋白可以为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或卵白蛋白等。
所述用于溶解反应物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～100mM，PH为8.5～9.5。用于保存生成物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～60mM，PH为7.0～7.4。
当采用超滤方法去除未反应的低分子物质时，选用截留分子量为10000～30000dal的超滤离心管，3000～6000rpm超滤三次，每次4～8分钟。当采用透析方法去除未反应的低分子物质时，将待透析物置于截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析3天。
对采用本发明的方法制得的完全抗原进行了以下几方面的检测：
1、完全抗原中载体蛋白质氨基酸替代度检测：利用A.F.S.A.HABEEB于1966年提出的运用TNBS(详见：Analytical Biochemistry，1966，14，328～336)来检测蛋白质中自由氨基酸基团数量法来检测蛋白质在偶联前后自由氨基酸基团数量的变化，从而计算出其蛋白质氨基酸替代度。运用此法计算出上述制备的抗原中蛋白质氨基酸替代度为23.8～53.6％，此结果表明双功能鳌合剂与载体蛋白质偶联成功。
2、完全抗原中Pb离子含量测量：为了进一步确定Pb离子是否与双功能鳌合剂鳌合，接着用ICP-AES法对制备抗原中的Pb离子含量进行检测，其结果为36.48～54.02mg/L，此结果表明抗原中Pb离子与双功能鳌合剂鳌合成功。
3、完全抗原免疫原性检测：通过步骤1和2制备出的完全抗原，需要检测其是否具有免疫原性。取此抗原与等量佐剂用注射器双推法混合均匀，常规免疫小鼠，免疫4～5次后测小鼠血清效价，对血清效价较高的小鼠，取其脾脏进行细胞融合，经过后续一系列步骤制备出小鼠腹水性Pb特异性单抗，对其也进行了效价检测。用含Pb完全抗原与无Pb完全抗原(二者的载体蛋白与免疫小鼠所用抗原的载体蛋白不同)包被酶标板，用间接ELISA法检测血清、腹水的效价以及它们对Pb离子特异性，结果显示：二者效价分别为1/(4.1×105～8.2×105)和1/(2.0×105～4.1×105)，并且在对二者进行检测时，用含Pb完全抗原作为间接ELISA检测抗原时的OD值远大于无Pb完全抗原，说明原抗原具有较好的免疫原性，用此抗原免疫小鼠能制备Pb特异性抗体，可以进一步制备重金属Pb快速检测试剂盒。
本发明成功解决了重金属Pb2+完全抗原制备难题，在我国实属首创。应用本项专利免疫动物制备金属特异性单抗，进而研制重金属快速高效检测试剂盒、试剂条或者传感器，其将成为进出口检验检疫部门、食品卫生部门、水产养殖和渔业检测部门、环保部门等部门的首选检测工具，这种检测仪器的普及将改变我国食品重金属残留检测滞后、被动的窘境，充分保障我国食品的食用安全，促进食品安全体系的建立，进而能提升我国食品安全的形象和质量信誉，增加食品出口创汇，从而促进相关食品产业可持续发展，具有良好的经济价值和社会效益，市场前景十分广阔。
具体实施方式
实施例一：
称取3mg钥孔血蓝蛋白、0.4mg双功能鳌合剂CHX-A”-DTPA、0.3mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、1.4mg三乙胺于1.0ml 30mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，3000rpm离心8分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例二：
称取4mg钥孔血蓝蛋白、0.7mg双功能鳌合剂CHX-A”-DTPA、0.4mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、2.5mg三乙胺于1.5ml 50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡12小时，取出抗原至6ml的截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例三：
称取5mg钥孔血蓝蛋白、0.9mg双功能鳌合剂CHX-A”-DTPA、0.6mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、3mg三乙胺于1.5ml 50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡10小时，取出抗原至6ml的截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例四：
称取8mg钥孔血蓝蛋白、1.2mg双功能鳌合剂CHX-A”-DTPA、0.7mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、4.0mg三乙胺于2.0ml 50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡8小时，取出抗原至6ml的截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例五：
称取10mg钥孔血蓝蛋白、1.8mg双功能鳌合剂CHX-A”-DTPA、0.8mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、4.5mg三乙胺于3ml 100mM HEPES缓冲溶液(PH9.5)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.0的30mM HEPES缓冲液稀释至5ml，6000rpm离心4分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例六：
称取3mg牛血清白蛋白、0.4mg双功能鳌合剂1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、0.3mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、1.4mg三乙胺于1.0ml 30mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，6000rpm离心4分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例七：
称取4mg牛血清白蛋白、0.7mg双功能鳌合剂1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、0.4mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及2.5mg三乙胺于1.5ml 50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡10小时，取出抗原至6ml截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例八：
称取5mg牛血清白蛋白、0.9mg双功能鳌合剂1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、0.6mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及3mg三乙胺于1.5ml50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡10小时，取出抗原至6ml截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例九：
称取8mg牛血清白蛋白、1.2mg双功能鳌合剂1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、0.7mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及4.0mg三乙胺于1.5ml 50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，15℃振荡12小时，取出抗原至6ml截留分子量为30000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例十：
称取10mg牛血清白蛋白、1.8mg双功能鳌合剂1B4M-DTPA(p-SCN-C6H5-DTPA)、0.8mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、4.5mg三乙胺于3ml 100mM HEPES缓冲溶液(PH9.5)中溶解，30℃振荡8小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.4的30mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例十一：
称取3mg卵白蛋白、0.4mg双功能鳌合剂1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)、0.3mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、1.4mg三乙胺于1.0ml 30mMHEPES缓冲溶液(PH8.5)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.4的50mM HEPES缓冲液稀释至5ml，4000rpm离心5分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
实施例十二：
称取4mg卵白蛋白、0.7mg双功能鳌合剂1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)、0.4mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及2.5mg三乙胺于1.5ml50mM HEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡12小时，取出抗原置于截留分子量为14000dal的透析袋中，于50mM HEPES缓冲液(PH7.4)中透析3天；再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得成品。
实施例十三：
称取5mg卵白蛋白、0.9mg双功能鳌合剂1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)、0.6mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及3mg三乙胺于1.5ml 50mMHEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原置于截留分子量为8000dal的透析袋中，于50mM HEPES缓冲液(PH7.4)中透析3天；再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得成品。
实施例十四：
称取8mg卵白蛋白、1.2mg双功能鳌合剂1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)、0.7mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2及4.0mg三乙胺于2.0ml 50mMHEPES缓冲溶液(PH9.0)中溶解，25℃振荡10小时，取出抗原置于截留分子量为14000dal的透析袋中，于60mM HEPES缓冲液(PH7.4)中透析3天；再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得成品。
实施例十五：
称取10mg卵白蛋白、1.8mg双功能鳌合剂1B4M-EDTA(p-SCN-C6H5-EDTA)、0.8mg光谱纯度级别的Pb(NO3)2、4.5mg三乙胺于3ml 60mMHEPES缓冲溶液(PH8.5)中溶解，15℃振荡24小时，取出抗原至6ml的截留分子量为10000dal超滤管中，用PH7.0的30mM HEPES缓冲液稀释至5ml，6000rpm离心4分钟，再重复两次，再将此HEPES缓冲液稀释到3ml，然后进行分装，得Pb2+完全抗原。
Claims (10)
1、一种重金属Pb2+完全抗原的制备方法，其特征在于：取3.0～10.0mg重量份载体蛋白、0.4～1.8mg重量份双功能鳌合剂、0.3～0.8mg重量份Pb(NO3)2及1.4～4.5mg重量份三乙胺，于1～3ml体积份的HEPES缓冲溶液中溶解，15～30℃温度下振荡8～24小时后，用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，剩余物于HEPES缓冲溶液中保存，分装，得成品。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述双功能鳌合剂为二乙烯三胺五乙酸或者乙二胺四乙酸的硫氰基衍生物。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的重量比为(4～8)∶(0.7～1.2)∶(0.4～0.7)∶(2.5～4.0)。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白、双功能鳌合剂、Pb(NO3)2及三乙胺的重量比为5∶0.9∶0.6∶3。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的Pb(NO3)2的纯度级别为光谱纯度级别。
6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或卵白蛋白。
7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述用于溶解反应物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～100mM，PH为8.5～9.5。
8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述用于保存生成物的HEPES缓冲溶液的浓度为30～60mM，PH为7.0～7.4。
9、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：采用超滤方法去除未反应的低分子物质时，选用截留分子量为10000～30000dal的超滤离心管，3000rpm～6000rpm超滤三次，每次4～8分钟。
10、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：采用透析方法去除未反应的低分子物质时，将待透析物置于截留分子量为8000～14000dal的透析袋中，透析3天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |