CN104048953A - 一种痕量内毒素的快速检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种痕量内毒素的快速检测方法，可直接灵敏高通量地检测多种样品中痕量内毒素，并提供相应的试剂盒，该试剂盒人工抗体的96孔酶标板、内毒素标准品溶液、兔抗内毒素多克隆抗体(一抗)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(二抗)和化学发光试剂组成。该方法将集特异性样品预处理和ELISA检测于一体，人工抗体耐高温、酸碱和有机溶剂，可高效特异性分离和富集样品中的痕量内毒素，ELISA则可特异快速地检测所富集的内毒素，结合高灵敏度的化学发光法，有效提高ELISA检测内毒素的灵敏度、准确性和稳定性，从而能灵敏、快速、高通量地检测各种样品中痕量内毒素。

Description

一种痕量内毒素的快速检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子印迹和免疫分析领域，具体涉及一种可特异性吸附内毒素的分子印迹人工抗体(MIP)的制备，以及该MIP与ELISA方法联合使用，建立一种集特异性样品预处理和ELISA检测于一体，直接灵敏高通量地检测多种样品中痕量内毒素的新型酶联免疫分析方法：MIP-ELISA法。并提供相应的试剂盒。

技术背景

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分，位于细胞壁的最外层，在细菌死亡菌体裂解或者人工破坏细菌结构的情况下则会释放出来。人体对内毒素极为敏感，极微量(1-5ng/kg体重)的内毒素即可使机体体温升高，产生内毒素休克，播散性血管内凝血等症状，严重威胁人群健康。由于内毒素广泛存在空气、土壤和水等与人类生活密切相关的环境中，因此，监测生物和环境中的内毒素含量对保障人类健康具有重要意义。

目前，检测内毒素的方法主要有鲎试验法和酶联免疫法等。鲎试验法具有快速、简便、灵敏度高和易推广等优点，是目前检测内毒素的金标准。但该方法仍然有以下两个主要缺点：(1)鲎试验法的检测结果易受样品本身的颜色及浊度影响；(2)制备鲎试剂需要捕杀大量的受保护动物鲎。基于此，人们开始研究鲎试验法的替代方法。酶联免疫法(ELISA)应用较为广泛，由于抗体的特异性和酶的放大作用，ELISA具有特异性高、准确性高、操作简便快速和高通量等优点，但是其灵敏度(100ng/mL)较鲎试验法(0.01-1ng/mL)低，可以直接检测含高浓度内毒素(如发热病人血清)的样本，但对于环境中的低浓度内毒素，往往需要进行样品预处理后才能检测。这一缺点限制了ELISA在环境样品检测中的应用。

针对ELISA需要进行样品预处理以提高检测灵敏度较的需要，如果能将特异性样品预处理和ELISA检测结合于一体，不仅可以提高ELISA检测的灵敏度，也因为样品预处理去除了干扰物质，可同时提高ELLISA检测的稳定性和准确性。天然抗体对温度、有机溶剂耐受性差，保存和反应条件严苛，无法用于样品预处理。分子印迹技术是20世纪90年代兴起的新型功能材料制备技术，所制备的人工抗体(又称分子印迹聚合物，MIP)可特异性识别和结合靶分子，并能耐受高温高压和强酸强碱等特点，已经广泛用于固相萃取、亲和层析等样品预处理和分析技术中。将MIP与ELISA技术结合，有望建立集特异性样品预处理和ELISA检测于一体的新型检测方法。

Piletsky等使用3-氨基苯硼酸，3-噻吩硼酸和苯胺作为功能单体，在聚苯乙烯微板表面成功制备了肾上腺素、莠去津和蛋白质的MIP。结果表明，所合成的MIP对模板分子具有特异性识别和吸附的能力，同时还具有高稳定性及重复性，有望代替天然抗体(Piletsky，SA，Piletska，EV，Bossi，A，et al，Substitution of Antibodies And Receptors with Molecularly Imprinted Polymers inEnzyme-linked And Fluorescent Assays.Biosens.Bioelectron.2001，16(9)：701-707.)。Takeuchi等在96孔酶标板内制备了以金鸡纳啶为模板，2-硫代乙基甲基丙烯酸酯为功能单体的MIP，可利用金鸡纳啶与MIP结合后荧光的改变，快速测定样品中金鸡纳啶浓度(Takeuchi T，Seko A，Matsui J，et al，Molecularly Imprinted Polymer Library on a Microtiter Plate.High-ThroughputSynthesis And Assessment of Cinchona Alkaloid-Imprinted Polymers.InstrumSci.Technol.2001，29(1)：1-9.)。Ogawa等以丙烯酰赖氨酸和丙烯酰苯基丙氨酸作为功能单体，脂质A作为模板分子，在96孔酶标板内制备了一种水凝胶MIP，对内毒素具有良好的特异性识别和吸附能力，有望应用于清除水或者蛋白质产品中的内毒素(Ogawa KI，Hyuga M，Okada T，et al，Development of LipidA-Imprinted Polymer Hydrogels That Selectively Recognize Lipopolysaccharides.Biosens.Bioelectron.2012，38：215-219.)。Takahashi等发现先将多粘菌素B、聚L-组氨酸或者聚L-赖氨酸包被于聚苯乙烯微板表面，能吸附内毒素并可用酶联免疫法检测所吸附的内毒素，其中使用聚L-赖氨酸包被之后的吸附效率最高。但是该方法易受pH影响，仅在pH6.5～8.0之间时有较高的吸附效能，且只能吸附较高浓度(大于100ng/mL)的内毒素(Takahashi K，Fukada M，Kawai M，et al，Detection of Lipopolysaccharide(LPS)And Identification of ItsSerotype by An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)UsingPoly-L-lysine.J.Immunol.Methods.1992，153(1)：67-71.)。ELISA方法也易受样品颜色、离子、pH等的影响。环境样品成分复杂，含多种可干扰非特异性结合的因素(如金属离子、pH变化大)，而且内毒素含量低，需要进行样品预处理后才能使用ELISA方法进行检测。

为准确测定复杂环境样品中的痕量内毒素，需要灵敏度高，特异性好的方法。将MIP与ELISA方法联合使用，即可利用MIP的特异性吸附能力，特异高效快速分离和富集样品中痕量的内毒素，去除主要的干扰物，显著提高ELISA检测的灵敏度和准确性。目前尚无集样品预处理和ELISA检测于一体的方法报道，因此集特异性样品预处理和ELISA检测于一体的MIP-ELISA快速检测方法，不仅可用于快速准确检测内毒素，也有望用于其它污染物的快速检测上，在医学、生物学和环境等领域将有较大的应用价值。

发明内容

本发明的任务是提供一种痕量内毒素的快速检测方法(MIP-ELISA法)，该方法集特异性样品预处理和ELISA检测内毒素于一体，在保证ELISA检测特异性的同时，提高了ELISA检测的灵敏度和稳定性，具有灵敏、快速、高通量等特点，从而实现对生物和环境等复杂样品中痕量内毒素的准确定量。

本发明的另一个任务是提供痕量内毒素的快速检测试剂盒。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的一种痕量内毒素的快速检测方法(MIP-ELISA法)，包括以下步骤：

步骤一、合成人工抗体：内毒素与多巴胺按质量浓度比为1∶2-8的比例混合溶于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液中，将混合溶液加于96孔酶标板孔内，在室温下暴露于空气中反应24-72小时；使用含3％乙酸和0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液反复震荡洗涤酶标板2-8次，每次20-60min，再使用三蒸水震荡洗涤2-8次，即可得到附着于酶标板表面的MIP；

步骤二、检测样品(试剂盒检测)，包括以下步骤a至d：

步骤a：向上述含有MIP的酶标板孔内加入100μL待测样品，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液(组分为氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，0.005％吐温20100μL，三蒸水定容至1000mL，pH＝7.4)洗涤2-8次；

步骤b：将兔抗内毒素多克隆抗体用抗体稀释液以1∶100～1∶2000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次；

步骤c：将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体用抗体稀释液以1∶500～1∶5000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次；

步骤d：每孔加入化学发光试剂200μL，立即使用多功能酶标仪检测发光强度，其中化学发光试剂由摩尔浓度为5×10^-4mol/L的鲁米诺(Luminol)，4×10^-3mol/L的过氧化氢(H₂O₂)及4×10^-4mol/L的对碘苯酚(PIP)组成。

本发明提供的痕量内毒素的快速检测试剂盒，由含人工抗体的96孔酶标板、内毒素标准品溶液、兔抗内毒素多克隆抗体(一抗)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(二抗)和化学发光试剂组成，所述的化学发光试剂由5×10^-4mol/L的鲁米诺(Luminol)、4×10-3mol/L的过氧化氢(H2O2)及4×10^-4mol/L的对碘苯酚(PIP)组成。

本发明提供的痕量内毒素的快速检测试剂盒的使用方法如下：

步骤一：向含有MIP的酶标板孔内加入100μL待测样品，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液(组分为氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，0.005％吐温20100μL，三蒸水定容至1000mL，pH＝7.4)洗涤2-8次。

步骤二：将兔抗内毒素多克隆抗体用抗体稀释液以1∶100～1∶2000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次。

步骤三：将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体用抗体稀释液以1∶500～1∶5000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次。

步骤四：每孔加入化学发光试剂200μL，立即使用多功能酶标仪检测发光强度，其中化学发光试剂由摩尔浓度为5×10^-4mol/L的鲁米诺(Luminol)，4×10^-3mol/L的过氧化氢(H2O2)及4×10^-4mol/L的对碘苯酚(PIP)组成。

本发明所建立的MIP-ELISA法，其中MIP是一种分子印迹聚合物，具有与内毒素大小和形状相匹配的立体空腔，并具有特定的非共价结合键，能在室温下特异性地结合内毒素，因而可快速且有效地分离和吸附内毒素，有效去除样品中的其它杂质和复杂样品基质对检测结果的干扰。同时耐受酸、碱、有机溶剂和温度，非常适合用于样品预处理；此外，MIP所结合的内毒素还能与天然抗体结合。利用MIP的仿生识别能力，建立MIP-ELISA法，一方面可利用包被抗体MIP的特异性吸附能力和高耐受性，选择性分离富集样品中痕量内毒素后，再使用ELISA方法测定所富集的内毒素。集选择性样品预处理和灵敏快速的ELISA于一体，复杂样品无需经过其他预处理即可直接进行检测，结合高灵敏度的化学发光方法，提高了检测灵敏度，特别适合用于复杂样品中痕量内毒素的快速检测。

本发明提供的MIP-ELISA法集特异性样品预处理和ELISA检测于一体，可直接灵敏高通量地检测多种样品中痕量内毒素。本发明以MIP为包被抗体，特异性分离和富集痕量内毒素后，然后加入一抗(兔抗内毒素多克隆抗体)与富集的内毒素形成抗原-抗体结合物，最后加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)，增强的化学发光法(ECL)直接检测包括自来水、江水和医院污水等各种样品中痕量内毒素含量。

众所周知，ELISA具有检测快速，高通量等特点，但是因为显色法ELISA灵敏度(100ng/mL)和化学发光法ELISA灵敏度(50ng/mL)较低而限制了其在痕量内毒素检测方面的应用。本发明所建立的MIP-ELISA方法，一方面利用MIP的特异性样品预处理能力，分离和富集了样品中的痕量内毒素，同时采用高灵敏度的发光法进行检测，有效提高了检测的灵敏度。本方法在直接上样100μL进行检测的情况下，其灵敏度比利用多克隆抗体的ELISA高了5～10倍，达到了10ng/mL。此外，经MIP样品预处理的样品，一方面有效去除了干扰物，另一方面通过浓缩样品，进一步提高ELISA检测的灵敏度、准确性和重现性。MIP-ELISA集特异性样品预处理与ELISA检测于一体，可用于生物和环境中痕量内毒素的准确监测。相似的方法也可用于其他痕量污染物的快速检测上。

本发明对MIP-ELISA法及相应试剂盒的检测灵敏度、特异性和稳定性进行了分析：

灵敏度分析：利用本发明MIP-ELISA法对系列浓度梯度的内毒素标准品进行检测，分析本发明方法对内毒素检测的线性范围及检测灵敏度，并与标准方法鲎试剂法、间接竞争性ELISA(icELISA)法进行比较

特异性分析：利用本发明MIP-ELISA法检测不同浓度的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌裂解液中的内毒素含量，判断本方法对不同细菌所产内毒素的检测特异性和准确性，并与标准方法鲎试剂法、icELISA法进行比较。其特征在于，所述的革兰氏阴性菌是大肠杆菌、明亮发光杆菌、绿脓杆菌，革兰氏阳性菌是金黄色葡萄球菌。

稳定性分析：测定本发明MIP-ELISA法对内毒素加标的江水样品检测的日间偏差(连续测定6天)和日内偏差(1天内测6次)，以样品的加标回收率和日内及日间精密度来分析MIP-ELISA的稳定性。测定试剂盒批次间偏差(6批次)，以批次间精密度来分析以MIP-ELISA法为基础所建立的试剂盒的稳定性。

附图说明

图1a在96孔酶标板的孔内(B1～F12)合成的MIP。图1b未经任何处理的96孔酶标板。从图1a可以看出MIP在孔内呈黑色膜状。

图2a MIP-ELISA法测定内毒素的标准曲线。纵坐标为不同内毒素浓度下所产生的发光强度；横坐标为标准品内毒素浓度。随着的内毒素浓度增加，其发光强度增强，发光强度与所加内毒素浓度成正比，变化值与内毒素浓度在10ng/mL～10⁵ng/mL范围内存线性关系，表明MIP-ELISA的检测灵敏度为10ng/mL。

图2b icELISA法测定内毒素的标准曲线。纵坐标为不同内毒素浓度下所产生的发光强度；横坐标为标准品内毒素浓度。随着的内毒素浓度增加，其发光强度增强，发光强度与所加内毒素浓度成正比，变化值与内毒素浓度在50ng/mL～10⁵ng/mL范围内存线性关系，表明icELISA的检测灵敏度为50ng/mL。

图3MIP-ELISA、icELISA与标准鲎试剂法对四种细菌样品的检测结果比较图。从图中可以看出，本发明MIP-ELISA法、鲎试剂法、icELISA法均可准确测量革兰氏阴性菌所产生的内毒素，而不产生内毒素的革兰氏阳性菌则无法测到内毒素。三种方法测定的内毒素含量结果无显著性差异(p＞0.05)。

图4MIP-ELISA、icELISA与标准鲎试剂法对三种实际水样的检测结果比较图。从图中可以看出，本发明MIP-ELISA法可以检测出自来水和江水中内毒素的含量，检测结果与鲎试剂法相当(p＞0.05，测定结果无显著性差异)，而icELISA法无法检测出，说明本发明方法的灵敏度高于icELISA法。

图5为本发明痕量内毒素快速检测方法的流程图。

具体实施方式

实施例1：MIP-ELISA法的灵敏度分析

将系列浓度梯度的内毒素标准品(10，50，100，1000，10000，100000ng/mL)分别加入到含人工抗体的酶标板孔内，每孔100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次。然后每孔加入100μL兔抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体(用抗体稀释液以1∶100～1∶2000进行稀释)，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次。每孔再加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(用抗体稀释液以1∶500～1∶5000进行稀释)，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次。最后每孔加入增强发光工作液200μL(摩尔浓度为5*10^-4mol/L的Luminol，4*10^-3mol/L的H₂O₂及4*10^-4mol/L的PIP)，立即使用多功能酶标仪检测发光强度。

从图2a可以看出，MIP-ELISA法随着的内毒素浓度增加，发光强度增大，发光强度与所加内毒素浓度成正比，在10ng/mL～10⁵ng/mL范围内，内毒素浓度与发光强度存在线性关系，最低内毒素检出浓度为10ng/mL。说明MIP-ELISA的检测灵敏度为10ng/mL。从图2b可以看出，icELISA法发光强度与所加内毒素浓度成正比，在50ng/mL～10⁵ng/mL范围内，内毒素浓度与发光强度存在线性关系，最低内毒素检出浓度为50ng/mL，说明icELISA的检测灵敏度为50ng/mL。由此可以得出，MIP-ELISA法的灵敏度高于icELISA法，可以方便地用于低浓度内毒素的检测。

实施例2：MIP-ELISA法的特异性分析

利用MIP-ELISA方法测定各种细菌所产生的内毒素含量，并与标准方法鲎试剂法、icELISA法进行比较。培养3种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、明亮发光杆菌、绿脓杆菌)，以及1种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。将4种细菌菌液(均为10⁵cfu/mL)在沸水中煮2.5h灭活，使细菌中的内毒素失活释放出来。按实施例1所建立的MIP-ELISA法测定各种细菌裂解液中的内毒素含量，革兰氏阴性菌——大肠杆菌、明亮发光杆菌和绿脓杆菌中的内毒素浓度分别为99.15±2.79ng/mL，112.63±3.68ng/mL，113.74±3.58ng/mL，革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌的检测结果为阴性。同时使用标准鲎试剂法(定量鲎试剂，厦门市鲎试剂实验厂有限公司)和icELISA法，检测同样的样本。鲎试剂法测定这4种细菌中的内毒素浓度分别为110.1±8.41ng/mL，111.8±7.65ng/mL，112.2±3.6ng/mL和阴性结果；icELISA法测定这4种细菌中的内毒素浓度分别为104.2±6.58ng/mL，115.1±4.97ng/mL，116.8±7.36ng/mL和阴性结果。三种方法测定的内毒素含量结果接近(p＞0.05，测定结果无显著性差异，图3)，显示MIP-ELISA可以准确检测革兰氏阴性菌产生的内毒素，但对不同的内毒素无鉴别能力。

实施例3：MIP-ELISA法及相应试剂盒的稳定性分析

(1)方法稳定性。将所采集的江水(武汉长江)静置于容器内，使其自然沉降24h以去除大颗粒及悬浮物，将不同浓度的内毒素标准品(10，50，100ng/mL)分别加入到沉降后的江水样品中，按实施例1所建立的MIP-ELISA法测定未加标和加标的江水样品中内毒素含量，其中内毒素的加标回收率在83.6％～101.7％，日内偏差为2.1～4.0％，日间偏差为1.6～4.6％，均小于5％(n＝6)。同时使用icELISA检测同样的样本，其中内毒素的加标回收率在79.3％～92.5％，日内偏差为4.2～7.1％，日间偏差为3.9～8.6％(n＝6)。说明MIP-ELISA具有较好的稳定性，而单纯利用天然抗体的icELISA检测稳定性较差。

(2)试剂盒批次间稳定性。制备不同批次的试剂盒，按实施例1所建立的MIP-ELISA法检测系列浓度的内毒素标准品(10，50，100，1000，10000，100000ng/mL)，建立标准工作曲线，其中各批次试剂盒的批次间偏差为2.5％～3.7％(n＝6)，说明本试剂盒具有较好的稳定性，能满足批量检测痕量内毒素的需要。

实施例4：MIP-ELISA法测定自来水中的内毒素含量

按实施例1所建立的MIP-ELISA法测定采集的自来水样品中内毒素含量，并与标准方法鲎试剂法、icELISA法进行比较。MIP-ELISA法测定自来水中的内毒素含量为18.15±2.62ng/mL，标准鲎试剂法的检测结果为16.52±2.73ng/mL，两种方法的测定结果无显著性差异(p＞0.05)，而icELISA法无法测定自来水中的内毒素含量，说明icELISA法由于灵敏度较低，无法测定低浓度的内毒素(图4)，说明利用本方法可准确地测定自来水中的内毒素含量。

实施例5：MIP-ELISA法测定江水中的内毒素含量

将所采集的江水(武汉长江)静置于容器内，使其自然沉降24h以去除大颗粒及悬浮物，按实施例1所建立的MIP-ELISA法测定沉降后的江水中的内毒素含量，并与标准方法鲎试剂法、icELISA法进行比较。MIP-ELISA法的检测结果为52.63±2.94ng/mL，标准鲎试剂法的检测结果为48.31±3.58ng/mL，两种方法的测定结果无显著性差异(p＞0.05)，而icELISA法则无法测定江水中的内毒素含量，显示icELISA法由于灵敏度较低，无法测定低浓度的内毒素(图4)，说明利用本方法可准确地测定江水中的内毒素含量。

实施例6：MIP-ELISA法测定医院污水中的内毒素含量

将所采集的处理后的医院污水静置于敞口的容器内，使其暴露于空气24h以除去氯气，按实施例1所建立的MIP-ELISA法测定医院污水中的内毒素含量，并与标准方法鲎试剂法、icELISA法进行比较。MIP-ELISA法的检测结果为99.31±1.86ng/mL，标准鲎试剂法的检测结果为102.57±3.53ng/mL，icELISA法的检测结果为104.72±4.92ng/mL，三种方法测定的医院污水中的内毒素含量结果接近(p＞0.05，测定结果无显著性差异，图4)，说明MIP-ELISA法不仅可检测江水和自来水中低浓度的内毒素，对医院污水中高浓度的内毒素也可准确检测。而icELISA由于受检测灵敏度限制，只能检测医院污水中高浓度的内毒素，对江水和自来水中低浓度的内毒素则无法检测，因此MIP-ELISA法提高了icELISA方法的灵敏度。

Claims (4)

1.一种痕量内毒素的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、合成人工抗体：内毒素与多巴胺按质量浓度比为1∶2-8的比例混合溶于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液中，将混合溶液加于96孔酶标板孔内，在室温下暴露于空气中反应24-72小时；使用含3％乙酸和0.1％十二烷基硫酸钠的水溶液反复震荡洗涤酶标板2-8次，每次20-60min，再使用三蒸水震荡洗涤2-8次，即可得到附着于酶标板表面的MIP；

步骤二、检测样品(试剂盒检测)，包括以下步骤a至d：

a.向上述含有MIP的酶标板孔内加入100μL待测样品，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次；

b.将兔抗内毒素多克隆抗体用抗体稀释液以1∶100～1∶2000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次；

c.将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体用抗体稀释液以1∶500～1∶5000进行稀释，然后每孔加入100μL，20-40℃作用1-5h后以磷酸盐缓冲液洗涤2-8次；

d.每孔加入化学发光试剂200μL，立即使用多功能酶标仪检测发光强度，其中化学发光试剂由摩尔浓度为5×10^-4mol/L的鲁米诺(Luminol)、4×10^-3mol/L的过氧化氢(H₂O₂)及4×10^-4mol/L的对碘苯酚(PIP)组成。

2.根据权利要求1所述的痕量内毒素的快速检测方法，其特征在于，在步骤二中，a步骤中所述的磷酸盐缓冲液是按以下方法配制成的pH＝7.4的缓冲液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，0.005％吐温20100μL，三蒸水定容至1000mL。

3.一种痕量内毒素的快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒人工抗体的96孔酶标板、内毒素标准品溶液、作为一抗的兔抗内毒素多克隆抗体、作为二抗的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体和化学发光试剂组成。

4.根据权利要求3所述的痕量内毒素的快速检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光试剂由5×10^-4mol/L的鲁米诺(Luminol)、4×10^-3mol/L的过氧化氢(H₂O₂)及4×10^-4mol/L的对碘苯酚(PIP)组成。