CN114053406B - 一种多功能光热纳米杀菌材料及制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多功能光热纳米杀菌材料及制备与应用，属于抗菌材料领域。本发明的目的是制备一种能够特异性吸附内毒素的多功能光热杀菌材料。以多巴胺为功能单体，以内毒素为模板分子，采用反相微乳液法制备可选择性吸附内毒素的聚多巴胺纳米粒子M‑PDA，可在利用光热转换高效杀灭细菌的同时，有效吸附G‑细菌释放的内毒素，减少光热杀菌中内毒素造成的次生损伤。本发明首次利用反相乳液聚合方法，制备了多功能光热杀菌材料，能在近红外光照射下快速杀灭细菌，可选择性吸附内毒素的聚多巴胺纳米粒子。

Description

一种多功能光热纳米杀菌材料及制备与应用
技术领域
本发明属于抗菌材料领域，更具体地，涉及一种多功能光热纳米杀菌材料及制备与应用，尤其涉及一种利用反相乳液聚合方法，制备可选择性吸附内毒素的多功能纳米光热杀菌材料M-PDA的方法，及其在光热杀菌中的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛使用，细菌对抗生素的耐药性快速增加，有些多重耐药细菌(Multi-drug resistant,MDR)甚至对目前所有抗生素均表现出一定程度的抗性，以至于被这些细菌感染后在治疗中出现无药可用的局面(Vet Microbiol,2014,171(3-4):273-278)，为有效控制细菌感染为了应对耐药细菌的感染，开发非抗生素型抗菌剂具有重要的公共卫生学意义。
光热抗菌是一种新兴的非抗生素型抗菌新技术，其主要抗菌机制是利用光热转换剂在近红外照射下产生的局部高温破坏细菌细胞壁和胞内蛋白，导致细菌菌体发生破裂、胞内蛋白发生变性而死亡。与传统抗菌药物不同的是，光热抗菌不依赖化学药剂杀死细菌，而是通过物理方式(热能)杀灭细菌，具有抗菌效应广谱、作用迅速和不易导致细菌产生抗性等优点。
耐药细菌中革兰氏阴性菌(G-细菌)的比例一直在不断攀升(Curr OpinMicrobiol,2017,39:106-112)。相比于G+细菌，G-细菌细胞壁更薄，更易被光热杀菌剂杀灭(Colloids Surf.B,2019,173:833-841)，因此光热杀菌剂在抗G-细菌感染中往往能够取得更好的疗效(Nanomedicine,2020,32:102324.)。目前，金纳米粒子(Acs Nano,2017,11(9):9330-9339)、石墨烯纳米片(Colloids Surf.B,2020,185:110616)、CuS纳米粒子(J BiolEng,2014,8:11)、Fe3O4纳米粒子已被证实能够有效杀灭G-细菌，但是G-菌细胞壁含有内毒素(Endotoxin)，在细菌细胞壁被破坏后，内毒素可从细胞壁上脱落、释放到机体中(CurrMed Chem,2004,11(3):359-368.)。据估计，一个G-细菌死亡后约可释放0.7–1.0×105分子的内毒素(Eur J Biochem,1974,43(3):533-539.)。人体对内毒素高度敏感，即使是痕量的内毒素，也可导致人体出现发热、败血性休克、弥漫性血管内凝血和多器官衰竭等严重病理反应(Crit Care Med,1993,21(2Suppl):S19-24.)。目前所使用的光热转换剂均无法在杀死G-菌的同时吸附细菌释放的内毒素，即使将G-细菌完全杀灭，细菌释放的内毒素在人体内逸散，仍有可能对人体造成严重的损害，成为光热杀菌材料实际应用中的主要限制之一。因此，开发一种新型的光热杀菌材料，使之能够在光热杀灭G-菌的同时吸附细菌释放的内毒素，具有很好的实际应用前景。
目前，用于吸附内毒素的主要有多粘菌素B(Polymyxin B,PMB)(Int J Biol MolSci,2021,22(4):2228.)和内毒素抗体(Int J Biol Mol Sci,2021,22(4):2228.)。PMB能够有效吸附内毒素，但对肾脏和神经系统具有严重毒副作用(Int J Biol Mol Sci,2021,22(4):2228.)。内毒素抗体可以特异性结合内毒素，但抗体不但制备复杂，价格昂贵，而且对热极其敏感(Proteins,2014,82(10):2620-2630.)，因此不适宜光热抗菌疗法中内毒素的吸附清除。
分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)是一种可特异性识别并结合靶分子(即模板分子)的高分子聚合物，又被称为“人工抗体”。MIP易于制备，对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性高(Molecules,2020,25(20):4740.)，是光热抗菌治疗中吸附清除内毒素的理想材料。
发明内容
本发明解决了现有技术中吸附内毒素的制剂具有毒副作用，且不能同时实现杀灭细菌的缺点。本发明的目的是制备一种能够特异性吸附内毒素的多功能光热杀菌材料。以多巴胺为功能单体，以内毒素为模板分子，采用反相微乳液法制备可选择性吸附内毒素的聚多巴胺纳米粒子M-PDA，可在利用光热转换高效杀灭细菌的同时，有效吸附G-细菌释放的内毒素，减少光热杀菌中内毒素造成的次生损伤。
根据本发明第一方面，提供了一种光热纳米杀菌材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)向环己烷中加入内毒素、表面活性剂和氨水，进行超声分散，得到油包水乳液；所述内毒素的亲水端朝向油包水结构的水相，内毒素的疏水端朝向油包水结构的油相；
(2)向步骤(1)得到的乳液中加入多巴胺，所述多巴胺进入油包水结构的水相，并在水相中形成聚多巴胺；
(3)依次用乙醇和水溶液洗去油包水结构的表面活性剂和内毒素，得到具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子。
优选地，所述多巴胺的质量比上内毒素的质量为(2.5-10)：0.4。
优选地，所述乙醇为无水乙醇，所述水溶液为乙酸水溶液。
根据本发明另一方面，提供了任一所述方法制备得到的光热纳米杀菌材料，所述光热纳米杀菌材料为球形结构的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子。
优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为60nm-80nm。
根据本发明另一方面，提供了任一所述的光热纳米杀菌材料的应用，用于制备杀菌试剂。
优选地，所述杀菌试剂为杀灭革兰氏阴性细菌的试剂。
优选地，所述光热纳米杀菌材料杀灭革兰氏阴性细菌后，吸附革兰氏阴性细菌死亡裂解后释放的内毒素。
优选地，所述杀菌试剂中光热纳米杀菌材料的浓度小于800μg/mL，则无明显溶血效应。
优选地，所述杀菌试剂中光热纳米杀菌材料的浓度小于等于200μg/mL，则无明显细胞毒性。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)多巴胺(Dopamine，DA)是体内的一种神经递质，富含酚羟基和胺基，可与内毒素亲水端的糖基形成氢键，且DA聚合而成的聚多巴胺(Polydopamine,PDA)具有良好的光热转换效应。本发明以DA为功能单体，以内毒素为模板分子，制备一种既具有光热转换效应，又能特异性吸附内毒素的分子印迹聚多巴胺(Molecularly imprinted polydopamine，M-PDA)，实现光热灭活G-菌的同时吸附细菌释放的内毒素，从而有效降低杀灭G-菌后，细菌释放的内毒素所造成的危害。控制M-PDA的粒径在纳米级别，可以提高吸附容量，减少吸附时间。
(2)利用内毒素具有亲水端和疏水端的结构特征，且多巴胺易于与内毒素亲水端糖基形成氢键的特点，利用油包水的反相乳液聚合法，聚合时，内毒素会自发有序地排列在油水界面处，印迹位点更多的分布于聚合物表面，使得M-PDA具有吸附容量大、吸附速率快等优点。
(3)本发明制备得到的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子M-PDA可选择性结合内毒素，对内毒素理论最大吸附量为41.99μg/mg，是对照组没有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子N-PDA(13.82μg/mg)的3.03倍。
(4)本发明制备得到的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子M-PDA具有光热杀菌效应：可以在近红外光照下产热，M-PDA经过9min近红外照射(NIR)后，可完全杀灭多种细菌，而在无NIR照射时对细菌无明显杀灭作用。
(5)本发明制备得到的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子M-PDA可有效吸附G-细菌死亡裂解后释放的内毒素，经近红外照射杀灭细菌后，M-PDA组上清游离的内毒素水平显著低于对照组(N-PDA)，显示M-PDA纳米粒子具有特异性吸附内毒素的功能。
(6)本发明制备得到的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子M-PDA对红细胞无显著的溶血性能，有良好的生物兼容性；M-PDA对L02人胚肝细胞具有较低的毒性，即纳米粒子有较高的生物安全性。
(7)现有的光热转换剂只能杀灭细菌，却无法有效吸附细菌死亡后释放的有害物质。本发明制备的多功能光热杀菌材料M-PDA不但具有显著的光热转换效应，在近红外光照射下快速将细菌灭活，而且还能水性环境下有效吸附细菌死亡后释放的内毒素，避免内毒素在人体内扩散对人体造成损害。此外，M-PDA具有良好的生物相容性和生物安全性，毒性低。
(8)本发明所构建的M-PDA纳米粒子制备方法简单易行，无需复杂的合成步骤，适宜运用到大规模产业化生产。
附图说明
图1为本发明制备M-PDA纳米粒子流程图。
图2中的A为制备M-PDA时优化的DA用量；图2中的B为优化内毒素ET用量。
图3中的A为M-PDA透射电镜图(标尺＝500nm)；图3中的B为非印迹对照N-PDA透射电镜图(标尺＝500nm)。
图4为M-PDA和N-PDA红外表征图。
图5中的A为M-PDA和N-PDA静态吸附曲线；图5中的B为静态吸附曲线Scatchard模型拟合结果。
图6为M-PDA和N-PDA动态吸附曲线。
图7中的A为不同浓度M-PDA在2.5W/cm2 NIR照射下温度变化曲线；图7中的B为200μg/mL的M-PDA在不同功率NIR照射下温度变化曲线；图7中的C为不同浓度的M-PDA在2.5W/cm2 NIR照射下的浓度-温度曲线；图7中的D为200μg/mL的M-PDA在不同功率的NIR照射下的功率-温度曲线。
图8中的A为不同浓度M-PDA和N-PDA在2.5W/cm2 NIR照射下升温效果对比；图8中的B为200μg/mL的M-PDA和N-PDA在不同功率NIR照射下升温效果对比。
图9中的A为M-PDA温度变化曲线；图9中的B为M-PDA温度变化曲线函数拟合结果；图9中的C为N-PDA温度变化曲线；图9中的D为N-PDA温度变化曲线函数拟合结果。
图10中的A为M-PDA和N-PDA经NIR照射不同时间后，大肠杆菌生长情况；图10中的B为M-PDA和N-PDA经NIR照射不同时间后，铜绿假单胞菌生长情况；图10中的C为大肠杆菌存活率随时间变化曲线；图10中的D为铜绿假单胞菌存活率随时间变化曲线。
图11中的A为大肠杆菌光热灭活后，M-PDA和N-PDA组上清中内毒素含量；图11中的B为铜绿假单胞菌光热灭活后，各组上清中内毒素含量；图11中的C为各组对大肠杆菌内毒素吸附效率；图11中的D为各组对铜绿假单胞菌内毒素吸附效率。
图12为M-PDA和N-PDA血液相容性评价结果。
图13为M-PDA和N-PDA细胞毒性评价结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了解决传统光热转换剂只能杀菌，但无法清除细菌释放内毒素的缺点，本发明以多巴胺为功能单体，以内毒素为模板，采用油包水反相微乳液法，制备一种多功能纳米光热杀菌材料M-PDA。该材料不但具有光热转换效应，还具有内毒素特异性吸附功能，在有效灭活细菌(如G-菌)的同时，能够特异性吸附细菌死亡后释放的内毒素，避免内毒素在人体中扩散对人体造成损害。以下通过具体的实施示例对本发明进行详细的说明。
本发明多功能光热纳米杀菌材料M-PDA利用反相乳液聚合方法，制备了可选择性吸附内毒素的多功能纳米光热杀菌材料M-PDA，包括以下步骤：
步骤一：在环己烷中加入内毒素(ET)、表面活性剂和氨水，磁力搅拌均匀后超声分散10min；选用环己烷是为了形成稳定的油包水乳液体系；
步骤二：加入多巴胺溶液，继续超声分散10min使之形成微乳液；将上述微乳液在室温下磁力搅拌24h后，破乳，离心收集沉淀；
步骤三：分别用无水乙醇和3％的乙酸水溶液清洗沉淀，最后用不含内毒素的除热源纯水再清洗3遍，即可获得可特异性结合内毒素的新型多功能光热杀菌材料——聚多巴胺纳米粒子(M-PDA)。
对照组N-PDA粒子，除不加内毒素外，其他条件与M-PDA完全相同。
实施例1：制备可特异性吸附内毒素的多功能纳米光热杀菌材料M-PDA
图1为本发明制备M-PDA纳米粒子流程图。制备步骤如下：
步骤一：在环己烷中加入内毒素(ET)、表面活性剂和氨水，磁力搅拌均匀后超声分散10min；
步骤二：加入多巴胺溶液，继续超声分散10min使之形成微乳液；将上述微乳液在室温下磁力搅拌24h后，破乳，离心收集沉淀。
步骤三：分别用无水乙醇和3％的乙酸水溶液清洗沉淀，最后用不含内毒素的除热源纯水再清洗3遍，即可获得可特异性结合内毒素的聚多巴胺纳米粒子(M-PDA)
作为对照，非印迹的聚多巴胺纳米粒子(N-PDA)的制备方法除不加内毒素外，其他条件与M-PDA完全相同。
实施例2：反应条件的优化
首先，固定内毒素用量，调整多巴胺DA浓度，制备系列M-PDA和N-PDA，对比各M-PDA和N-PDA对250ng/mL内毒素的吸附效果，确定最佳的DA浓度。随后，保持DA最佳浓度，调整内毒素用量，制备系列M-PDA和N-PDA，并评价它们对内毒素的吸附效果。
由图2中的A可知，当DA加入量在2.5-10mg之间时，随着DA用量的增加，M-PDA对内毒素吸附量和印迹因子也随之增加。当DA用量为10mg时，M-PDA对内毒素吸附量和印迹因子均达到最大值，继续增加DA用量时吸附量和相应的印迹因子反而呈现下降趋势，原因可能是DA过多时，PDA纳米粒子粒径变大，内毒素亲水端包埋过深，在洗脱模板时难以将内毒素完全去除，无法形成有效的印迹空穴。由图2中的B可知，随着内毒素ET用量的增加，M-PDA对内毒素的吸附量和印迹因子也随之增加，但是当ET达到4mg时，继续增加内毒素用量，M-PDA吸附容量和印迹因子再无明显改变，为此，以DA＝10mg，内毒素＝0.4mg为最佳功能单体和模板用量。
实施例3：M-PDA和N-PDA表征
由图3中的A和图3中的B可见，透射电镜显示实施例1中制备的M-PDA和N-PDA纳米粒子形貌均为球形结构，粒径大小较为均一，均为75nm左右，说明DA在反相微乳液体系中发生了聚合，成功制备聚多巴胺纳米粒子。
由图4可见，FT-IR光谱分析显示实施例1中制备的M-PDA和N-PDA纳米粒子均在3410cm-1、2929cm-1、1605cm-1、1510cm-1和1295cm-1处出现明显的特征吸收峰，分别对应酚羟基、-CH2-、苯环、胺基和酚C-O等基团。说明DA在微乳液液滴内成功发生了聚合，生成了聚多巴胺纳米粒子。
表1为M-PDA和N-PDA动态光散射和表面电位分析结果。由表1可见，动态光散射法显示实施例1中制备的M-PDA和N-PDA纳米粒子流体动力学直径较为接近，分别为79.4±17.0和74.8±15.1nm。它们在PBS中的分散指数分别为0.335和0.356，均小于0.5，表明M-PDA和N-PDA具有良好的分散性。M-PDA和N-PDA纳米粒子的表面电位分别为-19.4±4.1mV和-17.2±3.2mV。说明通过反相微乳液法成功制备了聚多巴胺纳米粒子。
表1
Figure BDA0003369937320000091
实施例4：M-PDA和N-PDA静态吸附特点
将FITC标记的内毒素(FITC-ET)溶液和M-PDA或N-PDA纳米粒子分散液按1:1(V/V)的比例混合，室温避光震荡吸附3h后，离心，吸出上清用荧光分光光度计测定上清中FITC-ET的含量。如图5中的A所示，随着FITC-ET浓度的增加，M-PDA和N-PDA对FITC-ET吸附量均呈现增加趋势，两者吸附量在800ng/mL时趋向饱和，但在相同浓度下，M-PDA吸附量明显较N-PDA高，表明M-PDA上存在的印迹位点能够实现对ET的特异性吸附。
用Scatchard模型对静态吸附进行拟合，图5中的B为拟合结果。根据Scatchard曲线拟合结果计算M-PDA和N-PDA理论最大吸附量(Qmax)和吸附-解离常数(Kd)，M-PDA对ET理论最大吸附量为41.99μg/mg，是N-PDA(13.82μg/mg)的3.03倍，而M-PDA吸附-解离常数为441.89μg/L，显著低于N-PDA(735.29μg/L)，显示M-PDA纳米粒子对内毒素有更高的亲和力。
实施例5：M-PDA和N-PDA的吸附动力学特点
将FITC-ET溶液与M-PDA或N-PDA纳米粒子分散液按1:1(V/V)的比例混合，室温避光震荡吸附0，30，60，90，120，150min，吸附完成后离心，吸出上清用荧光分光光度计测定上清中FITC-ET的含量，并计算M-PDA和N-PDA纳米粒子对ET的吸附量。结果如图6所示，在0-60min内，M-PDA和N-PDA对ET吸附量随吸附时间的延长快速增加，而60min后M-PDA吸附基本达到平衡，而N-PDA达到平衡则最少须要90min。此外，通过图6可以明显看出，在每个时间点M-PDA吸附量显著高于N-PDA，再次证明M-PDA对ET具有特异性吸附能力。
实施例6：M-PDA和N-PDA光热特征
本研究采用2.5W/cm2的NIR照射0-200μg/mL的M-PDA纳米粒子，每隔20s记录一次体系温度。结果由图7中的A所示，当M-PDA浓度为0μg/mL(即纯水)时，使用NIR照射600s体系温度仅增加3.2℃。而当体系中有M-PDA纳米粒子存在时，体系温度随着照射时间的延长快速增加，且M-PDA浓度越大体系温度增加越快，如图7中的C所示，600s内，200μg/mL的M-PDA可使体系温度增加37.0℃，表明M-PDA光热转换具有浓度依赖效应。为了进一步说明M-PDA的光热效果，本研究采用不同功率密度的NIR照射200μg/mL的M-PDA纳米粒子，每隔20s记录一次体系温度。结果由图7中的B所示，采用NIR照射M-PDA纳米粒子时，体系温度快速增加，如图7中的D所示，随着照射功率的增大，体系温度增加越快，表明M-PDA光热转换具有功率依赖效应。
为了对比M-PDA与N-PDA光热转换效果是否相同，本研究采用2.5W/cm2的NIR照射12.5-200μg/mL的M-PDA或N-PDA纳米粒子，600s后记录体系温度。结果如图8中的A所示，经过600s的NIR照射，相同浓度的M-PDA和N-PDA体系温度增加无显著性差异(P>0.05)。而采用不同功率密度的NIR照射200μg/mL的M-PDA或N-PDA纳米粒子时，照射功率相同时，两者体系温度增加也同样非常接近(图8中的B)。结果表明，M-PDA和N-PDA具有相同的光热转换效果。
为进一步考察M-PDA和N-PDA的光热特征，分别记录M-PDA和N-PDA的升降温曲线。用2.5W/cm2的NIR分别照射200μg/mL的M-PDA和N-PDA，待升温达到平衡值时关闭NIR激光器，每隔20s记录一次M-PDA和N-PDA温度变化，得到M-PDA(图9中的A)和N-PDA(图9中的C)的升降温曲线，对M-PDA和N-PDA降温段曲线进行-Ln转换后与降温时间的线性拟合结果如图9中的B和图9中的D所示。结果显示M-PDA和N-PDA有类似的光热特征。
实施例7：M-PDA和N-PDA光热杀菌效果
以大肠杆菌(E.coli)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)两种G-菌为模式菌株，考察M-PDA和N-PDA对G-细菌光热灭活效果。分别取0.5mL的大肠杆菌和铜绿假单胞菌(2×106CFU/mL)，与0.5mL浓度为400μg/mL的M-PDA或N-PDA纳米粒子混合后，用1.0W/cm2的NIR照射0-9min，每隔3min取出100μL上清，涂布于LB固体培养基上，37℃培养12-18h。对照组除不进行NIR照射外，其他实验条件与实验组相同。M-PDA和N-PDA与菌液混合后，NIR照射不同时间后大肠杆菌菌落生长情况见图10中的A，铜绿假单胞菌生长情况见图10中的B。统计分析结果显示：(1)在没有NIR的照射时，M-PDA和N-PDA组内大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌活力在9min内未见明显变化，表明M-PDA和N-PDA纳米粒子在无NIR照射时对细菌无明显杀灭作用。(2)有NIR照射时，M-PDA和N-PDA组内两种细菌活力在9min内均快速降低，NIR照射9min后两种细菌均被完全杀灭(图10中的C和图10中的D)。由于M-PDA与N-PDA的光热转换效率十分接近，因此M-PDA和N-PDA对同种细菌的灭活效果未见显著差异。
实施例8：M-PDA和N-PDA内毒素吸附效果
对G-细菌进行光热灭活时，一个不可忽视的问题是这些G-死亡、裂解后会释放大量的内毒素(一个G-细菌死亡后约可释放0.7–1.0×105分子的内毒素(Eur J Biochem,1974,43(3):533-539.)。为了研究M-PDA和N-PDA光热灭活G-细菌后对内毒素吸附清除的效果，我们采用鲎试剂法测定了细菌完全灭活后(阳性对照组经高压灭菌，M-PDA和N-PDA组经9minNIR照射)的菌液上清中内毒素水平，结果如图11所示，1×106CFU/mL的大肠杆菌或铜绿假单胞菌完全死亡后释放的内毒素浓度可以分别达到3120.68和5483.39EU/mL(EU:endotoxin unit,1EU＝0.1-0.2ng)。虽然在NIR照射下，M-PDA和N-PDA都能有效杀死细菌(图10)，但M-PDA+NIR组游离的ET水平显著低于N-PDA+NIR组(图11中的A和B)。细菌完全死亡后，M-PDA对两种细菌内毒素的吸附率分别为86.80±2.53％和56.29±7.11％，而N-PDA仅为47.26±2.56％和33.42±4.71％(图11中的C和D)，M-PDA对两种细菌内毒素的吸附率分别是N-PDA的1.84和1.68倍。可见，与普通的PDA纳米粒子(N-PDA)相比，M-PDA不但可以有效对细菌进行光热灭活，而且对细菌死亡后释放的内毒素具有更强的吸附能力。
实施例9：M-PDA和N-PDA的血液相容性
将不同浓度M-PDA和N-PDA纳米粒子与1％SD大鼠红细胞悬浮液混匀后，37摄氏度孵育2h后，取上清测定545nm处吸光度。纯水为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。结果显示，相同浓度的M-PDA和N-PDA，溶血率相近。仅当M-PDA和N-PDA浓度达到800μg/mL时才会造成约5％的红细胞发生溶血，低于800μg/mL组，红细胞溶血率与阴性对照组(生理盐水)相比无显著的统计学差异(P>0.05)(图12)，显示M-PDA和N-PDA纳米粒子均具有良好的血液相容性。
实施例10：M-PDA和N-PDA细胞毒性
将L02细胞接种于96孔板内(每孔约2×105个细胞)，在含5％CO2条件下37℃孵育24h后，分别加入含有M-PDA和N-PDA的新鲜培养基继续培养24h。然后用MTT法测定细胞活性。阴性对照组仅加新鲜培养基，空白对照组含有待测材料但不接种细胞。结果如图13所示，当M-PDA和N-PDA纳米粒子浓度等于或低于200μg/mL时，细胞活力与阴性对照组相比无显著性差异(P<0.05)，即使当M-PDA和N-PDA纳米粒子浓度达到400μg/mL时，细胞仍能够达到约80％的活力，表明表明M-PDA和N-PDA纳米粒子浓度小于等于200μg/mL时无明显的细胞毒性，具有较高的生物安全性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种光热纳米杀菌材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向环己烷中加入内毒素、表面活性剂和氨水，进行超声分散，得到油包水乳液；所述内毒素的亲水端朝向油包水结构的水相，内毒素的疏水端朝向油包水结构的油相；
（2）向步骤（1）得到的乳液中加入多巴胺，所述多巴胺进入油包水结构的水相，并在水相中形成聚多巴胺；所述多巴胺的质量比上内毒素的质量为（2.5-10）：0.4；
（3）依次用乙醇和水溶液洗去油包水结构的表面活性剂和内毒素，得到具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子。
2.如权利要求1所述的光热纳米杀菌材料的制备方法，其特征在于，所述乙醇为无水乙醇，所述水溶液为乙酸水溶液。
3.如权利要求1-2任一所述方法制备得到的光热纳米杀菌材料，其特征在于，所述光热纳米杀菌材料为球形结构的具有内毒素印迹的聚多巴胺纳米粒子。
4.如权利要求3所述的光热纳米杀菌材料，其特征在于，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为60 nm-80 nm。
5.如权利要求3或4任一所述的光热纳米杀菌材料的应用，其特征在于，用于制备杀菌试剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杀菌试剂为杀灭革兰氏阴性细菌的试剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述光热纳米杀菌材料杀灭革兰氏阴性细菌后，吸附革兰氏阴性细菌死亡裂解后释放的内毒素。
8.如权利要求6-7任一所述的应用，其特征在于，所述杀菌试剂中光热纳米杀菌材料的浓度小于800 μg/mL，则无明显溶血效应。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述杀菌试剂中光热纳米杀菌材料的浓度小于等于200 μg/mL，则无明显细胞毒性。
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