CN107438767B - 检测活动性结核病标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测活动性结核病标志物的方法、用于实施检测活动性结核病标志物的方法的便携式设备。本发明还涉及用于实施检测活动性结核病标志物的方法的系统、用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的方法、用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的系统以及用于进行所述方法的试剂盒。

Description

检测活动性结核病标志物的方法
本发明涉及检测活动性结核病标记物的方法、用于实施检测活动性结核病标志物的方法的便携式设备。本发明还涉及用于实施检测活动性结核病标志物的方法的系统、用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的方法、用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的系统以及用于所述方法的试剂盒。
引言
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)家族的病原菌，也是大多数结核病(TB)病例的致病因子。
2013年有900万人患有结核病，其中患HIV的人中有150万例。2013年，有150万人死于结核病，其中HIV阳性者中有360000人。结核病是全球妇女前三名杀手之一，2013年有510000名妇女死于结核病。HIV阳性者中的结核病死亡人数中有50％属于妇女。至少550000名儿童患有结核病，2013年估计有80000万名HIV阴性儿童死于结核病。2013年，全球估计有480000人发展为多重耐药结核病(MDR-TB)，估计有210000例死于多重耐药结核病。截至2013年底，有100个国家已经报告了至少一例广泛耐药结核病(XDR-TB)。平均而言，估计有9％的MDR-TB病例具有XDR-TB。
因此，诊断结核病的可靠和快速的方法是至关重要的。
已经开发了几种诊断结核病的方法，但所有方法都有它们的缺点。仅仅基于体征和症状诊断活动性结核病是困难的，正如在免疫抑制的患者中诊断疾病一样。TB皮肤测试(也称为Mantoux结核菌素皮肤测试)、TB血液测试(也称为干扰素-γ释放测定或IGRA)和胸部放射线检查(X射线)，以及在痰涂片上对抗酸杆菌(acid-fast-bacilli)AFB)存在的测试，在几天内指示一些受感染的个体。通过鉴定临床样品(例如痰、脓或活检组织)中的结核分枝杆菌来进行TB的确定性诊断。然而，这种慢生长的生物体的困难培养过程会需要2至6个星期的血液或痰培养。
感染结核分枝杆菌的人类或动物通常产生针对分枝杆菌属的抗体。在从被感染的个体取得的样品中存在这些抗体表示感染。WO 2005/116654描述了基于该原理的方法，并公开了检测活动性结核病标志物。WO 2005/116654的方法涉及从疑似患有活动性结核病的受试者获得第一、第二和第三样品，稀释第一样品，将其部分暴露于测试容器中的固定的分枝菌酸抗原，并将其部分暴露于对照容器中的固定的分枝菌酸抗原(mycolic antigen)。将第二样品暴露于含分枝菌酸抗原的脂质体，将第三样品暴露于不含分枝菌酸抗原的脂质体。将第二样品添加至测试容器中，将第三样品添加至对照容器中，并检测测试和对照容器中抗体对分枝菌酸和抗原的结合。比较测试与对照容器之间的结合程度，并且测试容器中较少的结合是针对分枝酸抗原的抗体存在的指标。
在WO 2013/186679中描述了进一步的发展，其公开了检测用于活动性结核病的诊断的抗原特异性生物标志物抗体的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含脂质体的脂质抗原呈递脂质体组合物，所述脂质体包含固醇修饰脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物；固定脂质体以产生固定的分枝菌酸抗原，其包含纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分或其类似物或衍生物；从疑似患有活动性结核病的人或动物获得第一、第二和第三样品，其中每个样品可能含有针对抗原的抗体，第一样品具有低于第二和第三样品的稀释浓度；将第一样品部分暴露于测试容器中的固定的分枝菌酸抗原；将第一样品的部分暴露于对照容器中的固定的分枝菌酸抗原；将第二样品暴露于第一步骤中提供的脂质抗原呈递脂质体组合物；将第三样品暴露于不含分枝菌酸抗原的脂质体；将第二样品在暴露于第一步骤中提供的含有分枝菌酸抗原的脂质体组合物之后添加到测试容器中；将第三样品在暴露于不含分枝菌酸的脂质体之后，添加至对照容器中；在实验和对照容器中实时检测抗体与分枝菌酸抗原的结合；并且比较测试与对照容器之间的结合程度或强度(extent)，测试容器中较弱的结合是样品中存在针对分枝酸抗原的抗体的指标，其指示样品所源自的人或动物中的活动性结核病。
WO 2005/116654和WO 2013/186679中描述的方法提供用于诊断结核病的可靠方法，但具有若干缺点。首先，WO 2005/116654和WO 2013/186679中描述的方法需要从同样的受试者提供几个样品。第二，这些方法需要几个稀释步骤和几个将样品转移至不同的未连接的隔室的步骤，需要复杂和大量的仪器部件组。第三，这些方法涉及样品及其稀释物的单独温育步骤和从而几个单独的测量。由于这些原因，WO 2005/116654和WO 2013/186679的方法是复杂和耗时的。事实上，使用WO 2005/116654和WO 2013/186679中公开的方法从获得疑似患有活动性结核病的受试者的样品至确定个体是否感染了活动性结核病的总时间花费了估计每样品至少2小时的时间。此外，由于上述方法需要复杂而大量的仪器部件组，所述方法在医院环形境中可以是有用的，但在不能享受医院和良好发展的医疗保健的地区，例如在发展中国家，可能是没有用的。特别地在这些国家，结核病最为普遍，可靠和快速的诊断是最需要的。
因此，本发明的目的在于提供确定个体是否感染了活动性肺结核(例如肺结核或肺外结核)的方法，该方法是快速且可靠的，并且可以在专业医疗环形境之外，即在医院外，例如在街上实施。
发明概述
在第一方面，本发明涉及如权利要求1中定义的实时检测活动性结核病标志物的方法。
在第二方面，本发明涉及如权利要求5中定义的在终点测定中检测活性结核病标志物的方法。
在第三方面，本发明涉及如权利要求11中定义的用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品的方法。
在第四方面，本发明涉及如权利要求20中定义的便携式设备。
在第五方面，本发明涉及如权利要求29和权利要求35中定义的用于实施检测活动性结核病标志物的方法的系统。
在第六方面，本发明涉及如权利要求32和34中定义的用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品的系统。
在第七方面，本发明涉及如权利要求39和40中定义的试剂盒。
附图说明
图1描述了本发明的设备的示例性实施方案。
图2描述了根据权利要求32的系统的示例性实施方案。
发明描述
本发明的原理是基于本发明人的观察：如果按照下述方法的步骤i)-v)预处理样品，则可快速可靠地检测样品中针对分枝菌酸衍生物的抗体。
实时检测方法
本发明在一个方面涉及用于检测样品中针对分枝菌酸衍生物的抗体诸如索状因子抗体或分枝菌酸(MA)抗体的方法，其中检测是实时发生的。
该方法包括以下步骤：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品与固醇脂质接触；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)将所述级分中的第二级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
vi)将步骤iv)中暴露的样品级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的测试基底物，并将步骤v)中暴露的样品级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的对照基底物；
vii)实时检测步骤vi)中抗体对抗原的结合；和
viii)比较测试和对照基底物之间的抗体结合的程度或强度，任何观察到的较少的与测试基底物的结合是指示样品中存在针对抗原的抗体的指示剂，其指示样品所源自的人或动物中的活动性结核病。该方法在整个申请中将被称为“实时方法”
实时方法使得样品，优选血液样品能够以可靠和快速的方式进行分析，而无需将样品从几个容器转移至几个容器。随后用固醇脂质对样品进行预温育步骤，然后将部分样品与分枝菌酸衍生抗原一起经历预温育步骤，以获得测试样品，将样品的另一部分在无分枝菌酸衍生抗原存在的情况下预温育以获得对照样品，使得样品适合于直接应用于最终检测步骤，所述最终检测步骤需要预处理的样品中的分枝菌酸抗原与载有分枝菌酸的生物传感器基底物的结合。因此，生物传感器基底物不需要用样品的稀释物对传感器进行预温育或预处理。因此，本发明的方法不需要现有技术方法中所需的几个稀释和转移步骤。
此外，本发明的实时方法有利地适合于借助于便携式设备，特别是借助于以下定义的设备进行。这使得可能以快速和可靠的方式确定个体是否感染了活动性结核病(例如肺结核或肺外结核病)，从而允许在少于15至25分钟内检测结核病。此外，该方法可以在专业医疗环形境之外进行。
特别地，实时方法提供了快速的方法来确定个体是否感染了活动性结核病作为护理点测试，即作为在患者护理场所或其附近的测试。本发明的测试提供了可在床边进行的简单的医学试验。
此外，实时方法仅需要从受试者获取一个样品，该样品可直接用于本发明的方法中。
现在将参照实时方法的步骤更详细地说明本发明的实时方法。
步骤i(实时方法)
本发明的实时方法基于对疑似患有活动性结核病的人或动物的样品，特别是血液样品的诊断测试。为此目的，在本发明的实时方法的步骤i)中，提供了疑似患有活动性结核病的人或动物的样品。所述样品优选为全血样品。可通过从受试者获得血液的任何常规方法获得样品。为了在本发明的方法中使用，可使用已在较早阶段收集，直至在合适的条件下使用，并在合适的时刻提供的样品。可选地，可在现场，即作为护理点测试将样品用于本发明的方法。在后一种情况下，本发明的便携式设备将特别适合使用。
在样品是全血样品的情况下，样品可取决于在步骤ii)之前检测抗体与待过滤或分离成血浆或血清的抗原的结合的方式。在通过检测质量差异进行检测的情况下，可优选进行过滤步骤以过滤出高质量组分诸如血细胞。在通过荧光检测结合的情况下，可以选择不过滤样品。这甚至会缩短诊断所需的时间。
样品优选为血液衍生的样品。样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。血清是没有凝血因子的血浆，优选作为血浆。因此，本申请中的血浆一词也可以指(血液)血清。血浆或血清的选择取决于本发明的设备是被设计来将全血分离成血浆还是血清。血清是优选的，因为其含有比血浆少的不同材料，所述不同材料可导致非特异性相互作用或不想要的生物活性。另外，血清可具有比血浆低的粘度。因此，使用血清可以避免稀释样品的需要，这节省了时间和材料。
全血的约55％由血浆/血清组成。如果全血样品没被完全过滤，或者如果患者的身体状况需要其，可能需要稀释全血样品或血浆或血清。因此，本申请中的词语血浆或血清也可指稀释的血浆或血清。
因此，血液或血浆的稀释可以以本发明的实时方法来进行，例如250至5000倍的稀释度，750至1250倍的稀释度，诸如例如4000、2000或1000倍的稀释度。取决于样品的粘度，这种稀释可以在将血浆从血液步骤分离血浆之前或在分离步骤或分离步骤的替代步骤之后进行。例如，稀释步骤可在分离步骤之后但在步骤iv)或v)之前或在步骤v)/vi)之后和步骤vii)之前进行。优选在步骤v)/vi)之后和步骤vii之前，即刚好在样品进入生物传感器之前，稀释样品。通过这种方式，在该方法的大多数步骤期间尽可能小地保持样品的体积，这有利于过程的速度和其中使用的装置的紧凑性。
稀释可用任何合适的稀释剂进行，例如基于PBS的缓冲液。此类缓冲液可以例如是PBS/AE缓冲液，其在生理pH下在水中包含NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和EDTA的。此类缓冲液可以是基于PBS的缓冲液，其由每升双蒸馏去离子水，其含有1mM EDTA和0.025％(m/v)叠氮化钠，8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4和1.05g Na2HPO4组成，其被调至pH 7.4。
可用阻止血液凝固的试剂，诸如EDTA、肝素或柠檬酸盐进一步稀释全血样品或血浆或血清。
任选地，可将去垢剂以低浓度添加至血液/血浆/血清中，以避免将组分粘附至管道、导管或容器的壁上。
步骤ii(实时方法)
在步骤ii中，将样品暴露于固醇脂质，即与其接触。
虽然本发明人不希望受任何理论的束缚，但仍假定固醇脂质从样品中清除掉抗胆固醇抗体，否则所述抗体将与传感器基底物上的分枝菌酸抗原交叉反应并导致结核病的假阳性诊断。
样品对固醇脂质的暴露时间优选少于10分钟，诸如2至8分钟、3至7分钟、4至6分钟或约5分钟。暴露时间取决于将样品与固醇脂质接触的方式。
将样品暴露于固醇脂质的一个示例性方式是将样品导入长螺旋通道并使其沿着通道的长度通过，该通道预先涂覆有固醇脂质，其优选为胆固醇。在通道末端，暴露于脂质固醇的样品可通过用于分流样品流的装置，诸如被动阀分流点，所述被动阀分流点将分流的样品流引导至步骤v)的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的下一个基底物，和步骤vi)的不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，即分别地包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器，和包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器。
将样品暴露于固醇脂质的另一种示例性方式是将其注射入涂有胆固醇的容器中，然后在其中温育少于10分钟。
全血/血浆/血清富含数百种不同种类的具有亲水至疏水性质的分子。因此，将使用对该样品的分子的非特异性结合是惰性的基底物材料。在该情况下，基底物应被理解为支撑材料。
步骤iv和v(实时方法)
在下一步骤中，将一部分暴露于固醇脂质的样品暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物(步骤iv))，并将另外一部分暴露于固醇脂质的样品暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物(步骤v))。
为了获得至少两个级分，在该过程的某一时刻必须分流血液/血浆流(实时方法的步骤iii)。为了方便并且优化方法的可靠性起见，优选在暴露于固醇脂质之后分流所述流，即将暴露于固醇脂质的样品分成至少两个部分来提供测试流和对照流。优选地将样品分成两个相等或基本上相等的部分，因为这可使得能够简单地比较两个部分而不需要校正计算。样品流的分流可通过用于分流样品流的任何装置，诸如被动阀分流点进行。
可选地，在过滤步骤后但在暴露于固醇脂质之前，将样品流(其被过滤成血浆或血清)分成至少两个部分。可选地，在过滤之前分流血流。这是不太优选的，因为在该情况下将需要两个过滤器。
步骤iv)和v)的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物和不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物优选具有相同的材料。
另外，由于固醇脂质(例如胆固醇)和分枝菌酸衍生物都是疏水性的，因此步骤iv)和v)中用于暴露的基底物将具有与可用于步骤ii)中的基底物相同的材料。应当理解，合适的基底物材料对于该样品的分子的非特异性结合是惰性的。
样品对固醇脂质的暴露时间优选少于10分钟，诸如2至8分钟，3至7分钟，4至6分钟或约5分钟。
将样品暴露于步骤iv)和v)的基底物的一种示例性方式是将分流的样品流引导至长螺旋通道中，优选在微芯片实施的，用分枝菌酸衍生物(步骤iv))或未用无分枝菌酸衍生物(步骤v))预涂的，并沿着这些通道的长度通过。两个通道与生物传感器的距离将需要相同的长度。重要的是，尽可能少地非特异性地结合基底物材料。
将分离的暴露于脂质固醇的样品暴露于涂覆有或未涂覆分枝菌酸衍生物的基底物的替代示例性方式，是将第一流注射至含有载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物(步骤iv)的容器中，和将第二样品流注射至包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物的容器(步骤v)中，并将样品温育少于10分钟，诸如2至8分钟、3至7分钟、4至6分钟或约5分钟。
步骤vi(实时方法)
在该步骤中，将步骤iv中暴露于分枝菌酸衍生物(测试流)或在步骤v中未暴露于分枝菌酸衍生物(对照流)的分流的暴露于固醇脂质的样品流，分别通过载有分枝菌酸衍生物，优选与步骤iv中的衍生物相同的衍生物的另外的基底物、测试和对照基底物。
这些测试和对照基底物包含在生物传感器中，所述生物传感器包含第一室(测试室)，其具有测试基底物，用于接收步骤iv)中的暴露于分枝菌酸衍生物的测试流，和第二室(对照室)，其具有对照基底物，用于接收步骤v)中的未暴露于分枝菌酸衍生物的对照流。两个室中的基底物优选具有相同的材料并载有相同的分枝菌酸衍生物。在该情况下，生物传感器可以是当抗体接触测试和对照基底物上的分枝菌酸衍生物时能够生成可测量信号的任何装置。
优选地，步骤vi)的测试和对照基底物是二氧化硅基础的，诸如基于二氧化硅的基底物。当使用环形共振技术来检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合时，二氧化硅基基底物是特别有用的。优选地，使用利用硅基环形共振器的生物传感器芯片进行检测。这使得本发明的方法能够用非常紧凑的设备来进行。
也很可能的是步骤vi)的基底物是金基础的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗分光镜法来检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合时，金基础的基底物是特别有用的。
步骤vii和viii(实时方法)
在步骤vii中，检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合。因为检测实时发生，所以在结合过程中直接检测到步骤vi的基底物上的抗体的结合。因此，应当理解，步骤vi和vii不是需要在不同时间进行的步骤。这也适用于步骤viii，即对测试和对照基底物的结合的比较以及检测可在步骤vii的结合过程仍然进行时进行。对于检测，原则上可使用所有实时的无标记分析技术，诸如表面等离子体共振或电化学阻抗谱等温滴定量热法、生物层干涉测量法、光栅、光子晶体、声共振分析、石英晶体微量天平平。
抗体和/或其他材料与分枝菌酸抗原的结合的检测可在自动化设备中进行。各种自动化设备将是本领域技术人员已知的，并且本领域技术人员将能够选择合适的软件工具来进行步骤viii)以比较测试和对照基底物之间的结合程度或强度，其中任何观察到较少的与测试基底物的结合是样品中存在针对抗原的抗体的指标，所述抗体的存在与样品所源自的人或动物中的活动性结核病相关。在该情况下，应当理解，可定性和定量地解释较少的，即较少的结合可被解释为具有较少的结合事件以及具有较弱的结合。
用于进行实时方法的设备
在另一方面，本发明涉及用于实施检测活动性结核病标志物的实时方法的便携式设备，其包含至少一个包含固醇脂质的容器，其被排布和配置来接收来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另一个容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收所述第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二个基底物，和生物传感器，其包含第一室，所述第一室与所述另一个容器连接，用于接收第一样品流的第一室，包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，和第二室，所述第二室与所述又一个另外的容器连接，用于接收第二样品流，包含与第一室相同的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物。
优选地，本发明的设备包括连接至第一管道的皮肤穿透端，第一管被排布和配置来接收来自皮肤穿透端的血液样品，并将所述血液样品从皮肤部位运送至包含固醇脂质的所述容器中。
在另一个优选实施方案中，该设备包括过滤器单元，其与所述第一管道连接的用于接收所述血液样品，并被配置来从所述全血样品分离血浆。
在另一优选实施方案中，便携式设备包含连接至第一管道的皮肤穿透端，所述第一管道被排布和配置接收来自皮肤穿透端的血液样品，并将所述血液样品运离皮肤部位；过滤器单元，其与用于接收所述血液样品的所述第一管道连接并被配置分离来自所述全血样品的血浆；用于接收所述样品的第一容器，所述第一容器包含固醇脂质；用于将所述样品分成至少第一和第二样品流的装置；用于接收所述第一样品流的第二容器，所述第二容器包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的第三容器，所述第三容器包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物；以及生物传感器，其包含第一室，所述第一室与第二容器连接，用于接收第一样品流，包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，和第二室，所述第二室与第三容器连接，用于接收第二样品流，并且包含与第一室相同的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物。
通过该仪器的流优选由泵，优选连续流动泵例如蠕动泵或隔膜泵驱动。泵优选位于生物传感器的下游，以便能够通过仪器吸取样品并在分析之前防止对样品的污染。
皮肤穿透装置可以是从人或动物获得血液样品的任何合适的装置，诸如针注射器等。
第一管道具有适合于该设备目的的尺度，即其需要很好地适应皮肤穿透装置和第一容器。
装置的部件，即容器、用于稀释的装置、过滤器单元和生物传感器可通过适当的互连管道相互连接。可选地，可这样设计设备的部件，使得它们可以彼此直接连接。本发明中使用的管道的材料可以是测试血液样品领域内的技术人员已知的任何合适的材料。合适的材料对血液/血浆/血清组分是惰性的，包括聚四氟乙烯(例如
Figure BDA0001385347400000121
)、聚丙烯、聚醚酮(PEEK)和聚乙烯。
可在设备的部件之间连接其它部件。可以以互连的管道连接此类其它部件，可将部件直接附接至部件。
本发明的设备还可包含用于稀释血液或血浆的装置。可在含固醇脂质的容器之前，过滤器单元之前，过滤器单元与含固醇脂质的容器之间，含固醇的容器和另外一个(另外的和又一个另外的或(第二和第三)容器之间或所述另外的/又一个另外的或第二/第三容器与生物传感的各自的室之间应此类装置。优选地，用于稀释样品的装置连接在所述另外的或第二容器与生物传感器之间和所述又一个另外的或第三容器与生物传感器之间。例如，可在所述另外的或第二容器和又一个另外的或第三容器的出口处应用10ml容器。合适的缓冲液可以已经存在于容器中或添加至该容器中以提供所需的稀释液。这样样品的体积在本发明的方法的大部分步骤中可保持尽可能小，这有利于本发明过程的速度和装置的紧凑性。
容器可以是器皿或通道或管道，诸如螺旋通道或螺旋管。螺旋通道或管道是优选的，因为此类结构在保持长的流动路径的同时几乎不占空间。可以有利地在微芯片上应用螺旋通道或管。这有助于本发明的装置的紧凑性。
过滤器单元可包含过滤器矩阵。为了紧凑化，优选地，在过滤器微芯片上应用过滤器。
容器的材料优选相同，合适的材料可以是bk-7玻璃、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚醚酮或聚乙烯。
容器的基底物必须是对样品分子的非特异性结合是惰性的材料，例如bk-7玻璃、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚醚酮或聚乙烯。
该设备包含含有载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器(第二容器)和含有不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器。只要不发生非特异性结合，后一容器可具有惰性涂层或无涂层而非固定化的分枝菌酸衍生抗原。
优选地，生物传感器的室的测试和对照基底物是二氧化硅基础的，诸如基于二氧化硅的基底物。当使用环形共振技术来检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合时，二氧化硅基的基底物是特别有用的。
生物传感器包含第一和第二室。应当理解，两个室不必在一个隔室或壳体中。例如，生物传感器可包含两个单独的传感器单元，每个传感器单元包含具有载有分枝菌酸衍生抗原的基底物的室，一个传感器单元经由管道与包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器连接，另一个传感器单元经由管道与包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器连接。
优选地，生物传感器包括硅基环形共振器。这使得本发明的装置非常紧凑。
在这方面，本发明还涉及生物传感器，其包含至少两个室，所述室包含具有固定的分枝菌酸衍生抗原的二氧化硅基基底物和Si环形共振器。
也很可能的是生物传感器的室的基底物是金基础的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗谱法来检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合时，金基础的基底物是特别有用的。
可将本发明的设备连接至任何合适的自动分析装置，诸如具有合适的软件程序的计算机，以进行生物传感器的室中的分枝菌酸抗体与固定的抗原结合的比较。
图1中显示了本发明的装置的示例性实施方案。
图1显示连接至第一管道2的皮肤穿透针1，所述第一管道2被排布和配置来接收来自针1的血液并且将一定量的血液从皮肤部位带走。管道1连接至过滤器单元3。该过滤器单元用于从所述全血样品分离血浆。过滤器单元3经由管道13连接至第一容器4，所述第一容器4呈螺旋通道的形式，所述通道内壁涂覆有固醇脂质。螺旋通道经由管道14与呈被动阀分流点形式的用于分流血浆5的装置连接。分流点的一个分支经由管道16与第二容器6连接，所述第二容器6用于接收第一血浆流，其包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物。分支点的另一分支经由管道15与第三容器7连接，所述第三容器7用于接收第二血浆流，其包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物。本实施方案中的容器6和7呈螺旋通道的形式，其内壁涂覆有分枝菌酸衍生抗原(容器6)或未涂覆有分枝菌酸衍生抗原(容器7)。容器6和7分别经由管道17和18分别与稀释容器11和12连接。这些容器可用合适的稀释缓冲液预先填充，其包含入口21、22用于引入稀释缓冲液。稀释容器21和22经由相应的管道19和20分别连接至生物传感器8的测试室9和生物传感器8的对照室10。测试和对照室9和10均包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的相同基底物。
试剂盒
在另一方面，本发明涉及用于使用实时检测方法诊断结核病的试剂盒，其包含一种或多个皮肤穿透装置；一个或多个管道；一个或多个容器，其涂覆有固醇脂质和任选的磷脂酰胆碱、果胶、两性霉素B或β-环糊精；一个或多个容器，其包含具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的；一个或多个容器，其包含不具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；和一个或多个生物传感器，其包含至少两个室，该室包含具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；和任选地用于稀释血液或血浆的装置和/或过滤器单元。
试剂盒还可包含组装部件的工具，诸如螺钉、夹具、胶水、胶带、螺丝刀等。
试剂盒还可包含在血液分析期间稀释血液或血浆的装置。诸如在第二和第三容器的出口处应用的容器(例如10ml)。合适的缓冲液可以已经存在于容器中或被添加至该容器中以提供所需的稀释液。
试剂盒的部件使得进行结核病诊断测试的人能够现场，即在护理点组装本发明的设备。因此，应当理解，试剂盒的部件具有与上面针对本发明的设备所解释的相同的特性和优选性质。本发明的设备通过本发明的试剂盒的部件来容易地组装，即不需要专门的技术背景。可方便地为该试剂盒提供组装和使用说明书。
终点法
本发明在另外方面涉及用于检测样品中针对分枝菌酸衍生物的抗体诸如索状因子抗体或分枝菌酸(MA)抗体的检测方法，其中通过终点测定实施检测。
该方法包括以下步骤：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品与固醇脂质接触；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)将所述级分中的第二级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
vi)将步骤iv)中暴露的样品级分的至少一部分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的测试基底物，以及将步骤v)中暴露的样品级分的至少一部分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的对照基底物；
vii)在终点测定中检测步骤vi)的抗体与抗原的结合；和
viii)比较测试和对照基底物之间的抗体结合的程度或强度，任何观察到的较少的与测试基底物的结合是样品中存在针对抗原的抗体的指示剂，其指示样品所源自的人或动物中的活动性结核病。该方法将在整个申请中被称为“终点法”。
在预处理步骤i)-v)之后，不一定必须紧接检测步骤vi-viii)。例如，可贮存在步骤v)之后获得的样品级分直至进一步使用或运输至检测基底物。这样，实施者在规划他的测试中有很大的灵活性。例如，在步骤i)-iv)之后不一定必须紧接步骤vi)-viii)的事实允许收集预处理的样品，因此可在一个基底物材料上同时测试它们，这提高可靠性和可重复性。这也使得在相同条件下测试来自多个患者的样品能够更容易。
因此，在另一方面，本发明还涉及用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品以用于检测的方法：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品暴露于固醇脂质；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)将所述级分中的第二级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
其中在步骤iv)和v)中暴露后，贮存样品级分的至少一部分以供进一步使用。该方法在整个申请中被称为“预处理方法”。
此外，本发明的终点法使得能够以可靠和快速的方式分析样品，优选血液样品。随后利用固醇脂质进行预温育步骤i)-v)，然后将一部分样品与分枝菌酸衍生抗原经历预温育步骤，以获得测试样品，并将另一部分样品在无分枝菌酸衍生抗原的情况下预温育以获得对照样品，使得样品适于直接应用于最终的终点检测步骤，所述步骤需要预处理的样品中的分枝菌酸抗原与载有分枝菌酸的基底物结合。因此，基底物不需要用样品的稀释物进行预温育或预处理。因此，不需要现有技术方法中所需的几个稀释和转移步骤。
此外，终点法使得可能以快速和可靠的方式确定个体是否感染了活动性结核病(例如肺结核或肺外结核)，允许在少于15至25分钟内检测结核病。这尤其归因于终点法和预处理方法的预处理步骤i)-v)。此外，终点法可在专业医疗环形境之外进行。因此，特别地，以护理点测试的方式，即以在患者护理部位或附近的测试的方式提供用于确定个体是否感染了活动性结核病的快速方法。本发明的测试提供了可在床边进行的简单的医学测试。
此外，由于预处理步骤i)-v)从受试者取得一个样品是足够的，因此该样品可直接用于检测而无需进一步处理。
现在将参照终点法和预处理方法的步骤更详细地说明本发明的这个方面的原理。
步骤i(终点法/预处理方法)
本发明的终点检测方法基于样品，特别是疑似患有活动性结核病的人或动物的血液样品的诊断测试。为此，在步骤i)中提供了来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品。样品优选为全血样品。可通过从受试者获得血液的任何常规方式获得样品。为了在本发明的方法中使用，可使用已在较早阶段收集的，被贮存直至在合适的条件下使用并在适当的时刻提供的样品。或者，可将样品在现场，即作为护理点测试用于本发明的检测方法。另一个替代方案是根据上述步骤i)-v)现场预处理样品，以及贮存所得的预处理样品直至进一步使用和/或转移至发生检测的另一场所。
在样品是全血样品的情况下，取决于检测抗体与抗原的结合的方式，可在步骤ii)之前将样品过滤或分离成血浆或血清。在通过检测质量差异进行检测的情况下，可优先进行过滤步骤以过滤出高质量组分诸如血细胞。在通过荧光检测结合的情况下，可选择不过滤样品。这甚至可缩短预处理和诊断所需的时间。
样品优选为血液衍生的样品。样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。血清是没有凝血因子的血浆，并且优选作为血浆。因此，本申请中的“血浆”一词也可以指(血液)血清。血浆或血清的选择取决于是否本发明的设备是被设计来将全血分离成血浆还是血清。血清是优选的，因为其含有比血浆少的可导致非特异性相互作用或不想要的生物活性的不同材料。另外，血清可具有比血浆低的粘度。因此，使用血清可以避免稀释样品的需要，这节省了时间和材料。
全血的约55％由血浆/血清组成。如果全血样品没被完全过滤，或者如果患者的身体状况需要其，则可能需要稀释全血样品或血浆或血清。因此，本申请中的词语血浆或血清也可指稀释的血浆或血清。
可以在本发明的方法中进行血液或血浆的稀释。10倍至250倍的稀释度是优选的，特别是当应用的终点测定是免疫金过滤测定诸如点免疫金过滤测定时。取决于样品的粘度，此类稀释可在将从血液分离血浆步骤之前或在分离步骤或对分离步骤的替代物步骤之后进行。例如，稀释步骤可在分离步骤之后但在步骤iv)或v)之前或在步骤v)/vi)之后并在步骤vii)之前进行。
稀释可用任何合适的稀释剂例如基于PBS的缓冲液进行。此类缓冲液可以例如是在生理pH下在水中包含NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和EDTA的PBS/AE缓冲液。此类缓冲液可以是由每升双蒸去离子水(含有1mM EDTA和0.025％(m/v)叠氮化钠)8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4和1.05g Na2HPO4组成的基于PBS的缓冲液，其被调至pH 7.4。
全血样品或血浆或血清可用阻止血液凝固的药物，诸如EDTA、肝素或柠檬酸盐，进一步稀释。
任选地，可将去垢剂以低浓度添加至血液/血浆/血清中，以避免组分粘附至管道、器皿或容器的壁上。
步骤ii(终点法/预处理方法)
在步骤ii中，将样品暴露于固醇脂质，即与固醇脂质接触。
虽然本发明人不希望受任何理论的束缚，但仍假定固醇脂质从样品中清除掉抗胆固醇抗体，否则所述抗体将与基底物上的分枝菌酸抗原交叉反应并导致结核病的假阳性诊断。
样品对固醇脂质的暴露时间优选少于10分钟，例如2至8分钟、3至7分钟、4至6分钟或约5分钟。暴露时间取决于将样品与固醇脂质接触的方式。
将样品暴露于固醇脂质的一个示例性方式是将样品导入长螺旋通道并使其沿着通道的长度通过，该通道预先涂覆有固醇脂质，其优选为胆固醇。在通道末端，暴露于脂质固醇的样品可通过用于分流样品流的装置，诸如被动阀分流点，所述被动阀分流点将分流的样品流引导至步骤v)的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的下一个基底物，和步骤vi)的不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，即分别地包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器，和包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器。
将样品暴露于固醇脂质的替代示例性方式是将其注射入涂有胆固醇的容器中，然后在其中温育少于10分钟。
另一种替代的示例性方式是将样品暴露于固醇脂质，其中固醇脂质包含在柱子的隔室中。在这种隔室中，优选将固醇脂质涂覆在珠粒上。
全血/血浆/血清富含数百种不同种类的具有亲水至疏水性质的分子。因此，将使用对该样品的分子的非特异性结合是惰性的基底物材料。在该情况下，基底物应被理解为支撑材料。
步骤iv和v(终点法/预处理方法)
在下一步骤中，将暴露于固醇脂质的样品的级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物(步骤iv))，并将暴露于固醇脂质的样品的另外级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物(步骤v))。
为了获得至少两个级分，在该过程的某一时刻必须分流血液/血浆流(实时方法的步骤iii)。为了方便并且优化方法的可靠性起见，在暴露于固醇脂质之后分流所述流，即将暴露于固醇脂质的样品分成至少两个级分来提供测试流和对照流。优选，将样品分成两个相等或基本上相等的级分，因为这可使得能够简单地比较两个级分而不需要校正计算。样品流的分流可通过用于分流样品流的任何装置(诸如被动阀分流点)进行。
或者，在过滤步骤后但在暴露于固醇脂质之前，将样品流(其被过滤成血浆或血清)分成至少两个级分。或者，在过滤之前分流血流。这是不太优选的，因为在该情况下将需要两个过滤器。
在使用柱子的情况下，在这种情况下，在步骤ii)中暴露于固醇脂质之前分流所述流，使得步骤ii)和iv)可在同一柱子中进行，并且步骤ii)和v)可在另一个柱子中进行。
步骤iv)和v)的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物和不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物优选具有相同的材料。
另外，由于固醇脂质(例如胆固醇)和分枝菌酸衍生物都是疏水性的，因此步骤iv)和v)中用于暴露的基底物可以是与可用于步骤ii)中的基底物相同的材料。应当理解，合适的基底物材料对于该样品的分子的非特异性结合是惰性的。
样品对固醇脂质的暴露时间优选少于10分钟，例如2至8分钟，3至7分钟，4至6分钟或约5分钟。
将样品暴露于步骤iv)和v)的基底物的一种示例性方式是将分流的样品流引导至长螺旋通道中，优选在用分枝菌酸衍生物(步骤iv)或未用无分枝菌酸衍生物(步骤v)预涂的微芯片中实施，并沿着这些通道的长度通过。
将分离的暴露于脂质固醇的样品暴露于涂覆有或未涂覆分枝菌酸衍生物的基底物的替代示例性方式，是将第一流注射至含有载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器(步骤iv)中，和将第二样品流注射至包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物的容器(步骤v)中，并将样品温育少于10分钟，诸如2至8分钟、3至7分钟、4至6分钟或约5分钟。
另一种替代方式是步骤iv)和v)在柱子中进行。在这种情况下，在步骤ii)中暴露于固醇脂质之前分流所述流，使得步骤ii)和iv)可在一个柱子中进行，并且步骤ii)和v)可以在另一个柱子中进行。
虽然为了检测方法的可重现性和可靠性的原因，优选在步骤v)中将所述暴露于固醇脂质的样品的另一级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，还可能的是省略将所述级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的步骤，并贮存所述级分直至进一步使用，诸如在步骤vi)中。这可以例如在其中进行与固醇脂质的温育的同一柱子或容器中进行。
因此，本发明还涉及包括以下步骤的方法：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品与固醇脂质接触；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)贮存所述级分中的第二级分的至少一部分直至步骤vi)；
vi)将步骤iv)中暴露的样品级分的至少一部分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的测试基底物，并将步骤v)中贮存的样品级分的至少一部分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的对照基底物；
vii)在终点测定中检测步骤vi)的抗体与抗原的结合；和
viii)比较测试和对照基底物之间的抗体结合的程度或强度，任何观察到的较少的与测试基底物的结合是指示样品中存在针对抗原的抗体的指示剂，其指示样品所源自的人或动物中的活动性结核病。
根据这一点，本发明还涉及用于预处理疑似患有活动性结核病的人或动物的样品以用于检测的方法：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品暴露于固醇脂质；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)贮存所述级分中的第二级分的至少一部分以供进一步使用；
其中在步骤iv)中暴露后，所述暴露的第一样品级分的至少一部分被贮存用于进一步的使用。
步骤vi(终点法)
在该步骤中，在步骤iv(测试流)中暴露于分枝菌酸衍生物或在步骤v(对照流)中未暴露于分枝菌酸衍生物的分流的暴露于固醇脂质的样品流分别被传递至其它基底物，测试和对照基底物，所述基底物载有分枝菌酸衍生物，优选与步骤iv中相同的衍生物。
测试和对照基底物可以是可载有固定的分枝菌酸衍生抗原的任何基底物，并且可从所述基底物检测到所述样品中包含的抗体与所述抗原之间的结合。
在优选实施方案中，通过免疫金过滤测定进行检测。在这样的测定中，测试和对照基底物是微孔膜，优选硝酸纤维素膜，其涂覆有固定的分枝菌酸衍生抗原。
测试基底物和对照基底物可以是分开的实体。或者，测试基底物和对照基底物可被实现为一个基底物实体上的不同位置。例如，在微孔膜的情况下，可由第一微孔(例如硝酸纤维素)膜和第二微孔(例如硝酸纤维素)膜形成测试基底物和对照基底物。或者，将测试基底物和对照基底物包含在一个膜上。在这种情况下，存在其中可在膜的一个位置发生抗体/抗原相互作用的测试区(例如斑点)和其中可在所述膜的另一位置发生抗体/抗原相互作用的对照区域。
步骤vii和viii(终点法)
在步骤vii)中，在终点测定中检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合。将至少一部分获得的预处理级分经历所述终点检测测定。有可能使用全部级分用于进行终点测定。或者，将级分的一部分用于检测终点测定中抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合，将另一部分贮存用于进一步测试，这取决于级分的第一部分的结果。
术语“终点测定”应被理解为其中与所谓的实时测定相反，目标结果是在固定的测定温育期之后的最终结果的测定。在本发明的检测方法的情况下，这意味着采用在步骤iv)和v)之后获得的处理样品，并将其经历测试，所述测试提供在步骤iv)和v)之后处理样品中存在的抗体的量的指示。
终点检测测定可以例如在测试结束时检测颜色、荧光、吸光度或发光水平的变化。在终点测定中，可通过诸如光子光谱学、荧光显微镜、化学发光或电化学发光检测技术的技术来适当地进行检测。这可涉及使用例如分光光度计/比色板读数器、荧光读板器或化学发光读取器。
合适的终点测定可以包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、放射性标记测定、光子光谱测定、免疫荧光、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、电化学阻抗谱(EIS)等。例如，ELISA涉及至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。在本发明的说明书中，抗原是分枝菌酸衍生抗原，抗体是针对分枝菌酸衍生抗原的抗体。
在终点测定中，抗体与分枝菌酸衍生抗原的相互作用可使用结合针对分枝菌酸衍生物的抗体的重链的第二抗体来进行。许多合适的第二抗体是商购可得的。第二抗体可被偶联至珠粒，例如金珠，或与脂质体缔合。第二抗体的实例可以是蛋白质A或G，可能与使得能够检测的酶缀合。
特别合适的技术或在步骤vii)中检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合是所谓的免疫金过滤测定(IGFA)，特别是点免疫金过滤测定(DIGFA)。
免疫金过滤测定是组合ELISA与免疫金技术的方法，并且是其中将待测定的样品通过微孔膜，优选硝酸纤维素膜过滤，并通过涂覆在膜上的捕获探针捕获的方法。使胶体金标记的探针以相同的方式通过微孔膜过滤。通过使用微孔膜作为捕获探针的载体并采用毛细管作用以及膜的渗透性，抗原和抗体的可以容易地反应并且可以方便地进行任选的洗涤和/或阻断步骤。当胶体金标记的探针与捕获探针结合时，胶体金颗粒聚集，出现肉眼可见的红点。
免疫金过滤测定是简单和快速的检测方法，因为除膜和试剂外不需要仪器，并且可在几分钟内通过肉眼观察结果。
在免疫金过滤测定中，微孔膜可以是例如硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜或具有合适孔径的PVDF膜。优选使用硝酸纤维素。合适的孔径为0.2至5μm。
在终点法中，通过终点测定法检测样品中所含的抗体。在终点测定是免疫金过滤测定的情况下，本发明的检测方法的步骤vi)和viii)中提及的基底物是微孔膜，优选硝酸纤维素膜，其涂覆固定的分枝菌酸衍生抗原。在将分枝菌酸衍生抗原固定在微多孔膜上之后，可将步骤i)至v)中预处理的样品级分施加至膜上。在添加样品级分并固定的分枝菌酸衍生抗原与膜上样品中所含的抗体反应后，将胶体金标记的第二抗体添加至膜上在抗原-抗体反应位置中使金颗粒聚集。在聚集的情况下，形成可见的红色或棕色斑点。斑点的强度与抗原和抗体之间的反应量成正比，即与预处理样品中抗体的量成比例。在对照基底物显示出比测试基底物更强的信号的情况下，这表明样品所源自的人的活动性结核病。另一方面，如果对照基底物与测试基底物相比未显示(或只有微不足道的)颜色强度信号的差异，这表明样品所源自的人或动物没有活动性结核病。
在免疫金过滤测定的各个步骤之间，可用合适的缓冲液，例如基于PBS的缓冲液洗涤膜。此类缓冲液可以例如是在生理pH下的水中包含NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和EDTA的PBS/AE缓冲液。这种缓冲液可以是由每升双蒸去离子水(含有1mM EDTA和0.025％(m/v)叠氮化钠)8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4和1.05g Na2HPO4组成的基于PBS的缓冲液，其被调至pH 7.4。
在使用DIGFA的情况下，微孔膜可以以逐点的方式(in a dot wise manner)涂覆有所述分枝菌酸衍生抗原。在DIGFA测定中，步骤i)至vi)中预处理的样品以点的形式施加到膜上。也以点形式添加胶体金标记的第二抗体。在这样的实施方案中，对照和测试基底物优选地是其上固定有分枝菌酸衍生抗原的点的相同微孔膜。本发明的检测方法使得可能在同一膜上同时检测对照和测试级分。这提高了测试的可靠性并且具有成本效益。DIGFA测定是特别优选的，因为在几个膜上的不同位点上，可以固定来自各种分枝杆菌菌株的各种抗原。通过这种方式，有可能提供关于患者感染的分枝杆菌菌株的信息。使用DIGFA的另一个有利方面是可在一次测试中比较源自疑似患有活动性结核病的不同人的样品，因为DIGFA能够以无限量的斑点快速可靠地检测抗体-抗原相互作用，具体取决于膜的尺寸。
抗体和/或其它材料与分枝菌酸抗原结合的检测，例如在DIGFA测定用作检测方法的情况下，可在自动化装置中进行红色染色。各种自动化装置将是本领域技术人员已知的，并且本领域技术人员将能够选择合适的软件工具来进行步骤viii)的测试和对照基底物之间的结合程度或强度的比较，其中任何观察到的较少的与测试基底物的结合是样品中存在针对抗原的抗体的指示剂，所述抗体的存在与样品所源自的人或动物中的活动性结核杆菌相关。在这种情况下，应当理解，可以定性和定量地解释较少者，即较少者结合可被解释为具有较少的结合事件以及具有较弱的结合。
可通过视觉检测技术或任何其它合适的检测技术来检测抗体和/或其它材料与分枝菌酸抗原的结合。在特别优选的实施方案中，可视地进行通过终点测定法的检测，优选用肉眼。这具有易于检测的有利方面，而不需要昂贵和复杂的检测技术。
在使用DIGFA的情况下，可通过肉眼评估抗体和/或其它材料与分枝菌酸抗原的结合。
视觉信号，例如在作为终点测定应用DIGFA测定的情况下的红色染色，也可借助于移动应用程序，即被设计来在诸如平板电脑或智能电话的移动设备上运行的计算机程序来检测。例如，可以使用被设计来比较测试和对照基底物的结合信号并且指示样品所源自的人或动物是否具有活动性结核病的应用程序。
系统
在另一方面，本发明涉及用于实施检测活动性结核病标志物的终点法的系统或设备，优选便携式系统或设备。该系统可被细分为1)用于预处理来自疑似具有活动性结核病的人或动物的样品流，以使样品适合于用本发明的方法进行检测的系统或设备；和2)，使得能够检测预处理样品中所含抗体的相互作用的检测装置。
在一个实施方案中，该系统包含至少一个包含固醇脂质的容器，其排布和配置来接收来自疑似具有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另外的容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及第一检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以接收至少部分第一样品流，和第二检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以接收至少部分第二样品流。
在具体的实施方案中，用于实施检测活性结核病标志物的方法的系统包含至少一个包含固醇脂质的容器，其被排布和配置来接收来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另外的容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及第一检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以从所述另外的容器接收所述第一样品流的至少一部分，和第二检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以从所述又一个另外的容器接收所述第二样品流的至少一部分，其中所述第一和第二检测基底物是微孔膜。
第一和第二检测基底物优选为微孔膜，优选为硝酸纤维素膜。在这种情况下，第一和第二检测基底物在同一膜上具有分开的点，即第一和第二检测斑点。通过这种方式，可使用一张相同的膜来检测抗体/抗原相互作用。这增加了检测的可靠性，并且使得比较测试和对照基底物上检测到的相互作用更容易。此外，这使得能够同时测试多个样品。
检测基底物不必与系统的其它部件物理连接。例如，可将在通过所述另外的和又一个另外的容器之后衍生的样品贮存直到进一步使用或输送至检测基底物。这样，实践者在规划他的测试中有很大的灵活性。例如，这允许收集来自多个受试者的预处理样品，使得可在一个基底物材料上一次全部测试它们。这也使得在相同条件下测试来自多个患者的样品更容易。
因此，在另一方面，本发明涉及系统或设备，优选便携式系统或设备，所述系统或设备用于预处理来自疑似患有活动性结核病的人或动物的品流，以使样品适合于检测方法中的检测，所述系统或设备包含至少一个包含固醇脂质的容器，所述容器被排布和配置来接收来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另外的容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及用于处理样品的贮存或运输的装置。这个或这些装置不需要与分别含有所述第一和第二基底物的容器物理上连接，当系统使用时，位于这些容器的下游，以便接收预处理样品级分。
在一个实施方案中，用于预处理来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流以使得适于用本发明的方法实施检测的样品的系统或设备可包含2个柱子。每个柱子包含两个隔室或容器。上隔室或容器包括涂覆有固醇脂质的基底物，例如涂覆有胆固醇的珠粒。其中一个柱子的下部隔室包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物，并且另一个柱子的下部隔室包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物。
在这一点上，本发明还涉及用于预处理源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的系统，其包含将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；至少第一和第二柱子，其被配置来分别接收所述第一和第二样品流；所述第一柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的另外的隔室，所述另外的隔室包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；并且所述第二柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的又一个另外的隔室，所述又一个另外的隔室包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物；以及用于贮存或运输通过所述柱子的所述处理样品的装置。用于贮存和运输的该装置或这些装置不必与分别包含所述第一和第二基底物的容器物理连接，并且当系统在使用时位于柱子的下游，以便接收预处理的样品级分。
该原理也可应用于实施检测活动性结核病标志物的终点法的系统。在这一点上，本发明还涉及用于实施检测源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中的活动性结核病标志物的方法的系统，其包含用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；至少第一和第二柱子，所述柱子被配置来分别接收所述第一和第二样品流；所述第一柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的另外的隔室，所述另外的隔室包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；并且所述第二柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的又一个另外的隔室，所述又一个另外的隔室包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及第一检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以接收所述第一样品流的至少一部分，和第二检测基底物，其载有固定的分枝菌酸衍生抗原，以接收所述第二样品流的至少一部分。
优选地，所述系统或装置包含连接至第一管道的皮肤穿透端，所述皮肤穿透端被排布和配置来从皮肤穿透端接收血液样品，并将所述血液样品从皮肤部位运送至包含固醇脂质的所述容器/隔室。
在另一个优选实施例中，系统或装置包含与所述第一管道连接的过滤器单元，其用于接收所述血液样品并被配置来从所述全血样品分离血浆。
在另一个实施方案中，系统或装置包含连接至第一管道的皮肤穿透端，其被排布和配置来从皮肤穿透端接收血液样品并将所述血液样品运离皮肤部位；与所述第一管道连接的过滤器单元，其用于接收所述血液样品并被配置来从所述全血样品分离血浆；用于接收所述样品的第一容器，所述第一容器包含固醇脂质；用于将所述样品分成至少第一和第二样品流的装置；用于接收所述第一样品流的第二容器，所述第二容器包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的第三容器，所述第三容器包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物；以及用于贮存或运输处理样品的装置。
通过系统或设备的流优选地由泵，优选连续流动泵驱动，例如蠕动泵或隔膜泵驱动。在应用柱子的情况下，流可通过重力或毛细管作用驱动
皮肤穿透装置可以是从人或动物获得血液样品的任何合适的装置，诸如针注射器等。
第一管具有适合于该设备目的的尺度，即其需要很好地适应皮肤穿透装置和第一容器。
系统或设备的部件，即容器、用于稀释的装置和过滤器单元可通过适当的互连管道相互连接。或者，可这样设计设备的部件，使得它们可以彼此直接连接，并且被例如过滤器分隔，样品但非基底物可选择性通过所述过滤器。本发明中使用的管道的材料可以是测试血液样品领域内的技术人员已知的任何合适的材料。合适的材料对血液/血浆/血清组分是惰性的，包括聚四氟乙烯(例如
Figure BDA0001385347400000291
)、聚丙烯、聚醚酮(PEEK)和聚乙烯。
可在设备的部件之间连接其它部件。可以以互连的管道连接此类其它部件，可将部件直接附接至部件。
用于进行本发明的方法的步骤i-v的系统或子设备还可包含用于稀释血液或血浆的装置。可在含固醇脂质的容器之前，过滤器单元之前，过滤器单元与含固醇脂质的容器之间，含固醇的容器与另外一个(另外的和又一个另外的或(第二和第三))容器之间或所述另外的/又一个另外的或第二/第三容器与用于贮存和运输的装置之间应此类装置。例如，可在所述另外的或第二容器和又一个另外的或第三容器的出口处应用10ml容器。合适的缓冲液可以已经存在于容器中或被添加至该容器中以提供所需的稀释液。这样样品的体积在本发明的方法的大部分步骤中可保持尽可能小，这有利于过程的速度和本发明装置的紧凑性。
过滤器单元可包含过滤器矩阵。为了紧凑化，优选地，在过滤器微芯片上应用过滤器。
容器可以是器皿或通道或管道，诸如螺旋通道或螺旋管。螺旋通道或管道是优选的，因为此类结构在保持长的流动路径的同时几乎不占空间。可以有利地在微芯片上应用螺旋通道或管。这有助于本发明的装置的紧凑性。术语“容器”将被广义地解释，即其可被看作是另一个单元中的限定区域，即隔室，例如柱子的隔室。因此，术语“容器”和“隔室”可在本发明的说明书中互换使用。重要的是含固体脂质的容器和另外一个(另外的和又一个另外的(第二和第三))容器在空间上是分离的。在这一点上，可将含有固醇的容器与所述另外的(或第二)容器一起包括在柱子中，同时将另外的含固醇的容器与又一个另外的(或第三)容器一起包含在柱子中。在本发明的上下文中，用于在测试基底上制备待测试的流的柱子可包含涂覆有固醇脂质的上部(或上游)基底物，所述基底物被屏障隔离，但与没涂覆分枝菌酸衍生抗原的下方(或下游)基底物流体连接。用于在对照基底物上制备待测试的流的柱子可包含涂覆有固醇脂质的上部(或上游)基底物，所述基底物被屏障隔离，但与涂覆有分枝菌酸衍生抗原的下方(或下游)基底物流体连接。应当理解，在本说明书中，与……连接意指待测试的样品可通过所述屏障，同时屏障不允许基底物通过。适用于此类柱子的基底物是珠粒。在这一点上，用于预处理来自疑似具有活动性结核病的人或动物的样品流以使样品适于用本发明的方法检测的本发明的系统的实施方案，包含至少第一和第二柱子，所述柱子被配置来分别接收所述第一和第二样品流，所述第一柱子包含含有固醇脂质的容器和含有载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物的所述另外的容器，所述第二柱子包含含有固醇脂质的容器和含有不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物的所述又一个另外的容器。
容器的材料优选相同，合适的材料可以是bk-7玻璃、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚醚酮或聚乙烯。两个容器之间的边界可以是不允许基底物材料通过但允许样品流通过的过滤器。容器的基底物必须是对样品的分子的非特异性结合是惰性的材料，例如bk-7玻璃、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯聚醚酮或聚乙烯。基底物可呈珠粒(任选地交联的珠粒，例如聚苯乙烯珠粒)的形式。
本发明的系统包含含有载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器(第二容器)和含有不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器。只要不发生非特异性结合，后一容器可具有惰性涂层或无涂层而非固定化的分枝菌酸衍生抗原。
用于贮存或运输处理样品的装置可以是小瓶，其中样品被贮存用于进一步分析，例如通过点免疫金过滤测定。或者，装置可以通过移液器形成，所述移液管可用于将本发明方法的步骤i)-v)中处理的样品级分转移至终点测定的具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，例如在点免疫金过滤测定中作为点转移至斑点级分。
可将装置/系统连接至任何合适的自动分析装置，诸如具有合适的软件程序的计算机，以进行基底物上分枝菌酸抗体与固定的抗原结合的比较。
根据权利要求32的系统的示例性实施方案示于图2中。
图2显示了连接至第一管道102的皮肤穿透针1，所述管道被排布和配置来从针101接收血液并且将一定量的血液从皮肤部位运走。管道101连接至过滤器单元103。该过滤器单元用于从所述全血样品中分离血浆。过滤器单元103经管道113连接至第一容器104，第一容器104呈螺旋形通道的形式，所述通道的内壁涂覆有固醇脂质。螺旋通道经由管道114与呈被动阀分流点形式的用于分流血浆105的装置连接。分流点的一个分支经由管道116与第二容器106连接，用于接收第一血浆流，其包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物。分流点的另一分支经由管道115与第三容器107连接，其用于接收第二血浆流，包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物。该实施方案中的容器106和107处于螺旋通道中，所述通道的内壁涂覆有分枝菌酸衍生抗原(容器106)或未涂覆有分枝菌酸衍生抗原(容器107)。容器106和107分别经由管道117和118与稀释容器111和112分别连接。这些容器可预先填充有合适的稀释缓冲液，所述容器包含入口121、122，用于引入稀释缓冲液。稀释容器121和122可经由相应的管道119和120分别连接至用于存储或运输的装置108和109。或者，稀释容器121和122可经由相应的管道119和120连接至具有固定的分枝菌酸衍生抗原的测试和对照基底物，在终点测定中测试所述基底物。
试剂盒
在另一方面，本发明涉及用于诊断结核病或预处理样品用于诊断结核病的试剂盒，其包含一个或多个皮肤穿透装置；一个或多个管道；涂覆有固醇脂质，任选地磷脂酰胆碱、果胶、两性霉素B或β-环糊精的一个或多个容器；一个或多个包含具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器；一个或多个包含不具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器；任选地一个或多个用于运输和贮存样品的容器；任选地用于稀释血液或血浆的装置和/或过滤器单元；至少一张其上固定有分枝菌酸衍生抗原的微孔膜，以及任选地第二抗体(优选胶体金标记第二抗体)，所述第二抗体与源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中包含的针对分枝菌酸衍生抗原的抗体的重链结合。
在优选实施方案中，试剂盒包含：一个或多个皮肤穿透装置；一个或多个管道；一个或多个柱子，其包含含有涂覆有固醇脂质(任选地磷脂酰胆碱)、果胶、两性霉素B或β-环糊精的基底物的隔室和在含有涂覆有固醇脂质的基底物的所述隔室下方的含有涂覆有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的隔室；一个或多个柱子，其包含含有涂覆有固醇脂质(任选地磷脂酰胆碱)、果胶、两性霉素B或β-环糊精的基底物的隔室和在含有涂覆有固醇脂质的基底物的所述隔室下方的含有未涂覆有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的隔室；任选地用于运输和贮存样品的一个或多个容器；任选地用于稀释血液或血浆的装置和/或过滤器单元；任选地至少一个其上固定有分枝菌酸衍生抗原的微孔膜，以及任选地第二抗体，所述第二抗体与源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中包含的针对分枝菌酸衍生抗原的抗体的重链结合。
试剂盒还可包含将根据本发明的方法的步骤i)至v)预处理的样品级分转移至微孔膜的一个或多个装置，例如移液管和移液管附件，诸如移液管吸头。
试剂盒还可包含贮存根据步骤i)至v)预处理的样品级分以用于进一步使用的一个或多个装置，诸如小瓶或管。
试剂盒还可包含组装部件的工具，例如螺钉、夹具、胶水、胶带、螺丝刀等。
试剂盒还可包含在血液分析期间稀释血液或血浆的装置，诸如可在第二和第三容器的出口处应用的容器(例如10ml)。合适的缓冲液可以已经存在于容器中或被添加至该容器中以提供所需的稀释液。
试剂盒的部件使得将进行结核病诊断测试的人能够现场，即在护理点组装本发明的系统。因此，应当理解，试剂盒的部件具有与上面针对本发明的系统所解释的相同的特性和优选性质。本发明的系统通过本发明的试剂盒的部件来容易地组装，即不需要专门的技术背景。可方便地为该试剂盒提供组装和使用说明书。
固醇脂质
在本发明的说明书中使用的固醇脂质优选为胆固醇或其衍生物。固醇脂质也可以是固醇修饰的磷脂。这种固醇修饰的脂质可以是固醇修饰的磷脂，例如固醇修饰的磷脂酰胆碱脂质或甘油磷脂。在这种固醇修饰的脂质中，固醇优选为胆固醇。适用于本发明目的的固醇修饰的脂质的一个良好的实例是1-棕榈酰-2-胆固醇基碳酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
优选将固醇脂质固定在表面上。一个实例是具有含有胆固醇或胆固醇酯的涂层的基底物，其中胆固醇酯是胆固醇亚油酸酯，其中亚油酸与胆固醇的重量比在1:3至1:20的范围内。
也可用与其它分子组合的固醇脂质，优选胆固醇涂覆基底物。
优选地，所述固醇脂质是与磷脂酰胆碱一起固定在基底物上的胆固醇。固醇脂质从血液/血浆/血清中清除掉抗胆固醇抗体，否则这些抗体与基底物上的分枝菌酸抗原交叉反应并导致结核病的假阳性诊断。磷脂酰胆碱会与血液样品中的疏水性物质结合，使得样品在暴露后更具亲水性。所得的亲水性样品将在随后的方法步骤中更容易处理，并且不太容易凝结。
在一个实施方案中，固醇脂质，优选胆固醇与果胶一起固定在基底物(例如，管道的内壁)上。在该实施方案中，固醇脂质从血液/血浆/血清清除掉抗胆固醇抗体，否则所述抗体将与基底物上的分枝菌酸抗原交叉反应并导致结核病的假阳性诊断。另外，果胶清除样品中的胆固醇，从而也清除掉胆固醇抗体。这导致更高的检测可靠性。
或者，固醇脂质，优选胆固醇与血液来源的样品中的与胆固醇结合的化合物诸如胆固醇结合杂多糖(诸如β-环糊精、果胶、两性霉素B或糊精)被固定在一起。此类分子清除掉样品中的胆固醇，从而也清除胆固醇抗体。这导致更高的检测可靠性。
例如固醇脂质，优选胆固醇与β-环糊精或果胶、两性霉素B一起被固定在基底物(诸如中空纤维聚丙烯膜或玻璃)上。
已知许多方法将固醇脂质特别是胆固醇固定在基底物上。本领域技术人员将能够选择适合于用于他的特定涂层的方案。例如，可通过以下方式涂覆涂层：首先将胆固醇溶解在有机溶剂中并进一步将溶解的胆固醇稀释在乙醇溶液中，允许所述溶液在容器内就地蒸发，用缓冲盐水漂洗涂覆的容器，风干该容器，并将容器与干燥剂密封在防水汽袋中。
分枝菌酸衍生抗原
分枝菌酸衍生抗原可衍生自选自毒性和致病性分枝杆菌的分枝杆菌。优选地，分枝菌酸抗原来源于结核分枝杆菌。所述分枝菌酸衍生抗原是选自分枝菌酸、索状因子、化学修饰的分枝菌酸、化学修饰的索状因子、合成分枝菌酸衍生物、合成索状因子衍生物中的至少一种。
分枝菌酸衍生物的天然来源包括分枝杆菌属诸如结核分枝杆菌的细胞壁，包括不同种类的化合物和不同分枝菌酸同系物(通常作为其中它们结合于细胞的细胞壁上的衍生物)的混合物。
除了分枝菌酸本身之外，分枝杆菌属的细胞还含有衍生自酸的化合物，诸如分枝菌酸的糖酯。天然存在的糖酯包括例如海藻糖-6,6'-二分枝酸酯，通常称为TDM，也称为“索状因子”；和海藻糖单分枝菌酸酯(通常称为TMM)。这些糖酯在自然界中作为不同种类的分枝菌酸的复杂混合物和每个种类内的不同同系物的复杂混合物存在。
由于难以确定天然产物中存在的索状因子的身份和难以分离单个分子种类，所以为了本发明的目的，优选使用半合成或更优选合成分枝菌酸衍生物。另外，已知分枝菌酸单元的结构影响索状因子的生物活性。因此，当在本发明中使用天然分枝菌酸衍生物时，这些衍生物之间的生物学活性的差异以及从而样品中抗原的抗体的结合的检测可导致检测结果的不可预测性和不确定性因素。另外，制备天然分枝菌酸衍生物制备中的偏差可导致关于不同测试批次的可再现性的问题。
因此，为了能够提供具有高可靠性和可再现结果的检测，优选使用半合成或甚至更优选合成的分枝菌酸衍生物，所述衍生物与天然混合物中发现的单一化合物相同或非常相似。
合适的半合成衍生物包括可通过将分枝菌酸附接至糖基团而制备的半合成索状因子。然而，这些半合成因子仍然包含不同同系物的混合物。
因此，在本发明的说明书中使用的特别合适的分枝菌酸衍生物是合成索状因子，例如WO 2010/08667中描述的合成索状因子，即式(M)x(S)y(M')z的化合物，其中x为1至6，y为1至12，z为0至10，每个M和每个M'独立地为包含β-羟基酸部分的分枝菌酸残基，并且每个S为单糖单位。
分枝菌酸抗原可呈选自均一和异质化合物混合物的形式。分枝菌酸衍生抗原可以例如与磷脂诸如磷脂酰胆碱组合使用。
可以以本领域技术人员已知的各种方式将分枝菌酸抗原固定在基底物上。合成分枝菌酸衍生抗原可用使得能够固定至基底物材料上的特定活性基团合成。
例如，为了固定在二氧化硅上，可应用甲硅烷偶联化学。
在硝酸纤维素基底物的情况下，可如下适当地固定分枝菌酸衍生抗原。可以以冻干形式获得分枝菌酸衍生抗原，将其在溶剂混合物例如氯仿:甲醇:水混合物中复溶，并稀释至几纳摩尔的数量级的浓度，例如1nM度。然后可将该稀释物点样在硝酸纤维素膜上，其中每个斑点以预定距离例如1cm相间隔。在干燥斑点之后，将分枝菌酸衍生抗原固定在膜上。替代的固定化方法可以例如涉及将抗原溶解在己烷或热PBS中以形成抗原涂覆溶液，然后将溶液点样在膜上。
实施例
以下实施例旨在说明本发明的原理，而不应被解释为限制权利要求的范围。在该实施例中，在ELISA测定中测试人血清样品的针对分枝菌酸衍生物的抗体。作为检测方法，选择ELISA方法是因为其不如例如表面等离体共振或电化学阻抗谱(EIS)或环形共振(Interferometry)敏感。因此，可得出结论，如果使用ELISA获得满意的结果，则也可用更灵敏的检测方法获得这些结果。
材料：
·样品(人血浆或血清)
·0.2微米自旋滤器(Whatman)
·分枝菌酸和胆固醇偶联珠
·溶于己烷中的多克隆分枝菌酸
·聚苯乙烯ELISA板
·PBS
·封闭缓冲液：0.5％的PBS中的酪蛋白
·一步超TMB-ELISA基底物溶液(Thermo Scientific)
·2M硫酸
·第二抗体：兔抗-人Ig HRP(DAKO)
程序
ELISA板的涂覆
向96孔ELISA板的各孔中添加50μl的具有浓度为3μg/ml的多克隆分枝菌酸的己烷。无分枝菌酸的己烷用作对照。在4℃下将板培养24小时，随后用PBS洗涤2次。
珠粒的制备
在本实施例中，珠粒用作基质，代表本发明方法的步骤ii)、iv和v)中提及的基底物。
为了本实施例的目的，使用Toyopearl AF-Amino-650M珠(Tosoh Bioscience)。按照制造商的说明书制备珠粒。基本上如Abdel-Magid AF等所述(Reductive Amination ofAldehydes and Ketones with Sodium Triacetoxyborohydride.Studies on Direct andIndirect Reductive Amination Procedures.J.Org.Chem.1996:61；3849-3862)，通过将7-酮基胆固醇(100mg，0.25mmol)和Toyopearl浆料(2.5ml，0.25mmol反应性基团)在乙腈(3.5ml)中混合，然后用三乙酰氧基硼氢化钠(80mg，0.375mmol)处理来将作为胆固醇的7-酮基胆固醇缀合于珠粒。将混合物在室温下在N2气氛下搅拌1.5小时。之后，通过添加饱和NaHCO3水溶液猝灭反应混合物。将珠粒用H2O、1M NaCl，最后用H2O充分洗涤，以除去过量的配体。之后，通过在0℃下向树脂中加入8ml 0.2M乙酸钠和4ml乙酸酐使残余氨基乙酰化30分钟，随后加入另外4ml乙酸酐，并在25℃温育30分钟。
基本上如Law B,Jenner WN.Immunoassay:A Practical Guide.London:Taylor&Francis.2005：第11-31页和Hermanson GT.Bioconjugate Techniques.第3版London；Elsevier.2013：第535-545页中所述，将作为分枝菌酸的天然存在的分枝菌酸异构体(Mw～1100-1300)的混合物用于与珠粒偶联。简言之，将N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸(EDC.HCl)(57.7mg，0.3mmol(1.2当量))和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(81.3mg，0.625mmol(2.5当量))添加至胺(Toyopearl氨基活化的，2.5mL，0.25mmol反应性基团)、酸(石胆酸：93.8mg，0.25mmol(1当量)/分枝菌酸：300mg，0.25mmol(1当量))和HOBt(1-羟基苯并三唑水合物)(40.5mg，0.3mmol(1.2当量))于DMF(2.5mL(10ml/1mmol)中的溶液中，并在室温下在氮气下搅拌/摇动24小时。通过蒸发除去溶剂，并用水和1M NaCl以及水洗涤珠粒。使用乙酰化封闭过量(未结合的)氨基。使用水、1M NaCl和水洗涤珠粒。首先，产生具有氮气或氩气的惰性气氛。试剂的顺序：分枝菌酸与DMF(0℃)，然后(HOBt)，10分钟后珠粒，10分钟后碱(DIPEA)，最后15分钟后EDC。
样品制备
将源自已知患有结核病的人的血清在封闭缓冲液中以1:5稀释。使用的样品来源于涂片阳性和涂片阴性患者。获得两个0.5ml的级分，并将其各自转移至0.2微米的旋转过滤器中，并以10000g离心。在封闭缓冲液中将流通从1:5合并为1:20。
将250μl流通添加至用胆固醇、多克隆分枝菌酸或封闭试剂涂覆的珠粒上。在室温下搅拌珠粒。温育后，将珠粒快速离心沉淀，将上清液用作样品。在该特定设置中用珠粒对样品进行的总体预处理(根据本发明的方法的步骤i)-v))在少于10分钟内进行，之后可以直接进行分析。
ELISA-程序
为了阻断抗体与ELISA板的孔中的分枝菌酸的非特异性结合，向每个孔中添加300μl封闭缓冲液并温育1小时。随后，用45μl样品替代封闭缓冲液。将封闭缓冲液用作阴性对照。温育后，将板用PBS洗涤三次。用封闭缓冲液中的缀合有HRP的第二抗体替代洗涤PBS缓冲液。温育后，将板用PBS再次洗涤三次。随后将50μl/孔的TMB-ELISA基底物溶液添加至孔中，并在室温下温育15-30分钟。通过添加50μl/孔的2M硫酸终止反应。测量450nm处的吸光度以定量抗体与ELISA板的分枝菌酸基底物的结合。
样品处理
如下处理样品。
1.在第一比较研究中，从源自不同人的6个样品中的每一个中获取两个级分(1和2)。将所有级分与无任何试剂偶联的珠粒(级分1和2)一起单独温育并贮存直至ELISA检测。测定从每个级分获得的平均ELISA信号。两个级分都有相同的结果。将这两个级分的ELISA信号设置为100％。
2.在第二比较研究中，从上述6个样品中的每一个获取两个级分(3和4)。将级分3的样品与仅用封闭试剂偶联的珠粒一起单独温育，随后贮存直至ELISA检测。将级分4的样品与用胆固醇偶联的珠粒单独温育，随后贮存直至ELISA检测。
3.在第三比较研究中，从上述6个样品中的每一个获取两个级分(5和6)。将级分5的样品与用胆固醇偶联的珠粒一起单独温育，随后贮存直至ELISA检测。首先将级分6的样品与用胆固醇偶联的珠粒单独温育，随后将样品快速旋转，并将上清液用于与多克隆分枝菌酸偶联的珠粒的第二次温育。随后贮存样品直至ELISA检测。
4.在进一步的研究中，从上述6个样品中的每一个获取两个级分(7和8)。将两个级分7和8与偶联胆固醇的珠粒和作为基底物的偶联多克隆分枝菌酸的珠粒一起同时温育，随后贮存直至ELISA检测粒。
除珠粒的差异外，所有其它条件都是相同的。
结果
测定从6个样品的每个级分获得的平均ELISA信号。级分1和2的ELISA信号相同，并被设定为100％。其它级分的ELISA信号以下表I中级分1(或2)的信号的百分比表示。
表I ELISA结果
级分 ELISA信号
级分1 100％
级分2 100％
级分3 81％
级分4 68％
级分5 73％
级分6 54％
级分7 96％
级分8 96％
这些结果表明，首先暴露于固醇脂质，随后暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的样品(级分6的样品)具有比测试的任何另外的级分低的ELISA信号。在级分5与6之间可以看出明显的差异，该比较研究可被视为根据本发明检测活动性结核病标志物的终点法的示例性实施方案。令人惊讶的是，从级分6获得的低ELISA信号不能通过将样品与偶联胆固醇的珠粒和偶联多克隆分枝菌酸的珠粒同时温育来获得。事实上，级分7和8的ELISA信号甚至高于单独的偶联封闭剂的珠粒或偶联胆固醇的珠粒的ELISA信号。当将级分暴露于单独的偶联分枝菌酸的珠粒时，也不能获得令人满意的结果。由此可以看出，重要的是，在1)暴露于固醇脂质和2)暴露于分枝菌酸衍生物的两个随后的步骤中进行样品的预处理，获得相较于未曾暴露于分枝菌酸衍生物的对照样品最显著减弱的信号和因此的抗体结合。
另外，从该实施例可以看出，在该特定设置中，用珠粒对样品进行的总体预处理(根据本发明的方法的步骤i)-v))可在少于10分钟内发生，之后可直接进行分析。
分析所需的时间取决于所应用的检测测定。如上所述，替代利用ELISA的分析，其它检测方法是可能的。如上所述预处理的样品可使用任何合适的无标记技术进行分析。本发明人已特别发现，当应用电化学阻抗谱(EIS)时，可以在数秒内检测样品中存在的抗体对检测基底物的结合。这使得有可能以快速和可靠的方式确定个体是否感染了活动性结核病，从而允许在少于10分钟内检测结核病。

Claims (35)

1.用于预处理来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品的方法，其包括以下步骤：
i)从疑似患有活动性结核病的人或动物提供样品；
ii)将所述样品暴露于固醇脂质，其中所述固醇脂质固定在基底物上，其中所述固醇脂质是胆固醇或其衍生物，且其中所述固醇脂质从所述样品中清除掉抗胆固醇抗体；
iii)在将所述样品暴露于所述固醇脂质之前或之后获得所述样品的至少两个级分；
iv)将所述暴露于固醇脂质的级分中的第一级分暴露于载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
v)将所述暴露于固醇脂质的级分中的第二级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；或贮存所述级分中的第二级分的至少一部分以用于进一步使用，省略将所述级分中的第二级分暴露于不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的步骤。
2.权利要求1的方法，其中在步骤iv)和v)中暴露后，至少一部分暴露的样品级分被贮存以供进一步使用。
3.权利要求1至2中任一项的方法，其中所述分枝菌酸衍生抗原是选自分枝菌酸、索状因子、化学修饰的分枝菌酸、化学修饰的索状因子中的至少一种。
4.权利要求1至2中任一项的方法，其中所述分枝菌酸衍生抗原是选自合成分枝菌酸衍生物和合成索状因子衍生物中的至少一种。
5.权利要求1的方法，其中将所述固醇脂质固定在基底物上，所述基底物包含所述固醇脂质和结合样品中的胆固醇的化合物。
6.权利要求5的方法，其中所述结合样品中的胆固醇的化合物为果胶、两性霉素B或β-环糊精。
7.权利要求1的方法，其中将所述固醇脂质固定在基底物上，所述基底物包含所述固醇脂质和磷脂酰胆碱。
8.用于实施检测活动性结核病标志物的方法的系统或设备，包含至少一个包含固醇脂质的容器，其中所述固醇脂质固定在基底物上，其中所述固醇脂质是胆固醇或其衍生物，所述容器被排布和配置来接收来自疑似具有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另外的容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一检测基底物，以接收来自所述另外的容器的第一样品流的至少一部分，和载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二检测基底物，以接收来自所述又一个另外的容器的第二样品流的至少一部分。
9.权利要求8的系统或设备，其是用于实施检测活动性结核病标志物的方法的便携式设备，其包含
-生物传感器(8)，其包含用于接收所述第一样品流的第一室(9)，所述第一室与所述另外的容器(6)连接，包含所述载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一检测基底物，和用于接收所述第二样品流的第二室(10)，所述第二室与所述又一个另外的容器(7)连接，并且包含所述载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二检测基底物，其基底物与第一基检测基底物的基底物相同。
10.权利要求9的系统或设备，其包含
-连接至第一管道(2)的皮肤穿透端(1)，其被排布和配置来接收来自皮肤穿透端(1)的血液样品，并将所述血液样品运离所述皮肤部位；
-与所述第一管道(2)连接的过滤器单元(3)，其用于接收所述血液样品并被配置来从全血样品分离血浆；
-用于接收所述样品的第一容器(4)，所述第一容器(4)包含所述固醇脂质；
-用于将所述样品分成至少第一和第二样品流的装置(5)；
-用于接收所述第一样品流的第二容器(6)，所述第二容器包括载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；
-用于接收所述第二样品流的第三容器(7)，所述第三容器包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物；以及
-生物传感器(8)，其包含用于接收所述第一样品流的第一室(9)，所述第一室与所述第二容器(6)连接，包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物，和用于接收所述第二样品流的第二室(10)，所述第二室与第三容器(7)连接，并且包含与所述第一室(9)相同的载有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物。
11.权利要求10的系统或设备，其还包含过滤器单元(3)，其与所述第一管道(2)和所述第一容器(4)连接，并且被配置来从全血样品分离血浆。
12.权利要求11的系统或设备，其中所述过滤器单元(3)包括过滤器矩阵。
13.权利要求10至12中任一项的系统或设备，其中所述第一和第二室(9，10)的基底物是二氧化硅基础的。
14.权利要求13的系统或设备，其中所述生物传感器包括Si环形共振器。
15.权利要求8至12中任一项的系统或设备，其用于检测活动性结核病标志物的方法，其中使用表面等离子体共振、电化学阻抗谱、等温滴定量热法、生物层干涉测量法、光栅、光子晶体、声共振分析、或石英晶体微量天平进行检测。
16.权利要求14的系统或设备，其用于检测活动性结核病标志物的方法，其中使用利用Si环形共振器的生物传感器芯片进行检测。
17.用于预处理来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的系统或设备，其包含至少一个包含固醇脂质的容器，所述容器被排布和配置来接收来自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流；用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；所述装置连接在所述至少一个包含固醇脂质的容器的上游或下游；用于接收所述第一样品流的另外的容器，其在下游与包含固醇脂质的所述容器连接，并且包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；用于接收第二样品流的又一个另外的容器，其与所述另外的容器平行配置并在下游与包含固醇脂质的所述容器连接；并且包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及用于处理样品的贮存或运输的装置，其中所述固醇脂质为胆固醇或其衍生物。
18.用于预处理源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品流的系统或设备，其包含将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；至少第一和第二柱子，其被配置来分别接收所述第一和第二样品流；所述第一柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的另外的隔室，所述另外的隔室包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；并且所述第二柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的又一个另外的隔室，所述又一个另外的隔室包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物；以及用于贮存或运输通过所述柱子的所述处理样品的装置，其中所述固醇脂质为胆固醇或其衍生物。
19.用于实施检测源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中的活性结核病标志物的方法的系统或设备，其包含用于将所述样品流分成至少第一和第二样品流的装置；至少第一和第二柱子，所述柱子被配置来分别接收所述第一和第二样品流；所述第一柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的另一个隔室，所述另一个隔室包含载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一基底物；并且所述第二柱子包含含有固醇脂质的隔室和处于含有固醇脂质的所述隔室下游的又一个另外的隔室，所述又一个另外的隔室包含不载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二基底物，以及载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第一检测基底物，以接收所述第一样品流的至少一部分，和载有固定的分枝菌酸衍生抗原的第二检测基底物，以接收所述第二样品流的至少一部分，其中所述固醇脂质为胆固醇或其衍生物。
20.权利要求18或19的系统或设备，其中将所述固醇脂质固定在珠粒上，并且所述第一和第二基底物是珠粒。
21.权利要求8-12或19中任一项的系统或设备，其中所述第一和第二检测基底物是微孔膜。
22.权利要求21的系统或设备，其中所述微孔膜为硝酸纤维素膜。
23.权利要求21的系统或设备，其中所述第一和第二检测基底物由相同膜上的分开的斑点形成。
24.权利要求22的系统或设备，其中所述第一和第二检测基底物由相同膜上的分开的斑点形成。
25.权利要求20的系统或设备，其中所述第一和第二检测基底物是微孔膜。
26.权利要求25的系统或设备，其中所述微孔膜为硝酸纤维素膜。
27.权利要求25或26的系统或设备，其中所述第一和第二检测基底物由相同膜上的分开的斑点形成。
28.权利要求8-12或19中任一项的系统或设备，用于终点测定，其选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、放射性标记测定、光子光谱测定、免疫荧光、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、电化学阻抗谱、或免疫金过滤测定。
29.权利要求8-12或19中任一项的系统或设备，用于点免疫金过滤测定(DIGFA)。
30.权利要求20的系统或设备，用于终点测定，其选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、放射性标记测定、光子光谱测定、免疫荧光、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、电化学阻抗谱、或免疫金过滤测定。
31.权利要求20的系统或设备，用于点免疫金过滤测定(DIGFA)。
32.权利要求8-12或17-19中任一项的系统或设备，其中将所述固醇脂质固定在基底物上，所述基底物包含所述固醇脂质和结合样品中的胆固醇的化合物。
33.权利要求32的系统或设备，其中所述结合样品中的胆固醇的化合物为果胶、两性霉素B或β-环糊精。
34.用于诊断结核病或预处理样品用于诊断结核病的试剂盒，其包含：
-一个或多个皮肤穿透装置；
-一个或多个管道；
-一个或多个涂覆有固醇脂质和任选地磷脂酰胆碱、果胶、两性霉素B或β-环糊精的容器；
-一个或多个包含具有和不具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物的容器；
-一个或多个用于运输和贮存样品的容器和/或至少一个在其上固定有分枝菌酸衍生抗原的微孔膜，以及任选地第二抗体，其与源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中包含的针对分枝菌酸衍生抗原的抗体的重链结合；或一个或多个生物传感器，所述生物传感器包含至少两个室，该室包含具有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；以及
-任选地用于稀释血液或血浆的装置和/或过滤器单元；
其中所述固醇脂质为胆固醇或其衍生物。
35.用于诊断结核病或预处理样品用于诊断结核病的试剂盒，其包含：
-一个或多个皮肤穿透装置；
-一个或多个管道；
-一个或多个柱子，所述柱子包含含有基底物的隔室，所述基底物涂覆有固醇脂质和任选地磷脂酰胆碱、果胶、两性霉素B或β-环糊精；和处于包含涂覆有固醇脂质的基底物的所述隔室下方的隔室，所述隔室包含涂覆有固定的分枝菌酸衍生抗原的基底物；
-一个或多个柱子，其包含含有基底物的隔室，所述基底物涂覆有固醇脂质和任选地磷脂酰胆碱、果胶、两性霉素B或β-环糊精；和处于包含涂覆有固醇脂质的基底物的所述隔室下方的隔室，所述隔室包含未用固定的分枝菌酸衍生抗原涂覆的基底物；
-任选地一个或多个用于运输和贮存样品的容器；
-任选地用于稀释血液或血浆的装置和/或过滤器单元；
-任选地至少一张其上固定有分枝菌酸衍生抗原的微孔膜；
-以及任选地第二抗体，其结合源自疑似患有活动性结核病的人或动物的样品中包含的针对分枝菌酸衍生抗原的抗体的重链；
其中所述固醇脂质为胆固醇或其衍生物。
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