KR20170102344A - 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법 - Google Patents

활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법 및 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 휴대용 디바이스에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 시스템, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 방법, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 시스템 및 이러한 방법을 수행하는 키트에 관한 것이다.

Description

활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법
본 발명은 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법 및 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 휴대용 디바이스에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 시스템, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 방법, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 시스템 및 이러한 방법을 수행하는 키트에 관한 것이다.
도입
결핵균은 마이코박테리움과 내의 병원성 박테리아 종 및 대다수 케이스의 결핵(TB)의 병원체이다.
2013년 900만 명의 사람들이 결핵을 앓았으며, 이들 중 150만 명은 HIV를 가지고 있다. 2013년에, 150만 명의 사람들이 결핵으로 사망하였으며, 여기에는 HIV 양성인 36만 명의 사람들이 포함되었다. 결핵은 세계적으로 여성이 사망하는 상위 3가지 요인 중 하나이며, 2013년에는 51만 명의 여성이 결핵으로 사망하였다. 특히 HIV 양성인 사람들 중 결핵으로 사망한 사람의 50%가 여성이었다. 적어도 55만 명의 어린이가 결핵을 앓았으며, 2013년에는 HIV 음성인 8만 명의 어린이가 결핵으로 사망한 것으로 추정된다. 전 세계적으로, 2013년에 48만 명의 사람들에게 다제내성 결핵(MDR-TB)이 발생한 것으로 추정되며 MDR-TB로 인해 21만 명이 사망한 것으로 추정된다. 광범위 약제내성 결핵(XDR-TB)의 적어도 하나의 케이스가 2013년 말까지 100개 국가에서 보고되었다. 평균적으로, MDR-TB 케이스 중 9%가 XDR-TB를 갖는 것으로 추정된다.
따라서 결핵을 진단하는 신뢰 가능하고 빠른 방법이 가장 중요하다.
결핵을 진단하는 몇몇 방법이 개발되었지만, 모든 방법은 각각 단점을 가진다. 면역 반응이 억제된 사람들에게서 질병의 진단과 같이 단지 징후와 증상에만 기초하여 활동성 결핵을 진단하는 것은 어려운 일이다. 결핵 피부 검사(망투 투베르쿨린 피부 검사로도 지칭됨), 결핵 혈액 검사(인터페론-감마 방출 분석 또는 IGRA로도 지칭됨) 및 흉부방사선촬영(X-ray), 및 객담 도말(sputum smear) 상의 세침흡인검사법(AFB)의 존재의 검사는 수일 내에 감염된 개인들 중 일부를 나타낸다. 결핵의 확정적 진단은 임상적 샘플(예를 들어, 객담, 고름, 또는 조직 생담) 내의 결핵균을 식별함으로써 이루어진다. 그러나 이러한 느린 성장 유기체를 위한 어려운 배양 프로세스는 혈액 또는 객담 배양에 대해 2 내지 6주가 소요될 수 있다.
결핵균에 감염된 사람 또는 동물은 일반적으로 마이코박테리움에 대항하는 항체를 생산한다. 감염된 개인으로부터 획득된 샘플 내의 이러한 항체의 존재는 감염을 나타낸다. WO 2005/116654는 이러한 원리에 기초한 방법을 기술하며 활동성 결핵의 표시자의 검출을 개시한다. WO 2005/116654의 방법은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 피검체로부터 제1, 제2 및 제3 샘플을 획득하는 단계, 제1 샘플을 희석하고 이것의 일부를 검사 용기 내의 고정된 미콜산 항원에 노출시키고 이것의 일부는 제어 용기 내의 고정된 미콜산 항원에 노출시키는 단계를 포함한다. 제2 샘플은 미콜산 항원 함유 리포솜에 노출되며 제3 샘플은 미콜산 항원을 함유하지 않은 리포솜에 노출된다. 제2 샘플은 검사 용기에 추가되고 제3 샘플은 제어 용기에 추가되며, 검사 용기 및 제어 용기 내의 미콜산 및 항원에 대한 항체의 결합이 검출된다. 검사 용기와 제어 용기 사이의 결합 정도가 비교되며 검사 용기 내의 더욱 약한 결합은 미콜산 항원에 대한 항체의 존재의 표지이다.
추가의 발전이 활동성 결핵의 진단을 위해 항원 특정 생체표시자 항체를 검출하는 방법을 개시한 WO 2013/186679에서 기술되었으며, 이 방법은: 스테롤-수식된 지질 및 정제된 마이코박테리아 지질 세포벽 성분 또는 그의 유사물 또는 파생물을 포함하는 리포솜을 포함하는 지질 항원 제시 리포솜 조성을 제공하는 단계; 정제된 마이코박테리아 지질 세포벽 성분 또는 그의 유사물 또는 파생물을 포함하는 고정된 미콜산 항원을 생산하도록 리포솜을 고정하는 단계; 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 제1, 제2 및 제3 샘플을 획득하는 단계로서, 이때 각 샘플은 항원에 대한 항체를 함유할 수 있고, 제1 샘플은 제2 및 제3 샘플보다 희석에 의해 낮은 농도를 가지는, 샘플 획득 단계; 제1 샘플의 일부를 검사 용기 내의 고정된 미콜산 항원에 노출시키는 단계; 제1 샘플의 일부를 제어 용기 내의 고정된 미콜산 항원에 노출시키는 단계; 제2 샘플을 제1 단계에서 제공된 지질 항원 제시 리포솜 조성에 노출시키는 단계; 제3 샘플을 미콜산 항원을 함유하지 않는 리포솜에 노출시키는 단계; 제1 단계에서 제공된 미콜산 항원 함유 리포솜 조성으로의 노출 후에, 제2 샘플을 검사 용기에 추가하는 단계; 미콜산을 함유하지 않은 리포솜으로의 노출 후에, 제3 샘플을 제어 용기에 추가하는 단계; 검사 용기 및 제어 용기 모두에서 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 실시간으로 검출하는 단계; 및 검사 용기와 제어 용기 사이의 결합 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하며, 검사 용기 내의 더욱 약한 결합은, 샘플이 유래한 사람 또는 동물에 활동성 결핵이 있음을 나타내는 샘플 내의 미콜산 항원에 대한 항체의 존재의 표지(indicator)이다.
WO 2005/116654 및 WO 2013/186679에 기술된 방법들은 결핵을 진단하기 위한 신뢰 가능한 방법을 제공하지만, 몇몇 단점을 가진다. 첫째, WO 2005/116654 및 WO 2013/186679에 기술된 방법들은 동일한 피검체로부터 여러 개의 샘플을 제공할 것을 요구한다. 둘째, 이들 방법은 여러 번의 희석 단계 및 서로 다른 비접속 컴파트먼트(compartment)로의 여러 번의 샘플 이동 단계를 요구하며, 이는 복잡하고 큰 장비 부분들의 세트를 필요로 한다. 셋째, 이들 방법은 샘플의 개별 배양 단계들 및 이것의 희석 단계 및 결과적으로 여러 번의 개별 측정을 포함한다. 이러한 이유로 인해 WO 2005/116654 및 WO 2013/186679의 방법들은 복잡하고 시간 소비적이다. 사실, WO 2005/116654 및 WO 2013/186679에 개시된 방법들을 이용하여 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 피검체로부터 샘플을 획득하는 것으로부터 개인이 활동성 결핵에 감염되었는지를 결정하기까지 소요되는 총 시간은 샘플당 최소 2시간으로 추정된다. 또한, 위의 방법이 복잡하고 큰 장비 부품들의 세트를 필요로 하기 때문에, 이러한 방법들은 병원 환경에서 유용할 수 있지만, 예를 들어 개발도상국과 같이 병원 및 잘 발달된 의료서비스가 부족한 지역에서는 유용하지 않을 수 있다. 특히 이러한 국가들에서 결핵이 가장 만연하며, 신뢰 가능하고 빠른 진단이 매우 요구된다.
따라서 본 발명의 목표는 빠르고 신뢰 가능하며, 전문적인 의료 환경 밖, 즉 병원 밖에서, 예를 들어 거리에서 수행될 수 있는, 개인이 활동성 결핵(예를 들어, 폐결핵 또는 폐외 결핵)에 감염되었는지를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 청구범위 제1항에서 정의된 것과 같이 활동성 결핵의 표시자를 실시간으로 검출하는 방법에 관련된다.
제2 양태에서, 본 발명은 청구범위 제5항에서 정의된 것과 같이 활동성 결핵의 표시자를 엔드-포인트 어세이(end-point assay)로 검출하는 방법에 관련된다.
제3 양태에서, 본 발명은 청구범위 제11항에서 정의된 것과 같이 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 사전처리하는 방법에 관련된다.
제4 양태에서, 본 발명은 청구범위 제20항에서 정의된 것과 같은 휴대용 디바이스에 관련된다.
제5 양태에서, 본 발명은 청구범위 제29항 및 제35항에서 정의된 것과 같은 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하는 시스템에 관련된다.
제6 양태에서, 본 발명은 청구범위 제32항 및 제34항에서 정의된 것과 같은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 사전처리하는 시스템에 관련된다.
제7 양태에서, 본 발명은 청구범위 제39항 및 제40항에서 정의된 것과 같은 키트(kit)에 관련된다.
도 1은 본 발명의 디바이스의 예시적인 실시예를 도시한 도면.
도 2는 청구범위 제32항에 따른 시스템의 예시적인 실시예를 도시한 도면.
본 발명의 서술
본 발명의 원리는 아래에 기술되는 방법들의 단계 i) - v)에 따라 샘플이 사전처리된다면 샘플 내의 미콜산 파생물에 대한 항체가 빠르고 신뢰 가능하게 검출될 수 있다는 발명자의 관찰에 기초한다.
실시간 검출 방법
본 발명은 일 양태에서 샘플 내의 코드 인자 항체 또는 미콜산(MA) 항체와 같은 미콜산 파생물에 대한 항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 검출은 실시간으로 이루어진다.
이 방법은:
i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
ii) 샘플을 스테롤 지질에 접촉시키는 단계;
iii) 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 이러한 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
iv) 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
v) 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계;
vi) 단계 iv)에서 노출된 샘플 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 검사 기판에 노출시키고 단계 v)에서 노출된 샘플 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제어 기판에 노출시키는 단계;
vii) 단계 vi)의 항원에 대한 항체들의 결합을 실시간으로 검출하는 단계; 및
viii) 검사 기판과 제어 기판 사이의 항체 결합의 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하고, 검사 기판에 대한 임의의 관찰된 더 작은 결합은 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표이다. 이 방법은 본 출원서 전반에 걸쳐 "실시간 방법"으로 지칭될 것이다.
실시간 방법은 샘플을 여러 개의 용기 밖으로 그리고 용기 안으로 이송할 필요 없이 신뢰 가능하고 빠른 방식으로 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플이 분석되는 것을 가능하게 한다. 검사 샘플을 획득하기 위해 샘플의 부분이 미콜산 유래 항원을 이용한 사전배양 단계를 거치고 제어 샘플을 획득하기 위해 샘플의 다른 부분이 미콜산 유래 항원이 없는 사전배양을 거치는 것으로 이어지는 스테롤 지질을 이용한 후속하는 샘플의 사전배양 단계는, 미콜산을 운반하는 생체센서 기판으로의 사전처리된 샘플 내의 미콜산 항원의 결합을 수반하는 궁극적인 검출 단계에서의 직접 응용에 샘플을 적합하게 한다. 따라서 생체센서 기판은 샘플의 희석을 이용한 센서의 사전배양 또는 사전처리를 요구하지 않는다. 그에 따라, 본 발명의 방법은 종래기술의 방법에서 요구된 여러 개의 희석 및 이송 단계를 요구하지 않는다.
또한 본 발명의 실시간 방법은 바람직하게는 휴대용 디바이스에 의해, 특히 아래에서 정의된 디바이스에 의해 수행되기에 적합하다. 이것은 개인이 활동성 결핵(예로서, 폐결핵 또는 폐외 결핵)에 감염되었는지를 빠르고 신속한 방식으로 결정하는 것을 가능하게 하며, 15 내지 25분 미만에 결핵의 검출을 가능케 한다. 또한 이 방법은 전문적인 의료 환경 밖에서 수행될 수 있다.
특히 실시간 방법은 현장 검사, 즉 환자 치료 장소 또는 그 부근에서의 검사로서 개인이 활동성 결핵에 감염되었는지를 결정하기 위한 신속한 방법을 제공한다. 본 발명의 검사는 침대 옆에서 수행될 수 있는 간단한 의료 검사를 제공한다.
또한, 실시간 방법은 피검체로부터 오직 하나의 샘플만을 채취할 것을 요구하며, 이 샘플은 본 발명의 방법에서 직접 사용될 수 있다.
본 발명의 실시간 방법은 이제 실시간 방법의 단계들을 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
단계 i (실시간 방법)
본 발명의 실시간 방법은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물의 샘플, 특히 혈액 샘플의 진단적 검사에 기초한다. 이러한 목적을 위해서, 본 발명의 실시간 방법의 단계 i)에서는 활동성 결핵으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플이 제공된다. 이 샘플은 바람직하게는 전혈 샘플이다. 이 샘플은 피검체로부터 혈액을 지속적으로 획득함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되도록, 이전 단계에서 수집되고, 적절한 조건하에서 사용할 때까지 저장되며, 적절한 순간에 제공된 샘플이 사용될 수 있다. 이와 다르게 즉석에서, 즉 현장 검사로서 본 발명의 방법에서 샘플이 사용될 수 있다. 현장 검사에서는 본 발명의 휴대용 디바이스가 특히 사용에 적합할 것이다.
샘플이 전혈 샘플인 경우에, 샘플은 단계 ii) 이전에 혈장 또는 혈청으로 여과 또는 분리되는 항원에 대한 항체의 결합의 검출 방법에 의존할 수 있다. 검출이 질량 차이를 검출하는 수단에 의해 수행되는 경우에, 혈액 세포와 같은 고 질량 성분을 걸러내기 위한 여과 단계가 바람직할 수 있다. 결합이 형광에 의해 검출되는 경우, 샘플을 여과하지 않도록 선택할 수 있다. 이는 진단에 요구되는 시간을 더욱 단축시킬 것이다.
샘플은 바람직하게는 혈액 유래 샘플이다. 이 샘플은 전혈 샘플, 혈장 샘플 또는 혈청 샘플일 수 있다. 혈청은 응고인자가 없는 혈장이며 혈장으로서 선호된다. 따라서 본 명세서에서 혈장이라는 단어는 (혈액) 혈청 또한 지칭한다. 혈장 또는 혈청의 선택은 본 발명의 디바이스가 전혈을 혈장 또는 혈청으로 분리하도록 설계되었는가 여부에 의존한다. 혈청은 불특정 상호작용 또는 원치 않는 생리학적 활동으로 이어질 수 있는 다른 물질들을 혈장보다 덜 함유하기 때문에 선호된다. 또한 혈청은 혈장보다 더 낮은 점성을 가질 수 있다. 따라서 혈청을 이용하는 것은 샘플 희석에 대한 필요성을 피할 수 있으며, 시간 및 재료를 절약한다.
전혈의 약 55%는 혈장/혈청으로 이루어진다. 만약 전혈 샘플이 완벽하게 여과되지 않거나 또는 환자의 신체적 상황이 불가피하다면, 전혈 샘플 또는 혈장 또는 혈청을 희석하는 것이 요구될 수 있다. 본 명세서에서 혈장 또는 혈청이라는 단어는 따라서 희석 혈장 또는 혈청으로도 지칭할 수 있다.
따라서 250 내지 5000배 희석, 750 내지 1250배 희석, 예를 들어 4000, 2000, 또는 1000배 희석과 같은 혈액 또는 혈장의 희석이 본 발명의 실시간 방법에서 구현될 수 있다. 샘플의 점성에 따라서, 이러한 희석은 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계 이전에 또는 분리 단계 후에 또는 분리 단계에 대안적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어 희석 단계는 분리 단계 후에 그러나 단계 iv) 또는 v) 이전에 또는 단계 v)/vi) 후에 그리고 단계 vii) 이전에 이루어질 수 있다. 단계 v)/vi) 후에 그리고 단계 vii) 이전에, 즉 샘플이 생체센서에 진입하기 직전에 샘플을 희석하는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 방법의 대다수의 단계 동안 샘플의 부피가 가능한 한 낮게 유지되며, 이것은 프로세스의 속도 및 여기에서 사용되는 디바이스의 조밀도에 유리하다.
희석은 예를 들어 PBS 기반 완충제와 같은 임의의 적절한 희석제로 수행될 수 있다. 이러한 완충제는 예를 들어 생리학적 pH의 물 내에 NaCl, KCl, KH2P04, Na2HPO4 및 EDTA를 포함하는 PBS/AE 완충제일 수 있다. 이러한 완충제는 pH 7.4로 조정된 0.025%(m/v) 아지드화 나트륨 및 1mM EDTA를 함유하는 재증류되고 탈이온화된 물의 리터당 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH2P04 및 1.05g Na2HP04로 이루어진 PBS 기반 완충제일 수 있다.
전혈 샘플 또는 혈장 또는 혈청은 EDTA, 헤파린 또는 구연산염과 같이 혈액 응고를 방지하는 약제를 이용하여 추가로 희석될 수 있다.
선택적으로 튜빙(tubing), 용기 또는 컨테이너의 벽에 성분들이 달라붙는 것을 방지하도록 세제가 혈액/혈장/혈청에 저 농도로 추가될 수 있다.
단계 ii (실시간 방법)
단계 ii에서, 샘플이 스테롤 지질에 노출되고, 즉 스테롤 지질과 접촉한다.
발명자는 어떠한 이론에 의해서 묶이는 것을 원치 않지만, 스테롤 지질은 센서 기판상의 미콜산 항원과 교차반응하여 결핵의 위양성 진단으로 이어지는 항콜레스테롤 항체를 샘플로부터 제거한다고 가정된다.
스테롤 지질에 대한 샘플의 노출 시간은 바람직하게는 10분 미만이고, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분이다. 이러한 노출 시간은 샘플이 스테롤 지질과 접촉하게 되는 시간에 의존한다.
스테롤 지질에 샘플을 노출하는 일 예시적인 방법은 샘플을 긴 나선형 채널 내로 이끌어 이것이 바람직하게는 콜레스테롤인 스테롤 지질로 사전 코팅된 채널의 길이를 따라 통과하는 것이다. 채널의 끝에서 스테롤 지질에 노출된 샘플은, 분할된 샘플 스트림을 단계 v)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 다음 기판 및 단계 vi)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판으로, 즉 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함하는 컨테이너로 각각 이끄는 수동 밸브 분기점과 같은 샘플 스트림을 분할하는 수단을 통과할 수 있다.
샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 다른 예시적인 방법은 콜레스테롤로 코팅된 컨테이너 내에 이것을 주입하고, 이어서 컨테이너 내에서 10분 미만으로 이를 배양하는 것이다.
전혈/혈장/혈청에는 친수성 분자부터 소수성 분자까지 수백 종류의 분자들이 풍부하다. 따라서 이러한 샘플의 분자들의 비특정 결합에 대해 비활성인 기판 재료가 사용될 것이다. 이러한 맥락에서, 기판은 지지 재료이도록 이해되어야만 한다.
단계 iv 및 v (실시간 방법)
다음 단계에서, 스테롤 지질에 노출된 샘플의 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출되고(단계 iv) 스테롤 지질에 노출된 샘플의 다른 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출된다(단계 v).
적어도 두 부분을 획득하기 위해서, 프로세스의 소정의 순간에서 혈액/혈장 스트림이 분할되어야만 한다(실시간 방법의 단계 iii). 편의를 위해서 그리고 방법의 신뢰 가능성을 최적화하기 위해서, 스트림이 스테롤 지질에 노출된 후에 분할되는 것이 바람직하며, 즉 스테롤 지질에 노출된 샘플이 검사 스트림 및 제어 스트림을 제공하도록 적어도 두 부분으로 분할되는 것이 바람직하다. 샘플이 두 개의 동일한 또는 실질적으로 동일한 부분으로 분할되는 것은 교정 계산의 필요 없이 두 부분의 단순한 비교를 가능하게 하기 때문에 바람직하다. 샘플 스트림을 분할하는 것은 수동 밸브 분기점과 같은 샘플 스트림을 분할하기 위한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.
대안적으로 (혈장 또는 혈청으로 여과된) 샘플 스트림은 여과 단계 후에, 그러나 스테롤 지질에 대한 노출 이전에 적어도 두 부분으로 분할된다. 대안적으로 혈액 스트림은 여과 이전에 분할된다. 이 경우 두 개의 필터가 요구될 것이기 때문에 덜 바람직하다.
단계 iv) 및 v)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판은 바람직하게는 동일한 재료이다.
또한, 스테롤 지질(예로서, 콜레스테롤) 및 미콜산 파생물이 모두 소수성이기 때문에, 단계 iv) 및 v)에서의 노출을 위한 기판은 단계 ii)에서 사용될 수 있는 기판과 동일한 재료일 것이다. 적절한 기판 재료는 이러한 샘플의 불특정 분자 결합에 대해 비활성임이 이해될 것이다.
스테롤 지질에 대한 샘플의 노출 시간은 바람직하게는 10분 미만이고, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분이다.
샘플들을 단계 iv) 및 v)의 기판에 노출하는 일 예시적인 방법은, 바람직하게는 미콜산 파생물로 사전 코팅되거나(단계 iv) 또는 미콜산 파생물로 사전 코팅되지 않은(단계 v) 마이크로칩으로 구현된 긴 나선형 채널 내로 분할된 샘플 스트림을 이끌어 이러한 채널의 길이를 따라 이를 통과시키는 것이다. 생체센서까지의 두 채널들의 거리는 동일한 길이를 가져야만 할 것이다. 기판 재료로의 불특정 결합이 가능한 한 적게 존재하는 것이 중요하다.
분할된 지질 스테롤 노출된 샘플들을 미콜산 파생물로 코팅되거나 미콜산 파생물로 코팅되지 않은 기판에 노출시키는 대안적인 예시적인 방법은 제1 샘플 스트림을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너 내에 주입하고(단계 iv), 제2 샘플 스트림을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 컨테이너 내에 주입하며(단계 v), 이러한 샘플들을 10분 미만, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분 동안 배양하는 것이다.
단계 vi (실시간 방법)
이 단계에서, 단계 vi에서 미콜산 파생물에 노출된(검사 스트림) 또는 단계 v에서 미콜산 파생물에 노출되지 않은(제어 스트림) 분할된 스테롤 지질에 노출된 샘플 스트림들은 각각 미콜산 파생물, 바람직하게는 단계 iv에서와 동일한 파생물을 운반하는 검사 기판 및 제어 기판인 추가의 기판들로 통과된다.
이들 검사 기판 및 제어 기판은 단계 iv)에서 미콜산 파생물에 노출된 검사 스트림을 수용하기 위한 검사 기판을 갖는 제1 챔버(검사 챔버)를 포함하는 생체센서 및 단계 v)에서 미콜산 파생물에 노출되지 않은 제어 스트림을 수용하기 위한 제어 기판을 갖는 제2 챔버(제어 챔버) 내에 포함된다. 두 챔버 내의 기판은 바람직하게는 동일한 재료이며 동일한 미콜산 파생물을 운반한다. 이러한 맥락에서 생체센서는 항체가 검사 기판 및 제어 기판상의 미콜산 파생물과 접촉할 때 측정 가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 수단일 수 있다.
바람직하게는 단계 vi)의 검사 및 제어 기판은 이산화규소에 기초한 기판과 같은 실리카 기반이다. 실리카 기반 기판은 고리 공명 기술이 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 사용될 때 특히 유용하다. 바람직하게는 검출은 Si-기반 고리 공명기를 이용하는 생체센서 칩을 사용하여 수행된다. 이것은 본 발명의 방법이 매우 소형의 디바이스로 수행되는 것을 가능하게 한다.
단계 vi)의 기판이 금 기반인 것 또한 매우 가능하다. 금 기반의 기판은 표면 플라즈몬 공명 또는 전자화학적 임피던스 분광학이 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 사용될 때 특히 유용하다.
단계 vii 및 viii (실시간 방법)
단계 vii에서 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합이 검출된다. 검출이 실시간으로 이루어지기 때문에, 단계 vi의 기판상의 항체의 결합이 결합 프로세스 동안 직접 검출된다. 따라서 단계 vi 및 vii는 별개의 시간에 발생해야 하는 단계들이 아님이 이해될 것이다. 이것은 단계 viii에 대해서도 적용되며, 즉 검사 기판 및 제어 기판에 대한 결합의 비교 및 검출이 단계 vii의 결합 프로세스가 여전히 진행하는 동안 이루어질 수 있다. 이론적으로 전체 실시간 검출을 위해서, 표면 플라즈몬 공명 또는 전자화학적 임피던스 분광학, 등온 적정 열량측정, 생체-층 간섭측정, 광학 격자, 광 결정, 음향 공명 프로파일링, 수정 진동자 저울과 같은 무표지 분석 기술이 사용될 수 있다.
미콜산 항원에 대한 항체 및/또는 다른 재료의 결합의 검출은 자동화된 디바이스에서 수행될 수 있다. 다양한 자동화된 디바이스가 당업자에게 알려질 것이고 당업자는 검사 기판과 제어 기판 사이의 결합 정도 또는 범위에 대한 단계 viii)의 비교를 하기 위한 적절한 소프트웨어 수단을 선택할 수 있을 것이며, 임의의 관찰된 검사 기판에 대한 더 작은 결합은 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표이다. 이러한 맥락에서, 더 작다는 것이 질적으로 및 양적으로 작은 것으로 해석될 수 있으며, 즉 더 작은 결합은 더 약한 결합을 가지는 것뿐 아니라 더 적은 결합 이벤트를 가지는 것으로도 해석될 수 있다.
실시간 방법을 수행하기 위한 디바이스
본 발명의 다른 양태는 실시간으로 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 휴대용 디바이스에 관한 것으로, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 추가의 컨테이너와의 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 제1 챔버 및 다른 추가의 컨테이너와의 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 챔버와 동일한 기판을 포함하는 제2 챔버를 포함하는 생체센서를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 디바이스는 피부 침투 단부로부터 혈액 샘플을 수용하고 혈액 샘플을 피부 부위로부터 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너로 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙에 접속된 피부 침투 단부를 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 디바이스는 혈액 샘플을 수용하도록 제1 튜빙과 접속하고 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛을 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서, 휴대용 디바이스는 피부 침투 단부로부터 혈액 샘플을 수용하고 혈액 샘플을 피부 부위로부터 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙에 접속된 피부 침투 단부; 혈액 샘플을 수용하도록 제1 튜빙과 접속하고 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛; 샘플을 수용하며 스테롤 지질을 포함하는 제1 컨테이너; 샘플을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 제1 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 제2 컨테이너; 제2 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 제3 컨테이너; 및 제2 컨테이너와의 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 제1 챔버 및 제3 컨테이너와의 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 챔버와 동일한 기판을 포함하는 제2 챔버를 포함하는 생체센서를 포함한다.
장치를 통과하는 스트림은 바람직하게는 펌프에 의해 구동되고, 바람직하게는 연속 흐름 펌프, 예를 들어 연동 펌프 또는 격막 펌프에 의해 구동된다. 이 펌프는 바람직하게는 장치를 통해 샘플을 흡입하고 분석 이전에 샘플의 오염을 방지할 수 있도록 생체센서의 하류에 위치된다.
피부 침투 수단은 주사침과 같이 사람 또는 동물로부터 혈액 샘플을 획득하기 위한 임의의 적절한 수단일 수 있다.
제1 튜빙은 디바이스의 목적에 적합한 크기를 가지며, 즉 피부 침투 수단 및 제1 컨테이너에 잘 적응 가능해야 한다.
디바이스의 구성요소들, 즉 컨테이너, 희석 수단, 필터 유닛 및 생체센서는 적절한 연결 튜빙에 의해 상호접속될 수 있다. 이와 다르게 디바이스의 구성요소들은 서로에 직접 접속될 수 있도록 설계될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 튜빙의 재료는 혈액 샘플 검사 분야의 당업자에게 알려진 임의의 적합한 재료일 수 있다. 적절한 재료는 혈액/혈장/혈청 성분에 비활성이며 폴리테트라플루오로에틸렌(예로서, Teflon®), 폴리프로필렌, 폴리에테르 케톤(PEEK) 및 폴리에틸렌을 포함한다.
추가의 구성요소들은 디바이스의 구성요소들 사이에 접속될 수 있다. 이러한 추가의 구성요소들은 구성요소들을 연결하고 구성요소들에 직접 부착되는 튜빙 내에 접속될 수 있다.
본 발명의 디바이스는 또한 혈액 또는 혈장을 희석하는 수단을 포함할 수 있다. 이러한 수단은 스테롤 지질 함유 컨테이너 앞에, 필터 유닛 앞에, 필터 유닛과 스테롤 지질 함유 컨테이너 사이에, 스테롤 함유 컨테이너와 다른(추가의 및 다른 추가의 또는 제2 및 제3) 컨테이너 사이에, 또는 추가의/다른 추가의 또는 제2 또는 제3 컨테이너와 생체센서의 개별 챔버들 사이에 구현될 수 있다. 바람직하게는 샘플을 희석시키는 수단은 추가의 또는 제2 컨테이너와 생체센서 사이에 그리고 다른 추가의 또는 제3 컨테이너와 생체센서 사이에 접속된다. 예를 들어 10ml 컨테이너는 추가의 또는 제2 컨테이너 및 다른 추가의 또는 제3 컨테이너의 배출구에 구현될 수 있다. 적절한 완충제는 이미 컨테이너 내에 존재할 수 있거나 또는 원하는 희석을 제공하기 위해서 이러한 컨테이너 내에 추가될 수 있다. 이러한 방식으로 샘플의 부피는 본 발명의 방법의 대부분의 단계 동안에 가능한 한 낮게 유지되며, 이것은 프로세스의 속도 및 본 발명의 디바이스의 소형화에 있어서 유리하다.
컨테이너들은 나선형 채널 또는 나선형 튜브와 같은 용기 또는 채널 또는 튜빙일 수 있다. 나선형 채널 또는 튜브는 이러한 구조가 작은 공간만을 차지하는 동시에 긴 흐름 경로를 유지하기 때문에 바람직하다. 나선형 채널 또는 튜브는 바람직하게는 마이크로칩 상에 구현될 수 있다. 이것은 본 발명의 디바이스의 소형화에 기여한다.
필터 유닛은 필터 행렬을 포함할 수 있다. 바람직하게는 필터는 소형화를 위해 필터 마이크로칩 상에 구현된다.
컨테이너들의 재료는 바람직하게는 동일할 수 있으며 이에 적합한 재료는 bk-7 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 케톤 또는 폴리에틸렌일 수 있다.
컨테이너들의 기판들은 예를 들어 bk-7 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 케톤 또는 폴리에틸렌과 같은 샘플의 분자들의 불특정 결합에 대해 비활성인 재료여야만 한다.
디바이스는 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너(제2 컨테이너) 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함하는 컨테이너를 포함한다. 고정된 미콜산 유래 항원 대신, 후자의 컨테이너는 불특정 결합이 발생하지 않는 한 비활성 코팅일 수 있거나 또는 코팅이 없을 수 있다.
바람직하게는 생체센서의 챔버들의 검사 기판 및 제어 기판은 이산화규소 기반 기판과 같은 실리카 기반이다. 실리카 기반 기판은 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 고리 공명 기술이 사용될 때 특히 유용하다.
생체센서는 제1 및 제2 챔버를 포함한다. 두 챔버가 하나의 컴파트먼트 또는 하우징 내에 있을 필요가 없음이 이해되어야만 한다. 예를 들어 생체센서는 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 갖는 챔버를 각각 포함하는 두 개의 개별 센서 유닛을 포함할 수 있으며, 하나의 센서 유닛은 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너와 튜빙을 통해서 접속하고, 다른 센서 유닛은 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함하는 컨테이너와 튜빙을 통해 접속한다.
바람직하게는, 생체센서는 Si-기반 고리 공명기를 포함한다. 이것은 본 발명의 디바이스가 매우 소형인 것을 가능하게 한다.
이와 관련하여 본 발명은 또한 생체센서와 관련되며, 이것은 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 실리카 기반 기판 및 Si 고리 공명기를 포함하는 적어도 두 개의 챔버를 포함한다.
생체센서의 챔버들의 기판들이 금 기반인 것 또한 매우 가능하다. 금 기반 기판은 고정된 미콜산 유래 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 표면 플라즈몬 공명 또는 전자화학적 임피던스 분광학이 사용될 때 특히 유용하다.
본 발명의 디바이스는 생체센서의 챔버들 내의 고정된 항원에 대한 미콜산 항체의 결합의 비교를 수행하기에 적합한 소프트웨어 프로그램을 갖는 컴퓨터와 같은 임의의 적절한 자동화된 분석 수단에 접속될 수 있다.
본 발명의 디바이스의 예시적인 실시예가 도 1에 도시되었다.
도 1은 바늘(1)로부터 혈액을 수용하고 피부 부위로부터 소정 양의 혈액을 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙(2)에 접속된 피부 침투 바늘(1)을 도시한다. 튜빙(1)은 필터 유닛(3)에 접속된다. 이러한 필터 유닛은 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하는 역할을 한다. 필터 유닛(3)은 자신의 내부 벽이 스테롤 지질로 코팅된 나선형 채널 형태인 제1 컨테이너(4)에 튜빙(13)을 통해서 접속된다. 나선형 채널은 수동 밸브 분기점의 형태로 혈장을 분할하기 위한 수단(5)과 튜빙(14)을 통해서 접속된다. 분기점의 하나의 분기는 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 제1 혈장 스트림을 수용하도록 튜빙(16)을 통해 제2 컨테이너(6)에 접속된다. 분기점의 다른 분기는 제2 혈장 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 제3 컨테이너(7)와 튜빙(15)을 통해 접속된다. 이러한 실시예에서 컨테이너(6, 7)는 자신의 내부 벽이 미콜산 유래 항원으로 코팅되거나(컨테이너(6)) 또는 미콜산 유래 항원으로 코팅되지 않은(컨테이너(7)) 나선형 채널의 형태를 가진다. 컨테이너(6, 7)는 각각 희석 컨테이너(11, 12)와 각각 튜빙(17, 18)을 통해서 접속된다. 이러한 컨테이너는 적절한 희석 완충제로 사전충전될 수 있거나 또는 희석 완충제를 도입하기 위한 유입구(21, 22)를 포함한다. 희석 컨테이너(21, 22)는 각각 개별 튜빙(19, 20)을 통해서 생체센서(8)의 검사 챔버(9) 및 생체센서(8)의 제어 챔버(10)로 접속된다. 검사 챔버(9) 및 제어 챔버(10)는 모두 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 동일한 기판을 포함한다.
키트
본 발명의 다른 양태는 실시간 검출 방법을 이용하여 결핵을 진단하는 데에 사용하기 위한 키트에 관한 것으로, 하나 이상의 피부 침투 수단; 하나 이상의 튜빙; 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 하나 이상의 컨테이너; 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 기판을 포함하는 하나 이상의 컨테이너; 고정된 미콜산 유래 항원을 갖지 않는 기판을 포함하는 하나 이상의 컨테이너; 및 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 기판을 포함하는 적어도 두 챔버를 포함하는 하나 이상의 생체센서; 그리고 선택적으로 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단 및/또는 필터 유닛을 포함한다.
키트는 나사, 클램프, 글루, 테이프, 나사드라이버 등과 같이 구성요소들을 조립하기 위한 도구도 포함할 수 있다.
키트는 혈액 분석 동안에 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단도 포함할 수 있다. 제2 및 제3 컨테이너의 배출구에 구현되는 컨테이너(예를 들어 10ml)와 같다. 적절한 완충제는 컨테이너 내에 이미 존재할 수 있거나 또는 원하는 희석을 제공하도록 이러한 컨테이너 내로 추가될 수 있다.
키트의 구성요소들은 결핵 진단 검사를 수행하는 사람이 즉석에서, 즉 현장 검사로 본 발명의 디바이스를 조립하는 것을 가능하게 한다. 따라서 키트의 구성요소들이 본 발명의 디바이스에 대해 위에서 설명된 것과 동일한 특징 및 바람직한 속성을 가짐이 이해된다. 본 발명의 디바이스는 본 발명의 키트의 구성요소들에 의해 쉽게 조립되며, 즉 전문적인 기술적 배경이 요구되지 않는다. 키트에는 편의상 조립 및 사용을 위한 장비가 제공될 수 있다.
엔드 -포인트 방법
본 발명은 추가의 양태에서 샘플 내의 코드 인자 항체 또는 미콜산(MA) 항체와 같은 미콜산 파생물에 대한 항체를 검출하기 위한 검출 방법에 관한 것으로, 이러한 검출은 엔드-포인트 어세이(end-point assay)에 의해 이루어진다.
이 방법은:
i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
ii) 샘플을 스테롤 지질에 접촉시키는 단계;
iii) 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 이러한 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
iv) 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
v) 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계;
vi) 단계 iv)에서 노출된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 검사 기판에 노출시키고 단계 v)에서 노출된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제어 기판에 노출시키는 단계;
vii) 단계 vi)의 항원에 대한 항체들의 결합을 엔드-포인트 어세이로 검출하는 단계; 및
viii) 검사 기판과 제어 기판 사이의 항체 결합의 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하고, 검사 기판에 대한 임의의 관찰된 더 작은 결합은, 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표이다. 이 방법은 본 출원서 전반에 걸쳐 "엔드-포인트 방법"으로 지칭될 것이다.
사전처리 단계 i)-v)가 반드시 검출 단계 vi)-viii)로 바로 이어져야 하는 것은 아니다. 예를 들어 단계 v) 후에 획득된 샘플 부분들은 추가로 이용할 때까지 또는 검출 기판으로의 수송을 위해 저장될 수 있다. 이러한 방식으로 실험자는 자신의 검사를 계획함에 있어 큰 유연성을 가진다. 예를 들어, 단계 i)-iv)가 반드시 단계 vi)-viii)로 이어질 필요가 없다는 사실은 사전처리된 샘플들이 수집되는 것을 가능하게 하며, 그에 따라 샘플들은 하나의 기판 재료상에서 모두 한 번에 검사될 수 있고, 이는 신뢰가능성 및 재생산가능성을 향상시킨다. 이것은 또한 동일한 조건 하에서 다수의 환자로부터의 샘플을 검사하는 것을 더 쉽게 만든다.
따라서, 다른 양태에서 본 발명은 검출을 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 사전처리하는 방법에 또한 관련되며, 이 방법은:
i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
ii) 샘플을 스테롤 지질에 접촉시키는 단계;
iii) 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 이러한 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
iv) 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
v) 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계를 포함하고,
단계 iv) 및 v)에서의 노출 후에 샘플 부분들의 적어도 일부가 추가의 이용을 위해서 저장된다. 이러한 방법은 본 출원서 전반에 걸쳐 "사전처리 방법"으로 지칭될 것이다.
또한 본 발명의 엔드-포인트 방법은 신뢰 가능하고 빠른 방식으로 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플이 분석되는 것을 가능하게 한다. 검사 샘플을 획득하기 위해 샘플의 부분이 미콜산 유래 항원을 이용한 사전배양 단계 i)-v)를 거치고 제어 샘플을 획득하기 위해 샘플의 다른 부분이 미콜산 유래 항원이 없는 사전배양을 거치는 것으로 이어지는 스테롤 지질을 이용한 후속하는 샘플의 사전배양 단계는, 미콜산을 운반하는 기판으로의 사전처리된 샘플 내의 미콜산 항원의 결합을 수반하는 궁극적인 엔드-포인트 검출 단계에서의 직접 응용에 샘플을 적합하게 한다. 따라서 기판은 샘플의 희석을 이용한 사전배양 또는 사전처리를 요구하지 않는다. 그에 따라, 종래기술의 방법에서 요구된 여러 개의 희석 및 이송 단계가 요구되지 않는다.
또한, 엔드-포인트 방법은 개인이 활동성 결핵(예로서, 폐결핵 또는 폐외 결핵)에 감염되었는지를 빠르고 신속한 방식으로 결정하는 것을 가능하게 하며, 15 내지 25분 미만에 결핵의 검출을 가능케 한다. 이것은 특히 엔드-포인트 방법의 사전처리 단계 i)-v) 및 사전처리 방법으로 인한 것이다. 또한 엔드-포인트 방법은 전문적인 의료 환경 밖에서 수행될 수 있다. 특히 여기에서 현장 검사, 즉 환자 치료 장소 또는 그 부근에서의 검사로서 개인이 활동성 결핵에 감염되었는지를 결정하기 위한 신속한 방법이 제공된다. 본 발명의 검사는 침대 옆에서 수행될 수 있는 간단한 의료 검사를 제공한다.
또한, 사전처리 단계 i)-v)는 피검체로부터 오직 하나의 샘플만을 채취하기 때문에, 이 샘플은 추가의 처리 없이 검출을 위해 직접 사용될 수 있다.
이제 본 발명의 이러한 양태의 원리가 엔드-포인트 방법 및 사전처리 방법의 단계들을 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
단계 i ( 엔드 -포인트 방법/사전처리 방법)
본 발명의 엔드-포인트 방법은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물의 샘플, 특히 혈액 샘플의 진단적 검사에 기초한다. 이러한 목적을 위해서, 단계 i)에서는 활동성 결핵으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플이 제공된다. 이 샘플은 바람직하게는 전혈 샘플이다. 이 샘플은 피검체로부터 혈액을 지속적으로 획득함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되도록, 이전 단계에서 수집되고, 적절한 조건하에서 사용할 때까지 저장되며, 적절한 순간에 제공된 샘플이 사용될 수 있다. 이와 다르게 즉석에서, 즉 현장 검사로서 본 발명의 검출 방법에서 샘플이 사용될 수 있다. 다른 대안은 전술된 단계 i)-v)에 따라 즉석에서 샘플이 사전처리되며, 추가의 이용까지 결과적인 사전처리 샘플이 저장되고/되거나 검출이 일어나는 다른 위치로 결과적인 사전처리 샘플이 이송되는 것이다.
샘플이 전혈 샘플인 경우에, 샘플은 단계 ii) 이전에 혈장 또는 혈청으로 여과 또는 분리되는 항원에 대한 항체의 결합의 검출 방법에 의존할 수 있다. 검출이 질량 차이를 검출하는 수단에 의해 수행되는 경우에, 혈액 세포와 같은 고 질량 성분을 걸러내기 위한 여과 단계가 바람직할 수 있다. 결합이 형광에 의해 검출되는 경우, 샘플을 여과하지 않도록 선택할 수 있다. 이는 사전처리 및 진단에 요구되는 시간을 더욱 단축시킬 것이다.
샘플은 바람직하게는 혈액 유래 샘플이다. 이 샘플은 전혈 샘플, 혈장 샘플 또는 혈청 샘플일 수 있다. 혈청은 응고인자가 없는 혈장이며 혈장으로서 선호된다. 따라서 본 명세서에서 혈장이라는 단어는 (혈액) 혈청 또한 지칭한다. 혈장 또는 혈청의 선택은 본 발명의 디바이스가 전혈을 혈장 또는 혈청으로 분리하도록 설계되었는가 여부에 의존한다. 혈청은 불특정 상호작용 또는 원치 않는 생리학적 활동으로 이어질 수 있는 다른 물질들을 혈장보다 덜 함유하기 때문에 선호된다. 또한 혈청은 혈장보다 더 낮은 점성을 가질 수 있다. 따라서 혈청을 이용하는 것은 샘플 희석에 대한 필요성을 피할 수 있으며, 시간 및 재료를 절약한다.
전혈의 약 55%는 혈장/혈청으로 이루어진다. 만약 전혈 샘플이 완벽하게 여과되지 않거나 또는 환자의 신체적 상황이 불가피하다면, 전혈 샘플 또는 혈장 또는 혈청을 희석하는 것이 요구될 수 있다. 본 명세서에서 혈장 또는 혈청이라는 단어는 따라서 희석 혈장 또는 혈청으로도 지칭할 수 있다.
혈액 또는 혈장의 희석이 본 발명의 방법에서 구현될 수 있다. 특히 엔드-포인트 어세이가 점 면역금 여과 어세이와 같은 면역금 여과 어세이일 때, 10배 내지 250배의 희석이 바람직하다. 샘플의 점성에 따라서, 이러한 희석은 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계 이전에 또는 분리 단계 후에 또는 분리 단계에 대안적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어 희석 단계는 분리 단계 후에 그러나 단계 iv) 또는 v) 이전에 또는 단계 v)/vi) 후에 그리고 단계 vii) 이전에 이루어질 수 있다.
희석은 예를 들어 PBS 기반 완충제와 같은 임의의 적절한 희석제로 수행될 수 있다. 이러한 완충제는 예를 들어 생리학적 pH의 물 내에 NaCl, KCl, KH2P04, Na2HPO4 및 EDTA를 포함하는 PBS/AE 완충제일 수 있다. 이러한 완충제는 pH 7.4로 조정된 0.025%(m/v) 아지드화 나트륨 및 1mM EDTA를 함유하는 재증류되고 탈이온화된 물의 리터당 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH2P04 및 1.05g Na2HP04로 이루어진 PBS 기반 완충제일 수 있다.
전혈 샘플 또는 혈장 또는 혈청은 EDTA, 헤파린 또는 구연산염과 같이 혈액 응고를 방지하는 약제를 이용하여 추가로 희석될 수 있다.
선택적으로 튜빙(tubing), 용기 또는 컨테이너의 벽에 성분들이 달라붙는 것을 방지하도록 세제가 혈액/혈장/혈청에 저 농도로 추가될 수 있다.
단계 ii ( 엔드 -포인트 방법/사전처리 방법)
단계 ii에서, 샘플이 스테롤 지질에 노출되고, 즉 스테롤 지질과 접촉한다.
발명자는 어떠한 이론에 의해서 묶이는 것을 원치 않지만, 스테롤 지질은 기판상의 미콜산 항원과 교차반응하여 결핵의 위양성 진단으로 이어지는 항콜레스테롤 항체를 샘플로부터 제거한다고 가정된다.
스테롤 지질에 대한 샘플의 노출 시간은 바람직하게는 10분 미만이고, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분이다. 이러한 노출 시간은 샘플이 스테롤 지질과 접촉하게 되는 시간에 의존한다.
스테롤 지질에 샘플을 노출하는 일 예시적인 방법은 샘플을 긴 나선형 채널 내로 이끌어 이것이 바람직하게는 콜레스테로인 스테롤 지질로 사전 코팅된 채널의 길이를 따라 통과하는 것이다. 채널의 끝에서 스테롤 지질에 노출된 샘플은, 분할된 샘플 스트림을 단계 v)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 다음 기판 및 단계 vi)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판으로, 즉 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함하는 컨테이너로 각각 이끄는 수동 밸브 분기점과 같은 샘플 스트림을 분할하는 수단을 통과할 수 있다.
샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 다른 예시적인 방법은 콜레스테롤로 코팅된 컨테이너 내에 이것을 주입하고, 이어서 컨테이너 내에서 10분 미만으로 이를 배양하는 것이다.
다른 대안적인 예시적인 방법은 샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 것으로, 이러한 스테롤 지질은 열(column)의 컴파트먼트 내에 함유된다. 이러한 컴파트먼트 내에서 스테롤 지질은 바람직하게는 비드 상에 코팅된다.
전혈/혈장/혈청에는 친수성 분자부터 소수성 분자까지 수백 종류의 분자들이 풍부하다. 따라서 이러한 샘플의 분자들의 비특정 결합에 대해 비활성인 기판 재료가 사용될 것이다. 이러한 맥락에서, 기판은 지지 재료이도록 이해되어야만 한다.
단계 iv 및 v ( 엔드 -포인트 방법/사전처리 방법)
다음 단계에서, 스테롤 지질에 노출된 샘플의 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출되고(단계 iv) 스테롤 지질에 노출된 샘플의 다른 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출된다(단계 v).
적어도 두 부분을 획득하기 위해서, 프로세스의 소정의 순간에서 혈액/혈장 스트림이 분할되어야만 한다(단계 iii). 편의를 위해서 그리고 방법의 신뢰 가능성을 최적화하기 위해서, 스트림이 스테롤 지질에 노출된 후에 분할될 수 있으며, 즉 스테롤 지질에 노출된 샘플이 검사 스트림 및 제어 스트림을 제공하도록 적어도 두 부분으로 분할되는 것이 바람직하다. 샘플이 두 개의 동일한 또는 실질적으로 동일한 부분으로 분할되는 것은 교정 계산의 필요 없이 두 부분의 단순한 비교를 가능하게 하기 때문에 바람직하다. 샘플 스트림을 분할하는 것은 수동 밸브 분기점과 같은 샘플 스트림을 분할하기 위한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.
대안적으로 (혈장 또는 혈청으로 여과된) 샘플 스트림은 여과 단계 후에, 그러나 스테롤 지질에 대한 노출 이전에 적어도 두 부분으로 분할된다. 대안적으로 혈액 스트림은 여과 이전에 분할된다. 이 경우 두 개의 필터가 요구될 것이기 때문에 덜 바람직하다.
열이 사용된 경우에, 스트림은 단계 ii)에서 스테롤 지질로의 노출 이전에 분할되며, 그에 따라 단계 ii) 및 iv)가 동일한 열에서 발생할 수 있고 단계 ii) 및 v)가 다른 열에서 발생할 수 있다.
단계 iv) 및 v)의 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판은 바람직하게는 동일한 재료이다.
또한, 스테롤 지질(예로서, 콜레스테롤) 및 미콜산 파생물이 모두 소수성이기 때문에, 단계 iv) 및 v)에서의 노출을 위한 기판은 단계 ii)에서 사용될 수 있는 기판과 동일한 재료일 수 있다. 적절한 기판 재료는 이러한 샘플의 불특정 분자 결합에 대해 비활성임이 이해될 것이다.
스테롤 지질에 대한 샘플의 노출 시간은 바람직하게는 10분 미만이고, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분이다.
샘플들을 단계 iv) 및 v)의 기판에 노출하는 일 예시적인 방법은, 바람직하게는 미콜산 파생물로 사전 코팅되거나(단계 iv) 또는 미콜산 파생물로 사전 코팅되지 않은(단계 v) 마이크로칩으로 구현된 긴 나선형 채널 내로 분할된 샘플 스트림을 이끌어 이러한 채널의 길이를 따라 이를 통과시키는 것이다.
미콜산 파생물로 코팅되거나 미콜산 파생물로 코팅되지 않은 기판에 노출시키는 대안적인 예시적인 방법은 제1 샘플 스트림을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너 내에 주입하고(단계 iv), 제2 샘플 스트림을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 컨테이너 내에 주입하며(단계 v), 이러한 샘플들을 10분 미만, 예컨대 2분 내지 8분, 3분 내지 7분, 4분 내지 6분 또는 약 5분 동안 배향하는 것이다.
다른 대안적인 방법은 단계 iv) 및 v)가 열 내에서 이루어지는 것이다. 이러한 경우 스트림은 단계 ii)에서 스테롤 지질에 노출되기 전에 분할되며, 그에 따라 단계 ii) 및 iv)가 하나의 열 내에서 발생할 수 있고 단계 ii) 및 v)가 다른 열 내에서 발생할 수 있다.
검출 방법의 재생산가능성 및 신뢰가능성의 이유로 단계 v)에서 스테롤 지질에 노출된 샘플의 다른 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출되는 것이 바람직하지만, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 이러한 부분을 노출하는 단계를 건너뛰고 단계 vi)에서와 같이 추가의 이용까지 이러한 부분을 저장하는 것 또한 가능할 수 있다. 이것은 예를 들어 스테롤 지질을 이용한 배양이 일어나는 것과 동일한 열 또는 컨테이너 내에서 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 방법에 관련되며, 이 방법은:
i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
ii) 샘플을 스테롤 지질과 접촉시키는 단계;
iii) 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
iv) 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
v) 단계 vi)까지 부분들 중 두 번째 부분의 적어도 일부를 저장하는 단계;
vi) 단계 iv)에서 노출된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 검사 기판에 노출시키고 단계 v)에서 저장된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제어 기판에 노출시키는 단계;
vii) 단계 vi)의 항원에 대한 항체들의 결합을 엔드-포인트 어세이로 검출하는 단계; 및
viii) 검사 기판과 제어 기판 사이의 결합의 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하고, 임의의 관찰된 검사 기판에 대한 더 작은 결합은 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표이다.
이와 유사하게, 본 발명은 또한 검출을 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 사전처리하는 방법에 관련되며, 이 방법은:
i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
ii) 이러한 샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 단계;
iii) 이러한 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
iv) 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
v) 추가 사용을 위해 부분들 중 두 번째 부분의 적어도 일부를 저장하는 단계를 포함하고, 단계 iv)에서의 노출 후에 노출된 샘플 부분들 적어도 일부가 추가 사용을 위해 저장된다.
단계 vi ( 엔드 -포인트 방법)
이 단계에서, 단계 iv에서 미콜산 파생물에 노출된(검사 스트림) 또는 단계 v에서 미콜산 파생물에 노출되지 않은(제어 스트림) 분할된 스테롤 지질에 노출된 샘플 스트림들은 각각 미콜산 파생물, 바람직하게는 단계 iv에서와 동일한 파생물을 운반하는 검사 기판 및 제어 기판인 추가의 기판들로 통과된다.
검사 기판 및 제어 기판은 고정된 미콜산 유래 항원을 운반할 수 있는 임의의 기판일 수 있으며, 이것으로부터 항원에 대한 샘플 내에 함유된 항체들 사이의 결합이 검출될 수 있다.
바람직한 실시예에서 면역금 여과 어세이에 의해 검출이 발생한다. 이러한 어세이에서, 검사 및 제어 기판은 미공성 멤브레인이고, 바람직하게는 고정된 미콜산 유래 항원이 코팅된 니트로셀룰로오스 멤브레인이다.
검사 기판 및 제어 기판은 개별적인 엔티티일 수 있다. 이와 다르게, 검사 기판 및 제어 기판은 하나의 기판 엔티티 상의 서로 다른 위치로서 구현될 수 있다. 예를 들어, 미공성 멤브레인의 경우에 검사 기판 및 제어 기판은 제1 미공성(예로서, 니트로셀룰로오스) 멤브레인 및 제2 미공성(예로서, 니트로셀룰로오스) 멤브레인에 의해 형성될 수 있다. 이와 다르게, 검사 기판 및 제어 기판은 하나의 멤브레인 상에 포함된다. 이러한 경우, 항체/항원 상호작용이 멤브레인의 일 위치 상에서 일어날 수 있는 검사 영역(예로서, 스팟) 및 항체/항원 상호작용이 멤브레인의 다른 위치 상에서 일어날 수 있는 제어 영역이 존재한다.
단계 vii 및 viii ( 엔드 -포인트 방법)
단계 vii)에서 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합이 엔드-포인트 어세이로 검출된다. 획득된 사전처리된 부분 중 적어도 일부가 엔드-포인트 검출 어세이를 거친다. 전체 부분을 엔드-포인트 어세이를 위해 사용하는 것이 가능하다. 대안적으로 부분의 일부가 엔드-포인트 어세이로 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 검출하도록 사용되고 다른 일부가 부분 중 제1 일부의 결과에 따라 추가의 검사를 위해 저장된다.
"엔드-포인트 어세이"라는 용어는 소위 실시간 어세이에 대조적으로, 관심 결과물이 고정된 어세이 배양 기간 후에의 종료 결과인 어세이로서 이해된다. 본 발명의 검출 방법의 맥락에서 이것은 단계 iv) 및 v) 후에 획득된 처리된 샘플이 취해지며 단계 iv) 및 v) 후에 처리된 샘플 내에 존재하는 항체 양의 표시를 제공하는 검사를 거침을 의미한다.
엔드-포인트 검출 어세이는 예를 들어 검사의 끝에서 색상, 형광성, 광 흡수력 또는 발광의 레벨에 대한 변화를 검출할 수 있다. 엔드-포인트 어세이 검출은 분광기, 형광 현미 기술, 화학발광 또는 전자화학발광 검출 기술과 같은 기술에 의해 적절하게 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 분광/착색 플레이트 리더, 형광 플레이트 리더 또는 화학 발광 리더의 사용을 포함할 수 있다.
적절한 엔드-포인트 어세이는 효소결합면역흡착검사(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 방사성 동위원소 표지 어세이, 발광 분광 어세이, 면역 형광 검사, 면역침전, 면역세포화학, 면역조직화학, 전자화학 임피던스 분광학(EIS) 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 ELISA는 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 항원은 미콜산 유래 항원이고 항체는 미콜산 유래 항원에 대한 항체이다.
엔드-포인트 어세이에서, 미콜산 유래 항원과 항체의 상호작용은 미콜산 파생물에 대한 항체의 중연쇄와 결합하는 2차 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 다수의 적절한 2차 항체가 상업적으로 입수 가능하다. 2차 항체는 비드, 예를 들어 금 비드에 결합될 수 있으며, 또는 리포솜과 연관된다. 2차 항체의 예는 단백질 A 또는 G일 수 있고, 검출을 가능하게 하는 효소와 복합된다.
단계 vii)에서 고정된 미콜산 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 구체적인 적절한 기술은 소위 면역금 여과 어세이(IGFA), 그리고 특히 점 면역금 여과 어세이(DIGFA)이다.
면역금 여과 어세이는 ELISA와 면역금 기술을 결합하는 방법이며 분석될 샘플을 미공성 멤브레인, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인을 통해 여과하고 멤브레인 상에 코팅된 캡처 프로브에 의해 캡처되는 방법이다. 콜로이드 금 표지된 프로브가 동일한 방식으로 미공성 멤브레인을 통해 여과하도록 허용된다. 미공성 멤브레인을 캡처 프로브를 위한 캐리어로서 사용하고 멤브레인의 모세관 작용 및 삼투성을 이용함으로써 항원 및 항체가 쉽게 반응할 수 있으며 편리하게 선택적인 세척 및/또는 차단 단계를 거칠 수 있다. 콜로이드 금 표지된 프로브가 캡처 프로브에 결합할 때 콜로이드 금 입자가 집합하여 육안으로 볼 수 있는 붉은색 점이 나타난다.
면역금 여과 어세이는 멤브레인 및 반응제 외에 다른 장비가 필요하지 않으며 수 분 내에 육안으로 결과를 관찰할 수 있기 때문에 단순하고 신속한 검출 방법이다.
면역금 여과 어세이에서 미공성 멤브레인은 예를 들어 니트로셀룰로오스 멤브레인, 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 또는 적절한 구멍 지름을 갖는 PVDF 멤브레인일 수 있다. 바람직하게 니트로셀룰로오스가 사용된다. 적절한 구멍 지름은 0.2 내지 5㎛이다.
엔드-포인트 방법에서 샘플에 함유된 항체는 엔드-포인트 어세이에 의해 검출된다. 엔드-포인트 어세이는 면역금 여과 어세이인 경우에, 본 발명의 검출 방법의 단계 vi) 및 viii)에서 언급된 기판은 고정된 미콜산 유래 항원으로 코팅된 미공성 멤브레인, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인이다. 미콜산 유래 항원을 미공성 멤브레인 상에 고정한 후에, 단계 i) 내지 v)에서 사전처리된 샘플 부분이 멤브레인에 적용될 수 있다. 멤브레인 상의 샘플 부분의 추가 및 샘플 내에 포함된 항체와 고정된 미콜산 유래 항원의 반응 후에, 콜로이드 금 표지된 제2 항체가 항원-항체 반응 위치에 금 입자 집합을 갖도록 멤브레인 상에 추가된다. 집합의 경우에 눈에 보이는 적색 또는 갈색 스팟이 형성된다. 스팟의 세기는 항원과 항체 사이의 반응의 정도, 즉 사전처리된 샘플 내의 항체의 양에 비례한다. 제어 기판이 검사 기판보다 강한 신호를 나타내는 경우에, 이것은 샘플이 유래한 사람 내에 활동성 결핵이 있음을 나타낸다. 다른 한 편으로, 제어 기판이 검사 기판과 비교하여 색상 강도 신호의 차이를 나타내지 않으면(또는 뚜렷하지 않다면) 이것은 샘플이 유래한 사람 또는 동물이 활동성 결핵을 갖지 않음을 나타낸다.
면역금 여과 어세이의 다양한 단계 사이에서 멤브레인이 적절한 완충제, 예를 들어 PBS 기반 완충제로 세척될 수 있다. 이러한 완충제는 예를 들어 생리학적 pH의 물 내에 NaCl, KCl, KH2P04, Na2HPO4 및 EDTA를 포함하는 PBS/AE 완충제일 수 있다. 이러한 완충제는 pH 7.4로 조정된 0.025%(m/v) 아지드화 나트륨 및 1mM EDTA를 함유하는 재증류되고 탈이온화된 물의 리터당 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH2P04 및 1.05g Na2HP04로 이루어진 PBS 기반 완충제일 수 있다.
DIGFA가 사용되는 경우에, 미공성 멤브레인이 점 방식으로 미콜산 유래 항원으로 코팅될 수 있다. DIGFA 어세이에서 단계 i) 내지 vi)에서 사전처리된 샘플은 점들의 형태로 멤브레인에 도포된다. 또한 콜로이드 금 표지된 제2 항체가 점들의 형태로 추가된다. 이러한 실시예에서, 제거 및 검사 기판은 바람직하게는 자신에 고정된 미콜산 유래 항원의 점들을 갖는 동일한 미공성 멤브레인이다. 본 발명의 검출 방법은 동일한 멤브레인 상에서 제어 및 검사 부분 모두를 검출하는 것을 가능하게 한다. 이것은 검사의 신뢰 가능성을 향상시키며 비용 효율적이다. DIGFA 어세이는 몇몇 멤브레인 상의 서로 다른 스팟에 다양한 마이코박테리아 스트레인으로부터 파생한 다양한 항원이 고정될 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 이러한 방식으로 환자가 감염된 마이코박테리아 스트레인에 대한 정보를 제공하는 것이 가능해진다. DIGFA를 이용하는 다른 장점은, DIGFA가 멤브레인의 크기에 의존하여 비제한적인 스팟 양에서의 항체-항원 상호작용의 빠르고 신뢰 가능한 검출을 가능하게 하기 때문에 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 서로 다른 사람들로부터 유래된 샘플들이 한 번의 검사로 비교될 수 있다는 점이다.
미콜산 항원에 대한 항체 및/또는 다른 재료의 결합의 검출, 예를 들어 DIGFA 어세이 경우에서의 붉은 착색의 검출이 자동화된 디바이스에서 수행될 수 있다. 다양한 자동화된 디바이스가 당업자에게 알려질 것이고 당업자는 검사 기판과 제어 기판 사이의 결합 정도 또는 범위에 대한 단계 viii)의 비교를 하기 위한 적절한 소프트웨어 수단을 선택할 수 있을 것이며, 임의의 관찰된 검사 기판에 대한 더 작은 결합은 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표이다. 이러한 맥락에서, 더 작다는 것이 질적으로 및 양적으로 작은 것으로 해석될 수 있으며, 즉 더 작은 결합은 더 약한 결합을 가지는 것뿐 아니라 더 적은 결합 이벤트를 가지는 것으로도 해석될 수 있다.
미콜산 항원에 대한 항체 및/또는 다른 재료의 결합의 검출은 시각적 검출 기술 또는 임의의 다른 적절한 검출 기술에 의해 수행될 수 있다. 특히 바람직한 실시예에서, 엔드-포인트 어세이에 의한 검출은 시각적으로, 바람직하게는 육안으로 이루어진다. 이것은 비용이 높고 복잡한 검출 기술을 필요로 하지 않는 쉬운 검출이라는 장점을 가진다.
DIGFA가 사용되는 경우에, 미콜산 항원에 대한 항체, 항체들 및/또는 다른 재료의 결합은 육안으로 평가될 수 있다.
시각적 신호, 예로서 DIGFA 어세이가 엔드-포인트 어세이로서 적용된 경우에는 붉은 착색이 또한 모바일 앱, 즉 태블릿 컴퓨터 또는 스마트폰과 같은 모바일 디바이스 상에서 실행하도록 설계된 컴퓨터 프로그램의 도움으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 검사 기판 및 제어 기판의 결합 신호를 비교하도록 설계되고 샘플이 유래한 사람 또는 동물이 활동성 결핵을 갖는지를 나타내는 앱이 사용될 수 있다.
시스템
본 발명의 다른 양태는 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 엔드-포인트 방법을 수행하기 위한 시스템 또는 디바이스, 바람직하게는 휴대용 시스템 또는 디바이스에 관한 것이다. 이 시스템은 1) 본 발명의 방법을 이용한 검출에 적합한 샘플을 만들기 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 시스템 또는 디바이스; 및 2) 사전처리된 샘플 내에 함유된 항체의 상호작용의 검출을 가능하게 하는 검출 수단으로 하위분할될 수 있다.
일 실시예에서, 시스템은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 추가의 컨테이너로부터 제1 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 검출 기판 및 다른 추가의 컨테이너로부터 제2 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제2 검출 기판을 포함한다.
특정 실시예에서 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 시스템은 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 추가의 컨테이너로부터 제1 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 검출 기판 및 다른 추가의 컨테이너로부터 제2 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제2 검출 기판을 포함하며, 제1 및 제2 검출 기판은 미공성 멤브레인이다.
제1 및 제2 검출 기판은 바람직하게는 미공성 멤브레인이고, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인이다. 제1 및 제2 검출 기판은 이 경우에 별개의 스팟을 가질 수 있으며, 즉 동일한 멤브레인 상에 제1 및 제2 검출 스팟을 가질 수 있다. 이러한 방식으로 하나의 동일한 멤브레인이 항체/항원 상호작용의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이것은 검출의 신뢰 가능성을 향상시키며 검사 기판 및 제어 기판 상에서 검출된 상호작용을 비교하는 것을 더 쉽게 만든다. 또한, 이것은 다수의 샘플이 동시에 검사되는 것을 가능하게 한다.
검출 기판들은 시스템의 다른 구성요소들과 물리적 접속을 할 필요가 없다. 예를 들어 추가의 컨테이너 및 다른 추가의 컨테이너를 통과한 후에 유래된 샘플은 추가의 사용까지 또는 검출 기판으로의 수송을 위해 저장될 수 있다. 이러한 방식으로 실험자는 자신의 검사를 계획함에 있어서 큰 유연성을 가지게 된다. 예를 들어, 이것은 다수의 피검체로부터 사전처리되는 샘플들이 수집되는 것을 가능하게 하며, 그에 따라 이들은 하나의 기판 재료 상에서 모두 한번에 검사될 수 있다. 이것은 또한 다수의 환자로부터의 검사 샘플들을 동일한 조건하에서 검사하는 쉽게 만든다.
따라서, 다른 양태에서 본 발명은 검출 방법에서의 검출에 적합한 샘플을 만들기 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하는 시스템 또는 디바이스, 바람직하게는 휴대용 시스템 또는 디바이스와 관련되며, 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너와의 하류 접속으로 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 처리된 샘플을 저장 및 수송하는 수단을 포함한다. 이러한 수단 또는 이러한 수단들은 각각 제1 및 제2 기판을 포함하는 컨테이너와 물리적으로 접속할 필요가 없으며 사전처리된 샘플 부분들을 수용하기 위해서 시스템이 사용될 때 이러한 컨테이너들의 하류에 위치된다.
일 실시예에서, 본 발명의 방법을 이용한 검출에 적합한 샘플을 만들기 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하는 시스템 또는 디바이스는 두 개의 열을 포함할 수 있다. 각 열은 두 개의 컴파트먼트 또는 컨테이너를 포함한다. 상부 컴파트먼트 또는 컨테이너는 스테롤 지질로 코팅된 기판, 예를 들어 콜레스테롤로 코팅된 비드를 포함한다. 열들 중 하나의 하부 컴파트먼트는 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하며 다른 열의 하부 컴파트먼트는 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함한다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 스트림을 사전처리하는 시스템에 관련되며, 이것은 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림을 각각 수용하도록 구성된 적어도 제1 열 및 제2 열로서, 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컴파트먼트를 포함하는 제1 열; 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컴파트먼트를 포함하는 제2 열; 및 열들을 통과하여 처리된 샘플들의 저장 또는 수송을 위한 수단을 포함한다. 저장 및 수송을 위한 이러한 수단 또는 이러한 수단들은 각각 제1 및 제2 기판을 포함하는 컨테이너와 물리적으로 접속할 필요가 없으며 사전처리된 동일한 부분들을 수용하기 위해서 시스템이 사용될 때 열들의 하류에 위치된다.
이러한 원리는 또한 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 엔드-포인트 방법을 수행하기 위한 시스템에도 적용될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명은 또한 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내의 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하기 위한 시스템에도 관련되고, 이것은 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 제1 샘플 스트림 및 제2 샘프 스트림을 각각 수용하도록 구성된 적어도 제1 열 및 제2 열로서, 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컴파트먼트를 포함하는 제1 열; 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컴파트먼트를 포함하는 제2 열; 및 제1 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 검출 기판 및 제2 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제2 검출 기판을 포함한다.
바람직하게 시스템 또는 디바이스는 피부 침투 단부로부터 혈액 샘플을 수용하고 혈액 샘플을 피부 부위로부터 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너/컴파트먼트로 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙에 접속된 피부 침투 단부를 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 시스템 또는 디바이스는 혈액 샘플을 수용하도록 제1 튜빙과 접속하고 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛을 포함한다.
추가의 실시예에서, 시스템 또는 디바이스는 피부 침투 단부로부터 혈액 샘플을 수용하고 혈액 샘플을 피부 부위로부터 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙에 접속된 피부 침투 단부; 혈액 샘플을 수용하도록 제1 튜빙과 접속하고 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛; 샘플을 수용하며 스테롤 지질을 포함하는 제1 컨테이너; 샘플을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 제1 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 제2 컨테이너; 제2 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 제3 컨테이너; 및 처리된 샘플의 저장 또는 수송을 위한 수단을 포함한다.
시스템 또는 디바이스를 통과하는 스트림은 바람직하게는 펌프에 의해 구동되고, 바람직하게는 연속 흐름 펌프, 예를 들어 연동 펌프 또는 격막 펌프에 의해 구동된다. 열이 적용되는 경우에, 스트림은 중력 또는 모세관 작용에 의해 구동될 수 있다.
피부 침투 수단은 주사침과 같이 사람 또는 동물로부터 혈액 샘플을 획득하기 위한 임의의 적절한 수단일 수 있다.
제1 튜빙은 디바이스의 목적에 적합한 크기를 가지며, 즉 피부 침투 수단 및 제1 컨테이너에 잘 적응 가능해야 한다.
시스템 또는 디바이스의 구성요소들, 즉 컨테이너, 희석 및 필터 유닛은 적절한 연결 튜빙에 의해 상호접속될 수 있다. 이와 다르게 디바이스의 구성요소들은 서로에 직접 접속될 수 있도록 설계될 수 있으며, 예를 들어 기판이 아닌 샘플이 선택적으로 통과할 수 있는 필터에 의해 분리된다. 본 발명에서 사용되는 튜빙의 재료는 혈액 샘플 검사 분야의 당업자에게 알려진 임의의 적합한 재료일 수 있다. 적절한 재료는 혈액/혈장/혈청 성분에 비활성이며 폴리테트라플루오로에틸렌(예로서, Teflon®), 폴리프로필렌, 폴리에테르 케톤(PEEK) 및 폴리에틸렌을 포함한다.
추가의 구성요소들은 디바이스의 구성요소들 사이에 접속될 수 있다. 이러한 추가의 구성요소들은 구성요소들을 연결하고 구성요소들에 직접 부착되는 튜빙 내에 접속될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 i-v를 수행하기 위한 시스템 또는 하위-디바이스는 또한 혈액 또는 혈장을 희석하는 수단을 포함할 수 있다. 이러한 수단은 스테롤 지질 함유 컨테이너 앞에, 필터 유닛 앞에, 필터 유닛과 스테롤 지질 함유 컨테이너 사이에, 스테롤 함유 컨테이너와 다른(추가의 및 다른 추가의 또는 제2 및 제3) 컨테이너 사이에, 또는 추가의/다른 추가의 또는 제2 또는 제3 컨테이너와 저장 및 수송을 위한 수단 사이에 접속된다. 예를 들어 10ml 컨테이너는 추가의 또는 제2 컨테이너 및 다른 추가의 또는 제3 컨테이너의 배출구에 구현될 수 있다. 적절한 완충제는 이미 컨테이너 내에 존재할 수 있거나 또는 원하는 희석을 제공하기 위해서 이러한 컨테이너 내에 추가될 수 있다. 이러한 방식으로 샘플의 부피는 본 발명의 방법의 대부분의 단계 동안에 가능한 한 낮게 유지되며, 이것은 프로세스의 속도 및 본 발명의 디바이스의 소형화에 있어서 유리하다.
필터 유닛은 필터 행렬을 포함할 수 있다. 바람직하게 필터는 소형화를 위해서 필터 마이크로칩 상에 구현된다.
컨테이너들은 나선형 채널 또는 나선형 튜브와 같은 용기 또는 채널 또는 튜빙일 수 있다. 나선형 채널 또는 튜브는 이러한 구조가 작은 공간만을 차지하는 동시에 긴 흐름 경로를 유지하기 때문에 바람직하다. 나선형 채널 또는 튜브는 바람직하게는 마이크로칩 상에 구현될 수 있다. 이것은 본 발명의 디바이스의 소형화에 기여한다. "컨테이너"라는 용어는 광범위하게 해석되어야만 하며, 즉 이것은 다른 유닛 내의 정의된 영역, 즉 컴파트먼트, 예를 들어 열의 컴파트먼트로서 볼 수 있다. "컨테이너" 및 "컴파트먼트"라는 용어는 따라서 본 발명의 맥락에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 중요한 것은 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너 및 다른(추가의 또는 다른 추가의 또는 (제2 및 제3)) 컨테이너가 공간적으로 분리되는 것이다. 이와 관련하여 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너는 추가의 (또는 제2) 컨테이너와 함께 하나의 열 내에 포함될 수 있는 반면 스테롤 지질을 포함하는 다른 컨테이너는 다른 추가의 (또는 제3) 컨테이너와 함께 하나의 열 내에 포함된다. 본 발명의 맥락에서 검사 기판 상에서 검사될 스트림을 준비하기 위한 열은 미콜산 유래 항원으로 코팅된 하부(또는 하류) 기판으로부터 장벽에 의해 분리되는, 그러나 유체 연통되는, 스테롤 지질로 코팅된 상부(또는 상류) 기판을 포함할 수 있다. 제어 기판 상에서 검사될 스트림을 준비하기 위한 열은 미콜산 유래 항원으로 코팅되지 않은 하부(또는 하류) 기판으로부터 장벽에 의해 분리되는, 그러나 유체 연통되는, 스테롤 지질로 코팅된 상부(또는 상류) 기판을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 접속한다는 표현은 검사될 샘플이 장벽을 통과할 수 있지만 장벽이 기판의 통과는 허용하지 않음을 의미한다는 것이 이해된다. 이러한 열에 적절한 기판은 비드이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법으로 검출에 적합한 샘플을 만들기 위해 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하기 위한 본 발명의 시스템의 실시예는 제1 샘플 스트림 및 제2 샘프 스트림을 각각 수용하도록 구성된 적어도 제1 열 및 제2 열을 포함하고, 이때 제1 열은 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너를 포함하며; 제2 열은 스테롤 지질을 포함하는 컨테이너 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너를 포함한다.
컨테이너들의 재료는 바람직하게는 동일할 수 있으며 이에 적합한 재료는 bk-7 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르 케톤 또는 폴리에틸렌일 수 있다. 두 컨테이너 사이의 경계는 기판 재료가 통과하는 것을 허용하지 않지만 샘플 스트림의 통과를 허용하는 필터일 수 있다. 컨테이너들의 기판들은 예를 들어 bk-7 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 폴리에테르 케톤 또는 폴리에틸렌과 같은 샘플의 분자들의 불특정 결합에 대해 비활성인 재료여야만 한다. 기판은 비드, 선택적으로는 교차결합된 비드, 예를 들어 폴리스티렌 비드의 형태일 수 있다.
본 발명의 시스템은 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 컨테이너(제2 컨테이너) 및 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판을 포함하는 컨테이너를 포함한다. 고정된 미콜산 유래 항원 대신, 후자의 컨테이너는 불특정 결합이 발생하지 않는 한 비활성 코팅일 수 있거나 코팅이 없을 수 있다.
처리된 샘플의 저장 및 수송을 위한 수단은 작은 약병일 수 있으며, 샘플은 예를 들어 점 면역금 여과 어세이에 의한 추가의 분석을 위해 저장된다. 이와 다르게, 이러한 수단은 예를 들어 점 면역금 여과 어세이에서의 점으로서 부분을 스팟하기 위해, 엔드-포인트 어세이의 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 기판에 본 발명의 방법의 단계 i)-v)에서 처리된 샘플 부분을 전달하도록 적용될 수 있는 피펫(pipette)에 의해 형성될 수 있다.
디바이스/시스템은 기판상의 고정된 항원에 대한 미콜산 항체의 결합의 비교를 수행하기에 적합한 소프트웨어 프로그램을 갖는 컴퓨터와 같은 임의의 적절한 자동화된 분석 수단에 접속될 수 있다.
청구항 제32항에 따른 시스템의 예시적인 실시예가 도 2에 도시되었다.
도 2는 바늘(101)로부터 혈액을 수용하고 피부 부위로부터 소정 양의 혈액을 운반하도록 배치 및 구성된 제1 튜빙(102)에 접속된 피부 침투 바늘(1)을 도시한다. 튜빙(101)은 필터 유닛(103)에 접속된다. 이러한 필터 유닛은 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하는 역할을 한다. 필터 유닛(103)은 자신의 내부 벽이 스테롤 지질로 코팅된 나선형 채널 형태인 제1 컨테이너(14)에 튜빙(113)을 통해서 접속된다. 나선형 채널은 수동 밸브 분기점의 형태로 혈장을 분할하기 위한 수단(105)과 튜빙(114)을 통해서 접속된다. 분기점의 하나의 분기는 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 제1 혈장 스트림을 수용하도록 튜빙(116)을 통해 제2 컨테이너(106)에 접속된다. 분기점의 다른 분기는 제2 혈장 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 제3 컨테이너(107)와 튜빙(115)을 통해 접속된다. 이러한 실시예에서 컨테이너(106, 107)는 자신의 내부 벽이 미콜산 유래 항원으로 코팅되거나(컨테이너(106)) 또는 미콜산 유래 항원으로 코팅되지 않은(컨테이너(107)) 나선형 채널의 형태를 가진다. 컨테이너(106, 107)는 각각 희석 컨테이너(111, 112)와 각각 튜빙(117, 118)을 통해서 접속된다. 이러한 컨테이너는 적절한 희석 완충제로 사전충전될 수 있거나 또는 희석 완충제를 도입하기 위한 유입구(121, 122)를 포함한다. 희석 컨테이너(121, 122)는 개별 튜빙(119, 120)을 통해서 저장 또는 수송을 위한 수단(108, 109)에 각각 접속될 수 있다. 이와 다르게, 희석 컨테이너(121, 122)는 엔드-포인트 어세이로 검사되는 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 검사 및 제어 기판에 개별 튜빙(119, 120)을 통해서 접속될 수 있다.
키트
본 발명의 다른 양태는 결핵의 진단 또는 결핵 진단을 위한 샘플의 사전처리에 사용하기 위한 키트에 관한 것으로, 하나 이상의 피부 침투 수단; 하나 이상의 튜빙; 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 하나 이상의 컨테이너; 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 기판을 포함하는 하나 이상의 컨테이너; 고정된 미콜산 유래 항원을 갖지 않는 기판을 포함하는 하나 이상의 컨테이너; 선택적으로 샘플의 저장 및 수송을 위한 하나 이상의 컨테이너; 선택적으로 혈액 또는 혈장 및/또는 필터 유닛을 희석하기 위한 수단; 미콜산 유래 항원이 고정된 적어도 하나의 미공성 멤브레인, 및 선택적으로 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내에 함유된 미콜산 유래 항원에 대항하는 항체의 중연쇄에 결합하는 2차 항체, 바람직하게는 콜로이드 금-표지 2차 항체를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 키트는: 하나 이상의 피부 침투 수단; 하나 이상의 튜빙; 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 아래의 고정된 미콜산 유래 항원으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트를 포함하는 하나 이상의 열; 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 아래의 고정된 미콜산 유래 항원으로 코팅되지 않은 기판을 포함하는 컴파트먼트를 포함하는 하나 이상의 열; 선택적으로 샘플의 수송 및 저장을 위한 하나 이상의 컨테이너; 선택적으로 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단 및/또는 필터 유닛; 선택적으로 자신에 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 적어도 하나의 미공성 멤브레인; 및 선택적으로 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내에 들어있는 미콜산 유래 항원에 대한 항체의 중연쇄에 결합하는 2차 항체를 포함한다.
키트는 또한 미공성 멤브레인에 본 발명의 방법의 단계 i)-v)에 따라 사전처리된 샘플 부분을 전달하기 위한 하나 이상의 수단, 예를 들어 피펫 및 피펫 팁과 같은 피펫 악세서리를 포함할 수 있다.
키트는 약병 또는 튜브와 같이 추가의 사용을 위해 단계 i)-v)에 따라 사전처리된 샘플 부분을 저장하기 위한 하나 이상의 수단 또한 포함할 수 있다.
키트는 나사, 클램프, 글루, 테이프, 나사드라이버 등과 같이 구성요소들을 조립하기 위한 도구도 포함할 수 있다.
키트는 혈액 분석 동안에 제2 및 제3 컨테이너의 배출구에 구현될 수 있는 컨테이너(예를 들어 10ml)와 같이 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단도 포함할 수 있다. 적절한 완충제는 컨테이너 내에 이미 존재할 수 있거나 또는 원하는 희석을 제공하도록 이러한 컨테이너 내로 추가될 수 있다.
키트의 구성요소들은 결핵 진단 검사를 수행하는 사람이 즉석에서, 즉 현장 검사로 본 발명의 시스템을 조립하는 것을 가능하게 한다. 따라서 키트의 구성요소들이 본 발명의 시스템에 대해 위에서 설명된 것과 동일한 특징 및 바람직한 속성을 가짐이 이해된다. 본 발명의 시스템은 본 발명의 키트의 구성요소들에 의해 쉽게 조립되며, 즉 전문적인 기술적 배경이 요구되지 않는다. 키트에는 편의상 조립 및 사용을 위한 장비가 제공될 수 있다.
스테롤 지질
본 발명의 맥락에서 사용되는 스테롤 지질은 바람직하게는 콜레스테롤 또는 그의 파생물이다. 스테롤 지질은 또한 스테롤 수식된 인지질일 수 있다. 이러한 스테롤 수식된 지질은 스테롤 수식된 인지질, 예를 들어 스테롤 수식된 포스파티딜콜린 지질 또는 글리세로인지질일 수 있다. 이러한 스테롤 수식된 지질에서, 스테롤은 바람직하게는 콜레스테롤이다. 본 발명의 목적에 적합한 스테롤 수식된 지질의 좋은 예는 1-팔미토일-2-콜레스테릴 카르보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린이다.
스테롤 지질은 바람직하게는 표면상에 고정된다. 예시는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 에스테르를 함유하는 코팅을 갖는 기판이며 이때 콜레스테롤 에스테르는 콜레스테롤 리놀레산염이고, 여기에서 콜레스테롤에 대한 리놀레산의 중량비는 1:3 내지 1:20의 범위 내에 있다.
기판은 또한 다른 분자들과의 조합으로 스테롤 지질, 바람직하게는 콜레스테롤로 코팅될 수 있다.
바람직하게 이러한 스테롤 지질은 포스파티딜콜린과 함께 기판상에 고정된다. 스테롤 지질은 혈액/혈장/혈청으로부터 항콜레스테롤 항체를 제거하며, 그렇지 않으면 이러한 항콜레스테롤 항체가 기판상의 미콜산 항원과 교차반응하여 결핵의 위양성 진단으로 이어진다. 포스파티딜콜린은 혈액 샘플 내의 소수성 재료에 결합할 것이며, 이는 샘플이 노출 후에 더욱 친수성이 되게 한다. 결과적인 친수성 샘플은 후속하는 방법 단계들에서 더욱 다루기 쉬울 것이며 응고하는 경향이 더 낮을 것이다.
일 실시예에서 스테롤 지질, 바람직하게는 콜레스테롤이 기판상에, 예를 들어 튜빙의 내부 벽 상에 펙틴과 함께 고정된다. 이러한 실시예에서 스테롤 지질은 혈액/혈장/혈청으로부터 항콜레스테롤 항체를 제거하며, 그렇지 않으면 이러한 항콜레스테롤 항체가 기판상의 미콜산 항원과 교차반응하여 결핵의 위양성 진단으로 이어진다. 또한, 펙틴은 샘플 내의 콜레스테롤을 제거하며 그와 함께 콜레스테롤 항체도 제거한다. 이것은 검출의 더욱 높은 신뢰 가능성으로 이어진다.
이와 다르게 스테롤 지질, 바람직하게는 콜레스테롤은 예컨대 β-시클로덱스트린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 덱스트린과 같은 콜레스테롤 결합 헤테로 다당류와 같은 혈액 유래 샘플 내의 콜레스테롤에 결합하는 화합물과 함께 고정된다.
예를 들어 스테롤 지질, 바람직하게는 콜레스테롤은 속이 빈 섬유 폴리프로필렌 멤브레인 또는 유리와 같은 기판상에 β-시클로덱스트린 또는 펙틴, 암포테리신 B로 고정된다.
스테롤 지질, 특히 콜레스테롤을 기판상에 고정하기 위한 다수의 방법이 알려졌다. 당업자는 자신의 특정 코팅에 적합한 프로토콜을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어 코팅은 먼저 유기 용매 내에 콜레스테롤을 용해시키고, 추가로 에탄올 용액 내에 용해된 콜레스테롤을 희석시키고, 용액이 컨테이너 내의 제자리에서 증발하게 하고, 코팅된 컨테이너를 완충 식염수로 세척하고, 컨테이너를 공기 건조하며, 방습 파우치 내에 컨테이너를 건조제와 함께 밀봉함으로써 도포될 수 있다.
미콜산 유래 항원
미콜산 유래 항원은 악성 및 병원성 마이코박테리아로부터 선택된 마이코박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 미콜산 항원은 결핵균으로부터 유래된다. 이러한 미콜산 유래 항원은 미콜산, 코드 인자, 화학적으로 수식된 미콜산, 화학적으로 수식된 코드 인자, 합성 미콜산 파생물, 합성 코드 인자 파생물의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나이다.
결핵균과 같은 마이코박테리아의 세포벽을 포함하는 미콜산 파생물의 자연 소스는 종종 세포벽에 결합되는 파생물로서 서로 다른 분류의 화합물 및 서로 다른 미콜산 동족체의 혼합물을 포함한다.
미콜산 자신에 더하여, 마이코박테리아의 세포는 또한 미콜산의 당 에스테르와 같은 산으로부터 유래된 화합물을 포함한다. 자연적으로 발생하는 당 에스테르는 예를 들어 흔히 TDM으로 지칭되며 "코드 인자"로도 알려진 트레할로스-6,6'-디미콜레이트; 및 트레할로스 모노미콜레이트(종종 TMM으로 지칭됨)를 포함한다. 이러한 당 에스테르는 서로 다른 분류의 미콜산 및 각 분류 내의 서로 다른 동족체의 복합 혼합물로서 자연적으로 발생한다.
천연물에 존재하는 코드 인자의 신원을 확립하고 개별 분자 종을 분리하는 것이 어렵기 때문에, 본 발명의 목적을 위해 반합성 또는 보다 바람직하게는 합성 미콜산 파생물을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 미콜산 유닛의 구조가 코드 인자의 생리학적 활동에 영향을 미친다는 것이 알려졌다. 따라서 자연 미콜산 파생물이 본 발명에서 사용될 때 이러한 파생물들 사이의 생리학적 활동에서의 차이 및 그에 따른 샘플 내 항원의 항체 결합의 검출은 검출 결과에 예측 불가능성 및 불확실성을 부여할 수 있다. 또한, 자연 미콜산 파생물의 제조에서의 편차는 서로 다른 테스트 배치의 재생산 가능성과 관련한 문제를 발생시킬 수 있다.
따라서 높은 신뢰 가능성 및 재생산 가능한 결과를 갖는 검출을 제공할 수 있도록, 자연 혼합물에서 발견된 단일 화합물과 동일하거나 근접하게 유사한 반합성 또는 더욱 바람직하게는 합성 미콜산 파생물을 사용하는 것이 바람직하다.
적절한 반합성 파생물은 미콜산을 당 그룹에 미콜산을 부착함으로써 제조될 수 있는 반합성 코드 인자를 포함한다. 그러나 이러한 반합성 인자는 여전히 서로 다른 동족체의 혼합물을 포함한다.
따라서 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 구체적인 적절한 미콜산 파생물은 합성 코드 인자, 예를 들어 WO 2010/08667에 기술된 합성 코드 인자, 즉 식 (M)x (S)y(M')z의 화합물이고, 이때 x는 1 내지 6, y는 1 내지 12, z는 0 내지 10이며, 각각의 M 및 각각의 M'는 독립적으로 β-히드록시산 일부(moiety)를 포함하는 미콜산 잔여물이고 각각의 S는 단당류 유닛이다.
미콜산 항원은 동종 및 이종 화합물 혼합들로부터 선택된 형태일 수 있다. 미콜산 유래 항원은 예를 들어 포스파티딜콜린과 같은 인지질과의 조합으로 사용될 수 있다.
미콜산 항원은 당업자에게 알려진 다양한 방식으로 기판상에 고정될 수 있다. 합성 미콜산 유래 항원은 기판 재료상의 고정을 가능하게 하는 특정한 활성 그룹과 합성될 수 있다.
예를 들어, 실리카 상의 고정을 위해서 실란 결합 반응이 적용될 수 있다.
니트로셀룰로오스 기판의 경우, 미콜산 유래 항원은 아래와 같이 적절히 고정될 수 있다. 미콜산 유래 항원은 냉동건조된 형태로 획득될 수 있고 예를 들어 클로로포름: 메탄올: 물 혼합물과 같은 용매 혼합물 내에서 재구성될 수 있으며, 대략 수 나노몰, 예를 들어 1nM의 농도로 희석된다. 이러한 희석은 그 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 스팟될 수 있으며, 각 스팟은 사전결정된 거리, 예를 들어 1cm만큼 분리된다. 스팟을 건조한 후에 미콜산 유래 항원은 멤브레인 상에 고정된다. 대안적인 고정 방법은 예를 들어 멤브레인 상에 용액을 스팟하기 전에 항원 코팅 용액을 형성하도록 헥산 또는 뜨거운 PBS 내에 항원을 용해시키는 것을 포함할 수 있다.
예
아래의 예는 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것으로 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예에서 사람의 혈청 샘플이 ELISA 어세이로 미콜산 파생물에 대항하는 항체에 대해 검사되었다. ELISA 방법은 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 또는 전자화학 임피던스 분광학(EIS) 또는 고리 공명(간섭측정)보다 덜 민감하기 때문에 검출 방법으로서 선택되었다. 따라서 만약 ELISA로 만족스러운 결과가 획득된다면, 이것은 더욱 민감한 검출 방법으로도 획득될 수 있다고 결론지을 수 있다.
재료:
· 샘플(사람의 혈장 또는 혈청)
· 0.2 미크론 스핀필터(Whatman)
· 미콜산 및 콜레스테롤 기반 비드
· 헥산 내에 용해된 다클론(polyclonal) 미콜산
· 폴리스티렌 ELISA 플레이트
· PBS
· 차단 완충제: PBS 내의 0.5% 카제인
· 1-단계 초 TMB-ELISA 기판 용액(열 과학)
· 2M 황산
· 2차 항체: 토끼 항인체 Ig HRP(DAKO)
절차
ELISA 플레이트의 코팅
96개의 우물을 갖는 ELISA 플레이트의 각 우물에 3㎍/ml의 농도인 다클론 미콜산을 갖는 헥산 50㎕가 추가되었다. 플레이트는 4℃에서 24시간 동안 배양되며 후속하여 PBS를 이용해 2차례 세척된다.
비드 준비
본 예시에서 본 발명의 방법의 단계들 ii), iv) 및 v)에서 언급된 기판을 나타내는 기판으로서 비드가 사용되었다.
이러한 예의 목적을 위해 Toyopearl AF-Amino-650M 비드(Tosoh Bioscience)가 사용되었다. 비드는 제조자의 지시에 따라 준비되었다. 콜레스테롤로서 7-케토 콜레스테롤이 아세토니트릴(3.5ml) 내에 7-케토 콜레스테롤(100mg, 0.25mmol) 및 Toyopearl 슬러리(2.5ml, 0.25mmol 반응 그룹)를 혼합함으로써 기본적으로 Abdel-Magid AF 외 다수에 기술된 바와 같은 비드에 활용되었으며, 이것은 나트륨 트리아세톡실보로하이드라이드(80mg, 0.375mmol)로 처리함으로써 이어진다(Studies on Direct and Indirect Reductive Ami-nation Procedures. J. Org. Chem. 1996: 61;3849-3862의 나트륨 트리아세톡시-보로하이드라이드를 이용한 알데하이드 및 케톤의 환원적 아미노화(Reductive Amination of Aldehydes and Ketones with Sodium Triacetoxy-borohydride)를 참조). 이러한 혼합물은 질소 대기 하의 RT에서 1.5시간 동안 저어진다. 그 후에, 반응 혼합물이 수분을 함유한 포화 NaHCO3을 추가함으로써 수냉된다(quenched). 이 비드는 H2O, 1M NaCl로 철저하게 세척되고 마지막으로 초과 리간드를 제거하도록 H2O로 세척된다. 그 후에 잔여 아미노 그룹이 8ml의 0.2M 나트륨 아세테이트 및 4ml의 무수 아세트산을 0℃의 아세트산에 30분 동안 추가하고 이어서 4ml의 무수 아세트산을 더 추가하며 25℃에서 30분간 배양함으로써 아세틸화되었다.
미콜산으로서 미콜산의 동형단백질을 자연 발생시키는 혼합물(Mw ~1100-1300)이 기본적으로 Law B, Jenner WN. Immunoassay: A Practical Guide. London: Taylor & Francis. 2005: p 11-31 및 Hermanson GT. Bioconjugate Techniques. 3판. London; Elsevier. 2013: p535-545에 기술된 바와 같이 비드에 결합되도록 사용되었다. 요약하면, N-(3-디에틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 히드로클로라이드(EDC.HCl)(57.7mg, 0.3mmol(1.2당량)) 및 N, N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(81.3mg, 0.625mmol(2.5당량))이 아민(Toyopearl 아미노 활성화된 2.5mL, 0.25mmol 반응 그룹)의 용액, 산(이소리토콜 산: 93.8mg, 0.25mmol(1당량)/미콜산: 300mg, 0.25mmol (1당량)) 및 DMF(2.5mL(10ml/lmmol)) 내의 HOBt(1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트)(40.5mg, 0.3mmol(1.2당량))에 추가되었으며 질소 하의 실온에서 24시간 동안 저어지고/섞인다. 용매는 증발에 의해 제거되었으며 비드는 물, 1M NaCl 및 물을 사용하여 세척되었다. 초과(언바운드) 아미노기는 아세틸화를 이용하여 차단되었다. 비드는 물, 1M NaCl 및 물을 사용하여 세척되었다. 먼저 질소 또는 아르곤을 갖는 비활성 대기가 생성된다. 시약의 순서는: (0℃에서) DMF을 갖는 미콜산, 다음으로 (HOBt), 10분 후에 비드, 10분 후에 베이스(DIPEA) 및 마지막으로 15분 후에 EDC이다.
샘플 준비
결핵을 앓고 있는 것으로 알려진 사람으로부터 유래된 혈청이 차단 완충제 내에서 1:5로 희석된다. 사용된 샘플은 도말(smear) 양성 및 도말 음성 환자 모두로부터 유래되었다. 0.5ml의 두 부분이 획득되고 각각 0.2 마이크론 스핀 필터에 전송되며 10000g로 원심분리된다. 통과액은 차단 완충제 내에서 1:5 내지 1:20로 혼합된다.
250㎕의 통과액이 콜레스테롤, 다클론 미콜산 또는 차단제로 코팅된 비드에 추가되었다. 비드는 실온에서 흔들린다. 배양 후에 비드는 빠르게 스핀다운되며 상청액이 샘플로서 사용되었다. 이러한 특정한 설정에서 본 발명의 방법(들)의 단계 i)-v)와 함께 비드와 샘플의 총 사전처리가 10분 내로 이루어질 수 있으며, 그 후에 분석이 직접 이어질 수 있다.
ELISA-절차
ELISA 플레이트의 우물 내의 미콜산과 항체의 불특정 결합을 차단하도록, 300㎕의 차단 완충제가 각 우물에 추가되었으며 1시간 동안 배양된다. 후속하여, 차단 완충제가 45㎕의 샘플로 대체되었다. 차단 완충제는 음성 제어로서 사용되었다. 배양 후에, 플레이트는 PBS로 세 차례 세척되었다. 세척 PBS 완충제는 차단 완충제 내의 HRP-복합 2차 항체로 대체되었다. 배양 후에, 플레이트는 다시 PBS로 세 차례 세척되었다. 후속하여 TMB-ELISA 기판의 우물마다 50㎕의 용액이 우물에 추가되었으며 실온에서 15-30분 동안 배양되었다. 반응은 우물마다 50㎕의 2M 황산을 추가함으로써 정지된다. 450nm에서의 광 흡수력이 ELISA 플레이트의 미콜산 기판에 대한 항체의 결합을 수량화하도록 측정되었다.
샘플의 처리
샘플들은 다음과 같이 처리되었다.
1. 제1 비교 연구에서, 서로 다른 사람들로부터 유래된 6개의 샘플 각각으로부터 두 부분(1 및 2)이 취해진다. 모든 부분들을 어떠한 제재 결합도 없이 비트와 개별적으로 배양되었으며(부분 1 및 2) ELISA 검출까지 저장된다. 결정된 각 부분으로부터 평균 ELISA 신호가 획득되었다. 두 부분 모두 동일한 결과를 가졌다. 이러한 두 부분의 ELISA 신호는 100%으로 설정되었다.
2. 제2 비교 연구에서, 전술된 6개의 샘플 각각으로부터 두 부분(3 및 4)이 취해진다. 부분 3의 샘플은 오직 차단제와 결합되어 비드와 개별적으로 배양되었으며 후속하여 ELISA 검출까지 저장되었다. 부분 4의 샘플은 콜레스테롤과 결합되어 비드와 개별적으로 배양되었으며 후속하여 ELISA 검출까지 저장되었다.
3. 제3 비교 연구에서, 전술된 6개의 샘플 각각으로부터 두 부분(5 및 6)이 취해진다. 부분 5의 샘플은 콜레스테롤과 결합되어 비드와 개별적으로 배양되었으며 후속하여 ELISA 검출까지 저장되었다. 부분 6의 샘플은 먼저 콜레스테롤과 결합되어 비드와 개별적으로 배양되고, 후속하여 이 샘플은 빠르게 스핀되었으며 상청액이 다클론 미콜산과 결합된 비드와의 제2 배양에서 사용되었다. 샘플은 후속하여 ELISA 검출까지 저장되었다.
4. 추가의 연구에서, 전술된 6개의 샘플 각각으로부터 두 부분(7 및 8)이 취해진다. 두 부분 7 및 8 모두 콜레스테롤과 결합된 비드 및 동시에 다클론 미콜산과 결합된 기판으로서 비드와 배양되었으며 후속하여 ELISA 검출까지 저장된다.
비드에서의 차이를 제외하면 모든 다른 조건은 모든 처리에서 동일하였다.
결과
6개 샘플의 각 부분으로부터 획득된 평균 ELISA 신호가 결정되었다. 부분 1 및 2의 ELISA 신호는 동일하였으며 100%으로 설정되었다. 다른 부분들의 ELISA 신호는 아래의 표 I에서 부분 1(또는 2)의 신호의 백분율로 나타내어졌다.
표 I ELISA 결과
Figure pct00001
이러한 결과들은 먼저 스테롤 지질에 노출되고 후속하여 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출된 샘플(부분 6의 샘플)이 검사된 어떠한 다른 부분들보다도 낮은 ELISA 신호를 가짐을 나타낸다. 명백한 차이를 부분 5 및 6 사이에서 볼 수 있으며, 이러한 비교 연구는 본 발명에 따른 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 엔드-포인트 방법의 예시적인 실시예로서 볼 수 있다. 놀랍게도 부분 6으로부터 획득된 낮은 ELISA 신호는 콜레스테롤과 결합된 비드 및 동시에 다클론 미콜산과 결합된 비드와 함께 샘플을 배양함으로써 획득될 수 없다. 사실, 부분 7 및 8의 ELISA 신호는 차단제와 결합된 또는 콜레스테롤과 결합된 비드의 ELISA 신호보다 더 높다. 또한 부분이 오직 미콜산과 결합된 비드에 노출되었을 때에는 만족스러운 결과가 획득되지 않았다. 이것으로부터, 가장 뚜렷한 신호의 감소를 획득하기 위해 샘플의 사전처리가 후속하는 두 단계인 1) 스테롤 지질로의 노출 및 2) 미콜산 파생물로의 노출 단계에서 이루어지며 그에 따라 항체 결합이 미콜산 파생물에 노출되지 않은 제어 샘플에 비교되는 것이 중요함을 나타낸다.
추가로, 샘플로부터 이러한 특정 설정에서 (본 발명의 방법(들)의 단계 i)-v)에 따른) 비드와 샘플의 모든 사전처리가 10분 내로 이루어질 수 있으며, 그 후에 분석이 직접 이어질 수 있다. 분석을 위해 필요한 시간은 적용된 검출 어세이에 의존한다. 전술된 바와 같이, ELISA를 이용한 분석 대신 다른 검출 어세이가 가능하다. 전술된 바와 같이 사전처리된 샘플은 임의의 적절한 비표지 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 본 발명인은 특히 전자화학적 임피던스 분광학(EIS)이 적용될 때 검출 기판에 대한 샘플 내에 존재하는 항체의 결합의 검출이 수초 내에 이루어질 수 있음을 발견하였다. 이것은 개인이 활동성 결핵에 감염되었는지를 신뢰 가능한 방식으로 결정하는 것을 가능하게 하며, 10분 내로 결핵의 검출을 가능하게 한다.

Claims (40)

  1. 활동성 결핵의 표시자(marker)를 검출하는 방법으로서,
    i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 단계;
    iii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 상기 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
    iv) 상기 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원(immobilised mycolic acid derived antigen)을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
    v) 상기 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계;
    vi) 단계 iv)에서 노출된 샘플 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 검사 기판에 노출시키고 단계 v)에서 노출된 샘플 부분이 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제어 기판을 거치는 단계;
    vii) 단계 vi)의 항원에 대한 항체들의 결합을 실시간으로 검출하는 단계; 및
    viii) 상기 검사 기판과 상기 제어 기판 사이의 결합의 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하고,
    임의의 관찰된 상기 검사 기판에 대한 더 작은 결합은, 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 상기 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 검사 기판 및 상기 제어 기판은 실리카 기반인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 검출은 Si 고리 공명기를 이용하는 생체센서 칩을 이용하여 수행되는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출은 표면 플라즈몬 공명 또는 전자화학적 임피던스 분광학, 등온 적정 열량측정, 생체-층 간섭측정, 광학 격자, 광 결정, 음향 공명 프로파일링, 수정 진동자 저울을 이용하여 수행되는, 방법.
  5. 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법으로서,
    i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 단계;
    iii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 상기 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
    iv) 상기 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
    v) 상기 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계; 또는 단계 vi)까지 상기 부분들 중 두 번째 부분의 적어도 일부를 저장하고, 상기 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계를 건너뛰는 단계;
    vi) 단계 iv)에서 노출된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 검사 기판에 노출시키고 단계 v)에서 노출 또는 저장된 샘플 부분의 적어도 일부를 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제어 기판에 노출시키는 단계;
    vii) 단계 vi)의 항원에 대한 항체들의 결합을 엔드-포인트 어세이(end-point assay)로 검출하는 단계; 및
    viii) 상기 검사 기판과 상기 제어 기판 사이의 결합의 정도 또는 범위를 비교하는 단계를 포함하고,
    임의의 관찰된 상기 검사 기판에 대한 더 작은 결합은 샘플이 유래한 사람 또는 동물 내의 활동성 결핵을 나타내는 상기 샘플 내의 항원에 대한 항체의 존재 지표인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 엔드-포인트 어세이는 효소결합면역흡착검사(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 방사성 동위원소 표지 어세이, 발광분광 어세이, 면역 형광 검사, 면역침전, 면역세포화학, 면역조직화학, 전자화학 임피던스 분광학으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 엔드-포인트 어세이는 면역금 여과 어세이인, 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역금 어세이는 점 면역금 어세이(DIGFA)인, 방법.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출은 시각적으로, 바람직하게는 육안으로 이루어지는, 방법.
  10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출은 상기 검사 기판 및 상기 제어 기판의 결합 신호를 비교하도록 설계된 모바일 앱에 의해 분석되며 샘플이 유래한 사람 또는 동물이 활동성 결핵을 갖는지 여부를 나타내는 시각적 신호로 이어지는, 방법.
  11. 검출을 위해 활동성 결핵를 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 사전처리하는 방법으로서,
    i) 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키는 단계;
    iii) 상기 샘플을 스테롤 지질에 노출시키기 전에 또는 후에 상기 샘플의 적어도 두 부분을 획득하는 단계;
    iv) 상기 부분들 중 첫 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판에 노출시키는 단계;
    v) 상기 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계; 또는 추가 사용을 위해 상기 부분들 중 두 번째 부분의 적어도 일부를 저장하고, 상기 부분들 중 두 번째 부분을 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 기판에 노출시키는 단계를 건너뛰는 단계를 포함하고,
    단계 iv) 및 v)에서의 노출 후에 상기 노출된 샘플 부분들 적어도 일부가 추가 사용을 위해 저장되는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 i)에서 획득된 샘플은 전혈 샘플인, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    단계 i) 후에 상기 전혈 샘플로부터 혈장이 분리되는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전혈 샘플 또는 상기 혈장을 희석하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미콜산 유래 항원은 미콜산, 코드 인자(cord factor), 화학적으로 수식된(chemically modified) 미콜산, 화학적으로 수식된 코드 인자, 합성 미콜산 파생물, 합성 코드 인자 파생물의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 표면상에 고정되는, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 상기 스테롤 지질 및 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린과 같은 상기 샘플 내의 콜레스테롤에 결합하는 화합물을 포함하는 기판 상에 고정되는, 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 상기 스테롤 지질 및 포스파티딜콜린을 포함하는 기판 상에 고정되는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 콜레스테롤인, 방법.
  20. 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하는 휴대용 디바이스로서,
    - 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너(4);
    - 상기 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 상기 적어도 하나의 컨테이너(4)의 상류 또는 하류에 접속되는 수단(5);
    - 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너(4)와의 하류 접속으로 상기 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너(6);
    - 상기 추가의 컨테이너(6)에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너(4)와의 하류 접속으로 상기 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너(7);
    - 상기 추가의 컨테이너(6)와의 접속으로 상기 제1 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 제1 챔버(9) 및 상기 다른 추가의 컨테이너(7)와의 접속으로 상기 제2 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 상기 제1 챔버(9)와 동일한 기판을 포함하는 제2 챔버(10)를 포함하는 생체센서(8)를 포함하는, 휴대용 디바이스.
  21. 제 20 항에 있어서,
    제1 튜빙(tubing)(2) 및 상기 제1 컨테이너(4)와 접속하며 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛(3)을 더 포함하는, 휴대용 디바이스.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 필터 유닛(3)은 필터 행렬을 포함하는, 휴대용 디바이스.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 피부 침투 단부(1)로부터 혈액 샘플을 수용하고 상기 혈액 샘플을 피부 부위로부터 운반하도록 배치 및 구성된, 제1 튜빙(2)에 접속된 피부 침투 단부(1);
    - 상기 혈액 샘플을 수용하도록 상기 제1 튜빙(2)과 접속하고 상기 전혈 샘플로부터 혈장을 분리하도록 구성된 필터 유닛(3);
    - 상기 샘플을 수용하며 스테롤 지질을 포함하는 제1 컨테이너(4);
    - 상기 샘플을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단(5);
    - 상기 제1 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 제2 컨테이너(6);
    - 상기 제2 샘플 스트림을 수용하고, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 제3 컨테이너(7); 및
    - 상기 제2 컨테이너(6)와의 접속으로 상기 제1 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 기판을 포함하는 제1 챔버(9) 및 상기 제3 컨테이너(7)와의 접속으로 상기 제2 샘플 스트림을 수용하고 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 상기 제1 챔버(9)와 동일한 기판을 포함하는 제2 챔버(10)를 포함하는 생체센서(8)를 포함하는, 휴대용 디바이스.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너(4)는 튜빙이며, 이것의 내부 벽은 포스파티딜콜린과 접속하는 스테롤 지질을 포함하는 코팅을 갖는, 휴대용 디바이스.
  25. 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너(4)는 튜빙이며, 이것의 내부 벽은 스테롤 지질 및 펙틴 또는 β-시클로덱스트린과 같은 상기 샘플 내의 콜레스테롤에 결합하는 화합물을 포함하는 코팅을 갖는, 휴대용 디바이스.
  26. 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 챔버(9, 10)의 상기 기판은 실리카 기반인, 휴대용 디바이스.
  27. 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체센서는 Si 고리 공명기를 포함하는, 휴대용 디바이스.
  28. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가의 컨테이너와 상기 생체센서 사이 및 상기 다른 추가의 컨테이너와 상기 생체센서 사이에 접속된 상기 샘플을 희석시키는 수단을 더 포함하는, 휴대용 디바이스.
  29. 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하는 시스템으로서,
    활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 상기 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 상기 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너와의 하류 접속으로 상기 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너와의 하류 접속으로 상기 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 상기 추가의 컨테이너로부터 상기 제1 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 검출 기판 및 상기 다른 추가의 컨테이너로부터 상기 제2 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제2 검출 기판을 포함하고, 상기 제1 및 제2 검출 기판은 미공성 멤브레인(microporous membrane)인, 시스템.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 미공성 멤브레인은 니트로셀룰로오스 멤브레인인, 시스템.
  31. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 검출 기판은 동일한 멤브레인 상의 별개의 스팟에 의해 형성되는, 시스템.
  32. 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 사전처리하는 시스템으로서,
    활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 스트림을 수용하도록 배치 및 구성된 스테롤 지질을 포함하는 적어도 하나의 컨테이너; 상기 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하며, 스테롤 지질을 포함하는 상기 적어도 하나의 컨테이너의 상류 또는 하류에 접속되는 수단; 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너와의 하류 접속으로 상기 제1 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컨테이너; 추가의 컨테이너에 평행한 배치 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너와의 하류 접속으로 상기 제2 샘플 스트림을 수용하며, 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컨테이너; 및 상기 처리된 샘플을 저장 및 수송하는 수단을 포함하는, 시스템.
  33. 제 32 항에 있어서,
    스테롤 지질을 포함하는 상기 컨테이너는 스테롤 지질 및 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린과 같은 상기 샘플 내의 콜레스테롤에 결합하는 화합물로 코팅된 기판을 포함하는, 시스템.
  34. 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 스트림을 사전처리하는 시스템으로서,
    상기 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 상기 제1 샘플 스트림 및 상기 제2 샘프 스트림을 각각 수용하도록 구성된 적어도 제1 열 및 제2 열로서, 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컴파트먼트를 포함하는 상기 제1 열; 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컴파트먼트를 포함하는 상기 제2 열; 및 상기 열들을 통과하여 처리된 샘플들의 저장 또는 수송을 위한 수단을 포함하는, 시스템.
  35. 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내의 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법을 수행하는 시스템으로서,
    상기 샘플 스트림을 적어도 제1 샘플 스트림 및 제2 샘플 스트림으로 분할하는 수단; 상기 제1 샘플 스트림 및 상기 제2 샘프 스트림을 각각 수용하도록 구성된 적어도 제1 열 및 제2 열로서, 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 기판을 포함하는 추가의 컴파트먼트를 포함하는 상기 제1 열; 스테롤 지질을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질을 포함하는 상기 컴파트먼트의 하류에서 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하지 않는 제2 기판을 포함하는 다른 추가의 컴파트먼트를 포함하는 상기 제2 열; 및 상기 제1 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제1 검출 기판 및 상기 제2 샘플 스트림의 적어도 일부를 수용하도록 고정된 미콜산 유래 항원을 운반하는 제2 검출 기판을 포함하는, 시스템.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 비드(bead) 상에 고정되며, 상기 제1 및 제2 기판은 비드인, 시스템.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 검출 기판은 미공성 멤브레인, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인인, 시스템.
  38. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스테롤 지질은 스테롤 지질 및 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린과 같은 상기 샘플 내의 콜레스테롤에 결합하는 화합물을 포함하는 기판상에 고정되는, 시스템.
  39. 결핵의 진단 또는 결핵을 진단하기 위한 샘플의 사전처리에서 사용하기 위한 키트(kit)로서,
    - 하나 이상의 피부 침투 수단;
    - 하나 이상의 튜빙;
    - 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 하나 이상의 컨테이너;
    - 고정된 미콜산 유래 항원을 갖거나 갖지 않는 기판을 포함하는 하나 이상의 컨테이너;
    - 샘플 및/또는 자신에 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 적어도 하나의 미공성 멤브레인 및 선택적으로 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내에 들어있는 미콜산 유래 항원에 대한 항체의 중연쇄(heavy chain)에 결합하는 2차 항체의 수송 및 저장을 위한 하나 이상의 컨테이너; 또는 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 기판을 포함하는 적어도 두 개의 챔버를 포함하는 하나 이상의 생체센서; 및
    - 선택적으로 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단 및/또는 필터 유닛을 포함하는, 키트.
  40. 결핵의 진단 또는 결핵을 진단하기 위한 샘플의 사전처리에서 사용하기 위한 키트로서,
    - 하나 이상의 피부 침투 수단;
    - 하나 이상의 튜빙;
    - 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질로 코팅된 기판을 포함하는 상기 컴파트먼트 아래의 고정된 미콜산 유래 항원으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트를 포함하는 하나 이상의 열;
    - 스테롤 지질 및 선택적으로 포스파티딜콜린, 펙틴, 암포테리신 B 또는 β-시클로덱스트린으로 코팅된 기판을 포함하는 컴파트먼트 및 스테롤 지질로 코팅된 기판을 포함하는 상기 컴파트먼트 아래의 고정된 미콜산 유래 항원으로 코팅되지 않은 기판을 포함하는 컴파트먼트를 포함하는 하나 이상의 열;
    - 선택적으로 샘플의 수송 및 저장을 위한 하나 이상의 컨테이너;
    - 선택적으로 혈액 또는 혈장을 희석하기 위한 수단 및/또는 필터 유닛;
    - 선택적으로 자신에 고정된 미콜산 유래 항원을 갖는 적어도 하나의 미공성 멤브레인; 및
    - 선택적으로 활동성 결핵을 갖는 것으로 의심되는 사람 또는 동물로부터 유래된 샘플 내에 들어있는 미콜산 유래 항원에 대한 항체의 중연쇄에 결합하는 2차 항체를 포함하는, 키트.
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