CN114217070A - 一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA‑GG、含生物素与p‑tau181抗体Ⅰ的结合物的组份Bio‑AbⅠ、含p‑tau181抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG‑AbⅡ和校准品。本发明利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的磷酸化tau181蛋白含量；与目前p‑tau181检测的ELISA等非均相免疫分析相比，检测范围宽，操作简单，检测时间短，灵敏度高，重复性好；整个检测过程无分离洗涤过程，不仅节省检测时间，且不会产生额外废液，免除洗涤误差，具有高精密度和灵敏度。

Description

一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂 盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用，属于分子免疫学领域。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是人在老年期最常见的中枢神经系统退行性疾病，是引起痴呆的最常见的病因。AD通常发生在60岁以上的老年人身上，疾病发展较为缓慢，起初患者无临床症状，逐步发展为健忘、性格多变，最终阿尔兹海默症会影响患者整个大脑。这一过程可达10年甚至20年之久。随着全球人口的老龄化，AD发病率也与日俱增，到2050年将增至1.15～1.35亿[The Global Impactof Dementia 2013–2050]。由于目前仍没有有效的治疗方法来预防、制止或逆转阿尔茨海默病；AD的唯一有效的治疗方法是延缓或减轻症状[Huang Y,2012]。因此，AD的早期诊断至关重要。
Tau蛋白高度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFTs)是AD的典型病理表现之一。高水平的磷酸化tau蛋白(p-tau)和总tau蛋白(t-tau)在AD患者脑脊液(CSF)中普遍存在。根据2018美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会(NIA-AA)AD研究框架，CSF p-tau181(tau蛋白在第181位苏氨酸位点磷酸化)已被列为AD核心生物标志物之一。
阿尔茨海默症(AD)的确诊需要临床症状、体征、心理测试和生物标志物检测等多方面的综合判定。正电子发射断层扫描(PET)成像以及检测脑脊液(CSF)中Aβ42、T-tau和P-T181-tau浓度是AD临床实践和研究中广泛使用的诊断生物标志物。然而，PET的昂贵成本限制了其在AD临床中的应用。脑脊液被认为是AD生物标志物的最佳来源，因为CSF与大脑能够直接接触，能反映中枢神经系统(CNS)中发生的一切病理生理变化。脑脊液中的Aβ42与尸检脑组织病理变化、PET图像具有高度相关性，证实了CSF对AD诊断的价值。然而，通过腰椎穿刺取CSF是一种侵入性手术方法，并且重复的CSF收集对患者和医师来说均具有挑战性。
AD患者脑脊液(CSF)中Tau和磷酸化Tau的过表达已得到很好的证实。最近的一些研究评估了AD中血浆Tau的水平，据报道与健康的老年人相比，AD和轻度认知障碍(M CI)患者的血浆Tau明显过量表达(S Janelidze·2020年)，灵敏度的检测方法能有力地检测到血浆中血浆标志物水平的稳定上升。[Karikari TK，2020年]。与CSF相比，通过血液检测进行AD生物标记物筛选是个不错的选择，因为取血液进行检测更容易且侵入性更小。
目前使用较多的ELISA和化学发光免疫分析方法，均属于非均相免疫分析。非均相免疫分析在检测信号前，需要通过反复洗涤固相(微粒)，以分离去除分布于液相中的未参加反应的标记抗体。多次洗涤必然会为免疫分析带来洗涤“误差”，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和分析敏感度。因此，设计一种检测精度更高的化学发光免疫检测方法是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的技术方案如下：
所述试剂盒包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA-GG、含生物素与p-tau181抗体Ⅰ的结合物的组份Bio-AbⅠ、含p-tau181抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG-AbⅡ、化学发光底物液、校准品和校准品缓冲液。
优选的，所述组份SA-GG含与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体，所述与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体包含有光活化的敏化剂，直径为180-220nm，且在含水介质中可溶。感光化合物受特殊波长680nm光激发，每秒可产生6万个以上单线态氧分子，放大信号，但单线态氧半衰期仅为4us，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等，接近供体，则受体中的荧光基团可迅速吸收单线态氧，以上转换方式产生520-620nm光信号，为检测器探测到。其中，链霉亲和素与供体偶联物缓冲液为发光试剂缓冲液发光试剂缓冲液。
优选的，所述组份Bio-AbⅠ含生物素与p-tau181抗体Ⅰ的偶联物，其中生物素为活化小分子生物素。p-tau181抗体Ⅰ可以识别并特异性结合181苏氨酸位置磷酸化的p-tau181。其中p-tau181抗体Ⅰ为经基因编辑的备鼠单抗，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。抗体制备方法参照《抗体制备与使用实验指南》。其中，微粒包被物缓冲液为100mM Tris缓冲液，PH＝7.0。
优选的，所述组份FG-AbⅡ含p-tau181抗体Ⅱ与受体结合物，其中受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；受体填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，直径为180-220nm。其中p-tau181抗体Ⅱ可结合TAU中间保守部位211-231aa。其中，微粒包被物缓冲液为100mM Tris缓冲液，PH＝7.0。
优选的，所述试剂盒还包括16ng/ml人磷酸化tau181蛋白校准品。校准品使用时用校准品缓冲液依次稀释至：64、32、16、8、4、2pg/mL的6个梯度。标准曲线公式y＝222.69x+120.27，R2＝0.9985。
试剂盒将上述试剂组份组装成盒，于-16℃以下条件保存。
本发明的另一个目的是公开了一种使用上述试剂盒的p-tau181光激化学发光均相免疫检测方法。所述方法包括如下步骤：
A.检测孔中加入待检的血浆标本以及标准品50μl/孔，均为双孔，同时设空白孔；
B.分别加入20ul的组份FG-AbⅡ和组份Bio-AbⅠ，孵育，进行第一步反应；再加入组份SA-GG进行第二步反应；
C.激光照射反应孔，测量每个反应孔的光信号值。
本发明中采用的发光测量仪为自动光激化学发光检测仪LiCA500。
优选的，所述组份SA-GG采用如下步骤制备：感光颗粒和链霉亲和素10:1的比例加入0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液，37℃反应避光震荡48小时。羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点。离心分离得到已连接亲和素的感光颗粒，用发光试剂缓冲液稀释偶联亲和素的感光微粒重悬保存。
更优选的，发光试剂缓冲液包含5％(v/v)HEPES、1％(wt/v)海藻糖、0.5％(wt/v)TrionX-100、(wt/v)0.1％Dextan，优选的PH为7.5。
优选的，所述组份Bio-AbⅠ采用如下步骤制备：将p-tau181抗体Ⅰ加入碳酸钠缓冲液中，加入活化生物素，37℃反应12-18小时后，进行透析，透析结束后加入Tris-Hcl缓冲液进行悬浮和保存。
优选的，所述组份FG-AbⅡ采用如下步骤制备：将受体加入碳酸钠缓冲液中，加入p-tau181抗体Ⅱ，迅速斡旋混匀，37℃避光反，加入含75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，去液体，得到p-tau181抗体Ⅱ和受体的结合物，加入Tris缓冲液进行重悬即为组份FG-AbⅡ。
本发明的第三个目的在于公开一种上述磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于阿尔茨海默氏痴呆早期诊断。
本发明的磷酸化tau181蛋白含量(p-tau181)试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的磷酸化tau181蛋白含量。与目前p-tau181检测的ELISA等非均相免疫分析相比，检测范围宽，操作简单，检测时间短，灵敏度高，重复性好。整个检测过程无分离洗涤过程，不仅节省检测时间，且不会产生额外废液，免除洗涤误差，具有高精密度和灵敏度。
附图说明
图1是本发明提供的p-tau181检测原理图；
图2是本发明提供的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1、试剂盒的制备
本发明的试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的磷酸化tau181蛋白含量。如图1所示，反应的技术原理为：通过在均相条件下将样本、生物素标记p-tau181抗体Ⅰ和偶联了p-tau181抗体Ⅱ的发光微球混合。此时生物素标记p-tau181抗体Ⅰ和偶联了p-tau181抗体Ⅱ的发光微球迅速有效地识别检测样本的目标分子而形成免疫夹心复合物。然后加入链霉亲和素标记的感光微球，形成感光微球-链霉亲和素-生物素-p-tau181抗体Ⅰ-p-tau181抗原-p-tau181抗体Ⅱ-发光微球免疫复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。在测定范围内，发光强度与样本中的磷酸化tau181蛋白浓度成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可定量测算出待测样本中磷酸化tau181蛋白浓度。
(1)组份SA-GG的制备：
a.感光微球(供体)混悬液处理：吸取10mg的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入0.2ml MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮。
b.链霉亲和素溶液配制：称量1mg链霉亲和素，加入0.2ml MES缓冲液溶解。
c.混合：将以上处理好的感光微球(供体)混悬液、链霉亲和素溶液，等体积比进行混合，迅速混匀。
d.反应：加入10ul MES缓冲液配制的40mg/ml的NaBH3CN溶液，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。
e.封闭：加入40ul MES缓冲液配制150mg/ml的Gly溶液以及25ul 40mg/ml的NaBH3CN溶液，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入0.3ml 200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，37℃旋转反应16小时。
f.清洗：离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次。
g.发光试剂缓冲液配置：5％(v/v)HEPES、1％(wt/v)海藻糖、0.5％(wt/v)TrionX-100、(wt/v)0.1％Dextan，PH为7.5±0.10。
h.稀释悬浮：最后用发光试剂缓冲液进行稀释悬浮，供体浓度为100μg/mL。
(2)组份Bio-AbⅠ的制备：
a.抗体处理：将p-tau181抗体Ⅰ透析于0.1M NaHCO3溶液，4h/次，换液1次，测定抗体浓度并调节至0.5mg/ml。
b.标记：取200ul取处理好的p-tau181抗体Ⅰ,再加入8ul 5mg/ml生物素溶液，迅速混匀。2-8℃静置反应12-16小时。
c.透析：将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH＝8.00)，2～8℃进行透析，至少更换透析液1次，每次至少透析4～5小时；
d.稀释悬浮：将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，用0.1M Tris-HCl溶液生物素标记抗体浓度调节至10ug/ml。
鼠单克隆抗体重链可变区序列(SEQ ID NO.1～2)具体如下：
Figure BDA0003363195180000051
Figure BDA0003363195180000061
鼠单克隆抗体轻链可变区序列(SEQ ID NO.3～4)具体如下：
Figure BDA0003363195180000062
(3)组份FG-AbⅡ的制备
a.抗体处理：将0.3mg p-tau181抗体Ⅱ透析于0.1M NaHCO3溶液，4h/次，换液1次，测定抗体浓度并调节至1mg/ml。
b.受体处理：取4mg受体加入离心管，加入0.05M NaHCO3缓冲液，7000rpm离心10min，弃上清，向离心管中加入800ul 0.05M NaHCO3缓冲液，进行超声清洗后，再次离心，弃上清。
c.混匀和反应：加入400ul pH9.6的0.05M CB缓冲液将受体重悬，使受体浓度为10mg/ml，再加入0.2mg透析后的p-tau181抗体Ⅱ，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25～40rpm避光混匀过夜。将离心管放入2～8℃下冷却10min，取8ul的8mg/mlNaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温混合器上反应2小时。
d.封闭：在离心管中加入70ul的75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，混匀，垂直旋转混合器上25～40rpm反应1小时。
e.清洗：7500rpm离心5min，弃上清，加入pH7.4的0.1M PBST缓冲液，进行超声清洗，重复两次。
f.稀释悬浮：用0.1M Tris-HCl溶液稀释至受体浓度200μg/mL。
(4)磷酸化tau181蛋白校准品的制备方法：
a.校准品缓冲液制备：
物料 用量
三羟甲基氨基甲烷 2.42g
氯化钠 18.00g
Tween-20 1.00g
胎牛血清 200mL
Proclin300 1.00g
将上述物料加入1000mL去离子水中，充分搅拌溶解，调节PH至7.40±0.10。
b.用校准品缓冲液将磷酸化tau181蛋白抗原依次稀释至：64、32、16、8、4、2pg/mL,6个梯度。
(5)组装：将上述试剂组份组装成盒，于-16℃以下条件保存。
实施例2、试剂盒的测试方法
(1)冰箱中取出试剂盒，均应平衡到室温(18-25℃)；
(2)取50μl待测样本(血浆)或标准品分别反应孔中；
(3)在反应孔中依次加入20ul组份FG-AbⅡ和20ul组份Bio-AbⅠ，充分混匀，37℃温育10min；
(4)再加入175ul组份SA-GG，37℃温育4min；
(5)激光照射微孔并计算每孔的信号值；
(6)根据标准曲线计算样品的浓度。
实施例3、试剂盒的性能测试结果
试剂盒性能评价包括对该方法制备的试剂盒进行线性、精密度、抗干扰能力、临床性能进行测定。
(1)采用蛋白校准品梯度稀释检测后绘制标准曲线，标准曲线如图2所示，标准曲线公式y＝222.69x+120.27，R2＝0.9985，检测结果如下表1所示。该试剂盒的测定的定量下限(1.0pg/mL)，空白的测定值均低于0.5pg/ml。
表1
实际浓度ng/L RLU
0 128
0.2 132
0.5 153
1 230
2 474
4 899
8 1897
16 3608
32 7660
64 14195
(2)检测重复性：
p-tau181光激化学发光试剂盒批内精密度
重复参考品C1 重复参考品C2 重复参考品C3
N(重复次数) 18 18 18
平均值 1.660 2.98 6.613
SD 0.074 0.0105 0.0183
CV 8.2％ 7.7％ 2.8％
由上述检测结果及分析可知，本发明的试剂盒检测结果重复性好，其结果均具有统计学意义。
(3)抗干扰性能：
鉴于均相免疫技术是一种免洗方法，因此它可能更容易受到来自黄疸，溶血和高血脂血液的异常临床样品的干扰。另外，生物素在许多基于链霉亲和素-生物素的免疫测定中引起干扰，从而导致夹心免疫测定中假降低的结果。
通过在血清库中添加已知量的甘油三酸酯，胆红素，血红蛋白和生物素来进行干扰测试。干扰率是根据添加干扰物质之前和之后的百分比差计算得出的，干扰率±10％为可接受范围。此外，甘油三酸酯，胆红素，血红蛋白和生物素的存在分别达到10.0g/L，0.5mmol/L，5.0g/L和250μg/L的浓度时，未观察到显着差异。
p-tau181化学发光试剂盒样本抗干扰性能
干扰率物质 2pg/mL样本干扰率 15pg/mL样本干扰率
10.0g/L甘油三酸酯 -7.63％ +2.45％
0.5mmol/L胆红素 -3.26％ -3.54％
5.0g/L血红蛋白 -2.26％ -2.09％
250μg/L生物素 -6.01％ -4.14％
(4)临床性能：
采用本申请试剂盒通过临床样本验证后，采用5.06pg/ml的血浆p-tau181作为截止值，检测109例样本，数据下表所示：
血浆p-tau181试剂盒临床检测性能
阳性样本 阴性样本
血浆p-tau181阳性样本 44 5
血浆p-tau181阴性样本 7 52
阴性符合率：52/59＝88.14％；
阳性符合率：44/49＝89.8％；
本发明的磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒具有很好的临床适用性和先进性。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003363195180000091
Figure BDA0003363195180000101
Figure BDA0003363195180000111
Figure BDA0003363195180000121
Figure BDA0003363195180000131
序列表
<110> 上海普然生物科技有限公司
<120> 一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(315)
<400> 1
atgctgttgg ggctgtctca gccactccga tctacaggat atcaaggtgt gcattgtgag 60
gtgcagcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagcctt ctgtggctct cgcttatctt 120
cacgtcagca gagtctgctg gaagatgaac tgggtccgcc aggctccagg aaagggtttg 180
gaatggattg ctcgcgctaa cagagtcaga ggcagaatgg tgtattatgc cgattcagtg 240
aaagacaggt tcaccatctc cagagatgat tcacaaagca tgctctatct gcagttgtct 300
tctccaccac tctct 315
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(105)
<400> 2
Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Pro Leu Arg Ser Thr Gly Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Val Ala Leu Ala Tyr Leu His Val Ser Arg Val Cys Trp Lys
35 40 45
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
50 55 60
Arg Ala Asn Arg Val Arg Gly Arg Met Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Leu Ser Ser Pro Pro Leu Ser
100 105
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(333)
<400> 3
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
atctcgtgca gggccaccaa cctgtgcgac gaatacacag ccatgcactg gtaccaacag 180
aaaccaggac agtcacccaa actcctcatc tatggcgacg tctccaacct agaatctggg 240
gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 300
gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgt 333
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(111)
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Asn Leu
35 40 45
Cys Asp Glu Tyr Thr Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asp Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110

Claims (10)

1.一种用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA-GG、含生物素与p-tau181抗体Ⅰ的结合物的组份Bio-AbⅠ、含p-tau181抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG-AbⅡ和校准品。
2.根据权利要求1所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份SA-GG含与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体，所述与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体包含有光活化的敏化剂，直径为180-220nm。
3.根据权利要求1所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份Bio-AbⅠ含生物素与p-tau181抗体Ⅰ的偶联物，其中生物素为活化小分子生物素。
4.根据权利要求3所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述p-tau181抗体Ⅰ为经基因编辑的备鼠单抗，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求1所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份FG-AbⅡ含p-tau181抗体Ⅱ与受体结合物，其中受体包含烯烃化合物和金属螯合物。
6.根据权利要求5所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述受体填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，直径为180-220nm。
7.根据权利要求1所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括16ng/ml人磷酸化tau181蛋白校准品。
8.一种采用根据权利要求1～7任一项所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
a)检测孔中加入待检的血浆标本以及标准品50μl/孔，检测孔均为双孔，同时设空白孔；
b)分别加入20ul的组份FG-AbⅡ和组份Bio-AbⅠ，孵育，进行第一步反应；再加入组份SA-GG进行第二步反应；
c)激光照射反应孔，测量每个反应孔的光信号值。
9.根据权利要求8所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测方法，其特征在于，所述组份SA-GG采用如下步骤制备：感光颗粒和链霉亲和素10:1的比例加入0.1M2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液，37℃反应避光震荡48小时。
10.一种根据权利要求1～9所述的用于磷酸化tau181蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法的应用，其特征在于，所述检测试剂盒及其检测方法采用化学发光均相免疫法体外检测磷酸化tau181蛋白。
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